Chiết xuất, phân lập một số hợp chất và thăm dò tác dụng hạ acid uric của lá Sa kê

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

m

Q uy

N

NGUYỄN THỊ THÚY AN

hơ

n

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT VÀ THĂM DÒ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC CỦA LÁ SA KÊ (Artocarpus communis J. R. Forster & G. Forster)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2016

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

hơ

n

NGUYỄN THỊ THÚY AN

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT VÀ THĂM DÒ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC CỦA LÁ SA KÊ (Artocarpus communis J. R. Forster & G. Forster)

e.

co

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

MÃ SỐ 60720406

G

oo

gl

CHUYÊN NGÀNH DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thái An

HÀ NỘI 2016

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, động viên và giúp đỡ tận tình từ các thầy cô, gia đình và bạn bè. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS. TS. Nguyễn Thái An người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện

n

thuận lợi để tôi có thể hoàn thành luận văn.

hơ

Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: GS. TS. Thái Nguyễn

N

Hùng Thu đã cho tôi những đóng góp quý báu về đề tài.

Q uy

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Sinh thái & Tài nguyên sinh

m

vật – Viện Hàn lâm khoa học & Công nghệ Việt Nam, Trung tâm Dược lý-

Kè

Dược lâm sàng – Trường Đại học Y Hà Nội, Bộ môn Dược lực – Trường Đại

ạy

học Dược Hà Nội đã hỗ trợ tôi trong quá trình nghiên cứu.

D

Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, cùng toàn thể các

m /+

thầy cô giáo, các cán bộ Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện để tôi có thể lĩnh hội những kiến thức quý giá về ngành Dược trong suốt 7 năm qua.

co

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn

G

oo

gl

e.

sát cánh, động viên tôi hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, ngày 31 tháng 03 năm 2016 Học viên Nguyễn Thị Thuý An

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

MỤC LỤC Trang Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục hình Danh mục bảng 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

3

n

ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1.1. Đặc điểm thực vật của Sa kê

Q uy

1.1.1.1. Tên gọi - Vị trí phân loại của Sa kê 1.1.1.2. Đặc điểm thực vật

m

1.1.1.3. Phân bố sinh thái

Kè

1.1.1.4. Bộ phận dùng

3

N

hơ

1.1. Tổng quan về lá Sa kê

3 4 4 4

1.1.2. Thành phần hóa học của lá Sa kê

6 10 10

1.1.3.2. Tác dụng chống oxy hóa

10

1.1.3.3. Tác dụng chống ung thư

10

1.1.3.4. Tác dụng chống xơ vữa động mạch

11

1.1.3.5. Tác dụng ức chế α-glucosidase

11

1.1.3.6. Tác dụng ức chế men chuyển angiotensin (ACE)

12

1.1.3.7. Tác dụng hạ huyết áp

12

1.1.3.8. Tác dụng cải thiện chức năng thận

13

1.1.3.9. Tác dụng kháng khuẩn

13

1.1.3.10. Tác dụng chống sốt rét

13

1.1.4. Độc tính của lá Sa kê

13

G

gl

e.

co

1.1.3.1. Tác dụng ức chế xanthin oxidase

oo

m /+

1.1.3. Tác dụng dược lý

D

ạy

1.1.1.5. Đặc điểm vi học lá Sa kê

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

14

1.2. Tổng quan về bệnh gút

15

1.2.1. Định nghĩa, phân loại

15

1.2.2. Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh

15

1.2.2.1. Quá trình sinh tổng hợp acid uric

15

1.2.2.2. Cơ chế bệnh sinh của gút theo y học hiện đại

16

1.2.2.3. Nguyên nhân bệnh sinh theo y học cổ truyền

17

n

1.1.5. Công dụng của lá Sa kê

hơ

1.2.3. Thuốc điều trị

N

1.2.3.1. Theo y học hiện đại

Q uy

1.2.3.2. Theo y học cổ truyền

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

17 19

ạy

19 19 20 21

2.3. Phương pháp nghiên cứu

21

2.3.1. Chiết xuất, phân lập các chất trong lá Sa kê

21

2.3.2. Thăm dò tác dụng hạ acid uric

22 22

2.3.2.2. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in

24

gl

e.

2.2.3. Động vật thí nghiệm

co

m /+

19

oo

2.2.2. Thiết bị

D

2.2.1. Hóa chất

Kè

2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.2. Phương tiện nghiên cứu

17

m

CỨU

17

2.3.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh

G

trên mô hình gây tăng acid uric cấp thực nghiệm

vitro 2.3.4.3. Phương pháp xử lý số liê ̣u

25

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

26

3.1. Chiết xuất, phân lập các hợp chất

26

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

26

3.1.1.1. Lấy mẫu và xác định độ ẩm dược liệu

26

3.1.1.2. Chiết xuất

26

3.1.2. Khảo sát sơ bộ thành phần cắn phân đoạn ethylacetat

27

3.1.2.1. Định tính cắn ethylacetat bằng phản ứng hóa học

27

3.1.2.2. Định tính cắn ethylacetat bằng sắc kí lớp mỏng

31

3.1.3. Phân lập

32

n

3.1.1. Chiết xuất

Q uy

3.1.4. Nhận dạng các chất phân lập 3.1.4.1. Hợp chất AR1

Kè

m

3.1.4.2. Hợp chất AR2

N

3.1.3.2. Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập

hơ

3.1.3.1. Phân lập

3.1.4.3. Hợp chất AR3

32 34 36 36 39 42 44

3.2.1. Chuẩn bị mẫu thử

44

D

ạy

3.2. Thăm dò tác dụng điều trị gút của lá Sa kê

m /+

3.2.2. Đánh giá khả năng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình gây

44

tăng cấp acid uric bằng kalioxonat tiêm màng bụng 44

3.2.2.2. Thăm dò với mẫu thử ở liều cao hơn

45

3.2.3. Đánh giá khả năng ức chế enzym xanthin oxidase của mẫu

46

oo

gl

e.

co

3.2.2.1. Thăm dò với mẫu thử ở liều thấp

thử

48

KẾT LUẬN

52

KIẾN NGHỊ

53

TÀI LIỆU THAM KHẢO

54

G

CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN

PHỤ LỤC

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ACE

Angiotensin converting enzym

AR

Cắn toàn phần

AR-C

Cắn chloroform

AR-E

Cắn ethyl acetat

AR-H

Cắn n-hexan

AR-W

Cắn nước

13

Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

hơ

C-NMR

n

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

EC50

Half maximal Effective Concentration

ESI-MS

Eletrospray Ionization Mass Spectroscopy

EtOAc

Ethylacetat

GF254

Gypsum fluorescent 254nm

HGPRTase

Hypoxanthin Guanin Phosphoribosyl Transferase

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Correlation

1

Proton Nuclear Magnetic Resonance

Q uy

ạy

Kè

m

HSQC

Hetoronuclear Single Quantum Coherence

gl

e.

Half maximal Inhibitory Concentration

oo

KHV

D

m /+

co

H-NMR

IC50

N

DEPT

G

LDL

Kính hiển vi Low Density Lipoprotein

MIC

Minimum Inhibitory Concentration

MS

Mass Spectroscopy

OECD

Organization for Economic Co-operation and Development

PC50

Half maximal penetration concentration

PRPP

Phosphoribosyl pyrophosphate

Rf

Retardation Factor

SKC

Sắc ký cột

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Sắc ký lớp mỏng

TT

Thuốc thử

UV254nm

Ultra Violet 254nm

UV365nm

Ultra Violet 365nm

XO

Xanthin oxidase

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

SKLM

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Trang

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các hợp chất flavonoid phân lập từ lá Sa kê

7

Bảng 2.1. Bố trí hỗn hợp phản ứng trong từng giếng

24

Bảng 3.1. Khối lượng các cắn phân đoạn từ dịch chiết Methanol lá

28

Sa kê Bảng 3.2. Kết quả định tính cắn ethyl acetat bằng phản ứng hóa

30

N

Bảng 3.4. Kết quả SKLM của AR2 với 3 hệ dung môi

hơ

Bảng 3.3. Kết quả SKLM của AR1 với 3 hệ dung môi

n

học 34 35 36

Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của AR1 (1)

38

Kè

m

Bảng 3.7. Dữ liệu phổ NMR của AR2 (2)

Q uy

Bảng 3.5. Kết quả SKLM của AR3 với 3 hệ dung môi

40 42

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của dịch chiết nước Sa kê lên nồng độ acid

44

ạy

Bảng 3.8. Dữ liệu phổ NMR của AR3 (3)

D

uric trong máu chuột

45

Bảng 3.11. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro của cao

46

co

nước

m /+

Bảng 3.10. Kết quả thử nghiệm với dịch chiết nước lá Sa kê liều cao

gl

e.

Bảng 3.12. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro của dịch

G

oo

chiết methanol lá Sa kê

47

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Trang

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Ảnh vi phẫu lá cây Sa kê

5

Hình 1.2. Ảnh một số đặc điểm bột lá Sa kê

6 14

Hình 2.1. Cây Sa kê tại quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

19

Hình 2.2. Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng hạ acid uric máu

23

hơ

trên mô hình gây tăng cấp bằng kali oxonat

n

Hình 1.3. Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể

N

Hình 2.3. Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế xanthin

Q uy

oxidase

25

27

Hình 3.2. Sắc ký đồ của cắn ethylacetat khai triển với hệ I ở các

32

m

Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá Sa kê.

Kè

điều kiện quan sát

33

Hình 3.4. Sắc kí đồ của AR1

34 35

Hình 3.6. Sắc kí đồ của AR3

36

Hình 3.7. Ảnh tinh thể của AR1 dưới KHV vật kính 10 và 40.

37

Hình 3.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất AR1 (1)

39

Hình 3.9. Sản phẩm AR2 phân lập được

39

Hình 3.10. Cấu trúc hóa học của hợp chất AR2 (2)

41

Hình 3.11. Sản phẩm AR3 phân lập được.

42

Hình 3.12. Cấu trúc hóa học của hợp chất AR3 (3)

43

G

gl

e.

co

m /+

Hình 3.5. Sắc kí đồ của AR2

oo

D

ạy

Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethylacetat.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, cùng với sự phát triển của tổng hợp hóa dược, công tác nghiên cứu, phát triển thuốc và sản phẩm có nguồn gốc cây cỏ đang là vấn đề thu hút sự quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới. Với các thuốc có nguồn gốc hóa dược, dù có những ưu điểm nổi bật như hiệu quả điều trị, dễ sản xuất, dễ sử dụng và bảo quản, thì hạn chế lớn nhất là tác dụng phụ của thuốc và tính kháng

n

thuốc khi sử dụng trong thời gian dài. Việc tìm kiếm các loại thuốc có nguồn

N

đặc biệt của các nhà hoá sinh và y dược trên thế giới.

hơ

gốc từ thảo dược thiên nhiên có thể khắc phục được bất lợi đó là mối quan tâm

Q uy

Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, với điều kiện tự nhiên đa dạng, Việt Nam là một trong những quốc gia trên thế giới có mức độ đa dạng sinh

m

học cao, nhiều loài thực vật đã được các cộng đồng dân tộc sử dụng trong chăm

Kè

sóc sức khỏe, phòng và trị bệnh. Tuy nhiên phần lớn nguồn tài nguyên này đang

ạy

được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian mà chưa được nghiên cứu đầy đủ về

D

liều lượng, tác dụng, hiệu quả điều trị.

m /+

Cây Sa kê có tên khoa học là Artocarpus communis J. R. Forst. & G. Forst (tên đồng nghĩa là Artocarpus altilis (Park.) Fosberg) thuộc họ Dâu tằm

co

(Moraceae) [14]. Cây Sa kê là loài cây quen thuộc ở miền Nam Việt Nam. Quả

e.

của cây Sa kê được sử dụng phổ biến làm thực phẩm với nhiều cách chế biến

oo

gl

khác nhau [12]. Ở nước ta, dân gian dùng lá Sa kê không chỉ để chữa phù thũng, tăng huyết áp, trị tiêu chảy, tiểu đường hoặc dùng ngoài chữa mụn rộp, đinh

G

nhọt, áp xe [12] mà còn được dùng đơn độc hoặc phối hợp với một số vị thuốc khác để trị gút [2], [15].

Năm 2013 - 2015, nhóm nghiên cứu tại trường Đại học Dược Hà Nội đã khảo sát đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của lá Sa kê và bước đầu đã phân lập được một số hợp chất. Nhằm tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của lá Sa kê cũng như đánh giá được kinh nghiệm sử dụng lá Sa kê để điểu trị gút, đề tài “Chiết xuất, phân lập một số hợp chất và thăm dò 1

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

tác dụng hạ acid uric của lá Sa kê (Artocarpus communis J. R. Forster & G. Forster)” được thực hiện với các mục tiêu sau:  Chiết xuất, phân lập 2-3 hợp chất từ lá Sa kê; nhận dạng chất phân lập được dựa trên dữ liệu các phổ.  Thăm dò tác dụng hạ acid uric của lá Sa kê. Để thực hiện các mục tiêu đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung

hơ

1. Chiết xuất và phân lập các chất trong lá Sa kê

n

sau:

N

- Định tính cắn phân đoạn ethylacetat bằng phản ứng hóa học và SKLM.

Q uy

- Phân lập một số hợp chất trong phân đoạn ethylacetat.

- Nhận dạng các chất phân lập được từ dữ liệu phổ.

m

2. Thăm dò tác dụng hạ acid uric của lá Sa kê trên 2 mô hình:

Kè

- Nghiên cứu khả năng hạ acid uric huyết thanh của mẫu thử trên mô

ạy

hình gây tăng cấp acid uric bằng kali oxonat tiêm màng bụng.

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

- Nghiên cứu khả năng ức chế enzym xanthin oxidase của mẫu thử.

.

2

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.3. Tổng quan về cây Sa kê 1.3.1. Đặc điểm thực vật của cây Sa kê 1.3.1.1. Tên gọi - Vị trí phân loại của Sa kê Tên khoa học: Artocarpus communis J. R. Forster & G. Forster [58].

n

Tên đồng nghĩa: Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg [58],

hơ

Artocarpus incisus (Thunberg) L. [58]

N

Tên nước ngoài: Breadfruit, Breadnut (Anh); A Pain (Pháp) [11], [14].

Q uy

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [58], chi Artocarpus J. R. Forst. & G. Forst được phân loại như sau:

Kè

m

Ngành Magnoliophyta (Ngọc lan) Lớp Magnoliopsida (Ngọc lan)

ạy

Phân lớp Dilleniidae (Sổ)

D

Bộ Urticales (Gai)

co

m /+

Họ Moraceae (Dâu tằm) Tông Artocarpeae (Mít) Chi Artocarpus J.R.Forst. & G.Forst

gl

e.

1.3.1.2. Đặc điểm thực vật

oo

Sa kê là cây gỗ lớn, có nhựa mủ trắng, có thân to, cao 12-15m [14], [58].

G

Thân có đường kính khoảng 90cm [11]. Cành có đường kính 0,5-1,5cm [58].

Lá mọc so le, rất rộng, hình trái xoan, thuôn, phủ nhiều lông ráp, có lá

kèm [5], [6], [58]. Lá non nguyên, sau đó xẻ lông chim, chia nhiều thùy thuôn nhọn, màu lục đậm ở mặt trên, dài từ 80cm đến 1m và rộng tới 10-50cm, cuống lá 8-12cm [14], [58]. Lá kèm rụng sớm, dài 12-13cm [8], [58].

Hoa đơn tính cùng gốc. Cụm hoa đực có hình chùy, 7-30cm và chỉ có một nhị [5], [14], [58]. Hoa đực có đài hình ống, thùy hình mũi mác, bao phấn hình elip [58]. Cụm hoa cái hình cầu, có khi hình ống [58]. Quả kép, gần như 3

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

tròn hoặc hơi hình trứng, có đường kính 15-30 x 8-15cm, vỏ màu xanh lục nhạt hay vàng nhạt, có gai tù, thịt quả rất nạc và trắng, chứa nhiều bột [6], [14], [58].

Quả mọc thành chùm vài ba quả không có hạt nhưng cũng có những quả có hạt chìm ngập trong thịt quả [11]. Hạt to 1cm [5], màu vàng nhạt [14].

1.3.1.3. Phân bố sinh thái Sa kê có nguồn gốc từ các đảo phía nam Thái Bình Dương, châu Đại

n

Dương. Hiện đã được di thực vào khu vực Đông Nam Á [11]. Ở nước ta, Sa kê

hơ

được trồng phổ biến tại các tỉnh phía nam, trong các vườn, công viên…[5],

N

[11].

Q uy

Sa kê là cây ưa sáng, ưa khí hậu nhiệt đới nóng - ẩm, nhiệt độ trung bình 23-30oC. Cây có thể chịu được thời tiết nắng nóng đến 40oC; lượng mưa 2000-

m

3000mm/năm và độ ẩm trung bình 70-90%. Sa kê sinh trưởng phát triển kém ở

ạy

Cây con ưa bóng và ưa ẩm [14].

Kè

những vùng có nhiệt độ trung bình dưới 20oC hoặc có mùa đông lạnh kéo dài.

D

Hoa Sa kê được thụ phấn nhờ gió hoặc côn trùng, số hoa cái đậu quả

m /+

thường 75%. Cây mọc từ hạt sau 4-5 năm bắt đầu có hoa quả, vào những năm sau sẽ cho nhiều quả hơn. Từ gốc cây mẹ hàng năm mọc ra nhiều chồi rễ. Cây

co

trồng từ chồi rễ sẽ nhanh cho thu hoạch hơn cây trồng từ hạt [14].

e.

1.3.1.4. Bộ phận dùng

oo

gl

Quả chín được dùng như thực phẩm [6] hay quả chưa chín thái thành lát,

G

sau đó phơi hoặc sấy khô [11].

Vỏ cây, rễ cây, nhựa cây và lá được sử dụng để làm thuốc [5].

