Xây dựng phương pháp định lượng Rivaroxaban trong viên nén bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (2020)

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

vectorstock.com/1593604

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection

Xây dựng phương pháp định lượng Rivaroxaban trong viên nén bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (2020) WORD VERSION | 2021 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG RIVAROXABAN TRONG VIÊN NÉN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT Mã sinh viên: 1501534

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG RIVAROXABAN TRONG VIÊN NÉN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Thuận Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hóa Dược, Đại học Dược Hà Nội 2. Viện công nghệ Dược phẩm Quốc Gia

HÀ NỘI - 2020

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Thị Thuận – giảng viên bộ môn Hóa Dược, Đại học Dược Hà Nội đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết để giảng dạy và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu khoa học tại bộ môn.

Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn chân thành đến PGS. TS Nguyễn Ngọc Chiến cùng toàn thể giảng viên, cán bộ, kỹ thuật viên tại Viện Công Nghệ Dược phẩm Quốc Gia, Bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt khóa luận này.

Cuối cùng tôi xin cảm ơn sự động viên, giúp đỡ từ gia đình và bạn bè trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài.

Do năng lực của bản thân có hạn, đề tài này không tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp để hoàn thiện nghiên cứu này.

Hà Nội, ngày 15 tháng 6 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Ánh Tuyết

MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN................................................................................. 2 1.1.

Tổng quan về Rivaroxaban ................................................................... 2

1.1.1. Công thức hóa học và tính chất hóa lí ............................................. 2 1.1.2. Đặc điểm dược động học [14] ........................................................... 2 1.1.3. Tác dụng dược lý ............................................................................... 3 1.1.4. Chỉ định, chống chỉ định .................................................................. 3 1.1.5. Một số chế phẩm chứa hoạt chất Rivaroxaban được lưu hành tại Việt Nam…………………………………………………………………………..3 1.2.

Các phương pháp phân tích đã công bố .............................................. 4

1.3 Sơ lược phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ..................................... 6 1.3.1. Khái niệm ............................................................................................. 6 1.3.2. Các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao .................................................... 6 1.3.3. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký ............................ 7 1.3.4. Cấu tạo hệ thống HPLC ...................................................................... 7 1.4. Vài nét về thẩm định phương pháp phân tích ...................................... 10 1.4.1. Tính đặc hiệu ..................................................................................... 10 1.4.2. Độ đúng .............................................................................................. 10 1.4.3. Độ chính xác ...................................................................................... 10 1.4.4. Độ tuyến tính ...................................................................................... 11 1.4.5. Khoảng xác định ................................................................................ 11

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 12 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu ................................ 12 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................... 12 2.1.2. Nguyên vật liệu, dung môi, hóa chất ................................................ 12 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ .............................................................................. 12 2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 13 2.2.1. Khảo sát xây dựng phương pháp phân tích ..................................... 13 2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích .................................................. 13 2.2.3. Ứng dụng phương pháp đã thẩm định để kiểm tra chất lượng viên nén bao phim Rivaroxaban 15 mg ....................................................................... 13 2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 13 2.3.1. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu ............................................................ 13 2.3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký .................................................................. 14 2.3.3. Thẩm định quy trình phân tích ......................................................... 14 2.3.4. Ứng dụng thực tế ............................................................................... 16 2.4. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................... 16 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................ 17 3.1. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu ................................................................. 17 3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký ........................................................................ 17 3.2.1. Khảo sát bước sóng phát hiện ........................................................... 17 3.2.2. Khảo sát pha động ............................................................................. 18 3.3. Thẩm định phương pháp định lượng Rivaroxaban bằng HPLC ........ 20 3.3.1.Độ phù hợp hệ thống .......................................................................... 20 3.3.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ................................................. 20 3.3.3. Độ đặc hiệu ........................................................................................ 21

3.3.4. Độ đúng .............................................................................................. 22 3.3.5. Độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian) ..................... 23 3.4. Áp dụng kiểm nghiệm viên nén Rivaroxaban 15 mg. .......................... 25 3.4.1. Định lượng ......................................................................................... 25 3.4.2. Thử độ hòa tan ................................................................................... 25 3.5. Bàn luận .................................................................................................... 27 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT......................................................... 29 4.1. Kết luận ..................................................................................................... 29 4.2. Đề xuất ...................................................................................................... 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 30 PHỤ LỤC............................................................................................................. 32

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu

Chú thích

ACN

Acetonitril

ATC

Hệ thống phân loại giải phẫu - điều trị - hoá học

C18

Octadecylsilan

C max

Nồng độ cực đại

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DVT

Huyết khối tĩnh mạch sâu

ELSD

Detector tán xạ bay hơi

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC–MS/MS

Sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ

HPTLC

Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao

Log P

Hệ số phân bố dầu nước

MeOH

Methanol

NOAC PE

Thuốc chống đông đường uống không kháng vitamin K Thuyên tắc phổi

r

Hệ số tuyến tính

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

RXN

Rivaroxaban

TLC

Sắc ký lớp mỏng

TLTK tR

Tài liệu tham khảo Thời gian lưu

v/v

Thể tích/thể tích

Vss

Thể tích phân bố

DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Một số chế phẩm chứa hoạt chất Rivaroxaban đượợc lưu hành tại Việt Nam Bảng 1.2. Các phương pháp phân tích Rivaroxaban bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Bảng 3.1. Kết quả độ phù hợp hệ thống Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ tuyến tính Bảng 3.3. Độ thu hồi Rivaroxaban Bảng 3.4. Kết quả độ chính xác trong ngày (ngày thứ nhất) Bảng 3.5. Kết quả độ chính xác khác ngày (ngày thứ 2) Bảng 3.6. Kết quả độ chính xác khác ngày (ngày thứ 3) Bảng 3.7. Giá trị RSD độ chính xác trong ba ngày Bảng 3.8. Kết quả định lượng viên nén bao phim Rivaroxaban 15 mg Bảng 3.9. Kết quả định lượng Rivaroxaban trong dung môi MeOH:H2O (50:50, v/v) và trong môi trường thử độ hòa tan Bảng 3.10. Kết quả thử độ hòa tan viên nén bao phim Rivaroxaban 15 mg

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Công thức cấu tạo Rivaroxaban Hình 3.1. Phổ xác định bước sóng hấp thụ của mẫu chuẩn Rivaroxaban.

Hình 3.2. Phổ xác định bước sóng hấp thụ của mẫu thử Rivaroxaban Hình 3.3. Sắc ký đồ Rivaroxaban khi chạy pha động ACN : H2O (55:45, v/v) Hình 3.4. Sắc ký đồ Rivaroxaban khi chạy pha động MeOH : H2O (55:45, v/v) Hình 3.5. Sắc ký đồ Rivaroxaban khi chạy pha động MeOH : H2O(50:50, v/v) Hình 3.6. Sắc ký đồ placebo Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của Rivaroxaban Hình 3.8. Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu thử độ hòa tan

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay thuốc chống đông máu được kê đơn rộng rãi trong phòng và điều trị các bệnh về tim và mạch máu như: Nhồi máu cơ tim, huyết khối tĩnh mạch sâu và thuyên tắc phổi… Các nhóm thuốc chống đông truyền thống bao gồm: Heparin và chất đối kháng vitamin K (Coumarin), trong đó Wafarin là thuốc được sử dụng rộng rãi nhất. Tuy nhiên Wafarin có chỉ số điều trị hẹp, tỷ lệ chảy máu cao và cần theo dõi đông máu thường xuyên, dẫn đến nhu cầu phát triển các thuốc chống đông máu mới hiệu quả hơn.

