Xây dựng phương pháp phân tích imipenem và cilastatin trong thuốc tiêm bằng hilic

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

BỘ Y TẾ

H

Ó

A

THUỐC TIÊM BẰNG SẮC KÍ LỎNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

10 00

IMIPENEM VÀ CILASTATIN TRONG

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

B

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

.Q TR ẦN

H Ư

N

G

NGUYỄN THỊ DUNG

Đ

ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U Y

N

H

Ơ

N

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HÀ NỘI - 2018

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

BỘ Y TẾ

H Ư

N

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

TR ẦN

IMIPENEM VÀ CILASTATIN TRONG

10 00

B

THUỐC TIÊM BẰNG SẮC KÍ LỎNG

H

Ó

A

TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC

Người hướng dẫn: ThS. Vũ Ngân Bình Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

G

Đ

ẠO

1301056

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

.Q TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

NGUYỄN THỊ DUNG

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

H

Ơ

N

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HÀ NỘI - 2018

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các thầy cô giáo, gia đình và bạn bè. Cho đến nay khi khoá luận đã hoàn thiện, tôi xin phép được bày tỏ

N

lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến họ.

Ơ

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Vũ Ngân Bình - Bộ môn Hóa

U Y

bảo và động viên tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm. Tôi cũng xin bày tỏ lòng

.Q

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Đ

Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất và Bộ môn Vật lý - Hóa lý đã tạo điều kiện cho tôi

N

G

thực hiện khóa luận.

H Ư

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và các cán

TR ẦN

bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội - những người đã dạy bảo và trang bị cho tôi những kiến thức khoa học nền tảng trong suốt năm năm học qua.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2018 Sinh viên

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường.

D

IỄ N

Đ

Nguyễn Thị Dung

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

ẠO

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên ở

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

đã tận tình hướng dẫn, chỉ ra hướng nghiên cứu trong quá trình thực hiện đề tài.

ÀN

http://daykemquynhon.ucoz.com

kính trọng và biết ơn tới PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà và PGS.TS Vũ Đặng Hoàng

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

N

H

phân tích và Độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

Ơ

N

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

.Q

G

Đ

1.1.2. Một số phương pháp phân tích đồng thời imipenem và cilastatin ..... 3

H Ư

N

1.2. Tổng quan về sắc kí lỏng tương tác thân nước .......................................... 5

TR ẦN

1.2.1. Pha tĩnh ............................................................................................... 5 1.2.2. Pha động ............................................................................................. 6

10 00

B

1.2.3. Cơ chế tách.......................................................................................... 7 1.2.4. Ưu điểm ............................................................................................... 8

H

Ó

A

1.2.5. Nhược điểm ......................................................................................... 9

-L

Í-

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 10

ÁN

2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 10

TO

2.2. Nguyên vật liệu ........................................................................................ 10

D

IỄ N

Đ

ÀN

2.2.1. Hóa chất ............................................................................................ 10

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

TP

ẠO

1.1.1. Đặc điểm của imipenem và cilastatin ................................................. 2

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

1.1. Tổng quan về imipenem và cilastatin ........................................................ 2

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U Y

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 2

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

N

H

ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1

2.2.2. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................ 10 2.2.3. Chuẩn bị mẫu .................................................................................... 11 2.2.4. Chuẩn bị dung môi pha động ............................................................ 12

2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 12

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

2.3.1. Phương pháp nghiên cứu .................................................................. 13 2.3.2. Thẩm định phương pháp ................................................................... 15

Ơ

2.5. Xử lý kết quả ............................................................................................ 18

N

2.4. Áp dụng phương pháp .............................................................................. 18

.Q

G

Đ

3.1.3. Khảo sát dung môi pha mẫu ............................................................. 23

H Ư

N

3.1.4. Khảo sát về thể tích tiêm mẫu .......................................................... 23

TR ẦN

3.1.5. Lựa chọn bước sóng phát hiện .......................................................... 24 3.2. Phương pháp phân tích đồng thời imipenem và cilastatin ....................... 24

10 00

B

3.3. Thẩm định phương pháp .......................................................................... 25 3.3.1. Độ phù hợp hệ thống ......................................................................... 25

Ó

A

3.3.2. Độ chọn lọc ....................................................................................... 25

Í-

H

3.3.3. Khoảng nồng độ tuyến tính ............................................................... 26

ÁN

-L

3.3.4. Độ lặp lại........................................................................................... 28

TO

3.3.5. Độ đúng ............................................................................................. 29

D

IỄ N

Đ

ÀN

3.3.6. Độ thô ................................................................................................ 31

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

TP

ẠO

3.1.2. Khảo sát pha động ............................................................................ 20

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

3.1.1. Khảo sát pha tĩnh ............................................................................. 19

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U Y

3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ......................................................................... 19

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

N

H

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................... 19

3.4. Ứng dụng phương pháp phân tích chế phẩm trên thị trường ................... 32 3.4.1. Công thức tính ................................................................................... 32 3.4.2. Kết quả định lượng ............................................................................ 32 3.5. Bàn luận chung ......................................................................................... 33

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

3.5.1. Ưu điểm của phương pháp ................................................................ 33 3.5.2. Nhược điểm của phương pháp .......................................................... 34

Ơ

4.1. Kết luận .................................................................................................... 35

N

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 35

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

.Q

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U Y

N

H

4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 35

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

CIL

Cilastatin

Cilastatin

DHP-1

Enzyme dehydropeptidase-I

Enzym dehydropeptidase-I

HILIC

Hydrophilic Interaction Chromatography Sắc ký lỏng tương tác thân nước

HPLC

High Performance Liquid

Ion – pair Chromatography

Sắc kí tạo cặp ion

NPLC

Normal Phase Liquid Chromatography

Sắc ký lỏng pha thuận

LC-MS

Liquid Chromatography - Mass

Sắc kí lỏng khối phổ

ẠO

Đ

G

H Ư

Spectrometry

Reversed Phase Liquid Chromatography

UV

Ultraviolet

Sắc ký lỏng pha đảo Tử ngoại

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

RPLC

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

IPC

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

Imipenem

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

.Q

Imipenem

TP

IMI

N

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Ơ H

N

U Y

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Tên tiếng Anh

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Một số đặc điểm của IMI và CIL ......................................................... 2 Bảng 1.2. Một số nghiên cứu về phân tích IMI và CIL bằng sắc kí lỏng ............. 4

Ơ

Bảng 2.2. Quy trình pha các mẫu đường chuẩn .................................................. 16

N

Bảng 2.1. Các điều kiện pha động khảo sát ........................................................ 14

.Q

Bảng 3.2. Kết quả độ chọn lọc ............................................................................ 26

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

G

Đ

Bảng 3.5. Kết quả độ đúng của CIL .................................................................... 30

H Ư

N

Bảng 3.6. Kết quả độ đúng của IMI .................................................................... 30 Bảng 3.7. Kết quả độ thô ..................................................................................... 31

TR ẦN

Bảng 3.8. Kết quả định lượng imipenem trong chế phẩm .................................. 33

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

Bảng 3.9. Kết quả định lượng cilastatin trong chế phẩm .................................... 33

D

IỄ N

Đ

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

ẠO

Bảng 3.4. Kết quả độ lặp lại trong ngày và khác ngày ....................................... 29

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính.................................................... 26

ÀN

http://daykemquynhon.ucoz.com

U Y

Bảng 3.1. Kết quả độ phù hợp hệ thống………………………………………..25

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

N

H

Bảng 2.3. Quy trình pha các mẫu chạy của độ đúng........................................... 18

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Thienamycin ..................................................... 3 Hình 1.2. Cơ chế tách trong HILIC ....................................................................... 7

Ơ

Hình 3.2. Kết quả khảo sát thành phần pha động ............................................... 20

N

Hình 3.1. Kết quả khảo sát pha tĩnh .................................................................... 19

.Q

Hình 3.5. Phổ hấp thụ của CIL…………………………………………………24

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

G

Đ

Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

pic của imipenem ................................................................................................ 28

D

IỄ N

Đ

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

pic của Cilastatin ................................................................................................. 27

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ẠO

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích

ÀN

http://daykemquynhon.ucoz.com

U Y

Hình 3.4. Phổ hấp thụ của IMI………………………………………................24

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

N

H

Hình 3.3. Kết quả khảo sát tốc độ dòng .............................................................. 23

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng sinh đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong công tác phòng và điều trị bệnh, đặc biệt là các bệnh do nhiễm khuẩn. Các kháng sinh nhóm β-lactam được sử dụng rất phổ biến ở Việt Nam nhưng tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc cũng khá cao, trong

Ơ

N

số đó có imipenem [5]. Imipenem có phổ tác dụng rất rộng trên phần lớn các vi khuẩn

N

H

Gram dương, Gram âm, ưa khí, kị khí và bền vững với các β-lactamase của vi khuẩn

.Q

Đ

Dược Việt Nam, từ năm 2010 đến tháng 12 năm 2015 có 15 số đăng kí trong nước và

G

47 số đăng kí nước ngoài với chế phẩm chứa hai hoạt chất trên [4]. Để đảm bảo được

H Ư

N

hiệu quả điều trị của imipenem trong lâm sàng cũng như giảm tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc, cần kiểm soát tốt hàm lượng của imipenem trong các chế phẩm được sản xuất

TR ẦN

và lưu hành tại Việt Nam.

Imipenem và cilastatin chủ yếu được phân tích bằng kỹ thuật sắc kí tạo cặp ion vì

10 00

B

chúng có độ phân cực cao [2],[13],[20]. Tuy nhiên, kỹ thuật này có nhược điểm là sử dụng chất tạo cặp ion có khả năng lưu giữ trên cột rất tốt nên thông thường sẽ không

A

thể dùng cột để phân tích pha đảo với đối tượng khác [8]. Một kỹ thuật khác có thể

H

Ó

dùng để phân tích hai hợp chất trên là sắc kí lỏng tương tác thân nước (HILIC). HILIC

Í-

sử dụng pha động phân cực và pha tĩnh phân cực nên lưu giữ tốt các hợp chất phân cực

-L

như imipenem và cilastatin. Theo tôi tìm hiểu, tính đến nay trên thế giới mới có một số

ÁN

ít nghiên cứu sử dụng HILIC để định lượng imipenem và cilastatin trong chế phẩm,

TO

còn tại Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào được công bố. Vì vậy, tôi tiến hành đề

ÀN

tài: “Xây dựng phương pháp phân tích imipenem và cilastatin trong thuốc tiêm

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

TP

ẠO

một chất ức chế DHP-I, trong các chế phẩm thuốc tiêm [3],[16]. Theo Cục Quản lí

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

dehydropeptidase-I (DHP-I) ở ống thận, do vậy nó thường được kết hợp với cilastatin,

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

khi các thuốc khác không có hiệu quả [3]. Tuy nhiên, nó lại bị phân hủy bởi enzym

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

nên được sử dụng như là kháng sinh hàng thứ ba cho những trường hợp cấp cứu nặng,

D

IỄ N

Đ

bằng sắc kí lỏng tương tác thân nước” với hai mục tiêu chính: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích imipenem và cilastatin trong thuốc tiêm bằng HILIC. 2. Ứng dụng phương pháp trên xác định hàm lượng imipenem và cilastatin trong một chế phẩm thuốc tiêm trên thị trường.

1

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về imipenem và cilastatin 1.1.1. Đặc điểm của imipenem và cilastatin dụng rất rộng nên được sử dụng như là kháng sinh hàng thứ ba cho những trường hợp

H

Ơ

cấp cứu nặng, khi các thuốc khác không có hiệu quả [3]. IMI thường được kết hợp với

N

Imipenem (IMI) là một kháng sinh carbapenem trong nhóm β-lactam, có phổ tác

Công thức cấu

Công thức

C12H17N3O4S

phân tử

B

299,3

10 00

Phân tử lượng

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

tạo

(g/mol) Danh pháp

A

Acid (5R,6S)-6-[(R)-1-hydroxy

acid (Z)-7-[[(R)-2-amino-2carboxyethyl]sulphanyl]-2-

Í-

amino]ethyl]sulphanyl]-7-oxo-1- [[[(1S)-2,2-dimethylcyclopropyl]

ÁN

-L

azabicyclo[3.2.0]hept-2-en-2-

carbonyl]amino]hept-2-enoic

carboxylic vàng nhạt. Hơi tan trong nước, hơi vàng, hút ẩm. Rất dễ tan trong khó tan trong methanol [2].