1.3.1.5. Đặc điểm vi học lá Sa kê Lá Sa kê có đặc điểm vi học như sau: 1.3.1.5.1. Đặc điểm vi phẫu lá Trên tiêu bản vi phẫu lá (hình 1.1): Phần gân lá: Mặt trên và mặt dưới đều lồi, tuy nhiên mặt trên lồi nhiều hơn. Tế bào biểu bì (1) gồm nhiều tế bào hình chữ nhật, có một số tế bào biến 4

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

thành lông che chở đơn bào (6). Mô dày (2) được cấu tạo bởi các tế bào hình trứng có thành dày, mặt trên có nhiều lớp tế bào hơn mặt dưới. Mô mềm (3) gồm các tế bào thành mỏng, hình tròn. Các bó mạch nằm trong khối mô mềm, phân bố thành hai phần: phần ngoài tạo thành vòng cung khép kín, phần trong nằm rải rác tạo thành các cánh cung. Trong mỗi bó mạch, phần libe (4) nằm ở ngoài, phần gỗ (5) ở trong. Ngoài ra, trên cả hai lớp biểu bì đều có nhiều tế bào

n

tiết đặc sắc (7), tinh thể canxi oxalat nằm rải rác ở mô mềm [1].

hơ

Phần phiến lá: Tế bào biểu bì (8) hình chữ nhật, mặt dưới có lông che

N

chở. Mô giậu (9) chiếm một phần tư chiều dày phần thịt lá, gồm 1-3 lớp tế bào

Q uy

chứa nhiều hạt diệp lục. Phía dưới là mô khuyết (10). Mô giậu và mô khuyết bị phân cách thành các phần bởi các mạch dẫn của gân phụ (11). Tinh thể canxi

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

oxalat nằm rải rác trong vùng mô giậu và mô khuyết [1].

Hình 1.1. Ảnh vi phẫu lá cây Sa kê [1]

1. Tế bào biểu bì gân lá

2. Mô dày

6. Lông che chở đơn bào

7. Lông tiết

9. Mô giậu

10. Mô khuyết

5

3. Mô mềm

4. Libe

5. Gỗ

8. Tế bào biểu bì phiến lá 11. Mạch dẫn gân phụ

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

1.1.1.5.2. Đặc điểm bột lá Bột lá có màu xanh lục, mùi thơm, có các đặc điểm (hình 1.2): Lông che chở đơn bào (1). Lông tiết (2). Mảnh biểu bì mang lỗ khí (3).

Tinh thể canxi oxalat hình cầu gai (4). Hạt tinh bột hình tròn đứng riêng rẽ, rốn hạt phân nhánh, vân rõ (5). Mảnh mô mềm (6). Mảnh mô giậu (7). Các mảnh

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

mang màu (8). Các mảnh mạch: mạch xoắn (9), mạch vạch (10). Sợi (11) [1].

D

Hình 1.2. Ảnh một số đặc điểm bột lá Sa kê [1] 2. Lông tiết

m /+

1. Lông che chở đơn bào

4. Tinh thể canxi oxalat hình cầu gai

3. Mảnh biểu bì mang lỗ khí

5. Hạt tinh bột

e.

co

7. Mảnh mô giậu 8. Các mảnh mang màu 10. Mảnh mạch vạch

6. Mảnh mô mềm

9. Mảnh mạch xoắn 11. Sợi

gl

1.3.2. Thành phần hóa học của lá Sa kê

oo

Năm 2014, Nguyễn Thị Thúy An đã tiến hành định tính và xác định sự

G

có mặt của các các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong dược liệu, kết quả cho thấy trong lá Sa kê có chứa các nhóm chất: flavonoid, saponin, anthranoid, tanin, đường khử, acid amin, polysaccharid, sterol [1]. Trong đó, thành phần chính là flavonoid, hàm lượng cao nhất thu được ở lá già vàng sắp rụng [44].

Các hợp chất đã phân lập được từ lá Sa kê gồm có 16 flavonoid, 2 sitosterol, 3 triterpen và một số hợp chất khác.

6

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Flavonoid Các hợp chất phân lập được thuộc nhóm flavonoid chủ yếu có các khung flavon, chalcon và flavanol.

Bảng 1.1. Các hợp chất flavonoid phân lập từ lá Sa kê ST

Tên chất

T

Công thức cấu tạo

hơ

1

n

kaempferol-3-O-α-Lrhamnopyranosid-7-β-D-

TK

[7]

Kè

8-Geranyl-4',5,7trihydroxyflavon

[10] [52]

2′,4′,5-trihydroxy-7-

co

[52]

methoxy-8-prenylflavon

G

oo

gl

e.

3

m /+

D

ạy

2

m

Q uy

N

glucopyranosid

TL

4

artocarpauron

[23]

7

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3[10] [23] [52]

[8-hydroxy-2-methyl-2-(45

methyl-3-pentenyl)-2H-1benzo pyran-5-yl] propan-1on

n hơ

[23] [52]

hydroxy dihydrochalcon

Q uy

N

6

2-geranyl-2’,3,4,4’-tetra

1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-

methyleneoct-6-enyl)-3,4-

[10]

ạy

dihydroxyphenyl)-propan-1-

Kè

7

m

(2-(2-hidroxy-7-

m /+

D

on

1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3(7-

[10]

hydroxybenzofuran-4-

co

8

oo

gl

e.

yl)-propan-1-on

Isolespeol

[20]

G

9

10

5'-geranyl-2',4',4-

[20]

trihydroxychalcon

8

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

11

3,4,2',4'-tetrahydroxy-3'-

[20]

geranyldihydrochalcon

lespeol

[20]

13

xanthoangelol

14

cycloaltilisin 7

15

(±)-sophoraflavanon A

[20]

[10] [23]

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

12

e.

co

m /+

[23]

[23]

trihydroxyflavanon

[52]

gl

2’-geranyl-3’,4’,7-

G

oo

16

Sitosterol: β-sitosterol [52], 3-O-β-D-glucopyranosyl-β-sitosterol [7].

Triterpen: 3β-acetoxycycloart-25-en-24-on, 3β-acetoxy-urs-12-en-11on và 3β-acetoxycycloart-25-methoxy-23-en [23].

Ngoài ra, Phạm Thị Thanh Huệ đã phân lập được một số hợp chất khác gồm: 2-methoxy-4-vinyl phenol, cyclo hexen-2-on, megastigmatrienon, 4,4,7trimethyl-5,6,7,7-tetrahydro-4H-benzofuran-2-on [9].

9

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

1.3.3. Tác dụng dược lý 1.3.3.1. Tác dụng ức chế xanthin oxidase Đái Thị Xuân Trang và cộng sự đã khảo sát khả năng ức chế enzym xanthin oxidase (XO) của cao ethanol lá Sa kê, nhận thấy hoạt tính của enzym XO bị ức chế gần như hoàn toàn (97,96 ± 0,49%) ở nồng độ cao ethanol lá Sa kê 0,5mg/mL, giá trị IC50 là 0,198mg/mL [13].

n

1.3.3.2. Tác dụng chống oxy hóa

hơ

Dịch chiết ethanol của lá Sa kê cho thấy tác dụng chống oxy hóa in vitro,

N

thông qua khả năng dọn gốc DPPH. Tổng phenolic tương ứng với 26,22mg acid

Q uy

gallic/g. Khả năng thu dọn gốc DPPH phụ thuộc vào liều, cao nhất là 70,59% ở nồng độ 200µg/ml [48]. Các hợp chất cyclocommunol, 1-(2,4-

benzo

Kè

m

dihydroxyphenyl)-3-[8-hydroxy-2-methyl-2-(4-methyl-3-pentenyl)-2H-1pyran-5-yl]-1-propanone

và

2-geranyl-2′,3,4,4′-tetrahydroxy

ạy

dihydrochalcone cho thấy khả năng dọn gốc DPPH với giá trị IC50 lần lượt là

D

1548,8 ± 486,8, 275,3 ± 10.0 và 94,1 ± 1,4μM [38]

m /+

1.3.3.3. Tác dụng chống ung thư

Dịch chiết methanol của lá Sa kê cho thấy khả năng gây độc 100% đối

co

với tế bào ung thư tuyến tụy PANC-1 của người ở nồng độ 50µg/ml. Sakenins

e.

F và H phân lập từ dịch chiết là hai chất có khả năng gây độc tế bào PANC-1

oo

gl

mạnh với giá trị PC50 lần lượt là 8,0µM và 11,1µM [34].

Một prenylated flavonoid, 1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-[8-hydroxy-2-

G

methyl-2-(4-methyl-3-pentenyl)-2H-1-benzopyran-5-yl]-1-propanon (1) từ dịch chiết dicloromethan của lá Sa kê cho thấy khả năng gây độc đối với tế bào bạch cầu P-388 ở chuột với mức liều IC50 là 6,7µg/ml [31]. Hợp chất này cũng cho thấy hoạt tính ức chế sự phosphoryl hóa STAT3 – một protein đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển ung thư tuyến tiền liệt. Thử nghiệm trên in vitro, hợp chất (1) ức chế phorphoryl hóa STAT3 phụ thuộc vào liều, với giá trị IC50 là 20µM. Ở nồng độ 50µM, (1) ức chế hoạt động của STAT3 đã phosphoryl 10

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

hóa tối đa trong 6 giờ, làm giảm nồng độ của STAT3 cũng như STAT3 đã phosphoryl hóa trong 24 giờ [24].

Ba geranyl dihydrochalcon được phân lập từ phân đoạn ethylacetat của dịch chiết methanol lá gồm: 1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-{4-hydroxy-6,6,9trimethyl-6a,7,8,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-5-yl}-1-propanon; [6-hydroxyl-3,7-dimethylocta-2(E),7-dienyl]-2’,3,4,4’-tetrahydroxy

2-

dihydro

n

chalcon và 1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-[3,4-dihydro-3,8-dihydroxy-2-methyl-

hơ

2-(4-methyl-3-pentenyl)-2H-1-benzo pyran-5-yl]-1-propanon có khả năng gây

N

độc đối với các dòng tế bào gây ung thư ở người: SPC-A-1 (tế bào ung thư

Q uy

phổi), SW-480 (tế bào ung thư ruột kết) và SMMC-7721 (tế bào ung thư biểu mô gan) [53].

m

Một geranyl chalcon, isolespeol, được phân lập từ phân đoạn

Kè

dicloromethan trong dịch chiết methanol lá cho thấy khả năng ức chế cao đối

ạy

với sự phát triển của tế bào ung thư mô mỡ SW 872 ở giá trị IC50 là 3,8mM.

D

Nghiên cứu cho thấy sự tác động của isolespeol lên tế bào SW 872 là thông qua của tế bào [20].

m /+

việc làm tăng tác động của protein p53 – một protein ảnh hưởng đến sự chết

co

1.3.3.4. Tác dụng chống xơ vữa động mạch

e.

Dịch chiết ethylacetat lá Sa kê cho thấy có tác dụng bảo vệ tế bào đối với

oo

gl

dòng tế bào U937 đang ủ bệnh do LDL bị oxy hóa, in vitro [52]. Trên mô hình chuột có chế độ ăn giàu cholesterol, ở liều 150 và 300mg/kg dùng trong 8 tuần,

G

dịch chiết ethylacetat làm giảm cholesterol máu cũng như ngăn ngừa lắng đọng cholesterol ở động mạch chủ [38].

1.3.3.5. Tác dụng ức chế α-glucosidase Đánh giá tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase cho thấy phân đoạn ethylacetate có hoạt tính mạnh nhất so với các phân đoạn ethanol, n-butanol, và n-hexan với giá trị IC50 lần lượt là 5,98; 6,79; 14,42 và 440,18µg/ml. Bốn hợp chất flavonoid: (1- (2,4-dihydroxyphenyl) -3- [8-hydroxy-2-methyl-2- (411

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

metyl-3-pentenyl) -2H-1-benzopyran-5-yl] -1-propanone (AC-31), 2-geranyl2',3,4,4'-

tetrahydroxy

dihydrochalcone

(AC-51),

8-geranyl-4',

5,7-

trihydroxyflavone (AC-33) và cyclocommunol (AA-3), phân lập từ phân đoạn ethylacetat cũng được đánh giá hoạt tính. AC-31 là hợp chất có tác dụng mạnh nhất so với AC-51, AC-33 và AA-3 với giá trị IC50 là 15,73; 24,41; 49,49 và 72,20µg/mL [32].

n

Thử nghiệm với altilisin H, I, và J (được phân lập từ dịch chiết methanol

hơ

lá Sa kê) cho thấy có tác dụng ức chế α-glucosidase với giá trị IC50 lần lượt là

N

4,9 ± 0,1; 5,4 ± 0,3; 5,1 ± 0,1µM, mức liều thấp hơn nhiều so với acarbose (là

Q uy

một chất ức chế α-glucosidase được sử dụng trong điều trị bệnh tiểu đường, IC50=241,8µM) [33].

m

1.3.3.6. Tác dụng ức chế men chuyển angiotensin (ACE)

Kè

Lá Sa kê được chiết xuất bằng nhiều dung môi khác nhau để tiến hành

ạy

nghiên cứu khả năng ức chế ACE. Trong số các dịch chiết, dịch chiết ethanol

D

nóng cho thấy khả năng ức chế ACE mạnh với giá trị IC50 là 54,08 ± 0,29mg/ml,

m /+

tiếp theo là dịch chiết ethylacetat lạnh với giá trị IC50 là 85,44 ± 0,85mg/ml, dịch chiết nước nóng cho thấy khả năng ức chế ACE kém với giá trị IC50 là

co

765,52 ± 11,97mg/ml. Phân tích thành phần hóa học sơ bộ cho thấy có mối liên

e.

quan giữa khả năng ức chế ACE với các hợp chất glycosid và phenolic có nhiều

oo

gl

trong dịch chiết [47].

G

1.3.3.7. Tác dụng hạ huyết áp Dịch chiết nước của lá Sa kê có tác dụng hạ huyết áp ở chuột phụ thuộc

vào liều, thông qua quản lý hoạt động adrenegic ở tim, kích thích các tế bào nội mô mạch máu và tác dụng chống co thắt trên cơ trơn mạch máu nhờ đối kháng kênh canxi [40].

12

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

1.3.3.8. Tác dụng cải thiện chức năng thận Trên mô hình chuột suy thận do gentamicin và piroxicam, dịch chiết ethanol của lá Sa kê với liều 200mg/kg trong 4 tuần cho thấy khả năng làm giảm nồng độ urê và creatinin huyết thanh cũng như phục hồi cấu trúc thận, gợi ý cho việc sử dụng lá Sa kê trong cải thiện chức năng thận [45].

1.3.3.9. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

n

Lá Sa kê chiết xuất với các dung môi khác nhau: ether dầu hỏa, methanol

hơ

và ethylacetat, được đánh giá hoạt động kháng khuẩn đối với một số loài vi

N

khuẩn gây bệnh như S. aureus, P. aeruginosa, S. mutans và E. faecalis, cho

Q uy

thấy dịch chiết methanol có hoạt tính mạnh nhất. Dịch chiết methanol có giá trị MIC đối với 4 chủng vi khuẩn dao động từ 0,3 đến 0,6mg/ml [42].

m

Dịch chiết methanol của lá Sa kê cũng có khả năng kháng khuẩn, kháng

Kè

nấm mạnh hơn so với dịch chiết nước và dịch chiết ethanol trên các chủng: M.

ạy

luteus, S. aureus, S. viridians, B. cereus, S. typhi, E. coli, V. cholera, K.

m /+

M. racemosus [43].

D

pneumonia, P. aeruginosa, E. aerogenes, P. hauseri, C. albicans, C. krusei,

co

1.3.3.10. Tác dụng chống sốt rét

Dịch chiết ethanol của lá Sa kê có tác dụng kháng ký sinh trùng P.

e.

falciparum với giá trị IC50 bằng 1,32µg/ml. Trên mô hình chuột bị sốt rét bởi

oo

gl

ký sinh trùng P. berghei, dịch chiết ethanol cũng cho thấy tác dụng chống sốt rét với giá trị ED50 bằng 0,82 mg/kg khối lượng cơ thể [22].

G

1.3.4. Độc tính của lá Sa kê Dịch chiết nước và methanol của lá Sa kê được tiến hành thử độc tính cấp theo OECD Guidelines 420. Ở liều dùng 2000mg/kg dùng hàng ngày, đến ngày thứ 14, dịch chiết không gây ra sự thay đổi về hành vi, về các chỉ số sinh hóa, và mô bệnh học ở chuột [46].

13

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

1.3.5. Công dụng của lá Sa kê Lá Sa kê có tác dụng tiêu viêm, tiêu độc, lợi tiểu [14]. Ở nước ta, dân gian dùng lá chữa phù thũng [5], [6], [14], hoặc dùng ngoài chữa mụn rộp, đinh nhọt, áp xe [14]. Lá già sắc hạ huyết áp, trị tiêu chảy, đái đường [14].

Một số bài thuốc có lá Sa kê: ‐ Trị bệnh gút và sỏi thận: 100g lá Sa kê tươi, 100g Dưa leo, 50g Cỏ xước khô.

n

Tất cả nấu nước uống trong ngày [15].

hơ

‐ Trị tiểu đường týp 2: 100g lá Sa kê tươi, 100g trái Đậu bắp tươi, 50g lá Ổi

N

non, nấu nước uống trong ngày [15].

Q uy

‐ Chữa viêm gan, vàng da: 100g lá Sa kê tươi, 50g Diệp hạ châu tươi, 50g Củ móp gai tươi, 20-50g Cỏ mực khô. Tất cả để chung nấu nước uống trong ngày

m

[15].

Kè

‐ Trị chứng huyết áp cao dao động: 2 lá Sa kê vàng vừa mới rụng, 50g Rau ngót

ạy

tươi, 20g lá Chè xanh tươi, để chung nấu nước uống trong ngày [15].

D

- Trị bệnh mụn rộp: lá Sa kê đốt thành than, tán mịn, phối hợp với dầu Dừa và

m /+

Nghệ tươi, giã nát, làm thành bánh, đắp [14].

co

- Chữa sưng háng, mụn nhọt, áp xe: lá Sa kê và lá Đu đủ để tươi, lượng bằng nhau, giã với vôi tôi cho đến khi có màu vàng, rồi đắp [5], [6], [14].

gl

e.

