XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC CHỐNG DỊ ỨNG TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THANH TUYỀN

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC CHỐNG DỊ ỨNG TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƢỢC BẰNG LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THANH TUYỀN

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC CHỐNG DỊ ỨNG TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƢỢC BẰNG LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2019

LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện đề tài Luận văn thạc sĩ dược học, các thầy cô, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp là những người đã luôn động viên, hỗ trợ, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành đề tài một cách hoàn thiện nhất.

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, là người đã tận tình hướng dẫn và luôn tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài của mình.

Tôi xin được cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Xuân Trường và các anh chị cán bộ Trung tâm giám định ma túy – Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an đã hỗ trợ cho tôi về thiết bị LC-MS/MS để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn NCS.Ths. Trần Thúy Hạnh – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và NCS.Ths. Đào Thị Cẩm Minh – Trường Đại học Y Dược Huế đã giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu, thực hiện luận văn.

Tôi xin được cảm ơn các thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là các thầy cô Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất đã truyền đạt cho tôi những kiến thức cần thiết, là nền tảng để tôi có thể xây dựng, thực hiện và hoàn thành đề tài nghiên cứu. Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn Công ty Cổ phần Traphaco đã giúp đỡ tôi trong quá trình tạo nền mẫu nghiên cứu, xin được cảm ơn Ban lãnh đạo và các anh chị cán bộ Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia đã tạo điều kiện về trang thiết bị, máy móc để hỗ trợ tôi suốt trong quá trình thực hiện đề tài.

Lời cuối cùng tôi xin dành lời cám ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn khích lệ, tạo động lực cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua.

Hà Nội, tháng 3 năm 2019 Học viên Phạm Thị Thanh Tuyền

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về các đối tƣợng nghiên cứu .......................................................... 3 1.1.1. Nhóm thuốc đối kháng thụ thể histamin H1 ..................................................... 3 1.1.2. Nhóm thuốc glucocorticoid ............................................................................... 5 1.1.3. Dược liệu và chế phẩm đông dược điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng ................ 8 1.2. Một số nghiên cứu phát hiện thuốc chống dị ứng trộn trái phép trong chế phẩm đông dƣợc ...................................................................................................... 10 1.2.1. Trên thế giới .................................................................................................... 10 1.2.2. Tại Việt Nam ................................................................................................... 12 1.3. Tổng quan về sắc ký lỏng khối phổ ................................................................ 14 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 18 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tƣợng nghiên cứu ........................................ 18 2.1.1. Hoá chất - chất chuẩn ...................................................................................... 18 2.1.2. Máy móc - trang thiết bị .................................................................................. 18 2.1.3. Đối tượng nghiên cứu...................................................................................... 19 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................ 20 2.2.1. Xử lý mẫu ........................................................................................................ 20 2.2.2. Xây dựng phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS ...................................... 20 2.2.3. Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng ................................................... 21 2.2.4. Ứng dụng quy trình phân tích trên mẫu thực .................................................. 21 2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu .............................................................................. 22 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 23 3.1. Xây dựng phƣơng pháp phân tích .................................................................. 23 3.1.1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn ........................................................................ 23

3.1.2. Khảo sát và lựa chọn các điều kiện khối phổ .................................................. 23 3.1.3. Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu ...................................................... 29 3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích ................................................................ 35 3.2.1. Độ phù hợp của hệ thống ................................................................................ 35 3.2.2. Độ đặc hiệu ..................................................................................................... 36 3.2.3. Khoảng nồng độ tuyến tính ............................................................................. 38 3.2.4. Độ đúng và độ chính xác ................................................................................. 40 3.2.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ..................................................... 43 3.3. Ứng dụng phân tích trên mẫu thực ................................................................ 45 Chƣơng 4. BÀN LUẬN ........................................................................................... 50 4.1. Về nền mẫu ....................................................................................................... 50 4.2. Về phƣơng pháp phân tích .............................................................................. 50 4.3. Về xử lý mẫu ..................................................................................................... 52 4.4. Về thẩm định phƣơng pháp phân tích ........................................................... 52 4.5. Ứng dụng ........................................................................................................... 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt AOAC AR BET Chuẩn DĐVN Chuẩn PTN CLO CYP DEX H HPLC HPTLC ICH LC – MS/MS LOD LOQ LOR m/z PA RSD S/N TLC TOF UHPLC

Tiếng anh hoặc tên khoa học Association of Official Analytical Chemists Analytical Reagent Betamethason

Tiếng việt Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống Thuốc thử phân tích Chuẩn Dược điển Việt Nam Chuẩn phòng thí nghiệm

Chlorpheniramin maleat Cyproheptadin hydroclorid Dexamethason acetat Hiệu suất High Performance Liquid Chromatography High Performance Thin Layer Chromatography International Conference on Harmonisation Liquid Chromatography – Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry Limit of Detection Limit of Quantitation Loratadin Pure Analysis Relative Standard Deviation Signal/Noise Thin Layer Chromatography Time Of Flight Ultra High Performance Liquid Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Hội nghị hòa hợp quốc tế Sắc ký lỏng hai lần khối phổ Giới hạn phát hiện Giới hạn định lượng Khối lượng/ điện tích Tinh khiết phân tích Độ lệch chuẩn tương đối Tín hiệu/Nhiễu Sắc ký lớp mỏng Thời gian bay Sắc ký lỏng hiệu suất siêu cao

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng ........ 8 Bảng 1.2. Một số chế phẩm đông dược điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng lưu hành trên thị trường ..................................................................................... 9 Bảng 1.3. Một số nghiên cứu phân tích các thuốc chống dị ứng trộn trái phép trong chế phẩm đông dược ................................................................................................... 11 Bảng 2.4. Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu ............................................... 18 Bảng 3.5. Các thông số máy khối phổ......................................................................... 24 Bảng 3.6. Điều kiện khối phổ của các chất phân tích ................................................. 24 Bảng 3.7. Điều kiện khảo sát pha động theo chế độ gradient ..................................... 26 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát dung môi chiết (n=3) ....................................................... 31 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát thời gian siêu âm (n = 3) ................................................. 33 Bảng 3.10. Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS (n=6) ................ 35 Bảng 3.11. Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp ................................................... 38 Bảng 3.12. Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất phân tích ............................................................................................................................... 39 Bảng 3.13. Kết quả độ đúng và độ chính xác trong ngày trên 3 nền mẫu (n=7) ........ 40 Bảng 3.14. Kết quả độ đúng và độ chính xác khác ngày trên 3 nền mẫu (n=7) ......... 41 Bảng 3.15. Kết quả độ đúng và độ chính xác trên 3 nền mẫu (n=14) ......................... 42 Bảng 3.16. Kết quả LOD và LOQ trên 3 nền mẫu ...................................................... 44 Bảng 3.17. Kết quả định tính trên mẫu thực ............................................................... 48 Bảng 3.18. Kết quả đánh giá các mẫu thực dương tính .............................................. 49

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS......................................................................... 15 Hình 1.2. Sơ đồ sự tạo thành ion dương trong ESI ..................................................... 16 Hình 1.3. Bộ phân tích tứ cực ..................................................................................... 16 Hình 1.4. Mô hình bộ phân tích tứ cực chập ba .......................................................... 16 Hình 3.5. Sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký ...................................................................... 25 Hình 3.6. Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ pha động ............................................................... 27 Hình 3.7. Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng pha động ................................................... 28 Hình 3.8. Biểu đồ đánh giá hiệu suất chiết phụ thuộc loại dung môi (nền N3) .......... 32 Hình 3.9. Biểu đồ đánh giá hiệu suất chiết phụ thuộc thời gian siêu âm (nền N3) ..... 34 Hình 3.10. Quy trình xử lý mẫu .................................................................................. 34 Hình 3.11. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu trên nền N1 ............................................. 37 Hình 3.12. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu trên nền N2 ............................................. 37 Hình 3.13. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu trên nền N3 ............................................. 37 Hình 3.14. Sắc ký đồ các chất phân tích ở nồng độ LOD trên nền N3 ....................... 44 Hình 3.15. Sắc ký đồ và phổ định danh cyproheptadin hydroclorid trong mẫu H05 46 Hình 3.16. Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính H05 để định lượng .......................... 46 Hình 3.17. Sắc ký đồ và phổ định danh dexamethason acetat trong mẫu B13 ........... 47 Hình 3.18. Sắc ký đồ và phổ định danh chlorpheniramin maleat trong mẫu B13 ...... 47 Hình 3.19. Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính B13 để định lượng .......................... 48

ĐẶT VẤN ĐỀ Dị ứng ngày nay được coi là bệnh của cuộc sống hiện đại, hiện trên thế giới có hơn 1 tỉ người đang mắc bệnh này và ở Việt Nam tỉ lệ mắc là khoảng 20% dân số cả nước [36], [39]. Các nhóm thuốc hóa dược để điều trị dị ứng bao gồm nhóm đối kháng thụ thể histamin H1 và glucocorticoid. Tuy nhiên cả hai nhóm này đều có thể gây những tác dụng phụ nghiêm trọng như: buồn ngủ, khô mắt, dị ứng, lệ thuộc thuốc; loãng xương, giữ nước gây phù, tăng huyết áp, viêm loét dạ dày, đái tháo đường, rối loạn tâm thần, đục thủy tinh thể, suy thượng thận...[5]. Đặc biệt khi được trộn lẫn vào các chế phẩm đông dược và dùng trong thời gian dài thì sẽ càng làm trầm trọng hơn các tác dụng không mong muốn.

Gần đây các chế phẩm đông dược đang ngày càng được sử dụng rộng rãi để phòng bệnh, cải thiện sức khỏe và điều trị những bệnh mãn tính. Nhiều chế phẩm đông dược đã được đưa vào thị trường để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe của người dân. Tuy nhiên, để tăng cường hoặc ngụy tạo tác dụng của các chế phẩm này mà một số nhà sản xuất đã pha trộn với thuốc hóa dược không được khai báo [17].

Các thuốc hóa dược được tìm thấy điển hình là thuốc điều trị đái tháo đường, chất ức chế phosphodiesterase-5 (PDE's-5), thuốc giảm béo, thuốc chống cao huyết áp, thuốc

giảm

đau

chống

viêm

không

steroid,

thuốc

chống

dị

ứng,

glucocorticoid…[16], [24], [26], [32]. Trong đó, đã có một số công bố về các thuốc chống dị ứng bao gồm nhóm thuốc đối kháng thụ thể histamin H1 như chlorpheniramin, cetirizin, diphenhydramin, loratadin…[24], [27], [34] và các glucocorticoid như dexamethason, betamethason [14], [23].

Với tình hình trên, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã ban hành một số hướng dẫn nhằm giám sát sự an toàn của thuốc thảo dược và tăng cường cơ quan quản lý thuốc của các quốc gia thành viên khác nhau. Ví dụ, trong năm 2007, Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) đã ban hành các quy định về thực hành sản xuất tốt (GMP) cho các thực phẩm chức năng và ghi nhãn thích hợp cho các sản phẩm thảo dược [22]. Các nước thành viên EU (Liên minh Châu Âu) cũng có các quy tắc để kiểm soát các sản phẩm thảo dược.

1

Ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu phát hiện thuốc hóa dược trộn lẫn trong đông dược, chủ yếu thuộc các nhóm giảm đau chống viêm không steroid, hạ huyết áp, hạ đường máu, glucocorticoid [8], [9], [10], [12], nhưng hiện nay chưa có nghiên cứu nào về việc trộn lẫn các thuốc hóa dược chống dị ứng nhóm đối kháng thụ thể histamin H1 trong chế phẩm đông dược được công bố.

Các phương pháp hay được sử dụng trong phát hiện thuốc hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bao gồm sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC). Tuy nhiên những phương pháp trên vẫn còn hạn chế như có thể cho kết quả âm tính giả hoặc dương tính giả. Hiện nay, sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ là một kỹ thuật mà gắn kết tiềm năng phân tích lý học của sắc ký lỏng (LC) với một khả năng phân tích khối (m/z) của bộ phận khối phổ (MS). Thiết bị LC-MS là một kỹ thuật được ứng dụng ngày càng nhiều do có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp để phân tích trên các nền mẫu phức tạp như các chế phẩm đông dược. Để góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn lẫn trong chế phẩm đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xây dựng phƣơng pháp xác định một số thuốc chống dị ứng trộn trái phép trong chế phẩm đông dƣợc bằng LC-MS/MS”. Với mục tiêu: 1.

Xây dựng phương pháp xác định đồng thời betamethason, dexamethason

acetat, chlorpheniramin maleat, cyproheptadin hydroclorid, loratadin trộn trái phép trong chế phẩm đông dược dạng rắn bằng LC-MS/MS. 2.

Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định các dược chất trên trộn trái

phép trong một số chế phẩm đông dược đang lưu hành trên thị trường.

2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về các đối tƣợng nghiên cứu Theo Tổ chức Y tế Thế giới, dị ứng là một rối loạn quá mẫn của hệ miễn dịch.

Phản ứng dị ứng xảy ra để chống lại các chất vô hại trong môi trường được gọi là chất gây dị ứng, các phản ứng này xảy ra nhanh chóng và có thể dự đoán được.

Thực tế, dị ứng là một trong bốn hình thức của chứng quá mẫn cảm. Nó kích hoạt quá mức các tế bào bạch cầu lympho B và một loại kháng thể được gọi là IgE, dẫn đến một phản ứng viêm nặng thông thường bao gồm chàm, phát ban, sốt, lên cơn hen suyễn, ngộ độc thức ăn, phản ứng với nọc độc của côn trùng chích như ong, muỗi, kiến... Dị ứng nhẹ rất phổ biến, gây ra các triệu chứng như viêm kết mạc dị ứng, ngứa và chảy nước mũi... Để điều trị dị ứng, ngoài tránh tiếp xúc với các tác nhân gây dị ứng, còn có thể sử dụng các thuốc hóa dược chống dị ứng như nhóm thuốc đối kháng thụ thể histamin H1, nhóm thuốc glucocorticoid hoặc có thể dùng các chế phẩm đông dược.

1.1.1. Nhóm thuốc đối kháng thụ thể histamin H1 Trên lâm sàng thuốc kháng histamin H1 dùng để ngăn ngừa các biểu hiện dị ứng, ngăn ngừa chứng say tàu xe. Vài thuốc kháng histamin H1 khác còn có thể dùng để điều trị ốm nghén, chúng có tác dụng chống nôn và chống dị ứng.

Thuốc kháng histamin H1 có 2 thế hệ. Thuốc kháng histamin H1 thế hệ 1 như: chlorpheniramin, diphenhydramin... thường có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương gây an thần, tuy nhiên mức độ tác dụng không giống nhau giữa các thuốc và các cá thể. Thuốc kháng histamin H1 thế hệ 2 như: loratadin, cyproheptadin... ít có tác dụng này.

Tác dụng không mong muốn: Thay đổi tuỳ theo từng cá thể, thường biểu hiện ức chế thần kinh (ngủ gà, khó chịu, giảm phản xạ, mệt), chóng mặt, thường gặp ở các thuốc kháng histamin H1 thế hệ 1. Tác dụng an thần trên gây nguy hiểm cho người sử dụng thuốc khi lái tàu, xe, làm việc trên cao, công việc cần sự tỉnh táo.

3

Các kháng histamin H1 làm tăng tác dụng của rượu và các thuốc ức chế thần kinh trung ương, gây chóng mặt, mệt mỏi, mất sự phối hợp nhịp nhàng, ù tai, bồn chồn, tăng co giật (động kinh) ở trẻ em. Ở cùng liều điều trị, các thuốc thế hệ 2 ít gây tác dụng không mong muốn hơn.

Các kháng histamin H1 thế hệ 1 còn có tác dụng kháng cholinergic nên gây khô miệng, họng và mũi. Ngoài ra còn gây căng ngực, đau đầu. Trên tiêu hóa, gây ăn kém ngon, nôn, buồn nôn, tiêu chảy….

1.1.1.1. Chlorpheniramin maleat - Công thức cấu tạo:

- Công thức phân tử: C16H19ClN2.C4H4O4 (M=390,9).

- Tên khoa học: (RS) -3-(4 clorophenyl) - 3 - (2-pyridyl) propyldimethylamin hydrogen maleat.

- Tính chất vật lý: Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, không mùi. Dễ tan trong nước, tan trong ethanol 96 %, cloroform; ít tan trong ether và benzen [7] .

- Chỉ định: Dị ứng ở đường hô hấp trên (cấp hoặc mạn) như viêm mũi dị ứng; dị ứng da (mày đay, chứng da nổi quầng, phát ban); phù Quincke; dị ứng thuốc, thức ăn…

- Tác dụng phụ: Buồn ngủ, thẫn thờ, choáng váng.

- Liều dùng: Người lớn: 4 mg/lần x 4 - 6 lần/ 24 giờ; tối đa 40 mg/24 giờ [3].

1.1.1.2. Cyproheptadin hydroclorid - Công thức cấu tạo:

- Công thức phân tử: C21H21N.HCl.3/2H2O (M= 350.9).

4

- Tên khoa học: 4-(5H-dibenzo[a,d] cyclohepten-5-yliden)-1-methylpiperidin hydroclorid.

- Tính chất vật lý: Bột tinh thể trắng hoặc trắng ngà, không mùi, vị hơi đắng. Tương đốì bển với ánh sáng, không khí và hơi ẩm ở nhiệt độ phòng. Chảy ở khoảng 162°C, dạng khan ỏ 250°C. Ít tan trong nước, tan trong ethanol, không tan trong ether [7].

- Chỉ định: Dùng cho các trường hợp viêm mũi dị ứng; dị ứng nhẹ, mề đay, phù mạch, da nổi quầng. Chủ yếu điều trị ngứa do các dị ứng tại chỗ do côn trùng cắn, do dị ứng vật lý, do thuốc, huyết thanh... ; phòng và chống chứng đau nửa đầu, kích thích ăn ngon ở người gầy yếu, chán ăn.

- Tác dụng phụ: Chóng mặt, buồn nôn, khô miệng, mệt mỏi, run, nhức đầu...

- Liều dùng: Người lớn: 4 mg/lần x 3-4 lần/ngày. Tối đa 0,5 mg/kg/24 giờ [3].

1.1.1.3. Loratadin - Công thức cấu tạo:

- Công thức phân tử: C22H23ClN2O2 (M=382.9) [7].

- Tính chất vật lý : Bột trắng đến trắng ngà. Dễ tan trong aceton, cloroform, methanol và toluen; không tan trong nước [31].