Đ

ÀN

TO

Tính chất vật lí Bột màu trắng, trắng ngà hay Bột vô định hình màu trắng hay

IỄ N D

358,4

H

Ó

ethyl]-3-[[2[(iminomethyl)

C16H26N2O5S

nước và methanol, khó tan trong

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

CIL

ẠO

IMI

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

Đặc điểm

.Q

Bảng 1.1. Một số đặc điểm của IMI và CIL

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

cấu tạo và một số tính chất lý hóa của IMI và CIL được liệt kê trong bảng 1.1.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

cilastatin (CIL) để ức chế sự phân huỷ của IMI ở thận bởi enzyme DHP-I. Đặc điểm

ethanol khan [2].

Tính chất hóa

pka1 = 3,2 và pka2 = 9,9.

pka1 = 2,53 và pka2 = 9,14.

học

Lg P = -3,9 [24].

Lg P = -1,3 [23].

Độ ổn định

Bị phân hủy trong môi trường acid và base.

2

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Hiện nay, tại Việt Nam có nhiều chế phẩm chứa hỗn hợp IMI và CIL đang được lưu hành. Các hàm lượng hay được sử dụng là IMI 500 mg (hoặc 750 mg) và CIL 500 mg (hoặc 750 mg) với dạng bột để pha tiêm bắp; IMI 250 mg (hoặc 500 mg) và CIL 250 mg (hoặc 500 mg) với dạng bột để pha tiêm truyền tĩnh mạch [3].

N

1.1.2. Một số phương pháp phân tích đồng thời imipenem và cilastatin

H

Ơ

Trên thế giới có một số nghiên cứu về phân tích đồng thời IMI và CIL trong chế

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Thienamycin

10 00

B

Kĩ thuật sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) hay được sử dụng để phân tích IMI và CIL trong chế phẩm do có thể tách riêng được tạp chất. IMI và CIL là những hợp chất

A

phân cực có khả năng hấp thu ánh sáng vùng tử ngoại (UV) nên phương pháp hay

H

Ó

được sử là sắc kí tạo cặp ion (IPC) và HILIC kết nối với detector tử ngoại. Trong đó,

Í-

IPC được sử dụng phổ biến hơn và được quy định trong một số dược điển [2],[13],[20].

-L

Chất tạo cặp ion được sử dụng ở đây là natri hexansulfonat do nó có khả năng tạo cặp

ÁN

với các nhóm chức amin của IMI và CIL. Sản phẩm tạo thành sau khi tạo cặp ion có

TO

độ phân cực kém hơn so với IMI và CIL, do đó chúng được lưu giữ tốt hơn trên pha

ÀN

tĩnh kém phân cực. Việc sử dụng kĩ thuật sắc kí tạo cặp ion có ưu điểm là sử dụng các

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

ẠO

khả năng bị phân hủy của IMI.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

.Q

giống IMI (hình 1.1) nên việc sử dụng phương pháp quang phổ đạo cần cân nhắc tới

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

này [9],[17]. Tuy nhiên, do IMI dễ bị phân hủy thành thienamycin [16] có cấu trúc gần

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

phẩm. Phương pháp quang phổ đạo hàm được áp dụng để phân tích đồng thời hai chất

D

IỄ N

Đ

loại cột pha đảo thông dụng hiện nay. Tuy nhiên, nó có nhược điểm là chất tạo cặp ion lưu giữ rất tốt trong cột, do vậy thường không thể sử dụng cột để phân tích pha đảo.

HILIC là kĩ thuật mới hơn có khả năng phân tích trực tiếp IMI và CIL do có khả năng lưu giữ tốt các chất phân cực. Bảng 1.2 tóm tắt một số thông tin về các nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới về phân tích đồng thời IMI và CIL bằng sắc kí lỏng.

3

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

U Y

Natri hexansulfonat trong dung dịch đệm

Việt Nam V

mm, 10 µm) duy trì

phosphat pH 6,8. Tốc độ dòng 2 ml/phút.

[2]

ở 50 ± 1oC.

Dược điển

IPC

tR CIL

tR IMI

sóng

N

G

254 nm

Cột C8 (200 x 4,6

Acid 3-(N-morpholino) propansulfonic,

mm, 10 µm) duy trì

natri 1-hexan sulfonat và dinatri dihydrogen

ở khoảng 50oC.

ethylendiamin tetracetat dihydrat trong

Khoảng

250 nm

3 phút

B

Nhật 16 [13]

Đ

Cột C18 (250 x 4,6

IPC

Bước

3

USP 38 [20]

IPC

10 00

nước, pH 7,0.

Cột C18 (300 x 4,6 Natri 1-hexansulfonat trong dung dịch đệm

254 nm

HILIC

Hỗn hợp ACN : amoni format (45 mM, pH

STAR (150 × 4,6

5,5) = 68:32 (v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút.

ÁN

Nakov [16]

Cột Purospher

-L Í-

Natalija

phút.

mm, 5 µm) duy trì ở

TO

4

H

1oC.

Ó

A

mm) duy trì ở 50 ± phosphat pH 6,8. Tốc độ dòng khoảng 2 ml/

25°C.

3,5 phút

4,8 phút

4

D

IỄ N

Đ

254 nm

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

2

Dược điển

Pha động

H Ư

1

Pha tĩnh

Kết quả MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

pháp

.Q

Điều kiện tiến hành

TP

Phương

ẠO

Tác giả

TR ẦN

STT

ÀN

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

Bảng 1.2. Một số nghiên cứu về phân tích IMI và CIL bằng sắc kí lỏng

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

N

H

Ơ

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Trên thế giới hiện nay mới có một số ít nghiên cứu sử dựng HILIC để phân tích IMI và CIL trong chế phẩm. Nghiên cứu của N. Nakov [16] sử dụng pha động gồm hỗn hợp dung môi ACN và dung dịch đệm amoni format 45 mM, pH 5,5 để phân tích IMI và CIL trong chế phẩm cho kết quả về thời gian lưu của các chất ngắn (dưới 5

N

phút). Tuy nhiên, nghiên cứu này còn hạn chế là hệ số kéo đuôi của cilastatin lớn

H

Ơ

(AS(CIL)= 1,6), hệ số chắn của đường chuẩn cao (Y-intercept của CIL và IMI lần lượt là

1.2. Tổng quan về sắc kí lỏng tương tác thân nước

G

Đ

HILIC là kĩ thuật sắc kí lỏng sử dụng pha tĩnh phân cực giống sắc kí lỏng pha

H Ư

N

thuận (NPLC) và pha động phân cực giống sắc kí lỏng pha đảo (RPLC) [7]. So với RPLC, HILIC có khả năng lưu giữ tốt hơn các chất phân cực. So với NPLC, HILIC sử

TR ẦN

dụng dung môi pha động ít độc hại hơn và tăng khả năng hòa tan các chất phân cực. Đối tượng phân tích của HILIC thường là các hợp chất phân cực, như các acid amin

B

[6], peptid [14], kháng sinh [21], carbohydrat [10]…

10 00

1.2.1. Pha tĩnh

Pha tĩnh sử dụng trong HILIC là những bề mặt phân cực, phổ biến nhất là silica và

Ó

A

dẫn xuất của nó. Ngoài ra, các pha tĩnh polyme cũng có thể được sử dụng trong HILIC

Í-

H

[7]. Tuy nhiên, có thể do giá thành đắt và độ phân giải thấp hơn so với các cột silica

-L

nên số lượng cột polyme trên thị trường cũng như các nghiên cứu về HILIC trên cột

ÁN

polyme là không nhiều.

TO

Dựa vào cấu tạo hóa học, pha tĩnh silica lại được chia thành 2 loại là silica không

ÀN

dẫn xuất và silica dẫn xuất hóa.

D

IỄ N

Đ

- Silica không dẫn xuất:

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

ẠO

thiện được các hạn chế của nghiên cứu trên.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

.Q

đích xây dựng phương pháp phân tích IMI và CIL trong chế phẩm bằng HILIC và cải

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

CIL trong chế phẩm bằng HILIC được công bố. Vì vậy, tôi tiến hành đề tài với mục

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

-2,6% và -8,8%). Hiện nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về phân tích IMI và

Hạt silica có chứa nhóm silanol (-SiOH), đóng vai trò thiết yếu tạo nên bề mặt

phân cực của silica. Ưu điểm của pha tĩnh silica không dẫn xuất là không bị pha động có pH thấp thủy phân, cắt các liên kết và rửa trôi như các pha tĩnh pha liên kết. So với RPLC, các pha tĩnh silica không dẫn xuất cải thiện độ nhạy 2 đến 10 lần khi tách các hợp chất phân cực [8]. Nhược điểm của nó là có thể xảy ra hiện tượng quá tải cột.

5

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

- Silica dẫn xuất hóa: Theo trạng thái tích điện, pha tĩnh silica dẫn xuất hóa được chia thành các nhóm sau: + Trung tính: amid, diol, cyanopropyl, cyclodextrin… + Lưỡng cực: sulfoalkyl betain…

N

+ Tích điện dương: amino propyl, silica bao latex…

H

Ơ

+Tích điện âm: silica liên kết poly(succinimid), poly aspartic, poly hydroxyethyl A,

HILIC sử dụng pha động là các dung môi hữu cơ thân nước như acetonitril (ACN)

G

Đ

cùng với một lượng nhỏ nước [7]. Hỗn hợp 60 - 97% ACN trong nước hoặc đệm dễ

H Ư

N

bay hơi thường được sử dụng. Với pha tĩnh silica trần, lượng nước yêu cầu ít nhất là 3% đủ để hydrat hóa hoàn toàn các hạt pha tĩnh [18]. Tuy nhiên, bất kỳ một dung môi

TR ẦN

không proton đồng tan với nước nào cũng có thể được sử dụng làm pha động cho HILIC (ví dụ như dioxan hoặc tetrahydrofuran). Alcol cũng có thể được sử dụng, tuy

10 00

so với các dung môi khác [11].

B

nhiên cần dùng ở nồng độ cao để đạt được cùng một mức độ lưu giữ các chất phân tích

A

Dưới đây là danh sách các dung môi theo chiều tăng lực rửa giải:

Ó

Aceton < isopropanol ~ propanol < acetonitril < ethanol < dioxan < dimethyl

Í-

H

formamid ~ methanol < nước [7].

-L

Thông thường, khi giảm độ phân cực của pha động sẽ làm tăng thời gian lưu của

ÁN

chất phân tích.

TO

Đệm thường được sử dụng để kiểm soát pH pha động và lực ion. Trong HILIC,

ÀN

chúng làm thay đổi sự phân cực của chất phân tích và pha động, cũng như trạng thái tồn tại của bề mặt pha tĩnh, dẫn đến những thay đổi khác biệt trong việc lưu giữ, do

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

ẠO

1.2.2. Pha động

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

.Q

hơn và khả năng lưu giữ tốt với nhiều chất.

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

Pha tĩnh silica không dẫn xuất được sử dụng phổ biến hơn loại dẫn xuất hóa do rẻ

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

poly sulfoethyl A.

D

IỄ N

Đ

vậy làm thay đổi thời gian lưu của chất phân tích. Đối với chất phân tích có nhiều dạng ion hóa, như thuốc kháng sinh aminoglycosid, pH thường được điều chỉnh để đảm bảo rằng các chất phân tích chỉ tồn tại một dạng ion duy nhất [7]. Đối với các chất phân tích trung tính (ví dụ carbohydrat) không cần sử dụng đệm trong pha động. Nếu trong cơ chế kiểm soát việc lưu giữ có sự đóng góp của tương tác ion, nồng độ đệm tăng sẽ

6

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

làm giảm thời gian lưu. Trong trường hợp tương tác ion không ảnh hưởng đến việc lưu giữ, tăng nồng độ đệm sẽ làm tăng thời gian lưu, ảnh hưởng đến solvat hóa cũng như hình dạng pic sắc ký (pic kéo đuôi, khả năng phục hồi pha tĩnh kém). Nồng độ đệm môi hữu cơ trong pha động nhỏ hơn 90%) [19]. Các loại đệm hay được sử dụng là đệm

H

Ơ

acetat và đệm format do có khả năng bay hơi, thuận lợi trong việc kết nối với detector

N

thường sử dụng là 2-20 mM (nồng độ 20 mM chỉ sử dụng trong trường hợp tỷ lệ dung

.Q

pH đệm rộng do dó phân tách tốt nhiều chất, tuy nhiên lại dễ bị tủa trong ACN tỷ lệ

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

N

H Ư

sử dụng trong sắc kí lỏng kết nối với khối phổ [7].

G

Đ

muốn. Tuy nhiên do các muối này không dễ bay hơi nên việc này không thuận lợi để HILIC có thể được thực hiện ở chế độ đẳng dòng hoặc chế độ gradient với tỷ lệ cao

TR ẦN

dung môi hữu cơ khi bắt đầu và kết thúc với tỷ lệ thấp dung môi hữu cơ.

