Xây dựng phương pháp định lượng một số acid amin bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước (2020)

SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC HILIC

vectorstock.com/1593604

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection

Xây dựng phương pháp định lượng một số acid amin bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước (2020) WORD VERSION | 2021 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN ĐÌNH TẠO

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ACID AMIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN ĐÌNH TẠO MÃ SINH VIÊN: 1501441

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ACID AMIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn : 1. PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà 2. ThS. Vũ Ngân Bình Nơi thực hiện : Bộ môn Hóa phân tích và độc chất

HÀ NỘI - 2020

LỜI CẢM ƠN Khóa luận này được hoàn thành tại Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà và ThS. Vũ Ngân Bình. Để hoàn thành đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu đến từ các thầy cô, bạn bè và gia đình. Khi khóa luận đã hoàn thiện, tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến họ.

Lời đầu tiên, với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà, Th.S Vũ Ngân Bình – Giảng viên bộ môn Hóa phân tích và độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình để giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện khóa luận.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, các anh/chị kĩ thuật viên Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất đã giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình tôi thực hiện khóa luận.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè, người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu.

Cuối cùng, kính chúc thầy cô và chúc các bạn luôn mạnh khỏe, hạnh phúc, may mắn luôn mỉm cười trong cuộc sống.

Hà Nội, ngày 20 tháng 6 năm 2020 Sinh viên

Nguyễn Đình Tạo

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………………1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2 1.1. Tổng quan về các acid amin .................................................................................. 2 1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng tương tác thân nước ................................................... 3 1.2.1. Pha tĩnh .................................................................................................................. 4 1.2.2. Pha động ................................................................................................................ 4 1.2.3. Các cơ chế tách chính trong HILIC ....................................................................... 5 1.3. Sơ lược về các phương pháp định lượng acid amin ............................................ 6 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 9 2.1. Nguyên vật liệu ....................................................................................................... 9 2.1.1. Chất đối chiếu ........................................................................................................ 9 2.1.2. Chế phẩm ............................................................................................................... 9 2.1.3. Hóa chất ................................................................................................................. 9 2.2. Thiết bị, dụng cụ ..................................................................................................... 9 2.3. Nội dung nghiên cứu............................................................................................. 10 2.4. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 10 2.4.1. Quy trình chuẩn bị mẫu ....................................................................................... 10 2.4.2. Quy trình chuẩn bị dung môi pha động ............................................................... 11 2.4.3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên thời gian lưu và khả năng tách của các acid amin khi phân tích bằng HILIC ..................................................................................... 12 2.4.3.1. Pha tĩnh............................................................................................................. 12 2.4.3.2. Pha động ........................................................................................................... 12 2.4.4. Xây dựng phương pháp định lượng một số acid amin trong chế phẩm .............. 12 2.4.4.1. Khảo sát bước sóng định lượng........................................................................ 12 2.4.4.2. Khảo sát pha tĩnh.............................................................................................. 12 2.4.4.3. Khảo sát pha động ............................................................................................ 12 2.4.5. Thẩm định phương pháp phân tích ...................................................................... 13 2.4.5.1. Độ phù hợp hệ thống ........................................................................................ 13

2.4.5.2. Độ chọn lọc....................................................................................................... 13 2.4.5.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính .................................................................. 14 2.4.5.4. Độ chính xác của phương pháp ........................................................................ 14 2.4.5.5. Độ đúng ............................................................................................................ 14 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................. 16 3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên thời gian lưu và khả năng tách các acid amin............................................................................................................................... 16 3.1.1. Ảnh hưởng của pha tĩnh ...................................................................................... 16 3.1.2. Ảnh hưởng của pha động..................................................................................... 16 3.1.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ ACN ................................................................................. 16 3.1.2.2. Ảnh hưởng của bản chất acid/muối.................................................................. 18 3.1.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ acid/muối .................................................................. 19 3.2. Xây dựng phương pháp định lượng một số acid amin trong chế phẩm.......... 20 3.2.1. Xử lý mẫu ............................................................................................................ 20 3.2.2. Khảo sát bước sóng định lượng ........................................................................... 20 3.2.3. Lựa chọn các điều kiện sắc ký ............................................................................. 21 3.3. Thẩm định phương pháp ..................................................................................... 23 3.3.1. Độ phù hợp hệ thống ........................................................................................... 23 3.3.2. Độ chọn lọc .......................................................................................................... 24 3.3.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính ..................................................................... 24 3.3.4. Độ chính xác của phương pháp ........................................................................... 26 3.3.5. Độ đúng. .............................................................................................................. 26 3.4. Ứng dụng phương pháp phân tích chế phẩm trên thị trường ......................... 27 3.5. Bàn luận ................................................................................................................. 28 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 30 4.1. Kết luận ................................................................................................................. 30 4.2. Kiến nghị ............................................................................................................... 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt ACN ADN AQC DABS-Cl DMF ESI FOMC GC HILIC HPLC MS NBD-Cl NP-LC OPA PHE PITC RP-LC RSD THF TRP TYR UPLC UV

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Acetonitril Deoxyribonucleic acid 6-aminoquinolyl-Nhydroxysuccinimidyl carbamate Dimethylaminoazobenzensulfonyl chlorid Dimethylformamide Electrospray ionisation 9-fluorenylmethyl chloroformate Gas Chromatography Hydrophilic interaction chromatography High performance liquid chromatography Mass spectrometry 4-chloro-7-nitrobenzofurazan Normal phase liquid chromatography ortho-phthalaldehyde Phenylalanine Phenylisothiocyanate Reverse phase liquid chromatography Relative standard deviation Tetrahydrofuran Tryptophan Tyrosine Ultra performance liquid chromatography Ultra violet

Acetonitril Acid deoxyribonucleic 6-aminoquinolyl-Nhydroxysuccinimidyl carbamat Dimethylaminoazobenzensulfonyl chlorid Dimethylformamid Bộ ion hóa bằng tia điện từ 9-fluorenylmethyl chloroformat Sắc ký khí Sắc ký lỏng tương tác thân nước Sắc ký lỏng hiệu năng cao Khối phổ 4-chloro-7-nitrobenzofurazan Sắc ký lỏng pha thuận Aldehyd (o) – phthalic phenylalanin Phenylisothiocyanat Sắc ký lỏng pha đảo Độ lệch chuẩn tương đối Tetrahydrofuran Tryptophan Tyrosin Sắc ký lỏng siêu hiệu năng Bức xạ tử ngoại

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Tên gọi, tên viết tắt, pI của các acid amin cơ bản [3] ..................................... 3 Bảng 1.2. Một số phương pháp phân tích acid amin ....................................................... 6 Bảng 2.1. Cách pha dung dịch đường chuẩn ................................................................. 11 Bảng 2.2. Cách pha dung dịch thử thêm chuẩn ............................................................. 11 Bảng 2.3. Các pha động đã khảo sát .............................................................................. 13 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của bàn chất muối/acid của pha động lên hệ số cân xứng pic ... 18 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng tách của một số acid amin ...... 20 Bảng 3.3. Chương trình gradient ................................................................................... 22 Bảng 3.4. Kết quả độ phù hợp hệ thống ........................................................................ 23 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát đường chuẩn ...................................................................... 25 Bảng 3.6. Kết quả độ chính xác của phương pháp ........................................................ 26 Bảng 3.7. Kết quả độ đúng của phương pháp ............................................................... 27 Bảng 3.8. Kết quả định lượng chế phẩm ....................................................................... 28