- Chỉ định : Viêm mũi dị ứng, viêm kết mạc dị ứng, ngứa và mề đay có liên quan đến histamin.

- Tác dụng phụ: Khi dùng với liều lớn hơn 10 mg hàng ngày có thể xảy ra một số tác dụng không mong muốn như: đau đầu, khô miệng, chóng mặt, khô mũi, hắt hơi, viêm kết mạc...

- Liều dùng: Người lớn và trẻ em từ 12 tuổi trở lên: 10 mg/24 giờ [3].

1.1.2. Nhóm thuốc glucocorticoid

5

Hormon vỏ thượng thận gồm 3 loại: mineral corticoid có tác dụng trao đổi chủ yếu lên chất khoáng, glucocorticoid có tác dụng chủ yếu lên trao đổi hydrat carbon và các steroid sinh dục. Glucocorticoid tự nhiên do vùng bó vỏ thượng thận sản xuất ra gồm 2 chất hydrocortison và cortison. Glucocorticoid tổng hợp gồm rất nhiều chất khác nhau.

Tác dụng của glucocorticoid: Ở nồng độ sinh lý các chất này cần cho cân bằng nội môi, tăng sức chống đỡ của cơ thể với stress và duy trì các chức năng khác của cơ thể như tác dụng trên chuyển hóa glucid, protid, lipid và chuyển hóa muối nước, trên các cơ quan…

Trong đó tác dụng chống viêm, chống dị ứng hay được áp dụng trong điều trị một số bệnh mãn tính như: thấp khớp, hen phế quản, viêm xoang, mề đay, mẩn ngứa…

Tác dụng không mong muốn: Glucocorticoid có khả năng gây ra tác dụng phụ đáng kể, tác dụng phụ phụ thuộc vào liều lượng thuốc sử dụng và có thể bao gồm: gây phù, tăng huyết áp do giữ natri và nước; loét dạ dày tá tràng; làm vết thương chậm liền sẹo, dễ nhiễm trùng; gây tăng đường huyết hoặc làm nặng thêm bệnh đái tháo đường; làm loãng xương, xốp xương; gây nhược cơ, teo cơ, mỏi cơ; đặc biệt gây suy thượng thận cấp khi ngừng dùng thuốc đột ngột… Ngoài ra có thể gặp các tác dụng không mong muốn khác như đục thủy tinh thể, mất ngủ, rối loạn tâm thần. Khi dùng tại chỗ có thể gây viêm da, teo da, rạn da… [5].

1.1.2.1. Betamethason - Công thức cấu tạo:

- Công thức phân tử: C22H29FO5 (M= 392,5).

- Tên khoa học: 9-fluoro-11,17,21-trihydroxy-16-methylpregna-1,4-dien-3,20dion.

6

- Tính chất vật lý: Bột kết tinh trắng hay gần như trắng. Thực tế không tan trong nước, ít tan trong ethanol, rất ít tan trong methylen clorid [7].

- Chỉ định: Điều trị thay thế khi vỏ thượng thận không tiết đủ hormon. Điều trị các bệnh tự miễn. Điều trị dị ứng, sốc phản vệ và các bệnh liên quan đến phản ứng dị ứng như hen phế quản, viêm mũi dị ứng, mề đay, viêm da tiếp xúc... Điều trị viêm cơ, khớp, viêm da....

- Tác dụng phụ: Rối loạn nước và điện giải, suy yếu cơ, loãng xương, loét dạ dày, chậm lành vết thương, rối loạn nội tiết…

- Liều dùng: 0,5 - 4 mg/ngày. Liều duy trì: 0,5 – 2 mg/ngày [5].

1.1.2.2. Dexamethason acetat - Công thức cấu tạo:

- Công thức phân tử: C24H31FO6 (M= 434,5).

- Tên khoa học : 9-fluoro-11,17-dihydroxy-16-methyl-3,20-dioxopregna-1,4dien-21-yl acetat.

- Tính chất vật lý: Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, đa hình. Dễ tan trong ethanol và aceton, khó tan trong methylen clorid, thực tế không tan trong nước [7].

- Chỉ định : Kháng viêm, dùng trong viêm gan mãn tính, viêm cầu thận, viêm mũi dị ứng, viêm xoang, viêm khớp, hen suyễn.

- Tác dụng phụ: dùng kéo dài gây loét dạ dày tá tràng, gây giữ nước và muối, hội chứng Cushing, teo vỏ thượng thận, loãng xương, teo cơ…

- Liều dùng: dùng đường uống 0,5 - 10 mg/24 giờ/lần hoặc chia vài lần [4].

Cả 5 thuốc hóa dược chống dị ứng ở trên là những thuốc hay được kê đơn trong các phác đồ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng do có hiệu quả điều trị cao và có mức liều điều trị thấp nên nếu được pha trộn vào các chế phẩm đông dược thì khó bị phát hiện bởi một số phương pháp phân tích thông thường như TLC, HPLC.

7

Hơn nữa, tác dụng an thần của các thuốc kháng histamin H1 đặc biệt là chlorpheniramin có thể được lợi dụng để làm xoa dịu những cơn khó chịu của người bệnh do ngứa ngáy đem lại, do đó các thuốc này có nguy cơ bị trộn trái phép vào các chế phẩm đông dược cao hơn so với các thuốc khác trong cùng nhóm tác dụng dược lý. Do đó lựa chọn 5 thuốc hóa dược trên để tiến hành nghiên cứu.

1.1.3. Dƣợc liệu và chế phẩm đông dƣợc điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều các chế phẩm đông dược có số đăng ký có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mề đay, mẩn ngứa. Chúng đa dạng về thành phần các loại dược liệu (liên kiều, kim ngân hoa, kinh giới, bồ công anh, ngưu bàng tử, cúc hoa …) cũng như dạng bào chế (viên hoàn, thuốc bột, viên nang, cốm tan). Một số vị dược liệu và chế phẩm đông dược có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mề đay, mẩn ngứa theo „Thông tư danh mục thuốc cổ truyền được Bộ Y tế công nhận‟ do bộ trưởng Bộ y tế ban hành ngày 31/10/2016 được minh họa trong bảng dưới đây : Bảng 1.1. Một số dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng STT Dƣợc liệu

Tên khoa học

Bộ phận dùng

1

Kim ngân hoa Flos Lonicerae

Hoa

2

Liên kiều

Fructus Forsythiae

Quả chín

3

Bồ công anh

Herba Taraxaci

Toàn cây

4

Thổ phục linh Smilax glabra

Thân rễ

5

Phòng phong

Radix Saposhnikoviae divaricatae

Rễ

6

Kinh giới

Spica Elsholtziae

Phần trên mặt đất

7

Cúc hoa

Flos Chrysanthemi

Hoa

8

Ngưu bàng tử

Fuctus Arctii

Quả chín

9

Bạc hà

Herba Menthae

Toàn cây

10

Ké đầu ngựa

Fructus Xanthii strumarii

Quả

11

Đạm đậu xị

Semen Sojae praeparata

Hạt

12

Đơn lá đỏ

Folium Excoecariae

Lá

13

Hoàng bá

Cortex Phellodendri

Vỏ thân

8

14

Xuyên khung

Rhizoma Ligustici wallichii

Thân rễ

15

Thuyền thoái

Periostracum Cicadae

Xác của con ve sầu

16

Sài đất

Herba Wedeliae

Toàn cây

Bảng 1.2. Một số chế phẩm đông dược điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng lưu hành trên thị trường STT

Tên chế phẩm

Thành phần

Dạng bào chế

Cao đặc qui về khan (tương ứng với Ngân kiều 1

giải độc Favomin

Kim ngân hoa 267 mg; Liên kiều 267 mg; Bạc hà 160 mg; Kinh giới 107 mg; Đạm đậu xị 133 mg; Ngưu bàng tử 160mg; Cát cánh 160 mg; Đạm trúc

Nhà sản xuất Công ty

Viên

cổ phần

nang

Dược

cứng

phẩm OPC

diệp 107 mg; Cam thảo 133 mg) Mỗi gói 5,5 g chứa cao khô dược liệu Thanh 2

nhiệt giải độc SXH

(tương ứng: Tang diệp 4 g; Cúc hoa 4 g; Kim ngân hoa 4 g; Liên kiều 4 g; Bạc hà 2 g; Cát cánh 2 g; Mạch môn

Công ty Cốm tan

2,7 g; Hoàng cầm 2,7 g; Quả dành dành

Cổ phần BV Pharma

2,7 g) Mỗi gói 1 g chứa: Bạch chỉ 0,15g;

3

Thuốc bột

Phòng phong 0,15 g; Cát căn 0,15 g;

giải nhiệt

Sài hồ 0,10 g; Kim ngân hoa 0,10g;

Thuốc

Cơ sở

tiêu ban

Liên kiều 0,10 g; Ma hoàng 0,10 g; Tô

bột

Phú Sơn

tán

diệp 0,05 g; Bạc hà 0,05 g; Cam thảo 0,05 g.

Cao khô dược liệu (12:1) 0,25 g (tương

4

Công ty

Bảo bảo

đương với: Bồ công anh 0,5 g; Kim

Viên

TNHH

nhiệt độc

ngân hoa 0,5 g; Sài đất 0,5 g; Thổ phục

nang

Dược

thanh

linh 0,5 g; Ké đầu ngựa 0,4 g; Hạ khô

cứng

phẩm

thảo 0,5 g; Huyền sâm 0,1 g)

9

Hoa Linh

1.2. Một số nghiên cứu phát hiện thuốc chống dị ứng trộn trái phép trong chế phẩm đông dƣợc 1.2.1. Trên thế giới Trong những năm gần đây, đã có sự gia tăng trong việc sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dược để điều trị hoặc hỗ trợ điều trị bệnh, điều này có thể do hệ quả mà các tác dụng phụ của các thuốc hóa dược mang lại và sự gia tăng vấn đề tự sử dụng thuốc và thực phẩm chức năng. Theo WHO, có tới 80% số người sống ở các nước đang phát triển vẫn chủ yếu dựa vào các loại thuốc truyền thống để chăm sóc sức khỏe của họ [22]. Tuy nhiên sự pha trộn với các loại thuốc hóa dược là một mối quan tâm lớn cho các cơ quan quản lý thuốc khi có nhiều báo cáo về các rủi ro ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe mà nguyên nhân là từ các chế phẩm đông dược được khẳng định là "hoàn toàn tự nhiên". Các thuốc hóa dược hay được trộn thuộc các nhóm thuốc điều trị đái tháo đường, chất ức chế phosphodiesterase-5 (PDE's-5), thuốc chống cao huyết áp, thuốc giảm đau chống viêm không steroid, thuốc chống dị ứng, glucocorticoid, thuốc giảm béo …[16], [24]. Đặc biệt, nhóm hóa dược hay bị trộn điển hình nhất là glucocorticoid. Ở Hàn Quốc, So-Hyun Cho và cộng sự đã khảo sát trên 294 loại thực phẩm và thực phẩm chức năng được quảng cáo là có hiệu quả trong điều trị viêm khớp, xương và đã phát hiện 30% các mẫu có chứa hóa dược gồm dexamethason, cortison-21-acetat, prednison-21-acetat, betamethason, prednison and prednisolon [18]. Ở Anh, Ramsay H.M. và cộng sự đã xác định được hydrocortison, clobetason butyrat, betamethason valerat, and clobetasol propionat trong 24 loại kem thảo dược điều trị eczema bằng phương pháp HPLC [29].

Nhóm thuốc kháng histamin H1 cũng được cho thấy là hay bị trộn vào các chế phẩm đông dược vì tác dụng chống dị ứng và tác dụng an thần của nó. Một nghiên cứu ở Mỹ chỉ ra rằng trong số 243/260 loại thuốc đông dược ở châu Á đã được thu thập từ các cửa hàng thảo dược bán lẻ ở California, có 17 loại (7%) chứa thuốc hóa dược không được khai báo. Trong đó, chlorpheniramin là 1 trong 4 loại hóa dược không khai báo phổ biến nhất [28]. Ở Trung Quốc, YE Lin-hu và cộng sự sử dụng phương pháp LC-MS/MS khảo sát 7 antihistamin bao gồm loratadin,

10

diphenhydramin hydrochlorid, cyproheptadin hydrochlorid, cetirizin hydrochlorid, promethazin hydrochlorid, mizolastin, and chlorpheniramin maleat trên 9 loại chế phẩm thảo dược, kết quả đã xác định 4 mẫu chế phẩm đã bị lẫn với các antihistamin trên [34]. Ở Hàn Quốc, Jung Yeon Kim và cộng sự sử dụng phương pháp LCMS/MS khảo sát trên 117 mẫu chế phẩm chăm sóc sức khỏe và đã phát hiện 1 mẫu chứa diphenhydramin [27].

Các nghiên cứu phát hiện các thuốc hóa dược này trộn trái phép trong chế phẩm đông dược sử dụng nhiều phương pháp phân tích khác nhau, được trình bày trong bảng sau : Bảng 1.3. Một số nghiên cứu phân tích các thuốc chống dị ứng trộn trái phép trong chế phẩm đông dược Nền mẫu

Hoạt chất

Trà thảo Chlorpheniramin dược

Phƣơng pháp phân tích UHPLC – MS/MS Cột XBridge BEH C18 (100 mm x 2,1 mm; 3,5 μm) Pha động: acetonitril /0,1% acid formic

Xử lý mẫu

Tài liệu

Chiết mẫu [35] bằng acetonitril, tinh chế theo quy trình QuEChERS

(tt/tt) Chiết

mẫu [27]

Viên nang, Diphenhydramin

LC-ESI-MS/MS

viên nén, chất lỏng, bột thảo dược

Cột Acquity UPLC bằng methanol, BEH C18 ( 100 x 2,1 siêu âm 10 mm; 1,7 µm) phút Pha động: 0,1% acid formic trong nước và 0,1% acid formic trong acetonitril Detector: ESI-MS.

11

Chiết

mẫu [34]

Viên nén, Loratadin,

LC-MS/MS

thuốc mỡ, Diphenhydramin kem hydrochlorid

Cột Agilent Eclipse bằng methanol Plus C18 (2,1 mm × 50 80%, siêu âm

Cyproheptadin

mm; 3,5 μm）

hydrochlorid Cetirizin

Tốc độ ml/phút

hydrochlorid

Pha động: 0,1% acid

Promethazin hydrochlorid Mizolastin Chlorpheniramin

formic trong nước và

30

dòng:

phút,

ly

0,4 tâm.

0,1% acid formic trong acetonitril Detector: ESI-MS.

maleat Thực phẩm Dexamethason chức năng Betamethason

LC-MS/MS Cột: ACQUITY

Dung môi [18] Waters chiết: UPLC methanol:nước

BEH C18 (2,1 × 100 (70:30), mm; 1,7 µm) âm.

Pha động: 0,1% acid formic trong nước (A) và ACN (B) Detector: ESI-MS.

siêu

Viên nang, Dexamethason viên nén,

LC-MS/TOF Dung Cột: C18 (250 mm × chiết:

môi [30]

thuốc bột

4,6 mm, 5 µm). methanol:nước Pha động: methanol : (80:20), siêu dung dịch ammonium âm 40 phút. acetat 0,01M

1.2.2. Tại Việt Nam Tại Việt Nam, các chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng có mặt trên thị trường hiện nay rất đa dạng, nhiều thành phần, khó kiểm soát vì được bán qua nhiều kênh khác nhau như trong hiệu thuốc, cửa hàng bán các sản phẩm chăm sóc sức khỏe, qua mạng internet, đa cấp, siêu thị … nên có nguy cơ cao các sản phẩm này được làm giả gây ra nhiều tác dụng không mong muốn khi sử dụng.

12

Năm 2010, phát hiện cơ sở sản xuất thuốc YHCT Hinh Hòa có mẫu ”Khu phong tê thấp thủy” và “Truy phong tê thấp thủy” điều trị đau lưng, mỏi gối, đau khớp xương bị trộn betamethason [13]. Năm 2011, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã kiểm tra mẫu „Thuốc bổ Tỳ‟ của cơ sở Phước Lợi Đường tại Đà Nẵng với công dụng kích thích ngon miệng đã phát hiện có trộn dexamethason và cyproheptadin.

Năm 2014, Thanh tra Sở Y tế Hà Nội kiểm tra Cơ sở thuốc đông y gia truyền Hà Tộc ở số 34, khu tập thể Ngân hàng Ba La, Hà Đông, Hà Nội, đã phát hiện trong gói thuốc bột “Thuốc Đông y gia truyền” có thành phần hoạt chất hóa dược là prednisolon, dexamethason acetat và paracetamol [37].

Năm 2017, Sở Y tế thành phố Hồ Chí Minh đã phát hiện cơ sở đông y Nhơn Tâm Tế (quận 12) lưu giữ và bày bán nhiều chế phẩm đông dược điều trị biếng ăn cho trẻ em, kết quả kiểm nghiệm cho thấy có chứa corticoid và cyproheptadin [38].

Từ những thực trạng trên có thể thấy rõ tình hình trộn trái phép các thuốc hóa dược chống dị ứng trong chế phẩm đông dược đang xảy ra thường xuyên và phức tạp, tuy nhiên các nghiên cứu để phát hiện vẫn chưa thật sự nhiều, chủ yếu là các nghiên cứu trên nhóm corticoid. Lê Đào Khánh Long và cộng sự đã tiến hành xây dựng phương pháp phát hiện dexamethason, betamethason, prednison, prednisolon và hydrocortison pha trộn trong các chế phẩm đông dược bổ tỳ vị, trừ phong thấp bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng. 5 hệ dung môi đã được xây dựng để tách các corticoid ra khỏi hỗn hợp, phát hiện bằng thuốc thử xanh tetrazolium và thuốc thử H2SO4/cồn có formaldehyd. Kết quả khảo sát trong 26 mẫu đông dược lấy từ thị trường, có 7 mẫu (22%) cho thấy có dexamethason hoặc betamethason [9]. Trần Thị Hoàng Chi đã tiến hành định tính, định lượng dexamethason acetat và betamethason trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng HPLC. Phương pháp đã sử dụng ethyl acetat làm dung môi chiết mẫu, cột C18, pha động gồm nước và acetonitril tỷ lệ 55:45, bước sóng phát hiện 240 nm, hiệu suất thu hồi 104 - 109 %. LOD và LOQ lần lượt là 0,5 ppm và 1,6 ppm. Kết quả cho thấy 6 mẫu trong tổng số mẫu khảo sát có chứa corticoid. Hàm lượng dexamethason acetat và betamethason được phát hiện trong khoảng 0,029 - 0,13 mg/g chế phẩm [6].