1.2.3. Cơ chế tách

B

Về cơ bản, có ba cách để mô phỏng về cơ chế tách trong HILIC: thứ nhất là sự

10 00

phân bố chất phân tích giữa pha động và pha tĩnh; thứ hai là sự hấp phụ của chất phân tích lên bề mặt của pha tĩnh; thứ ba pha động hấp phụ lên bề mặt pha tĩnh, tiếp theo các

Ó

A

chất phân tích phân bố lên lớp hấp phụ này [7]. Hiện nay, cách mô phỏng thứ ba được

TO

ÁN

-L

Í-

H

thừa nhận rộng rãi. Hình 1.2 minh họa cơ chế tách này:

D

IỄ N

Đ

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

được sử dụng để tăng sự phân cực của pha động nhằm đạt được rửa giải mong

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ẠO

cao. Việc sử dụng các muối khác (chẳng hạn như natri perclorat 100-300 mM) có thể

ÀN

http://daykemquynhon.ucoz.com

phân tích không sử dụng detector khối phổ. Đệm phosphat có ưu điểm là có khoảng

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

khối phổ. Đệm phosphat ở nồng độ thấp cũng có thể được sử dụng trong trường hợp

Hình 1.2. Cơ chế tách trong HILIC

7

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Theo cơ chế này, khi pha động di chuyển qua pha tĩnh phân cực, một phần pha động hấp phụ lên bề mặt pha tĩnh tạo thành một lớp chất lỏng chứa nước bao trên bề mặt pha tĩnh. Chất phân tích khi đi qua cột sắc kí sẽ được phân bố giữa pha động và lớp chất lỏng thân nước bao xung quanh pha tĩnh này. Như vậy, chất phân tích càng

N

phân cực, nó sẽ được lưu giữ lâu hơn trong lớp nước trên bề mặt pha tĩnh. Nói cách

H

Ơ

khác, quá trình phân tách phụ thuộc vào độ phân cực của chất phân tích và lớp solvat

.Q

nước trong pha động thấp hơn 20%, hấp phụ nước có thể là nhiều lớp, và lượng nước

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

G

Đ

phân cực của pha động thì thời gian lưu của chất phân tích trong HILIC cũng sẽ tăng

H Ư

N

theo [8]. Trong trường hợp pha tĩnh có mang điện tích, chất phân tích có thể có thêm các tương tác tĩnh điện với pha tĩnh.

TR ẦN

1.2.4. Ưu điểm

HILIC có những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp sắc kí khác khi phân

B

tích các chất phân cực. Trong RPLC, do sử dụng pha động phân cực và pha tĩnh kém

10 00

phân cực nên các chất phân tích phân cực mạnh sẽ không được lưu giữ hoặc lưu giữ kém. Trái lại, trong HILIC chất phân tích được phân bố ở cả lớp dung môi thân nước

Ó

A

bao trên bề mặt pha tĩnh và pha động khan nước, từ đó tăng lưu giữ các chất phân tích

Í-

H

phân cực. NPLC hoặc IPC hay được sử dụng trong việc phân tích các hợp chất phân

-L

cực. Tuy nhiên, do NPLC sử dụng dung môi pha động độc hại và khả năng hòa tan

ÁN

chất phân tích phân cực [8] kém nên nó không phải là phương pháp tối ưu cho việc

TO

phân tích các chất phân cực. Khác với NPLC, HILIC sử dụng các dung môi thân thiện hơn (như ACN, nước… ), và hòa tan tốt chất phân tích phân cực. IPC có nhược điểm lớn là cột sau khi đã sử dụng bằng phương pháp này thường không thể sử dụng cho

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

thường khi tăng tỷ lệ dung môi hữu cơ trong pha động, hay nói cách khác là giảm độ

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ẠO

hấp phụ có thể cao hơn nhiều so với lượng nước trong dung môi [7]. Nói chung, thông

ÀN

http://daykemquynhon.ucoz.com

lên, nước tương tác mạnh hơn với bề mặt của pha tĩnh phân cực. Khi nồng độ của

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

hoá trên bề mặt pha tĩnh. Khi nồng độ ACN (hoặc một số dung môi hữu cơ khác) tăng

D

IỄ N

Đ

mục đích khác, tốn nhiều thời gian để ổn định hệ thống và rửa cột do chất tạo cặp ion bị lưu giữ mạnh hoặc tạo liên kết với pha tĩnh. Chính vì những lí do trên mà HILIC có ưu diểm vượt trội khi phân tích các hợp chất phân cực.

8

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

HILIC sử dụng pha động có nồng độ dung môi hữu cơ cao có độ nhớt thấp nên có thể tiến hành được ở áp suất thấp hơn. Độ nhớt thấp cũng cho phép cột có khả năng làm việc ở tốc độ dòng cao, giảm thời gian phân tích [7].

Với các chất phân cực hấp thụ UV kém như các acid amin, HILIC có thể định

N

lượng trực tiếp các chất tại bước sóng thấp do sử dụng dung môi có bước sóng tới hạn

H

Ơ

thấp [6]. Khi phân tích các hợp chất này bằng RPLC cần phải dẫn xuất hóa, vì vậy gây

HILIC có khả năng kết nối với detector khối phổ [22] nhờ pha động có chứa lượng

G

Đ

lớn dung môi hữu cơ đồng tan với nước, dễ hóa hơi, thích hợp với LC-MS. Đối với

H Ư

N

RPLC, khi phân tích các hợp chất phân cực thường sử dụng pha động chứa tỷ lệ nước cao, khó hóa hơi nên không phù hợp với LC-MS. Ngược lại, pha động không phân cực

TR ẦN

của NPLC không những độc hại với môi trường mà rất khó hoà tan các dược chất phân cực, giảm tỷ lệ ion hoá của chất phân tích, có thể gây nhiễu nền hoặc tín hiệu kém [8]

B

khi phân tích bằng LC-MS.

10 00

1.2.5. Nhược điểm

Bên cạnh các ưu điểm đã trình bày ở trên, HILIC cũng có một số nhược điểm như:

Ó

A

- Thời gian đạt được cân bằng lâu hơn RPLC.

Í-

H

- Pha tĩnh silica kém lưu giữ các anion.

-L

- Tương tác phức tạp, nhiều lớp, khó kiểm soát hơn RPLC và NPLC.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

- Phụ thuộc quá nhiều vào dung môi acetonitril, khó tìm lựa chọn thay thế.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

ẠO

bớt công đoạn tạo dẫn xuất trong định tính, định lượng chất.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

.Q

gian lưu thích hợp, xác định trực tiếp nhiều chất tại bước sóng thấp cỡ 200 nm, giảm

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

(thường sử dụng ACN có bước sóng tới hạn là 190 nm [1]) cho phép lưu giữ ở thời

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

khó khăn cho việc định tính và định lượng chất. Trong khi đó, pha động HILIC

9

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là thuốc tiêm truyền tĩnh mạch Tienam của Merck Sharp & mg cilastatin. Ngoài ra, chế phẩm còn chứa natri bicarbonat vô khuẩn là tá dược không

H

Ơ

có hoạt tính.

2.2.1. Hóa chất

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

- Thuốc tiêm truyền tĩnh mạch Tienam: Nhà sản xuất Merck Sharp & Dohme Corp., số

G

Đ

- Chuẩn cilastatin natri: Hàm lượng 95,54% Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương.

H Ư

N

- Tá dược natri bicarbonat: Nhà sản xuất CTCP DPDL PHARMEDIC – Việt Nam. - Acetonitril dùng cho HPLC: Sản xuất bởi Merck – Đức.

TR ẦN

- Methanol dùng cho HPLC: Sản xuất bởi Merck – Đức.

- Acid phosphoric: Sản xuất bởi Scharlau – Tây Ban Nha.

B

- Kali dihydro phosphat: Sản xuất bởi Merck – Đức.

10 00

- Acid acetic băng dùng cho HPLC: Sản xuất bởi Merck – Đức.

- Acid formic dùng cho MS: Sản xuất bởi Merck – Đức.

H

Í-

- Nước cất hai lần.

Ó

A

- Natri hydroxyd: Sản xuất bởi Merck – Đức.

-L

2.2.2. Thiết bị, dụng cụ

ÁN

- Hệ thống máy HPLC Agilent 1200 series và phần mềm chemstation.

TO

- Cột sắc kí: Cột Supelco Ascentis Silica (250 x 4,6 mm, 5 µm) (Sigma Aldrich) và cột

ÀN

Hypersil Silica (200 x 4,6 mm, 5 µm) (Agilent).

- Máy lắc Labinco L46 (Đài Loan).

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

- Chuẩn imipenem: Hàm lượng 93,74% của Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ẠO

lô sản xuất: N026757 và N023795, hạn dùng: 27/04/2019 và 13/02/2019.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

2.2. Nguyên vật liệu

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Dohme Corp. Mỗi lọ chứa một lượng bột tương đương với 500 mg imipenem và 500

D

IỄ N

Đ

- Máy lọc hút chân không Rocker 400.

- Màng lọc cellulose 0,45 µm.

- Cân phân tích Sartorius TE214S và cân phân tích METTLER – TOLEDO XPE 105 – Thụy Sĩ (d = 0,01 mg).

- Máy siêu âm Ultrasonic LC60H (Hà Lan).

10

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

- Máy đo pH Mettler Tolero .

- Pipet chính xác 1,00 ml, 1,50 ml, 2,00 ml, 3,00 ml, 4,00 ml, 5,00ml, micro pipet 1001000 µl (Đức).

- Bình định mức: 5,00 ml, 10,00 ml, 20,00 ml, 100,0ml.

N

- Tủ lạnh sâu PANASONIC MDF-594.

H

Ơ

- Các dụng cụ khác: pipet Pasteur, cốc có mỏ, ống đong, đũa thủy tinh, vial.

.Q

đủ, lắc đều thu được hỗn hợp dung môi pha mẫu ACN : nước theo tỷ lệ 60:40.

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

G

Đ

dịch natri bicarbonat 120 ppm. Hút 0,50 ml dung dịch này vào bình định mức 10,00 ml,

H Ư

N

bổ sung dung môi vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch placebo 6 ppm (dựa theo cách pha mẫu của DĐVN V [2]).

TR ẦN

- Dung dịch chuẩn đơn gốc: Cân chính xác khoảng 21,4 mg chuẩn IMI và 22,2 mg CIL natri vào hai bình định mức 10,00 ml; hòa tan trong 4,00 ml nước, sau đó thêm

B

ACN vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch chuẩn đơn IMI và CIL nồng độ 2000 ppm.

10 00

Từ dung dịch này pha thành dung dịch chuẩn đơn nồng độ 150 ppm.

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hút 5,00 ml của mỗi dung dịch chuẩn đơn nồng độ 2000

Ó

A

ppm vào bình định mức 20,00 ml; bổ sung dung môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều thu được

Í-

H

dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa nồng độ 500 ppm của từng chất. Từ dung dịch này,

-L

dùng pipet chính xác và bình định mức pha thành các dung dịch có nồng độ 250 ppm,

ÁN

200 ppm, 150 ppm, 100 ppm và 75 ppm.

TO

- Dung dịch mẫu thử: + Xác định khối lượng bột trong chế phẩm: Cân toàn bộ chế phẩm (sau khi đã loại bỏ nắp nhôm bảo vệ) được khối lượng m1 (g). Chuyển toàn bộ phần bột vào cốc thủy tinh

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

mức 100,0 ml. Hòa tan trong 40 ml nước, bổ sung nước vừa đủ, lắc đều thu được dung

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ẠO

- Mẫu placebo tự tạo: Cân chính xác khoảng 12,0 mg natri bicarbonat vào bình định

ÀN

http://daykemquynhon.ucoz.com

- Dung môi pha mẫu: Hút 40 ml nước vào bình định mức 100,0 ml, bổ sung ACN vừa

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

2.2.3. Chuẩn bị mẫu

D

IỄ N

Đ

khô và sạch, dùng bông tẩm cồn, lau sạch lượng bột dính trên lọ và nắp. Cân khối lượng vỏ được m2 (g). Khối lượng bột trong chế phẩm bằng (m1-m2) g tương ứng với 500 mg IMI và 500 mg CIL. + Cân chính xác khoảng 10,65 mg thuốc tiêm Tienam vào bình định mức 10,00 ml, hòa tan trong 4,00 ml nước, bổ sung ACN vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch thử có

11

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

nồng độ khoảng 500 ppm của IMI và CIL. Hút 1,50 ml dung dịch thử trên vào bình định mức 5,00 ml; bổ sung dung môi vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch thử 150 ppm.