Lá Sa kê được sử dụng để điều trị gút như sau:

oo

Tùy thuộc vào thể bệnh chính kèm theo gút như thận âm hư, can âm hoặc

G

can huyết hư, tỳ thận dương hư mà dùng bài thuốc cho thích hợp nhưng vị thuốc chính là lá Sa kê từ 20 đến 30g [2].

Thí dụ: Gút thứ phát trên tăng huyết áp thể can thận âm hư thì dùng Bài Bổ can thận (gồm: Đương quy 12g, Thục địa 16g, Sài hồ 12g, Thảo quyết minh 12g, Hoài sơn 12g, Trạch tả 12g, Hà thủ ô 12g) gia thêm lá Sa kê 20-30g [2].

Hoặc dùng độc vị lá Sa kê 50g sắc uống dưới dạng trà hằng ngày, kèm theo bài thuốc Lục vị nếu có thận âm hư hay kèm theo bài thuốc Bát vị nếu có tỳ thận dương hư… [2] 14

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

1.4. Tổng quan về bệnh gút 1.4.1. Định nghĩa, phân loại Gút là bệnh rối loạn chuyển hóa acid uric, có đặc điểm chính là tăng acid uric máu. Khi acid uric bão hòa ở dịch ngoại bào sẽ gây lắng đọng các tinh thể monodium urat ở các mô. Tùy theo vị trí tinh thể urat bị tích lũy mà bệnh biểu hiện bởi một hay nhiều triệu chứng lâm sàng: viêm khớp và cạnh khớp cấp

n

và/hoặc mạn tính, thường được gọi là viêm khớp do gút; hạt tophi ở mô mềm;

Có hai loại chính [2]:

Q uy

- Gút nguyên phát: có tính chất di truyền.

N

hơ

bệnh thận do gút hoặc sỏi tiết niệu [2].

- Gút thứ phát: thường là hậu quả tiến triển của một bệnh hay là hậu

m

quả của việc sử dụng thuốc lâu ngày (như thuốc lợi tiểu, aspirin liều thấp,…).

Kè

1.4.2. Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh

ạy

1.4.2.1. Quá trình sinh tổng hợp acid uric

D

Quá trình sinh tổng hợp acid uric gồm [2]:

m /+

+ Tổng hợp: Acid uric được tạo thành từ 3 nguồn, với sự tham gia của các

transferase:

co

men nuclease, xanthin oxydase, hypoxanthin guanin phosphoribosyl

e.

- Thoái biến từ chất có nhân purin do thức ăn mang vào.

oo

gl

- Thoái biến từ chất có nhân purin từ trong cơ thể (các acid nhân ADN và ARN do sự phá hủy các tế bào giải phóng ra).

G

- Tổng hợp các purin từ con đường nội sinh.

+ Thải trừ: Để cân bằng, hàng ngày acid uric được thải trừ chủ yếu theo đường thận (450-500mg/24h), một phần qua đường phân và một số cùng với các đường khác (200mg).

15

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Ribose 5-phosphat PRPP synthetase

+

PRPP Ức chế ngược

Ức chế ngược

Acid nucleic

Acid guanylic HGPRTase

hơ

n

Acid nucleic

Glutamin

Acid inosinic

N

PRPP

Acid adenylic

Q uy

HGPRTase

Guanin

Kè

m

Hypoxanthin

+

PRPP

Xanthin oxidase

D

ạy

Xanthin Xanthin oxidase

m /+

Acid uric

co

Hình 1.3. Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể [19]

e.

1.4.2.2. Cơ chế bệnh sinh của gút theo y học hiện đại

gl

Cơ chế bệnh sinh chính của gút là sự tăng acid uric máu. Tăng acid uric

oo

được định nghĩa là khi nồng độ acid uric máu vượt quá giới hạn hòa tan tối đa

G

của acid uric huyết tương: nam trên 7,0mg/dL (tức trên 420μmol/L); nữ trên 6,0mg/dL (tức trên 360μmol/L) [12]. Khi nồng độ acid uric trong huyết thanh cao hơn nồng độ bão hòa, dẫn tới tích lũy tinh thể urat tại các mô, tạo nên các hạt microtophi. Sự lắng đọng của các hạt này tại các vị trí khác nhau sẽ gây nên các tổn thương khác nhau. Tại sụn khớp, khi các hạt này vỡ ra, sẽ khởi phát cơn gút cấp; sự lắng đọng của các vi tinh thể cạnh khớp, trong màng hoạt dịch, trong mô sụn và mô xương sẽ dẫn đến bệnh xương khớp mạn tính do gút; sự có mặt

16

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

vi tinh thể urat tại mô mềm, bao gân tạo nên hạt tophi; và cuối cùng, lắng đọng tại tổ chức kẽ của thận gây viêm thận kẽ [3].

Như vậy, việc tác động vào các yếu tố tham gia vào quá trình sinh tổng hợp và chuyển hóa acid uric sẽ là một trong các cách làm thay đổi nồng độ acid uric máu.

1.4.2.3. Nguyên nhân bệnh sinh theo y học cổ truyền

n

Gút (hay thống phong) nằm trong phạm trù chứng tý thể hàn tý, thấp tý

hơ

và chứng lịch tiết phong [2].

N

Nguyên nhân bệnh là do ba thứ tà khí, phong hàn, thấp vào tích tụ lâu

Q uy

ngày trong cơ thể mà cơ thể lại có can thận bất túc: can hư không nuôi dưỡng được cân mạch; thận hư không làm chủ được cốt tủy. Hư nhiệt kết hợp với khí

m

huyết ứ trệ do tà khí tích tụ gây bế tắc làm cho khớp xương sưng nóng đau

Kè

không co duỗi vận động được. Đau càng dữ dội về đêm, trời lạnh đau tăng,

lịch tiết [2].

m /+

1.4.3. Thuốc điều trị

D

ạy

chườm nóng đỡ đau. Nếu bệnh tiến triển nhanh và mạnh hơn thì gọi là bạch hổ

1.4.3.1. Theo y học hiện đại

co

Có hai nhóm thuốc điều trị chính [3]:

gl

e.

- Thuốc chống viêm (điều trị gút cấp): colchicin và các thuốc chống viêm

oo

không steroid.

G

- Thuốc làm giảm acid uric (điều trị gút mạn): + Thuốc làm tăng thải trừ acid uric: probenecid, sulfinpyrazon. + Thuốc làm giảm sinh tổng hợp acid uric: allopurinol, febuxostat.

1.4.3.2. Theo y học cổ truyền  Gút nguyên phát Y học cổ truyền mô tả trong chứng thống tý hay hàn tý. Đau dữ dội ở một khớp trời lạnh đau tăng, đêm đau nhiều không ngủ được. Hàn khí nhiều

17

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

hay hành bệnh đi xuống làm cho khớp xương, da thịt hai chân nặng nề hoặc sưng nhức [2].

Phép chữa chung: tán hàn, khu phong, trừ thấp và hành khí hoạt huyết.

Thể hàn tý [2] - Phép trị: tán hàn làm chính, sơ phong táo thấp làm phụ và gia thêm thuốc ôn thống vì tính chất của hàn là ngưng trệ.

- Các bài thuốc:

hơ

n

+ Bài Độc hoạt tang ký sinh thang gia thêm các vị thuốc như Phụ tử 8g, Quế chi 8g.

Q uy

N

+ Bài Ô đầu thang gia giảm gồm: Phụ tử chế 8g, Ma hoàng 12g, Bạch thược 12g, Hoàng kỳ 12g, Phục linh 12g, Cam thảo 8g.

m

+ Bài Ngũ tích tán gia giảm.

Kè

Lịch tiết phong [2]

- Nếu ở giai đoạn cấp khớp sưng to, đau nhức dữ dội, co duỗi khó khăn,

ạy

phát sốt thì dùng bài Bạch hổ quế chi thang gia vị (gồm: Thạch cao, Quế chi,

D

Tri mẫu, Thương truật, Hoàng bá, Tang chi, Ngạnh mễ, Phòng kỷ).

m /+

- Nếu qua giai đoạn cấp thì dùng bài Độc hoạt tang ký sinh gia giảm (gồm: Độc hoạt, Phòng phong, Tang ký sinh, Tế tân, Tần giao, Đương quy,

co

Đảng sâm, Phục linh, Ngưu tất, Đỗ trọng, Quế chi, Thục địa, Bạch thược, Phụ

e.

tử chế, Cam thảo)

gl

 Gút thứ phát

oo

Theo [2], tùy thuộc vào thể bệnh chính kèm theo Gút như thận âm hư,

G

can âm hoặc can huyết hư, tỳ thận dương hư mà dùng bài thuốc cho thích hợp nhưng vị thuốc chính là lá Sa kê từ 20 đến 30g.

Thí dụ: Gút thứ phát trên tăng huyết áp thể can thận âm hư thì dùng như sau: Bài Bổ can thận (Đương quy 12g, Thục địa 16g, Sài hồ 12g, Thảo quyết minh 12g, Hoài sơn 12g, Trạch tả 12g, Hà thủ ô 12g) gia thêm lá Sa kê 20-30g.

Hoặc dùng độc vị lá Sa kê 50g sắc uống dưới dạng trà hằng ngày, kèm theo bài thuốc Lục vị nếu có thận âm hư; kèm theo bài thuốc Bát vị nếu có tỳ thận dương hư.

18

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Lá cây Sa kê được thu hái tại quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.

Dược liệu được sấy ở 600C đến khô, làm nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo, thoáng mát làm nguyên liệu nghiên cứu.

n

Mẫu nghiên cứu đã được PGS. TS Nguyễn Khắc Khôi - Viện Sinh thái và

hơ

Tài nguyên sinh vật giám định tên khoa học là Artocarpus communis J.R. Forst.

N

& G.Forst., họ Dâu tằm (Moraceae). Mẫu nghiên cứu được lưu tại Phòng tiêu

Q uy

bản thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (Viện Hàn Lâm Khoa học

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

và Công nghệ Việt Nam).

Hình 2.1. Cây Sa kê tại quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

2.2. Phương tiện nghiên cứu 2.2.1. Hóa chất -

Oxonic acid

potassium salt

(Sigma-Aldrich, Đức), Sodium

carboxymethyl cellulose (CMC-Na, Nhật Bản), Dimethyl sulfoxid (Merck).

- Kit định lượng acid uric (Hungary) 19

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

- Viên nén Allopurinol STADA® 300 mg - Xanthin oxidase từ sữa bò (0,8 U/mg protein, 9 mg protein/ml, Sigma Aldrich).

- Các thuốc thử, dung môi, hóa chất khác sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV. 2.2.2. Thiết bị

Q uy

- Cột sắc ký, đèn tử ngoại.

hơ

- Bột silicagel pha đảo cỡ hạt 30 - 50µm.

N

- Bột silicagel pha thường cỡ hạt 40 - 60µm.

n

- Bản mỏng silicagel GF254 (Merck) tráng sẵn.

- Cân kỹ thuật Sartorius, cân phân tích Precisa, Bộ môn Dược liệu –

m

Trường Đại học Dược Hà Nội.

Kè

- Máy xác định độ ẩm Sartorius, Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học

ạy

Dược Hà Nội.

D

- Tủ sấy Shellab, máy cất quay chân không Buchi Rotavapor R-200, Bộ

m /+

môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội..

- Kính hiển vi Bio Blue EU3111730, Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học

co

Dược Hà Nội.

e.

- Máy ảnh IXUS115HS.

oo

gl

- Máy đo phổ khối lượng (MS): AGILENT 6310 LC-MSD Trap, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

G

Nam.

- Máy đo phổ cộng hưởng hạt nhân (NMR): Bruker AM500 FT-NMR

Spectrometer, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Máy đo điểm nóng chảy: Kofler micro-hostade, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Máy đo pH, máy ly tâm, máy siêu âm, thiết bị khuấy từ, Bộ môn Dược

20

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

lực – Trường Đại học Dược Hà Nội.

- Hệ thống ELISA gồm máy đọc khay vi tinh thể và máy ủ lắc khay, Bộ môn Dược lực – Trường Đại học Dược Hà Nội.

- Máy cất nước 2 lần, Bộ môn Dược lực – Trường Đại học Dược Hà Nội.

- Đĩa 96 giế ng đáy phẳng Costar 3635, Micropipet với các loa ̣i thể tích.

2.2.3. Động vật thí nghiệm

hơ

do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp.

n

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, cân nặng từ 18-22g, khỏe mạnh

N

Động vật được nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày

Q uy

trước khi thực hiện nghiên cứu, được nuôi dưỡng bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp, uống nước tự do.

m

2.3. Phương pháp nghiên cứu

Kè

2.3.1. Chiết xuất, phân lập các chất trong lá Sa kê

ạy

Chiết xuất

Chiết xuất bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng với dung môi

m /+

D

methanol thu được cắn toàn phần. Cắn toàn phần được chiết bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan,

co

chloroform và ethylacetat. Các phân đoạn dịch chiết được cất thu hồi dung môi

e.

tới cắn.

gl

Phân lập

oo

Sử dụng phương pháp sắc kí cột và sắc ký lớp mỏng điều chế để phân lập

G

các chất.

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường cỡ hạt

40 - 60µm và silicagel pha đảo cỡ hạt 30 - 50µm.

Sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trên bản mỏng silicagel GF254, phát hiện vết chất bằng ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 365nm, cạo lớp silicagel có chất, phản hấp phụ và tinh chế bằng cách kết tinh lại nhiều lần trong dung môi thích hợp.

21

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập bằng SKLM với một số hệ dung môi khai triển.

Nhận dạng các chất tinh khiết Nhận dạng chất phân lập được từ dữ liệu các phổ: phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1H-NMR, 13C-NMR), phổ DEPT, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều (HMBC, HSQC).

2.3.2. Thăm dò tác dụng hạ acid uric

hơ

n

Chuẩn bị mẫu thử

Sử dụng phương pháp chiết nóng với dung môi là nước và phương pháp

Q uy

N

ngâm ở nhiệt độ phòng với dung môi methanol để thu dịch chiết nước và dịch chiết methanol.

Kè

gây tăng acid uric cấp thực nghiệm

m

2.3.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình  Thiết kế thí nghiệm

ạy

Đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid

D

uric cấp bằng kali oxonat theo phương pháp của Watanabe T. và cộng sự [54],

m /+

tiến hành tại Trung tâm Dược lý- Dược lâm sàng – Trường Đại học Y Hà Nội.

co

Chuột nhắt trắng, được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10 con.

- Lô 1 (chứng trắng): uống dung môi pha thuốc là CMC-Na 0,5% với thể

gl

e.

tích 0,2 ml/10g cân nặng chuột.

oo

- Lô 2 (chứng bệnh): uống CMC-Na 0,5% với thể tích 0,2 ml/10g kết hợp

G

tiêm màng bụng hỗn dịch kali oxonat với thể tích 0,1 ml/10g cân nặng chuột - Lô 3 (chứng dương): uống allopurinol liều 10 mg/kg với thể tích

0,2ml/10g kết hợp tiêm màng bụng hỗn dịch kali oxonat với thể tích 0,1ml/10g cân nặng chuột.

- Lô 4 (mẫu thử): uống dịch chiết nước sa kê với thể tích 0,2ml/10g kết hợp tiêm màng bụng hỗn dịch kali oxonat với thể tích 0,1ml/10g cân nặng chuột.

22

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Chuột được uống dung môi pha thuốc (CMC-Na 0,5%), thuốc đối chứng hoặc chế phẩm thử với cùng thể tích 0,2ml/10g cân nặng chuột vào một giờ nhất định hàng ngày trong vòng 4 ngày trước khi gây mô hình. Trước khi dùng CMC-Na 0,5% hoặc thuốc thử 1,5 giờ, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường. Ngày thứ năm của nghiên cứu, 1 giờ trước khi uống thuốc lần cuối, chuột ở các lô được tiêm màng bụng kali oxonat với liều 500mg/kg chuột nhắt trắng (lô chứng trắng được tiêm dung môi pha thuốc CMC-Na

hơ

n

0,5%). Sau khi uống thuốc 2 giờ, lấy máu từ xoang hốc mắt của chuột, để lắng tự nhiên ở nhiệt độ phòng 1 giờ trước khi đem ly tâm với tốc độ 3500 vòng

Q uy

N

trong 10 phút để lấy huyết thanh. Xác định nồng độ acid uric trong huyết thanh chuột thí nghiệm.

m

Quy trình thí nghiệm được mô tả ở hình 2.2.

Kè

Ngày thứ năm

ạy

4 ngày

Uống thuốc

Lấy máu

m /+

D

Tiêm kali oxonat Nhịn ăn

60 phút

120 phút

e.

co

Uống thuốc hàng ngày 30 phút

oo

gl

Hình 2.2. Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng hạ acid uric máu trên mô hình gây tăng cấp bằng kali oxonat

G

 Thông số đánh giá - Nồng độ acid uric trong huyết thanh chuột thí nghiệm.

- Tỷ lệ giảm nồng độ acid huyết thanh của lô thử so với lô chứng.

I (%) =

Cc - Ct Cc

x 100

trong đó : Cc, Ct: nồng độ acid uric huyết thanh của lô chứng, lô thử.

I (%): tỷ lệ giảm acid uric huyết thanh của thử so với chứng trắng.

23

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

2.3.2.2. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro  Nguyên tắc Xanthin oxidase (XO) xúc tác cho quá trình oxy hóa xanthin thành acid uric:

XO

Xanthin + O2 + H2O

acid uric+ H2O2

Phương pháp đánh giá tác du ̣ng ức chế xanthin oxidase đươ ̣c triể n khai theo phương pháp của Noro [39] trên điã 96 giế ng và đươ ̣c điều chỉnh cho phù

hơ

n

hơ ̣p với điề u kiêṇ phòng thí nghiê ̣m.  Bố trí thí nghiệm:

Q uy

N

Thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Dược lực – Trường Đại học Dược Hà Nội. Trên mỗi đĩa 96 giếng gồ m có: giế ng chứng và các giế ng thử; bố trí

m

hỗn hợp thử trong các giếng được thể hiện ở bảng 2.1.