13

Gần đây, nhóm nghiên cứu của Đào Thị Cẩm Minh và cộng sự đã xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời 9 chất thuộc nhóm giảm đau và chống viêm: betamethason, dexamethason acetat, hydrocortison acetat, prednisolon, prednison, paracetamol, piroxicam, indomethacin, ketoprofen trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp LC/MS. Đối tượng nghiên cứu là các chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh xương khớp ở dạng thuốc bột, hoàn cứng, viên nang, viên nén và trà túi lọc. Phương pháp đã sử dụng cột sắc ký Restek Ultra II C18 (100 mm x 2,1 mm; 1,9 µm), cột bảo vệ Restek Ultra C18 Guard Cartridge (10 mm x 4 mm; 3 µm), thể tích tiêm mẫu 2µl, tốc độ dòng 3 ml/phút, pha động gồm 0,1% acid formic trong nước (kênh A) và 0,1% acid formic trong acetonitril (kênh B) ở chế độ gradient. Kết quả phân tích trên 30 mẫu chế phẩm đông dược hỗ trợ điều trị bệnh xương khớp đã phát hiện 5 chế phẩm bị trộn trái phép các hoạt chất giảm đau và chống viêm (cả nhóm NSAIDs và corticoid), trong đó có 2 mẫu dương tính với dexamethason acetat [11].

Tuy nhiên, các nghiên cứu phát hiện thuốc hóa dược chống dị ứng nhóm đối kháng thụ thể histamin H1 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược cho đến nay vẫn còn hạn chế. Vì vậy, nghiên cứu này sẽ phát triển phương pháp xác định các thuốc hóa dược chống dị ứng trộn trái phép trong chế phẩm đông dược có độ chính xác và độ nhạy cao ở mức nồng độ ppb, góp phần vào công tác đảm bảo chất lượng thuốc và bảo vệ sức khỏe cho người dân.

1.3. Tổng quan về sắc ký lỏng khối phổ Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách các chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography – HPLC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận khối phổ (Mass spectrometry – MS). Thiết bị LC-MS là một kỹ thuật đầy tiềm năng được ứng dụng ngày càng rộng rãi vì có tính chọn lọc và độ nhạy cao, giới hạn phát hiện có thể đến 10-14 gam, thời gian phân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu gần giống nhau mà các phương pháp sắc ký lỏng thông thường không làm được [1].

14

Sắc ký lỏng (LC) cho phép tách riêng biệt các chất phân tích trong hỗn hợp nhiều thành phần dựa vào sự khác biệt về ái lực của các chất này với pha động và pha tĩnh. Tùy vào bản chất của chất cần phân tích mà chúng có thể được phát hiện bằng các loại detector khác nhau.

Khối phổ (MS) phân tích các chất dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa... Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z và được phát hiện ở detector, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất [2].  Cấu tạo thiết bị khối phổ Một thiết bị khối phổ gồm có các bộ phận sau (Hình 1.1) :

Hình 1.1. Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS  Bộ nạp mẫu: đưa mẫu vào máy. Nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc rắn cần chuyển sang dạng hơi. Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc ký.  Bộ nguồn ion hóa: ion hóa các phân, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi.

Các kiểu hình thành ion phổ biến: Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionizaton – ESI), Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization – APCI), Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photonization – APPI). Trong đó, kiểu Ion hóa phun điện tử (ESI) được sử dụng phổ biến nhất.

15

Hình 1.2. Sơ đồ sự tạo thành ion dương trong ESI  Bộ phân tích khối: tách các ion theo tỷ số m/z. Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector. Có nhiều bộ phân tích khối khác nhau như: Bộ phân tích tứ cực, phân tích tứ cực chập ba, phân tích bẫy ion, phân tích thời gian bay...

Trong đó, bộ tứ cực (Quadrupole) dựa trên nguyên tắc các ion có khối lượng khác nhau sẽ dao động khác nhau theo điện áp tổng hợp một chiều và xoay chiều đặt vào môi trường di chuyển của nó.

Hình 1.3. Bộ phân tích tứ cực Hiện nay, có loại dùng bộ phân tích gồm ba tứ cực xếp nối tiếp nhau Q1, Q2, Q3 (gọi là bộ tứ cực chập ba) để ghi phổ.

Q0

Q2

Q1

Q3

Hình 1.4. Mô hình bộ phân tích tứ cực chập ba Trong đó: Q0: Nguồn ion mẹ.

16

Q1: Bộ tứ cực thứ nhất, có nhiệm vụ tách các ion. Lựa chọn ion mẹ với m/z nhất định từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến Q2.

Q2: Bộ tứ cực thứ hai, ở điều kiện áp suất cao, các ion mẹ bị phân ly do va chạm với khí trơ có mặt như khí N2, Ar, He. Bộ Q2 tạo ra phân ly do các ion mẹ bị phân mảnh tiếp theo tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con (daughter ions). Q2 không đóng vai trò là bộ lọc ion mà nó chấp nhận tất cả các ion do Q1 chuyển đến. Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách Q3.

Q3: Bộ tứ cực thứ ba làm nhiệm vụ tách các ion được chuyển từ Q2 để đi tới bộ phận phát hiện.

Thiết bị khối phổ ba tứ cực gọi là máy khối phổ hai lần (LC-MS/MS).  Bộ phận phát hiện ion (detector): có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch đại thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.  Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system): Tín hiệu điện từ detector được khuếch đại trước khi chuyển thành tín hiệu số phục vụ xử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau như: ghi phổ khối, so sánh với thư viện phổ, định lượng… Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm :  SCAN: Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích.  Selected Ion Monitoring (SIM): Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.  SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring): SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện.

MRM: cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.

17

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1. Hoá chất - chất chuẩn Bảng 2.4. Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu STT

Nguyên liệu

1

Betamethason

2 Chất

3

Nguồn gốc

chuẩn Chuẩn

Chuẩn VKNTTW

DĐVN

SKS: 0214124.01 HL: 100,69%

Dexamethason

Chuẩn

Chuẩn VKNTTW

acetat

DĐVN

SKS: 0200014 HL: 99,7%

Chlorpheniramin

Chuẩn

Chuẩn VKNTTW

maleat

DĐVN

SKS: WS.0317032.03 HL: 99,10%

Cyproheptadin

Chuẩn

Chuẩn VKNTTW

hydroclorid

PTN

SKS: 0102126 HL: 100,64%

Chuẩn

Chuẩn VKNTTW

PTN

SKS: SKS 0108242 HL: 99,6%

chuẩn 4

Tiêu

5

Loratadin

6

Acetonitril

HPLC

Merck - Đức

Hóa

7

Acid formic

PA

Merck - Đức

chất

8

Ethanol

AR

Trung Quốc

9

Methanol

HPLC

Merck - Đức

2.1.2. Máy móc - trang thiết bị - Máy sắc ký lỏng 2 lần khối phổ LC/MS/MS: Triple Quadrupole BRUKER EVOQ Qube – Mỹ.

- Cân phân tích METTLER – AB204 – Thụy Sỹ (d = 0,1 mg) - Cân phân tích METTLER – TOLEDO XPE105 – Thụy Sỹ (d = 0,01 mg) - Máy lắc siêu âm DAIHAN WUC – A22H – Hàn Quốc - Máy ly tâm HERMLE Z306 – Đức - Tủ sấy MEMMERT ULM 500 – Đức 18

- Máy lắc xoáy Vortex ZX3 -Ý - Các dụng cụ trong phân tích: bình định mức, pipet, micropipet....

2.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu - Mẫu thử: Các chế phẩm đông dược và thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng bào chế viên nang cứng, viên hoàn, bột thuốc có tác dụng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng đang lưu hành tại Việt Nam. + Nơi thu thập mẫu: từ các hiệu thuốc đông y, thuốc gia truyền, mạng internet, mẫu gửi. + Nơi lưu hành mẫu: Hà Nội, Đà Nẵng, Khánh Hòa, Hà Tĩnh, An Giang, Phú Yên. + Dạng bào chế: viên hoàn, viên nang cứng, thuốc bột.

- Mẫu trắng: 3 nền mẫu dùng để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích được xây dựng dựa trên nguyên lý Y học cổ truyền phương Đông, các bài thuốc kinh điển, các nghiên cứu khoa học về dược liệu có tác dụng điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng đã công bố. Cả 3 nền mẫu được chế tạo tại Công ty Cổ phần Traphaco - Hà Nội. + Nền N1 (viên hoàn) : Dựa vào bài thuốc cổ truyền Ngân kiều tán trong sách Ôn bệnh điều biện và theo Dược điển Việt Nam V, gia giảm thành phần của bài thuốc cho phù hợp với tác dụng điều trị, gồm 9 loại dược liệu như sau: kim ngân hoa, liên kiều, cát cánh, bạc hà, đạm trúc diệp, kinh giới tuệ, lô căn, ngưu bàng tử, cam thảo. Các bước tiến hành: điều chế cao đặc dược liệu và bột mịn dược liệu, trộn đều, vê thành viên, bao màu, sấy khô, đóng gói. + Nền 2 (bột cốm): Dựa vào bài thuốc cổ truyền Liên kiều bại độc tán trong sách Thương hàn toàn sinh tập gồm 14 loại dược liệu như sau: liên kiều, chi tử, khương hoạt, huyền sâm, bạc hà, phòng phong, sài hồ, cát cánh, thăng ma, xuyên khung, đương quy, hoàng cầm, bạch thược, ngưu bàng tử. Các bước tiến hành: điều chế cao đặc dược liệu, thêm tá dược tạo khối ẩm, xát hạt qua rây, sấy hạt, sửa hạt, đóng gói. + Nền 3 (viên nang): Dựa vào bài thuốc cổ truyền Tiêu phong tán trong sách Y tông kim giám, gia giảm thành phần của bài thuốc cho phù hợp với tác dụng điều 19

trị, gồm 11 loại dược liệu như sau: kinh giới, phòng phong, ngưu bàng tử, thuyền thoái, sinh địa, đan bì, bạch thược, thổ phục linh, ké đầu ngựa, bồ công anh, cam thảo. Các bước tiến hành: điều chế cao đặc dược liệu và bột mịn dược liệu, trộn đều tạo khối ẩm, rây qua rây tạo hạt, sấy hạt, thêm tá dược thích hợp, đóng nang.

- Mẫu tự tạo: Mẫu trắng có thêm các chất phân tích với tỉ lệ phù hợp.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Xử lý mẫu Dựa vào tính tan của các chất phân tích và một số nghiên cứu đã công bố [7],[11], [18], [27], [34] tiến hành khảo sát khả năng chiết các thuốc hóa dược từ nền mẫu qua các bước như sau :  Khảo sát dung môi chiết: methanol, ethanol, acetonitril, hỗn hợp methanol : nước theo các tỉ lệ khác nhau.  Khảo sát thời gian siêu âm : 5-15 phút.

Quy trình chiết xuất cho đối tượng nghiên cứu là các chế phẩm đông dược dạng viên nang, bột cốm, viên hoàn gồm các bước như sau: - Xác định khối lượng trung bình đơn vị mẫu, làm đồng nhất mẫu.

- Cân chính xác một lượng mẫu tương ứng 1/10 liều dùng vào ống falcon 50ml, thêm chính xác 25 ml dung môi chiết, lắc đều.

- Lắc xoáy 5 phút, siêu âm trong thời gian thích hợp ở nhiệt độ phòng.

- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, lấy phần dịch trong pha loãng tới nồng độ thích hợp bằng dung môi chiết, lọc qua màng lọc 0,22 µm, tiến hành phân tích.

2.2.2. Xây dựng phƣơng pháp phân tích bằng LC-MS/MS Tiến hành khảo sát theo các nội dung sau: - Khảo sát điều kiện khối phổ: Lựa chọn điều kiện nguồn ion hóa, ion mẹ, điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion con, lựa chọn ion con để định tính, định lượng. Khảo sát, tìm điều kiện khối phổ phân tích đồng thời 5 chất nghiên cứu trên.

- Khảo sát điều kiện sắc ký: Lựa chọn pha động, cột sắc ký, nhiệt độ cột, thể tích tiêm mẫu, tốc độ dòng để có thể tách và phát hiện đồng thời các chất phân tích ở nồng độ ng/ml, các pic nhỏ gọn, cân xứng, thời gian phân tích không quá dài.

20

2.2.3. Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng Tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của AOAC 2016 [15] và ICH 2005 [25] trên 3 nền mẫu tự tạo chứa các chất phân tích với các chỉ tiêu: - Độ phù hợp của hệ thống: Tiêm lặp lại sáu lần dung dịch chuẩn hỗn hợp gồm betamethason (BET) và dexamethason acetat (DEX) có nồng độ 30 ng/ml; 3 chất chlorpheniramin maleat (CLO), cyproheptadin hydroclorid (CYP) và loratadin (LOR) có nồng độ 50 ng/ml vào hệ thống LC-MS/MS. Đánh giá độ biến thiên của diện tích pic và thời gian lưu (RSD < 15 % đối với mức nồng độ ≤ 100 ppb).

- Độ đặc hiệu của phương pháp: phân tích mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu chuẩn. Trên sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện pic trùng với thời gian lưu của các chất phân tích. Trên sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn, các pic xuất hiện trùng thời gian lưu với mẫu chuẩn.

- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng (LOD, LOQ): Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp bằng cách phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các nồng độ nhỏ khác nhau. Tiến hành phân tích, nồng độ tại đó cho tỷ số S/N (tín hiệu/ nhiễu) = 3 là LOD và S/N = 10 là LOQ. - Khoảng nồng độ tuyến tính: Từ dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp pha loãng thành dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp bằng dung môi đã khảo sát. Xây dựng đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic của từng chất chuẩn với nồng độ các chất phân tích.

- Độ đúng và độ chính xác của phương pháp: Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng theo quy trình xử lý mẫu đã xây dựng, thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ (thấp, trung bình, cao) phù hợp. Phân tích lặp lại 7 lần ở mỗi nồng độ để xác định độ đúng và độ chính xác trong ngày và khác ngày (độ thu hồi trong khoảng 80,0 - 110,0 % và RSD < 15% ở nồng độ ≤ 100 ppb).

2.2.4. Ứng dụng quy trình phân tích trên mẫu thực - Áp dụng phương pháp LC-MS/MS phát hiện các chất phân tích trong một số chế phẩm đông dược điều trị hoặc hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng thu thập trên thị trường. Dựa vào thời gian lưu, mảnh mẹ, hai mảnh con, tỷ lệ cường độ hai

21

mảnh con của mẫu thử so với mẫu chuẩn để xác định sự có mặt của chất phân tích (định tính).

- Xác định nồng độ các chất phân tích trên (nếu có) trong các mẫu thử thu thập được dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính tương ứng của 5 chất phân tích (định lượng).

2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu - Các kết quả thu được trong quá trình tiến hành nghiên cứu được xử lý bằng phần mềm có sẵn trong thiết bị LC-MS/MS. - Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích nhờ các hàm toán học, thống kê có sẵn trong phần mềm tin học Microsoft Excel để tính toán kết quả.

22

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Xây dựng phƣơng pháp phân tích 3.1.1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn - Dung dịch chuẩn gốc đơn 1 mg/ml: Cân chính xác khoảng 10 mg mỗi chất BET, DEX, CLO, CYP, LOR chuẩn vào các bình định mức 10 ml, hòa tan và định mức vừa đủ 10 ml bằng methanol được các dung dịch chuẩn gốc đơn có nồng độ chính xác khoảng 1 mg/ml.

- Dung dịch chuẩn đơn 10 µg/ml: Dùng micropipet hút chính xác 100 µl mỗi dung dịch chuẩn gốc đơn cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ thu được các dung dịch chuẩn đơn có nồng độ chính xác khoảng 10 µg/ml.

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 ng/ml: Dùng micropipet hút chính xác 100 µl mỗi dung dịch chuẩn đơn có nồng độ chính xác khoảng 10 µg/ml cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ thu được các dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ chính xác khoảng 100 ng/ml.

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp 50 ng/ml: Dùng pipet hút chính xác 5 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ chính xác khoảng 100 ng/ml cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ chính xác khoảng 50 ng/ml.

- Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp: Cân chính xác khoảng 7,5 mg đối với BET và DEX; 12,5 mg đối với CLO, CYP và LOR chuẩn vào bình định mức 20 ml. Hòa tan và định mức vừa đủ 20 ml bằng methanol thu được dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp có nồng độ BET và DEX là 0,375 mg/ml; CLO, CYP và LOR là 0,625 mg/ml.

3.1.2. Khảo sát và lựa chọn các điều kiện khối phổ 3.1.2.1. Khảo sát điều kiện khối phổ Phương pháp LC-MS/MS phân tích các chất dựa trên cơ sở xác định ion phân tử (ion mẹ) và ion sản phẩm (ion con) đối với từng hoạt chất. Với kỹ thuật ion hóa ESI ở chế độ ion dương, các ion mẹ thường được tạo thành bằng cách thêm một proton [M-H]+ hay thêm hai proton [M-2H]++. Từ ion mẹ đã xác định được, tiến hành bắn phá để lựa chọn các ion con dùng cho định tính và định lượng.

23

Tiêm không qua cột vào hệ thống MS các dung dịch chuẩn đơn có nồng độ 5 µg/ml (được pha loãng 2 lần từ dung dịch chuẩn đơn 10 µg/ml bằng methanol) để xác định ion mẹ và các ion con. Các điều kiện phân mảnh ion, năng lượng bắn phá phân mảnh (CE) được tối ưu hóa tự động theo thiết bị khối phổ. Lựa chọn 2 ion con có tín hiệu lớn, ổn định để định tính và định lượng, trong đó ion con có tín hiệu lớn và ổn định hơn làm ion định lượng, ion con còn lại dùng để định tính. Điều kiện khối phổ lựa chọn được trình bày trong các bảng sau: Bảng 3.5. Các thông số máy khối phổ Thông số

Giá trị tối ƣu (đơn vị)

Điện áp đầu phun

+4500 V

Khí chắn

20 psi

Nhiệt độ nón

350C

Khí ion hóa 1

40 psi

Nhiệt độ ion hóa

250C

Khí ion hóa 2

45 psi

CID gas

Ar 1.5 mTorr

Bảng 3.6. Điều kiện khối phổ của các chất phân tích Tên chất Betamethason Dexamethason acetat Chlorpheniramin maleat Cyproheptadin hydroclorid Loratadin

Ion mẹ (m/z)

Ion con (m/z)

CE (eV)

Tỷ lệ (%)

*

6

58,1

355,1

9

41,9

309,1*

11

51,5

397,2

7

48,5

230,0*

14

73,5

167,0

40

26,5

96,2*

23

58,8

191,0

30

41,2

337,0*

20

58,5

267,0

35

41,5

373,2

393,2 435,2 275,1 288,2 383,1

* : Ion định lượng Nhận xét: Từ Bảng 3.5 và Bảng 3.6, xác định được điều kiện MS/MS để phân tích các chất phân tích. Kết quả khảo sát cho thấy ion mẹ của 5 chất phân tích đều ở

24

dạng [M-H]+ có số khối lớn hơn khối lượng phân tử một đơn vị (m/z=M+1) cho cường độ tín hiệu lớn nhất. Từ đó, mỗi chất phân tích được xác định bằng một ion mẹ và hai ion con dùng để định lượng và định tính. Kết quả này đáp ứng yêu cầu hiện nay đối với phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS theo quy định của Châu Âu (2002/657/EC) với số điểm nhận dạng (IP) là 4 (1 ion mẹ – 1 điểm và 2 ion con – mỗi ion 1,5 điểm).