- Các dung dịch trên được bảo quản trong tủ lạnh âm sâu ở -80 oC. - Dung dịch acid phosphoric 0,5% và 0,1 %: Hút 750 µl H3PO4 đặc pha vào 250 ml

N

2.2.4. Chuẩn bị dung môi pha động

H

Ơ

nước, khuấy đều, thu được dung dịch H3PO4 0,5%. Pha loãng 50 ml dung dịch này

.Q

vào cốc có mỏ, hòa tan trong 80 ml nước, thêm nước đến khoảng 200 ml, khuấy đều.

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

G

Đ

- Dung dịch đệm phosphat 20 mM (pH 2,50): Cân chính xác 1,6320 g KH2PO4 vào cốc

H Ư

N

có mỏ 100 ml, hòa tan trong 80 ml nước cất hai lần. Rót vào bình định mức 500,0 ml, thêm nước vừa đủ. Lắc đều. Chỉnh đến pH 2,50 bằng dung dịch H3PO4 20 mM (210 µl

TR ẦN

H3PO4 đặc pha trong 200 ml nước trong bình định mức).

- Dung dịch HCOOH 0,05%; 0,1% và 0,2%: Hút 410 µl HCOOH pha trong 250 ml

B

nước, khuấy đều thu được dung dịch HCOOH 0,2%. Pha loãng 100 ml dung dịch

10 00

HCOOH 0,2% bằng nước để được 200 ml dung dịch HCOOH 0,1%. Hút 100 µl HCOOH pha trong 250 ml nước, khuấy đều thu được dung dịch HCOOH 0,05%.

Ó

A

- Dung dịch CH3COOH 1% và 0,1%: Hút 2 ml CH3COOH băng pha trong 200 ml

Í-

H

nước, khuấy đều thu được dung dịch CH3COOH 1%. Hút 240 µl CH3COOH băng pha

-L

trong nước vừa đủ 250 ml, khuấy đều.

ÁN

- Dung dịch đệm acetat 10 mM (pH 4,75): Hút 140 µl CH3COOH băng pha trong 200 ml nước, điều chỉnh đến pH 4,75 bằng dung dịch NaOH 0,5 M, thêm nước vừa đủ 250

ÀN

ml.

Các dung dịch trên được lọc qua màng 0,45 µm và siêu âm trước khi sử dụng.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

thêm nước vừa đủ, lắc đều.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ẠO

Chỉnh đến pH 6,80 bằng dung dịch NaOH 0,5 M. Chuyển vào bình định mức 250,0 ml,

TO

http://daykemquynhon.ucoz.com

- Dung dịch đệm phosphat 5 mM (pH 6,80): Cân chính xác khoảng 170,0 mg KH2PO4

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

bằng nước để được 250 ml dung dịch H3PO4 0,1%.

D

IỄ N

Đ

2.3. Nội dung nghiên cứu - Xây dựng phương pháp phân tích IMI và CIL trong thuốc tiêm bằng HILIC. Tiến hành khảo sát các điều kiện sắc kí sau: + Pha tĩnh + Pha động: thành phần, tỷ lệ, nồng độ, pH, tốc độ dòng

12

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

+ Dung môi pha mẫu + Thể tích tiêm + Bước sóng phát hiện - Thẩm định phương pháp phân tích IMI và CIL trong chế phẩm thuốc tiêm bằng

N

HILIC theo hướng dẫn của ICH [12] với các tiêu chí sau:

H

Ơ

+ Độ đặc hiệu

+ Độ thô

G

Đ

- Ứng dụng phương pháp trên xác định hàm lượng IMI và CIL trong thuốc tiêm

H Ư

N

Tienam trên thị trường.

2.3.1. Phương pháp nghiên cứu

TR ẦN

Dựa trên nghiên cứu của N. Nakov [16] về phân tích IMI và CIL bằng HILIC trong chế phẩm thuốc tiêm, kết hợp với điều kiện trang thiết bị của phòng thí nghiệm, tôi

10 00

2.3.1.1. Khảo sát pha tĩnh

B

tiến hành khảo sát các điều kiện chạy sắc kí như sau: Cột silica có thể sử dụng làm pha tĩnh HILIC, loại cột này có giá thành rẻ, sẵn có,

Ó

A

vì vậy, tôi lựa chọn cột hai cột silica có độ dài khác nhau, cùng kích thước hạt nhồi cột

Í-

H

5 µm để tiến hành khảo sát:

-L

- Cột Supelco Ascentis Silica kích thước 250 x 4,6 mm: Cột đã sử dụng chạy pha

ÁN

thuận trước đây, được hoạt hóa lại bằng isopropanol để chạy HILIC.

TO

- Cột Hypersil Silica kích thước 200 x 4,6 mm: Cột mới được hoạt hóa bằng

ÀN

isopropanol.

Dựa vào hình dạng pic sắc kí và thời gian phân tích để lựa chọn cột.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

ẠO

+ Độ đúng

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

.Q

+ Độ lặp lại

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

+ Khoảng nồng độ tuyến tính

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

+ Độ phù hợp hệ thống

D

IỄ N

Đ

2.3.1.2. Khảo sát pha động Tiến hành khảo sát thành phần pha động, tỷ lệ, nồng độ, pH và tốc độ dòng. Dựa vào khả năng tách các chất, mức độ ổn định của đường nền và thời gian lưu của IMI và CIL để lựa chọn pha động thích hợp. Bảng 2.1 dưới đây mô tả các điều kiện pha động mà tôi đã tiến hành khảo sát:

13

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Bảng 2.1. Các điều kiện pha động khảo sát Tỉ lệ

Tốc độ

(v/v)

(ml/phút)

70:30

1

70:30

1

70:30

1

75:25

1

70:30

1

70:30

1

MeOH : H3PO4 0,1%

75:25

1

90:10

1

70:30

1

70:30

1

70:30

1

60:40

1

70:30

1

ACN : đệm acetat 10 mM (pH 4,75)

TR ẦN

A

10 00

ACN : nước

H Ư

N

G

5 µm)

H

Ó

ACN : HCOOH 20 mM

-L

Í-

ACN : HCOOH 50 mM

ÁN

ACN : CH3COOH 1%

TO

Cột Hypersil

ÀN

75:25

ACN : H3PO4 0,1%

Đ

60:40

1

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

1

ACN : CH3COOH 0,1%

IỄ N D

.Q

ẠO 70:30

ACN : HCOOH 10 mM

4,6 mm, 5 µm)

1 1

(250 x 4,6 mm,

Silica (200 x

70:30

Đ

Ascentis Silica

ACN : đệm phosphat 5 mM (pH 6,80)

1

B

Cột Supelco

70:30

1

TP

ACN : H3PO4 0,5%

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

80:20

U Y

1,5

Ơ

1,2

H

75:25

N

ACN : H3PO4 0,1%

N

1

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

Pha động

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Pha tĩnh

1,2 1

ACN : đệm phosphat 20 mM, pH 2,50

60:40

0,8 0,5

14

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

2.3.1.3. Khảo sát dung môi pha mẫu Pha mẫu trong hỗn hợp dung môi ACN và nước như trong nghiên cứu N. Nakov [16] nhưng với các tỷ lệ khác nhau gồm 75:25 và 60:40 (v/v). Tiến hành chạy sắc ký, dựa vào hình dáng của pic sắc ký và chi phí để lựa chọn dung môi pha mẫu thích hợp.

N

2.3.1.4. Khảo sát thể tích tiêm

H

Ơ

Tiến hành chạy sắc kí ở hai thể tích tiêm mẫu là 10 µl và 5 µl, dựa vào hình dạng

G

Đ

Phương pháp phân tích IMI và CIL bằng HILIC được thẩm định theo các tiêu chí

H Ư

N

sau theo hướng dẫn của ICH [12]: - Độ chọn lọc - Khoảng nồng độ tuyến tính

B

- Độ lặp lại

TR ẦN

- Độ phù hợp hệ thống

10 00

- Độ đúng - Độ thô

Ó

A

2.3.2.1. Độ phù hợp hệ thống

Í-

H

- Chuẩn bị: Pha mẫu chuẩn hỗn hợp nồng độ 150 ppm bằng cách hút 1,50 ml dung

-L

dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ 500 ppm vào bình định mức 5,00 ml, thêm dung môi pha

ÁN

mẫu vừa đủ, lắc đều.

TO

- Tiến hành: Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp

ÀN

một mẫu chuẩn hỗn hợp ở nồng độ 150 ppm. Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của các lần sắc ký.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

2.3.2. Thẩm định phương pháp

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ẠO

190 nm đến 400 nm. Lựa chọn bước sóng thích hợp của mỗi chất.

TP

.Q

Tiến hành quét phổ trên pic sắc kí của hai chất chuẩn trong khoảng bước sóng từ

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

2.3.1.5. Khảo sát bước sóng phát hiện

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

pic và độ cân xứng của pic để lựa chọn thể tích tiêm mẫu thích hợp.

D

IỄ N

Đ

- Yêu cầu: Chênh lệch diện tích pic, thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) không lớn hơn 2,0% [2].

2.3.2.2. Độ chọn lọc - Chuẩn bị các mẫu sau: + Mẫu dung môi pha mẫu: Chuẩn bị như mục 2.2.3.

15

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

+ Mẫu placebo tự tạo: Pha dung dịch natri bicarbonat 6 ppm như mục 2.2.3. + Mẫu chuẩn đơn thành phần IMI, CIL 150 ppm: Hút 1,50 ml chuẩn đơn gốc vào bình định mức 20,00 ml, bổ sung dung môi vừa đủ. Lắc đều.

Hút 3,00 ml chuẩn hỗn hợp gốc vào bình 5,00 ml, bổ sung dung môi vừa đủ. Lắc đều.

N

+ Mẫu chuẩn hỗn hợp gồm hai thành phần IMI và CIL nồng độ 150 ppm của mỗi chất:

H

Ơ

+ Mẫu thử nồng độ 150 ppm của mỗi chất: Hút 1,50 ml dung dịch mẫu thử vào bình

TP

.Q

- Yêu cầu:

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

G

Đ

+ Trên sắc kí đồ của dung dịch thử có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống

H Ư

N

kê với thời gian lưu của chất chuẩn trong sắc kí đồ của mẫu chuẩn. Pic của chất cần phân tích phải tinh khiết (Độ tinh khiết của pic sắc kí > 0,995). Chồng phổ của chất

TR ẦN

phân tích với chất chuẩn cho hệ số Match ≥ 0,999. Nếu xuất hiện pic tạp chất, thì phải tách khỏi pic chất thử với độ phân giải Rs > 1,5.

B

2.3.2.3. Khoảng nồng độ tuyến tính

10 00

- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ IMI và CIL khoảng từ 75 ppm đến 250 ppm từ dung dịch chuẩn hỗn hợp 500 ppm. Bảng 2.2 mô tả quy trình pha các

Ó

A

mẫu dường chuẩn:

Í-

H

Bảng 2.2. Quy trình pha các mẫu đường chuẩn Hệ số pha loãng

ÁN

-L

Nồng độ (ppm)

500 ppm (ml)

75

6,7

1,50

10,0

100

5

1,00

5,0

150

3,3

1,50

5,0

200

2,5

2,00

5,0

250

2

5,00

10,0

TO Đ

Bình định mức (ml)

D

IỄ N

V dung dịch

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

pic tại vị trí của hoạt chất chính. Nếu có thì ảnh hưởng của mẫu placebo (AH%) ≤ 1%.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ẠO

+ Trên sắc kí đồ của dung dịch mẫu trắng và dung dịch placebo không được xuất hiện

ÀN

http://daykemquynhon.ucoz.com

- Tiến hành: Chạy sắc ký các mẫu trên, so sánh các pic trên sắc ký đồ thu được.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

5,00 ml, bổ sung dung môi vừa đủ. Lắc đều.

- Tiến hành chạy sắc ký, xây dựng phương trình hồi quy, xác định hệ số tương quan (R) và hệ số chắn tại nồng độ 100% (Y-intercept).

16

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

- Yêu cầu: Hệ số tương quan R ≥ 0,995 và hệ số chắn tại nồng độ 100%: -2,0% ≤ Yintercept ≤ 2,0 %.

2.3.2.4. Độ lặp lại - Độ lặp lại trong ngày

N

+ Chuẩn bị: Cân 6 mẫu thử riêng biệt. Pha mẫu thử như mục 2.2.3.

H

Ơ

+ Tiến hành: Chạy sắc kí 6 mẫu thử.

