Biotecnologia Aplicada à Saúde - Vol. 3 by Editora Blucher

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3 FUNDAMENTOS E APLICAÇÕES

Nesta coleção, a intenção foi reunir, em uma obra didática, sucinta e objetiva, os fatos mais recentes da literatura e os conhecimentos clássicos dos temas disponíveis em obras separadas. Para se ter todo o escopo de Biotecnologia Aplicada à Saúde e Biotecnologia Aplicada à Agro&Indústria, o primeiro tema é abordado em três volumes e o segundo em um, totalizando 4 volumes, sendo que todos os tópicos são abordados nos cursos de pós-graduação em Biociências e Biotecnologia, entre outros.

FUNDAMENTOS E APLICAÇÕES

Seguindo essa direção, e para produzir um livro que seja para uso tanto de alunos de graduação como de pós-graduação e para aqueles profissionais que queiram se introduzir na área de biotecnologia utilizando técnicas modernas e qualquer tipo de modelo celular, disponibilizamos, em um tópico de cada capítulo, as metodologias e os procedimentos para a realização de experimentos. Um guia prático e simples para a bancada de experimentos complexos.

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organizador

RODRIGO RIBEIRO RESENDE

Neste terceiro volume, você aprenderá que sequências de RNA, DNA, peptídeos e fagos funcionam como ligantes e descobrirá como selecioná-las contra alvos específicos. Você encontrará os RNAs não codificantes e descobrirá como as diferenças entre humanos e macacos podem estar neles. Para todo genoma, também temos metabolomas, proteomas, transcriptomas, técnicas inovadoras, sequenciamento de nova geração e análises de todo o genoma por bioinformática. Você também aprenderá a aplicar tudo isso na clínica, da farmacogenômica às doenças inflamatórias; da surdez às análises de DNA forenses e à toxicologia. E conhecerá técnicas desenvolvidas pelas empresas de biotecnologia mais conceituadas do mundo.

colaboradores

organizador

MARCUS VINICIUS GOMEZ SILVIA GUATIMOSIM CARLOS RICARDO SOCCOL

RODRIGO RIBEIRO RESENDE

BIOTECNOLOGIA APLICADA À SAÚDE FUNDAMENTOS E APLICAÇÕES VOLUME 3

RODRIGO RIBEIRO RESENDE ORGANIZADOR

MARCUS VINICIUS GOMEZ SILVIA GUATIMOSIM CARLOS RICARDO SOCCOL COLABORADORES

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FICHA CATALOGRÁFICA Rua Pedroso Alvarenga, 1245, 4o andar 04531-934, São Paulo – SP – Brasil Tel.: 55 11 3078-5366 contato@blucher.com.br www.blucher.com.br

Biotecnologia aplicada à saúde: fundamentos e aplicações, volume 3 / organizado por Rodrigo Ribeiro Resende; colaboração de Marcus Vinicius Gomez, Silvia Guatimosim e Carlos Ricardo Soccol. – São Paulo: Blucher, 2015.

Segundo o Novo Acordo Ortográfico, conforme 5a ed. do Vocabulário Ortográfico da Língua Portuguesa, Academia Brasileira de Letras, março de 2009.

ISBN 978-85-212-0967-6

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1. Biotecnologia 2. RNA 3. DNA I. Resende, Rodrigo Ribeiro II. Gomez, Marcus Vinícius III. Guatimosim, Silvia IV. Soccol, Carlos R. 15-1024

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Índices para catálogo sistemático: 1. Biotecnologia

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CONTEÚDO Prefácio – Luiz Renato França – INPA

Bibliotecas Combinatórias 1. SELEX: conceitos básicos e metodologia para o desenvolvimento de aptâmeros de RNA como ligantes de receptores de superfície celular 2. Phage display: fundamentos e aplicações 3. Phage display: aspectos básicos e perspectivas atuais 4. Bibliotecas de peptídeos sintéticos

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RNAs Não Codificadores 5. RNAs não codificadores longos: genômica, biogênese, mecanismos e função 6. RNAs curtos não codificadores: genômica, biogênese, mecanismos e função 7. Interferência por RNA 8. miRNAs: oportunidades de inovação em biotecnologia