3.1.2.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký a) Cột sắc ký Sử dụng cùng hệ pha động gồm acid formic 0,1 % /nước (A) và acetonitril (B), thể tích tiêm mẫu là 2 µl, tốc độ dòng là 0,3 ml/phút, tiêm vào hệ thống sắc ký hỗn hợp 5 chất phân tích nồng độ 50 ng/ml theo chương trình gradient 0 → 7,5 phút: 15 → 75 % B; 7,5 → 8,5 phút: 75 → 15% B; 8,5 → 12 phút: 15 % B. Tiến hành khảo sát trên hai cột là: cột Ultra II C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 µm) (cột 1) và cột InertSustain AQ-C18 (100 mm x 2,1 mm; 3,0 µm) (cột 2). Sắc ký đồ tổng hợp của các chất phân tích sử dụng hai loại cột trên được trình bày ở Hình 3.5.

Hình 3.5. Sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký (a) Cột Ultra II C18 (b) Cột InertSustain AQ-C18

25

Nhận xét: từ Hình 3.5 cho thấy: Cột 1 các chất phân tích rửa giải chậm hơn, pic loratadin bị doãng chân. Cột 2 cho các pic nhỏ gọn, cân đối, thời gian phân tích ngắn hơn. Vì vậy cột 2 được lựa chọn để tiến hành phân tích. b) Pha động: Sử dụng cột InertSustain AQ-C18 (100 mm x 2,1 mm; 3,0 µm) để khảo sát các thông số dưới đây:  Thành phần pha động Tham khảo một số nghiên cứu trước đây, tiến hành khảo sát trên dung dịch chuẩn hỗn hợp 50 ng/ml với 2 pha động như sau: - MP1: Acid formic 0,1% /nước (A) và acetonitril (B) - MP2: Acid formic 0,1% /nước (A) và acid formic 0,1% /acetonitril (B) Thể tích tiêm mẫu là 2 µl, tốc độ dòng là 0,3 ml/phút.

Kết quả: cả 2 hệ pha động trên đều có thời gian phân tích tương tự nhau, các pic đều cân xứng và cường độ tín hiệu cao. Hệ pha động MP1 đơn giản, dễ chuẩn bị hơn. Do đó, lựa chọn hệ MP1 là pha động để tiến hành phân tích.  Tỷ lệ pha động Sử dụng hệ pha động MP1 với kênh A: acid formic 0,1%/nước và kênh B: acetonitril, khảo sát chế độ đẳng dòng 50:50 (A:B) và các chế độ gradient sau: Bảng 3.7. Điều kiện khảo sát pha động theo chế độ gradient Gradient 1

Gradient 2

Gradient 3

Thời gian (phút)

%A

%B

Thời gian (phút)

%A

%B

Thời gian (phút)

%A

%B

0 – 7,5

75→30

25→70

0 – 7,5

60→20

40→80

0 – 7,5

85→25

15→75

7,5 – 8

30

70

7,5 – 8

20

80

7,5 - 8,5

25→85

75→15

8–9

30→75

70→25

8 - 8,5

20→60

80→40

8,5 - 12

85

15

9 - 12

75

25

8,5 – 12

60

40

26

(a) Chế độ đẳng dòng A:B = 50:50

(b) Chế độ gradient 1

(c) Chế độ gradient 2

(d) Chế độ gradient 3

Hình 3.6. Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ pha động

27

Nhận xét: từ Hình 3.6 cho thấy: -

Chế độ đẳng dòng A:B = 50:50 (hình a): các pic ra sớm, thời gian lưu từ 0,9

- 3,0 phút. Pic loratadin và dexamethason acetat không cân xứng, chlorpheniramin maleat bị chẻ pic.

-

Chế độ gradient 1 (hình b): thời gian lưu từ 1,6 – 6,0 phút, chlorpheniramin

maleat bị chẻ pic, các pic còn lại nhỏ gọn, cân đối.

-

Chế độ gradient 2 (hình c): các pic ra sớm, thời gian lưu từ 1,1 – 3,3 phút.

Pic betamethason và loratadin bị đổ đầu; trên sắc ký đồ của chlorpheniramin maleat có xuất hiện pic phụ và cyproheptadin hydroclorid không tách pic rõ ràng.

-

Chế độ gradient 3 (hình d): các pic có thời gian lưu từ 3,3 – 6,7 phút. Các pic

nhỏ gọn, sắc nét, cân đối, cường độ tín hiệu pic phù hợp để phân tích.

Vì vậy, hệ pha động gồm acid formic 0,1% /nước và acetonitril chạy theo chế độ gradient 3 được lựa chọn để tiến hành phân tích.  Tốc độ dòng pha động.

Tiêm vào hệ thống sắc ký hỗn hợp 5 chất nghiên cứu có nồng độ mỗi chất là 50 ng/ml với 2 tốc độ dòng 0,2 ml/phút và 0,3 ml/phút. Kết quả sắc ký đồ các chất khi phân tích với 2 tốc độ dòng trên được thể hiện ở hình sau:

(a) Tốc độ dòng 0,2 ml/phút

(b) Tốc độ dòng 0,3 ml/phút

Hình 3.7. Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng pha động 28

Nhận xét: từ Hình 3.7 cho thấy: ở cả 2 tốc độ dòng pha động khảo sát, các pic đều có hình dáng nhỏ gọn, cân xứng. Với tốc độ dòng 0,3 ml/phút, các chất phân tích rửa giải sớm hơn (thời gian lưu từ 3,3 đến 6,7 phút). Với tốc độ dòng 0,2 ml/phút, các chất phân tích rửa giải chậm hơn (thời gian lưu từ 4,4 đến 7,9 phút).

Do vậy, lựa chọn tốc độ dòng 0,3 ml/phút để tiến hành phân tích tiếp theo.

Từ các kết quả khảo sát, lựa chọn điều kiện chạy LC-MS/MS nhƣ sau: - Cột sắc ký: InertSustain AQ-C18 (100 mm x 2,1 mm; 3,0 µm) - Điều nhiệt cột: 40oC - Thể tích tiêm mẫu: 2 µl - Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút - Thời gian phân tích: 12 phút - Pha động: Kênh A: Acid formic 0,1% /nước Kênh B: Acetonitril - Chương trình pha động: Chế độ gradient 3: 0 → 7,5 phút: 15 → 75 % B; 7,5 → 8,5 phút: 75 → 15% B; 8,5 → 12 phút: 15 % B. - Các điều kiện khối phổ theo Bảng 3.5 và Bảng 3.6.

3.1.3. Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu Chuẩn bị các mẫu như sau: - Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp trong methanol gồm BET và DEX có nồng độ 30 ng/ml; 3 chất CLO, CYP, LOR có nồng độ là 50 ng/ml.

- Dung dịch mẫu tự tạo: Xác định khối lượng trung bình của mỗi đơn vị nền mẫu, nghiền mịn và làm đồng nhất. Cân chính xác một lượng nền mẫu tương ứng 1/10 liều dùng cho vào ống falcon 50 ml (0,51 g đối với nền N1; 0,15 g đối với nền N2; 0,33 g với nền N3). Thêm 100 µl dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp gồm BET và DEX có nồng độ 0,375 mg/ml; 3 chất CLO, CYP và LOR có nồng độ 0,626 mg/ml vào nền mẫu, lắc nhẹ, để bay hơi dung môi ở điều kiện phòng. Thêm chính xác 25 ml dung môi chiết, lắc đều. Lắc xoáy 5 phút, siêu âm trong thời gian thích hợp ở nhiệt độ phòng, ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút. Gạn lấy phần dịch trong ở phía trên, pha loãng 50 lần bằng methanol để các chất phân tích sau khi xử lý có nồng độ 29

30 ng/ml đối với BET và DEX, 50 ng/ml đối với mỗi chất CLO, CYP, LOR. Lọc qua màng lọc 0,22 µm và tiến hành tiêm vào hệ thống LC-MS/MS. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu với các loại dung môi chiết khác nhau và thời gian siêu âm khác nhau. Mỗi quá trình được thực hiện làm lặp lại 3 lần. Tính độ thu hồi dựa vào diện tích pic của chất phân tích trong dung dịch thử so với dung dịch chuẩn.

3.1.3.1. Khảo sát dung môi chiết Tiến hành chiết mẫu tự tạo theo quy trình chung với thời gian siêu âm là 10 phút (cố định lượng nền mẫu, lượng chuẩn thêm vào, thể tích dung môi chiết mẫu, thời gian lắc xoáy, siêu âm, ly tâm). Khảo sát với các dung môi chiết như sau: ethanol, methanol – nước (50:50), methanol – nước (70:30), methanol, acetonitril. Tiến hành tiêm vào hệ thống LC-MS/MS. Kết quả hiệu suất chiết được trình bày trong Bảng 3.8.

30

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát dung môi chiết (n=3) *

Hoạt chất

m

Ethanol thêm

vào

(ng)

mtìm lại

H (%) ± SD

(ng)

Methanol : nƣớc (50:50) mtìm H (%) ± SD lại (ng)

Methanol : nƣớc (70:30) mtìm H (%) ± SD lại (ng) Nền N1

Methanol mtìm lại

Acetonitril mtìm

H (%) ± SD

(ng)

lại

H (%) ± SD

(ng)

BET

30,11

24,64

81,82 ± 5,45

26,78

88,94 ± 3,75

28,55

94,83 ± 3,58

29,54

98,11 ± 5,04

24,92

82,76 ± 4,92

DEX

30,79

26,73

86,81 ± 4,25

25,60

83,13 ± 2,16

28,44

92,35 ± 1,17

29,64

96,26 ± 2,92

25,98

84,37 ± 4,37

CLO

50,03

41,21

82,37 ± 2,87

43,89

87,71 ± 2,36

45,71

91,36 ± 3,83

47,53

94,99 ± 5,37

35,65

71,25 ± 4,15

CYP

50,10

39,05

77,94 ± 3,33

40,79

81,42 ± 6,00

45,36

90,54 ± 2,94

48,00

95,79 ± 3,57

36,83

73,50 ± 4,56

LOR

50,22

41,96

83,55 ± 1,85

43,36

86,34 ± 2,86

45,99

91,58 ± 4,11

48,84

97,26 ± 1,38

42,80

85,23 ± 4,66

Nền N2 BET

30,11

24,26

80,56 ± 1,84

25,85

85,85 ± 4,57

27,75

92,16 ± 2,77

28,94

96,11 ± 3,15

25,19

83,65 ± 2,53

DEX

30,79

26,14

84,90 ± 1,83

25,26

82,02 ± 3,98

28,19

91,56 ± 1,98

29,98

97,36 ± 2,29

27,58

89,55 ± 1,52

CLO

50,03

37,56

75,08 ± 2,17

41,82

83,59 ± 3,55

45,75

91,44 ± 3,20

47,27

94,48 ± 2,93

38,76

77,48 ± 1,77

CYP

50,10

41,55

82,92 ± 6,94

42,90

85,62 ± 3,61

45,21

90,23 ± 4,05

49,97

99,74 ± 3,48

40,84

81,52 ± 3,37

LOR

50,22

44,11

87,85 ± 1,98

43,43

86,50 ± 1,68

47,95

95,48 ± 4,07

51,43

102,4 ± 3,33

45,69

90,98 ± 1,47

Nền N3 BET

30,11

24,20

80,36 ± 2,30

26,43

87,78 ± 3,18

28,86

95,85 ± 4,16

29,36

97,50 ± 3,89

24,11

80,08 ± 4,28

DEX

30,79

26,73

86,80 ± 5,01

27,27

88,56 ± 5,36

29,22

94,88 ± 5,00

30,45

98,90 ± 5,38

25,72

83,54 ± 4,73

CLO

50,03

41,67

83,28 ± 2,49

42,28

84,51 ± 4,74

45,07

90,09 ± 2,69

46,91

93,76 ± 4,06

34,80

69,55 ± 3,25

CYP

50,10

35,16

70,18 ± 2,44

40,03

79,89 ± 4,82

42,79

85,39 ± 2,15

47,75

95,31 ± 2,44

36,43

72,71 ± 2,23

LOR

50,22

42,83

85,29 ± 2,02

45,22

90,06 ± 3,25

47,69

94,97 ± 3,38

50,63

100,8 ± 5,30

43,95

87,53 ± 1,71

31

120.00

Hiệu suất (%)

100.00 BET DEX CLO CYP LOR

80.00 60.00 40.00 20.00 0.00 Ethanol

Methanol : Methanol : nước (50:50) nước (70:30)

Methanol

Acetonitril

Hình 3.8. Biểu đồ đánh giá hiệu suất chiết phụ thuộc loại dung môi (nền N3) Nhận xét: Từ Bảng 3.8 và Hình 3.8 cho thấy: hiệu suất chiết của các dung môi không có sự khác biệt lớn trên 3 nền mẫu, tuy nhiên hiệu suất chiết của các dung môi khác nhau có sự chênh lệch đáng kể. Sử dụng dung môi chiết là ethanol 96% cho hiệu suất chiết các chất phân tích từ 70,18 – 87,85 %. Dung môi chiết là hỗn hợp methanol : nước (50:50) cho hiệu suất chiết từ 79,89 – 90,06 %. Dung môi chiết là hỗn hợp methanol : nước (70:30) cho hiệu suất chiết từ 85,39 – 95,85 %. Dung môi chiết là methanol cho hiệu suất chiết từ 93,76 – 102,4 %. Dung môi chiết là acetonitril cho hiệu suất chiết từ 69,55 – 90,98 %. Với dung môi chiết là methanol, hiệu suất chiết các chất phân tích khá đồng đều nhau và cao hơn 4 dung môi còn lại, do đó lựa chọn dung môi chiết mẫu là methanol.

3.1.3.2. Khảo sát thời gian siêu âm Tiến hành chiết mẫu theo quy trình chung với dung môi chiết là methanol. Khảo sát các thời gian siêu âm như sau: 5 phút, 10 phút, 15 phút. Tiến hành tiêm vào hệ thống LC-MS/MS. Kết quả hiệu suất chiết được trình bày trong Bảng 3.9.

32

Bảng 3.9. Kết quả khảo sát thời gian siêu âm (n = 3) Tên hoạt chất

mthêm

Siêu âm 5 phút mtìm

vào

(ng)

lại

Siêu âm 10 phút mtìm

H (%) ± SD

(ng)

lại

Siêu âm 15 phút mtìm

H (%) ± SD

(ng)

lại

H (%) ± SD

(ng)

Nền N1 BET

30,11

24,81

82,38 ± 2,71

29,54

98,11 ± 5,04

29,65

98,47 ± 4,57

DEX

30,79

26,95

87,53 ± 0,88

29,64

96,26 ± 2,92

29,79

96,76 ± 2,82

CLO

50,03

38,87

77,70 ± 2,90

47,53

94,99 ± 5,37

47,11

94,16 ± 2,92

CYP

50,10

40,70

81,23 ± 4,65

48,00

95,79 ± 3,57

49,20

98,19 ± 5,50

LOR

50,22

44,24

88,10 ± 3,49

48,84

97,26 ± 1,38

50,97

101,5 ± 2,48

Nền N2 BET

30,11

25,61

85,05 ± 3,03

28,94

96,11 ± 3,15

29,37

97,55 ± 3,45

DEX

30,79

27,22

88,39 ± 2,16

29,98

97,36 ± 2,29

30,19

98,03 ± 1,14

CLO

50,03

42,57

85,08 ± 4,48

47,27

94,48 ± 2,93

47,88

95,70 ± 2,85

CYP

50,10

41,59

83,01 ± 2,64

49,97

99,74 ± 3,48

49,74

99,27 ± 5,19

LOR

50,22

45,23

90,06 ± 3,73

51,43

102,4 ± 3,33

51,29

102,1 ± 5,76

Nền N3 BET

30,11

24,66

81,90 ± 3,03

29,36

97,50 ± 3,89

29,30

97,31 ± 5,05

DEX

30,79

26,77

86,94 ± 1,22

30,45

98,90 ± 5,38

30,04

97,55 ± 4,56

CLO

50,03

40,26

80,47 ± 4,30

46,91

93,76 ± 4,06

47,69

95,33 ± 2,04

CYP

50,10

39,98

79,80 ± 2,83

47,75

95,31 ± 2,44

48,30

96,39 ± 5,91

LOR

50,22

43,98

87,59 ± 3,72

50,63

100,8 ± 5,30

51,63

102,8 ± 4,08

33

120.00

Hiệu suất (%)

100.00 80.00

BET DEX

60.00

CLO CYP

40.00

LOR 20.00 0.00 Siêu âm 5 phút

Siêu âm 10 phút

Siêu âm 15 phút

Hình 3.9. Biểu đồ đánh giá hiệu suất chiết phụ thuộc thời gian siêu âm (nền N3) Nhận xét: Từ Bảng 3.9 và Hình 3.9 cho thấy: hiệu suất chiết trên 3 nền mẫu tương tự nhau. Thời gian siêu âm là 5 phút cho hiệu suất chiết các chất phân tích thấp nhất, từ 77,70 – 90,06 %. Thời gian siêu âm 10 phút và 15 phút cho hiệu suất chiết tương tự nhau, từ 93,76 – 102,4 % (siêu âm 10 phút) và từ 94,16 – 102,8 % (siêu âm 15 phút). Do đó, thời gian siêu âm 10 phút là thích hợp để tiến hành xử lý mẫu ở các bước tiếp theo.