Các thuốc chống đông đường uống không kháng vitamin K (NOAC) ra đời đã giải quyết được các nhược điểm trên. Thuốc khởi phát tác dụng nhanh hơn, hiệu quả hơn, tác dụng chống đông được dự đoán tốt hơn vì thế không cần theo dõi thường xuyên và chỉnh liều như Wafarin. Các đại diện của nhóm này bao gồm: Rivaroxaban, Edoxaban, Epixaban…

Rivaroxaban được cấp phép lưu hành tại Mỹ vào năm 2011 [12]. Hiện tại ở Việt Nam đã có một số công ty tiến hành nghiên cứu, làm thủ tục đăng ký để được phép sản xuất thuốc generic với hoạt chất rivaroxaban. Trong quá trình nghiên cứu, để đánh giá chất lượng thuốc, việc xây dựng phương pháp định lượng là rất cần thiết. Từ đó chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng Rivaroxaban trong viên nén bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với mục đích: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Rivaroxaban bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).

2. Áp dụng phương pháp đã thẩm định, định lượng và đánh giá độ hòa tan viên nén bao phim Rivaroxaban 15 mg do Viện công nghệ dược phẩm Quốc gia nghiên cứu sản xuất.

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1.

Tổng quan về Rivaroxaban

1.1.1. Công thức hóa học và tính chất hóa lí

Hình 1.1. Công thức cấu tạo Rivaroxaban - Tên khoa học: 5-chloro-N-[[(5S)-2-oxo-3-[4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]-1,3oxazolidin-5-yl]methyl]thiophene-2-carboxamide.

- Mã ATC: B01AF01.

- Công thức phân tử: C19H18ClN3O5S. - Khối lượng phân tử: 435,9 g/mol.

- Tính chất hóa lý: + Bột kết tinh mầu trắng đến vàng, không mùi, không tan trong nước và dung môi phân cực, ít tan trong dung môi hữu cơ (aceton, polyethylen glycol 400), tan được trong Acetonitril, MeOH. Log P = 2,18. + Trong dung môi MeOH, rivaroxaban hấp thụ tử ngoại với bước sóng cực đại 248 nm [13].

1.1.2. Đặc điểm dược động học [14] Sinh khả dụng: Rivaroxaban có sinh khả dụng phụ thuộc vào liều. Đối với liều 10 mg, sinh khả dụng là khoảng 80 - 100% và không bị ảnh hưởng bởi thức ăn. Sinh khả dụng của liều 20 mg uống khi đói là 66%.

Hấp thu: Rivaroxaban được hấp thu nhanh chóng, nồng độ cực đại (C max) đạt được sau 2 - 4 giờ uống thuốc. Hấp thu của Rivaroxaban phụ thuộc vào vị trí giải phóng của thuốc trong đường tiêu hóa. Thuốc hấp thu tốt nhất tại dạ dày.

2

Phân bố: Rivaroxaban có khả năng liên kết với protein huyết tương cao, khoảng 92% đến 95%. Thể tích phân bố của Rivaroxaban (Vss) khoảng 50 lít.

Chuyển hóa: Rivaroxaban được chuyển hóa thông qua enzyme CYP3A4 và CYP2J2.

Thải trừ: Sau uống thuốc, khoảng 2/3 lượng thuốc được chuyển hóa, trong đó, một nửa được thải trừ hoàn toàn và nửa còn lại được thải trừ qua đường phân. 1/3 lượng thuốc còn lại bài tiết nguyên vẹn qua nước tiểu. Thời gian bán hủy của thuốc là từ 5 đến 9 giờ ở người trẻ và 11 đến 13 giờ ở người cao tuổi.

1.1.3. Tác dụng dược lý Rivaroxaban là một chất ức chế Xa yếu tố trực tiếp có tính chọn lọc cao. Sự ức chế yếu tố Xa làm gián đoạn con đường đông máu nội sinh và ngoại sinh, ức chế sự hình thành thrombin và sự phát triển của thrombi. Rivaroxaban không ức chế thrombin (yếu tố kích hoạt II) và không có tác dụng trên tiểu cầu.

1.1.4. Chỉ định, chống chỉ định Chỉ định: Phòng ngừa huyết khối tĩnh mạch ở bệnh nhân trưởng thành trải qua phẫu thuật thay khớp háng hoặc khớp gối. Điều trị và phòng ngừa huyết khối tĩnh mạch sâu và tắc mạch phổi.

Chống chỉ định: Rivaroxaban chống chỉ định trong các trường hợp sau: + Đối tượng có nguy cơ chảy máu cao + Bệnh nhân được điều trị đồng thời với bất kỳ thuốc chống đông máu khác + Bệnh gan liên quan đến rối loạn đông máu + Phụ nữ mang thai và cho con bú.

1.1.5. Một số chế phẩm chứa hoạt chất Rivaroxaban được lưu hành tại Việt Nam Một số chế phẩm chứa hoạt chất Rivaroxaban được cấp phép lưu hành tại Việt Nam được thể hiện trong Bảng 1.1.

3

Bảng 1.1. Một số chế phẩm chứa hoạt chất Rivaroxaban đượợc lưu hành tại Việt Nam

STT

Tên thuốc

Hoạt chất, hàm lượng

Dạng bào chế

Tên công ty đăng ký

1

Abmuza

Rivaroxaban 15 mg

Viên nén bao phim

Công ty cổ phần dược phẩm Me Di Sun

2

Xelostad 10

Rivaroxaban 10mg

Viên nén bao phim

Công ty TNHH Stada-Việt Nam.

3

Xarelto

Rivaroxaban 15mg

Viên nén bao phim

Bayer (South East Asia) Pte., Ltd.

4

Xarelto

Rivaroxaban 20mg

Viên nén bao phim

Bayer (South East Asia) Pte., Ltd.

5

Langitax 15

Rivaroxaban 15 mg

Viên nén bao phim

Công ty cổ phần dược phẩm Medbolide

1.2.

LD

Các phương pháp phân tích đã công bố Việc nghiên cứu, xây dựng phương pháp định lượng Rivaroxaban đã được tiến hành

với nhiều phương pháp khác nhau như: Phương pháp quang phổ UV-VIS [5], [8], sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ (HPLC–MS/MS) [10], phương pháp sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) [7], phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [4], [6], [9], [11]…Trong các phương pháp phân tích ở trên, HPLC là phương pháp phổ biến hơn cả, do tính đơn giản và độ nhạy cao của phương pháp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu phương pháp định lượng Rivaroxaban bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Các phương pháp phân tích Rivaroxaban bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao đã nghiên cứu được sơ lược trong Bảng 1.2 dưới đây:

4

Bảng 1.2. Các phương pháp phân tích Rivaroxaban bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Điều kiện phân tích Bước sóng Tốc độ Cột sắc ký Pha động STT phân dòng tích 0,1% acid C18 acetic 250 1,0 1 (250×4,6mm, băng: ACN nm ml/phút 5µm) (30:70 %v/v) ACN: MeOH: C18 H3PO4 234 1,5 2 (250×4,6mm, 0,1% nm ml/phút 5µm) (90:8:2), pH 4,06 MachereyChương Nagel trình Nucleodur gradient C18 (250 x 254 1,5 3 của hỗn 4,6 mm, nm ml/phút hợp: 5m).