TP

.Q

- Độ lặp lại khác ngày

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

G

Đ

+ Yêu cầu: Chênh lệch kết quả giữa 6 lần thử trong cùng một ngày và 12 lần thử trong

H Ư

N

2 ngày khác nhau, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của IMI và CIL phải không lớn hơn 2,0%.

TR ẦN

2.3.2.5. Độ đúng - Chuẩn bị:

B

+ Cân 21,30 mg thử vào bình định mức 20,00 ml. Hòa tan trong 8 ml nước, thêm ACN

10 00

tới vạch, lắc đều thu được dung dịch thử nồng độ khoảng 500 ppm. + Cân 3 mẫu chuẩn hỗn hợp gồm 11,10 mg CIL natri chuẩn và 10,70 mg IMI chuẩn

Ó

A

vào 3 bình định mức 20,00 ml. Hòa tan trong 8 ml nước, thêm ACN tới vạch, lắc đều

Í-

H

thu được 3 dung dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ 500 ppm.

-L

+ Thêm các lượng chuẩn ở mức 30%, 50%, 70% vào mẫu thử 50% được 9 dung dịch

ÁN

dịch ở mức nồng độ khoảng 80%, 100%, 120% (tương ứng với các dung dịch có nồng

TO

độ khoảng 120 ppm, 150 ppm và 180 ppm). Bảng 2.3 dưới đây mô tả cách pha của 9 dung dịch trên:

D

IỄ N

Đ

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

+ Tiến hành: Chạy sắc kí 6 mẫu thử.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ẠO

+ Chuẩn bị: Cân 6 mẫu thử riêng biệt. Pha mẫu thử như mục 2.2.3.

ÀN

http://daykemquynhon.ucoz.com

RSD (%) của IMI và CIL phải không lớn hơn 2,0%.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

+ Yêu cầu: Chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối

17

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Bảng 2.3. Quy trình pha các mẫu chạy của độ đúng Bình định

(ml)

(ml)

(ml)

mức (ml)

1,00

10,00

1,50

1,00

10,00 1,00

1,50

10,00

1,50

2,00

2,00

10,00

H Ư

N

G

1,50

10,00 10,00

Đ

120

2,00

10,00

ẠO

1,50

TP

1,50

- Chạy sắc kí 9 dung dịch trên. Tính nồng độ chuẩn đã thêm vào, từ đó tính tỷ lệ thu

TR ẦN

hồi của chất chuẩn IMI và CIL thêm vào mẫu thử 50%.

lượng chất chuẩn thu hồi x 100% lượng chất chuẩn thêm vào

A

Tỷ lệ thu hồi (%) =

10 00

Công thức tính tỷ lệ thu hồi:

B

- Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi đạt 98% - 102% , RSD ≤ 2,0% ở mỗi mức nồng độ.

Ó

2.3.2.6. Độ thô

Í-

H

Độ thô đánh giá độ ổn định của phương pháp khi có sự thay đổi nhỏ về các thông

-L

số của phương pháp. Trong nghiên cứu này, tôi khảo sát sự thay đổi của tỷ lệ dung môi

ÁN

pha động, nồng độ đệm và pH. Dùng phần mềm Modde để xây dựng quy trình thẩm

TO

định độ thô. Kết quả được đánh giá dựa vào giá trị RSD (%) của hai thông số là thời

ÀN

gian lưu và diện tích pic của IMI và CIL.

D

IỄ N

Đ

2.4. Áp dụng phương pháp

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

1,50

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

10,00

1,50

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

100

1,50

U Y

1,50

10,00

N

1,50

H

80

V chuẩn 3

N

1,50

V chuẩn 2

Ơ

độ (%)

V chuẩn 1

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

V thử (ml)

.Q

Mức nồng

Áp dụng phương pháp trên tiến hành phân tích đồng thời IMI và CIL trong thuốc

tiêm truyền tĩnh mạch Tienam.

2.5. Xử lý kết quả Kết quả được xử lý bằng phần mềm Chemstation và tính toán bằng Microsoft excel 2007.

18

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký 3.1.1. Khảo sát pha tĩnh Tiến hành chạy sắc kí mẫu chuẩn hỗn hợp nồng độ 150 ppm với các pha động như

N

bảng 2.1 trên cột Supelco Ascentis Silica (250 x 4,6 mm, 5 µm).

H

Ơ

Nhận thấy khi chạy sắc kí trên cột Supelco Ascentis Silica sử dụng các điều kiện

.Q

quả. Tiến hành hoạt hóa lại cột Sulpelco Ascentis Silica bằng isopropanol nhưng

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

G

Đ

Khảo sát trên cột Hypersil Silica (200 x 4,6 mm, 5 µm) cho thấy hình dáng pic

H Ư

N

được cải thiện hơn. Cột Hypersil Silica được hoạt hóa bằng isopropanol và sử dụng riêng cho HILIC nên cho hiệu lực tách tốt hơn (số đĩa lý thuyết trên 9000). Vì vậy, cột

TR ẦN

Hypersil Silica được lựa chọn để khảo sát tiếp. Sắc kí đồ khi phân tích IMI và CIL sử dụng hai cột trên với pha động là hỗn hợp ACN và dung dịch đệm phosphat, tốc độ

10 00

B

dòng 1 ml/phút ở bước sóng 226 nm được thể hiện trong hình 3.1.

a)

H

Ó

A

CIL

TO

ÁN

-L

Í-

IMI

b)

Đ

CIL

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

pha thuận nên hiệu lực cột khi chuyển sang hệ dung môi thân nước của HILIC bị giảm.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ẠO

không cải thiện được hình dạng pic. Điều này có thể do cột đã được sử dụng cho sắc kí

ÀN

http://daykemquynhon.ucoz.com

hiện tượng quá tải cột nên tôi tiến hành giảm thể tích tiêm mẫu nhưng không có hiệu

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

pha động như trong bảng 2.1, các pic đều bị đổ đầu, giãn chân. Điều này có thể do

D

IỄ N

IMI

Hình 3.1. Kết quả khảo sát pha tĩnh a) cột Supelco Ascentis Silica

b) cột Hypersil Silica

Các kết quả khác trên cột Ascentis Silica được thể hiện trong phụ lục PL-2, PL-3.

19

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

3.1.2. Khảo sát pha động 3.1.2.1. Khảo sát thành phần pha động Tiến hành khảo sát các pha động khác nhau trên cột Hypersil Silica như bảng 2.1.

Kết quả cho thấy khi sử dụng các dung môi acid HCOOH, CH3COOH, H3PO4, thời

N

gian lưu của hai chất, đặc biệt là IMI rất dài. Khi sử dụng đệm phosphat 20 mM, pH

H

Ơ

2,50; thời gian phân tích được rút ngắn. Do đó, đệm này được lựa chọn cho các khảo

A

10 00

B

CIL

CIL

IMI

d) CIL IMI

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

c)

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

b)

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

CIL

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

.Q a)

ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

thể hiện trong hình 3.2.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

sát tiếp theo. Một số kết quả khảo sát thành phần pha động ở bước sóng 226 nm được

Hình 3.2. Kết quả khảo sát thành phần pha động a) ACN : HCOOH 0,1%

b) ACN : CH3COOH 1%

c) ACN : H3PO4 0,1%

d) ACN : Đệm phosphat 20 mM, pH 2,5

20

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Từ kết quả khảo sát pha động, tôi đưa ra một số nhận xét sau: - Về khoảng pH khảo sát: IMI và CIL có nhiều dạng ion hóa tùy thuộc vào pH pha động. Theo B. Buszewski [7], đối với các chất phân tích có nhiều dạng ion hóa, pH thường điều chỉnh để chất

N

phân tích chỉ tồn tại một dạng ion hóa duy nhất. IMI có pka1 = 3,2 và pka2 = 9,9 và CIL

H

Ơ

có pk1 = 2,5 và pka2 = 9,14. Để chúng chỉ tồn tại ở một dạng ion hóa duy nhất (hoặc là

Khi pH > 4-5, các nhóm –SiOH của pha tĩnh bị khử proton hóa làm cho bề mặt pha

G

Đ

tĩnh mang điện âm [19]. Đồng thời, IMI và CIL tồn tại ở dạng lưỡng cực –COO- và –

H Ư

N

NH3+. Khi đó, tương tác ion giữa bề mặt pha tĩnh mang điện âm và chất phân tích có nhóm mang điện dương sẽ đóng vai trò quan trọng trong cơ chế tách của HILIC, kết

TR ẦN

quả của tương tác này là làm tăng thời gian lưu của chất phân tích. Điều này đúng khi tôi tiến hành khảo sát với đệm phosphat pH 6,8 và đệm acetat pH 4,75 trên cột Supelco

B

Ascentis. Do vậy trên cột Hypersil Silica, khoảng giá trị pH này không được khảo sát

10 00

nữa.

- Về loại pha động sử dụng:

Ó

A

Acid acetic và acid formic được khuyến cáo sử dụng trong HILIC do tan tốt trong

Í-

H

các dung môi hữu cơ, và đặc tính dễ hóa hơi, thuận tiện khi kết nối với detector khối

-L

phổ. Tuy nhiên, do thời gian lưu của CIL và IMI quá dài nên tôi không chọn chúng để

ÁN

khảo sát tiếp. Đệm phosphat nồng độ cao không được khuyến cáo sử dụng do dễ bị tủa

TO

trong tỷ lệ cao ACN và không có khả năng hóa hơi nên không tương thích với LC-MS.

ÀN

Tuy nhiên, đề tài sử dụng đệm phosphat nồng độ thấp (20 mM) và tỷ lệ ACN thấp (60%), kết hợp với việc sử dụng detector mảng diod cho kết quả tốt về thời gian lưu và

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

ẠO

và pH > 8 không được khảo sát trên cột Hypersil Silica.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

.Q

sẽ bị hòa tan tạo thành các khoảng trống trong cột [1],[15]. Do vậy, các khoảng pH < 2

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

tức là nằm ngoài khoảng pH từ 2 đến 8. Tuy nhiên ở các giá trị pH này, pha tĩnh silica

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

–NH3+ hoặc là –COO-) thì pH sử dụng phải nhỏ hơn (pka1 – 2) hoặc lớn hơn (pka2 + 2),

D

IỄ N

Đ

khả năng tách hai chất. Do vậy, đệm phosphat pH 2,5 được lựa chọn để khảo sát tiếp.

Kết quả về thời gian lưu của CIL và IMI trên các pha động khác nhau có thể giải thích như sau: Thời gian lưu của chất phân tích giảm khi độ phân cực của pha động tăng lên [8].

Khi sử dụng dung dịch đệm, độ phân cực của pha động tăng so với khi sử dụng dung

21

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

dịch acid. Do đó, thời gian lưu của CIL và IMI khi dùng dung dịch đệm phosphat ngắn hơn so với khi dùng dung dịch acid phosphoric. Khi so sánh về thời gian lưu của IMI và CIL khi sử dụng các dung dịch acid, dung dịch acid phosphoric cho thời gian phân tích ngắn nhất. Điều này có thể do acid phosphoric có độ phân cực lớn hơn so với acid

Ơ

N

acetic và acid formic (Lg P của acid phosphoric, acid acetic, acid formic lần lượt là -1

H

[27], -0,17 [26], -0,54 [25]).

.Q

sử dụng trong trường hợp tỷ lệ dung môi hữu cơ trong pha động nhỏ hơn 90%) [16].

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

G

Đ

tiếp.

H Ư

N

- Về tỷ lệ pha động:

Hỗn hợp 60 - 97% ACN trong nước hoặc đệm dễ bay hơi thường được sử dụng [7].

TR ẦN

Với pha tĩnh silica trần, lượng nước yêu cầu ít nhất là 3% đủ để hydrat hóa hoàn toàn các hạt pha tĩnh [18]. Khi tăng tỷ lệ đệm sẽ làm tăng độ phân cực của pha động, dẫn

B

tới làm giảm thời gian lưu của chất phân tích. Do vậy, tỷ lệ pha động là 60 % ACN và

10 00

40% đệm được lựa chọn. Một ưu điểm khác khi dùng tỷ lệ này là tiết kiệm được ACN, do vậy đạt hiệu quả về kinh tế.

Ó

A

3.1.2.2. Khảo sát tốc độ dòng

Í-

H

Chạy sắc kí hỗn hợp chuẩn hỗn hợp nồng độ 150 ppm trên cột Hypersil Silica với

-L

pha động gồm hỗn hợp ACN và dung dịch đệm phosphat (20 mM, pH 2,50) = 60:40

ÁN

(v/v) với 3 tốc độ dòng khác nhau là 0,5 ml/phút; 0,8 ml/phút và 1 ml/phút thu được

TO

sắc kí đồ ở bước sóng 226 nm thể hiện ở hình 3.3.