Sau quá trình khảo sát, lựa chọn điều kiện xử lý mẫu nhƣ sau:

Hình 3.10. Quy trình xử lý mẫu

34

3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích 3.2.1. Độ phù hợp của hệ thống Tiêm lặp lại sáu lần dung dịch chuẩn hỗn hợp gồm BET và DEX có nồng độ 30 ng/ml; 3 chất CLO, CYP và LOR có nồng độ 50 ng/ml vào hệ thống LC-MS/MS. Kết quả phân tích được trình bày ở Bảng 3.10.

Bảng 3.10. Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS (n=6) Hoạt chất

BET

DEX

CLO

CYP

LOR

Thời gian lƣu (phút) L1

4,99

6,64

3,31

4,95

5,86

L2

4,99

6,64

3,31

4,96

5,86

L3

5,01

6,65

3,32

4,98

5,88

L4

5,01

6,66

3,33

4,98

5,88

L5

5,00

6,66

3,32

4,98

5,88

L6

5,02

6,67

3,33

4,99

5,89

5,00

6,65

3,32

4,97

5,88

0,24

0,18

0,27

0,30

0,21

Trung bình RSD (%)

Diện tích pic (Cps.s) L1

106959

49143

2502381

639240

525189

L2

102734

51470

2461180

634256

575266

L3

105729

51019

2467740

634694

552556

L4

107741

50736

2539688

650903

561180

L5

105844

50458

2453072

649935

562834

L6

107912

52339

2460853

618237

549068

106153

50861

2480819

637878

554349

1,80

2,10

1,36

1,89

3,06

Trung bình RSD (%)

Nhận xét: Từ Bảng 3.10 cho thấy RSD của thời gian lưu thấp (< 1%) và RSD của diện tích pic dao động trong khoảng 1,36 – 3,06 % tùy mỗi chất. Như vậy hệ thống đáp ứng yêu cầu theo AOAC 2016 (RSD < 15% với mức nồng độ ≤ 100 ppb).

35

3.2.2. Độ đặc hiệu Phương pháp LC-MS/MS đã xây dựng cho chất phân tích có 1 ion mẹ (1 điểm) và 2 ion con với mỗi chất (mỗi ion con 1,5 điểm), điều này phù hợp với quy định của châu Âu (2002/657/EC) khi có ít nhất 4 điểm IP [20]. So sánh thời gian lưu, ion mẹ, 2 ion con, tỷ lệ cường độ 2 ion con định tính và định lượng của mẫu thử so với mẫu chuẩn để cho kết luận sự có mặt của các chất phân tích trong mẫu thử.

Chuẩn bị mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu chuẩn như sau: - Mẫu trắng: Xử lý nền mẫu theo quy trình xử lý mẫu đã xây dựng.

- Mẫu chuẩn: Từ dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp pha loãng với dung môi là methanol thành dung dịch chuẩn hỗn hợp gồm BET và DEX có nồng độ 30 ng/ml; 3 chất CLO, CYP và LOR có nồng độ 50 ng/ml.

- Mẫu trắng thêm chuẩn: Cân chính xác một lượng nền mẫu tương ứng 1/10 liều dùng cho vào ống falcon 50 ml (0,51 g đối với nền N1; 0,15 g đối với nền N2; 0,33 g đối với nền N3). Thêm 100 µl dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp gồm BET và DEX có nồng độ 0,375 mg/ml; 3 chất CLO, CYP và LOR có nồng độ 0,626 mg/ml vào nền mẫu. Tiến hành xử lý mẫu như quy trình xử lí mẫu chung ở mục 3.1.3. Nồng độ các chất phân tích sau khi xử lý tương tương với mẫu chuẩn.

Thực hiện lần lượt trên 3 nền mẫu (N1, N2, N3), phân tích mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu chuẩn. Sắc ký đồ của các mẫu trình bày ở các hình dưới đây:

36

Mẫu trắng

Mẫu trắng thêm chuẩn

Mẫu chuẩn

Hình 3.11. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu trên nền N1

Mẫu trắng

Mẫu trắng thêm chuẩn

Mẫu chuẩn

Hình 3.12. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu trên nền N2

Mẫu trắng

Mẫu trắng thêm chuẩn

Mẫu chuẩn

Hình 3.13. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu trên nền N3

37

Nhận xét: Từ 3 hình trên cho thấy: Trên sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện pic trùng với thời gian lưu của các chất phân tích. Trên sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn, các pic xuất hiện trùng thời gian lưu với mẫu chuẩn, các pic đều có hình dạng đẹp, cân đối. Như vậy, phương pháp phân tích đã xây dựng đáp ứng được yêu cầu về độ đặc hiệu trên cả 3 nền mẫu N1, N2, N3.

3.2.3. Khoảng nồng độ tuyến tính Chuẩn bị các dung dịch sau: - Dung dịch chuẩn hỗn hợp 1: Dùng micropipet hút chính xác 100 µl dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ thể tích thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 có nồng độ BET và DEX là 3,75 µg/ml; 3 chất CLO, CYP và LOR có nồng độ là 6,25 µg/ml.

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp 2: Dùng micropipet hút chính xác 600 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 cho vào bình định mức 25 ml, thêm methanol vừa đủ thể tích thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp 2 có nồng độ BET và DEX là 90 ng/ml; 3 chất CLO, CYP và LOR có nồng độ là 150 ng/ml.

Từ dung dịch chuẩn hỗn hợp 2 pha loãng thành dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp bằng methanol với tỷ lệ như bảng sau: Bảng 3.11. Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp

Dung dịch chuẩn

Thể tích dung dịch chuẩn hỗn hợp 2 thêm vào (µl)

Thể tích methanol thêm vào (µl)

C1

100

1400

C2

200

1300

C3

300

1200

C4

400

1100

C5

500

1000

C6

700

800

C7

900

600

Tiến hành tiêm vào hệ thống LC-MS/MS. Xây dựng đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic với nồng độ các chất phân tích. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.12.

38

Bảng 0.12. Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất phân tích Hoạt chất

BET

C1

C2

C3

C4

C5

C6

C7

C (ng/ml)

6,02

12,03

18,05

24,06

30,08

42,11

54,14

Spic (Cps.s)

17369

37302

66516

83200

111561

154183

204200

% thu hồi

104,3

94,91

105,0

96,65

101,6

98,7

100,6

Đường chuẩn

DEX

y = 3877,4x - 6967,8 ;

C (ng/ml)

6,05

12,10

18,14

24,19

30,24

42,34

54,43

Spic (Cps.s)

8031

17237

29330

38208

53491

73689

98956

% thu hồi

114,1

97,35

100,3

94,62

102,5

98,45

101,2

Đường chuẩn

CLO

y = 1887,8x - 4999,7 ; 10,03

20,06

30,10

40,13

50,16

70,22

90,29

Spic (Cps.s)

432250

856584

1,266e6

1,681e6

2,456e6

3,277e6

4,192e6

% thu hồi

111,5

99,94

95,04

92,90

106,6

100,6

99,42

y = 47844x - 102612 ;

R² = 0,9952

C (ng/ml)

10,19

20,38

30,58

40,77

50,96

71,34

91,73

Spic (Cps.s)

118397

215641

368644

476382

666799

862498

1,113e6

% thu hồi

104,4

90,70

100,8

96,95

107,7

99,08

99,09

Đường chuẩn

LOR

R² = 0,9978

C (ng/ml)

Đường chuẩn

CYP

R² = 0,9985

y = 12392x - 13419

;

R² = 0,9956

C (ng/ml)

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

70,00

90,00

Spic (Cps.s)

100949

210318

334721

432496

538703

775670

1,057e6

% thu hồi

109,8

101,4

102,8

97,89

96,37

97,60

102,5

Đường chuẩn

y = 11766x - 28223

39

;

R² = 0,9972

Kết quả: có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ các chất phân tích với diện tích pic thu được (R² > 0,99) trong khoảng nồng độ 6 – 54 ng/ml đối với BET và DEX, 10 – 90 ng/ml đối với CLO, CYP và LOR. Độ thu hồi của các chất phân tích tại mỗi mức nồng độ trong dãy chuẩn đạt yêu cầu theo AOAC 2016 (tỷ lệ thu hồi nằm trong khoảng 80 – 110 % ở mức nồng độ ≤ 100 ppb và trong khoảng 60 – 115 % ở mức nồng độ ≤ 10 ppb).

3.2.4. Độ đúng và độ chính xác Độ đúng và độ chính xác của phương pháp được tiến hành trên 3 nền mẫu thêm chuẩn ở các nồng độ thấp, trung bình và cao. Mỗi mức nồng độ tiến hành lặp lại 7 lần trên 1 nền mẫu để xác định độ đúng và độ chính xác trong ngày. Độ đúng và độ chính xác khác ngày được tiến hành tương tự như trên nhưng vào một ngày khác.

Chuẩn bị dung dịch mẫu tự tạo: Cân chính xác một lượng nền mẫu tương ứng 1/10 liều dùng cho vào ống falcon 50 ml (0,51 g đối với nền N1; 0,15 g đối với nền N2; 0,33 g đối với nền N3). Thêm chính xác một lượng chuẩn (dung dịch) vào nền mẫu sao cho các chất phân tích sau khi xử lý ở 3 mức nồng độ như sau: BET và DEX 15 – 30 - 45 ng/ml; 3 chất CLO, CYP, LOR 25 – 50 - 75 ng/ml. + Lượng chuẩn hỗn hợp thêm vào: tương ứng với 3 mức nồng độ thêm chuẩn, lượng dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp (có nồng độ BET và DEX là 0,375 mg/ml; 3 chất CLO, CYP và LOR là 0,625 mg/ml) được thêm vào nền mẫu lần lượt là 50 µl, 100 µl, 150 µl. Xử lý mẫu theo quy trình chung ở mục 3.1.3. Tiến hành phân tích.

Kết quả được trình bày trong Bảng 3.13, Bảng 3.14 và Bảng 3.15.

Bảng 3.13. Kết quả độ đúng và độ chính xác trong ngày trên 3 nền mẫu (n=7) Hoạt chất

BET

DEX

m*thêm

Nền N1

(ng)

mtìm lại (ng)

15,04

Nền N2

H (%)

RSD (%)

14,54

96,65

30,08

29,44

45,12

vào

mtìm lại

H (%)

Nền N3 RSD (%)

mtìm lại

H (%)

RSD (%)

101,6

3,95

6,31

(ng) 15,59

103,6

2,03

(ng) 15,28

97,87

4,18

29,43

97,84

2,83

28,71

95,45

5,99

42,56

94,32

4,26

42,85

94,98

1,98

44,92

99,57

2,60

15,12

14,98

99,08

1,66

15,22

100,7

2,81

15,01

99,29

5,11

30,24

29,31

96,91

2,99

29,02

95,97

2,93

28,94

95,69

2,58

45,36

43,25

95,36

5,06

42,56

93,83

2,54

43,78

96,51

2,47

40

CLO

CYP

LOR

25,08

25,21

100,5

2,41

25,47

101,6

2,59

25,08

100,0

4,85

50,16

46,87

93,44

6,50

46,68

93,06

1,59

46,46

92,62

4,91

75,24

69,38

92,21

5,53

68,42

90,94

2,95

72,81

96,77

1,77

25,48

25,92

101,7

5,67

26,12

102,5

3,40

25,26

99,14

4,86

50,96

49,16

96,47

5,26

50,10

98,31

3,04

48,13

94,44

4,12

76,44

71,05

92,95

5,91

70,62

92,39

5,84

72,81

95,25

4,13

25,00

25,47

101,9

2,96

25,85

103,4

1,51

25,53

102,1

5,79

50,00

49,88

99,75

4,49

50,39

100,8

5,30

48,41

96,81

6,25

75,00

70,51

94,01

4,46

72,65

96,86

3,96

74,25

99,00

2,85

*: lượng chuẩn trong 1 ml mẫu phân tích Bảng 3.14. Kết quả độ đúng và độ chính xác khác ngày trên 3 nền mẫu (n=7) Hoạt chất

BET

DEX

CLO

CYP

LOR

m*thêm vào

(ng)

Nền N1 mtìm lại

H (%)

Nền N2 RSD (%)

mtìm lại

Nền N3

H (%)

RSD (%)

103,2

mtìm

RSD (%)

2,76

(ng) 15,49

H (%) 103,0

3,36

lại

15,04

(ng) 15,38

102,3

1,52

(ng) 15,52

30,08

29,10

96,76

4,41

27,30

90,76

2,15

28,08

93,35

2,79

45,12

41,32

91,57

3,50

41,28

91,48

4,78

42,46

94,11

2,89

15,12

15,18

100,4

2,97

15,68

103,7

2,70

15,62

103,3

2,47

30,24

29,31

96,92

4,98

27,38

90,54

1,46

27,27

90,17

4,69

45,36

40,91

90,18

2,46

41,35

91,15

2,39

42,82

94,41

2,19

25,08

25,60

102,1

1,76

24,20

96,49

4,99

24,87

99,15

5,77

50,16

51,68

103,0

1,85

49,37

98,43

2,69

48,49

96,67

4,02

75,24

70,03

93,07

6,50

68,77

91,41

3,67

72,69

96,61

2,98

25,48

25,80

101,3

1,76

25,06

98,37

5,01

25,52

100,2

5,21

50,96

50,80

99,68

4,51

46,37

90,99

5,21

46,98

92,19

3,85

76,44

69,09

90,38

4,04

69,91

91,46

3,82

70,70

92,49

3,72

25,00

25,38

101,5

5,57

26,01

104,0

2,81

25,74

103,0

3,61

50,00

48,68

97,35

5,16

46,21

92,42

4,13

46,81

93,63

5,89

75,00

67,71

90,28

3,22

68,12

90,82

3,40

71,60

95,46

3,57

*: lượng chuẩn trong 1 ml mẫu phân tích

41

Bảng 3.15. Kết quả độ đúng và độ chính xác trên 3 nền mẫu (n=14) Hoạt chất BET

DEX

CLO

CYP

LOR

Nền N1 RSD H (%) (%)

Nền N2 RSD H (%) (%)

Nền N3 RSD H (%) (%)

15,04

99,45

5,20

103,4

2,53

102,3

3,59

30,08

97,31

4,17

94,30

4,63

94,40

4,96

45,12

92,94

4,06

93,43

4,26

96,84

4,01

15,12

99,76

2,42

102,2

3,26

101,3

4,32

30,24

96,91

3,95

93,25

3,80

92,93

4,78

45,36

92,77

4,34

92,54

3,07

95,46

2,61

25,08

101,3

2,18

99,03

4,86

99,58

5,14

50,16

98,23

6,71

95,75

3,70

94,65

5,01

75,24

92,64

5,82

90,82

3,26

96,69

2,40

25,48

101,5

4,05

100,5

4,91

99,65

4,87

50,96

98,07

4,99

94,65

5,85

93,31

4,20

76,44

91,67

5,10

92,89

3,54

93,87

4,25

25,00

101,7

4,29

103,7

2,36

102,5

4,65

50,00

98,55

4,81

96,60

6,54

95,22

6,35

75,00

92,14

4,31

94,38

5,07

97,23

3,71

m*thêm vào (ng)

*: lượng chuẩn trong 1 ml mẫu phân tích Nhận xét: từ Bảng 3.13, Bảng 3.14 và Bảng 3.15 cho thấy: - Trên nền N1: tỷ lệ thu hồi trong ngày và khác ngày của các chất phân tích ở 3 mức nồng độ thêm chuẩn nằm trong khoảng từ 90,18 – 103,0 %, giá trị RSD dao động trong khoảng 1,52 – 6,50 %.

- Trên nền N2: tỷ lệ thu hồi trong ngày và khác ngày của các chất phân tích ở 3 mức nồng độ thêm chuẩn nằm trong khoảng từ 90,54 – 104,0 %, giá trị RSD dao động trong khoảng 1,46 – 5,84 %.

- Trên nền N3: tỷ lệ thu hồi trong ngày và khác ngày của các chất phân tích ở 3 mức nồng độ thêm chuẩn nằm trong khoảng từ 90,17 – 103,3 %, giá trị RSD dao động trong khoảng 2,18 – 6,25 %.

42

- Trên cả 3 nền mẫu, tỷ lệ thu hồi của các chất phân tích ở 3 mức nồng độ thêm chuẩn (n = 14) nằm trong khoảng 90,82 – 103,7 %, giá trị RSD dao động trong khoảng 1,46 – 6,71 %.

Như vậy, phương pháp đã xây dựng cho độ đúng và độ chính xác trên cả 3 nền mẫu đạt theo yêu cầu của AOAC 2016 (tỷ lệ thu hồi nằm trong khoảng 80 – 110 % và RSD < 15 % ở mức nồng độ ≤ 100 ppb).

3.2.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp bằng cách phân tích các chất ở nồng độ thấp dựa trên giá trị tỷ số tín hiệu / nhiễu nền (S/N).

Thêm chuẩn ở các mức nồng độ khác nhau vào nền mẫu và tiến hành chiết như quy trình xử lý mẫu chung ở mục 3.1.3. Nồng độ các chất phân tích sau khi xử lý như sau: 0,10 ppb; 0,15 ppb; 0,20 ppb; 0,25 ppb; 0,30 ppb; 0,35 ppb; 0,40 ppb; 0,50 ppb; 0,75 ppb; 1,0 ppb.

Tiến hành phân tích trên cả 3 nền mẫu, nồng độ tại đó cho tỷ số tín hiệu / nhiễu nền (S/N) = 3 là LOD và tỷ số tín hiệu/ nhiễu nền (S/N) = 10 là LOQ. Kết quả phân tích LOD, LOQ của 5 chất phân tích được thể hiện ở hình và bảng sau:

43

Hình 3.14. Sắc ký đồ các chất phân tích ở nồng độ LOD trên nền N3 Bảng 3.16. Kết quả LOD và LOQ trên 3 nền mẫu Nền N1

Hoạt

Nền N2

LOD LOQ

Nền N3

LOD

LOQ

(ppb)

(ppb)

3

0,20

0,66

0,99

3

0,25

0,15

0,50

4

3

0,15

0,50

4

0,15

0,50

chất

S/N

BET

3

0,25

0,83

DEX

3

0,30

CLO

4

CYP LOR

(ppb) (ppb)

LOD

LOQ

(ppb)

(ppb)

3

0,25

0,83

0,83

4

0,30

0,99

0,10

0,33

3

0,10

0,33

3

0,15

0,50

4

0,15

0,50

3

0,10

0,33

3

0,10

0,33

S/N

S/N

Nhận xét: Từ Bảng 3.16 cho thấy LOD và LOQ rất thấp, LOD từ 0,10 đến 0,30 ppb, LOQ từ 0,33 đến 0,99 ppb trên 3 nền mẫu.

Từ các kết quả thẩm định thu đƣợc cho thấy: Phương pháp có độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện thấp (từ 0,10 đến 0,30 ppb; có mối tương quan tuyến tính giữa đáp ứng và nồng độ chất phân tích trong khoảng nồng độ khảo sát (hệ số tương quan R² > 0,99); độ đúng (90,17 – 104,0 %) và độ chính xác (RSD 1,46 – 6,50%) 44

đáp ứng yêu cầu tỷ lệ thu hồi khoảng 80,0 – 110,0% và RSD < 15 % ở mức nồng độ ≤ 100 ppb. Điều đó cho thấy phương pháp đã xây dựng có thể tin cậy để ứng dụng trong phân tích các mẫu trên thị trường.

3.3. Ứng dụng quy trình phân tích trên mẫu thực Thu thập mẫu: 15 chế phẩm đông dược, thực phẩm bảo vệ sức khỏe điều trị hoặc hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng từ các nguồn khác nhau, trong đó có 2 chế phẩm được mua qua mạng internet; 8 chế phẩm được mua tại các nhà thuốc đông y; 5 chế phẩm còn lại do người sử dụng nghi ngờ gửi đến kiểm tra. Các mẫu được lưu hành ở Hà Nội, Đà Nẵng, Huế, Khánh Hòa, Hà Tĩnh, Phú Yên, An Giang; có số đăng ký hoặc không; bao gồm 3 chế phẩm hoàn cứng, 2 chế phẩm hoàn mềm, 1 chế phẩm viên nang cứng, 9 chế phẩm dạng bột. Tiến hành xử lý mẫu và phân tích theo quy trình đã xây dựng. Đánh giá kết quả: - So sánh thời gian lưu, mảnh mẹ, hai mảnh con, tỷ lệ cường độ hai mảnh con định tính và định lượng của mẫu thử so với mẫu chuẩn để cho kết luận đúng (pass) hoặc nghi ngờ (fail) sự có mặt của các chất phân tích trong mẫu thử.

- Tính nồng độ các chất phân tích nếu có trong mẫu thực dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính tương ứng của các chất phân tích được thiết lập trong ngày. Từ nồng độ các chất phân tích (nếu có) trong dịch chiết mẫu thử, tính hàm lượng chất phân tích trong mẫu thực ban đầu dựa vào khối lượng cân và hệ số pha loãng sau quá trình xử lý mẫu. Từ đó, là cơ sở để khuyến cáo người sử dụng trong việc cân nhắc lựa chọn các chế phẩm đông dược để điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng.

Kết quả phân tích trên 15 mẫu chế phẩm đông dược thu thập được đã phát hiện 7 chế phẩm bị trộn trái phép một số hoạt chất nhóm chống dị ứng (cả nhóm kháng histamin H1 và corticoid). Kết quả định danh và định lượng các chất được minh họa ở các hình và bảng sau:

45

Hình 3.15. Sắc ký đồ và phổ định danh cyproheptadin hydroclorid trong mẫu H05

Hình 3.16. Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính H05 để định lượng

46

Hình 3.17. Sắc ký đồ và phổ định danh dexamethason acetat trong mẫu B13

Hình 3.18. Sắc ký đồ và phổ định danh chlorpheniramin maleat trong mẫu B13

47

Hình 3.19. Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính B13 để định lượng Bảng 3.17. Kết quả định tính trên mẫu thực Mẫu thực VN01 H02 B03 B04 H05 H06 B07 B10 B11 H12 B13 H21 B23 B24 B26

Dạng bào Nguồn gốc BET DEX CLO chế Viên nang Lương y Hoàn mềm Lương y Bột Lương y Bột Lương y Hoàn mềm Lương y Hoàn cứng Lương y Bột Lương y Bột Lương y Bột Mẫu gửi + Hoàn cứng Mẫu gửi + + Bột Mẫu gửi + + Hoàn cứng Mẫu gửi + Bột Internet + + Bột Internet + + Bột Mẫu gửi (-): Không phát hiện (<LOD); (+): Phát hiện

48

CYP

LOR

+ -

-

Bảng 3.18. Kết quả đánh giá các mẫu thực dương tính Hàm Mẫu thử

H05 B11 H12 B13 H21

Dạng

Tỉnh /

Liều

Chất

Hàm

lƣợng

Hàm

bào

Thành

dùng

phát

lƣợng

(mg/đơn

lƣợng

chế

phố

(đơn vị)

hiện

(mg/g)

vị mẫu)

(mg/liều)

Hà Nội

6 viên

CYP

0,062

0,13

0,801

An Giang

1 gói

CLO

1,14

1,07

1,073

1 gói (10 DEX

0,081

0,23

0,23

CLO

0,66

1,89

1,893

DEX

0,51

0,42

0,422

CLO

4,03

3,32

3,322

CLO

1,24

2,83

2,834

DEX

0,033

0,22

0,11

CLO

0,28

1,92

0,96

DEX

0,21

0,28

0,28

CLO

1,98

2,64

2,643

Hoàn mềm Gói bột Hoàn cứng Gói bột Hoàn cứng

B23

Gói bột

B24

Gói bột

1,2,3,4

An Giang An Giang Phú Yên Khánh Hòa Khánh Hòa

viên) 1 gói 1 gói (43 viên) 1/2 gói 1 gói

: Dung dịch thử được pha loãng thêm 2; 3,5; 5; 10 lần Nhận xét: Kết quả phân tích trên 15 mẫu chế phẩm đông dược thu thập được

đã phát hiện 7 chế phẩm bị trộn trái phép với một số hoạt chất nghiên cứu. Trong đó, phát hiện 1 mẫu dương tính với cyproheptadin hydroclorid (0,80 mg/liều), 2 mẫu dương tính với đơn hoạt chất chlorpheniramin maleat (1,07 mg/liều và 2,83 mg/liều). Đồng thời phát hiện 4 mẫu dương tính với cả hai chất dexamethason acetat (0,11 mg/liều – 0,42 mg/liều) và chlorpheniramin maleat (0,96 mg/liều – 3,32 mg/liều).

49

Chƣơng 4. BÀN LUẬN 4.1. Về nền mẫu Phạm vi nghiên cứu của đề tài tập trung vào các sản phẩm ở dạng rắn, do đó 3 nền mẫu được xây dựng dựa trên các bài thuốc cổ phương được bào chế dưới dạng viên hoàn, bột cốm và viên nang cứng. Thành phần nền mẫu N1 (viên hoàn) dựa vào bài thuốc cổ truyền “Ngân kiều tán” trong sách Ôn bệnh điều biện và theo Dược điển Việt Nam V, gia giảm thành phần của bài thuốc cho phù hợp với thành phần các bài thuốc đang lưu hành trên thị trường và tác dụng điều trị, gồm 9 loại dược liệu có tác dụng tiêu độc, tán phong, như sau: kim ngân hoa, liên kiều, cát cánh, bạc hà, đạm trúc diệp, kinh giới tuệ, lô căn, ngưu bàng tử, cam thảo. Thành phần nền mẫu N2 (bột cốm) dựa vào bài thuốc cổ truyền “Liên kiều bại độc tán” trong sách Thương hàn toàn sinh tập gồm 14 loại dược liệu có tác dụng phát hãn giải biểu, tán phong nhiệt như: liên kiều, chi tử, khương hoạt, huyền sâm, bạc hà, phòng phong, sài hồ, cát cánh, thăng ma, xuyên khung, đương quy, hoàng cầm, bạch thược, ngưu bàng tử. Thành phần nền mẫu N3 dựa vào bài thuốc cổ truyền “Tiêu phong tán” trong sách Y tông kim giám, gia giảm thành phần của bài thuốc gồm 11 loại dược liệu như sau: kinh giới, phòng phong, ngưu bàng tử, thuyền thoái, sinh địa, đan bì, bạch thược, thổ phục linh, ké đầu ngựa, bồ công anh, cam thảo có tác dụng giải biểu, khu phong, chỉ ngứa, tuyên độc thấu chẩn. Các nền mẫu này tương tự các sản phẩm được cấp số đăng ký lưu hành trên thị trường như “Ngân kiều giải độc Favomin” (Công ty cổ phần Dược phẩm OPC), “Ngân kiều giải độc PV” (CTCP dược thảo Phúc Vinh), “Thuốc bột giải nhiệt tiêu ban tán” (Cơ sở phú Sơn), “Thanh nhiệt giải độc SXH” (Công ty Cổ phần BV Pharma)…do đó 3 nền mẫu này có tính đại diện nhất định cho các chế phẩm đông dược dạng rắn có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mề đay, mẩn ngứa.

4.2. Về phƣơng pháp phân tích Trong những năm gần đây, phương pháp LC-MS/MS được sử dụng ngày càng phổ biến trên thế giới, đặc biệt là trong phân tích các chất cấm trộn trái phép trong chế phẩm đông dược, thuốc y học cổ truyền vì có độ nhạy và độ đặc hiệu cao [18],

50

[19]. Ở Việt Nam, việc ứng dụng phương pháp này trong công tác phân tích kiểm nghiệm cũng đã được thực hiện trên nhiều nền mẫu khác nhau như thực phẩm, dịch sinh học, nước thải… nhưng trên nền mẫu chế phẩm đông dược thì phương pháp này vẫn chưa được đưa vào ứng dụng nhiều. Hiện nay trên thị trường có rất nhiều chế phẩm đông dược dùng để điều trị và hỗ trợ điều trị nhiều bệnh khác nhau, với nhiều dạng bào chế khác nhau (viên hoàn, viên nén, viên nang, thuốc bột…) và đa dạng về thành phần các loại dược liệu. Nếu sử dụng các phương pháp phân tích thông thường như TLC hay HPLC thì vẫn có thể sẽ gây kết quả âm tính giả, dương tính giả tùy thuộc vào mức nồng độ hoạt chất được trộn vào và tính phức tạp của nền mẫu. Hơn nữa, các phương pháp kể trên thường có giới hạn phát hiện ở mức nồng độ ppm trở lên, trong khi liều chất cấm được trộn vào có thể rất nhỏ, đặc biệt là nhóm kháng histamin H1 và corticoid có liều điều trị thấp, nên có thể bỏ qua trường hợp dương tính. Do đó, LC-MS/MS là phương pháp phù hợp hơn cả để phát hiện các hoạt chất cấm này do có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp hạn chế sự ảnh hưởng của nền mẫu và những kết quả âm tính giả hay dương tính giả nêu trên.

Phương pháp LC-MS/MS với chế độ bắn phá mảnh ion thì lựa chọn điều kiện khối phổ và điều kiện sắc ký là rất quan trọng để đạt được độ đặc hiệu cao. Các điều kiện sắc ký bao gồm cột sắc ký, thành phần pha động, tỷ lệ pha động, tốc độ dòng cũng như thể tích tiêm mẫu đã lựa chọn cho phép tách được các chất nghiên cứu có pic gọn, cân đối, thời gian phân tích tương đối ngắn, cường độ tín hiệu pic phù hợp để phân tích. Đặc biệt, pha động với chương trình gradient lựa chọn đã đảm bảo được sự ổn định của quá trình tách; tốc độ dòng pha động phù hợp với lượng khí phun và áp suất đầu phun, đảm bảo thời gian phân tích không quá dài và không làm ảnh hưởng đến hình dạng pic và tuổi thọ của cột sắc ký. Các thông số về MS của phương pháp đã xây dựng đạt yêu cầu theo quy định của Châu Âu (2002/657/EC) khi có ít nhất 4 điểm IP (1 ion mẹ và 2 ion con định tính và định lượng) [20]. Trong khi đó, so sánh với nghiên cứu của YE Lin-hu xác định 7 kháng histamin H1 trong chế phẩm y học cổ truyền Trung Quốc [34] hay nghiên cứu của M. Gergov xác định 18 kháng histamin H1 trong mẫu máu [21] (đều chỉ sử dụng 1 ion con để định tính và định lượng) thì nghiên cứu này tuân thủ theo quy định 4 điểm IP nên cho kết quả 51

khách quan hơn. Do vậy, dù thời gian lưu của cyproheptadin hydroclorid và betamethason xấp xỉ nhau (4,97 phút đối với cyproheptadin hydroclorid và 5,00 phút đối với betamethason) thì dựa vào ion mẹ, 2 ion con và tỷ lệ giữa 2 ion con vẫn cho phép xác định được riêng biệt mỗi chất phân tích trên một cách chính xác.

4.3. Về xử lý mẫu Xử lý mẫu trong phân tích là bước quan trọng vì có ảnh hưởng trực tiếp kết quả của phương pháp phân tích, do đó cần lựa chọn phương pháp xử lý mẫu phù hợp để có thể chiết được hoạt chất với hiệu suất cao nhất và hạn chế được sự ảnh hưởng của nhiễu nền. Trên thị trường, các chế phẩm đông dược dạng rắn thường ở nhiều dạng bào chế khác nhau (viên hoàn, viên nén, viên nang, thuốc bột…) và đa dạng về thành phần các loại dược liệu nên việc tìm ra một phương pháp xử lý mẫu vừa nhanh chóng, tiết kiệm chi phí và phù hợp với điều kiện phân tích là rất cần thiết. Qua tham khảo một số nghiên cứu trước đây [33], [34], nghiên cứu đã khảo sát quá trình xử lý mẫu qua 2 giai đoạn là khảo sát dung môi chiết và khảo sát thời gian siêu âm. Về dung môi chiết, nghiên cứu đã sử dụng phương pháp chiết trực tiếp với các dung môi khác nhau là ethanol, acetonitril, methanol, hỗn hợp methanol : nước và đã chọn được methanol là dung môi có khả năng chiết các chất tốt nhất.

Ethanol tuy là dung môi rẻ tiền, ít độc tuy nhiên cho hiệu suất chiết các chất phân tích không đồng đều nhau và thấp hơn khi chiết bằng methanol. Kết quả trên tương tự khi chiết bằng acetonitril hay hỗn hợp methanol : nước. Vì thế methanol được lựa chọn là dung môi để chiết mẫu. Về thời gian siêu âm, khảo sát ở 3 mức lần lượt là 5 phút, 10 phút, 15 phút. Kết quả cho thấy siêu âm 5 phút cho hiệu suất chiết thấp hơn nhiều so với 2 mức thời gian còn lại. Siêu âm 10 phút và 15 phút cho hiệu suất chiết cao (93,76 – 102,82 %) và đều nhau, do đó lựa chọn siêu âm mẫu trong 10 phút để tiết kiệm chi phí và thời gian phân tích.

4.4. Về thẩm định phƣơng pháp phân tích Thẩm định phương pháp đã xây dựng trên các tiêu chí gồm độ phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ đúng và độ chính xác. Kết quả cho thấy tiêu chí về độ phù hợp của hệ thống, độ đúng và độ chính xác đáp ứng theo yêu cầu của AOAC 2016 trên cả 3

52

nền mẫu tự tạo (tỷ lệ thu hồi nằm trong khoảng 80 – 110 % và RSD < 15 % ở mức nồng độ ≤ 100 ppb).

Về độ đặc hiệu, thực hiện trên các nền mẫu tự tạo (mẫu trắng) với 3 nền gồm nền N1 (viên hoàn), nền N2 (bột cốm), nền N3 (viên nang); mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn. Kết quả cho thấy, trên sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện pic trùng với thời gian lưu của các chất phân tích. Trên sắc ký đồ mẫu chuẩn, các pic xuất hiện trùng thời gian lưu với mẫu trắng thêm chuẩn, các pic đều có hình dạng cân xứng, nhỏ gọn. Hơn nữa, phương pháp đạt yêu cầu theo quy định của Châu Âu (2002/657/EC) khi có ít nhất 4 điểm IP (1 ion mẹ, 2 ion con để định tính và định lượng). Như vậy, phương pháp phân tích đã xây dựng đáp ứng được yêu cầu về độ đặc hiệu.

Nghiên cứu xây dựng khoảng tuyến tính của các chất nghiên cứu ở mức nồng độ khá thấp từ khoảng 6 – 54 ng/ml đối với betamethason, dexamethason acetat; và 10 – 90 ng/ml đối với chlorpheniramin maleat, cyproheptadin hydroclorid, loratadin. Với khoảng tuyến tính này có thể phát hiện được các hoạt chất nghiên cứu với tỷ lệ được trộn rất nhỏ trong mẫu.

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp được xác định bằng cách phân tích các nền mẫu thêm chuẩn ở các nồng độ khác nhau theo hướng dẫn của AOAC 2016 và ICH 2005. Kết quả LOD của 5 chất phân tích nằm trong khoảng 0,10 – 0,30 ppb; LOQ nằm trong khoảng 0,33 – 0,99 ppb.

Kết quả này tương đương hoặc cao hơn kết quả của Đào Thị Cẩm Minh (LOD của betamethason là 0,227 ppb và dexamethason acetat là 0,455 ppb) [11], của YE. Linhu (LOD của loratadin và cyproheptadin hydroclorid đều là 0,50 ppb, LOD của chlorpheniramin maleat là 2,50 ppb) [34].

