Page 1

УДК 580.027.2:633.88 О.З. Яремчук Тернопільський національний педагогічний університет імені Володимира Гнатюка

Застосування клонального мікророзмноження in vitro для збереження та відтворення ресурсів рідкісного лікарського виду Gentiana lutea L. Незважаючи на досягнення сучасної науки, основним джерелом для отримання лікувальних і профілактичних засобів продовжують залишатись лікарські рослини. У світовій практиці близько 40% усіх лікарських препаратів виготовляють з рослинної сировини [Мамчур, 1986]. Її використання не тільки залишається стабільним, а й має тенденцію до збільшення. Для медичної практики важливе значення має не тільки загальне збільшення об'єму заготівель лікарської сировини, але й збільшення збору сировини певних видів, які широко застосовуються у фармацевтичній промисловості. Масова заготівля таких видів призводить до швидкого спустошення їхніх екотопів, зниження внутрішньовидової мінливості популяцій і, зрештою, до загрози зникнення цих видів. Одним із методів, який сприятиме збереженню генофонду цінних лікарських рослин, до яких відносяться й види роду Gentiana L., є клональне мікророзмноження. Порівняно з традиційними методами розмноження, що використовуються в сільськогосподарській практиці, клональне розмноження в культурі in vitro має такі переваги: коефіцієнт розмноження в останньому випадку набагато вищий, ніж при звичайних методах розмноження; ріст рослин можна підтримувати протягом цілого року. Метод розмноження in vitro економічно вигідний: тисячі рослин можуть рости на відносно невеликій лабораторній площі; одночасно з розмноженням часто відбувається й оздоровлення рослин від вірусів і патогенних мікроорганізмів; методом культури тканин можна розмножувати рослини, які важко або зовсім не розмножуються вегетативно [Катаева, Аветисов, 1981]. В Україні рід Gentiana представлений 10 видами: 8 багаторічними – G. acaulis L., G. аsсlepiadea L., G. cruciata L., G. laciniata Kit. ex Kanitz., G. lutea L., G. pneumonanthe L., G punctata L., G. verna L. [Драпайло, 1995; Определитель…, 1987], і 2 однорічними – G. nivalis L. [Кардаш, 1991] та G. utriculosa L. [Загульський, Чорней, 2004], з яких здавна у неофіційної медицини використовували 4 види (G. аsсlepiadea, G. pneumonanthe,


2

G. punctata, – Gcruciata L.), а у традиційній медицині до останнього часу широко застосовувався лише тирлич жовтий — Gentiana lutea. Однак, проведений хімічний аналіз речовин, виділених з надземної та підземної частин видів G. аsсlepiadea, G. pneumonanthe, G. punctata, G. cruciata, показав, що за хімічним складом вони подібні до тирличу жовтого. Кількість біологічно активних речовин, що синтезуються в коренях і кореневищі цих видів менша, порівняно з G. lutea, однак їх можна використовувати в офіційній медицині як замінники сировини тирличу жовтого [Китанов и др., 1991; Лебеда та ін., 1992], популяції якого майже знищенні на території Карпатських гір [Кишко, 1998]. П’ять видів роду занесені до Червоної книги України: G. lutea, G. punctata належать до зникаючих видів, G. acaulis, G. laciniata, G. verna – до вразливих, які у майбутньому можуть бути віднесені до категорії зникаючих [Червона книга України, 1996]. Зважаючи на обмежений ареал і малу чисельність популяцій, потребують занесення до Червоної книги України також G. nivalis і G. utriculosa. Згідно з літературними даними, види роду Gentiana – G. lutea, G аslepiadea, G. punctata – здебільшого поширені в Карпатах, а також є характерними для флор Закарпаття та Прикарпаття; G. аsсlepiadea, G. cruciata, G. pneumonanthe трапляються у Львівській області; G. cruciata, G. pneumonanthe – у Хмельницькій області. Для Тернопільської області наводиться лише вид G. cruciata [Шиян (Драпайло), 1993]. Складна біологія розмноження і розвитку тирличів робить неможливим достатнє відновлення їх природних запасів і перешкоджає вирощуванню в культурі. Культура рослинних тканин в цьому випадку відкриває нові можливості для отримання первинного культиваційного матеріалу, масового мікророзмноження, оздоровлення, створення колекції різних видів тирличів in vitro і ex situ, після адаптації до нестерильних умов. Введення у культуру in vitro видів роду Тирлич і застосування методів мікроклонального розмноження дозволить зменшити антропогенний пресинг на рослинні угруповання тирличу жовтого та реінтродукувати його знищенні популяції. Відомо, що основними факторами, які впливають на процес мікроклонального розмноження, є тип експланту, склад поживних середовищ і умови культивування [Dodds & Roberts, 1985]. І тому з метою відпрацювання умов для мікроклонального розмноження використовувалися 1-1,5 місячні асептичні проростки G. lutea довжиною 20-25 мм, отримані з насіння рослин рівненської (пол. Рівна, 1400 м н.р.м.) та пожижевської (г. Пожижевська, 1420 м н.р.м.) популяцій. Проростки висаджували на середовище Мурасiге-Скуга (МС) [Murashige, Skoog, 1962] з половинним вмістом макро- і мікросолей (МС/2) та середовище МС/2 з подвійним вмістом СаCl2, рН 5,5 (МС/2мод). Введення у склад поживного середовища підвищених


3

концентрацій солей Са2+ та зменшення показників рН середовища (у середовищі МС рН становить 5,7) обумовлені кальцефільними властивостями виду та його здатністю зростати як на лужних, так і на кислих ґрунтах. Для дослідження впливу регуляторів росту на процес мікроклонального розмноження тестували приведене вище середовище МС/2 мод, доповнене комбінаціями різних концентрацій 6-бензиламінопурину — БАП (0,001-0,05 мг/л) і кінетину — Кін (0,001-0,1 мг/л) (табл. 1); Кін (0,001-1,0 мг/л), гіберелової кислоти — ГК3 (0,1 мг/л) і нафтилоцтової кислоти — НОК (0,010,1 мг/л) (табл. 2); БАП (0,001-0,05 мг/л), Кін (0,001-0,05мг/л) і НОК (0,01-0,1 мг/л) (табл. 3). Таблиця 1. Вплив різних комбінацій концентрацій фітогормонів Кін та БАП у середовищі МС/2мод на мікроклональне розмноження тирличу жовтого БАП, мг/л 0,001 0,01 0,05

Кін, мг/л 0,001 – – МК, АЗ

0,01 МК – МК

0,05 МК Р АЗ

0,1 АЗ – МК Таблиця 2.

Вплив різних комбінацій концентрацій фітогормонів Кін, НОК та ГК3 у середовищі МС/2мод на мікроклональне розмноження тирличу жовтого Фітогормони НОК, мг/л 0,01 0,1

Кін, мг/л ГК3, мг/л

0,001 0,1 КОР КОР

0,01 0,1 КОР АЗ

0,05 0,1 КОР АЗ

0,1 0,1 – АЗ

1,0 0,1 АЗ – Таблиця 3.

Вплив різних комбінацій концентрацій фітогормонів Кін, НОК та БАП у середовищі МС/2мод на мікроклональне розмноження тирличу жовтого Фітогормони БАП, мг/л 0,05 0,05 0,001 НОК, мг/л Кін, мг/л 0,001 0,05 0,05 0 Р МК, АЗ Р 0,01 КОР, Р КОР, Р КОР, Р 0,05 – КОР, – АЗ 0,1 КОР, Р КОР, – КОР – – мікроклональне розмноження не спостерігається, ріст проростків гальмується; МК – спостерігається мікроклональне розмноження; АЗ – відбуваються аномальні зміни пагонів (з трьома листками, що відходять від одного вузла); Р – спостерігається нормальний ріст пагонів; КОР – спостерігається утворення коренів.


4

Встановлено, що введення у склад живильного середовища ауксину — НОК у концентрації 0,01 мг/л та ГК3 у концентрації 0,1 мг/л приводило до вкорінення проростків. Збільшення концентрації НОК у живильному середовищі до 0,1 мг/л призводило до аномальних змін пагонів (табл. 2). Отже, підвищення концентрації НОК було причиною пригнічення ростових процесів гібереловою кислотою, оскільки відомо, що результат від внесення гіберелової кислоти у середовище залежить від балансу ауксинів у тканинах і середовищі культивування [Калинин и др., 1980]. При заміні ГК 3 на БАП (0,001-0,05 мг/л), НОК в концентрації 0,1 мг/л стимулює утворення коренів. У кожному варіанті досліду тестували 8-10 проростків. Оцінку ефективності мікроклонального розмноження проводили через 1-2 місяці, визначаючи кількість проростків з мікроклонами та середню кількість мікроклонів на проростках. Найбільш оптимальним для мікроклонального розмноження рослин G. lutea з рівненської популяції є середовище МС/2 мод, доповнене 0,05 мг/л БАП та 0,1 мг/л Кін, для рослин з пожижевської популяції – МС/2, 0,05 мг/л БАП+ 0,1 мг/л Кін (табл. 4). Середня кількість мікроклонів у розрахунку на один живець складала 4-5 і 6-8 штук, відповідно. Таблиця 4. Мікроклональне розмноження G. lutea Живильне середовище Вид