Acetonitrile Nhiệt độ cột: và nước 35oC Cột C18, Phenomenex ACN: 251 250 x 4,6 1,2 4 Nước nm mm, 5 μm. ml/phút (55:45 v/v) Nhiệt độ cột: 35°C

Nền mẫu

TLTK

20l

Viên nén

[9]

Acid acetic 0,1%: 20l ACN (30:70 % v/v)

Viên nén

[6]

Viên nén

[4]

Viên nén

[11]

Thể tích tiêm

20l

Dung môi pha mẫu

DMSO

20l ACN:Nước (75:25 v/v)

Các tài liệu tham khảo ở trên đều sử dụng phương pháp HPLC với detector UV, dùng cột C18 để phân tích, tốc độ dòng trong khoảng 1,0-1,5 ml/phút. Vì thế trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên sử dụng phương pháp HPLC detector UV, cột C18 với tốc độ dòng 1,0 ml/phút.

5

1.3 Sơ lược phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 1.3.1. Khái niệm Sắc ký là kỹ thuật phổ biến sử dụng trong phân tích, được định nghĩa là một tập hợp các kỹ thuật được sử dụng để tách các thành phần trong hỗn hợp, dựa trên sự khác biệt giữa hệ số phân bố của chất phân tích với pha động và pha tĩnh. Có nhiều loại kỹ thuật sắc ký khác nhau là sắc ký giấy, sắc ký khí, sắc ký lỏng , sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký trao đổi ion và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography HPLC) được cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển, trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ, dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân bố theo kích cỡ. Chất phân tích di chuyển qua cột chứa pha tĩnh. Hệ số phân bố của chất phân tích giữa 2 pha quyết định đến thứ tự rửa giải khỏi cột.

1.3.2. Các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng phân bố hiệu năng cao: Pha tĩnh là chất lỏng, gồm 2 dạng: + Sắc ký lỏng - lỏng: Pha tĩnh là lớp chất lỏng bao quanh hạt chất mang rắn. + Sắc ký pha liên kết: Pha tĩnh có liên kết hóa học với bề mặt chất mang rắn (silica, alumina…). Pha tĩnh có thể là phân cực hoặc không phân cực. Trong sắc ký pha thuận, pha tĩnh là chất lỏng phân cực, trong sắc ký pha đảo, pha tĩnh không phân cực.

Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao: Pha tĩnh là chất rắn phân cực, lưu giữ chất phân tích nhờ lực hấp phụ.

Sắc ký trao đổi ion: Pha tĩnh là chất trao đổi ion, la các polymer không tan trong nước, mang các nhóm trao đổi ion, bao gồm chất trao đổi anion và chất trao đổi cation.

[2]

6

1.3.3. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký 1.3.3.1 Lựa chọn cột (pha tĩnh) Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp có nhiều thành phần. Pha tĩnh có bản chất là chất rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ và đường kính cỡ hạt từ 3 – 10 µm.

Yêu cầu của pha tĩnh: Phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký, có khả năng tách trong điều kiện nhất định, tính chất bề mặt ổn định, cân bằng động học của sự tách xảy ra nhanh và lặp lại tốt, cỡ hạt phải đồng nhất.

1.3.3.2. Lựa chọn pha động cho HPLC Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất cần phân tích ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký. Pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp. Pha động có thể là nước, dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định.

Yêu cầu: Phải trơ đối với pha tĩnh, phải hòa tan được chất mẫu, ổn định theo thời gian, có độ tinh khiết cao, nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.

Trong sắc ký pha thuận thì pha động thường là các dung môi hữu cơ ít phân cực như: n-hexan, n-hepta, benzen…

Trong sắc ký pha đảo thì dung môi pha động thường là hệ dung môi phân cực như: Nước, methanol, acetonitril hay hỗn hợp của chúng.

1.3.3.3. Chọn tốc độ dòng Sau khi có pha động, pha tĩnh thích hợp thì cần phải lựa chọn tốc độ dòng cho pha động để quá trình tách tốt hơn.

Yêu cầu: Tốc độ dòng không quá lớn nhằm tránh tạo áp suất cao trong cột, gây tổn hại cột sắc ký và cho thời gian lưu của chất phân tích hợp lí.

1.3.4. Cấu tạo hệ thống HPLC Cấu tạo chung của hệ thống HPLC gồm một số bộ phận được kết nối với nhau, bao gồm: 7

+ Hệ thống cấp pha động + Hệ thống bơm + Bộ phận tiêm mẫu + Cột và pha tĩnh + Detector + Bộ phận thu nhận và xử lý tín hiệu.

1.3.4.1. Hệ thống cấp pha động Pha động trong sắc ký lỏng thường là hai dung môi hòa tan vào nhau với tỷ lệ được khảo sát để tối ưu hóa quá trình phân tách. Pha động trước khi sử dụng cần lọc qua màng lọc 0,45 µm và đuổi bọt khí (bằng siêu âm hoặc sục khí trơ).

Có 2 cách dùng pha động: + Chế độ đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký. + Chế độ gradient: Pha động thường gồm 2-4 loại dung môi với tỷ lệ các pha thay đổi trong quá trình chạy sắc ký nhằm nâng cao hiệu quả phân tách.

1.3.4.2. Hệ thống bơm: Dùng hệ thống bơm cao áp để đẩy pha động và chất phân tích qua cột sắc ký, thực hiện quá trình chia tách. Bơm phải tạo được áp suất cao khoảng 3000- 6000 PSI hoặc 250 at đến - 500 at (1at = 0,98 bar) và bơm phải tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 9,999 ml/phút. Lưu lượng bơm càng cao (tốc độ dòng càng lớn) thì áp suất trong cột càng lớn, cần khảo sát để có tốc độ dòng phù hợp, không ảnh hướng đến chất lượng cột.

1.3.4.3. Bộ phận tiêm mẫu (injection): Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy. Với dung tích của cột là 5-100 l. Có 02 cách lấy mẫu vào trong cột: Tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động (autosampler).

1.3.4.4. Cột HPLC (pha tĩnh): Cột thường được làm bằng thép không gỉ, có chiều dài và đường kính trong () khác nhau. Cấu tạo của cột bao gồm: 8

+ Cột chính (chứa các hạt nhồi) được bảo vệ bằng một lớp nhôm. Các loại cột khác nhau có loại, lượng và kích thước hạt nhồi khác nhau, số đĩa lý thuyết trong cột khác nhau. Hạt nhồi thường có kích thước 5 hoặc 10 m. + Cột bảo vệ: Được đặt trước cột chính để loại các chất có mặt trong pha động và chất phân tích, có chiều dài ngắn hơn nhưng có cùng loại hạt nhồi như cột chính.