4.5. Ứng dụng Ứng dụng phương pháp LC-MS/MS đã xây dựng để phân tích các chất nghiên cứu trong 15 chế phẩm đông dược, thực phẩm bảo vệ sức khỏe điều trị hoặc hỗ trợ điều trị mề đay mẩn ngứa, dị ứng từ các nguồn khác nhau, trong đó có 2 chế phẩm được mua qua mạng internet; 8 chế phẩm được mua tại các nhà thuốc đông y; 5 chế phẩm còn lại được gửi kiểm tra. Các chế phẩm được lưu hành ở Hà Nội, Đà Nẵng, 53

Huế, Khánh Hòa, Hà Tĩnh, Phú Yên, An Giang; có số đăng ký hoặc không; có tác dụng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị bệnh dị ứng, mề đay mẩn ngứa ở dạng rắn bao gồm 3 chế phẩm hoàn cứng, 2 chế phẩm hoàn mềm, 1 chế phẩm viên nang cứng, 9 chế phẩm dạng bột. Kết quả cho thấy có 8 chế phẩm không phát hiện dương tính với cả 5 chất nghiên cứu, 7 chế phẩm bị trộn trái phép một số hoạt chất nhóm chống dị ứng (cả nhóm kháng histamin H1 và corticoid). Trong đó, phát hiện 1 mẫu dương tính với cyproheptadin hydroclorid (0,80 mg/liều), 2 mẫu dương tính với đơn hoạt chất chlorpheniramin maleat (1,07 mg/liều và 2,83 mg/liều). Đồng thời phát hiện 4 mẫu dương tính với cả hai chất dexamethason acetat (0,11 mg/liều – 0,42 mg/liều) và chlorpheniramin maleat (0,96 mg/liều – 3,32 mg/liều). Trong số 7 chế phẩm dương tính có 4 chế phẩm là mẫu được gửi để kiểm tra, 1 chế phẩm được mua tại nhà thuốc đông y và 2 chế phẩm được mua qua mạng internet. Các chế phẩm dương tính này được lưu hành tại nhiều địa phương trên cả nước, bao gồm 1 chế phẩm lưu hành ở Hà Nội, 1 chế phẩm lưu hành ở Phú Yên, 2 chế phẩm lưu hành ở Nha Trang và 3 chế phẩm lưu hành ở An Giang, trong đó, có 6/7 chế phẩm dương tính không có số đăng ký. Từ đó cho thấy, thực trạng trộn trái phép các thuốc hóa dược chống dị ứng trong các chế phẩm đông dược, thực phẩm bảo vệ sức khỏe điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng vẫn tồn tại đáng kể, xảy ra ở nhiều địa phương khác nhau và nhất là trên các chế phẩm không có số đăng ký. Do đó, người sử dụng cần cân nhắc khi lựa chọn các chế phẩm đông dược để điều trị các bệnh mề đay, mẩn ngứa, dị ứng.

Như vậy, phương pháp phân tích đã xây dựng có tính thực tiễn cao trong việc phát hiện các hoạt chất chống dị ứng trộn trái phép trong chế phẩm đông dược, góp phần vào công tác quản lý, kiểm tra chất lượng thuốc trên thị trường.

54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ những kết quả thu được chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: 1. Đã xây dựng được phương pháp xác định đồng thời 5 dược chất betamethason, dexamethason acetat, chlorpheniramin maleat, cyproheptadin hydroclorid, loratadin trộn trái phép trong chế phẩm đông dược điều trị hoặc hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa dị ứng bằng LC-MS/MS ở chế độ ESI (+). Phương pháp được thực hiện với kỹ thuật xử lý mẫu đơn giản, dung môi chiết ít độc hại, thời gian phân tích ngắn (12 phút), cho tính đặc hiệu cao với số điểm IP = 4, đáp ứng yêu cầu hiện nay đối với phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS theo quy định của Châu Âu (2002/657/EC).

2. Đã thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của AOAC 2016 và ICH 2005 trên 3 nền mẫu tự tạo. Phương pháp có độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện thấp (từ 0,10 đến 0,30 ppb; có mối tương quan tuyến tính giữa đáp ứng và nồng độ chất phân tích trong khoảng nồng độ khảo sát (hệ số tương quan R² > 0,99); độ đúng (90,17 – 104,0 %) và độ chính xác (RSD 1,46 – 6,50%) đáp ứng yêu cầu tỷ lệ thu hồi khoảng 80,0 – 110,0 % và RSD < 15 % ở mức nồng độ ≤ 100 ppb. Điều đó cho thấy phương pháp đã xây dựng có thể tin cậy để ứng dụng trong phân tích các mẫu trên thị trường.

3. Đã ứng dụng phương pháp phân tích trên 15 mẫu chế phẩm đông dược, thực phẩm bảo vệ sức khỏe điều trị hoặc hỗ trợ điều trị mề đay mẩn ngứa, dị ứng đang lưu hành trên thị trường. Kết quả cho thấy có 7/15 chế phẩm phát hiện dương tính với chất nghiên cứu. Trong 15 mẫu chế phẩm, phát hiện 1 mẫu dương tính với cyproheptadin hydroclorid (0,80 mg/liều), 2 mẫu dương tính với đơn hoạt chất chlorpheniramin maleat (1,07 mg/liều và 2,83 mg/liều). Đồng thời phát hiện 4 mẫu dương tính với cả hai chất dexamethason acetat (0,11 mg/liều – 0,42 mg/liều) và chlorpheniramin maleat (0,96 mg/liều – 3,32 mg/liều).

55

KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu và phát triển phương pháp trên các dược chất điều trị dị ứng khác, nhằm xây dựng một phương pháp có thể phát hiện đồng thời nhiều hoạt chất hơn, phát huy tối đa ưu thế của detector khối phổ.

Mở rộng đối tượng nghiên cứu trên các nền mẫu đông dược ở các dạng bào chế khác như dạng dung dịch, viên nén, viên nang mềm và ứng dụng trên nhiều chế phẩm khác, đặc biệt là các chế phẩm không có số đăng ký và được bán qua mạng internet.

56

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Trần Tử An (2012), Hóa phân tích tập 2: Phân tích dụng cụ, Nhà xuất bản Y học, tr.107-215.

2. Bộ môn Hóa phân tích - Kiểm nghiệm (2011), Kiểm nghiệm thuốc, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, tr.296-307.

3. Bộ Y tế (2007), Hóa Dược tập 1, Nhà xuất bản Y học, tr.272-286.

4. Bộ Y tế (2007), Hóa dược tập 2, Nhà xuất bản Y học, tr.47-66.

5. Bộ Y tế (2012), Dược lý học tập 2, Nhà xuất bản Y học, tr.286-353.

6. Trần Thị Hoàng Chi, Trần Ngọc Thu, Huỳnh Ngọc Thụy & Trần Hùng (2011), "Định tính - định lượng dexamethason acetat và betamethason trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng HPLC", Tạp chí Dược liệu, 16(3), tr.201-207.

7. Hội đồng Dược điển Việt Nam (2018), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học, tr.144-586.

8. Cao Công Khánh, Nguyễn Tường Vy & Hoàng Quỳnh Trang (2013), "Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời sibutramin, furosemid, dexamethason và piroxicam trong thực phẩm chức năng bằng kỹ thuật HPLC", Tạp chí Dược học, 53(5), tr.40-44.

9. Lê Đào Khánh Long, Vũ Văn Hiếu, Trương Ngọc Huyền & Trần Hùng (2011), "Phát hiện corticoid pha trộn trong các chế phẩm đông dược bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng", Y học thành phố Hồ Chí Minh, 15(1), tr.617-621.

10. Đào Thị Cẩm Minh, Nguyễn Thị Hà, Lê Thị Trâm, Phạm Thị Thanh Hà & Nguyễn Thị Kiều Anh (2016), "Xây dựng phương pháp xác định một số thuốc giảm đau, chống viêm trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao", Tạp chí Nghiên cứu dược và thông tin thuốc, 4+5, tr.9196.

11. Đào Thị Cẩm Minh, Thái Khoa Bảo Châu, Trần Tuấn Phong, Nguyễn Phúc Khánh Nhi, Trần Hữu Dũng, Phạm Thị Thanh Hà & Nguyễn Thị Kiều Anh (2018), "Xây dựng phương pháp phát hiện đồng thời một số thuốc giảm đau, kháng viêm trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng LC-MS/MS", Tạp chí Dược học, 58(3), tr.18-32.

12. Trịnh Thị Quy & Đoàn Cao Sơn (2013), "Nghiên cứu phát hiện một số Glucocorticoid trộn trái phép trong thuốc đông dược bằng phương pháp HPLC", Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, 3, tr.13-18.

13. Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2010), Công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc năm 2010, định hướng năm 2011, Báo cáo hội nghị Kiểm nghiệm.

Tiếng Anh 14. Ameti A., Poposka Z., Memeti Sh., Shishovska M., Mustafa Z., Starkoska K. & Sarafinovska Z.A. (2013), "HPLC Analysis of nine corticosteroids in “natural creams” for atopic eczema", European Journal of Pharmaceutical Sciences, 50, pp.58-59.

15. AOAC International (2016), "Guidelines for Standard Method Performance Requirements", AOAC Official Methods of Analysis, pp.1-18.

16. Bogusz M.J., Hassan H., Al-Enazi E., Ibrahim Z. & Al-Tufail M. (2006), "Application of LC-ESI-MS-MS for detection of synthetic adulterants in herbal remedies", J Pharm Biomed Anal, 41(2), pp.554-564.

17. Byard R.W. (2010), "A review of the potential forensic significance of traditional herbal medicines", Journal of Forensic Sciences, 55(1), pp.89-92.

18. Cho S.H., Park H.J., Lee J.H., Kim H.J., Cho S., Yoon C.Y. & Kim W.S. (2014), "Monitoring of 35 illegally added steroid compounds in foods and dietary supplements", Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess, 31(9), pp.1470-1475.

19. Deconinck E., Sacre P. Y., Baudewyns S., Courselle P. & De Beer J. (2011), "A fast ultra high pressure liquid chromatographic method for qualification and quantification of pharmaceutical

combination preparations containing

paracetamol, acetyl salicylic acid and/or antihistaminics", J Pharm Biomed Anal, 56(2), pp.200-209.

20.European

Commission

(2002),

Commission

Decision

2002/657/EC

implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results, Official Journal of the European Communities.

21. Gergov M., Robson J.N., Ojanperä I., Heinonen O.P. & Vuori E. (2001), "Simultaneous screening and quantitation of 18 antihistamine drugs in blood by liquid chromatography ionspray tandem mass spectrometry", Forensic Science International, 121(1-2), pp.108-115.

22. Haneef J., Shaharyar M., Husain A., Rashid M., Mishra R., Siddique N.A. & Pal M. (2013), "Analytical methods for the detection of undeclared synthetic drugs in traditional herbal medicines as adulterants", Drug Test Anal, 5(8), pp.607-613.

23. Hon K.L., Leung T.F., Yau H.C. & Chan T. (2012), "Paradoxical use of oral and topical steroids in steroid-phobic patients resorting to traditional Chinese medicines", World J Pediatr, 8(3), pp.263-267.

24. Huang W.F., Wen K.C. & Hsiao M.L. (1997), "Adulteration by Synthetic Therapeutic Substances of Traditional Chinese Medicines in Taiwan", The journal of Clinical Pharmacology, 37(4), pp.344-350.

25. International Conference on Harmonisation (2005), Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, ICH harmonised tripartite guideline, pp.113.

26. Jin P., Liang X., Wu X., He X., Kuang Y. & Hu X. (2018), "Screening and quantification of 18 glucocorticoid adulterants from herbal pharmaceuticals and health foods by HPLC and confirmed by LC-Q-TOF-MS/MS", Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess, 35(1), pp.10-19.

27. Kim Jung Yeon, Choi Ji Yeon, Yoon Chang Yong, Cho Sooyeul, Kim Woo Seong & Do Jung Ah (2015), "LCâ&#x20AC;&#x201C;MS/MS monitoring of 22 illegal antihistamine compounds in health food products from the Korean market", Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 58(1), pp.137-147.

28. Ko R.J. (1998), "Adulterants in Asian patent medicines", The New England Journal of Medicine, 339(12), pp.847.

29. Ramsay H. M., Goddard W., Gill S. & Moss C. (2003), "Herbal creams used for atopic eczema in Birmingham, UK illegally contain potent corticosteroids", Archives of Disease in Childhood, 88(12), pp.1056-1057.

30. Savaliya A.A., Prasad B., Raijada D.K. & Singh S. (2009), "Detection and characterization of synthetic steroidal and non-steroidal anti-inflammatory drugs in Indian ayurvedic/herbal products using LC-MS/TOF", Drug Test Anal, 1(8), pp.372-381.

31. United States Pharmacopeial Convention (2013), United States Pharmacopeia 40 National Formulary 35, pp.1246-1269.

32. Wang Tie-jie, Han Dong-qi, Lu Yi & Yin Guo (2015), "HPLC determination of 17 additive chemical components in traditional Chinese medicines and health food", Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 35(7), pp.1223-1230.

33. Zhou S., Guo C., Shi F., Jiang W. & Wang L. (2016), "Application of an ultrahigh-performance liquid chromatography coupled to quadrupole-orbitrap high-resolution mass spectrometry for the rapid screening, identification and quantification of illegal adulterated glucocorticoids in herbal medicines", J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1038, pp.34-42.

Tiếng Trung 34. Lin-hu Y.E., Song X., Li-sha W., Mei H.E. & Qi C. (2016), "Simultaneous determination of 7 antihistamine agents added into traditional Chinese medicine preparation by LC-MS/MS", Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 36(11), pp.2022-2028.

35. Ningning S., Keming Z. , Xianghong L. , Tong S.

, Yu S.

& Nanyan T.

(2015), "Determination of twelve chemical drugs illegally added in herbal tea by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with modified QuEChERS", Chinese Journal of Chromatography, 33(10), pp.1026-1031.

Trang web 36. Trung Anh (2015), "Hơn 1 tỉ người trên thế giới đang mắc bệnh dị ứng". Địa chỉ truy cập: https://vov.vn/suc-khoe/hon-1-ti-nguoi-tren-the-gioi-dang-mac-benhdi-ung-453245.vov. Ngày truy cập 19/8/2018.

37. Bộ Y tế (2014) Điểm tin y tế ngày 12-14/10/2014 "Thanh tra Sở Y tế Hà Nội xử phạt 80 triệu đồng đối với chủ cơ sở lương y gia truyền Hà Tộc". Địa chỉ truy cập:http://moh.gov.vn/news/Pages/DiemTinYTeTuCacBaoCaoV2.aspx?ItemI D=198&QAItemID=198&sId=1. Ngày truy cập 29/7/2018.

38. Bộ Y tế (2017) Điểm tin y tế ngày 5/5/2017 "Sở Y tế thành phố Hồ Chí Minh sẽ công khai địa chỉ cơ sở đông y bán thuốc chứa corticoid". Địa chỉ truy cập: http://moh.gov.vn/news/Pages/DiemTinYTeTuCacBaoCaoV2.aspx?ItemID=6 13&QAItemID=613&sId=1. Ngày truy cập 29/7/2018.

39. Cẩm Quyên (2014), "20% dân số Việt Nam mắc các bệnh dị ứng, mề đay". Địa chỉ truy cập: http://vietnamnet.vn/vn/suc-khoe/20-dan-so-viet-nam-mac-cacbenh-di-ung-me-day-186604.html. Ngày truy cập 19/8/2018.

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC 1. PL 1: Quy trình phân tích các thuốc hóa dược chống dị ứng trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng LC-MS/MS 2. PL 2: Chế tạo nền mẫu và hình ảnh các nền mẫu 3. PL 3: Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ của các chất phân tích 4. PL 4: Sắc ký đồ khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính 5. PL 5: Danh mục mẫu chế phẩm đông dược được phân tích 6. PL 6: Sắc ký đồ, kết quả định danh và hình ảnh mẫu dương tính

1. PL 1: Quy trình phân tích các thuốc hóa dƣợc chống dị ứng trộn trái phép trong chế phẩm đông dƣợc bằng LC-MS/MS 1.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và dung cụ Bảng PL1.1. Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

Chất

STT

Nguyên liệu

1

Betamethason

2

Nguồn gốc

chuẩn Chuẩn

Chuẩn VKNTTW

DĐVN

SKS: 0214124.01 HL: 100,69%

Dexamethason acetat

Chuẩn DĐVN

Chuẩn VKNTTW SKS: 0200014 HL: 99,7%

Chlorpheniramin

Chuẩn

Chuẩn VKNTTW

maleat

DĐVN

SKS: WS.0317032.03 HL: 99,10%

4

Cyproheptadin hydrochlorid

Chuẩn PTN

Chuẩn VKNTTW SKS: 0102126 HL: 100,64%

5

Loratadin

Chuẩn

Chuẩn VKNTTW

PTN

SKS: SKS 0108242 HL: 99,6%

6

Acetonitril

HPLC

Merck - Đức

7

Acid formic

PA

Merck - Đức

8

Ethanol

AR

Trung Quốc

9

Methanol

HPLC

Merck - Đức

3

chuẩn

Hóa chất

Tiêu

 Máy móc - trang thiết bị - Máy sắc ký lỏng 2 lần khối phổ LC/MS/MS: Triple Quadrupole BRUKER EVOQ Qube – Mỹ.

- Cân phân tích METTLER – AB204 – Thụy Sỹ (d = 0,1 mg) - Cân phân tích METTLER – TOLEDO XPE105 – Thụy Sỹ (d = 0,01 mg) - Máy lắc siêu âm DAIHAN WUC – A22H – Hàn Quốc - Máy ly tâm HERMLE Z306 – Đức - Tủ sấy MEMMERT ULM 500 – Đức - Máy lắc xoáy Vortex ZX3 -Ý - Các dụng cụ trong phân tích: bình định mức, pipet, micropipet

1.2. Quy trình phân tích và kết quả

1.2.1. Điều kiện khối phổ Bảng PL1.2. Các thông số máy khối phổ Thông số

Giá trị tối ƣu (đơn vị)

Điện áp đầu phun

+4500 V

Khí chắn

20 psi

Nhiệt độ nón

350C

Khí ion hóa 1

40 psi

Nhiệt độ ion hóa

250C

Khí ion hóa 2

45 psi

CID gas

Ar 1.5 mTorr

Bảng PL1.3. Điều kiện khối phổ của các chất phân tích Tên chất

Ion mẹ (m/z)

Betamethason

Dexamethason acetat

393,2

435,2

Chlorpheniramin maleat

275,1

Cyproheptadin hydroclorid Loratadin

288,2

383,1

Ion con (m/z)

CE (eV)

Tỷ lệ (%)

373,2*

6

58,1

355,1

9

41,9

309,1*

11

51,5

397,2

7

48,5

230,0*

14

73,5

167,0

40

26,5

96,2*

23

58,8

191,0

30

41,2

337,0*

20

58,5

267,0

35

41,5

* : Ion định lượng 1.2.2 Điều kiện sắc ký - Cột sắc ký: InertSustain AQ-C18 (100 mm x 2,1 mm; 3,0 µm) - Điều nhiệt cột: 40oC - Thể tích tiêm mẫu: 2 µl - Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút

- Thời gian phân tích: 12 phút - Pha động: Acid formic 0,1% /nước (A) và acetonitril (B) - Chương trình pha động: Chế độ gradient 3: 0 → 7,5 phút: 15 → 75 % B; 7,5 → 8,5 phút: 75 → 15% B; 8,5 → 12 phút: 15 % B. 1.2.3. Chuẩn bị mẫu - Dung dịch thử: Xác định khối lượng trung bình của mỗi đơn vị mẫu, nghiền mịn và làm đồng nhất. Cân chính xác một lượng mẫu tương ứng 1/10 liều dùng cho vào ống falcon 50 ml. Thêm chính xác 25 ml dung môi chiết, lắc đều. Lắc xoáy 5 phút, siêu âm 10 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút. Gạn lấy phần dịch trong ở phía trên, pha loãng 50 lần bằng methanol, lọc qua màng lọc 0,22 µm và tiến hành tiêm vào hệ thống LC-MS/MS. - Dung dịch chuẩn: chuẩn bị các dung dịch chuẩn sau : + Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp: Cân chính xác khoảng 7,5 mg đối với betamethason và dexamethason acetat; 12,5 mg đối với chlorpheniramin maleat, cyproheptadin hydroclorid và loratadin vào bình định mức 20 ml. Hòa tan và định mức vừa đủ 20 ml bằng methanol thu được dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp có nồng độ betamethason và dexamethason acetat là 0,375 mg/ml; 3 chất chlorpheniramin maleat, cyproheptadin hydroclorid và loratadin có nồng độ là 0,625 mg/ml. + Dung dịch chuẩn hỗn hợp 1: Dùng micropipet hút chính xác 100 µl dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ thể tích thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 có nồng độ betamethason và dexamethason acetat là 3,75 µg/ml; 3 chất chlorpheniramin maleat, cyproheptadin hydroclorid và loratadin có nồng độ là 6,25 µg/ml. + Dung dịch chuẩn hỗn hợp 2: Dùng micropipet hút chính xác 600 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 cho vào bình định mức 25 ml, thêm methanol vừa đủ thể tích thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp 2 có nồng độ betamethason và dexamethason acetat là 90 ng/ml; 3 chất chlorpheniramin maleat, cyproheptadin hydroclorid và loratadin có nồng độ là 150 ng/ml.