0,5 ml/phút

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

lưu của chất phân tích [8]. Do vậy, nồng độ đệm 20 mM được lựa chọn để khảo sát

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ẠO

Tăng nồng độ đệm sẽ làm tăng độ phân cực của pha động, do đó làm giảm thời gian

CIL

Đ

ÀN

http://daykemquynhon.ucoz.com

Theo khuyến cáo, nồng độ đệm thường sử dụng là 2-20 mM (nồng độ 20 mM chỉ

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

- Về nồng độ đệm sử dụng:

D

IỄ N

IMI

22

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

0,8 ml/phút

CIL

Khi tăng tốc độ dòng, thời gian lưu của chất phân tích giảm. Xét về mặt thời gian

TR ẦN

phân tích, tốc độ dòng 1,0 ml/phút có ưu thế nhất nhưng thời gian lưu của CIL lại trùng với thời gian chết. Xét về kinh tế, thể tích ACN sử dụng là tương đương nhau. Vì

B

vậy, tốc độ dòng 0,8 ml/ phút được lựa chọn.

10 00

3.1.3. Khảo sát dung môi pha mẫu

Sau khi chạy sắc kí với 2 mẫu chuẩn hỗn hợp nồng độ 150 ppm pha trong hỗn hợp

Ó

A

dung môi ACN : nước theo tỷ lệ 75:25 và 60:40, nhận thấy không có sự khác biệt về

Í-

H

các thông số như thời gian lưu, diện tích pic… và hình dạng pic. Sắc kí đồ của hai

-L

dung dịch trên ở bước sóng 226 nm được thể hiện trong hình 3.4.

ÁN

Thông thường, dung dịch đệm của pha động sẽ được sử dụng để pha mẫu, nhưng

TO

trong đề tài lại chọn hỗn hợp ACN : nước vì IMI không bền trong môi trường acid.

ÀN

Theo khuyến cáo, tỷ lệ nước trong dung môi pha mẫu không lớn hơn so với tỷ lệ nước

Đ

trong pha động nên tôi tiến hành pha mẫu trong hỗn hợp ACN : nước theo tỷ lệ 60:40

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

H Ư

N

Hình 3.3. Kết quả khảo sát tốc độ dòng

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

G

Đ

ẠO

IMI

TP

CIL

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y .Q

1 ml/phút

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

H

Ơ

N

IMI

D

IỄ N

và 75: 25. Nhưng do kết quả không có sự khác nhau giữa hai tỷ lệ nên tỷ lệ 60:40 được lựa chọn vì giống với tỷ lệ của pha động lựa chọn và tăng khả năng hòa tan IMI. 3.1.4. Khảo sát về thể tích tiêm mẫu Khi tiêm mẫu với thể tích 5,0 µl và 10,0 µl, các thông số và hình dạng pic không có sự khác biệt.

23

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Nhược điểm của pha tĩnh silica trần là dễ xảy ra hiện tượng quá tải cột. Nguyên nhân gây ra hiện tượng này thường là do nồng độ chất phân tích quá cao hoặc thể tích tiêm quá lớn. Khi tiêm với thể tích 5,0 µl sẽ tránh được hiện tượng quá tải cột nên nó được lựa chọn.

N

3.1.5. Lựa chọn bước sóng phát hiện

H

Ơ

Quét phổ trên pic của hai chất chuẩn trong khoảng bước sóng từ 190 nm đến 400

10 00

- IMI có 2 cực đại hấp thụ ở 200 nm và 312 nm. Tuy nhiên, ở bước sóng 200 nm gần với bước sóng tới hạn của ACN (190 nm [1]) nên đường nền sẽ bị nhiễu, khó ổn định

Ó

A

hơn so với bước sóng 312 nm. Chính vì vậy, bước sóng 312 nm được lựa chọn để phân

H

tích IMI.

-L

Í-

- CIL không thấy cực đại hấp thụ trong khoảng bước sóng từ 190 nm đến 400 nm,

ÁN

nhưng có vai ở 226 nm. Do đó, bước sóng 226 nm được lựa chọn để phân tích CIL.

TO

Trong nghiên cứu của N. Nakov [14], tác giả lựa chọn bước sóng 254 nm để phân tích đồng thời IMI và CIL, có thể do khi sử dụng pha động ACN : amoni format (45

ÀN

mM, pH 5,5) = 68:32, phổ hấp thụ của IMI và CIL thay đổi.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

B

Từ phổ hấp thụ của IMI và CIL, nhận thấy:

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

Hình 3.5. Phổ hấp thụ của CIL

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

.Q Hình 3.4. Phổ hấp thụ của IMI

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U Y

N

nm, thu được kết quả như trong hình 3.4 và 3.5.

D

IỄ N

Đ

3.2. Phương pháp phân tích đồng thời imipenem và cilastatin Từ kết quả thực nghiệm trên, tôi xây dựng phương pháp phân tích đồng thời hai chất IMI và CIL như sau: - Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp nồng độ 150 ppm như mục 2.2.3.

- Điều kiện sắc ký:

24

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

+ Cột pha tĩnh: Cột Hypersil Si 200 x 4,6 mm; 5 µm. + Pha động: hỗn hợp ACN : đệm phosphat (20 mM, pH 2,5) = 60:40 (v/v). + Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút. + Bước sóng phát hiện: 226 nm đối với CIL và 312 nm đối với IMI.

N

+ Thể tích tiêm mẫu: 5µl.

H

Ơ

3.3. Thẩm định phương pháp

.Q

lần với điều kiện sắc ký đã trình bày ở mục 3.2. Sắc kí đồ được thể hiện trong phụ lục

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

G

Đ

Bảng 3.1. Kết quả độ phù hợp hệ thống

Imipenem

S (mAU.s)

1

3,461

2

3,461

3

3,461

4 5

S (mAU.s)

1057

4,371

1055

1057

4,370

1055

1058

4,369

1054

3,460

1057

4,369

1054

3,461

1060

4,367

1055

3,461

1057

4,370

1053

3,461

1058

4,369

1054

0,012

0,12

0,031

0,077

B

10 00

A

Í-

H

Ó

6 TB

tR (phút)

TR ẦN

tR (phút)

ÁN

-L

RSD (%)

H Ư

N

Cilastatin

STT

Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các thông số phân tích đều dưới

ÀN

2,0%.

D

IỄ N

Đ

Kết luận: Phương pháp đã khảo sát đạt tiêu chuẩn về độ phù hợp hệ thống với hai

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

trong bảng 3.1.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ẠO

PL-4 và PL-5. Kết quả thời gian lưu và diện tích pic của IMI và CIL được thể hiện

TO

http://daykemquynhon.ucoz.com

Chuẩn bị một dung dịch chuẩn hỗn hợp như mục 2.3.2.1. Tiến hành sắc ký lặp lại 6

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

3.3.1. Độ phù hợp hệ thống

chất IMI và CIL theo tiêu chuẩn trong DĐVN V [2].

3.3.2. Độ chọn lọc Do không có placebo của nhà sản xuất và không biết hàm lượng của placebo trong chế phẩm nên dựa theo chuyên luận Bột pha tiêm Imipenem và Cilastatin trong DĐVN V [2], tiến hành chuẩn bị mẫu placebo như mục 2.2.3.

25

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Tiến hành chạy sắc kí như mục 3.2.

Kết quả độ chọn lọc được thể hiện trong bảng 3.2 và phụ lục PL-6 và PL-7.

Bảng 3.2. Kết quả độ chọn lọc tR CIL (phút)

tR IMI (phút)

Ơ

N

Dung môi pha mẫu

4,378

Mẫu thử

3,462

4,372

Đ G

Nhận xét:

H Ư

N

- Trên sắc ký đồ chuẩn CIL ở bước sóng 226 nm xuất hiện pic ở 3,458 phút. Độ tinh khiết của pic CIL bằng 999,995. khiết của pic IMI là 999,341.

TR ẦN

- Trên sắc ký đồ chuẩn IMI ở bước sóng 312 nm xuất hiện pic ở 4,488 phút. Độ tinh

10 00

B

- Trên sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp, có pic hai chất ứng với thời gian lưu với pic trong chuẩn đơn thành phần.

A

- Trên sắc ký đồ của dung môi pha mẫu và mẫu placebo không có pic tại thời gian lưu

Í-

đơn từng chất.

H

Ó

tương ứng với thời gian lưu của hai chất phân tích trong mẫu chuẩn hỗn hợp và chuẩn

-L

- Trên sắc ký đồ mẫu thử có các pic tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của

ÁN

hai chất trong dung dịch chuẩn hỗn hợp của CIL và IMI. Hệ số chồng phổ của CIL và

TO

IMI lần lượt là 999,994 và 999,751. Có pic tạp giữa pic của CIL và IMI nhưng Rs của

ÀN

CIL và tạp và Rs của tạp và IMI đều > 1,5.

D

IỄ N

Đ

Kết luận: Phương pháp đã khảo sát đạt tiêu chuẩn về độ chọn lọc với IMI và CIL.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

3,461

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

Mẫu chuẩn hỗn hợp

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

3,458

TP

Mẫu chuẩn CIL natri

.Q

U Y

N

4,488

ẠO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

Mẫu chuẩn IMI

H

Mẫu placebo tự tạo

3.3.3. Khoảng nồng độ tuyến tính Chuẩn bị như mục 2.3.2.3. Tiến hành như mục 3.2.

Sắc kí đồ được thể hiện ở phụ lục PL-8, PL-9. Bảng 3.3 dưới đây thể hiện nồng độ và diện tích pic của IMI và CIL.

26

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính Imipenem

(ppm)

(mAU.s)

(ppm)

(mAU.s)

73,9

593,3

73,5

799,4

98,6

779,8

98,0

1046

147,8

1167

146,9

1571

197,1

1559

195,9

2098

246,4

1963

244,9

2640

N

Diện tích

Ơ

Nồng độ

H

Diện tích

B

1500

10 00

1000 500

Ó

0

-L

Í-

H

0,0

100,0

200,0

300,0

Nồng độ (ppm)

pic của Cilastatin

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

y = 7,9408x - 0,7537 R² = 0,9999

2000

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

Đ

H Ư TR ẦN

2500

A

Diện tích pic (mAU.s)

N

G

Hình 3.6 và 3.7 là đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy của CIL và IMI:

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

.Q

U Y

N

Nồng độ

ẠO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

Cilastatin

27

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

y = 10,7499x - 1,3305 R² = 0,9999

3000

2500 2000 1500

Ơ

N

1000

H

500

G

Đ

Nhận xét: Trong khoảng nồng độ khảo sát, có sự tương quan tuyến tính giữa nồng

N

độ và diện tích pic khảo sát:

H Ư

- Cilastatin: tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 73,9 đến 246,4 ppm; hệ số tương quan

TR ẦN

R = 1,00; hệ số chắn tại nồng độ 100%: Y-intercept = -0,06%.

- Imipenem: tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 73,5 đến 244,9 ppm, hệ số tương

B

quan R = 1,00; hệ số chắn tại nồng độ 100%: Y-intercept = -0,08%.

10 00

Kết luận: Phương pháp đã khảo sát có khoảng tuyến tính đạt yêu cầu.

Nghiên cứu của N. Nakov [16] thẩm định ở khoảng nồng độ 100 ppm đến 300 ppm

Ó

A

thu được hệ số chắn tại nồng độ 100% của CIL và IMI lần lượt là -2,6% và -8,8%. So

Í-

H

với nghiên cứu của N. Nakov, đề tài đã khảo sát được khoảng nồng độ tuyến tính với

-L

Y-intercept thấp.

ÁN

3.3.4. Độ lặp lại

TO

Chuẩn bị 6 mẫu thử độc lập như mục 2.3.2.4. Tiến hành chạy sắc kí với các điều kiện như mục 3.2.