Phần lớn quá trình phân tách được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nhưng cột có thể được làm nóng nhằm thu được hiệu quả cao hơn. Tuy nhiên, nhiệt độ cột cũng không được phép vượt quá 60oC vì có thể xảy ra hiện tượng phân huỷ của pha tĩnh hoặc sự thay đổi thành phần của pha động. [2] 1.3.4.5. Detector: Là bộ phận phát hiện các chất khi có chất ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên săc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Detector phải có đáp ứng nhanh, lặp lại, có độ nhạy cao, phát hiện chất phân tích ở nồng nồng độ hoặc khối lượng nhỏ, đáo ứng khoảng nồng độ chất phân tích rộng, hoạt động ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng.

Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp. Các lọai detector thường sử dụng: + Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm. + Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang. + Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang. + Loại hiện đại đại hơn có Detector Diod Array, ELSD (Detector tán xạ ánh sáng bay hơi) các detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất.

1.3.4.6. Bộ phận ghi tín hiệu Sử dụng phần mềm để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang. Tín hiệu bao gồm: Sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của pic, chiều cao… Các máy thế hệ mới có thể 9

lưu tất cả các thông số, phổ đồ và các thông số của pic như tính đối xứng, hệ số phân giải, lập đường chuẩn....

1.4. Vài nét về thẩm định phương pháp phân tích Việc thẩm định quy trình phân tích là nhằm chứng minh quy trình đó có phù hợp với mục đích ứng dụng không. Trong nghiên cứu này, việc thẩm định phương pháp phân tích được tiến hành theo “Hướng dẫn của ASEAN về thẩm định quy trình phân tích” [3]. Theo hướng dẫn này, đối với phương pháp định lượng, cần thẩm định các chỉ tiêu sau: + Độ đúng + Độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian) + Tính đặc hiệu + Độ tuyến tính + Khoảng xác định 1.4.1. Tính đặc hiệu Tính đặc hiệu là khả năng đánh giá chắc chắn một chất phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể có trong mẫu thử. Thông thường các thành phần này gồm các tạp chất, sản phẩm phân huỷ, chất nền...

1.4.2. Độ đúng Độ đúng của một quy trình phân tích biểu diễn sự đồng nhất giữa giá trị tìm thấy với giá trị thực hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận.

1.4.3. Độ chính xác Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả sự thống nhất (mức độ phân tán) kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mô tả. Độ chính xác có thể chia thành 3 cấp: Độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ tái lặp. Độ chính xác nên được thử trên một mẫu thử thực, đồng nhất.

10

+ Độ lặp lại: Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại còn được gọi là độ chính xác trong cùng điều kiện định lượng. + Độ chính xác trung gian: Độ chính xác trung gian diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm được thực hiện ở các ngày khác nhau, kiểm nghiệm viên khác nhau và thiết bị khác nhau. + Độ tái lặp: Độ tái lặp diễn tả độ chính xác giữa các phòng thí nghiệm.

1.4.4. Độ tuyến tính Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả kết quả phân tích thu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử.

1.4.5. Khoảng xác định Khoảng xác định của một quy trình phân tích là khoảng cách giữa nồng độ trên và dưới của chất phân tích trong mẫu thử (bao gồm cả các nồng độ này), trong khoảng nồng độ này, quy trình phân tích đã được chứng minh đáp ứng độ chính xác, độ đúng và tính tuyến tính.

11

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Chế phẩm viên nén bao phim Rivaroxaban 15 mg, do Viện công nghệ dược phẩm quốc gia sản xuất.

2.1.2. Nguyên vật liệu, dung môi, hóa chất - Chất đối chiếu: Rivaroxaban + Nhà sản xuất: Jiangxi Synergy Pharmaceutical Co., Ltd., Jiangxi Province, P.R. China. + Số lô: 201829. + Hạn dùng: 06/03/2020. + Hàm lượng: 99,8%.

- Dung môi: + Acetonitril (dùng cho HPLC), hãng sản xuất: Merk KGaA. + Methanol (dùng cho HPLC), hãng sản xuất: Fisher. + Nước cất hai lần.

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ - Thiết bị: + Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao: Hãng Shimadzu, model: L20155518195, cột Shim-pack GIST C18 (150 x 4,6mm; 5µm). + Bộ lọc dung môi (màng lọc 0,45 µm). + Máy lọc hút chân không. + Cân phân tích Mettler Toledo 21 XPE 105. + Máy siêu âm. + Tủ lạnh Sanyon MDF U333. + Tủ sấy Memmert ULM 500. + Máy cất nước hai lần Hamilton.

12

- Dụng cụ: + Bình định mức chính xác, pipet chính xác, quả bóp cao su và các dụng cụ thủy tinh khác.

2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Khảo sát xây dựng phương pháp phân tích 2.2.1.1. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu.

- Khảo sát dung môi và tỷ lệ dung môi pha mẫu.

2.2.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký: - Bước sóng phát hiện - Pha động và tỷ lệ pha động 2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích - Độ phù hợp hệ thống - Khoảng tuyến tính và đường chuẩn - Độ đặc hiệu - Độ đúng - Độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian) 2.2.3. Ứng dụng phương pháp đã thẩm định để kiểm tra chất lượng viên nén bao phim Rivaroxaban 15 mg 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu Dựa vào độ tan của Rivaroxaban và điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi khảo sát ba dung môi xử lý mẫu là ACN, MeOH và MeOH:H2O (50:50 v/v).

- Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 15 mg chuẩn Rivaroxaban vào bình định mức 100 ml thêm khoảng 70 ml dung môi nghiên cứu, siêu âm 30 phút, định mức tới vạch bằng dung môi nghiên cứu, được dung dịch có nồng độ khoảng 150 g/ml. Các mẫu được 13

lọc qua giấy lọc, dịch lọc được pha loãng 10 lần bằng pha động, lọc tiếp qua màng lọc kích thước 0,45 m và tiến hành tiêm sắc ký.

- Mẫu thử: Cân chính xác lượng bột viên chế phẩm tương ứng khoảng 15 mg Rivaroxaban vào bình định mức 100 ml, tiến hành xử lý tiếp như chuẩn bị mẫu chuẩn.

2.3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký Chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện sắc kí sau: - Khảo sát bước sóng phát hiện: Chọn bước sóng sao cho tại đó đáp ứng của chất phân tích là tối ưu.

- Pha động và tỉ lệ pha động: Khảo sát với pha động là ACN : H2O (tỷ lệ 55:45 v/v); MeOH : H2O (tỷ lệ 55: 45 v/v), MeOH : H2O (tỷ lệ 50: 50 v/v). Lựa chọn pha động sao cho thời gian lưu vừa phải, pic của chất phân tích cân đối, sắc nét.

2.3.3. Thẩm định quy trình phân tích Tiến hành thẩm định phương pháp định lượng theo “Hướng dẫn của ASEAN về thẩm định quy trình phân tích” [3].

2.3.3.1. Độ phù hợp hệ thống Phân tích sắc ký lặp lại 6 lần mẫu chuẩn Rivaroxaban có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính, ghi lại sắc ký đồ. Đánh giá tính thích hợp của hệ thống về thời gian lưu và diện tích pic của Rivaroxaban. Giá trị RSD của thời gian lưu ≤ 2,0% và diện tích pic phải ≤ 2,0% nếu không có quy định khác. Trường hợp giá trị RSD>2%, phải có sự giải thích phù hợp.

2.3.3.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn Từ dung dịch chuẩn gốc nồng độ chính xác khoảng 150 g/ml trong MeOH, pha loãng với hỗn hợp dung môi MeOH:H2O (50:50 v/v) để được các dung dịch làm việc có nồng độ Rivaroxaban đạt 70% - 80% - 90% - 100% - 110% - 125% so với nồng độ dung dịch thử dự kiến (tương ứng khoảng 15 g/ml), tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính và tính hệ số tương quan r.

Yêu cầu: Đường hồi quy có dạng đường thẳng và hệ số tương quan (r) phải ≥ 0,999.

14

2.3.3.3. Độ đặc hiệu: So sánh đáp ứng của mẫu trắng (có thành phần tá dược như viên thử nhưng không có Rivaroxaban), mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu trắng thêm chuẩn, phân tích trong cùng điều kiện.

Yêu cầu: Mẫu trắng không xuất hiện pic của chất phân tích tại thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu chuẩn. Mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu trắng thêm chuẩn có thời gian lưu của chất phân tích giống nhau.

2.3.3.4. Độ đúng Thêm một lượng chính xác chuẩn rivaroxaban tương ứng 80%, 100%, 120% so với hàm lượng viên ghi trên nhãn vào bột placebo, chuẩn bị mẫu 6 lần độc lập, tiến hành tương tự như mẫu thử, phân tích mẫu, ghi lại sắc ký đồ và tính độ thu hồi của Rivaroxaban.

Yêu cầu: Độ thu hồi của Rivaroxaban từ 98,0-102,0%, RSD ≤ 2%.

2.3.3.5. Độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian) Độ chính xác của phương pháp là mức độ đồng nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất và được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD). + Độ lặp lại: Tiến hành phân tích độc lập 6 mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ 100%, tính kết quả dựa vào đường chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện. Xác định độ lặp lại bằng cách tính RSD giá trị các lần định lượng.

Yêu cầu: RSD giữa các lần thử ≤ 2%. + Độ chính xác trung gian: Biểu thị mức độ dao động kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm được thực hiện ở các ngày khác nhau hoặc người phân tích khác nhau.

Trong cùng một điều kiện, chuẩn bị một đường chuẩn và 3 lô mẫu tự tạo, mỗi lô gồm 6 mẫu độc lập (ở ba mức nồng độ thấp, trung bình, cao) được chuẩn bị như dung dịch chuẩn làm việc. Dựa theo đường chuẩn, tính lại nồng độ hoạt chất có trong các mẫu tự tạo. Xác định độ lặp lại trong ngày bằng cách tính toán độ lệch RSD% giữa giá trị các 15

lần định lượng của mỗi nồng độ phân tích trong cùng một ngày. Xác định độ lặp lại khác ngày bằng cách tính toán độ lệch RSD% giữa giá trị các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong ít nhất 3 ngày khác nhau.

Yêu cầu: Độ chính xác trong ngày RSD ≤ 2%, gộp kết quả của 3 ngày RSD ≤ 2%.

2.3.4. Ứng dụng thực tế Ứng dụng phương pháp đã thẩm định để phân tích 2 lô nghiên cứu (lô NC 04 và lô NC 09) do Viện công nghệ dược phẩm quốc gia nghiên cứu sản xuất. Tiến hành định lượng hàm lượng Rivaroxaban trong viên và định lượng hàm dược chất giải phóng trong phép thử độ hòa tan.

2.4. Phương pháp xử lý số liệu Kết quả thực nghiệm được xử lí bằng thống kê trên phần mềm Microsoft Office Excel 2010.

16

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu Khảo sát điện kiện xử lí mẫu trong dung môi ACN, MeOH, MeOH : H2O (50:50 v/v).

Kết quả: Sau khi siêu âm với dung môi MeOH : H2O (50:50 v/v), bột dược chất không tan hết. Với dung môi ACN, MeOH, bột dược chất đều tan, diện tích pic của Rivaroxaban thu được ở hai dung môi này là như nhau.Vì thế để thu được pic sắc ký đẹp, chúng tôi tiến hành pha mẫu trong dung môi MeOH hoặc ACN (tùy theo pha động sử dụng), sau đó pha loãng mẫu 10 lần bằng pha động.

3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký Qua tham khảo tài liệu [4], [6], [9], [11], các điều kiện sắc ký được giữ cố định như sau: - Cột sắc kí: Cột Shim-pack GIST C18 (150 x 4,6mm; 5µm).

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.

- Nhiệt độ lò cột: 350C. - Thể tích tiêm mẫu: 10 l.

3.2.1. Khảo sát bước sóng phát hiện Quét phổ UV- VIS mẫu thử và mẫu chuẩn Rivaroxaban từ 200 – 400 nm, thu được kết quả như Hình 3.1 và Hình 3.2. mAU 7.491/ 1.00

30

mAU 7.501/ 1.00

30

25

20

248

248

25

20

221

10

10

5

221

15

15

383

320

5

0

0 200

250

300

350

nm

200

Hình 3.1. Phổ xác định bước sóng hấp thụ của mẫu chuẩn Rivaroxaban.

250

300

350

Hình 3.2. Phổ xác định bước sóng hấp thụ của mẫu thử Rivaroxaban 17

nm

Nhận xét: Ở mẫu thử và mẫu chuẩn, Rivaroxaban có đỉnh hấp thụ tại 248 nm. Vì thế chúng tôi chọn bước sóng 248 nm để phân tích.

3.2.2. Khảo sát pha động Phân tích mẫu chuẩn Rivaroxaban trong MeOH với pha động là ACN : H2O (tỷ lệ 55:45 v/v); pha động MeOH : H2O (tỷ lệ 55: 45 v/v), pha động MeOH : H2O (tỷ lệ 50: 50, v/v). Sắc ký đồ của các mẫu phân tích được thể hiện trong Hình 3.3, Hình 3.4, Hình 3.5.

Sắc ký đồ của placebo được thể hiện trong Hình 3.6.

Hình 3.3. Sắc ký đồ Rivaroxaban khi chạy pha động ACN : H2O (55:45, v/v)

Hình 3.4. Sắc ký đồ Rivaroxaban khi chạy pha động MeOH : H2O (55:45, v/v)

Hình 3.5. Sắc ký đồ Rivaroxaban khi chạy pha động MeOH : H2O(50:50, v/v)

Hình 3.6. Sắc ký đồ placebo

18

Nhận xét: Trong sắc ký đồ mẫu placebo, xuất hiện 2 pic tạp (tại khoảng 2,5 phút và 5,5 phút). Khi dùng hai dung môi pha động là ACN : H2O (55:45, v/v) và MeOH : H2O (55:45, v/v), tuy thời gian phân tích ngắn nhưng hình dạng chân pic xấu, pic của chất phân tích có thể trùng với pic tạp, dẫn tới kết quả định lượng không chính xác. Với dung môi MeOH : H2O (50:50, v/v), thời gian lưu của rivaroxaban ở khoảng 7,5 phút, pic chất phân tích tách xa pic tạp trong nền mẫu, chân pic cân đối. Vì thế, sử dụng pha động MeOH : H2O (50:50, v/v) sẽ cho kết quả định lượng chính xác.

Kết luận: Chúng tôi sử dụng hệ pha động MeOH : H2O (50:50, v/v) để tiến hành phân tích.

Kết luận: Từ các khảo sát ở trên, điều kiện sắc ký và điều kiện xử lí mẫu lựa chọn là: - Điều kiện xử lí mẫu Kết luận: Từ khảo sát ở trên, chúng tôi lựa chọn điều kiện xử lí mẫu như sau: + Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 15 mg chuẩn Rivaroxaban vào bình định mức 100 ml thêm khoảng 70 ml MeOH, siêu âm 30 phút, định mức tới vạch bằng MeOH, được dung dịch có nồng độ khoảng 150 g/ml. Các mẫu được lọc qua giấy lọc, dịch lọc được pha loãng 10 lần bằng pha động MeOH : H2O (50:50, v/v), lọc tiếp qua màng lọc kích thước 0,45 m và tiến hành tiêm sắc ký. + Mẫu thử: Cân chính xác lượng bột viên chế phẩm tương ứng khoảng 15 mg Rivaroxaban vào bình định mức 100 ml, tiến hành xử lý tiếp như chuẩn bị mẫu chuẩn.

- Điều kiện sắc ký 

Cột sắc ký: Shim-pack GIST C18 (150 x 4,6mm; 5µm).



Detector phát hiện: UV 248 nm.



Pha động: MeOH : H2O (50:50, v/v).



Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.



Thể tích tiêm mẫu: 10 l.



Nhiệt độ cột: 35OC.

19

3.3. Thẩm định phương pháp định lượng Rivaroxaban bằng HPLC 3.3.1.Độ phù hợp hệ thống Kết quả độ phù hợp hệ thống khi tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn Rivaroxaban nồng độ khoảng 15 g/ml được thể hiện ở Bảng 3.1.

Bảng 3. 1. Kết quả độ phù hợp hệ thống.

STT 1 2 3 4 5 6 Trung bình (%) SD RSD (%)

Thời gian lưu (phút) 7,45 7,46 7,46 7,46 7,46 7,44 7,46 0,0084 0,11

Diện tích pic (mAU.s) 476851 476713 476046 477058 476497 476577 476624 346,48 0,07

Nhận xét: Giá trị RSD thời gian lưu của Rivaroxaban ≤ 2% và RSD diện tích pic ≤ 5%.

Kết luận: Phương pháp xây dựng đạt chỉ tiêu độ phù hợp hệ thống.

3.3.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn Tiến hành sắc ký dãy dung dịch chuẩn (chuẩn bị như đã trình bày ở mục 2.3.3.2) theo điều kiện sắc ký đã chọn. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.2 và Hình 3.7.

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ tuyến tính STT 1 2 3 4 5 6 Phương trình hồi quy tuyến tính Hệ số tương quan r

Nồng độ Rivaroxaban Diện tích pic (mAU.s) (g/ml) 10,47 331338 12,32 392681 13,55 433082 15,40 495398 18,48 590756 19,10 616056 y = 32707x – 10348 0,9998 20

800000 y = 32707x - 10348 R² = 0,9997

600000 400000 200000 9

11

13

15

17

19

21

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của Rivaroxaban Nhận xét: Đường hồi quy là đường thẳng và hệ số tương quan r = 0,9998 (> 0,999).

Kết luận: Phương pháp đạt yêu cầu về khoảng tuyến tính và đường chuẩn.

3.3.3. Độ đặc hiệu Chuẩn bị độc lập 6 mẫu trắng và các mẫu trắng thêm chuẩn (như trình bày ở mục 2.3.3.3). Tiến hành sắc ký trong điều kiện đã chọn. Kết quả được trình bày ở Hình 3.8.

Hình 3.8. Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu Chú thích: Data 1: Sắc ký đồ mẫu thử Data 2: Sắc ký đồ mẫu chuẩn Data 3: Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn Data 4: Sắc ký đồ mẫu placebo 21

Kết quả: Cả 6 mẫu trắng đều không cho tín hiệu của chất phân tích tại thời gian lưu trùng với thời gian lưu của RXN trong mẫu chuẩn. Mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu trắng thêm chuẩn có thời gian lưu giống nhau.

Kết luận: Phương pháp đã xây dựng có tính đặc hiệu cao.

3.3.4. Độ đúng Chuẩn bị các mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ 80, 100, 120 % (như trình bày ở mục 2.3.3.4). Mỗi nồng độ làm 6 mẫu độc lập, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Kết quả độ thu hồi của Rivaroxaban được trình bày ở Bảng 3.3.

Bảng 3.3. Độ thu hồi Rivaroxaban

Phép thử 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

% thêm vào

80%

100%

120%

Diện tích pic (mAU.s) 397556 389624 392143 392833 387385 394428 495451 499591 492021 494548 490688 492210 582283 600016 600820 599711 600305 599667

Lượng chuẩn thêm vào (mg)

12,32

15,40

18,48

Lượng chuẩn tìm thấy (mg) 12,25 12,01 12,08 12,11 11,93 12,16 15,32 15,45 15,21 15,29 15,17 15,22 18,04 18,60 18,62 18,59 18,61 18,59

Tỷ lệ thu hồi (%) 99,46 97,44 98,08 98,26 96,87 98,67 99,48 100,32 98,79 99,30 98,51 98,82 97,62 100,63 100,76 100,58 100,68 100,57

Trung bình (%)

RSD (%)

98,13

0,93

99,20

0,66

100,14

1,23

Nhận xét: Độ thu hồi của Rivaroxaban đều nằm trong khoảng từ 98,0-102,0%, RSD ≤ 2,0%.

Kết luận: Phương pháp đã xây dựng đạt yêu cầu về độ đúng.

22

3.3.5. Độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian) Kết quả độ chính xác trong ngày và khác ngày được thể hiện trong Bảng 3.4, Bảng 3.5, Bảng 3.6 và Bảng 3.7.

Bảng 3.4. Kết quả độ chính xác trong ngày (ngày thứ nhất) Mẫu tự tạo 1 Lượng Lượng Độ tìm STT thêm đúng vào thấy (%) (mg) (mg) 1 11,95 99,60 2 11,95 99,58 3 11,98 99,82 12,00 4 11,93 99,40 5 11,90 99,16 6 11,87 98,95 Trung bình 11,93 99,42 (%) RSD 0,32 0,32 (%)

Mẫu tự tạo 2 Lượng Lượng Độ thêm tìm đúng vào thấy (%) (mg) (mg) 14,79 98,63 14,58 97,17 14,75 98,34 15,00 14,64 97,63 14,60 97,31 14,85 98,97

Mẫu tự tạo 3 Lượng Lượng Độ thêm tìm đúng vào thấy (%) (mg) (mg) 17,47 97,07 17,64 98,00 17,56 97,57 18,00 17,53 97,41 17,53 97,41 17,61 97,84