Từ dung dịch chuẩn hỗn hợp 2 pha loãng thành dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp bằng methanol với tỷ lệ như bảng sau:

Bảng PL1.4. Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp Thể tích dung dịch chuẩn

Thể tích methanol

hỗn hợp 2 thêm vào (µl)

thêm vào (µl)

C1

100

1400

C2

200

1300

C3

300

1200

C4

400

1100

C5

500

1000

C6

700

800

C7

900

600

Dung dịch chuẩn

1.2.4. Tiến hành phân tích và đánh giá kết quả: - Đánh giá độ phù hợp của hệ thống: tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp vào hệ thống LC-MS/MS, đánh giá độ biến thiên của diện tích pic và thời gian lưu (RSD < 15 % đối với mức nồng độ ≤ 100 ppb).

- Phân tích các mẫu chuẩn: lập đường chuẩn thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ các chất phân tích (y = ax + b). Yêu cầu: hệ số tương quan R2 ≥ 0,99 và độ thu hồi của các chất phân tích tại mỗi mức nồng độ trong dãy chuẩn nằm trong khoảng 80 – 110 % ở mức nồng độ ≤ 100 ppb và trong khoảng 60 – 115 % ở mức nồng độ ≤ 10 ppb.

- Phân tích mẫu thử: tiêm mẫu thử vào hệ thống LC-MS/MS. + Định tính: So sánh thời gian lưu, mảnh mẹ, hai mảnh con, tỷ lệ cường độ hai mảnh con định tính và định lượng của mẫu thử so với mẫu chuẩn để cho kết luận đúng (pass) hoặc nghi ngờ (fail) sự có mặt của các chất phân tích trong mẫu thử. + Định lượng: Tính nồng độ các chất phân tích nếu có trong mẫu thực dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính tương ứng của các chất phân tích được thiết lập trong ngày. Từ nồng độ các chất phân tích (nếu có) trong dịch chiết mẫu thử, tính hàm lượng chất phân tích trong mẫu thực ban đầu dựa vào khối lượng cân và hệ số pha loãng sau quá trình xử lý mẫu.

2. PL 2: Chế tạo nền mẫu và hình ảnh các nền mẫu Bảng PL2.1. Công thức 3 nền mẫu STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Thành phần

Tên khoa học Nền N1: Ngân kiều tán gia giảm Kim ngân hoa Flos Lonicerae Liên kiều Fructus Forsythiae Cát cánh Radix Platycodi Bạc hà Herba Menthae Đạm trúc diệp Herba Lophatheri Cam thảo Radix Glycyrrhizae Kinh giới tuệ Spica Elsholtziae Lô căn Rhizoma Phragmitis Ngưu bàng tử Fuctus Arctii Nền N2: Liên kiều bại độc tán Liên kiều Fructus Forsythiae Chi tử Fructus Gardeniae Khương hoạt Rhizoma et Radix Notopterygii Huyền sâm Radix Scrophulariae Bạc hà Herba Menthae Phòng phong Radix Saposhnikoviae divaricatae Sài hồ Radix Bupleuri Cát cánh Radix Platycodi Thăng ma Rhizoma Cimicifugae Xuyên khung Rhizoma Ligustici wallichii Đương quy Radix Angelicae sinensis Hoàng cầm Radix Scutellariae Bạch thược Radix Paeoniae lactiflorae Ngưu bàng tử Fructus Arctii Nền N3: Tiêu phong tán gia giảm Kinh giới Spica Elsholtziae Phòng phong Radix Saposhnikoviae divaricatae Ngưu bàng tử Fructus Arctii Thuyền thoái Periostracum Cicadae Sinh địa Radix Rehmanniae glutinosae Đan bì Cortex Paeoniae suffruticosae Bạch thược Radix Paeoniae lactiflorae Thổ phục linh Smilax glabra Ké đầu ngựa Fructus Xanthii strumarii Bồ công anh Herba Taraxaci Cam thảo Radix Glycyrrhizae

Khối lượng 40 g 40 g 24 g 24 g 16 g 20 g 16 g 20 g 24 g 12 g 12 g 10 g 10 g 8g 10 g 12 g 10 g 10 g 10 g 12 g 10 g 10 g 8g 16 g 12 g 12 g 8g 16 g 8g 8g 16 g 8g 12 g 8g

 Nền 1 (viên hoàn) : gồm 9 loại dược liệu như sau: kim ngân hoa, liên kiều, cát cánh, bạc hà, đạm trúc diệp, kinh giới tuệ, lô căn, ngưu bàng tử, cam thảo.  Cách bào chế: tiến hành trên 5 thang thuốc theo tỷ lệ các thành phần trong bảng PL2.1.  Điều chế cao đặc dược liệu: Cân các thành phần kim ngân hoa, liên kiều, cát cánh, đạm trúc diệp, lô căn, ngưu bàng tử, cam thảo. Thái nhỏ, thêm nước ngập dược liệu, đun sôi. Giảm nhiệt độ, tiếp tục đun sôi trong 3 tiếng, thỉnh thoảng bổ sung nước để đảm bảo nước ngập dược liệu. Sau 3 tiếng, lọc qua vải lọc thu được dịch chiết lần 1. Thêm tiếp nước vào bã dược liệu lần 1 đến ngập, đun sôi. Giảm nhiệt độ, tiếp tục đun sôi trong 2 tiếng, thỉnh thoảng bổ sung nước để đảm bảo nước ngập dược liệu. Sau 2 tiếng, lọc qua vải lọc thu được dịch chiết lần 2. Gộp dịch lọc lần 1 và lần 2, cô đến khi thành cao đặc.  Điều chế bột mịn dược liệu: Cân các thành phần bạc hà, kinh giới tuệ, thái nhỏ. Trộn đều, sấy khô rồi xây thành bột min, rây qua rây kích thước 0,2 mm, đồng nhất mẫu thu được bột mịn dược liệu.  Trộn bột dược liệu đều với cao đặc dược liệu tạo khối ẩm, vê tròn thành viên rồi sấy khô viên. Bao màu bằng dịch bao màu (hòa tan than hoạt, bột talc vào siro tỷ lệ 1 :1) đến khi viên có màu đồng nhất, sấy khô viên và đóng gói. Khối lượng trung bình 1 gói (1 liều): 5,1064 g. Khối lượng 1/10 liều: 0,5106 g.  Nền 2 (bột cốm): gồm 14 loại dược liệu như sau: liên kiều, chi tử, khương hoạt, huyền sâm, bạc hà, phòng phong, sài hồ, cát cánh, thăng ma, xuyên khung, đương quy, hoàng cầm, bạch thược, ngưu bàng tử.  Cách bào chế: tiến hành trên 10 thang thuốc theo tỷ lệ các thành phần trong bảng PL2.1.  Điều chế cao đặc dược liệu: Cân các thành phần liên kiều, chi tử, khương hoạt, huyền sâm, bạc hà, phòng phong, sài hồ, cát cánh, thăng ma, xuyên khung, đương quy, hoàng cầm, bạch thược, ngưu bàng tử. Thái nhỏ, thêm nước ngập dược liệu, nấu thành cao đặc theo quy trình tương tự ở nền 1. Bổ sung glucose và tá dược dính PVP/ethanol 96% vào cao đặc tạo khối ẩm. Xát hạt qua rây 1,0 mm rồi sấy ở nhiệt độ 60oC đến khi cốm khô. Sửa hạt qua rây 1,25 mm thu được bột cốm tan,

đóng gói. Khối lượng trung bình 1 gói (1 liều): 1,5058 g. Khối lượng 1/10 liều: 0,1506 g.  Nền 3 (viên nang): gồm 11 loại dược liệu như sau: kinh giới, phòng phong, ngưu bàng tử, thuyền thoái, sinh địa, đan bì, bạch thược, thổ phục linh, ké đầu ngựa, bồ công anh, cam thảo.  Cách bào chế : tiến hành trên 10 thang thuốc theo tỷ lệ các thành phần trong bảng PL2.1.  Điều chế cao đặc dược liệu: Cân các thành phần phòng phong, ngưu bàng tử, thuyền thoái, sinh địa, đan bì, bạch thược, thổ phục linh, ké đầu ngựa, bồ công anh, cam thảo. Thái nhỏ, thêm nước ngập dược liệu, nấu thành cao đặc theo quy trình tương tự ở nền 1.  Điều chế bột mịn dược liệu: Cân thành phần kinh giới thái nhỏ. Trộn đều, sấy khô rồi xây thành bột mịn, rây qua rây kích thước 0,2 mm, đồng nhất mẫu thu được bột mịn dược liệu.  Trộn bột dược liệu đều với cao đặc dược liệu tạo khối ẩm, rây qua rây 1,0mm tạo hạt, sấy hạt ở nhiệt độ 60oC đến khi có hàm ẩm thích hợp. Trộn hạt với tá dược trơn (bột talc, magnise sterat tỷ lệ 1 %) và đóng nang số 0. Khối lượng trung bình 1 viên: 0,6694 g. Khối lượng 1 liều (5 viên): 3,347 g. Khối lượng 1/10 liều: 0,3347 g.

Hình PL2.1. Nền N1

Hình PL2.2. Nền N2

Hình PL2.3. Nền N3

3. PL 3: Kết quả tối ƣu hóa điều kiện khối phổ của các chất phân tích

Hình PL3.1. Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ của betamethason

Hình PL3.2. Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ của dexamethason acetat

Hình PL3.3. Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ của chlorpheniramin maleat

Hình PL3.4. Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ của cyproheptadin hydroclorid

Hình PL3.5. Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ của loratadin

4. PL 4: Sắc ký đồ khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính

Hình PL4.1. Sắc ký đồ các chất phân tích tại nồng độ C1

Hình PL4.2. Sắc ký đồ các chất phân tích tại nồng độ C2

Hình PL4.3. Sắc ký đồ các chất phân tích tại nồng độ C3

Hình PL4.4. Sắc ký đồ các chất phân tích tại nồng độ C4

Hình PL4.5. Sắc ký đồ các chất phân tích tại nồng độ C5

Hình PL4.6. Sắc ký đồ các chất phân tích tại nồng độ C6

Hình PL4.7. Sắc ký đồ các chất phân tích tại nồng độ C7

5. PL 5: Danh mục mẫu thực chế phẩm đông dƣợc Bảng PL5.1. Danh mục mẫu thực chế phẩm đông dược STT Mã SP 1 VN01

Tên thuốc Đặc trị bệnh ngoài da - Đông y gia truyền Phúc Thanh Đường – (Viên nang cứng) Không có tên (thuốc đặc trị mề đay) (Hoàn mềm)

2

H02

3

B03

Không có tên (thuốc đặc trị mề đay) (Bột)

4

B04

Không có tên (thuốc đặc trị mề đay) (Bột)

5

H05

6

H06

Không có tên (thuốc tiêu độc giải nhiệt, mát gan thận) (Hoàn mềm) Không có tên (thuốc đặc trị mề đay, dị ứng) (Hoàn cứng)

7

B07

Không có tên (thuốc đặc trị mề đay, dị ứng) (Bột)

Số lô, hạn dùng, nơi sản xuất Số lô: Không có Hạn dùng: Không có SĐK: Không có Nhà sản xuất: Đông y gia truyền Phúc Thanh Đường – Hà Nội Số lô: Không có Hạn dùng: Không có SĐK: Không có Nhà sản xuất: Nhà thuốc đông y gia truyền Đức Hưng – Hà Nội Số lô: Không có Hạn dùng: Không có SĐK: Không có Nhà sản xuất: Nhà thuốc đông y gia truyền Khương Viên – Hà Nội Số lô: Không có Hạn dùng: 20 ngày kể từ ngày sản xuất SĐK: Không có Nhà sản xuất: Thuốc gia truyền 17 Trần Xuân Soạn – Hà Nội Số lô: Không có Hạn dùng: Không có SĐK: Không có Nhà sản xuất: Nhà thuốc đông y gia truyền Hồng Phúc – Hà Nội Số lô: Không có Hạn dùng: Không có SĐK: Không có Nhà sản xuất: Nhà thuốc Đức Phú Đường – Đà Nẵng Số lô: Không có Hạn dùng: Không có SĐK: Không có Nhà sản xuất: Hiệu thuốc bắc Xuân Phước Đường - Đà Nẵng

Liều dùng 2 lần/ngày 3 viên/lần

2 lần/ngày 2 viên/lần

3 lần/ngày 3 thìa/lần

2 lần/ngày 2 túi/lần

2 lần/ngày 6 viên/lần

3 lần/ngày 1 muỗng canh/lần

2 lần/ngày 1 muỗng cafe/lần

8

B10

9

B11

10

B13

11

H12

12

H21

13

B23

14

B24

15

B26

Số lô: Không có Hạn dùng: Không có SĐK: Không có Nhà sản xuất: Thuốc gia truyền – Hà Tĩnh Trị viêm mũi Số lô: Không có (Bột) Hạn dùng: Không có SĐK: Không có Nhà sản xuất: Thuốc gia truyền Đông y Đỗ Thái Nam – An Giang Trị viêm mũi Số lô: Không có Hạn dùng: Không có SĐK: Không có Nhà sản xuất: An Giang Trị viêm mũi Số lô: Không có (Hoàn cứng) Hạn dùng: Không có SĐK: Không có Nhà sản xuất: Thuốc gia truyền Đông y Đỗ Thái Nam – An Giang Cảm cúm ho Số lô: Không có (Hoàn cứng) Hạn dùng: Không có SĐK: SGD-802-95 Nhà sản xuất: Cơ sở Thiên Sanh – Phú Yên Đặc trị chữa bệnh Số lô: Không có (Bột) Hạn dùng: Không có SĐK: Không có Nhà sản xuất: Đông y gia truyền – Khánh Hòa Thuốc đặc trị Số lô: Không có viêm mũi thấp Hạn dùng: Không có khớp SĐK: Không có (Bột) Nhà sản xuất: Thuốc gia truyền – Y học dân tộc Thị trấn Trà Sư – Khánh Hòa Trân châu mạo Số lô: Không có khải tán NSX: 10/08/2018 (Hoàn cứng) Hạn dùng: 10/08/2021 SĐK: V118-H12-18 Nhà sản xuất: Không có Không có tên (thuốc trị ngứa mề đay) (Bột)

1 lần/ngày 1/5 gói/lần

2 lần/ngày 1 gói/lần

2 lần/ngày 1 gói/lần

2 lần/ngày 1 gói (10 viên)/lần

3 lần/ngày 1 gói/lần

2 lần/ngày 1/2 gói/lần

2-3 lần/ngày 1 gói/lần

1-3 gói chia 2 lần/ngày

6. PL 6: Sắc ký đồ, kết quả định danh và hình ảnh mẫu dƣơng tính 6.1. Mẫu H05

Hình PL6.1. Sắc ký đồ và phổ định danh cyproheptadin hydroclorid trong mẫu H05

Hình PL6.2. Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính H05 để định lượng

Hình PL6.3. Mẫu dương tính H05

6.2. Mẫu H21

Hình PL6.4. Sắc ký đồ và phổ định danh chlorpheniramin maleat trong mẫu H21

Hình PL6.5. Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính H21 để định lượng

Hình PL6.6. Mẫu dương tính H21

6.3. Mẫu B11

Hình PL6.7. Sắc ký đồ và phổ định danh chlorpheniramin maleat trong mẫu B11

Hình PL6.8. Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính B11 để định lượng

Hình PL6.9. Mẫu dương tính B11

6.4. Mẫu H12

Hình PL6.10. Sắc ký đồ và phổ định danh dexamethason acetat trong mẫu H12

Hình PL6.11. Sắc ký đồ và phổ định danh chlorpheniramin maleat trong mẫu H12

Hình PL6.12. Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính H12 để định lượng

Hình PL6.13. Mẫu dương tính H12

6.5. Mẫu B13

Hình PL3.14. Sắc ký đồ và phổ định danh dexamethason acetat trong mẫu B13

Hình PL3.15. Sắc ký đồ và phổ định danh chlorpheniramin maleat trong mẫu B13

Hình PL3.16. Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính B13 để định lượng

Hình PL6.17. Mẫu dương tính B13

6.6. Mẫu B23

Hình PL6.18. Sắc ký đồ và phổ định danh dexamethason acetat trong mẫu B23

Hình PL6.19. Sắc ký đồ và phổ định danh chlorpheniramin maleat trong mẫu B23

Hình PL6.20. Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính B23 để định lượng

Hình PL6.21. Mẫu dương tính B23

6.7. Mẫu B24

Hình PL6.22. Sắc ký đồ và phổ định danh dexamethason acetat trong mẫu B24

Hình PL6.23. Sắc ký đồ và phổ định danh chlorpheniramin maleat trong mẫu B24

Hình PL6.24. Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính B24 để định lượng

Hình PL6.25. Mẫu dương tính B24