Місце знаходження

МС/2мод, 0,05 мг/л БАП+ 0,1 мг/л Кін

МС/2, 0,05 мг/л БАП+ 0,1 мг/л Кін

МС/2мод, 0,5 мг/л БАП+ 0,1 м/л Кін

МС/2, 0,2 мг/л БАП+ 0,2 м/л Кін

МС/2, 0,5 мг/л БАП+ 0,1 м/л Кін

Кількість адвентивних пагонів G. lutea

Пол. Рівна, 1400 м н.р.м. г. Пожижевська, 1420 м н.р.м

4,250,31

1,500,15

1,850,12

1,160,08

0,460,03

1,200,09

6,500,36

0,900,06

1,850,16

1,340,11

Таким чином, відпрацьовані нами оптимальні умови для мікроклонального розмноження in vitro цінної лікарської рослини — G. lutea — є одним із перспективних способів збереження даного виду. Отримані в результаті мікроклонального розмноження рослини після адаптації до септичних умов можна висаджувати на в природні місця їх зростання, на експозиційні ділянки ботанічних садів, садово-паркових господарств тощо, забезпечуючи таким чином збереження їх генофонду. Список літератури 1. Мамчур Ф. I. Довiдник з фiтотерапiї. – К.: Здоров’я, 1986. – 280 с. 2. Катаева Н. В., Аветисов В. А. Клональное размножение растений в


5

культуре ткани // Культура клеток растений / Под ред. Р. Г. Бутенко. – М.: Наука, 1981. – 168 с. 3. Драпайло Н.М. Рід Gentiana s.l. флори України: Автореф. дис... канд. біол. наук. – К., 1995. – 24 с. 4. Определитель высших растений Украины / Авт. кол.: Д.Н. Доброчаева и др.; Редкол.: Ю.Н. Прокудин /отв. ред./ и др. – К.: Наук. думка, 1987. – 546 с. 5. Кардаш Я.В. Про охорону рідкісних та ендемічних видів флори високогір’я Свидівця в Українських Карпатах // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. – 1991. – Вип. 21. Біотичні ресурси Розточчя і Зовнішніх Карпат та їх антропогенні зміни. – С. 37–41. 6. Загульський М.М., Чорней І.І. Gentiana utriculosa L. (Gentianaceae Juss.) в Українських Карпатах // Укр. ботан. журн. – 2004. – 61, №2. – С. 79–83. 7. Китанов Г. М., Тхе Ван Д., Асенов И. Изучение химического состава корней Gentiana asclepiadea // Химия природн. соедин. – 1991. – N 3. – С. 425-427. 8. Лебеда А.П., Джуренко Н.І., Ісайкіна О.П. та ін. Лікарські рослини: Енциклопедичний довідник / Відп. ред. А.М. Гродзінський. – К.: В-во “Українська Радянська Енциклопедія” ім. М.П. Бажана, Український виробничо-комерційний центр “Олімп”, 1992. – 544 с. 9. Кишко К.М. Дослідження біоморфології Gentiana asclepiadea L. в Закарпатті // “Наукові записки” Тернопільського державного педагогічного університету ім. Володимира Гнатюка. Серія 4: Біологія, №2;1998. — С. 15-18. 10.Червона книга України. Рослинний світ / Ю.Р. Шеляг-Сосонко та ін. (ред.) – К.: Вид-во “Укр. енциклопедія” ім. М.П. Бажана, 1996. – 608 с. 11.Шиян (Драпайло) Н.М. Еколого-географічні особливості роду Gentiana флори України // Актуальні питання ботаніки та екології: Тези доп. наук. конф. молод. вчен. та спец. (Ялта, 1993 р.) – Ялта. – 1993. – С. 126. 12.Dodds S.H., Roberts L.W. Experiments in plant tissue culture. – Cambridge Univ. Press. – 1985. – P. 113-132. 13.Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. plant. – 1962. – V. 57. – P. 473-497. 14.Калинин Ф. Л., Сарнацкая В. В., Полищук В. Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. – К.: Наук. думка, 1980. – 488 с.

2006 24 zakhystyaremchukp  

http://ecoleague.net/images/pdf/konkursy/zakhyst/works/2006__24_zakhystYaremchukP.doc

2006 24 zakhystyaremchukp  

http://ecoleague.net/images/pdf/konkursy/zakhyst/works/2006__24_zakhystYaremchukP.doc

Advertisement