Giếng chứng

Các giếng thử

0

0

50µl

0

50µl

0

85µl

35µl

35µl

60µl

60µl

60µl

30µl

30µl

30µl

25µl

25µl

25µl

200µl

200µl

200µl

ạy

Giếng đối chiếu

m /+

Kè

Bảng 2.1. Bố trí hỗn hợp phản ứng trong từng giếng Dung dịch thử Đệm phosphat

e.

XO

co

Xanthin

D

Dung dịch đối chiếu

gl

HCl

oo

Tổng thể tích

G

Quy trình tiến hành như hình 2.3.

 Đánh giá kết quả: - Tính I (% ức chế) theo công thức:

ODc - ODt I (%) =

x 100

ODc trong đó:

∆ODc = ODchứng - ODtrắng chứng. ∆ODt = ODthử - ODtrắng thử 24

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Các giếng thử Các giếng chứng

35µl đệm, 50µl mẫu thử các nồng độ,

85µl đệm, 30µl enzym

30µl enzym

Ủ 15 phút Thêm 60µl dd xanthin 150 µM

hơ

Q uy

Đo quang ở 290nm

N

Thêm 25µl HCl 1N

n

Ủ 30 phút

m

Hình 2.3. Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase 2.3.4.3. Phương pháp xử lý số liê ̣u

Kè

Các số liệu thu thập được xử lý bằng phương pháp thống kê y sinh học

ạy

theo t- test. Các giá trị được biểu diễn dưới dạng X  SD .

D

Số liệu được lưu trữ bằng phần mềm Microsoft Excel và tính trung bình

G

oo

gl

e.

co

m /+

I% ở các nồng độ khảo sát bằng Microsoft Excel.

25

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Chiết xuất, phân lập các hợp chất 3.1.1. Chiết xuất 3.1.1.1. Lấy mẫu và xác định độ ẩm dược liệu Lá cây Sa kê được thu hái tại quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.

hơ

nơi khô ráo, thoáng mát làm nguyên liệu nghiên cứu.

n

Dược liệu được sấy ở 60oC đến khô, làm nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín, để

N

Lấy khoảng 2g mẫu nghiên cứu đã làm nhỏ để xác định độ ẩm. Bật máy đĩa cân và đợi máy tự động hiện kết quả.

Q uy

đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 130oC. Trải đều mẫu nghiên cứu lên đĩa cân, đậy

Kè

m

Độ ẩm mẫu nghiên cứu xác định được là 10,51%.

3.1.1.2. Chiết xuất

ạy

Lá Sa kê làm nhỏ được cho vào bình chiết inox, sử dụng dung môi

D

methanol, ngâm ở nhiệt độ phòng, rút dịch chiết 3 lần (trong 24 giờ, 48 giờ và

m /+

72 giờ), lọc, gộp dịch lọc và cô dưới áp suất giảm đến cắn để thu được cắn toàn phần, ký hiệu là AR. Với 1000g lá Sa kê thu được 71,25g cắn toàn phần.

co

Hòa cắn toàn phần AR với một lượng vừa đủ nước nóng 60oC. Sử dụng

e.

phương pháp chiết lỏng-lỏng chiết lần lượt với các dung môi là n-hexan,

oo

gl

cloroform và ethylacetat. Các phân đoạn dịch chiết được cất thu hồi dung môi tới cắn để được kí hiệu lần lượt là AR-H (0,65g), AR-C (6,22g) và AR-E

G

(2,05g). Dịch nước còn lại cũng được cô đến cắn và được ký hiệu là AR-W. Quá trình chiết xuất được lặp lại với một số mẻ để thu được lượng cắn cần thiết. Các cắn AR-H, AR-C, AR-E được khảo sát sơ bộ thành phần bằng sắc ký lớp mỏng và thăm dò sự có mặt của các nhóm hợp chất bằng các phản ứng đặc trưng để chọn lựa phân đoạn ưu tiên nghiên cứu phân lập tiếp theo.

Sơ đồ chiết xuất để thu được các phân đoạn như ở hình 3.1.

26

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Dược liệu đã làm nhỏ (1000g) Ngâm methanol x 3 lần

Lọc Dịch chiết methanol

Methanol thu hồi

hơ

n

Cắn toàn phần AR (71,25g)

N

Nước cất 600C

Q uy

Dịch chiết nước

Kè

m

n-hexan

Dịch chiết nước

ạy

Dịch chiết n-hexan

Chloroform

D

n-hexan thu hồi

co

m /+

Cắn AR-H (0,65g)

Dịch chiết chloroform

Dịch chiết nước

G

oo

gl

e.

Chloroform thu hồi

Ethylacetat Cắn AR-C (6,22g) Dịch chiết ethylacetat

Ethylacetat thu hồi Cắn AR-E (2,05g)

Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá Sa kê.

27

AR-W

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bảng 3.1. Khối lượng các cắn phân đoạn từ dịch chiết Methanol lá Sa kê Khối lượng

Khối lượng cắn

% so với nguyên

dược liệu (g)

(g)

liệu khô

n-hexan

1000

0,65

0,65

2

chloroform

1000

6,22

6,22

3

ethylacetat

1000

2,05

2,05

STT

Phân đoạn

1

n

Nhận xét: Phân đoạn chloroform cho khối lượng cắn nhiều nhất trong ba phân

hơ

đoạn (6,22%), phân đoạn ethylacetat cũng cho khối lượng cắn đáng kể (2,05%),

N

khối lượng cắn thu được từ phân đoạn n-hexan rất thấp (0,65%). Theo các tài

Q uy

liệu tham khảo được, phân đoạn chloroform đã được tiến hành phân lập, công bố nhiều hợp chất từ phân đoạn này trong khi phân đoạn ethylacetat chưa được

m

quan tâm nhiều. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn phân đoạn ethylacetat để tiến hành

Kè

phân lập các hợp chất.

ạy

3.1.2. Khảo sát sơ bộ thành phần cắn phân đoạn ethylacetat

m /+

 Định tính flavonoid

D

3.1.2.1. Định tính cắn ethylacetat bằng phản ứng hóa học Hòa tan cắn vào ethanol 900, lọc qua giấy lọc nếp gấp lấy dịch lọc đem làm

co

các phản ứng:

e.

 Phản ứng với dung dịch kiềm loãng

gl

Cho dịch lọc vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch NaOH 10% nếu thấy

oo

ống nghiệm có tủa đục màu vàng thì phản ứng dương tính.

Kết quả: Phản ứng dương tính.

G

 Phản ứng Cyanidin Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống khoảng 1ml dịch lọc. Ống thứ nhất thêm

ít bột magie kim loại rồi nhỏ từ từ vài giọt acid hydrocloric đậm đặc, ống thứ 2 để đối chiếu. Khi phản ứng xong quan sát nếu thấy ống 1 xuất hiện màu đỏ đậm hơn ống đối chiếu thì phản ứng dương tính.

Kết quả: Phản ứng dương tính.

28

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

 Phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid Cho khoảng 1ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc đều nếu thấy xuất hiện màu xanh đen thì phản ứng dương tính.

Kết quả: Phản ứng dương tính.  Phản ứng với hơi amoniac Nhỏ vài giọt dịch lọc lên miếng giấy lọc, để khô rồi hơ lên miệng lọ amoniac đặc, quan sát nếu thấy vết chất chuyển sang màu vàng thì dương tính.

hơ

n

Kết quả: Phản ứng dương tính.

Sơ bộ kết luận: Cắn ethylacetat có flavonoid.

Q uy

N

 Định tính coumarin

Hòa tan cắn vào ethanol 900, lọc qua giấy lọc nếp gấp lấy dịch lọc đem làm

m

các phản ứng:

Kè

 Phản ứng mở đóng vòng lacton:

ạy

Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch lọc. Ống 1 cho thêm 0,5ml NaOH

D

10% rồi đun cách thủy cả 2 ống trng 2 phút. Để nguội, thêm vào mỗi ống 4 ml

m /+

nước cất, nếu ống 1 trong hơn ống 2 nhưng sau đó acid hóa mà đục hoặc có kết tủa như ống 2 thì phản ứng dương tính.

co

Kết quả: Phản ứng âm tính.

e.

 Phản ứng chuyển dạng đồng phân cis-trans:

gl

Nhỏ hai giọt dịch chiết ethanol lên giấy lọc, sau đó nhỏ tiếp lên 1 giọt

oo

NaOH 10%, để khô. Che nửa vết chất thử bằng một mảnh kim loại rồi soi dưới

G

ánh sáng tử ngoại trong khoảng 30 giây, bỏ vật che ra thấy nửa của vết chất thử không che có cường độ màu sáng hơn nửa vết chất thử bị che thì phản ứng dương tính.

Kết quả: Phản ứng âm tính.

Sơ bộ kết luận: Cắn ethylacetat không có coumarin.

29

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

 Định tính tanin: Hòa tan cắn trong nước nóng. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc. Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ mỗi ống 2ml dịch lọc. Ống 1: Thêm vài giọt sắt (III) chlorid 5% nếu thấy xuất hiện tủa màu xanh đen thì phản ứng dương tính. Ống 2: Thêm vài giọt chì acetat 10% nếu thấy xuất hiện tủa bông thì phản

n

ứng dương tính. ứng dương tính.

Q uy

Kết quả: Phản ứng dương tính ở cả 3 ống.

N

hơ

Ống 3: Thêm vài giọt gelatin 1% nếu thấy xuất hiện tủa bông trắng thì phản

Sơ bộ kết luận: Cắn ethylacetat có tanin.

Nhóm chất

P/ư định tính

Kè

TT

m

Bảng 3.2. Kết quả định tính cắn ethylacetat bằng phản ứng hóa học

+++

P/ư với dd FeCl3 5%

++

P/ư với NH3 đặc

++

P/ư với dd FeCl3 5%

++

P/ư với dd chì acetat 10%

++

P/ư với dd gelatin 1%

++

m /+ co

Tanin

oo

gl

e.

2

Coumarin

G

3

Ghi chú:

Kết luận

+

P/ư với dd NaOH 10%

D

Flavonoid

1

ạy

P/ư Cyanidin

Kết quả

P/ư mở, đóng vòng lacton

-

P/ư huỳnh quang

-

Có

Có

Không

(-): phản ứng âm tính (+): phản ứng dương tính (++): phản ứng dương tính rõ (+++): phản ứng dương tính rất rõ

Nhận xét: Bằng các phản ứng hóa học thường quy, kết quả cho thấy trong cắn phân đoạn ethylacetat của lá Sa kê có chứa nhóm chất flavonoid, tanin.

30

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

3.1.2.2. Định tính cắn ethylacetat bằng sắc kí lớp mỏng.

- Mẫu thử: cắn ethylacetat được hòa tan trong methanol.

- Bản mỏng silicagel GF254 tráng sẵn, hoạt hóa ở 1100C trong 1h.

Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi khai triển.

Hệ I: Dichloromethan - Ethylacetat - Acid formic (8:3:1) Hệ II: Ethylacetat - Methanol - Nước (12:2:1)

N

- Thuốc thử hiện màu: vanilin/H2SO4 10%.

Q uy

Hệ V: Ethylacetat - Aceton - Nước (30:5:2)

hơ

Hệ IV: Chloroform - Aceton - Acid acetic băng (3:2:0,1)

n

Hệ III: Toluen - Aceton (2:3)

- Tiến hành: Chấm dịch chấm sắc ký lên bản mỏng, sấy nhẹ cho bay hết dung

m

môi, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi. Sau khi khai triển, lấy bản mỏng

Kè

ra, sấy khô, quan sát dưới UV-VIS, UV365nm, UV254nm. Sau đó phun thuốc thử,

ạy

sấy ở 1100C, quan sát tiếp dưới UV-VIS.

m /+

nhiều vết nhất.

D

Sau khi thăm dò 5 hệ dung môi trên thấy hệ I cho kết quả tách rõ ràng và Hình 3.2 trình bày sắc ký đồ của cắn ethylacetat khi khai triển với hệ dung

co

môi I và quan sát ở các điều kiện khác nhau (ánh sáng thường, UV254nm, UV365nm

gl

e.

và thuốc thử vanilin/H2SO4 10%.).

oo

Nhận xét:

G

- Ở UV-VIS, quan sát thấy có ba vết màu vàng mờ.

- Ở UV254nm, quan sát thấy mười vết màu nâu đen, trong đó có một vết

rất rõ.

- Ở UV365nm, quan sát thấy mười bốn vết, trong đó có một vết màu vàng rõ, 3 vết màu xanh lam rõ.

- Sau khi phun thuốc thử, quan sát ở UV-VIS thấy chín vết, trong đó có ba vết màu vàng rõ.

31

c

m

b

Kè

a

Q uy

N

hơ

n

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

d

Hình 3.2. Sắc ký đồ của cắn ethylacetat với hệ I ở các điều kiện quan sát

ạy

a) Không phun TT, UV-VIS 3.1.3. Phân lập

co

3.1.3.1. Phân lập

d) Phun TT, UV-VIS

m /+

D

b) Không phun TT, UV254nm

c) Không phun TT, UV365nm

Phân lập các chất có trong phân đoạn ethylacetat (7,5g) bằng sắc ký cột.

e.

Cột sắc ký được làm sạch, lót một lớp bông mỏng dưới đáy cột. Nhồi cột bằng

oo

gl

phương pháp nhồi cột ướt với chất nhồi cột pha đảo là YMC-ODS, cỡ hạt 30 -

G

50µm dùng cho sắc ký cột. Ổn định cột trong 24h.

Cắn ethylacetat (AR-E) được phân lập trên cột pha đảo YMC-ODS, rửa

giải với hệ dung môi methanol-nước (1:1). Kiểm tra các dịch rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng và dồn các ống có cùng thành phần, loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 5 phân đoạn: AR-E1 (400mg), AR-E2 (500mg), AR-E3 (250mg), AR-E4 (750mg) và AR-E5 (1,2g).

Phân đoạn AR-E4 (750mg) được tiếp tục phân lập trên cột silicagel, cỡ hạt 40 - 60µm, rửa giải với hệ dung môi ethylacetat - methanol-acid formic 32

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

(5:1:0,1). Kiểm tra thành phần của dịch rửa giải bằng SKLM để dồn các ống có cùng thành phần, loại dung môi thu được 3 phân đoạn AR-E4A (120mg), ARE4B (155mg) và AR-E4C (190mg).

Tiến hành sắc kí lớp mỏng điều chế với phân đoạn AR-E4C với hệ dung môi khai triển là ethylacetat-methanol-acid formic (5:1:0,1), thu được 2 chất là AR1 (1; 18mg) và AR2 (2; 6mg).

n

Tiếp tục phân lập các chất trong phân đoạn AR-E4A trên cột silicagel,

hơ

cỡ hạt 40- 60µm, rửa giải với hệ dung môi n-hexan - ethylacetat (1,3:1) thu

N

được AR3 (3; 6mg).

Q uy

Cắn ARE (7,50g)

AR-E3 (250mg)

D

AR-E2 (500mg)

AR-E4 (750mg)

AR-E5 (1,20g)

Silicagel pha thường, Ethylacetat-methanol-acid formic (5:1:0,1)

AR-4A (120mg)

oo

gl

e.

co

m /+

AR-E1 (400mg)

ạy

Kè

m

Silicagel pha đảo, Methanol-nước (1:1)

AR-4B (155mg)

G

Silicagel pha thường, n-hexan - ethyl acetat (1,3:1)

AR3 (6mg)

AR2 (6mg)

AR-4C (190mg) SKLM điều chế, Ethylacetatmethanol-acid formic (5:1:0,1)

AR1 (18mg)

Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethylacetat.

33

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

3.1.3.2. Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập 3.1.3.2.1. Hợp chất AR1(1) AR1 được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM triển khai với 3 hệ dung môi: Hệ I: Ethylacetat - Methanol - Acid formic (5:1:0,1) Hệ II: Ethylacetat - Aceton - Nước (30:5:2) Hệ III: Ethylacetat - Methanol - Nước (12:2:1) Quan sát dưới UV254nm đều thấy một vết duy nhất trên bản mỏng (hình

hơ

n

3.4). Vì vậy sơ bộ kết luận AR1 là một chất tinh khiết. Sắc ký so sánh AR1 với

N

cắn ethylacetat trên cùng một bản mỏng, hệ dung môi khai triển ethylacetat -

Q uy

methanol - nước (12:2:1), thuốc thử là acid boric - acid oxalic (2:1) và quan sát

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

ở UV365nm, thể hiện trên hình 3.4.

I

II

III

IIIA

Hình 3.4. Sắc kí đồ của AR1

I, II, III: Sắc ký đồ của AR1 ở 3 hệ dung môi I, II, III ở UV254nm IIIA: Sắc ký so sánh AR1 với cắn EtOAc, hệ dung môi III, sau khi phun TT, ở UV365nm Bảng 3.3. Kết quả SKLM của AR1 với 3 hệ dung môi

Hệ dung môi

I

II

III

Rf x 100

32,07

19,52

41,82

Màu sắc

Màu nâu đen

Màu nâu đen

Màu nâu đen

34

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

3.1.3.2.2. Hợp chất AR2 (2) AR2 được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM triển khai với 3 hệ dung môi: Hệ I: Ethylacetat - Methanol - Acid formic (5:1:0,1) Hệ II: Ethylacetat - Aceton - Nước (30:5:2) Hệ III: Chloroform - Aceton - Acid formic (4:2:1) Quan sát dưới UV254nm đều thấy một vết duy nhất trên bản mỏng. Vì vậy

n

sơ bộ kết luận AR2 là một chất tinh khiết (hình 3.5). Sắc ký so sánh AR2 với

hơ

cắn ethylacetat trên cùng một bản mỏng, hệ dung môi khai triển IV: Aceton –

N

Nước – Acid formic (1:2:0,15), quan sát ở điều kiện UV254nm. Kết quả thể hiện

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

trên hình 3.5.