14,70

98,01

17,56

97,55

0,76

0,76

0,36

0,34

Bảng 3.5. Kết quả độ chính xác khác ngày (ngày thứ 2) Mẫu tự tạo 1 Mẫu tự tạo 2 Mẫu tự tạo 3 Lượng Lượng Lượng Lượng Lượng Lượng Độ Độ Độ tìm thêm tìm thêm tìm STT thêm đúng đúng đúng vào thấy vào thấy vào thấy (%) (%) (%) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) 1 11,61 96,78 14,82 98,79 17,87 99,29 2 11,71 97,61 14,71 98,05 18,12 100,66 3 11,72 97,69 14,62 97,47 17,88 99,32 12,00 15,00 18,00 4 11,74 97,86 14,75 98,32 17,69 98,26 5 11,50 95,86 14,84 98,91 17,66 98,13 6 11,21 93,43 14,81 98,72 17,47 97,03 Trung bình 11,58 96,54 14,76 98,38 17,78 98,78 (%) RSD 1,76 1,76 0,56 0,56 1,27 1,27 (%)

23

Bảng 3.6. Kết quả độ chính xác khác ngày (ngày thứ 3) Mẫu tự tạo 1 Lượng Lượng Độ tìm STT thêm đúng vào thấy (%) (mg) (mg) 1 11,43 95,28 2 11,49 95,71 3 11,59 96,59 12,00 4 11,59 96,55 5 11,66 97,20 6 11,74 97,83 Trung bình 11,58 96,53 (%) RSD 0,97 0,97 (%)

Mẫu tự tạo 2 Lượng Lượng Độ thêm tìm đúng vào thấy (%) (mg) (mg) 14,57 97,16 14,74 98,29 14,52 96,81 15,00 14,74 98,27 14,77 98,46 14,60 97,32

Mẫu tự tạo 3 Lượng Lượng Độ thêm tìm đúng vào thấy (%) (mg) (mg) 17,53 97,41 17,72 98,42 17,20 95,58 18,00 17,37 96,51 17,50 97,25 17,56 97,58

14,66

97,72

17,48

97,12

0,72

0,72

1,00

1,00

Bảng 3.7. Giá trị RSD độ chính xác trong ba ngày

Mẫu tự tạo 1

Mẫu tự tạo 2

Mẫu tự tạo 3

Ngày thứ nhất (%)

Ngày thứ 2 (%)

Ngày thứ 3 (%)

99,60 99,58 99,82 99,40 99,16 98,95 98,63 97,17 98,34 97,63 97,31 98,97 97,07 98,00 97,57 97,41 97,41 97,84

96,78 97,61 97,69 97,86 95,86 93,43 98,79 98,05 97,47 98,32 98,91 98,72 99,29 100,66 99,32 98,26 98,13 97,03

95,28 95,71 96,59 96,55 97,20 97,83 97,16 98,29 96,81 98,27 98,46 97,32 97,41 98,42 95,58 96,51 97,25 97,58

24

Giá trị RSD độ chính xác của 3 ngày (%)

1,80

0,70

1,16

Nhận xét: Kết quả độ chính xác trong ngày RSD ≤ 2%, gộp kết quả của 3 ngày, RSD ≤ 2%.

Kết luận: Phương pháp đạt yêu cầu về độ chính xác.

3.4. Áp dụng kiểm nghiệm viên nén Rivaroxaban 15 mg.

Phương pháp đã được thẩm định ở trên được ứng dụng để thẩm định 02 lô viên nén bao phim Rivaroxaban trong quá trình nghiên cứu sản xuất (Lô NC 04 và lô NC 09) với hai chỉ tiêu định lượng và thử độ hòa tan.

3.4.1. Định lượng Định lượng hàm lượng dược chất trong 02 lô viên nén bao phim Rivaroxaban Lô NC 04: Khối lượng trung bình viên: 0,1678 g.

Lô NC 09: Khối lượng trung bình viên: 0,1594 g.

Kết quả định lượng được thể hiện trong Bảng 3.8.

Bảng 3.8. Kết quả định lượng viên nén bao phim Rivaroxaban 15 mg

Lô NC 04 Lô NC 09

Chuẩn Thử 1 Thử 2 Thử 3 Chuẩn Thử 1 Thử 2 Thử 3

Lượng cân (g)

Diện tích pic (mAU.s)

0,0154 0,1626 0,1616 0,1628 0,0160 0,1605 0,1589 0,1607

487100 490523 468946 488803 488973 471979 463829 480160

Hàm lượng (mg)

% so với khối lượng ghi trên nhãn (%)

Trung bình (%)

RSD (%)

16,00 15,40 15,93

106,69 102,63 106,19

105,17

2,10

15,44 15,23 15,58

102,93 101,50 103,89

102,22

0,99

3.4.2. Thử độ hòa tan Tiến hành kiểm tra nồng độ Rivaroxaban khi hòa tan trong dung môi pha mẫu (MeOH: H2O (50:50, v/v)) và môi trường thử độ hòa tan (HCl 0,1N và natri lauryl sulfat 0,75%). Từ dung dịch chuẩn Rivaroxaban 150 µg/ml trong MeOH, tiến hành pha loãng 25

10 lần với hai dung môi trên, mỗi dung môi chuẩn bị 6 mẫu trong cùng điều kiện và tiến hành tiêm sắc ký. Kết quả định lượng được thể hiện trong Bảng 3.9.

Bảng 3.9. Kết quả định lượng Rivaroxaban trong dung môi MeOH:H2O (50:50, v/v) và trong môi trường thử độ hòa tan Dung môi

MeOH: H2O (50:50, v/v)

HCl 0,1N và natri lauryl sulfat 0,75%

Mẫu Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Mẫu 6 Trung bình Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Mẫu 6 Trung bình

Thời gian lưu (phút) 7,51 7,50 7,50 7,49 7,49 7,50 7,50 7,51 7,52 7,51 7,52 7,53 7,53 7,52

Diện tích pic (mAu.s) 349096 349237 349396 348972 355452 346491 349774,00 353335 351081 348819 343327 343028 362091 350280,17

Dùng test T-student để so sánh sự khác biệt về giá trị diện tích pic trung bình của Rivaroxaban trong hai dung môi ở trên. Kết quả định lượng Rivaroxaban trong hai dung môi khác nhau không có giá trị thống kê với p = 0,875 (lớn hơn 0,05).

Tiến hành thử độ hòa tan hai lô viên nén bao phim ở trên trong môi trường HCl 0,1N và natri lauryl sulfat 0,75%, kết quả được thể hiện ở Bảng 3.10.

26

Bảng 3.10. Kết quả thử độ hòa tan viên nén bao phim Rivaroxaban 15 mg Khối lượng trung bình viên (g)

Lượng Mẫu cân thử chuẩn hòa tan (g)

Hệ số pha loãng

Chuẩn Thử 1 Thử 2 Thử 3 Thử 4 Thử 5 Thử 6 Chuẩn Thử 1 Thử 2 Thử 3 Thử 4 Thử 5 Thử 6

1000 900 900 900 900 900 900 1000 900 900 900 900 900 900

Lô NC 0,1678 0,0154 04

Lô NC 0,1594 0,0160 09

Hàm Hàm lượng lượng Diện Trung dược dược RSD tích pic bình chất giải chất giải (%) (mAU.s) (%) phóng phóng (mg) (%) 507238 300384 8,21 54,72 301768 8,25 54,97 53,83 2,85 293016 8,01 53,38 300339 8,21 54,71 298025 8,14 54,29 279499 7,64 50,91 502857 487385 13,96 93,05 480492 13,76 91,73 90,88 4,36 480716 13,77 91,77 434186 12,43 82,89 485147 13,89 92,62 488231 13,98 93,21

Nhận xét: Về phép định lượng, hai lô nghiên cứu đều cho kết quả định lượng hàm lượng dược chất trong viên cao (101,50% đến 106,69%). Về phép thử độ hòa tan, lô NC 04 có trung bình % dược chất giải phóng là 53,83%, số liệu này ở lô NC 09 là 90,88%.

Tham chiếu theo Dược điển Việt Nam V, phụ lục 11.4, lô NC 04 không đạt chỉ tiêu độ hòa tan, lô NC 09 đạt chỉ tiêu độ hòa tan.

3.5. Bàn luận Do RXN hấp thụ tử ngoại tốt, theo tác giả Mustafa Ç, Mustafa S.K và cộng sự [8], có thể xác định hàm lượng RXN bằng tử ngoại khả kiến. Tuy nhiên khi ứng dụng phương pháp này vào thử độ hòa tan trên lô NC 04, chúng tôi thấy sự sai khác lớn so với kết quả khi nghiên cứu bằng phương pháp HPLC. Kết quả thử độ hòa tan lô NC 04 bằng phương pháp UV-VIS, lượng hoạt chất giải phóng đạt 107,30%. Tuy nhiên, theo phương pháp của chúng tôi, hàm lượng dược chất giải phóng chỉ khoảng 53,83%. Sở dĩ có sự sai khác như vậy là do có một số tá dược trong công thức hấp thụ UV ở bước sóng 248 nm. Điều này được thấy rõ trong sắc ký đồ thể hiện trong Hình 3.9.

27

Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu thử độ hòa tan Như vậy, phương pháp HPLC cho kết quả định lượng chính xác hơn, không bị ảnh hưởng bởi tá dược sử dụng.

Các nghiên cứu về định lượng Rivaroxaban bằng HPLC trước đây thường pha mẫu trong dung môi ACN : MeOH (50:50, v/v), acid acetic 0,1% : ACN (30:70, v/v) hoặc dùng hỗn hợp nhiều dung môi và sử dụng chương trình gradient, một số khác cần phải thêm chất một số dung môi khác để trợ tan như DMSO [4]. Trong phương pháp đã xây dựng, chúng tôi sử dụng điều kiện sắc ký đơn giản hơn nhiều, không dùng các muối đệm, chương trình gradient, phương pháp có tốc độ dòng vừa phải, đảm bảo độ bền của cột.

Ngoài ra, dung môi MeOH và nước thường được sử dụng để rửa cột sắc kí, vì thế phương pháp của chúng tôi đơn giản và tiện lợi trong quá trình phân tích.

28

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1. Kết luận Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi đã đạt được các mục tiêu sau: - Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Rivaroxaban trong viên nén Rivaroxaban 15 mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

- Áp dụng phương pháp đã thẩm định để kiểm nghiệm 2 lô viên nén bao phim Rivaroxaban 15 mg do Viện công nghệ dược phẩm Quốc gia sản xuất. Kết quả cho thấy cả 2 lô nghiên cứu đều đạt yêu cầu về định lượng, tuy nhiên lô NC 04 không đạt về chỉ tiêu độ hòa tan. Dựa trên kết quả này, Viện công nghệ dược phẩm Quốc gia đã cải tiến công thức bào chế và sản xuất lô NC 09 đạt yêu cầu cả về định lượng và thử độ hòa tan.

4.2. Đề xuất Sử dụng phương pháp đã xây dựng để kiểm tra chất lượng thành phẩm cho các thành phẩm Rivaroxaban khác, mở rộng thử nghiệm, khảo sát phương pháp định lượng Rivaroxaban trong dịch sinh học, phục vụ cho các nghiên cứu về dược động học, dược lực học và thử tương đương sinh học.

29

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt 1. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam V, NXB Y học 2. Bộ Y tế (2007), Hóa Phân Tích Tập 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội 3. Bộ Y tế (2018), Hướng dẫn của ASEAN về thẩm định phương pháp phân tích, phụ lục 1 – Thông tư 32/2018/TT-BYT Quy định việc đăng ký lưu hành thuốc, nguyên liệu làm thuốc Tiếng Anh 4. Basima..A., Mohammad.A.A., Francois.K., Manal.D., et al (2018), “Development and of

validation rivaroxaban

of and

a

liquid

chromatography

determination

of

its

method

production

for

the

related

analysis impurities,

Pharmaceutical Chemistry Journal, pp 52 5. Chandra B.S., Vankayalapati H.B., Mittapalli R.D., et al (2013), “Development and validation of UV spectrophotometric method for the determination of rivaroxaban”, Scholars Research Library, 5(4), pp 1-5 6. Chandra. Sekhar.K., Satya vani.P., Dhana lakshimi.A, et al (2012), “A new method development and validation for analysis of rivaroxaban in formulation by RP HPLC”, Research desk, 1(1), pp 24-33.

7. Darshna V., Pinak P. (2014), “High performance thin layer chromatographic method with densitometry analysis for determination of rivaroxaban from its tablet dosage form”, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, pp 6.

8. Mustafa Ç., Mustafa S.K., Sacide A., et al (2014), “UV Spectrophotometric Method for Determination of the Dissolution Profile of Rivaroxaban”, Dissolution Technologies, November 2014, pp 56-59.

9. Rao.R.N., Reddy.L.S., Meenakshi.R. (2017), “Rp- hplc method development and validation for determination of rivaroxaban in the pure and pharmacuetical dosage form”, International Journal of Pharmacy, 7(3), pp 71-77.

10. Rohde.G. (2008), “Determination of rivaroxaban – a novel, oral, direct Factor Xa inhibitor – in human plasma by high-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry”, Journal of Chromatography B, 872, pp 43–50.

11. Suraj S., Suman K.M. (2017), “Assay comparison of rivaroxaban by new HPLC method with an existing method in tablet dosage form”, Pharmaceutical and biological evaluations, 4, pp 180-182.

Link tham khảo: 12. Rivaroxaban, < https://en.wikipedia.org/wiki/Rivaroxaban>, 22/11/2019 13. (2006). Rivroxaban, <https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Rivaroxaban>, xem 18/11/2019 14. (2008).

Xarelto 20mg film-coated <https://www.medicines.org.uk/emc/product/2793/smpc>, xem 19/11/2019

tablets,

PHỤ LỤC 1. Sắc ký đồ các mẫu đường chuẩn 2. Sắc ký đồ độ chính xác 3. Sắc ký đồ thử độ hòa tan viên nén Rivaroxaban 15 mg 4. Sắc ký đồ định lượng viên nén Rivaroxaban 15 mg

Phụ lục 1 Sắc ký đồ các mẫu đường chuẩn

Phụ lục 2 Sắc ký đồ độ chính xác

Phụ lục 3 Sắc ký đồ thử độ hòa tan viên nén Rivaroxaban 15 mg

Phụ lục 4 Sắc ký đồ định lượng viên nén Rivaroxaban 15 mg