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Bibliotecas de Omas 9. DNA microarray: tipos e aplicações 389 10. Mapeamento de genomas bacterianos: sequenciamento e análise funcional 445 11. Análise transcriptômica: fundamentos, métodos e aplicações 477 12. Proteômica I – análise de expressão e caracterização de proteínas: fundamentos, métodos e aplicações 513 13. Proteômica II – análise de interação entre proteínas: fundamentos, métodos e aplicações 583 14. Estratégias genômicas, proteômicas e peptidômicas isentas de gel na identificação de compostos bioativos 623 15. Metabolômica e redes bioquímicas globais: fundamentos, métodos e aplicações 671 16. Anotação de genoma: fundamentos e aplicações das análises in silico 717 Biotecnologia Médica 17. Segmentação, mecanismo e resolução de doenças inflamatórias 18. Pesquisas no tratamento da surdez: terapia celular e molecular 19. Farmacogenômica: fundamentos, métodos e aplicações da genômica na resposta aos fármacos 20. Aplicações forenses do DNA: fundamentos, métodos e limitações 21. Eletroforese capilar como ferramenta analítica para toxicologia forense 22. Método simples e rápido para determinação de cocaína e seus principais produtos de biotransformação por eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas

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23. D esenvolvimento de metodologia analítica para determinação de 3,4-metilenodioxi metanfetamina (MDMA) em comprimidos de ecstasy por eletroforese capilar com detecção por arranjo de diodos (CE-DAD) 941 O que as empresas dizem 24. U ma introdução ao sequenciamento de DNA 25. F undamentos da reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) 26. Citometria de fluxo: fundamentos e princípios

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Autores

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BIBLIOTECAS COMBINATÃ&#x201C;RIAS

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CAPÍTULO

SELEX: CONCEITOS BÁSICOS E METODOLOGIA PARA O DESENVOLVIMENTO DE APTÂMEROS DE RNA COMO LIGANTES DE RECEPTORES DE SUPERFÍCIE CELULAR Katia das Neves Gomes Arquimedes Cheffer Rodrigo R. Resende Henning Ulrich 1.1 INTRODUÇÃO

A utilização de microarranjos de DNA e RNA (pequenos chips com sequências sintéticas de DNA ou RNA utilizados para isolar genes e analisar sua expressão) levantou a possibilidade de que anticorpos pudessem também ser utilizados de maneira similar para a triagem de outras macromoléculas,

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como proteínas e carboidratos. Tentativas foram feitas para o desenvolvimento de microchips de anticorpos. Entretanto, seu sucesso foi limitado pela falta de anticorpos puros e pela sua sensibilidade à degradação. Isso fez com que sequências sintéticas de DNA e RNA passassem a ser consideradas para a triagem de um determinado ligante1. Os ácidos nucleicos são compostos atrativos como ferramentas de triagem por se dobrarem em estruturas secundárias e terciárias bem definidas, serem de fácil síntese química ou enzimática e carecerem de imunogenicidade 2. De fato, é a conformação tridimensional do oligonucleotídeo que explica sua capacidade de se ligar a um determinado alvo, diferente dos microarranjos de DNA ou RNA que funcionam com base na complementariedade entre as bases nitrogenadas. Esses ligantes de DNA ou RNA, conhecidos como aptâmeros, podem ser definidos como oligonucleotídeos sintéticos capazes de interagir com aminoácidos, proteínas e outras moléculas; são obtidos a partir de uma biblioteca combinatória de ácidos nucleicos por meio de um processo interativo que envolve os passos de ligação ao alvo, separação das sequências ligantes e amplificação das mesmas3. Muito embora a capacidade de moléculas de DNA e RNA de interagir com proteínas ou mesmo com outras moléculas de DNA e RNA fosse já conhecida antes do advento dos aptâmeros, o potencial dos mesmos só se tornou evidente quando se observou que tais moléculas de ácido nucleico também eram capazes de interagir com compostos que normalmente não interagem com DNA ou RNA. Isso só foi capaz graças ao surgimento da técnica denominada Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX), a qual será discutida nesse capítulo.

1.2 HISTÓRICO A técnica de SELEX permite isolar moléculas de ácido nucleico a partir de uma biblioteca combinatória de mais de 1015 sequências individuais e foi desenvolvida apenas na década de 1990, por dois grupos de pesquisa separadamente. Na época, Craig Tuerk estava terminando sua tese de doutorado, sob orientação do professor Larry Gold, na Universidade do Colorado. Ambos estavam interessados em elucidar o funcionamento do operador traducional do RNA mensageiro que codifica para a DNA polimerase do bacteriófago T4. Esse operador consiste de um grampo e da sequência de Shine e Dalgarno, aos quais a polimerase se liga para reprimir a sua síntese quando os níveis de replicação estão apropriados. Para tanto, o grampo foi

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RNAS NÃ&#x192;O CODIFICADORES