I

II

III

IV

Hình 3.5. Sắc kí đồ của AR2

I, II, III: Sắc ký đồ của AR2 ở 3 hệ dung môi I, II, III ở UV254nm

IV: Sắc ký so sánh AR2 với cắn EtOAc, hệ dung môi IV, ở UV254nm Bảng 3.4. Kết quả SKLM của AR2 với 3 hệ dung môi

Hệ dung môi

I

II

III

Rf x 100

40,74

25,93

32,08

Màu sắc

Màu nâu đen

Màu nâu đen

Màu nâu đen

35

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

3.1.3.2.3. Hợp chất AR3 (3) AR3 được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM triển khai với 3 hệ dung môi: Hệ I: Toluen - Ethylacetat - Acid formic (10:3:1) Hệ II: Diclomethan - Ethylacetat - Acid fomic (8:2:1) Hệ III: Toluen – Ethylacetat - Acid formic (5:2:1) Quan sát dưới UV254nm đều thấy một vết duy nhất trên bản mỏng. Vì vậy

n

sơ bộ kết luận AR3 là một chất tinh khiết (hình 3.6). Sắc ký so sánh AR3 với

hơ

cắn ethylacetat trên cùng một bản mỏng, hệ dung môi khai triển Toluen –

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

Ethylacetat - Acid formic (5:2:1) và quan sát ở UV365nm, thể hiện trên hình 3.6.

e.

co

I

II III Hình 3.6. Sắc kí đồ của AR3

IIIA

gl

I, II, III: Sắc ký đồ của AR1 ở 3 hệ dung môi I, II, III ở UV254nm

G

oo

IIIA: Sắc ký so sánh AR1 với cắn EtOAc, hệ dung môi III, ở UV254nm Bảng 3.5. Kết quả SKLM của AR3 với 3 hệ dung môi

Hệ dung môi

I

II

III

Rf x 100

32,02

57,03

38,09

Màu sắc

Nâu ánh xanh

Nâu ánh xanh

Nâu ánh xanh

36

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

3.1.4. Nhận dạng các chất phân lập 3.1.4.1. Hợp chất AR1 (1) - Tính chất: AR1 (1) được phân lập dưới dạng chất kết tinh ở dạng tinh thể hình kim (hình 3.7).

hơ

n

Vật kính 40

Q uy

N

Vật kính 10

Hình 3.7. Ảnh tinh thể của AR1 dưới KHV vật kính 10 và 40.

m

- Các phổ NMR của AR1 đều cho thấy (1) là một flavonol-glycosid.

Kè

Phổ 1H-NMR của (1) xuất hiện tín hiệu proton tại δH 6,23 (1H, s) và δH

ạy

6,42 (1H, s) đặc trưng cho proton vòng A tại vị trí C-6 và C-8; tín hiệu δH 8,07

D

(2H, d, J = 8,0 Hz) và δH 6,91 (2H, d, J = 8,0 Hz) cho thấy vòng B bị thế tại C-

m /+

4'. Trong đó hai nhóm đường dễ nhận ra là glucose và rhamnose. Đường glucose với cấu hình H-1'' là β (δH 5,11; 1H, d; J = 7,0 Hz, δC 104,66) và nhóm

co

methylen đặc trưng 6''-CH2 (δH 3,39, 1H, dd, J = 3,0;10,0 Hz, Ha-6; 3,82, 1H,

e.

d; J = 10,0 Hz, Hb-6, δC 68,63). Đường rhamnose được nhận diện với cấu hình

gl

H-1''' là α (δH 4,53, 1H, s, δC 102,40) và nhóm methyl đặc trưng 6'''-CH3 (δH

oo

1,15, 3H, d, J = 6,0 Hz; δC 17,90).

G

Phổ 13C-NMR của (1) xuất hiện tín hiệu của 27 carbon, ngoài 15 carbon

thuộc khung flavonol còn tín hiệu của 2 phân tử đường glucose (δC 104,66; 75,68; 78,10; 71,43; 77,17 và 68,63) và rhamnose (δ C 102,40; 72,05; 72,27; 73,87; 69,70 và 17,90). Các giá trị cộng hưởng của proton liên kết trực tiếp với carbon được xác định chính xác nhờ vào kỹ thuật phổ hai chiều HSQC. Các tương tác xa H-C trên phổ HMBC của AR1 được nêu cụ thể trên bảng 3.5.

37

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NMR của AR1 (1)

e.

gl

oo

ạy

D

m /+

104,58 75,76 78,15 71,46 77,22 68,57

n

5,7,8,10

hơ

6,23 (s) 6,42 (s) 8,07 (d, 8,0) 6,91 (d, 8,0) 6,91 (d, 8,0) 8,07 (d, 8,0)

7,9,6,10

N

161,49 135,50 179,43 162,88 100,08 166,22 95,01 158,52 105,58 122,70 132,36 116,13 159,51 116,13 132,36

Q uy

161,49 135,51 179,43 163,01 99,96 166,02 94,91 158,56 105,68 122,76 132,37 116,13 159,44 116,13 132,37

co

Aglycon 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' 3-Glucosyl 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6''

HMBC (HC)

δHa,c Mult (J=Hz)

m

δCa,b

Kè

δC[26]

#

C

104,66 75,68 78,10 71,43 77,17 68,63

5,11 (d, 7,0) 3,68 (dd, 9,5, 7,5) 3,63 (t, 9,5) 3,31 (t, 9,5) 3,27 (m) 3,39 (dd, 10,0, 3,0) 3,82 (d, 10,0)

1',3',4',6'

4',3',6' 5',4',2 3

G

6''-Rhamnosyl 1''' 102,42 102,40 4,53 (s) 6'',2''',3''',5''' 2''' 72,09 72,05 3,67 (m) 3''' 72,30 72,27 3,54 (m) 4''' 73,89 73,87 3,26 (m) 5''' 69,73 69,70 3,45 (m) 6''' 17,91 17,90 1,15 (d, 6,0) 5''',4''' a Đo trong methanol – d4; b125 MHz; c500MHz

38

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Tương tác của proton anomer của đường glucose H-1'' (δH 5,11) với C-3 (δC 135,50) khẳng định phân tử đường glucose được nối với khung flavonoid tại vị trí C-3. Bên cạnh đó tương tác của proton anomer của đường rhamnose H-1''' (δH 4,53) với C-6'' (δC 68,63) cho thấy phân tử đường rhamnose được nối với C-6'' của đường glucose.

Phổ khối lượng ESI-MS xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 593,0 [M-H]kết hợp với phổ 1H-NMR và 13C-NMR có thể dự đoán công thức phân tử là

hơ

n

C27H30O15 (M = 594).

Từ những dữ kiện phổ trên đều cho thấy đây là một flavonol-glycosid.

Q uy

N

So sánh với dữ liệu phổ của hợp chất kaempferol 3-O-rutinosid [26] nêu ra trong bảng 3.6 cho phép xác định hợp chất (1) là kaempferol 3-O-rutinosid, có

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

cấu trúc như hình 3.8.

gl

Hình 3.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất AR1

oo

3.1.4.2. Hợp chất AR2 (2)

G

- Tính chất: AR2 (2) được phân lập dưới dạng chất vô định hình.

Hình 3.9. Sản phẩm AR2 phân lập được 39

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Phổ 1H-NMR của (2) xuất hiện tín hiệu proton đặc trưng của 3 nhóm methyl bậc 3 dưới dạng singlet tại δH 1,03 (3H, s); 1,11 (3H, s) và 2,07 (3H, s); 1 nhóm methyl bậc 2 dạng doublet tại δH 1,21 (3H, d, J = 6,0 Hz); 1 proton olefin nội vòng tại δH 5,82 (1H, s). Ngoài ra, còn thấy xuất hiện tín hiệu của proton anome tại δH 4,35 (1H, d, J = 8,0 Hz) và các proton oxymethin vùng đường trong khoảng 3,21-3,85ppm. δCa,b

DEPT

δHa,c(J,Hz)

1

37,20

37,31

C

-

2

48,00

48,07

CH2

3

202,30

202,42

C

4

125,30

125,37

CH

5

170,00

170,13

C

6

52,30

52,38

7

26,70

26,82

8

37,70

37,80

9

75,00

10

19,80

11

27,50

12

Q uy

N

Aglycon

HMBC

hơ

δC [50]

#

C

n

Bảng 3.7. Dữ liệu phổ NMR của AR2 (2)

1,97 (m)/2,49 (d,17,5)

1,3,4,6

Kè

m

-

5,82 (s) 2,02

CH2

1,53 (m)/1,98

ạy

CH

1,66 (m)

75,48

m /+

CH

3,91 (m)

7,8,1'

19,87

CH3

1,21 (d;6,0)

8,9

27,53

CH3

1,11 (s)

1,2,6

29,00

e.

29,08

CH3

1,03 (s)

1,2,6,11

25,00

24,97

CH3

2,07 (s)

4,5,6

1'

102,00

102,11

CH

4,35 (d; 8,0)

9

2'

75,40

75,14

CH

3,16 (dd; 9,0; 8,0)

1',3'

3'

78,00

78,15

CH

3,37 (dd; 9,0; 9,0)

4'

71,70

71,83

CH

3,29 (dd; 9,0; 9,0)

5'

77,70

77,89

CH

3,28 (m)

6'

62,80

62,91

CH2

3,36 (dd; 11,5; 5,5)

oo

13

co

CH2

gl

5,6,8

G

D

2,6,13

9-Glucosyl

3,87 (dd; 11,5; 2,0) a

đo trong CD3OD, b đo tại 125 MHz, c đo tại 500 MHz 40

4',5'

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Phổ 13C-NMR và DEPT xuất hiện cộng hưởng của 19 nguyên tử carbon trong đó có một carbonyl tại δC 202,42; một nối đôi tại δC 125,37 (CH) và 170,13 (C), hai nhóm methin tại δC 75,48 và 52,38; ba nhóm methylen tại δC 48,07, 37,80 và 26,82; 4 nhóm methyl tại δC 19,87; 24,97; 27,53 và 29,08. Bên cạnh đó, các tín hiệu đặc trưng cho phân tử đường glucose cũng xuất hiện (δC 102,11 (CH); 75,14 (CH); 78,15 (CH); 71,83 (CH); 77,89 (CH) và 62,91

hơ

megastigman gắn một phân tử đường glucose.

n

(CH2)). Từ phổ các dữ liệu phổ 1H-, 13C-NMR và DEPT gợi ý (2) có khung

N

Phân tích các tương tác nhận được trên phổ hai chiều HSQC và HMBC

Q uy

cho phép xác định chính xác cấu trúc của (2). Trên phổ HMBC tương tác giữa H-13 (δH 2,07) với C-4 (δC 125,37)/C-5 (δC 170,13)/C-6 (δC 52,38); giữa H-11

m

(δH 1,11) với C-1 (δC 37,31)/C-2 (δC 48,07)/C-6 (δC 52,38) và giữa H-4 (δH

Kè

5,82) với C-2 (δC 48,07)/C-6 (δC 52,38)/C-13 (δC 24,97) cho phép xác định có

ạy

2 nhóm CH3 liên kết với C-1 và một nối đôi giữa C-4/C-5. Nhóm carbonyl được xác định tại C-3 dựa vào tương tác HMBC giữa H-2 (δH 1,97/2,49) với C-1 (δC

m /+

D

37,31)/C-3 (δC 202,42)/C-4 (δC 125,37)/C-6 (δC 52,38). Tương tác HMBC giữa H-9 (δH 3,91) với C-7 (δC 26,82)/C-8 (δC 37,80)/C-1' (δC 102,11) và giữa H-1'

co

(δH 4,35) với C-9 (δC 75,48) cho thấy phân tử đường glucose liên kết với khung

e.

megastigman tại C-9.

gl

Từ những phân tích trên cùng việc so sánh dữ kiện phổ của (2) với dữ kiện

oo

phổ tham khảo tương ứng [50] và sự xuất hiện pic ion phân tử trên phổ ESI-

G

MS tại m/z 373,1 [M+H]+ cho phép xác định hợp chất (2) là byzantionosid B.

Hình 3.10. Cấu trúc hóa học của hợp chất AR2

41

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

3.1.4.3. Hợp chất AR3 (3)

Q uy

N

hơ

n

- Tính chất: AR3 được phân lập dưới dạng bột màu vàng.

Hình 3.11. Sản phẩm AR3 phân lập được δC [25]

δCa,b

DEPT

δHa,c Mult (J=Hz)

C

-

CH

6,93 (s)

Kè

#

C

m

Bảng 3.8. Dữ liệu phổ NMR của AR3 (3) 156,6

156,16

3

102,6

102,20

4

122,4

121,98

CH

7,37 (d, 8,0)

4a

123,5

123,07

C

-

5

113,7

113,26

CH

6,76 (dd, 8,0; 2,0)

157,7

157,26

C

-

D

m /+

e.

co 98,9

98,49

CH

6,92 (d, 2,0)

7a

157,3

156,84

C

-

1'

134,2

134,00

C

-

2'

104,4

103,97

CH

6,78 (d, 2,0)

3'

160,4

159,95

C

-

4'

103,9

103,55

CH

6,26 (t, 2,0)

5'

160,4

159,95

C

-

6'

104,4

103,97

CH

6,78 (d, 2,0)

G

gl

7

oo

6

ạy

2

a

đo trong CD3OD; b125 MHz; c500MHz

42

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Phổ 1H-NMR của hợp chất (3) xuất hiện 3 tín hiệu proton đặc trưng của một vòng thơm H 7,37 (1H, d, J = 8,0 Hz); 6,76 (1H, dd, J = 8,0; 2,0 Hz) và 6,92 (1H, d, J = 2,0 Hz); tín hiệu một vòng thơm khác có trục đối xứng cũng được xác định tại H 6,78 (2H, d, J = 2,0 Hz) và 6,26 (1H, t, J = 2,0 Hz). Ngoài ra, tín hiệu một proton olefin được xác định tại H 6,93 (1H, s) gợi ý (3) có cấu trúc khung 2-phenylbenzofuran.

n

Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất (3) xuất hiện các tín hiệu của 14

hơ

carbon trong đó có 7 nhóm methyl và 7 carbon bậc 4. Tín hiệu của vòng phenyl

N

có trục đối xứng tại C 134,00 (C-1′); 103,97 (2C, C-2′/C-6′); 159,95 (2C, C-

Q uy

3′/C-5′) và 103,55 (C-4′); tín hiệu vòng benzofuran xuất hiện tại C 156,16 (C-

m

2); 102,20 (C-3); 121,98 (C-4); 123,07 (C-4a); 113,26 (C-5); 157,26 (C-6);

Kè

98,49 (C-7) và 156,84 (C-7a).

Công thức phân tử của AR3 được dự đoán là C14H10O4 (M = 242) dựa

ạy

vào các kết quả phổ NMR và phổ ESI-MS tại m/z 243,0 [M+H]+.

m /+

D

Từ những dữ kiện phổ trên, cùng sự so sánh với hợp chất moracin M [25] nêu ra trong bảng 3.8 cho phép xác định hợp chất (3) là moracin M, có cấu trúc

G

oo

gl

e.

co

như hình 3.12.

Hình 3.12. Cấu trúc hóa học của hợp chất AR3

43

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

3.2. Thăm dò tác dụng hạ acid uric của lá Sa kê 3.2.1. Chuẩn bị mẫu thử - Cao lỏng và cắn nước: 2kg dược liệu cho vào bình sắc dược liệu, thêm nước cho ngập dược liệu khoảng 2cm. Đun sôi 1 giờ, lấy dịch chiết đem lọc.

Bã dược liệu được dùng để chiết tiếp lần 2, lần 3. Gộp các dịch lọc lại, đem cô cách thủy đến cao lỏng 4:1. Một phần cao lỏng 4:1 được tiếp tục cô đến cắn.

n

- Cắn methanol: tiến hành tương tự phần 3.1.1.

N

3.2.2.1. Thăm dò với mẫu thử ở liều thấp

Q uy

cấp acid uric bằng kalioxonat tiêm màng bụng

hơ

3.2.2. Đánh giá khả năng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng

Tiến hành thăm dò tác dụng của dịch chiết nước lá Sa kê liều 24g/kg ở

Kè

m

lô 4 ( mẫu thử) ( Chuột được uống dịch chiết nước lá Sa kê liều 24g/kg với thể

0,1ml/10g cân nặng chuột).

ạy

tích 0,2ml/10g kết hợp tiêm màng bụng hỗn dịch kali oxonat với thể tích

m /+

hiện ở bảng 3.9.

D

Nồng độ acid uric trong huyết thanh chuột thí nghiệm ở các lô được thể Bảng 3.9. Ảnh hưởng của dịch chiết nước Sa kê lên nồng độ acid uric

e.

co

trong máu chuột

oo

gl

Lô nghiên cứu

n

Nồng độ acid uric (µmol/L)

Tỷ lệ giảm acid uric so với lô chứng bệnh (%)

10

208,89 ± 26,23

Lô 2 (chứng bệnh)

10

346,70 ± 18,61

Lô 3 (chứng dương)

10

319,44 ± 21,49

7,86

Lô 4 (dùng mẫu thử)

10

338,78 ± 16,10

2,29

G

Lô 1 (chứng trắng)

44

p

p2-3=0,009 p2-4=0,3376 p3-4=0,0463

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Nhận xét: - Nồng độ acid uric của lô chứng bệnh tăng cao rõ rệt so với lô chứng trắng, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 10-8.

- Dịch chiết nước lá Sa kê ở liều 24g/kg không làm giảm nồng độ acid uric trong huyết tương chuột (sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình tại liều thử (p2-4>0,05)).

n

3.2.2.2. Thăm dò với mẫu thử ở liều cao

hơ

Sau khi thử nghiệm dịch chiết nước lá Sa kê với liều 24g/kg chưa thấy

N

cho kết quả rõ rệt. Chúng tôi tiến hành thử nghiệm với 4 lô chuột mới, mỗi lô

Q uy

10 con. Trong thử nghiệm lần này Lô 4 (mẫu thử) được uống dịch chiết nước sa kê liều gấp 6 lần (144 g/kg) với thể tích 0,2 ml/10g kết hợp tiêm màng bụng

m

hỗn dịch kali oxonat với thể tích 0,1ml/10g cân nặng chuột. Kết quả cụ thể được

Kè

tổng hợp ở bảng 3.10.

D

ạy

Bảng 3.10. Kết quả thử nghiệm với dịch chiết nước lá Sa kê liều cao Nồng độ acid

acid uric so

uric (µmol/L)

với lô chứng

m /+ n

e.

10 382,30 ± 16,40

gl

Lô 2 (chứng bệnh)

G

oo

Lô 3 (chứng dương)

Lô 4 (dùng mẫu thử)

p

bệnh (%)

co

Lô nghiên cứu

Tỷ lệ giảm

10 275,20 ± 35,10

28,02

10 339,20 ± 28,70

11,27

p2-3=1,35.10-6

p2-4=0,0057 p3-4=0,0003

Nhận xét: - Ở liều 144g/kg lá Sa kê đã thể hiện tác dụng hạ acid uric trong huyết thanh chuột thử nghiệm với tỷ lệ giảm đạt được 11,27%. Với mức độ giảm

45

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

nồng độ acid uric trong mẫu thử đã có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p=0,0057).

- Tuy nhiên sự giảm này vẫn chưa tương đương với dung dịch allopurinol liều 10mg/kg. Mức độ giảm của lô thử kém lô chứng dương có ý nghĩa thống kê (p=0,0003).

- Dịch chiết nước lá Sa kê có khả năng hạ acid uric trong huyết tương

n

chuột ở liều 144g/kg nhưng với mức độ yếu hơn allopurinol 10mg/kg.

hơ

3.2.3. Đánh giá khả năng ức chế enzym xanthin oxidase của mẫu thử

N

Mẫu cao nước lá Sa kê sẽ được thử tác dụng ức chế XO in vitro tại 5 nồng

hành thử ba lần, mỗi lần thử ba giếng.

m

Kết quả thu được như ở bảng 3.11

Q uy

độ 300μg/ml, 200μg/ml, 100μg/ml, 50μg/ml, 20μg/ml. Mỗi nồng độ được tiến

100

co

200

m /+

50

D

20

% ức chế I

-0,0128

-6,06

-0,0173

-8,363

-0,0224

-10,41

0,0102

4,72

0,028

13,02

gl

e.

300

∆OD

ạy

Nồng độ (μg/ml)

Kè

Bảng 3.11. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro của cao nước

oo

Nhận xét:

Dịch chiết nước lá Sa kê cho tác dụng ức chế XO yếu: Ở nồng độ

G

300μg/ml phần trăm ức chế đạt được là 13,02%.

Chúng tôi tiến hành đánh giá thêm khả năng ức chế XO của dịch chiết methanol ở 6 nồng độ 100, 75, 60, 40, 20, 10μg/ml. Mỗi nồng độ được tiến hành thử ba lần, mỗi lần thử ba giếng. Kết quả thu được như ở bảng 3.12.

46

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bảng 3.12. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro của dịch chiết Nồng độ (μg/ml)

∆OD

% ức chế I

10

0,0054

2,56

20

0,0108

5,11

40

0,0271

12,83

60

0,035

16,56

75

0,0526

n

methanol lá Sa kê

100

0,0542

hơ

24,89

Q uy

N

25,65

Nhận xét:

Mẫu dịch chiết nước không thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase.

Kè

m

Dịch chiết methanol lá Sa kê cho tác dụng ức chế XO rõ ràng hơn dịch chiết nước lá Sa kê: Ở nồng độ 75μg/ml, phần trăm ức chế đạt được là 25,65%;

ạy

Với tỷ lệ cắn methanol thu được từ dược liệu là 7,12%, nồng độ 75μg/ml

D

của cắn methanol tương đương với nồng độ khoảng 1mg/ml tính theo dược liệu

G

oo

gl

e.

co

m /+

khô đã đạt được phần trăm ức chế XO là 25%.

47

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN Ở Việt Nam các nghiên cứu về Sa kê chưa được đầy đủ, đặc biệt là việc chiết tách, phân lập các hợp chất có tác dụng dược lý nhằm chứng minh kinh nghiệm dân gian khi sử dụng dược liệu này. Vì vậy việc nghiên cứu về cây Sa kê là cần thiết, góp phần khẳng định và nâng cao giá trị sử dụng của dược liệu.

n

Về chiết xuất

hơ

Đề tài đã tiến hành chiết xuất các nhóm chất trong lá Sa kê bằng phương

N

pháp ngâm ở nhiệt độ phòng với dung môi methanol thu được cắn toàn phần.

Q uy

Phương pháp ngâm có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền.

Từ cắn toàn phần chiết lần lượt bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng với các

Kè

m

dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, cloroform và ethylacetat.

Về phân lập

ạy

Năm 2014, Nguyễn Thị Thúy An đã tiến hành định tính và xác định sự có

D

mặt của các các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong dược liệu, kết quả cho thấy

m /+

trong lá Sa kê có chứa các nhóm chất: flavonoid, saponin, anthranoid, tanin, đường khử, acid amin, polysaccharid, sterol [1]. Đây là các nhóm chất có độ

co

phân cực khá cao, đồng thời theo tài liệu tra cứu được thì các hợp chất đã được

e.

công bố chủ yếu phân lập từ phân đoạn chloroform, vì vậy chúng tôi tiến hành

oo

gl

phân lập các chất ở phân đoạn ethylacetat sẽ cho kết quả khả thi nhất. Đề tài sử dụng các phương pháp sắc kí là sắc kí cột pha thường, sắc kí cột

G

pha đảo và sắc kí lớp mỏng điều chế. Đây là các phương pháp được sử dụng phổ biến để phân lập các chất ở Việt Nam, sử dụng thiết bị rẻ tiền, chất hấp phụ sẵn có, dễ kiếm, tiến hành đơn giản hơn so với các phương pháp phân lập khác.

Bước đầu đề tài đã phân lập được 3 hợp chất từ phân đoạn ethylacetat. Cấu trúc của các hợp chất được xác định là kaempferol-3-O-rutinosid, byzantionosid B và moracin M dựa trên các dữ liệu phổ khối (ESI-MS), phổ 1D, 2D-NMR, phổ DEPT. Theo các tài liệu tham khảo tra cứu được chưa thấy 48

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

có công trình nghiên cứu nào phân lập được ba hợp chất này từ lá Sa kê, như vậy đây là một đóng góp mới của đề tài trong việc nghiên cứu thành phần hóa học của lá Sa kê.

Kaempferol-3-O-rutinosid là một flavonol-glycosid có mặt trong nhiều loài thực vật như

Clitoria ternatea [26], Selliguea feei [16], Angelica

shikokiana [37], Afgekia mahidoliae [41], Prunus persica [57], Carthami flos

n

[28], Jovibarba globifera [49],… Bên cạnh đó, kaempferol-3-O-rutinosid được

hơ

biết đến với các tác dụng chống oxy hóa [49], [57], ức chế α-glucosidase [21],

N

bảo vệ tế bào thần kinh khỏi chất gây độc tế bào Aβ25-35 [37], làm lành vết

Q uy

thương [41]. Hơn nữa, kaempferol-3-O-rutinosid cho thấy tác dụng ức chế xanthin oxidase với IC50 = 14,8 ± 2,0µM [18], đây là tác dụng mà đề tài hướng

m

tới khi nghiên cứu về lá Sa kê.

Kè

Byzantionosid B là một megastigman đã được các nhà khoa học nghiên

ạy

cứu chiết xuất từ các loài thực vật khác nhau như Stachys Byzantina [50], Uraria crinita [35], Elephan-topus tomentosus [30], Crataegus pinnatifida

m /+

D

[29], Piper elongatum [36], Casearia sylvestris [51],… tuy nhiên chưa có nhiều công bố về tác dụng của hợp chất này, mặc dù hợp chất thuộc nhóm có tác dụng

co

chống viêm, chống oxy hóa tốt.

e.

Moracin M là một phenylbenzofuran có mặt trong nhiều loài thuộc chi

gl

Morus, họ Dâu tằm (Moraceae) [17], [25], [27]. Sa kê cũng là một loài thuộc

oo

học Dâu tằm (Moraceae). Vì vậy, đây có thể xem là một trong những chất dùng

G

để đánh dấu, cũng như phân loại thực vật học các loài thuộc họ Dâu tằm dựa trên chất thứ cấp. Moracin M là hợp chất có tác dụng ức chế tyrosinase (là enzyme tham gia vào sản xuất melanin) [25], ức chế Phosphodiesterase-4 (có tác dụng chống viêm, chống dị ứng) [17], [56], kháng khuẩn [27], hạ đường huyết [55],… Đây cũng là những tác dụng dược lý đã nghiên cứu ở lá Sa kê.

Như vậy, với ba hợp chất phân lập được cũng góp phần trong việc định hướng nghiên cứu thêm về thành phần hóa học cũng như sàng lọc tác dụng sinh học của lá Sa kê.

49

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Về tác dụng hạ acid uric Từ kinh nghiệm sử dụng lá Sa kê của người dân khu vực Nam bộ, cùng với các dữ liệu, thông tin tham khảo được, các mẫu lá khác nhau đã được thu hái. Việc thu hái dược liệu làm mẫu khảo sát ban đầu được thực hiện trên cùng một cây, tại cùng một khu vực để đảm bảo tính chặt chẽ cho đối tượng nghiên cứu. Lá Sa kê khi già sẽ chuyển dần sang màu vàng hoàn toàn và rụng. Theo kinh nghiệm của người dân, 2 loại lá được sử dụng để trị gút là lá vàng ruộm dụng hạ acid uric máu trên lá già màu vàng ruộm.

hơ

n

sắp rụng và lá chuyển vàng chanh (lá bánh tẻ). Đề tài tiến hành thăm dò tác

Q uy

N

Với phương pháp đánh giá khả năng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp thực nghiệm, dịch chiết nước lá Sa kê cho thấy kết quả như sau: tại liều 24g/kg lá Sa kê tuy có làm giảm được 2,29% nồng độ acid

Kè

m

uric trong huyết tương chuột nhưng sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình tại liều thử; tại liều 144g/kg lá Sa kê cho tỷ lệ 11,27, có sự khác

ạy

biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p=0,0057). Đề tài tiến hành với

D

mục tiêu thăm dò tác dụng hạ acid uric máu của lá Sa kê, với kết quả thu được

m /+

đã cho thấy lá Sa kê thể hiện tác dụng trên mô hình gây tăng acid uric cấp, bước đầu chứng minh được kinh nghiệm sử dụng lá Sa kê để điều trị gút của

co

dân gian, cũng như định hướng cho nghiên cứu tiếp theo về liều tối ưu của lá

e.

Sa kê cho tác dụng hạ acid uric máu. Theo kinh nghiệm sử dụng của dân gian,

gl

50-100g lá Sa kê được sắc uống hàng ngày để trị bệnh gút [2], [15], tác dụng

oo

hạ acid uric máu của lá Sa kê có thể tiếp tục nghiên cứu trên mô hình gây tăng

G

acid uric mạn để đánh giá được chính xác hơn tác dụng điều trị của lá Sa kê.

Khi một thuốc làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh, cơ chế tác dụng

thường được dự đoán theo 2 hướng: làm giảm tổng hợp acid uric (thường do ức chế XO) hoặc làm tăng thải trừ acid uric hay kết hợp cả 2 cơ chế. Trong đó, hướng ức chế XO thường được nghĩ đến nhiều hơn. Từ các kết quả nghiên cứu ban đầu về khả năng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp thực nghiệm, chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro của lá Sa kê.

50

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Với phương pháp đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro, dịch chiết nước được lựa chọn thử nghiệm trước tiên. Kết quả, ở nồng độ 300μg/ml phần trăm, mẫu thử ức chế XO đạt được 13,02%. Để có thể có kết luận về khả năng tác dụng của mẫu lá già trong điều trị gút, cùng với kết quả thử nghiệm với dịch chiết nước và hướng tới mục tiêu phân lập các chất trong dịch chiết methanol của lá Sa kê, đề tài tiến hành đánh giá thêm tác dụng ức chế XO của dịch chiết methanol. Kết quả cho thấy dịch chiết methanol có tác dụng ức chế enzyme XO

hơ

n

với IC50 nằm trong khoảng 150-300μg/ml. Dịch chiết methanol lá Sa kê cho tác dụng ức chế XO rõ ràng hơn dịch chiết nước lá Sa kê, cụ thể tại nồng độ

Q uy

N

75μg/ml phần trăm ức chế đạt được là 25,65%. Theo [13], dịch chiết ethanol từ lá Sa kê có khả năng ức chế XO với IC50 = 0,198mg/ml. Ước tính, dịch chiết methanol từ lá Sa kê cũng có khả năng ức chế với IC50 gần với dịch chiết

Kè

m

ethanol. Trong khi đó, dược liệu có các mẫu thử cho IC50 nhỏ hơn 100 μg/ml được coi là dược liệu có tiềm năng trong việc điều trị gút, điều này phần nào

ạy

chứng tỏ kinh nghiệm dân gian dùng lá Sa kê trong điều trị gút.

D

Qua thực tế khảo sát, nhận thấy lá Sa kê lại được sử dụng phổ biến trong

m /+

dân gian để điều trị bệnh gút [15], và đã được đưa vào sách đào tạo giảng dạy [2]. Theo Y học cổ truyền, lá Sa kê có tác dụng tiêu viêm, tiêu độc, lợi tiểu [5],

co

[14], [15] đều là một trong những tác dụng cần đạt được trong quá trình điều

e.

trị bệnh Gút. Tuy nhiên, các kết quả thử nghiệm trên mới chỉ được thực hiện

gl

với mẫu lá già, việc kết luận tác dụng của dược liệu có hay không và đạt ở mức

G

oo

độ nào cần được tiếp tục thăm dò trên mẫu lá bánh tẻ (lá già màu vàng chanh).

Với kết quả ban đầu về tác dụng ức chế XO của dịch chiết methanol cũng

như qua các tài liệu tham khảo, nhận thấy việc đánh giá khả năng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp thực nghiệm của dịch chiết methanol là cần thiết. Đồng thời, việc thử tác dụng điều trị gút của lá Sa kê cần được tiến hành thêm một số tác dụng như chống viêm, lợi tiểu, đặc biệt là các mô hình đặc hiệu đối với bệnh Gút như: tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối, khả năng thải trừ acid uric… để có thể kết luận chính xác hơn về tác dụng điều trị gút của lá Sa kê.

51

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

KẾT LUẬN Sau thời gian tiế n hành làm thực nghiê ̣m, luận văn đã thu đươ ̣c mô ̣t số kế t quả sau đây: Chiết xuất, phân lập các chất trong lá Sa kê - Đã chiết xuất bằng dung môi methanol và tiến hành chiết lỏng – lỏng cắn methanol với dung môi lần lượt là n-hexan, chloroform, ethylacetat.

n

- Đã phân lập được ba chất bằng phương pháp sắc ký từ phân đoạn ethylacetat

hơ

là AR1, AR2, AR3. Dựa trên các dữ liêụ phổ MS, NMR (1H-NMR, 13C-NMR,

N

DEPT, HMBC, HSQC), xác định được cấu trúc hóa học của 3 chất là

Q uy

kaempferol-3-O-rutinosid, byzantionosid B và moracin M. Thăm dò tác dụng hạ acid uric của lá Sa kê

m

- Đã chuẩn bị mẫu thử tác dụng sinh học bằng phương pháp chiết nóng với

Kè

nước, và chiết ngâm ở nhiệt độ phòng với methanol.

ạy

- Đã thăm dò tác dụng hạ acid uric của mẫu thử trên 2 mô hình:

D

+ Trên mô hình gây tăng cấp acid uric bằng kali oxonat tiêm màng bụng:

m /+

tại liều 24g/kg lá Sa kê tuy có làm giảm được 2,29% nồng độ acid uric trong huyết tương chuột nhưng sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê so với lô mô

co

hình tại liều thử; liều 144g/kg lá Sa kê đã thể hiện tác dụng hạ acid uric trong

e.

huyết thanh chuột thử nghiệm với tỷ lệ giảm đạt được 11,27%, với mức độ

oo

gl

giảm nồng độ acid uric trong mẫu thử đã có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

G

so với lô chứng bệnh. + Trên mô hình đánh giá khả năng ức chế xanthin oxidase in vitro, ở

nồng độ 300μg/ml, dịch chiết nước đạt được phần trăm ức chế XO 13,02%.

Dịch chiết methanol lá Sa kê cho thấy tác dụng ức chế XO rõ ràng hơn dịch chiết nước lá Sa kê, cụ thể tại nồng độ 75μg/ml (tương đương với nồng độ 1mg/ml tính theo dược liệu khô), phần trăm ức chế đạt được là 25,65%.

52

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

KIẾN NGHỊ Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên những kết quả nghiên cứu trên đây mới chỉ đóng góp phần nào trong công trình nghiên cứu về cây Sa kê. Vì vậy chúng tôi xin đưa ra một số đề xuất:  Tiếp tục nghiên cứu về thành phần hoá học của lá Sa kê.  Tiến hành nghiên cứu thử tác dụng sinh học của các hợp chất đã phân

n

lập được, đặc biệt là trên mô hình ức chế xanthin oxidase in vitro.

hơ

 Cần tiến hành thăm dò tác dụng hạ acid uric máu của mẫu lá bánh tẻ trên

N

cùng mô hình, mở rộng với mẫu thu hái tại các địa điểm khác nhau.

Q uy

 Tiếp tục đánh giá khả năng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp thực nghiệm của dịch chiết methanol, dịch chiết ethanol, và

Kè

m

các phân đoạn từ dịch chiết.