D

IỄ N

Đ

ÀN

Bảng 3.4 thể hiện kết quả độ lặp lại trong ngày và khác ngày.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

pic của imipenem

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ẠO

Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

300,0

.Q

100,0 200,0 Nồng độ (ppm)

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

0,0

N

0

U Y

Diện tích pic (mAU.s)

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

28

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Bảng 3.4. Kết quả độ lặp lại trong ngày và khác ngày % IMI so

với HLGTN

với HLGTN

(%)

(%)

1194

1663

99,4

102,3

2

10,5

1193

1585

102,2

100,2

3

10,6

1202

1586

102,0

99,4

4

10,8

1190

1655

99,1

5

10,5

1193

1578

102,2

6

10,7

1192

1655

100,2 100,9

Đ

TB1 (n=6)

N

U Y .Q

99,8

102,7 101,0 1,4

101,9

99,4

101,6

98,9

10,67

1188

1575

2

10,64

1181

1563

3

11,24

1240

1689

101,0

101,2

4

10,90

1235

1632

103,7

100,8

5

10,70

1194

1588

102,2

99,9

6

10,76

1618

103,5

101,3

102,3

100,3

1,0

1,0

TB (n=12)

101,6

100,6

RSD (n=12) (%)

1,4

1,2

B

TR ẦN

H Ư

N

1

10 00

2

101,8

1,4

G

RSD1 (n=6) (%)

H

10,8

ẠO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

1216

A

TB1 (n=6)

ÁN

-L

Í-

H

Ó

RSD2 (n=6) (%)

Nhận xét: RSD của cả IMI và CIL ở 6 mẫu của độ lặp lại trong ngày và 12 mẫu độ

TO

http://daykemquynhon.ucoz.com

1

1

D

IỄ N

Đ

ÀN

lặp lại khác ngày đều không lớn hơn 2,0%.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

(mg)

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

(mAU.s) (mAU.s)

% CIL so

N

SIMI

Ơ

mẫu thử

SCIL

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Lượng cân

STT

TP

Ngày

Kết luận: Phương pháp khảo sát có độ lặp lại tốt.

3.3.5. Độ đúng Chuẩn bị như mục 2.3.2.5. tiến hành chạy sắc kí với các điều kiện như mục 3.2.

Kết quả độ thu hồi các chất và được trình bày tại bảng 3.5 và 3.6 dưới đây:

29

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Bảng 3.5. Kết quả độ đúng của CIL Nồng độ

S

Nồng độ

% thu hồi

Trung

chuẩn CIL

(mAU.s)

CIL thu

(%)

bình (%)

3

49,6

989

49,6

100,2

4

77,4

1202

77,2

99,8

5

73,7

1168

73,9

100,3

6

74,3

1189

75,4

101,5

7

103,2

1407

103,6

100,5

8

98,3

1368

100,1

101,9

9

99,1

1381

100,2

101,1

99,9

100,5

0,9

G

0,7

N

101,1

TR ẦN

Bảng 3.6. Kết quả độ đúng của IMI Nồng độ

Nồng độ

Trung % thu

bình

RSD

(mAU.s)

lại (ppm)

hồi (%)

(%)

(%)

1357

50,9

99,7

1346

50,4

100,3

99,5

0,8

1328

49,1

98,7

1624

75,8

98,9

75,4

1608

75,1

99,6

99,1

0,4

74,6

1587

73,6

98,7

7

102,2

1908

102,3

100,1

8

100,6

1886

101,3

100,7

100,0

0,7

9

99,5

1851

98,7

99,2

thêm vào (ppm)

1

51,1

2

50,3

3

49,7

Ó

-L

Í-

H

B

STT

A

S

10 00

IMI thu

chuẩn IMI

76,6

ÁN

4

TO

5

IỄ N

Đ

ÀN

6

D

0,5

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

100,3

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

49,3

Ơ

979,9

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

49,1

H

2

N

99,4

U Y

51,2

.Q

1001

TP

51,6

Đ

1

N

lại (ppm)

H Ư

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

thêm vào (ppm)

RSD (%)

ẠO

STT

Nhận xét: Độ thu hồi của IMI và CIL trong 9 dung dịch đều nằm trong khoảng 98% đến 102% và RSD tại 3 mức nồng độ khoảng 80%, 100% và 120% đều nhỏ hơn 2,0.

30

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Kết luận: Phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng trong khoảng nồng độ khảo sát.

3.3.6. Độ thô Để loại trừ sự ảnh hưởng của sai số trong quá trình cân, chỉnh pH và của bộ trộn, tiến hành khảo sát độ thô với ba thông số nồng độ đệm, pH và tỷ lệ pha động. Khoảng

N

thay đổi của nồng độ đệm, pH và tỷ lệ pha động được khảo sát lần lượt là 5%, 4% và 3%

H

Ơ

so với điều kiện chạy mẫu đã lựa chọn.

TP

pH

Tỷ lệ

tR CIL

SCIL

tR IMI

chạy

(mM)

đệm

ACN:đệm

(phút)

(mAU.s)

(phút) (mAU.s)

60:40

2

20

2,50

60:40

3

21

2,60

58:42

4

19

2,40

5

20

2,50

6

21

7

21

8

21

N

H Ư

2,50

4,582

1497

3,513

967,3

4,580

1495

3,464

968,2

4,406

1460

58:42

3,478

970,4

4,560

1537

60:40

3,506

970,2

4,578

1477

2,40

58:42

3,478

975,8

4,477

1523

2,60

62:38

3,550

970,5

4,701

1502

2,40

62:38

3,555

970,2

4,712

1487

19

2,60

58:42

3,468

970,2

4,428

1454

19

2,60

62:38

3,549

967,1

4,667

1418

11

19

2,40

62:38

3,556

972,0

4,799

1496

TB

3,512

969,6

4,590

1486

RSD (%)

1,0

0,32

2,7

2,2

Đ

ÀN

TO

10

ÁN

-L

Í-

A

10 00

B

20

TR ẦN

963,8

Ó

1

9

3,515

H

phosphat

SIMI

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

C đệm

Đ

Thứ tự

G

Bảng 3.7. Kết quả độ thô

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ẠO

Bảng 3.7 dưới đây là các thông số khảo sát và kết quả về độ thô.

IỄ N D

.Q

phần mềm thiết kế.

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

động, tiến hành chạy mẫu chuẩn hỗn hợp nồng độ 150 ppm theo 11 chương trình do

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

Dùng phần mềm Modde khảo sát sự thay đổi về nồng độ đệm, pH đệm và tỷ lệ pha

Nhận xét: RSD của thời gian lưu và diện tích pic của IMI và CIL đều dưới 3,0%.

Kết luận: Phương pháp đạt yêu cầu về độ thô khi thay đổi tỉ lệ pha động, nồng độ đệm, pH đệm.

31

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

3.4. Ứng dụng phương pháp phân tích chế phẩm trên thị trường Tiến hành: - Xác định khối lượng bột trong chế phẩm: Cân toàn bộ chế phẩm được khối lượng m1 = 23,6412 (g). Chuyển toàn bộ phần bột vào cốc thủy tinh khô và sạch, dùng bông

H

Ơ

Khối lượng bột trong lọ mbột = m1-m2 = 1,065 g tương ứng với 500 mg IMI và 500 mg

N

tẩm cồn, lau sạch lượng bột dính trên lọ và nắp. Cân khối lượng vỏ được m2 = 22,5762.

- Hàm lượng imipenem từ 90,0% đến 115,0% so với lượng ghi trên nhãn [20].

G

Đ

- Hàm lượng cilastatin từ 90,0% đến 115,0% so với lượng ghi trên nhãn [20].

H Ư

N

3.4.1. Công thức tính Hàm lượng có trong chế phẩm so với HLGTN: St Sc

x

mc .P(%) HL

x

Dt

TR ẦN

H(%) =

Dc

B

Trong đó:

x 100%

10 00

H(%): hàm lượng so với lượng ghi trên nhãn St: Diện tích pic của IMI/ CIL trong mẫu thử (mAU.s)

Ó

A

Sc: Diện tích pic của IMI/ CIL trong mẫu chuẩn (mAU.s)

H

mc: Khối lượng chuẩn cân (mg) tính theo IMI/ CIL

-L

Í-

P(%): Hàm lượng của chuẩn (%)

ÁN

HL: Lượng chất ghi trên nhãn =

mthử mbột

x 500 x 1000 (mg)

ÀN

TO

mbột = 1,0650 g

mthử: khối lượng mẫu thử cân (g)

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

ẠO

Yêu cầu:

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

.Q

hành pha mẫu thử như mục 2.2.3 và chạy sắc ký với điều kiện như mục 3.2.

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

- Cân 3 mẫu thử độc lập với nhau từ chế phẩm Tienam (số lô SX: N023795). Tiến

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

CIL.

D

IỄ N

Đ

Dt, Dc: Hệ số pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn 3.4.2. Kết quả định lượng Bảng 3.8 và 3.9 dưới đây là kết quả định lượng imipenem và cilastatin:

32

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Bảng 3.8. Kết quả định lượng imipenem trong chế phẩm

(mg)

1

10,8

10,6

2

10,8

3

10,7

SIMI chuẩn

P(%)I

Dt

Dc

H(%)IMI

3,3

3,3

107,3

1662

3,3

3,3

107,8

1693

3,3

3,3

110,8

(mAU.s) (mAU.s) 1655

1511

MI

93,74

N

Trung bình

.Q

(mg)

1

10,8

11,6

2

10,8

1196

3

10,7

1178

P(%)I

(mAU.s) (mAU.s) 1215

MI

95.54

N

G

1189

Dt

Dc

H(%)CIL

3,3

3,3

100,8

3,3

3,3

101,4

3,3

3,3

100,8

TR ẦN

Trung bình

101,0

10 00

B

Nhận xét: Hàm lượng imipenem và cilastatin trong chế phẩm Tienam (số lô SX: N023795) đều nằm trong khoảng giới hạn cho phép.

Ó

H

3.5. Bàn luận chung

A

Kết luận: Chế phẩm đạt yêu cầu về hàm lượng theo USP 38.

Í-

3.5.1. Ưu điểm của phương pháp

-L

Phương pháp đã khảo sát có những ưu điểm sau:

ÁN

- Thời gian phân tích ngắn (dưới 5 phút).

TO

- Tiết kiệm dung môi ACN.

ÀN

- Kết quả thẩm định đạt tiêu chuẩn của ICH.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

(mg)

SCIL chuẩn

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

SCIL thử

ẠO

mc CIL

Đ

mthử

H Ư

STT

TP

Bảng 3.9. Kết quả định lượng cilastatin trong chế phẩm

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U Y

108,6

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

(mg)

SIMI thử

N

mc IMI

Ơ

mthử

H

STT

D

IỄ N

Đ

- Có một số ưu điểm so với các nghiên cứu phân tích đồng thời IMI và CIL trước đó: + So với kĩ thuật quang phổ đạo hàm, phương pháp đã tách riêng được tạp chất Thienamycin ra khỏi CIL và IMI với độ phân giải Rs > 1,5. + So với kĩ thuật IPC quy định trong các dược điển, phương pháp cho phép định lượng IMI và CIL mà không cần sử dụng chất tạo cặp ion.

33

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

+ So với nghiên cứu của N. Nakov, phương pháp có ưu điểm: Hệ số kéo đuôi của IMI và CIL lần lượt là 0,84 và 0,80. Hệ số chắn tại nồng độ 100% của IMI và CIL lần lượt là -0,08% và -0,06%.

3.5.2. Nhược điểm của phương pháp

N

- Thời gian cân bằng cột lâu do cần có thời gian hình thành lớp dung môi thân nước

H

Ơ

trên bề mặt pha tĩnh.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

.Q

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U Y

N

- Thời gian rửa cột lâu do sử dụng đệm phosphat.

34

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Từ kết quả nghiên cứu, tôi đưa ra những kết luận sau: - Chuẩn bị mẫu tử và chuẩn hỗn hợp nồng độ 150 ppm trong hỗn hợp dung môi ACN :

N

nước = 60:40 (v/v).

H

Ơ

- Điều kiện sắc ký:

TP

.Q

+ Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

G

Đ

- Thẩm định quy trình theo hướng dẫn của ICH thu được kết quả đạt về các tiêu chí

H Ư

N

sau: + Độ chọn lọc + Khoảng nồng độ tuyến tính

B

+ Độ lặp lại

TR ẦN

+ Độ phù hợp hệ thống

10 00

+ Độ đúng

A

+ Độ thô

Ó

4.2. Kiến nghị

Í-

H

Dựa trên kết quả nghiên cứu, tôi xin đưa ra một vài đề xuất như sau:

ÁN

nghiệt.

-L

- Tiến hành thẩm định độ tái lặp, độ ổn định của mẫu thử trong các điều kiện khắc

TO

- So sánh phương pháp trên với phương pháp chuẩn trong dược điển.

D

IỄ N

Đ

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

+ Thể tích tiêm mẫu: 5µl.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ẠO

+ Bước sóng phát hiện: 226 nm đối với CIL và 312 nm đối với IMI.

ÀN

http://daykemquynhon.ucoz.com

+ Pha động: hỗn hợp ACN : đệm phosphat (20 mM, pH 2,5) = 60:40 (v/v).