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CAPÍTULO

RNAS NÃO CODIFICADORES LONGOS: GENÔMICA, BIOGÊNESE, MECANISMOS E FUNÇÃO

Ana Carolina Ayupe Eduardo Moraes Rego Reis 5.1 INTRODUÇÃO As células dos organismos unicelulares e multicelulares dependem de uma organização estrutural e funcional complexa para realizar as funções necessárias à sua sobrevivência e perpetuação. Uma teoria amplamente aceita para a origem da vida é a de que, na Terra pré-biótica existiam condições físico-químicas que propiciaram o surgimento de moléculas de ácido ribonucleico (RNA) com atividades catalíticas, capazes de copiar outras moléculas de RNA, possibilitando assim a transmissão de informação1-4. A compartimentalização de RNAs catalíticos autorreplicantes (RNA replicases) em lipossomos teria dado origem a protocélulas dotadas de um metabolismo rudimentar, que adquiriram a capacidade de se duplicar e transmitir o material

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genético para as células-filhas. Ao longo de milhões de anos, protocélulas desenvolveram a capacidade de sintetizar polipeptídeos a partir de aminoácidos, que progressivamente aumentaram de variedade e complexidade e adquiriram novas atividades catalíticas características das células modernas. A extensiva caracterização bioquímica de proteínas durante os séculos XIX e XX desvendou inúmeras funções estruturais e enzimáticas exercidas por essas versáteis biomoléculas. Atuando como enzimas, receptores de superfície, componentes de canais ou transportadores transmembranares, organizadores do citoesqueleto, entre diversas outras funções, está bem estabelecido que as proteínas ocupam papeis centrais no controle e execução das funções metabólicas e reprodutivas das células modernas. Também, ao longo da evolução, o RNA foi eventualmente substituído pelo ácido desoxirribonucleico (DNA) como molécula de armazenamento da informação genética, em função de sua maior estabilidade química 3. As instruções necessárias para a síntese de proteínas e a montagem e funcionamento das células estão armazenadas no DNA que compõe o seu genoma. A informação no genoma está organizada em unidades discretas – os genes – codificadas na sequência de nucleotídeos que compõem o DNA. A mobilização da informação genética é um processo altamente controlado, no qual o DNA serve como molde para a síntese de moléculas de RNAs, em reações catalisadas por enzimas RNA polimerases (transcrição). A transcrição do DNA nas regiões de genes ativos produz diferentes classes de RNAs, onde historicamente se destacam os RNAs mensageiros (mRNAs) que codificam a informação necessária para a síntese das proteínas celulares, e RNAs envolvidos no processo de tradução proteica: os RNAs ribossomais (rRNAs) componentes dos ribossomos, a máquina molecular responsável pela síntese de proteínas, os RNAs transportadores de aminoácidos (tRNAs), que fazem a leitura do código genético presente nos mRNAs, além de pequenos RNAs nucleares (small nuclear RNA – snRNAs) e nucleolares (small nucleolar RNA – snoRNAs) envolvidos no processamento e modificação química de mRNAs, rRNAs e tRNAs. A multiplicidade de funções moleculares exercidas pelas proteínas nos processos biológicos aliada à observação de que as principais classes de RNAs participam no processo de tradução dos mRNAs em proteínas, sedimentaram a noção de que, nas células modernas, os RNAs desempenham, principalmente, papéis acessórios no fluxo da informação genética armazenada no DNA. Este conceito está expresso no Dogma Central da Biologia Molecular, elaborado originalmente por Francis Crick em 1958 5. Contudo, nas últimas duas décadas têm sido descritas e caracterizadas novas classes

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BIBLIOTECAS DE OMAS

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CAPÍTULO

DNA MICROARRAY: TIPOS E APLICAÇÕES

Katia C. Oliveira Sergio Verjovski-Almeida 9.1 INTRODUÇÃO A quantidade de informação que foi gerada nos últimos dez anos com os projetos de sequenciamento dos genomas e transcriptomas dos diversos organismos abriu inúmeras oportunidades para explorar um novo conjunto de dados que até então não era acessível. Uma vez que as sequências contidas no genoma se tornaram conhecidas, era necessário descobrir qual a função de cada uma delas e como seus produtos trabalham conjuntamente. Diante destas necessidades nasceu a genômica funcional, que consiste num conjunto de abordagens técnicas que visa esclarecer a função dos genes. Neste contexto, emerge a tecnologia dos DNA microarrays, também conhecidos como microarranjos de DNA, ou chips de DNA. Os microarranjos de DNA consistem em superfícies sólidas (geralmente lâmina ou chip) sobre as quais são depositados, ou sintetizados in loco ordenadamente, centenas de milhares de fragmentos de DNA (produtos da PCR* ou oligonucleotídeos) denominados sondas (ou probes). Por meio dessas pequenas plataformas é possível quantificar a abundância relativa, em uma amostra, de determinados trechos de DNAs ou RNAs-alvos (ou targets) dos genes com sequência complementar às sequências presentes no microarranjo.

* Polymerase chain reaction, ou reação em cadeia da polimerase.

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Poder medir a presença/ausência ou o nível de expressão de milhares de genes num mesmo ensaio foi um passo muito importante para agregar grande quantidade de informação funcional relativa aos trechos de DNA dos genomas sequenciados. Dessa forma, correlacionar os níveis de expressão ou presença/ausência de genes, transcritos a partir de determinadas regiões do genoma, com os fenótipos observados foi o primeiro passo para a inferência da função de determinados trechos do genoma. Assim, somado ao fato de os chips serem cada vez mais capazes de abrigar um número maior de elementos, e ficarem cada vez mais baratos, os microarrays se popularizaram como uma das primeiras abordagens no estudo funcional na era pós-genômica. Se fizermos uma busca no Pubmed *, utilizando a palavra microarray, obteremos o resultado abaixo (Figura 9.1) que mostra o número de publicações anuais com o tema microarrays, e nos revela que esta técnica é amplamente difundida e utilizada pela comunidade científica no mundo.

Figura 9.1 Número de publicações anuais com o tema microarray no Pubmed. Pesquisa atualizada em 14 jan. 2014.

* Ver: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/>.

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BIOTECNOLOGIA MÃ&#x2030;DICA

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CAPÍTULO

SEGMENTAÇÃO, MECANISMO E RESOLUÇÃO DE DOENÇAS INFLAMATÓRIAS Denise Alves Perez Alesandra Corte Reis Juliana Priscila Vago Rayssa Maciel Athayde Lirlândia Pires de Sousa Vanessa Pinho Mauro Martins Teixeira 17.1 INTRODUÇÃO 17.1.1 Inflamação

O reconhecimento do processo inflamatório data da Antiguidade. O primeiro a definir os sintomas clínicos da inflamação foi o médico romano Cornelius Celsius, no século I d.C. Esses sintomas foram descritos como os quatro sinais cardinais da inflamação: o rubor (vermelhidão, devido à hiperemia), tumor (inchaço, causado pelo aumento da permeabilidade da microvasculatura e extravasamento de proteínas para o espaço intersticial),

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calor (associado ao aumento do fluxo sanguíneo) e dor (em parte, devido a alterações nas terminações nervosas, como alteração de atividade simpática, entre outros). A functio laesa (perda da função ou disfunção dos órgãos envolvidos devido ao edema e dor) foi descrita como a quinta característica da inflamação por Rudolf Virchow em 1858 (Figura 17.1)1.

Figura 17.1 Sinais cardinais da inflamação: calor, rubor, tumor (edema), dor e perda da função.

A inflamação pode ser definida como uma reação a lesões traumáticas, danos químicos ou físicos, de natureza autoimune ou em resposta a agentes infecciosos, visando à restauração da homeostase2. Ela é guiada inicialmente por componentes da imunidade inata, tais como moléculas sinalizadoras, seus receptores e alguns grupos celulares e, posteriormente, pela participação de elementos da imunidade adquirida. Alterações na microcirculação, migração leucocitária através dos vasos e liberação de moléculas solúveis nos tecidos danificados são as principais características da inflamação3. As moléculas solúveis, também conhecidas como mediadores inflamatórios, atuam localmente na lesão ou de forma sistêmica. São originários do plasma, de células inflamatórias ou dos tecidos lesados, e apresentam redundância funcional. Sistemas compostos de proteínas plasmáticas, tais como complemento, cininas e fibrinogênio, são ativados e seus produtos serão responsáveis pelos eventos inflamatórios citados anteriormente, bem como os produtos de origem celular: mediadores lipídicos, espécies reativas de oxigênio, quimiocinas e citocinas3,4,5. As citocinas são proteínas secretadas com função na regulação da resposta imune, podendo regular também o tráfego e organização celulares em órgãos linfoides. Em geral, agem como fatores de crescimento na diferenciação e proliferação celular, e na maturação de células da medula óssea. Algumas são quimiotáticas (atraem células para o sítio inflamatório). Chamadas quimiocinas, possuem propriedades ativadoras e supressoras, incluindo

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O QUE AS EMPRESAS DIZEM

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CAPÍTULO

UMA INTRODUÇÃO AO SEQUENCIAMENTO DE DNA Ricardo Dalla-Costa Leonardo Varuzza Fernando Amaral Daphine de Paula Eduardo Castan Camila Camanzano Ornelas Weslley Tsutsumida

24.1 SURGIMENTO DO SEQUENCIAMENTO DO DNA Apesar de a molécula de DNA ter sido isolada pela primeira vez em 1869 por Friedrich Miescher, apenas mais de um século depois seriam publicadas as primeiras sequências da molécula. Em 1968, Wu e Kaiser1 mediram a incorporação de nucleotídeos radioativamente marcados catalisada pela enzima DNA polimerase e definiram uma sequência parcial de DNA lambda de bacteriófago. A sequência completa de 12 bases seria publicada apenas em 19712. Métodos que resultassem em sequências mais longas apareceriam somente em meados da década de 1970, com os trabalhos de Sanger3 e Maxam e Gilbert4, que se tornaram marcos na história do sequenciamento do DNA. Uma das chaves desse avanço foi o uso de géis de poliacrilamida para separar por tamanhos produtos sintetizados pela DNA polimerase, publicado

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em 1975 por Sanger e Coulson 5. Maxam e Gilbert também desenvolveram um método de sequenciamento que utilizava poliacrilamida, mas o princípio de geração dos produtos era totalmente diverso do de Sanger e Coulson, e se baseava em um processo químico para clivar fragmentos de DNA. A técnica se revelou muito laboriosa e complexa, sobretudo quando comparada à metodologia de Sanger e colaboradores, publicada em 1977, e acabou sendo pouco empregada em anos posteriores. O sequenciamento de Sanger, também denominado de método de terminação de cadeia ou dideóxido, utiliza a enzima DNA polimerase para sintetizar cadeias de DNA de comprimentos variados. O elemento essencial dessa técnica é a inclusão na mistura de reação de dideoxinucleotídeos trifosfatados, os ddNTPs. Nesses dideoxinucleotídeos não há na região 3’ um grupo hidroxila (OH) necessário para formar a ponte fosfodiéster entre um nucleotídeo e o próximo durante a elongação da molécula de DNA (Figura 24.1). Dessa forma, quando um dideoxinucleotídeo é incorporado à cadeia de DNA crescente, há uma parada na extensão da fita. O resultado de múltiplas reações é uma profusão de fragmentos de DNA de comprimentos diversos, que são, então, separados por tamanho em gel ou por um sistema de eletroforese capilar, métodos que utilizam um campo elétrico para que as moléculas de DNA carregadas negativamente se desloquem para o polo positivo de um eletrodo (Figura 24.2). A velocidade à qual um fragmento de DNA se move é inversamente proporcional à sua massa molecular, o que resulta na separação por tamanho dos produtos de extensão. O procedimento é sensível o suficiente para distinguir fragmentos de DNA que diferem por apenas uma base6. A reação de sequenciamento de Sanger inclui: o molde de DNA a ser sequenciado, um oligo de DNA com uma sequência específica para iniciar a reação (primer), os quatro deoxinucleotídeos usuais (dATP, dGTP, dCTP e dTTP), os dideoxinucleotídeos (ddNTPs), a enzima DNA polimerase e um tampão de reação. Na década de 1970, quando a técnica começou a ser utilizada, era preciso realizar quatro reações distintas para sequenciar uma mesma amostra. Cada reação continha um dos quatro dideoxinucleotídeos (ddA, ddC, ddG ou ddT) marcados radioativamente. Durante a elongação da fita, a enzima DNA polimerase adiciona as bases à fita de DNA crescente que é complementar ao molde. Se um deoxinucleotídeo (dNTP) ou um dideoxinucleotídeo (ddNTP) será adicionado depende da concentração dessas moléculas na mistura de reação. Quando um dNTP é adicionado à extremidade 3’, a extensão da cadeia prossegue. Entretanto, quando um ddNTP é adicionado, há parada da elongação da molécula. Como resultado, obtêm-se fragmentos de DNA de tamanhos diferentes. Cada uma das quatro

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3 FUNDAMENTOS E APLICAÇÕES

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Biotecnologia Aplicada à Saúde - Vol. 3 Fundamentos e Aplicações Rodrigo R. Resende ISBN: 9788521209676 Páginas: 1096 Formato: 17 x 24 cm Ano de Publicação: 2016 Peso: 1.687 kg