 Tiến hành đánh giá tác dụng điều trị gút của lá Sa kê trên các mô hình

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

khả năng thải trừ acid uric…

ạy

khác: tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối,

53

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Nguyễn Thị Thúy An (2014), Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của lá Sa kê, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội.

2. Bộ Y tế (2007), Bệnh học và điều trị nội khoa (Kết hợp Đông – Tây y), Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 538-547.

n

3. Bộ Y tế (2007), Dược lý học, tập 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

hơ

4. Bộ Y tế (2008), Bài giảng bệnh học nội khoa, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

N

5. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học.

Q uy

6. Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, tập 1, tr.366-370, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật.

m

7. Bùi Quang Huy Hoàng (2014), Chiết xuất, phân lập một số thành phần từ

Kè

lá Sa kê, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ , Đại học Dược Hà Nội.

D

bản Trẻ, Hà Nội.

ạy

8. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, quyển 2, tr.546-549, Nhà xuất

m /+

9. Phạm Thị Thanh Huệ (2012), Nghiên cứu chiết tách và xác định một số thành phần hóa học trong dịch chiết lá Sa kê bằng ethanol, Khóa luận tốt

co

nghiệp cử nhân khoa học, Đại học Đà Nẵng-Trường Đại học Sư phạm- Khoa

gl

e.

Hóa, Đà Nẵng.

oo

10. Nguyễn Hữu Duy Khang (2011), Khảo sát thành phần hóa học cao chloroform của lá cây Sa kê Artocarpus altilis (Parinson) Fosberg, Họ Dâu

G

Tằm (Moraceae), Luận văn Thạc sĩ Hóa học, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh- trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh.

11. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, tr. 936, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

12. Nguyễn Vĩnh Ngọc (2007), Điều trị học nội khoa tập 1, Nxb Y học, Hà Nội.

54

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

13. Đái Thị Xuân Trang, Huỳnh Ngọc Trúc, Nguyễn Trọng Tuân (2014), “Khảo sát khả năng ức chế enzym Xanthine oxidase từ lá Sa kê Artocarpus altilis (Park.) Fosb”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, tr. 94101.

14. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt nam, tập 2, tr. 1090-1092, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

n

15. Tường Vy (2012), “Cây Sa kê”, Bản tin Khoa học và ứng dụng - Sở Khoa

hơ

học và Công nghệ - Liên hiệp các hội khoa hoc và kĩ thuật Đồng Nai, số

N

04, tr.13.

Q uy

Tài liệu tiếng Anh

16. Baek N. I., Kennelly E. J., Kardono L. B. S., Tsauri S., Padmawinata K.,

Kè

m

Soejarto D. D., Kinghorn A. D. (1994), “Flavonoids and a proanthocyanidin from rhizomes of Selliguea feei”, Phytochemistry, 36(2),

ạy

pp. 513-518.

D

17. Chen S. K., Zhao P., Shao Y. X., Li Z., Zhang C., Liu P., He X.,

m /+

Luo H. B., Hu X. (2012), “Moracin M from Morus alba L. is a natural

co

phosphodiesterase-4 inhibitor”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 22, pp. 3261–3264.

gl

e.

18. Cos P. et al. (1998), "Structure-activity relationship and classification of

oo

flavonoids as inhibitors of xanthine oxidase and superoxide scavengers.",

G

Journal of Natural Products, 61 (1), pp. 71-76.

19. Dubchak N., Falasca G. F. (2010), "New and improved strategies for the treatment of gout", Int J Nephrol Renovasc Dis, 3, pp. 145-166.

20. Fang S. C., Hsu C. L., Yu Y. S., Yen G. C. (2008), “Cytotoxic effects of new geranyl chalcon derivatives isolated from the leaves of Artocarpus communis in SW 872 human liposarcoma cells”, J Agric Food Chem, 56(19), pp. 8859–8868.

55

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

21. Habtemariam S. (2011), "α-glucosidase inhibitory activity of kaempferol3-O-rutinoside." Natural Product Communications, 6 (2), pp. 201-203.

22. Hafid A. F., Febrianty N., Septiani R. P., Ranggaditya D., Fabriana L. H. (2016), “Antimalarial activity of crude extracts of Artocarpus altilis and Artocarpus camansi”, Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 9(1), pp. 279-281.

n

23. Tran Thu Huong, Nguyen Xuan Cuong, Le Huyen Tram, Tran Thuong

hơ

Quang, Le Van Duong, Nguyen Hoai Nam, Nguyen Tien Dat, Phan

N

Thi Thanh Huong, Chau Ngoc Diep, Phan Van Kiem, Chau Van Minh

Q uy

(2012), “A new prenylated auron from Artocarpus altilis”, Journal of Asian Natural Products Research, 14(9), pp. 923-928.

m

24. Jeon Y. J., Jung S. N., Chang H., Yun J., Lee C. W., Lee J., Kwon B. M.

Kè

(2015), “Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg extracts and geranyl

ạy

dihydrochalcone inhibit STAT3 activity in prostate cancer DU145 cells”,

D

Phytotherapy Research, 29(5), pp. 749-756.

m /+

25. Jeong S. H., Ryu Y. B., Curtis-Long M. J., Ryu H. W., Baek Y. S., Kang J. E., Lee W. S., Park K. H. (2009), “Tyrosinase Inhibitory Polyphenols

co

from Roots of Morus lhou”, J. Agric. Food Chem, 57, pp. 1195–1203.

gl

e.

26. Kazuma K., Noda N., Suzuki M. (2003), “Malonylated flavonol glycosides

oo

from the petals of Clitoria ternatea”, Phytochemistry, 62, pp. 229-237.

27. Kuete V., Fozing D.C., Kapche W.F.G.D., Mbaveng A.T., Kuiate J.R.,

G

Ngadjui B.T., Abegaz B.M. (2009), “Antimicrobial activity of the methanolic extract and compounds from Morus mesozygia stem bark”, Journal of Ethnopharmacology, 124, pp. 551–555.

28. Lan X. H., Xiao S., Gong W., Wang Y., Zhao X.P. (2014), “Study of screening nephroprotective bioactive substances based on triple-color fluorescence probes in Carthami flos”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, (10), pp. 1880-1885.

56

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

29. Li L. Z., Gao P. Y., Song S. J., Yuan Y. Q., Liu C. T., Huang X. X., Liu Q. B. (2015), “Monoterpenes and flavones from the leaves of Crataegus pinnatifida with anticoagulant activities”, Journal of Functional Foods, 12, pp. 237-245.

30. Li Y., Zhang C. Y., Lin T., Wang G. H., Zeng D. Q., Guo Z. J., Zou X. H., Chen H. F. (2013), “Chemical constituents from Elephantopus

n

tomentosus”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 38(11), pp. 1751-1756.

hơ

31. Lotulung P. D., Fajriah S., Hanafi M., Filaila E. (2008), “Identification

Q uy

cells”, Pak J. Biol. Sci., 11(21), pp. 2517–2520.

N

of cytotoxic compound from Artocarpus communis leaves against P-388 32. Lotulung P. D. N, Mozef T., Risdian C., Darmawan A. (2014), “In vitro

m

antidiabetic activities of extract and isolated flavonoid compounds from

Kè

Artocarpus altilis (Parkinson) Forberg”, Indo. J. Chem., 14 (1), pp. 7 – 11.

Huu

Trong, Nguyen

D

Nguyen

ạy

33. Nguyen Thi Thanh Mai, Nguyen Xuan Hai, Dang Hoang Phu, Phan Trung

Nhan (2012), “Three

new

m /+

geranyl aurons from the leaves of Artocarpus altilis”, Phytochemistry

co

Letters, 5, pp. 647–650.

34. Nguyen Thi Thanh Mai, Nguyen Trung Nhan, Nguyen Huu Duy Khang,

gl

e.

Dau Thi Thu Hien, Nguyen Xuan Hai, Dang Hoang Phu, Le Minh Tam, Huu

Trong, Tran Hai Anh, Nguyen Duy Bac, Ueda J.,

oo

Phan Nguyen

Awale S. (2014), “Geranyl Dihydrochalcones from Artocarpus altilis and

G

Their Antiausteric Activity”, Planta Med, 80, pp. 193–200.

35. Mao Y. W., Lin R. D., Hung H. C., Lee M. H. (2014), “Stimulation of osteogenic activity in human osteoblast cells by edible Uraria crinita”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 62(24), pp. 5581-5588.

36. Masuoka C., Ono M., Ito Y., Okawa M., Nohara T. ( 2002), “New megastigmane glycoside and aromadendrane derivative from the aerial part

57

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

of Piper elongatum”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo), 50(10), pp. 1413-1415.

37. Mira A., Yamashita S., Katakura Y., Shimizu K. (2015), “In Vitro Neuroprotective Activities of Compounds from Angelica shikokiana Makino.”, Molecules, 20(3), pp. 4813-4832.

38. Mozef T., Risdian C., Sukandar E. Y., Soemardji A. A. (2015), “Bioactivity

Fosberg)

in

preventing

N

Chemistry, 16, pp. 106-112.

atherosclerosis”, Procedia

hơ

(Parkinson)

n

of ethylacetate fraction from the leaves of “Sukun” (Artocarpus altilis

Q uy

39. Noro T et al (1983), “Inhibitors of xanthine oxidase from flowers and buds of Daphne genkwa”, Chem. Pharm. Bull., 31, p. 3984-3987.

m

40. Nwokocha C. R., Owu D. U., McLaren M., Murray J., Delgoda R., Thaxter

Kè

K., McCalla G., Young L. (2012), “ Possible mechanisms of action of the

ạy

aqueous extract of Artocarpus altilis (breadfruit) leaves in producing

D

hypotension in normotensive Sprague–Dawley rats”, Pharmaceutical

m /+

Biology, 50(9), pp. 1096–1102.

41. Petpiroon N., Suktap C., Pongsamart S., Chanvorachote P., Sukrong S.,

co

(2015), “Kaempferol-3-O-rutinoside from Afgekia mahidoliae promotes

gl

e.

keratinocyte migration through FAK and Rac1 activation.”, Journal of

oo

Natural Medicines, pp. 1-9.

42. Pradhan C., Mohanty M., Rout A. (2013), “Assessment of the antibacterial

G

potential of breadfruit leaf extracts againt pathogenic bacteria”, Int J Pharm, 3(2), pp. 374-379.

43. Raman V., Sudhahar D., Anandarajagopal K.(2012), “Preliminary phytochemical investigation and screening of antimicrobial activity of leaf extracts of Artocarpus altilis”, Asian J. Biol. Life Sci., 1(2), pp 104-107.

44. Riasari H., Ruslan K. (2015), “Metabolite profile of various development bread fruit leaves (Artocarpus altilis Parkinson. Fosberg) and the 58

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

identification of their major componens”, International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 6(5), pp. 2170-2177.

45. Safitri D., Sukandar E. Y., Rachmamaryam S. (2016), “Effect of ethanolic extract of Breadfruit (Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg) leaves on ameliorating renal function of rat”, Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 9(1), pp. 215-218.

n

46. Sairam S., Urooj A. (2014), “Safety Evaluation of Artocarpus altilis as

pages.

J. M.,

Angaswamy

N.,

Vishwanath

Q uy

47. Siddesha

N

hơ

Pharmaceutical Agent in Wistar Rats”, Journal of Toxicology Volume, 8

B. S.

(2011),

“Phytochemical screening and evaluation of in vitro angiotensin-converting

Kè

m

enzyme inhibitory activity of Artocarpus altilis leaf”, Natural Product Research: Formerly Natural Product Letters, 25(20), pp.1931-1940.

ạy

48. Sikarwar M. S., et al (2014), "Antioxidant activity of Artocarpus altilis

D

(Parkinson) Fosberg leaves." Free Radic Res, 4 (2), pp. 33-39.

m /+

49. Szewczyk K., Krzaczek T., Łopatyński T., Gawlik D.U., Zidorn C. (2014), “Flavonoids from Jovibarba globifera (Crassulaceae) rosette leaves and

e.

gl

1658.

co

their antioxidant activity”, Natural Product Research, 28(19), pp. 1655-

oo

50. Takeda Y., Zhang H., Masuda T., Honda G.O., Hideaki, Sezik E., Yesilada

G

E., Sun H. (1997), “Megastigmane glucosides from Stachys Byzantina”, Phytochemistry, 44(7), pp. 1335-1337.

51. Wang W., Li X.C., Ali Z., Khan I.A. (2009), “Two new C(13) norisoprenoids from the leaves of Casearia sylvestris”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo), 57(6), pp. 636-638.

52. Wang Y., Deng T., Lin L., Pan Y., Zheng X. (2006), “Bioassayguided isolation of antiatherosclerotic phytochemicals from Artocarpus altilis”, Phytother Res, 20(12), pp. 1052–1055 .

59

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

53. Wang Y., Xu K., Lin L., Pan Y., Zheng X. (2007), “Geranyl flavonoids from the leaves of Artocarpus altilis”, Phytochemistry, 68(9), pp. 1300– 1306.

54. Watanabe S, Kimura Y, Shindo K, and Fukui T (2006), “Effect of human placenta extract on potassium oxonat-induced elevation of blood acid uricconcentration”, Journal of Health Science, 52 (6), 738-742

n

55. Zhang M., Chen M., Zhang H. Q., Sun S., Xia B., Wu F. H. (2009), “In

hơ

vivo hypoglycemic effects of phenolics from the root bark of Morus alba”,

N

Fitoterapia, 80, pp. 475–477.

Q uy

56. Zhao P., Chen S. K., Cai Y. H., Lu X., Li Z., Cheng Y. K., Zhang C., Hu X., He X., Luo H. L. (2013), “The molecular basis for the inhibition of

Kè

m

phosphodiesterase-4D by three natural resveratrol analogs. Isolation, molecular docking, molecular dynamics simulations, binding free energy,

ạy

and bioassay”, Biochimica et Biophysica Acta, 1834, pp. 2089–2096.

D

57. Zhao X., Zhang W., Yin X., Su M., Sun C., Li X., Chen K. (2015)

m /+

“Phenolic composition and antioxidant properties of different Peach

co

(Prunus persica (L.) Batsch) cultivars in China.”, International Journal of Molecular Sciences, 16(3), pp. 5762-5778.

G

oo

gl

e.

58. Zhou Z., Gilbert M. G. (2003), “Moraceae”, Flora of China, 5, pp. 21-73.

60

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC VÀ BIÊN SOẠN TƯ LIỆU LOÀI THỰC VẬT. PHỤ LỤC 2. KẾT QUẢ PHỔ CỦA CHẤT AR1 (MS, 1H-NMR, 13C-NMR,

n

HMBC, HSQC).

N

DEPT, HMBC, HSQC).

hơ

PHỤ LỤC 3. KẾT QUẢ PHỔ CỦA CHẤT AR2 (MS, 1H-NMR, 13C-NMR,

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

DEPT).

Q uy

PHỤ LỤC 4. KẾT QUẢ PHỔ CỦA CHẤT AR3 (MS, 1H-NMR, 13C-NMR,

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

PHỤ LỤC 1. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC VÀ BIÊN

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

SOẠN TƯ LIỆU LOÀI THỰC VẬT.

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

PHỤ LỤC 2. KẾT QUẢ PHỔ CỦA CHẤT AR1 (MS, 1H-NMR, C-NMR, HMBC, HSQC).

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

13

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Print of window 80: MS Spectrum

593.0

MS Spectrum

100

N

hơ

n

Max: 145344

Kè

m

Q uy

80

m /+

D

ạy

60

595.0

G

20

620.9 628.9 629.9

oo

gl

e.

594.0

co

40

0 300

LCMS SQ 8/4/2014 12:32:50 PM SYSTEM

400

500

600

700

m/z

Page

1 of 1

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

hơ

n

8.562 8.082 8.066 6.919 6.903 6.420 6.228 5.121 5.107 4.880 4.532 3.836 3.817 3.669 3.562 3.556 3.543 3.537 3.495 3.486 3.475 3.464 3.455 3.448 3.430 3.402 3.390 3.373 3.369 3.358 3.345 3.336 3.333 3.330 3.326 3.323 3.308 3.289 3.277 3.259 2.030

AR1−MeOD−1H

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

F2 − Acquisition Parameters Date_ 20140522 Time 15.58 INSTRUM spect PROBHD 5 mm Multinucl PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT MeOD NS 16 DS 0 SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2769001 sec RG 90.5 DW 50.000 usec DE 6.00 usec TE 300.0 K D1 1.00000000 sec MCREST 0.00000000 sec MCWRK 0.01500000 sec

m /+

======== CHANNEL f1 ======== NUC1 1H P1 8.50 usec PL1 −4.00 dB SFO1 500.1335009 MHz

oo

gl

e.

co

F2 − Processing parameters SI 32768 SF 500.1300011 MHz WDW EM SSB 0 LB 0.30 Hz GB 0 PC 1.00

5

4

3

2

1 2.994

6

1.155 1.087 1.012 1.066 2.904 2.969 2.090

7

1.015

8

1.000 1.017

9

1.935

10

1.962

G 11

2.088

12

Current Data Parameters NAME 11K_AR1 EXPNO 1 PROCNO 1

0

ppm

6.5 6.0

1.015

7.0

1.017

7.5 1.000

8.0

1.935

m /+

co

e.

gl

oo

G

8.5

1.962

2.088

D

Kè

ạy

6.228

6.420

5.121 5.107

n

hơ

N

Q uy

m

6.919 6.903

8.082 8.066

8.562

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

AR1−MeOD−1H

5.5 ppm

4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 2.090

4.2 2.969

4.3 2.904

4.4 1.066

4.5

m /+

co

e.

gl

2.994

oo 1.1

1.012

4.6

G 1.2

1.087

4.7 1.155

D

Kè

ạy

n

hơ

N

Q uy

m

3.669 3.562 3.556 3.543 3.537 3.495 3.486 3.475 3.464 3.455 3.448 3.430 3.402 3.390 3.373 3.369 3.358 3.345 3.336 3.333 3.330 3.326 3.323 3.308 3.289 3.277 3.259

3.836 3.817

4.532

1.150 1.138

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

AR1−MeOD−1H

ppm

3.3 3.2 3.1 ppm

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

17.896

116.138 105.584 104.657 102.403 100.083 95.015 78.098 77.173 75.680 73.874 72.271 72.045 71.434 69.709 68.632 49.846 49.508 49.337 49.167 48.997 48.825 48.656 48.486

Current Data Parameters NAME 11K_AR1 EXPNO 2 PROCNO 1

hơ

n

122.704

135.502 132.362

166.223 162.882 161.499 159.510 158.523

179.342

AR1−MeOD−C13CPD

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

F2 − Acquisition Parameters Date_ 20140523 Time 12.19 INSTRUM spect PROBHD 5 mm Multinucl PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT MeOD NS 512 DS 2 SWH 31446.541 Hz FIDRES 0.479836 Hz AQ 1.0420883 sec RG 32768 DW 15.900 usec DE 6.00 usec TE 300.0 K D1 2.00000000 sec d11 0.03000000 sec DELTA 1.89999998 sec MCREST 0.00000000 sec MCWRK 0.01500000 sec

co

======== CHANNEL f1 ======== NUC1 13C P1 7.40 usec PL1 0.00 dB SFO1 125.7715724 MHz

oo

gl

e.

======== CHANNEL f2 ======== CPDPRG2 waltz16 NUC2 1H PCPD2 80.00 usec PL2 −4.00 dB PL12 15.47 dB PL13 22.00 dB SFO2 500.1320005 MHz

G

F2 − Processing parameters SI 32768 SF 125.7576167 MHz WDW EM SSB 0 LB 1.00 Hz GB 0 PC 1.00

200

180

160

140

120

100

80

60

40

20

ppm

180 175 170

m /+

co

e.

gl

oo

G

D

Kè

ạy

165 160 78

155 76 74

150 72

145 140 135 130 125 120 115 110 105 100

95.015

100.083

102.403

105.584 104.657

n 116.138

122.704

hơ

N

Q uy

m

132.362

135.502

162.882 161.499 159.510 158.523

166.223

179.342

69.709 68.632

72.271 72.045 71.434

73.874

75.680

78.098 77.173

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

AR1−MeOD−C13CPD

ppm

ppm

m /+ 4

3

co

D

Kè ạy

n hơ N Q uy m

AR1−MeOD−HMBC

5

e.

6

2

gl

7

oo

8

1

G

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ppm 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 ppm

6.0

m /+

D 6.5

co

Kè ạy

n hơ N Q uy m

AR1−MeOD−HMBC

7.0

e.

7.5

5.5

gl

8.0

oo

8.5

ppm

95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 5.0 ppm

G

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

2.5

m /+

D

Kè ạy 3.0

2.0

co

n hơ N Q uy m

AR1−MeOD−HMBC

3.5

e.

4.0

1.5

gl

4.5

oo

5.0

1.0

G

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ppm 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 ppm

3.6

m /+

D 3.8

co

Kè ạy

n hơ N Q uy m

AR1−MeOD−HMBC

4.0

e.

4.2

3.4

gl

4.4

oo

4.6

3.2

G

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ppm 65

70

75

80

85

90

95

100

105

ppm

AR1−MeOD−HSQC

G

2

oo

gl

e.

3

co

4

m /+

D

5

ạy

Kè

6

m

Q uy

7

N

hơ

8

n

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

1 ppm

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

ppm

5.5

m /+

D 6.0

co

Kè ạy

n hơ N Q uy m

AR1−MeOD−HSQC

6.5

5.0

e.

7.0

gl

7.5

oo

8.0

4.5

G

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ppm

95

100

105

110

115

120

125

130

135 ppm

m /+

D 3.5

3.4

co

Kè ạy

n hơ N Q uy m

AR1−MeOD−HSQC

3.6

e.

3.7

3.3

gl

3.8

oo

3.9

G

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ppm 67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79 3.2 ppm

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

hơ

C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC).

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

13

n

PHỤ LỤC 3. KẾT QUẢ PHỔ CỦA CHẤT AR2 (MS, 1H-NMR,

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Print of window 80: MS Spectrum

373.1

MS Spectrum

100

N

hơ

n

Max: 178816

Kè

m

Q uy

80

m /+

D

ạy

60

e.

428.2

374.1

429.2

G

20

293.1

oo

gl

211.1

co

40

0 100

LCMS SQ 9/18/2014 2:49:08 PM SYSTEM

200

300

400

500

600 m/z

Page

1 of 1

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Print of window 80: MS Spectrum

407.1

MS Spectrum

100

N

hơ

n

Max: 96184

Kè

m

Q uy

80

m /+

D

ạy

60

oo

408.1 409.3

gl

e.

co

40

410.1

401.2

391.2

434.1

G

20

0 200

LCMS SQ 9/18/2014 2:50:00 PM SYSTEM

250

300

350

400

450

500

m/z

Page

1 of 1

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

hơ

n

5.824 4.839 4.800 4.356 4.340 3.919 3.909 3.907 3.895 3.891 3.887 3.867 3.864 3.774 3.685 3.674 3.662 3.659 3.651 3.388 3.370 3.353 3.337 3.334 3.330 3.327 3.324 3.310 3.290 3.283 3.278 3.270 3.268 3.253 3.248 3.178 3.162 3.160 3.144 2.501 2.466 2.072 2.069 2.022 2.013 2.008 1.998 1.992 1.989 1.978 1.971 1.962 1.951

AD14−MeOD−1H AR2−MeOD−1H

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

F2 − Acquisition Parameters Date_ 20140522 Time 10.23 INSTRUM spect PROBHD 5 mm Multinucl PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT MeOD NS 16 DS 0 SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2769001 sec RG 181 DW 50.000 usec DE 6.00 usec TE 300.0 K D1 1.00000000 sec MCREST 0.00000000 sec MCWRK 0.01500000 sec

m /+

======== CHANNEL f1 ======== NUC1 1H P1 10.00 usec PL1 −2.00 dB SFO1 500.1335009 MHz

oo

gl

e.

co

F2 − Processing parameters SI 32768 SF 500.1300008 MHz WDW EM SSB 0 LB 0.30 Hz GB 0 PC 1.00

G 7

6

5

4

3

2

1

1.037 3.089 3.302 2.170 1.107 3.276 3.218 3.287

8

1.089 2.173 1.107 1.179 2.216 1.090

9

1.000

10

Current Data Parameters NAME 11K_AR2 EXPNO 1 PROCNO 1

0

ppm

4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 1.090

4.1 2.216

4.2 1.179

4.3

m /+

co

e.

gl

oo

1.000 5.8

1.107

4.4

G

5.9

2.173

1.089

D

Kè

ạy

n

3.388 3.370 3.353 3.337 3.334 3.330 3.327 3.324 3.310 3.290 3.283 3.278 3.270 3.268 3.253 3.248 3.178 3.162 3.160 3.144

hơ

N

Q uy

m

3.685 3.674 3.662 3.659 3.651

3.774

3.919 3.909 3.907 3.895 3.891 3.887 3.867 3.864

4.356 4.340

5.825 5.824

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

AD14−MeOD−1H AR2−MeOD−1H

ppm

3.2 ppm

2.5 2.4 2.2 2.0 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4

Kè

ạy

n

hơ

N

Q uy

m

1.033

1.1 3.287

1.113

D

1.2 3.218

m /+

co

2.072 2.069 2.022 2.013 2.008 1.998 1.992 1.989 1.978 1.971 1.962 1.951 1.707 1.703 1.698 1.695 1.689 1.684 1.680 1.673 1.663 1.659 1.652 1.640 1.636 1.629 1.625 1.619 1.613 1.603 1.564 1.550 1.540 1.533 1.528 1.521 1.517 1.512

2.501 2.466

1.212 1.200

1.3 3.276

1.107

1.9 2.170

2.1

3.302

e.

gl

oo

G

2.3 3.089

1.037

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

AD14−MeOD−1H AR2−MeOD−1H

ppm

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

78.151 77.892 75.480 75.144 71.825 62.911 52.379 49.510 49.338 49.168 48.999 48.827 48.657 48.488 48.074 37.796 37.317 29.055 27.528 26.819 24.972 19.865

Current Data Parameters NAME 11K_AR2 EXPNO 2 PROCNO 1

hơ

n

102.105

125.373

170.125

202.424

AD14−MeOD−C13CPD AR2−MeOD−C13CPD

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

F2 − Acquisition Parameters Date_ 20140523 Time 10.36 INSTRUM spect PROBHD 5 mm Multinucl PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT MeOD NS 256 DS 2 SWH 31446.541 Hz FIDRES 0.479836 Hz AQ 1.0420883 sec RG 32768 DW 15.900 usec DE 6.00 usec TE 295.4 K D1 2.00000000 sec d11 0.03000000 sec DELTA 1.89999998 sec MCREST 0.00000000 sec MCWRK 0.01500000 sec

co

======== CHANNEL f1 ======== NUC1 13C P1 6.60 usec PL1 −1.00 dB SFO1 125.7715724 MHz

oo

gl

e.

======== CHANNEL f2 ======== CPDPRG2 waltz16 NUC2 1H PCPD2 80.00 usec PL2 −2.00 dB PL12 16.06 dB PL13 22.00 dB SFO2 500.1320005 MHz

G

F2 − Processing parameters SI 32768 SF 125.7576139 MHz WDW EM SSB 0 LB 1.00 Hz GB 0 PC 1.00

220

200

180

160

140

120

100

80

60

40

20

ppm

80 75

m /+

co

e.

gl

oo

G

70 65

D

Kè

ạy

60 55 50 45 40 35 30 25

19.865

24.972

27.528 26.819

29.055

37.796 37.317

n

hơ

N

Q uy

m

52.379 49.510 49.338 49.168 48.999 48.827 48.657 48.488 48.074

62.911

71.825

75.480 75.144

78.151 77.892

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

AD14−MeOD−C13CPD AR2−MeOD−C13CPD

ppm

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

AD14−MeOD−C13CPD AR2−MeOD−C13CPD &DEPT

200

190

180

170

160

150

200

190

180

170

160

150

200

190

180

170

140

130

120

110

100

90

80

70

60

50

40

30

20

ppm

m

210

Q uy

N

hơ

n

DEPT90

Kè

DEPT135

m /+

D

ạy

CH&CH3

130

120

110

100

90

80

70

60

50

40

30

20

ppm

130

120

110

100

90

80

70

60

50

40

30

20

ppm

G

oo

gl

C13CPD

140

e.

210

co

CH2

210

160

150

140

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

AD14−MeOD−C13CPD AR2−MeOD−C13CPD &DEPT

70

65

60

70

65

60

55

50

45

40

35

30

25

20

ppm

m

75

Q uy

N

hơ

n

DEPT90

Kè

DEPT135

m /+

D

ạy

CH&CH3

55

50

45

40

35

30

25

20

ppm

55

50

45

40

35

30

25

20

ppm

e.

75

co

CH2

G

oo

gl

C13CPD

75

70

65

60

3.0

D

Kè ạy 3.5

2.5

m /+

4.0

co

n hơ N Q uy m

AR2−MeOD−HMBC AD14−MeOD−HMBC

4.5

2.0

e.

5.0

1.5

gl

5.5

oo

6.0

1.0

G

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ppm

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 ppm

1.6

m /+

D

Kè ạy 1.8

1.4

co

n hơ N Q uy m

AR2−MeOD−HMBC AD14−MeOD−HMBC

2.0

e.

2.2

1.2

gl

2.4

oo

2.6

1.0

G

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ppm

125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 190 195 200 205 210 ppm

m /+ co 4.0

e.

D

Kè ạy

n hơ N Q uy m

AR2−MeOD−HMBC AD14−MeOD−HMBC

4.5

3.5

gl

5.0

oo

5.5

G

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ppm 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 ppm

1.6

m /+

D

Kè ạy

1.8

1.4

co

n hơ N Q uy m

AR2−MeOD−HMBC AD14−MeOD−HMBC

2.0

e.

2.2

1.2

gl

2.4

oo

2.6

1.0

G

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ppm 20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

ppm

3.0

D

Kè ạy 3.5

2.5

m /+

n hơ N Q uy m

AR2−MeOD−HSQC AD14−MeOD−HSQC

4.0

2.0

co

4.5

e.

5.0

1.5

gl

5.5

1.0

oo

6.0

G

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ppm 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 ppm

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

AR2−MeOD−HSQC AD14−MeOD−HSQC

ppm 20

N

hơ

n

25

30

Q uy

35

Kè

m

40

D

ạy

45

m /+

50

gl

e.

co

55

G

oo

60

65

70

75

80 4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

ppm

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

hơ

C-NMR, DEPT).

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

13

n

PHỤ LỤC 4. KẾT QUẢ PHỔ CỦA CHẤT AR3 (MS, 1H-NMR,

Print of window 80: MS Spectrum

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

243.0

MS Spectrum

100

N

hơ

n

Max: 53920

Kè

m

Q uy

80

m /+

D

ạy

60

G

20

244.0

oo

gl

e.

co

40

0 100

150

LCMS SQ 8/4/2014 4:52:53 PM SYSTEM

200

250

300

350

400

m/z

Page

1 of 1

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

0.968

Current Data Parameters NAME 11K_AR3 EXPNO 1 PROCNO 1

hơ

n

2.175

3.369 3.336 3.333 3.330 3.326 3.323

7.377 7.361 6.932 6.931 6.919 6.915 6.780 6.776 6.764 6.760 6.747 6.743 6.266 6.262 6.258 4.894 4.854

AR3−MeOD−1H

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

F2 − Acquisition Parameters Date_ 20140526 Time 19.33 INSTRUM spect PROBHD 5 mm Multinucl PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT MeOD NS 16 DS 0 SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2769001 sec RG 161.3 DW 50.000 usec DE 6.00 usec TE 300.0 K D1 1.00000000 sec MCREST 0.00000000 sec MCWRK 0.01500000 sec

m /+

======== CHANNEL f1 ======== NUC1 1H P1 8.50 usec PL1 −4.00 dB SFO1 500.1335009 MHz

G

oo

gl

e.

co

F2 − Processing parameters SI 32768 SF 500.1300011 MHz WDW EM SSB 0 LB 0.30 Hz GB 0 PC 1.00

9

8

7

6

5

4

3

2 0.634

10

1.105 2.127 2.087 1.047 1.002

11

1

ppm

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

49.625 49.510 49.337 49.283 49.168 48.999 48.826 48.657 48.488

113.262 103.974 103.552 102.196 98.488

Current Data Parameters NAME 11K_AR3 EXPNO 2 PROCNO 1

hơ

n

123.067 121.983

159.949 157.261 156.842 156.158

AR3−MeOD−C13CPD

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

F2 − Acquisition Parameters Date_ 20140529 Time 14.30 INSTRUM spect PROBHD 5 mm Multinucl PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT MeOD NS 2048 DS 2 SWH 31446.541 Hz FIDRES 0.479836 Hz AQ 1.0420883 sec RG 32768 DW 15.900 usec DE 6.00 usec TE 304.1 K D1 2.00000000 sec d11 0.03000000 sec DELTA 1.89999998 sec MCREST 0.00000000 sec MCWRK 0.01500000 sec

co

======== CHANNEL f1 ======== NUC1 13C P1 7.40 usec PL1 0.00 dB SFO1 125.7715724 MHz

oo

gl

e.

======== CHANNEL f2 ======== CPDPRG2 waltz16 NUC2 1H PCPD2 80.00 usec PL2 −4.00 dB PL12 15.47 dB PL13 22.00 dB SFO2 500.1320005 MHz

G

F2 − Processing parameters SI 32768 SF 125.7576129 MHz WDW EM SSB 0 LB 1.00 Hz GB 0 PC 1.00

220

200

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0 ppm

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

98.488

103.974 103.552 102.196

hơ

n

113.262

123.067 121.983

157.261 156.842 156.158

159.949

AR3−MeOD−C13CPD

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

F2 − Acquisition Parameters Date_ 20140529 Time 14.30 INSTRUM spect PROBHD 5 mm Multinucl PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT MeOD NS 2048 DS 2 SWH 31446.541 Hz FIDRES 0.479836 Hz AQ 1.0420883 sec RG 32768 DW 15.900 usec DE 6.00 usec TE 304.1 K D1 2.00000000 sec d11 0.03000000 sec DELTA 1.89999998 sec MCREST 0.00000000 sec MCWRK 0.01500000 sec

co

======== CHANNEL f1 ======== NUC1 13C P1 7.40 usec PL1 0.00 dB SFO1 125.7715724 MHz

oo

gl

e.

======== CHANNEL f2 ======== CPDPRG2 waltz16 NUC2 1H PCPD2 80.00 usec PL2 −4.00 dB PL12 15.47 dB PL13 22.00 dB SFO2 500.1320005 MHz F2 − Processing parameters SI 32768 SF 125.7576129 MHz WDW EM SSB 0 LB 1.00 Hz GB 0 PC 1.00

G 160

155

150

145

140

Current Data Parameters NAME 11K_AR3 EXPNO 2 PROCNO 1

135

130

125

120

115

110

105

100 ppm

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

AR3−MeOD−C13CPD &DEPT

170

160

150

140

130

160

150

140

130

160

150

120

110

100

90

80

70

60

50

40

30

20

ppm

m

180

Q uy

N

hơ

n

DEPT90

Kè

DEPT135

m /+

D

ạy

CH&CH3

170

110

100

90

80

70

60

50

40

30

20

ppm

110

100

90

80

70

60

50

40

30

20

ppm

G

oo

gl

C13CPD

120

e.

180

co

CH2

180

170

140

130

120

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

AR3−MeOD−C13CPD &DEPT

120

118

116

114

122

120

118

116

122

120

112

Q uy

122

110

108

106

104

102

100

98

ppm

m

124

co

N

hơ

n

DEPT90

Kè

DEPT135

m /+

D

ạy

CH&CH3

124

112

110

108

106

104

102

100

98

ppm

114

112

110

108

106

104

102

100

98

ppm

G

oo

gl

C13CPD

114

e.

CH2

124

118

116