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

+ Cột pha tĩnh: Cột Hypersil Si 4,6 x 200 mm, 5 µm.

35

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Trần Tử An (2012), Hoá phân tích tập 2, NXB Y học, Hà Nội, tr.181.

2. Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, NXB Y học, Hà Nội, tr.501-502-503-

N

260.

H

Ơ

3. Bộ Y Tế (2009), Dược thư quốc gia Việt Nam 4, Hà Nội, tr.1797-1799.

.Q

(http://www.dav.gov.vn/default.aspx?action=detail&newsid=1141&type=3)

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

G

Đ

6. Đỗ Thị Tuyết Nhung (2017), Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời glycin, không tạo dẫn xuất, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội.

TR ẦN

Tiếng Anh

7. Buszewski B., Noga S. (2012), “Hydrophilic interaction liquid chromatography

B

(HILIC) – a powerful separation technique”, Anal Bioanal Chem, 402, pp.231-

10 00

247.

A

8. Dejaegher B., Heyden Y.V. (2010), “HILIC methods in pharmaceutical analysis”,

Ó

J. Sep. Sci., 33, pp.698-715.

Í-

H

9. Forsyth R.J., Ip D.P. (1994), “Determination of imipenem and cilastatin sodium

-L

in Primaxin by first order derivative ultraviolet spectrophotometry”, Journal of

ÁN

pharmaceutical and biomedical analysis, 12(10), pp.1243-1248.

TO

10. Fu Q., Liang T., Zhang X. et al. (2010), “Carbohydrate separation by hydrophilic interaction liquid chromatography on a ‘click’ maltose column”, Carbohydrat

Đ IỄ N D

H Ư

N

cystein và amoni glycyrrhizat bằng sắc kí lỏng tương tác thân nước (HILIC)

Research, 345(18), pp.2690-2697.

11. Hemström

P.,

Irgum

K.

(2006),

“Hydrophilic

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

kháng sinh ở Việt Nam, Global Antibiotic Resistance Partnership, tr.29-47.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ẠO

5. Nguyễn Văn Kính (2010), Phân tích thực trạng: Sử dụng kháng sinh và kháng

ÀN

http://daykemquynhon.ucoz.com

12/2015.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

4. Cục Quản lí Dược, Danh mục thuốc cấp số đăng ký từ năm 2010 đến tháng

interaction

chromatography”, Journal of separation science, 29(12), pp.1784-1821 12. ICH (1996),

Q2B

Validation

of

Analytical

Procedures:

Methodology

International Conference on Harmonization, Geneva.

13. Japanese Pharmacopeia 16, pp.971.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

14. Malerod H., Rogeberg M., Tanaka N. et al. (2013), “Large volume injection of aqueous peptide samples on a monolithic silica based zwitterionic-hydrophilic interaction liquid chromatography system for characterization of posttranslational modifications”, Journal of Chromatography A, 1317, pp.129-137.

KGaA,

“Particulate

analytical

HPLC

(LiChrosorb®,

columns

N

15. Merck

H

Ơ

Lichrospher®, Superspher®, Purospher® and Aluspher®) General information

.Q

approach for optimization of HILIC method for simultaneous determination of

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

H Ư

N

derivative spectrofotometric determination of imipenem and cilastatin in injections”, J Pharm Biomed Anal, 11, pp.477-482.

TR ẦN

18. SeQuant A. (2008), Practical Guide to HILIC: A Tutorial and Application Book, Umea Sweden.

B

19. Thermo Scientific, “HILIC Seperations Technical Guide: A Practiceal Guide to

10 00

HILIC Mechanisms, Method Development and Troubleshooting”.

20. USP 38 (2015), Imipenem and Cilastatin for injection.

Ó

A

21. Valette J.C., Demesmay C., Rocca J.L. et al. (2004), “Separation of Tetracycline

Í-

H

Antibiotics by Hydrophilic Interaction Chromatography Using an Amino-Propyl

-L

Stationary Phase”, Chromatographia, 59(1–2), pp.55–60.

ÁN

22. Yunsheng Hsieh (2008), “Potential of HILIC-MS in quantitative bioanalysis ofdrugs and drug metabolites”.

ÀN

23. https://www.drugbank.ca/drugs/DB01597, accessed on 11/01/2018.

D

IỄ N

Đ

24. https://www.drugbank.ca/drugs/DB01598, accessed on 11/01/2018.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

G

Đ

17. Parra A., Villanova J.G., Rodenas V., Gomez M.D. (1993), “First and second-

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Chromatography & Related Technologies, pp.2-4-20.

ẠO

imipenem and cilastatin sodium in powder for injection”, Journal of Liquid

TO

http://daykemquynhon.ucoz.com

16. Nakov N., Petkovska R., Acevska J., Dimitrovska A. (2013), “Chemometric

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

and Guidelines for Care and Use”.

25. https://www.drugbank.ca/drugs/DB01942, accessed on 15/05/2018.

26. https://www.drugbank.ca/drugs/DB03166, accessed on 15/05/2018.

27. https://www.drugbank.ca/drugs/DB09394, accessed on 15/05/2018.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

PHỤ LỤC Phụ lục 1. Chuẩn bị mẫu và dung môi pha động Chuẩn bị mẫu đủ, lắc đều thu được hỗn hợp dung môi pha mẫu ACN : nước theo tỷ lệ 60:40.

H

Ơ

- Mẫu placebo tự tạo: Cân chính xác khoảng 12,0 mg natri bicarbonat vào bình định

N

- Dung môi pha mẫu: Hút 40 ml nước vào bình định mức 100,0 ml, bổ sung ACN vừa

- Dung dịch chuẩn đơn gốc: Cân chính xác khoảng 21,4 mg chuẩn IMI và 22,2 mg

G

Đ

CIL natri vào hai bình định mức 10,00 ml; hòa tan trong 4,00 ml nước, sau đó thêm

H Ư

N

ACN vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch chuẩn đơn IMI và CIL nồng độ 2000 ppm.

Từ dung dịch này pha thành dung dịch chuẩn đơn nồng độ 150 ppm.

TR ẦN

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hút 5,00 ml của mỗi dung dịch chuẩn đơn nồng độ 2000 ppm vào bình định mức 20,00 ml; bổ sung dung môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều thu được

B

dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa nồng độ 500 ppm của từng chất. Từ dung dịch này,

10 00

dùng pipet chính xác và bình định mức pha thành các dung dịch có nồng độ 250 ppm,

Ó

- Dung dịch mẫu thử:

A

200 ppm, 150 ppm, 100 ppm và 75 ppm.

Í-

H

+ Xác định khối lượng bột trong chế phẩm: Cân toàn bộ chế phẩm (sau khi đã loại bỏ

-L

nắp nhôm bảo vệ) được khối lượng m1 (g). Chuyển toàn bộ phần bột vào cốc thủy tinh

ÁN

khô và sạch, dùng bông tẩm cồn, lau sạch lượng bột dính trên lọ và nắp. Cân khối

TO

lượng vỏ được m2 (g). Khối lượng bột trong chế phẩm bằng (m1-m2) g tương ứng với

ÀN

500 mg IMI và 500 mg CIL. + Cân chính xác khoảng 10,65 mg thuốc tiêm Tienam vào bình định mức 10,00 ml,

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

ẠO

pha mẫu của DĐVN V [2]).

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

.Q

bổ sung dung môi vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch placebo 6 ppm (dựa theo cách

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

dịch natri bicarbonat 120 ppm. Hút 0,50 ml dung dịch này vào bình định mức 10,00 ml,

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

mức 100,0 ml. Hòa tan trong 40 ml nước, bổ sung nước vừa đủ, lắc đều thu được dung

D

IỄ N

Đ

hòa tan trong 4,00 ml nước, bổ sung ACN vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch thử có nồng độ khoảng 500 ppm của IMI và CIL. Hút 1,50 ml dung dịch thử trên vào bình định mức 5,00 ml; bổ sung dung môi vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch thử 150 ppm.

- Các dung dịch trên được bảo quản trong tủ lạnh âm sâu ở -80 oC.

PL-1

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Chuẩn bị dung môi pha động: Dung dịch đệm phosphat 20 mM (pH 2,50): Cân chính xác 1,6320 g KH2PO4 vào cốc có mỏ 100 ml, hòa tan trong 80 ml nước cất hai lần. Rót vào bình định mức 500,0 ml, thêm nước vừa đủ. Lắc đều. Chỉnh đến pH 2,50 bằng dung dịch H 3PO4 20 mM

N

(210 µl H3PO4 đặc pha trong 200 ml nước trong bình định mức).

H

Ơ

Phụ lục 2: Sắc kí đồ

.Q 226 nm

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

IMI

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

ẠO

CIL

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

IMI

A

10 00

B

312 nm

CIL IMI

TO

ÁN

-L

226 nm

Í-

H

Ó

2. ACN : CH3COOH 0,1% = 70:30, 1 ml/phút

312 nm

IMI

D

IỄ N

Đ

ÀN

http://daykemquynhon.ucoz.com

1. ACN : đệm phosphat 5 mM, pH 6,80 = 70:30, 1 ml/phút

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

Sắc kí chuẩn hỗn hợp 150 ppm chạy trên cột Ascentis Silica với các pha động

PL-2

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

3. ACN : HCOOH 10 mM = 70:30, 1 ml/phút CIL IMI

312 nm

H Ư

226 nm

IMI

10 00

B

TR ẦN

CIL

IMI

Í-

H

Ó

A

312 nm

ÁN

-L

5. ACN : nước = 70:30, tốc độ 1 ml/phút

CIL

312 nm

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

226nm nm 226

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

N

G

Đ

4. ACN : H3PO4 0,1% = 70:30, 1 ml/phút

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

.Q

ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

IMI

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

N

H

Ơ

N

226 nm

PL-3

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

Í-

-L A

Ó

H

Lần 4

B

10 00 TR ẦN G

Lần 3

N

H Ư

ẠO

Đ

TP

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú CIL IMI

CIL IMI

Lần 5

CIL

IMI

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

U Y

.Q

CIL

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ÁN

TO Lần 2

IMI

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÀN

Đ

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Ơ

H

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Sắc kí đồ độ phù hợp hệ thống ở bước sóng 226 nm

Lần 1 CIL IMI

Lần 6

CIL

IMI

PL-4

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

Í-

-L A

Ó

H

Lần 4

B

10 00 TR ẦN

Lần 3

G

N

H Ư

ẠO

Đ

TP

Lần 5

Lần 6

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú IMI

IMI

IMI

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

U Y

.Q

IMI

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ÁN

TO Lần 2

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÀN

Đ

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Ơ

H

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Sắc kí đồ độ phù hợp hệ thống ở bước sóng 312 nm

Lần 1 IMI

IMI

PL-5

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

ÁN

TO

A

Ó

H B

10 00 TR ẦN

Chuẩn đơn CIL

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú CIL

Chuẩn hỗn hợp

CIL IMI

G

N

H Ư

ẠO

Đ

TP

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Í-

-L

U Y

.Q

Placebo

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÀN

Đ

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Ơ

H

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Sắc kí đồ độ chọn lọc ở bước sóng 226 nm

Dung môi pha mẫu

Mẫu thử

CIL

IMI

PL-6

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

Í-

-L A

Ó

H B

10 00

Chuẩn đơn IMI

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

TR ẦN G

N

H Ư

ẠO

Đ

TP

Chuẩn hỗn hợp

Mẫu thử IMI

IMI

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

U Y

.Q

Placebo

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ÁN

TO

N

Ơ

H

N

Dung môi pha mẫu

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÀN

Đ

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Sắc kí đồ độ chọn lọc ở bước sóng 312 nm

IMI

PL-7

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

Í-

-L A

Ó

H B

10 00 TR ẦN

150 ppm

G

N

H Ư

ẠO

Đ

IMI

200 ppm

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú CIL IMI

CIL IMI

CIL

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

CIL

TP

U Y

.Q

100 ppm

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ÁN

TO

N

Ơ

H

N

75 ppm

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÀN

Đ

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Sắc kí đồ khoảng tuyến tính ở bước sóng 226 nm

CIL IMI

250 ppm

IMI

PL-8

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

Í-

-L A

Ó

H B

10 00

150 ppm

TR ẦN G

N

H Ư

ẠO

Đ

250 ppm

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú IMI

200 ppm

IMI

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

U Y

N

Ơ

H

N

IMI

.Q

100 ppm

TP

IMI

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

ÁN

TO 75 ppm

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÀN

Đ

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon http://daykemquynhon.blogspot.com

Sắc kí đồ khoảng tuyến tính ở bước sóng 312 nm

IMI

PL-9

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial