Técnicas Moleculares de diagnóstico en Micrología

DIAGNÓSTICO MOLECULAR El concepto de “diagnóstico molecular” es un término amplio que incluye técnicas de biología molecular en beneficio de la salud humana, detectando y/o cuantificando secuencias genéticas específicas de ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) o proteínas para la detección de enfermedades infecciosas, ya sea de origen vírico, bacteriano o fúngico.

Las técnicas de biología molecular permiten la detección de material genético (Ácidos nucleicos) tanto del DNA como RNA que constituyen la característica inequívoca de especie y sus modificaciones, como mutaciones, deleciones y translocaciones.

La principal explicación a este desarrollo se debe a la dificultad de detectar un patógeno mediante la microbiología clásica. Los largos periodos de crecimiento, las condiciones de cultivo y la obtención de una muestra adecuada son los mayores factores que afectan el diagnóstico microbiológico tradicional.

Largos periodos de crecimiento, en algunos casos hasta de 25 días.

Considerando que las técnicas de biología molecular se basan en la detección de segmentos de ADN, no es necesaria la presencia de un microorganismo viable en la muestra, sino que sólo su material genético.

EN MICROBIOLOGÍA Permiten la detección de porciones de ácidos nucleicos que son específicos de cada microorganismo. Su aplicación surge como una necesidad para poder detectar microorganismos de difícil crecimiento en cultivos o desarrollos tardíos y donde las técnicas serológicas de detección de antígenos (Ag) y anticuerpos (Ac) carecen de suficiente sensibilidad y especificidad diagnóstica.

MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS Dado la gran importancia de los microorganismos para el ser humano, se han desarrollado una serie de metodologías para poder diferenciar un microorganismo de otro. Las cuales se ha basado tradicionalmente en la observación de los síntomas que presentan los hospederos, en la observación macro o microscópica del microorganismo o bien de las estructuras reproductivas de los microorganismos, del desarrollo del patógeno en un medio de cultivo específico, de la tinción producida al aplicar algunos colorantes sobre el tejido infectado, o bien sobre el patógeno y la reacción de un anticuerpo a la presencia de un patógeno.

TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR  Fundamento  Consiste en la separación electroforética de grandes moléculas de DNA inmersas en gel de agarosa, alternando la orientación del campo eléctrico.  El tiempo de activación de cada campo → Pulso  El tiempo de reorientación es D.P. al tamaño de la molécula.

Características o Arma epidemiológica para comparar genéticamente cepas pertenecientes a una misma especie. o Diferenciar cepas pertenecientes a especies distintas. o Requiere una preparación muy elaborada de la muestra y equipamiento especializado.

sus secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla.

Extensión del cebador (72°C) : la temperatura de la reacción se eleva para que la Taq polimerasa extienda los cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN.

“En cada ciclo de reacción se duplica la cantidad de material genético presente en la muestra”

Características o Alta sensibilidad y especificidad. o Producto final: ácido nucleico de doble cadena. o El producto final puede ser analizado en tamaño, secuencia y cantidad. o Útil para la búsqueda de material genético de un agente infeccioso en una muestra clínica. o Útil para la identificación de aislamientos.

Es una técnica para hacer muchas copias de una determinada región de ADN in vitro (en un tubo de ensayo en lugar de un organismo).

La reacción se somete repetidamente a un ciclo de cambios de temperatura que permiten la producción de muchas copias de la región blanca.

Fundamento  Desnaturalización (94°C): la reacción se calienta bastante para separar, o desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto proporciona los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso.  Alineación del cebador (54°C): la reacción se enfría para que los cebadores puedan unirse a

Técnica que emplea marcadores moleculares para amplificación por RCP de secuencias cortas de ADN polimórfico empleando un cebador de secuencia corta (10 a 12 pares de bases –pb).

Fundamento  Similar a la de PCR, pero utiliza Cebadores aleatorios para la amplificación arbitraria del ADN.  Los fragmentos de DNA generados se separan mediante electroforesis en gel de agarosa.  Se obtienen patrones y mediante comparación permite la identificación de patógenos.

Análisis en muestras para detectar la presencia de ácidos nucleicos (ADN o ARN), realizando una combinación anti paralela de estas con una molécula de doble cadena. Sus técnicas se utilizan para detectar una molécula diana partiendo de una sonda complementaria a ella.

Características o Aplicación en estudios epidemiológicos. o Útil para la comparación de aislamientos pertenecientes a una misma especie. o Útil para discriminar entre variedades y aislamientos de patógenos.

Fundamento  Formación de moléculas de doble cadena, cuyas hebras tienen distinto origen.  Requieren dos elementos básicos: o La secuencia diana de ácido nucleico. o Fragmento corto de ácido nucleico conocido como sonda.

Método comúnmente empleado por su rapidez en la obtención del resultado, bajo costo y especificidad.

Fundamento  Utilización de restrictasas que rompen el DNA en dianas o secuencias específicas.  La molécula de ADN es digerida en diferentes sitios y da lugar a fragmentos de diferente longitud, que dan lugar a Patrones de restricción.

Características o Utilizada para generar patrones electroforéticos (marcadores genéticos) de aislamientos pertenecientes a una misma especie o a especies diferentes. o Utilidad en Epidemiología molecular.

Características o Encontramos diferentes tipos, siendo las más comunes:  Southern blot  Dot blot. o El Southern blot permite la transferencia de fragmentos de ADN originados por endonucleasas de restricción y posterior hibridación con una sonda marcada, permitiendo la comparación de patrones genéticos. o El Dot blot permite la detección cualitativa de una agente infeccioso en muestra de sangre, heces, esputos, etc.

Determina la secuencia completa de ADN en el genoma de una persona; consiste en determinar el orden de las bases Adenina, Citosina, Guanina y Timina en un fragmento de ADN. Con esta técnica

se logra obtener secuencias hasta 500 bases aproximadamente, estas son ensambladas a un genoma de referencia que secuencia un genoma completo.

de ácidos nucleicos, con lo cual las probabilidades de obtener falsos negativo se incrementan.

Establece el orden de los nucleótidos presentes en las moléculas de ADN o ARN a estudiar. Tiene alta aplicación en estudios epidemiológicos gracias a las ventajas ofrecidas por este tipo de métodos como es el uso de genomas completos para establecimiento de relaciones filogenéticas entre especies, identificación de posibles recombinaciones y marcadores epidemiológicos.

Secuencia por la síntesis de ADN con detección en tiempo real, usada para la identificación de bases individuales o secuencias cortas de ácidos nucleicos en posiciones predeterminada a través del uso de fosfato durante a incorporación de los nucleótidos de la cadena de ADN seguido de una serie de reacciones enzimáticas.

Además es simple, robusta, rápida, sensible, altamente cuantitativa y precisa, flexible, costo efectiva y tiene la capacidad de automatización de la muestra

(unión de un microorganismo a un soporte sólido utilizando un anticuerpo y una posterior amplificación de ADN por PCR). Es una técnica que combina las ventajas de las técnicas inmunológicas (ELISA) y de las técnicas moleculares (PCR) para que las ventajas combinadas, disminuyan o eliminen las desventajas de ambas técnicas.

Estas técnicas se desarrollaron a partir del conocimiento de que dos cadenas sencillas de ácido nucleico que tengan secuencias complementarias se pueden unir o hibridar para formar una cadena doble. Las cadenas sencillas pueden ser de ADN o ARN, o bien una de ADN y otra de ARN.

En esta técnica la muestra a analizar se aplasta contra un soporte sólido originando una huella, la muestra se fija utilizando alcohol o exponiéndola a UV. Se hibridiza con la sonda específica para el microorganismo en cuestión.

Tiene la ventaja de ser una técnica rápida, que puede ser utilizada en campo o fuera de laboratorio. Sin embargo es una técnica sucia, lo cual a veces no permite distinguir una hibridación

(similar a la anterior, en este caso el soporte es una esfera magnética, la cual es removida de la muestra con un magneto y posteriormente se realiza la PCR). En esta técnica un anticuerpo primario se encuentra unido a perlas metálicas las cuales se colocan dentro de la muestra a analizar, se deja incubar para la unión antígeno-anticuerpo, posteriormente se extraen estas perlas metálicas con una magneto, se lavan y se colocan en un tubo en el cual se realiza la PCR.

Esta técnica se ha utilizado para la detección de Listeria monocytogenes en alimentos.

CONDICIONES INDISPENSABLES PARA

LLEVAR A CABO LA REALIZACIÓN DE ESTÁS TÉCNICAS.

Uno de los problemas de las técnicas de PCR discutidas anteriormente es que solo permiten la identificación de un solo patógeno a la vez. Con la finalidad de solucionar este problema se ha diseñado la técnica conocida como PCRmúltiple la cual permite la detección de diferentes moléculas o microorganismo de interés en una sola reacción.

En esta técnica se incorporan a la reacción un par de iniciadores por cada uno de las moléculas o microorganismos a detectar, lo cual permite un ahorro en tiempo y costo para la detección de diferentes microorganismos simultáneamente.

A. Muestra clínica adecuada: consultar en todos los casos al laboratorio, tipo de muestra, conservación y transporte necesario para cada determinación en particular por ser cada una de estas dependientes de la patología, estructura y distancia en cada situación. El concepto universal es que el recipiente debe ser nuevo y estéril.

B. Laboratorio con estructura apropiada: tiene que constar de 2 o 3 áreas separadas y aisladas, cada uno con sus propios materiales para trabajar y estar instaladas en un sector con escasa circulación de personal, equipamiento adecuado, materiales calibrados, esterilizados y que sistemas de bioseguridad adecuados.

C. Personal capacitado: el flujo de circulación del personal y la muestra, el uso adecuado de materiales y procedimientos, conjuntamente con la interpretación correcta de resultados permiten evitar el principal inconveniente de estas técnicas, que son los resultados falsos positivos por contaminación.

VENTAJAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES ●

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La utilización de iniciadores que reconocen una secuencia única elegida de cada microorganismo, le confiere su gran especificidad.

Rapidez: se puede identificar un microorganismo en menos de 24 horas.

La característica de detectar AN en vez de viabilidad del microorganismo permite su realización en una gran variedad de muestras.

Especificidad: pueden detectar solo la molécula o microorganismo de interés.

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Sensibilidad: son capaces de detectar la presencia de un solo microorganismo.

El uso de técnicas moleculares ha permitido identificar nuevos microorganismos, los cuales no había sido posible su cultivo e identificación por técnicas tradicionales (Jan y LeBorgne, 2001).

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Se requiere de personal altamente capacitado para el desarrollo de las pruebas de identificación.

El alto costo de las técnicas moleculares tenderá a bajar a medida que se incremente el uso de estas técnicas.

DESVENTAJAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES. ●

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La probabilidad de resultados falsos positivos por contaminación con productos de amplificados anteriores "amplicaciones", hace necesario una cuidadosa evaluación de resultados.

No permite el aislamiento del microorganismo para la posterior detección de resistencia.

Probabilidad de falsos negativos por la presencia de inhibidores o inconvenientes en los diferentes pasos de las técnicas, aunque esto se puede controlar con la incorporación de controles internos.

No distinguen entre organismos vivos y muertos, aunque algunas veces esto no es precisamente una desventaja en el caso de Staphylococcus aureus la bacteria muere a temperaturas que no degradan la toxina así la detección de la bacteria muerta es un indicativo de la presencia de toxinas en la muestra.

CONCLUSIONES Las técnicas empleadas en la investigación con fundamento molecular, han permitido un avance significativo en la investigación.

Son aplicadas para el conocimiento de características genotípicas de comunidades bacterianas en diferentes ambientes como el ambiental, veterinario y humano, y generado conocimiento sobre el comportamiento epidemiológico y los cambios que las poblaciones principalmente bacterianas han desarrollado como mecanismo de defensa y/o adaptación a sus condiciones de hábitat.

Hoy el uso de técnicas moleculares permite el estudio de un genoma completo o secuencias específicas de ADN de secuencias largas o cortas con el fin de detectar y analizar secuencias de interés para la investigación.

Cada método se caracteriza por la confiabilidad y rapidez en la obtención del resultado, robustez, especificidad, sensibilidad y flexibilidad.