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Công thức tổng quát của acid amin ................................................................. 2 Hình 3.1. Sắc ký đồ trên cột amid và cột silica ............................................................. 16 Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ ACN lên thời gian lưu của tyrosin ............................... 17 Hình 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ ACN lên khả năng tách của một số acid amin............. 18 Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên thời gian lưu của chất phân tích.............. 19 Hình 3.5. Phổ hấp thụ của Trp và Tyr ........................................................................... 20 Hình 3.7. Sắc ký đồ các điều kiện đã khảo sát .............................................................. 22 Hình 3.8. Sắc ký đồ độ chọn lọc .................................................................................... 24 Hình 3.9. Đường chuẩn Trp và Tyr ............................................................................... 25

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, kỹ thuật sắc ký lỏng là kỹ thuật quan trọng và phổ biến trong nhiều lĩnh vực rất đa dạng: kiểm nghiệm, an toàn thực phẩm, xét nghiệm hóa sinh, vi sinh, môi trường. Kỹ thuật sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC) là một nhánh của sắc ký lỏng,, khác với các kiểu sắc ký truyền thống quen thuộc như sắc ký lỏng phân bố pha thuận (NP-LC) hay sắc ký lỏng phân bố pha đảo (RP-LC). Kỹ thuật này sử dụng pha tĩnh và pha động đều phân cực và thể hiện nhiều ưu điểm so với các kiểu sắc ký truyền thống với các đối tượng phân tích là các chất phân cực. Tuy nhiên, HILIC lại có các cơ chế tách khá phức tạp, đòi hỏi nhiều nghiên cứu để hỏi rõ các cơ chế tách và các yếu tố ảnh hưởng lên kỹ thuật này. Mặc dù vậy, các nghiên cứu về HILIC ở Việt Nam rất hạn chế.

Trên thị trường có nhiều chế phẩm chứa acid amin với các mục đích khác nhau: cung cấp thành phần cấu trúc protein cho người suy dinh dưỡng, suy thận; giải độc gan (chứa methionin), cải thiện giấc ngủ (tryptophan)… Các chế phẩm chứa acid amin thường là các chế phẩm đa acid amin, do đó việc định lượng các acid amin gặp nhiều khó khăn. Các phương pháp phổ biến để phân tích acid amin là sử dụng phương pháp dẫn xuất hóa để làm tăng khả năng lưu giữ, khả năng tách trên cột pha đảo và tăng độ hấp thụ UV-VIS của acid amin [2, 5] , tuy nhiên việc dẫn xuất hóa phức tạp và tốn nhiều thời gian. Bên cạnh đó cũng có nghiên cứu ứng dụng HILIC để phân tích acid amin trực tiếp, không cần dẫn xuất hóa [19]. Acid amin, với bản chất phân cực và có phân tử lượng nhỏ, là một đối tượng phân tích phù hợp với HILIC. Do đó việc nghiên cứu về các điều kiện ảnh hưởng lên HILIC, từ đó ứng dụng HILIC để phân tích trực tiếp các acid amin không qua dẫn xuất hóa là có ý nghĩa thực tiễn.

Với mong muốn hiểu rõ hơn về kỹ thuật HILIC, cung cấp thêm những góc nhìn mới về kỹ thuật này và ứng dụng kỹ thuật trong thực tế, tôi tiến hành đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng một số acid amin bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước” trên đối tượng cụ thể là chế phẩm tiêm truyền đa acid amin với các mục tiêu như sau: -

Khảo sát một số ảnh hưởng của pha tĩnh và pha động lên thời gian lưu và khả năng tách của một số acid amin trong HILIC.

-

Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng một số acid amin trong chế phẩm bằng HILIC. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng cho chế phẩm trên thị trường.

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về các acid amin Acid amin là thành phần cấu tạo nên protein. Chúng là những phân tử chứa nhóm chức amin (-NH2) và carboxyl (-COOH), nhóm thế R khác nhau với mỗi acid amin. Có 20 loại acid amin cơ bản cấu tạo nên chuỗi protein trong cơ thể được mã hóa bởi ADN và tất cả chúng đều là các α-amino acid (nhóm chức -NH2 và -COOH đều gắn với C ở vị trí α). Công thức tổng quát của các acid amin cơ bản như hình 1.1.

Hình 1.1. Công thức tổng quát của acid amin Nhóm thế R có vai trò quan trọng đối với các tính chất lý hóa của các acid amin cơ bản (quyết định khả năng hòa tan, tính phân cực, tính oxy hóa,…).Dựa theo nhóm thế R có thể phân 20 acid amin cơ bản thành các nhóm: -Nhóm có tính acid: Acid aspatic, Acid glutamic.

-Nhóm có tính base: Lysin, Asparagin, Histidin.

-Nhóm acid amin thơm: Tryptophan, Phenylalanin, Tyrosin .

-Nhóm các acid amin còn lại.

Mỗi acid amin có một giá trị pH cụ thể mà tại đó acid amin tồn tại trong dung dịch ở dạng ion lưỡng cực, giá trị pH đó gọi là pH đẳng điện (pI). Tại giá trị pI của nó, acid amin trung hòa về điện, tổng điện tích dương bằng tổng điện tích âm.

Chúng được phân thành 2 loại dựa trên khả năng tổng hợp của cơ thể: Acid amin thiết yếu (cơ thể không tự tổng hợp được), Acid amin không thiết yếu (cơ thể có khả năng tự tổng hợp được) [3].  Nhóm các acid amin thiết yếu (các acid amin cơ thể người không thể tự sinh tổng hợp): Met, Val, Trp, Ile, Phe, Thr, Leu, Lys (đối với trẻ em có thêm Arg, His).  Nhóm acid amin không thiết yếu: Gly, Ala, Ser, Tyr, Cys, Asp, Asn, Glu, Gln, Arg, His, Pro.

2

Bảng 1.1. Tên gọi, tên viết tắt, pI của các acid amin cơ bản [3] STT

Tên gọi

Tên viết

pI

STT

Tên gọi

tắt

Tên viết

pI

tắt

1

Glycin

Gly

5,97

11

Asparagin

Asp

5,41

2

Alanin

Ala

6,01

12

Cystein

Cys

5,07

3

Prolin

Pro

6,48

13

Tryptophan

Trp

5,89

4

Leucin

Leu

5,98

14

Phenylalanin

Phe

5,48

5

Isoleucin

Ile

6,02

15

Tyrosin

Tyr

5,66

6

Methionin

Met

5,74

16

Histidin

His

7,59

7

Valin

Val

5,97

17

Arginin

Arg

10,76

8

Serin

Ser

5,68

18

Lysin

Lys

9,74

9

Threonin

Thr

5,87

19

Acid aspatic

Asp

2,77

10

Glutamin

Gln

5,60

20

Acid

Glu

3,22

Glutamic Các chế phẩm chứa acid amin trên thị trường Việt Nam hiện nay chủ yếu là các chế phẩm đa acid amin dùng trong tiêm truyền và một số chế phẩm kết hợp acid amin với một số thành phần khác như vitamin hay chất giảm đau,…

Trong đề tài này, nhóm các acid amin thơm được tập trung khảo sát.

1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng tương tác thân nước Sắc ký lỏng tương tác thân nước (Hydrophilic interaction chromatography HILIC)) là một kỹ thuật được biết đến vào những năm 1970 và lần đầu được định nghĩa vào năm 1990 [7]. HILIC là một biến thể của sắc ký thông thường, sử dụng pha tĩnh phân cực, pha động phân cực với thành phần chính thường là nước chiếm 5-40% và một dung môi hữu cơ không proton hóa (thường là acetonitril). HILIC đặc biệt có hiệu quả trong việc tách các chất phân cực và không mang điện. Do đó HILIC được ứng dụng trong việc tách các acid amin [15], một số kháng sinh aminoglycosid [14], các peptid [16]…

3

1.2.1. Pha tĩnh Pha tĩnh sử dụng trong HILIC là những bề mặt phân cực, ưa nước, dễ dàng hình thành lớp nước trên bề mặt. Phổ biến nhất trong phân tích HILIC là pha tĩnh có bản chất là silica và các dẫn xuất của nó.

Dựa vào cấu tạo, pha tĩnh silica được chia làm 2 loại: -

Silica không dẫn xuất hóa: cột chứa các hạt nhồi mang nhóm silanol (-SiOH).

Chất phân tích được giữ lại mạnh mẽ nhờ liên kết hydro và tương tác trao đổi với nhóm silanol. Pha tĩnh silica không dẫn xuất hóa thường được sử dụng trong vùng pH từ 2-8 để đảm bảo độ bền vững hóa học cho nhóm silanol. Cột silica không dẫn xuất hầu như không mang điện trong khoảng pH từ 2 tới 3 [17], mang điện âm rõ rệt (-SiO-) với các môi trường có pH>4 [11, 17].

-

Silica dẫn xuất hóa: Các pha tĩnh dẫn xuất hóa thu được thông qua việc

biến đổi hóa học bề mặt silica. Dựa vào trạng thái tĩnh điện, chúng được phân loại thành các nhóm: trung tính (amid, diol, cyanopropyl, cyclodextrin,…), lưỡng cực (sulfoalkyl betain,…), tích điện dương (amino silica,…), tích điện âm (poly aspartic, poly sulfoethyl A, poly succinimid silica…).

1.2.2. Pha động Pha động được sử dụng trong HILIC là pha động phân cực nhằm tạo một lớp giàu nước trên bề mặt pha tĩnh, có vai trò như một hệ chiết lỏng-lỏng. Để có pha động như vậy người ta thường sử dụng pha động có thành phần là một dung môi hữu cơ thân nước và một ít nước (đệm). Tỷ lệ nước dao động từ khoảng 5-40% và tối thiểu cần 2% để tạo pha tĩnh giả - cơ chế chính trong phân tách bằng HILIC [20].

Dung môi hữu cơ thường được sử dụng là acetonitril (ACN). Tuy nhiên các dung môi hữu cơ đồng tan với nước nào cũng có thể được sử dụng trong HILIC (dioxan, THF,…) [8].

Dung dịch đệm và các chất hòa tan khác được sử dụng nhằm mục đích kiểm soát pH và lực ion của pha động. Kiểm soát pH có nhiều vai trò quan trọng khi phân tách bằng HILIC. Thay đổi pH làm thay đổi trạng thái mang điện của các chất phân tích có nhiều dạng ion hóa khác nhau, thay đổi tính chất của lớp pha tĩnh. Do đó cần cố định pH ở khoảng phù hợp để cố định thời gian lưu giữ của chất phân tích cũng như đảm bảo độ bền của pha tĩnh (ví dụ như pha tĩnh silica thường bền trong pH từ 2-8). Việc thay đổi nồng độ đệm thường ảnh hưởng tới thời gian lưu của chất phân tích do thay đổi độ 4

phân cực của pha động, thay đổi bề dày lớp nước hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh [6, 17], cạnh tranh tương tác tĩnh điện giữa ion pha động và chất phân tích dạng ion [6].

HILIC có thể được sử dụng ở cả 2 chế độ là đẳng dòng hoặc gradient. Khi độ phân cực của pha động giảm thì khả năng lưu giữ chất phân tích được tăng lên. Do đó có thể sử dụng chế độ gradient trong HILIC với thời gian đầu tỷ lệ nước thấp và kết thúc với tỷ lệ nước cao hơn.

1.2.3. Các cơ chế tách chính trong HILIC Có 4 loại tương tác để mô phỏng cơ chế tách trong HILIC [8, 17, 20]: -

Sự hấp phụ của chất phân tích lên bề mặt pha tĩnh

-

Sự phân bố chất phân tích giữa pha động và pha tĩnh

-

Sự phân bố chất phân tích giữa pha động và pha tĩnh giả (do pha động hấp phụ lên bề mặt pha tĩnh tạo thành)

-

Tương tác tĩnh điện khi cả chất phân tích mang điện và pha tĩnh mang điện

Các cơ chế có thể xảy ra rất đa dạng trong HILIC. Với các chất không tĩnh điện, chủ yếu cơ chế xảy ra là cơ chế phân bố. Cơ chế hấp phụ xảy ra khi lớp nước trên bề mặt pha tĩnh mỏng và có thể xuất hiện các tương tác tại chỗ như tương tác tĩnh điện hay tương tác hydro với các vị trí nhóm chức có thể tham gia tương tác này. Khi lớp nước đủ dày, cơ chế chủ yếu xảy ra là cơ chế phân bố.

Sự phân bố chất phân tích giữa pha động và pha tĩnh giả là tương tác đặc trưng cho sự tách bằng HILIC. Với mô hình này, khi pha động di chuyển qua pha tĩnh, một lớp solvat hóa được hình thành trên bề mặt pha tĩnh. Lớp solvat hóa này có thể được coi là một lớp pha tĩnh giả có độ phân cực cao hơn so với pha động chứa dung môi hữu cơ, kết hợp với pha động tạo thành một hệ phân bố lỏng - lỏng. Chất phân tích được phân bố giữa 2 lớp chất lỏng này. Độ dày của lớp pha tĩnh giả tăng lên khi tăng tỷ lệ pha nước và nồng độ muối trong pha nước ở trong dung môi pha động.

Với các pha tĩnh mang điện, tương tác tĩnh điện xảy ra khi các chất phân tích mang điện . Acid amin là một đối tượng phân tích có thể mang điện dấu âm và dấu dương tùy theo pH. Do đó tương tác tĩnh điện đóng góp khá quan trọng trong cơ chế tách các acid amin trên pha tĩnh mang điện (ví dụ như pha tĩnh silica mang điện âm, pha tĩnh amino mang điện dương). Thay đổi nồng độ muối trong pha động cũng sẽ làm thay đổi mức độ tương tác tĩnh điện giữa acid amin và dạng pha tĩnh mang điện này.

5

1.3. Sơ lược về các phương pháp định lượng acid amin Hiện nay có nhiều phương pháp định lượng acid amin trên nhiều nền mẫu khác nhau. Với những nền mẫu phức tạp thường có giai đoạn thủy phân để tạo các acid amin tự do trước khi phân tích.

Các phương pháp đã được nghiên cứu để phân tích acid amin chủ yếu là sử dụng sắc ký nhằm mục đích tách các acid amin rồi định lượng chúng. Nhiều loại sắc ký khác nhau được sử dụng: sắc ký bản mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký pha đảo, sắc ký khí,..

Ngoài ra một kỹ thuật khá phổ biến khác là điện di mao quản.

Do đặc điểm hấp thụ UV kém của đa số acid amin, đa phần các kỹ thuật định lượng đều sử dụng phương pháp dẫn xuất hóa. Kỹ thuật được áp dụng nhiều nhất để định lượng acid amin là kỹ thuật sắc ký trao đổi ion dẫn xuất sau cột và sắc ký lỏng pha đảo dẫn xuất trước cột [21].

Với sắc ký trao đổi ion, một cột trao đổi cation được sử dụng. Một chương trình gradient tăng dần pH được dùng để đưa acid amin qua cột. Ứng với mỗi pH tương ứng với điểm đẳng điện của acid amin, acid amin đó trở nên trung tính và được rửa giải ra khỏi cột. Sau cột, chúng được dẫn xuất hóa, phổ biến nhất là bằng ninhydrin và ophthaldialdehyd (OPA) [21].

Với sắc ký lỏng pha đảo, thường sử dụng cột C18 và một chương trình gradient dùng Acetonitril [21]. Các chất để dẫn xuất hóa được sử dụng phổ biến là PITC, OPAFOMC,…

Một số phương pháp khác không sử dụng dẫn xuất hóa như: sử dụng bước sóng UV thấp, detector độ dẫn điện, cộng hưởng từ hạt nhân, đo chỉ số khúc xạ, detector khối phổ,…[21] Bảng 1.2. Một số phương pháp phân tích acid amin STT

Tác giả

1

Dược điển Việt Nam V [2]

Phương pháp

Nền mẫu

Kỹ thuật 1: Tạo dẫn chất sau cột với thuốc thử ninhydrin, sắc ký trao đổi ion Kỹ thuật 2: Tạo dẫn chất sau cột với thuốc thử OPA, sắc ký trao đổi ion Kỹ thuật 3: Tạo dẫn chất trước cột với thuốc thử PITC, RP-LC 6

Kỹ thuật 4: Tạo dẫn chất trước cột với thuốc thử AQC, RP-LC Kỹ thuật 5: Tạo dẫn chất trước cột với thuốc thử OPA, RP-LC Kỹ thuật 6: Tạo dẫn chất trước cột bằng thuốc thứ DABS-CI, RP-LC Kỹ thuật 7: Tạo dẫn chất trước cột với thuốc thử FMOC-CI, RP-LC 2

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN

Thức ăn

Dẫn xuất hóa sau cột với ninhydrin, Sắc ký

chăn nuôi trao đổi ion

8764:2012 (ISO 13903:2005) [1] 3

Lê Thị Hồng

Thực

Dẫn xuất hóa trước cột bằng AQC

Hảo (2008)[5]

phẩm

Cột C18 (150mm x 4,6mm x 3,9µm) Pha động: đệm acetat - phosphat pH 5,05, acetonitril, nước theo chế độ gradient

4

5

Nicola Gray và

Nước

cộng sự (2019)

tiểu

Dẫn xuất hóa trước cột bằng 6-aminoquinolyln-hydroxysuccinimidyl carbamate

[9]

chuột

Hệ thống UPLC-MS/MS

Mei Musa

Thực

Dẫn xuất hóa bằng 4-chloro-7-nitro-2.1,3-

Ali Omar và

phẩm

benzoxadiazole (NBD-Cl) trước khi tiến hành điện di mao quản với detector UV

cộng sự (2017) [18] 6

7

Prinsen HCMT

Huyết

Sắc ký lỏng tương tác thân nước HILIC với

và cộng sự [19]

tương

detector ESI-MS

Lê Duy Cường, Trần Thị Chi

Dịch sinh Dẫn xuất hóa trước cột bằng AQC, hệ thống học

sắc ký UPLC

Mai [4] 8

Bram Vancompernolle

Thực vật

Dẫn xuất hóa bằng methyl chloroformat, hệ thống sắc ký khí GC-MS

và cộng sự [24] 7

Hiện nay các phương pháp sử dụng HILIC áp dụng vào phân tích các acid amin chưa phổ biến là chưa có nghiên cứu sử dụng HILIC đi kèm detector UV. Với đặc điểm phân cực của acid amin, việc sử dụng HILIC là hoàn toàn phù hợp và có thể phát hiện tín hiệu bằng detector UV ở bước sóng thấp.

Với chế phẩm đa acid amin trên thị trường, nồng độ acid amin trong chế phẩm lớn và đủ nồng độ để có thể phát hiện bằng detector UV. Thêm vào đó nền mẫu trong dung dịch tiêm truyền không quá phức tạp nên nếu xấy dựng được chương trình tách các acid amin thì có thể định lượng được chúng.

Vì vậy, nghiên cứu này được tiến hành nhằm xây dựng phương pháp định lượng các acid amin trong chế phẩm bằng kỹ thuật HILIC với detector UV.

8

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu 2.1.1. Chất đối chiếu Các chất chuẩn acid amin: -

Tryptophan (99,12%), Phenylalanin (99,48%), Methionin (99,7%), Cystein (98%): Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.

-

Tyrosin (99,4%); Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh.

2.1.2. Chế phẩm -

Chế phẩm tiêm truyền Kidmin thành phần gồm 17 acid amin. Thành phần cụ thể trong phần phụ lục 2.

2.1.3. Hóa chất -

Acetonitril dùng cho HPLC: sản xuất bởi Merck – Đức.

-

Acid acetic băng dùng cho HPLC: sản xuất bởi Merck – Đức.

-

Amoni acetat dùng cho HPLC: sản xuất bởi Merck – Đức.

-

Acid Hydrocloric dùng cho phân tích, sản xuất bởi Xilong Scientific – Trung Quốc

-

Nước cất hai lần.

2.2. Thiết bị, dụng cụ -

Hệ thống máy HPLC Agilent 1200 series và phần mềm chemstation.

-

Cột sắc ký: Cột Supelco Ascentis Silica (250  4,6 mm, 5µm) (Sigma Aldrich), cột Zorbax Rx Silica (150  4,6 mm, 5µm) (Agilent), cột Luna Silica (250  4,6 mm, 5 µm) (Phenomenex), cột Inertsil Amid (150  4,6 mm, 5µm) (GL Science), cột Inertsil SIL-100A (150  3,0 mm, 3 µm).

-

Cân Phân Tích A&D GR200 (Nhật Bản).

-

Máy lắc Labinco L46 (Đài Loan).

-

Máy lọc hút chân không Rocker 400.

-

Màng lọc cellulose 0,45 µm.

-

Máy siêu âm Ultrasonic LC60H (Đức).

-

Micropipet 100-1000 µL, 10-100 µL. (Đức).

-

Bình định mức: 5, 10, 20, 25, 50 và 100 mL.

9

-

Các dụng cụ khác: pipet Pasteur, pipet chia vạch, cốc có mỏ, ống đong, đũa thủy tinh, vial, bình nón, …

2.3. Nội dung nghiên cứu -

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên thời gian lưu và khả năng tách của các acid amin khi phân tích bằng kỹ thuật HILIC

-

Khảo sát điều kiện sắc ký phân tích một số acid amin có trong chế phẩm bằng HILIC.

-

Thẩm định phương pháp trên các tiêu chí sau: độ phù hợp hệ thống, độ chọn lọc, đường chuẩn, độ chính xác, độ đúng.

-

Áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng các acid amin trong chế phẩm KIDMIN.

2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Quy trình chuẩn bị mẫu -

Dung dịch HCl 0,01 M: hút 85 µL vào bình định mức 100 mL và định mức vừa đủ bằng nước cất hai lần.

-

Các dung dịch chuẩn đơn gốc: + Cân chính xác khoảng 62,5 mg Trp vào bình định mức 25 mL, định mức vừa đủ bằng dd HCl 0,01 M thu được dung dịch Trp 2500 ppm. + Cân chính xác khoảng 12,5 mg Tyr vào bình định mức 25 mL, định mức vừa đủ bằng dd HCl 0,01 M thu được dung dịch Tyr 500 ppm. + Cân chính xác khoảng 125 mg Phe vào bình định mức 25 mL, định mức vừa đủ bằng dd HCl 0,01 M thu được dung dịch Phe 5000 ppm.

-

Dung dịch chuẩn chạy sắc ký ở các nồng độ được pha từ chuẩn đơn gốc trong dung môi pha động. + Các chuẩn đơn: hút 50 μL chuẩn gốc + 950 μL dung môi pha động vào vial. + Chuẩn hỗn hợp Trp, Phe, Tyr: hút 50 μL chuẩn gốc + 850 μL dung môi pha động vào vial.

-

Mẫu thử: hút chính xác 1 mL mẫu thử vào bình định mức 20 mL, thêm khoảng 5 mL nước cất và định mức vừa đủ bằng ACN.

-

Các dung dịch dùng trong thẩm định: + Dung dịch chuẩn đơn (Trp, Tyr): hút chính xác 1 mL chuẩn gốc vào bình định mức 20 mL, thêm khoảng 5 mL nước cất và định mức vừa đủ bằng ACN. 10

+ Dung dịch chuẩn hỗn hợp: hút chính xác 1 mL mỗi chuẩn gốc Trp và Tyr vào bình định mức 20 mL, thêm khoảng 4 mL nước cất và định mức vừa đủ bằng ACN. + Các dung dịch đường chuẩn: hút chính xác x mL mỗi chuẩn gốc vào bình định mức thích hợp, thêm khoảng y mL nước cất và định mức bằng ACN như bảng 2.1.

Bảng 2.1. Cách pha dung dịch đường chuẩn Nồng độ Trp

Nồng độ Tyr

(ppm)

(ppm)

50%

62,5

12,5

0,5

5

20

80%

100

20

1

5

25

100%

125

25

1

4

20

120%

150

30

1,5

4

25

150%

187,5

37,5

1,5

3

20

C%

x (mL)

Bình định

y (mL)

mức (mL)

+ Các dung dịch thử thêm chuẩn: hút chính xác 1,5 mL dung dịch thử và x mL dung dịch mỗi chuẩn gốc vào bình định mức 50 mL, thêm khoảng y mL nước cất và định mức bằng ACN như bảng 2.2 Bảng 2.2. Cách pha dung dịch thử thêm chuẩn Mức nồng độ

x (mL)

y (mL)

60% thử + 20% chuẩn

0,5

12,5

60% thử + 40% chuẩn

1

11,5

60% thử + 60% chuẩn

1,5

10,5

2.4.2. Quy trình chuẩn bị dung môi pha động -

Dung dịch amoni acetat 1 M: cân chính xác 1,925 g amoni acetat vào bình định mức 25 mL, định mức bằng nước cất 2 lần.

-

Các dung dịch amoni acetat x mM: hút 0,1x mL dung dịch amoni acetat vào bình định mức 100 mL, định mức vừa đủ bằng nước cất 2 lần.

-

Dung dịch acid acetic 20 mM: hút 114 µL dung dịch acid acetic vào bình định mức 100 mL, định mức vừa đủ bằng nước cất 2 lần

11

Các dung dịch này được lọc qua màng 0,45 μm, siêu âm 10 phút trước khi

chạy sắc ký.

2.4.3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên thời gian lưu và khả năng tách của các acid amin khi phân tích bằng HILIC Khảo sát thời gian lưu và khả năng tách của các acid amin khi thay đổi các yếu tố sau: 2.4.3.1. Pha tĩnh Khảo sát 2 nhóm pha tĩnh có bản chất khác nhau là: -

Pha tĩnh silica tích điện âm ở pH > 4 bao gồm cột Zorbax RX Silica (150 × 4,6 mm, 5 μm) và Ascentis Silica (250 × 4,6 mm, 5 μm)

-

Pha tĩnh không tích điện cột Inertsil Amid (150 × 4,6 mm, 5 μm)

2.4.3.2. Pha động Pha động trong đề tài này sửa dụng hỗn hợp ACN và dung dịch muối/đệm/acid.

Khảo sát các yếu tố: -

Tỷ lệ ACN trong pha động: từ 65-90%

-

Bản chất acid/muối trong pha động

-

Nồng độ acid/muối trong pha động

2.4.4. Xây dựng phương pháp định lượng một số acid amin trong chế phẩm 2.4.4.1. Khảo sát bước sóng định lượng.

Khảo sát phổ hấp thụ của các acid amin nhằm tìm bước sóng định lượng phù hợp.

2.4.4.2. Khảo sát pha tĩnh Tiến hành khảo sát trên các cột : -

Luna Silica 250 × 4.6 mm, 5μm

-

Inertsil SIL-100A 150 × 3.0 mm, 3µm

Lựa chọn pha tĩnh dựa vào thời gian lưu, độ cân xứng pic, độ phân giải các chất.

2.4.4.3. Khảo sát pha động Dựa vào kết quả nghiên cứu được tìm hiểu ở nội dung trước, tiến hành khảo sát và thay đổi điều kiện pha động để định lượng một số acid amin trong chế phẩm.

Các pha động đã khảo sát được trình bày trong bảng 2.3.

12

Bảng 2.3. Các pha động đã khảo sát Cột

Pha động

Inertsil SIL-100A, 150 × 3.0 mm, 3µm

85% ACN : 15% dung dịch amoni acetat 30 mM, f=1mL/phút 90% ACN : 10% dung dịch amoni acetat 50 mM, f=1,3mL/phút

Luna Silica 250 × 4,6 mm, 5µm

85% ACN : 15% dung dịch amoni acetat 50 mM, f=1.5mL/phút 87% ACN : 13% dung dịch amoni acetat 50 mM, f=1.8mL/phút

2.4.5. Thẩm định phương pháp phân tích Sau khi lựa chọn được điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định phương pháp định lượng một số acid amin bằng HILIC theo hướng dẫn của ICH trên các tiêu chí sau: Độ ổn định hệ thống, độ chọn lọc, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, độ chính xác của phương pháp, độ đúng của phương pháp.

2.4.5.1. Độ phù hợp hệ thống Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị.

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần mẫu dung dịch hỗn hợp chuẩn các acid amin. Ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích pic. Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích. Yêu cầu các giá trị thời gian lưu có RSD% ≤ 2,0%, diện tích pic có RSD% ≤ 2%.

2.4.5.2. Độ chọn lọc Là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, tính chọn lọc thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng, pic của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các pic tạp. Trên sắc ký đồ mẫu trắng phải không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn.

Tiến hành chạy các mẫu sắc ký: dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng. Dung dịch mẫu trắng phải không có đáp ứng của chất phân tích. Thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu thử là chuẩn phải tương đương nhau.

13

2.4.5.3. Ä?Ć°áť?ng chuẊn vĂ khoảng tuyáşżn tĂ­nh -

Khoảng tuyáşżn tĂ­nh cᝧa phĆ°ĆĄng phĂĄp phân tĂ­ch lĂ khoảng náť“ng Ä‘áť™ áť&#x; Ä‘Ăł cĂł sáťą tuyáşżn tĂ­nh cᝧa náť“ng Ä‘áť™ chẼt phân tĂ­ch váť›i đấi lưᝣng Ä‘o.

-

Ä?Ć°áť?ng chuẊn: lĂ Ä‘Ć°áť?ng biáťƒu diáť…n sáťą ph᝼ thuáť™c tuyáşżn tĂ­nh giᝯa đấi lưᝣng Ä‘o đưᝣc vĂ náť“ng Ä‘áť™ cĂĄc chẼt phân tĂ­ch.

CĂĄch tiáşżn hĂ nh: chuẊn báť‹ cĂĄc mẍu dung dáť‹ch chuẊn háť—n hᝣp cĂł náť“ng Ä‘áť™ 50%, 80%, 100%, 120%, 150% náť“ng Ä‘áť™ Ä‘áť‹nh lưᝣng vĂ váş˝ Ä‘áť“ tháť‹ máť—i tĆ°ĆĄng quan giᝯa Ä‘ĂĄp ᝊng vĂ náť“ng Ä‘áť™ chẼt phân tĂ­ch. Ä?Ć°áť?ng chuẊn cĂł dấng y=ax+b trong Ä‘Ăł y lĂ Ä‘ĂĄp ᝊng vĂ x lĂ náť“ng Ä‘áť™ chẼt phân tĂ­ch.

2.4.5.4. Ä?áť™ chĂ­nh xĂĄc cᝧa phĆ°ĆĄng phĂĄp Ä?áť™ chĂ­nh xĂĄc tháťƒ hiᝇn mᝊc Ä‘áť™ phân tĂĄn káşżt quả giᝯa máť™t loất pheĚ p Ä‘o tᝍ nhiáť u lần tiáşżn hĂ nh phân tĂ­ch trĂŞn cĂšng máť™t mẍu tháť­ Ä‘áť“ng nhẼt dĆ°áť›i nhᝯng Ä‘iáť u kiᝇn xĂĄc Ä‘áť‹nh. + Ä?áť™ lạp lấi cᝧa phĆ°ĆĄng phĂĄp (repeatability): Ä?áť™ lạp lấi diáť…n tả Ä‘áť™ chĂ­nh xĂĄc cᝧa máť™t quy trĂŹnh phân tĂ­ch trong cĂšng Ä‘iáť u kiᝇn thĂ­ nghiᝇm trong khoảng tháť?i gian ngắn.

Tiáşżn hĂ nh thĂ­ nghiᝇm 6 lần váť›i cĂšng máť™t náť“ng Ä‘áť™ mẍu tháť­, xĂĄc Ä‘áť‹nh Ä‘áť™ lᝇch chuẊn tĆ°ĆĄng Ä‘áť‘i RSD (%) cᝧa hĂ m lưᝣng. + Ä?áť™ chĂ­nh xĂĄc trung gian (intermediate precision): Báť‘ trĂ­ thĂ­ nghiᝇm tĆ°ĆĄng táťą phần Ä‘áť™ lạp lấi cᝧa phĆ°ĆĄng phĂĄp nhĆ°ng tiáşżn hĂ nh vĂ o tháť?i gian khĂĄc, Ä‘áť•i kiáťƒm nghiᝇm viĂŞn vĂ phân tĂ­ch trĂŞn hᝇ sắc kĂ˝ láť?ng khĂĄc.

2.4.5.5. Ä?áť™ Ä‘Ăşng -

Ä?áť™ Ä‘Ăşng cᝧa phĆ°ĆĄng phĂĄp: lĂ khĂĄi niᝇm chᝉ mᝊc Ä‘áť™ gần nhau giᝯa cĂĄc giĂĄ tráť‹ trung bĂŹnh cᝧa káşżt quả tháť­ nghiᝇm vĂ giĂĄ tráť‹ tháťąc hoạc giĂĄ tráť‹ đưᝣc chẼp nháş­n lĂ Ä‘Ăşng.

-

Ä?áť™ thu háť“i (Ä‘ĂĄnh giĂĄ Ä‘áť™ Ä‘Ăşng): lĂ tᝡ lᝇ phần trăm giᝯa giĂĄ tráť‹ thu đưᝣc so váť›i giĂĄ tráť‹ lĂ˝ thuyáşżt.

ThĂŞm vĂ o mẍu tháť­ Ä‘ĂŁ đưᝣc xĂĄc Ä‘áť‹nh hĂ m lưᝣng hoất chẼt máť™t lưᝣng chĂ­nh xĂĄc chẼt chuẊn áť&#x; 03 mᝊc 80%, 100%, 120% so váť›i hĂ m lưᝣng acid amin cĂł trong mẍu khảo sĂĄt. Ä?áť™ thu háť“i đưᝣc tĂ­nh theo cĂ´ng thᝊc: đ?‘… (%) =

đ??śđ?‘Ąđ?‘? − đ??śđ?‘› . 100 % đ??śđ?‘Ľ

R: Ä‘áť™ thu háť“i (%).

14

đ??śđ?‘Ąđ?‘? : náť“ng Ä‘áť™ chẼt phân tĂ­ch trong mẍu tháť­ thĂŞm chuẊn (Âľg/mL).

Cn: náť“ng Ä‘áť™ chẼt phân tĂ­ch trong mẍu tháť­ (Âľg/mL). đ??śđ?‘Ľ : náť“ng Ä‘áť™ chuẊn thĂŞm (lĂ˝ thuyáşżt) (Âľg/mL).

YĂŞu cầu: Tᝡ lᝇ thu háť“i 95-105% áť&#x; máť—i mᝊc náť“ng Ä‘áť™ vĂ giĂĄ tráť‹ RSD (%) cᝧa tᝡ lᝇ thu háť“i phải ≤ 2,0 % áť&#x; máť—i mᝊc náť“ng Ä‘áť™.

15

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên thời gian lưu và khả năng tách các acid amin 3.1.1. Ảnh hưởng của pha tĩnh Tiến hành chạy sắc ký mẫu dung dịch hỗn hợp chuẩn các acid amin Trp, Phe, Tyr là các acid amin thơm hấp thụ UV khá tốt với chương trình sắc ký như sau: -

Pha động bao gồm ACN:dung dịch muối amoni acetat 10 mM tỷ lệ 85:15

-

Tốc độ dòng 1 mL/phút

-

Bước sóng 210 nm

-

Thể tích tiêm mẫu 20 µL

với 2 pha tĩnh khác nhau Zorbax RX Silica (150 × 4,6 mm, 5µm) và Inertsil Amid (150 × 4.6 mm, 5µm)

Hình 3.1. Sắc ký đồ trên cột amid và cột silica Sắc ký đồ cho thấy ở 2 pha tĩnh Trp luôn được rửa giải sớm nhất, sau đó đến Phe và Tyr. Cột Amid cho độ cân xứng pic rất tốt (hệ số đối xứng xấp xỉ 1) và tách tốt hơn.

Tuy nhiên, vì điều kiện thực tế không cho phép tiếp tục sử dụng cột amide trong khuôn khổ nghiên cứu này, các bước khảo sát tiếp theo được thực hiện trên cột silica.

3.1.2. Ảnh hưởng của pha động 3.1.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ ACN Chạy sắc ký dung dịch hỗn hợp chuẩn Tyr với pha động bao gồm ACN và dung dịch muối amoni acetat 10 mM với tỷ lệ ACN thay đổi từ 70-85% trên pha tĩnh Ascentis Silica (250 × 4,6 mm, 5 µm).

Các sắc ký đồ thu được như hình 3.2.

16

Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ ACN lên thời gian lưu của tyrosin Kết quả cho thấy rằng khi tăng tỷ lệ ACN, thời gian lưu của chất phân tích tăng lên. Đặc biệt ở khoảng nồng độ >80% ACN, thời gian lưu của chất phân tích tăng lên rất đáng kể. Điều này có thể giải thích dựa trên cơ chế tách chính của HILIC. Khi tăng tỷ lệ ACN, độ phân cực của pha động giảm, do đó làm giảm khả năng rửa giải các chất phân cực.

Khi tăng tỷ lệ ACN, khả năng tách của các acid amin cũng tăng lên được thể hiện trong các sắc ký đồ sau khi sử dụng pha động ACN và dung dịch amoni acetat trên cột Zorbax RX Silica 150 × 4,6 mm, 5 µm với các tỷ lệ ACN khác nhau. Thể hiện trong hình 3.1, khi tăng tỷ lệ pha động từ 75:25 (ACN:dung dịch muối) đến 83:17 (ACN:dung dịch muối) thì pic Phe và Tyr từ không tách được đã tách được hoàn toàn.

17

Hình 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ ACN lên khả năng tách của một số acid amin 3.1.2.2. Ảnh hưởng của bản chất acid/muối Tiến hành chạy sắc ký mẫu hỗn hợp chuẩn Trp, Phe, Tyr với 2 pha động: ACN : acid acetic 20mM và ACN : amoni acetat 20 mM với tỷ lệ 85:15 (v/v) trên cột Zorbax RX Silica 150 × 4,6mm, 5µm.

Kết quả từ sắc ký đồ cho thấy thời gian lưu của các pic sắc ký hầu như không đổi.

Tuy nhiên ở pha động chứa acid, hệ số đối xứng của các pic kém hơn so với pha động chứa muối amoni acetic (bảng 3.1) nên hệ số phân giải giữa các pic cũng kém đi.

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của bàn chất muối/acid của pha động lên hệ số cân xứng pic Chất phân tích

Hệ số đối xứng pic Pha động chứa acid Pha động chứa muối

Trp

0,602

0,608

Phe

0,454

0,699

Tyr

0,350

0,508

Kết luận: lựa chọn hệ dung môi chứa amoni acetat để khảo sát tiếp theo.

18

3.1.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ acid/muối Khảo sát dung dịch amoni acetat có nồng độ trong khoảng từ 2-30 mM với chất phân tích là Tyr. Sự thay đổi về thời gian lưu được minh họa trong hình 3.4 và khả năng tách của các acid amin minh họa trong bảng 3.2. (cột Ascentis Silica, pha động ACN dung dịch amoniacetat).

Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên thời gian lưu của chất phân tích Nhận xét: Kết quả trên pha tĩnh silica cho thấy khi tăng nồng độ muối, thời gian lưu của chất phân tích tăng. Tuy nhiên đến một mức nồng độ nhất định (15 mM), sau đó thời gian lưu lại giảm. Khi thay đổi nồng độ muối, hệ số phân giải giữa các pic sắc ký cũng thay đổi như bảng 3.2. Kết quả cho thấy tăng nồng độ muối cho kết quả tách tốt hơn giữa các pic sắc ký.

19

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng tách của một số acid amin Pha động

Hệ số phân giải

ACN: dung dịch amoni acetat

Nồng độ

Trp&Phe

Phe&Tyr

15 mM

2,81

2,18

20 mM

2.84

2.44

30 mM

3,19

2.51

3.2. Xây dựng phương pháp định lượng một số acid amin trong chế phẩm Trong giới hạn của đề tài này phương pháp định lượng 2 acid amin là Trp và Tyr trong chế phẩm tiêm truyền đã được xây dựng và thẩm định.

3.2.1. Xử lý mẫu Pha loãng mẫu thử 20 lần bằng cách: hút chính xác 1 mL dung dịch chế phẩm vào bình định mức 20 mL, thêm khoảng 5 mL nước cất và định mức bằng ACN. Do chế phẩm có nhiều thành phần khó tan trong ACN nên việc thêm ACN phải từ từ và kết hợp với lắc đều. Dung dịch này được sử dụng làm mẫu chạy sắc ký. Độ ổn định đã được khảo sát, cho thấy nồng độ các chất cần phân tích trong mẫu thử ổn định trong ngày làm việc (8 giờ).

3.2.2. Khảo sát bước sóng định lượng Phổ hấp thụ của Trp và Tyr như hình 3.5.

Hình 3.5. Phổ hấp thụ của Trp và Tyr 20

Từ phổ hấp thụ thấy được Tyr và Trp có đỉnh hấp thụ gần nhau là ở bước sóng 276nm với Tyr và 280nm với Trp. Lựa chọn định lượng 2 chất này ở bước sóng 276nm nhằm mục đích loại bỏ ảnh hưởng của các acid amin khác lên đáp ứng của chất phân tích tại bước sóng này (các acid amin khác đều không còn hấp thụ UV ở bước sóng 276nm).

3.2.3. Lựa chọn các điều kiện sắc ký Từ những kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên thời gian lưu và khả năng tách của các acid amin, cho thấy để có khả năng tách tốt đối với pha tĩnh silica cần: -

Tỷ lệ ACN trong pha động ≥ 85% (theo phần 3.1.2.1)

-

Pha nước là muối amoni acetat (theo phần 3.1.2.2) và nồng độ muối ≥ 30 mM (theo phần 3.1.2.3)

Khảo sát các điều kiện sắc ký trên 2 pha tĩnh Inertsil SIL-100A 150 × 3.0 mm, 3µm và Luna Silica 250 × 4,6mm , 5µm với các điều kiện sau: -

Điều kiện 1: cột Inertsil SIL-100A 150 × 3,0 mm, 3µm; pha động ACN : dung dịch amoni acetat 30 mM tỷ lệ 85:15 (v/v), tốc độ dòng 1 mL/phút.

-

Điều kiện 2: cột Inertsil SIL-100A 150 × 3,0 mm, 3µm; pha động ACN : dung dịch amoni acetat 50 mM tỷ lệ 90:10 (v/v), tốc độ dòng 1,3 mL/phút.

-

Điều kiện 3: cột Luna Silica 250 × 4,6mm , 5µm; pha động ACN : dung dịch amoni acetat 50 mM tỷ lệ 85:15 (v/v), tốc độ dòng 1,5 mL/phút.

-

Điều kiện 4: cột Luna Silica 250 × 4,6mm , 5µm; pha động ACN : dung dịch amoni acetat 50 mM tỷ lệ 87:13 (v/v), tốc độ dòng 1,8 mL/phút.

-

Điều kiện 5: cột Luna Silica 250 × 4,6mm , 5µm; pha động ACN : dung dịch amoni acetat 50 mM tỷ lệ 90:10 (v/v), tốc độ dòng 1,8 mL/phút.

Trên 2 điều kiện sắc ký khảo sát trên cột Inertsil SIL-100A 150 × 3,0 mm, 3µm, khi tăng tỷ lệ ACN và nồng độ muối thì khả năng tách của 2 chất đã được cải thiện tuy nhiên vẫn chưa tách hoàn toàn.

Trên 3 điều kiện sắc ký khảo sát trên cột Inertsil SIL-100A 150 × 3,0 mm, 3µm, khả năng tách của 2 chất vẫn được cải thiện khi tăng tỷ lệ ACN. Ở điều kiện tỷ lệ 85% ACN, 2 pic chưa được tách hoàn toàn. Ở điều kiện tỷ lệ 90% ACN, 2 pic tách rất tốt nhưng thời gian lưu quá dài (>30 phút). Kết quả tách tốt ở điều kiện 87% ACN, hệ số tách của 2 pic Rs=3,03 và thời gian phân tích ở mức hợp lý.

21

a) Điều kiện sắc ký 1

b) Điều kiện sắc ký 2

c) Điều kiện sắc ký 3

d) Điều kiện sắc ký 4

Hình 3.6. Sắc ký đồ các điều kiện đã khảo sát Vậy lựa chọn pha động 87%ACN : 13% dung dịch amoni acetat 50 mM, tốc độ dòng 1,8 mL/phút để định lượng Trp và Tyr trong chế phẩm.

Tuy nhiên, vì trong chế phẩm còn chứa rất nhiều thành phần khác, có những thành phần rửa giải rất muộn. Do đó, để rút ngắn thời gian phân tích, chương trình gradient đã được xây dựng. Sau khi 2 pic cần định lượng đã rửa giải (12 phút), tỷ lệ ACN được giảm xuống tối thiểu theo khuyến cáo cho hệ pha động HILIC (60%) để tăng độ phân cực của pha động tối đa, giúp rửa giải toàn bộ các thành phần còn lại nhanh hơn (từ >60 phút xuống còn 30 phút).

Chương trình gradient được lựa chọn như bảng 3.3.

Bảng 3.3. Chương trình gradient Thời gian

Kênh A

Kênh B

(dung dịch amoni

(ACN)

Tốc độ dòng (mL/phút)

acetat 50 mM) 0 phút

13%

87%

1,8

13 phút

13%

87%

1,8

13,5 phút

40%

60%

1,8

22

19 phút

40%

60%

1,8

19,5 phút

13%

87%

1,8

35 phút

13%

87%

1,8

Vậy phương pháp định lượng đã xây dựng có điều kiện như sau: -

Pha loãng mẫu thử như mục 3.2.1

-

Pha tĩnh: cột Luna Silica 250 × 4,6 mm, 5 μm

-

Pha động: ACN : dung dịch amoni acetat 50 mM, chương trình gradient mô tả trong bảng 3.3

-

Thể tích tiêm mẫu: 20 µL

-

Bước sóng phát hiện: 276 nm

3.3. Thẩm định phương pháp 3.3.1. Độ phù hợp hệ thống Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp Trp và Tyr như ở mục 2.4.1. Tiến hành chạy sắc ký lặp lại 06 lần theo phương pháp định lượng đã xây dựng , ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic. Kết quả độ ổn định hệ thống được thể hiện ở bảng 3.4 và sắc đồ cung cấp trong phụ lục.

Bảng 3.4. Kết quả độ phù hợp hệ thống STT

Trp

Tyr

tR (phút)

S (mAU.s)

tR (phút)

S (mAU.s)

1

8,492

2014,9

11,476

129,1

2

8,511

1997,3

11,509

128,4

3

8,508

2000,1

11,499

126,6

4

8,493

2004,3

11,477

130,5

5

8,511

2000,1

11,501

132,2

6

8,503

1981,0

11,492

128,1

RSD

0,10%

0,77%

0,12%

1,52%

Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các thông số phân tích đều dưới 2%. Như vậy, phương pháp đã khảo sát đạt tiêu chuẩn về độ ổn định hệ thống với hai chất Trp và Tyr. 23

3.3.2. Độ chọn lọc Chuẩn bị các dung dịch thử, dung dịch chuẩn Trp, dung dịch chuẩn Tyr, dung dịch thử thêm chuẩn Trp, dung dịch thử thêm chuẩn Tyr, dung dịch mẫu trắng tiến hành chạy sắc ký. Các sắc ký đồ thu được như hình 3.8.

Hình 3.7. Sắc ký đồ độ chọn lọc Nhận xét: Trên sắc ký đồ mẫu trắng không có đáp ứng tại thời gian lưu của các chất phân tích trong các mẫu chuẩn và mẫu thử. Đối với mẫu thử, thời gian xuất hiện

đáp ứng của mẫu thử tương ứng với thời gian lưu của các acid amin trên sắc ký đồ các mẫu chuẩn.

Kết luận: Phương pháp đã khảo sát đạt tiêu chuẩn về độ chọn lọc với Trp và Tyr. Pic Trp có thời gian lưu khoảng 8,503 phút, pic Tyr có thời gian lưu khoảng 11,501 phút.

3.3.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính Chuẩn bị các mẫu hỗn hợp chuẩn 50%, 80%, 100%, 120%, 150% như mục 2.4.1.

Tiến hành chạy sắc ký theo phương pháp định lượng đã xây dựng. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.5.

24

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát đường chuẩn Trp

Tyr

Nồng độ (ppm)

S (mAU.s)

Nồng độ (ppm)

S (mAU.s)

62

994,0

12,5

57,3

99,2

1631,4

20

97,9

124

2064,2

25

117,8

148,8

2480,1

30

154,7

186

3157,1

37,5

191,1

Y = 17,398x - 92,037

Y = 5,3972x – 11,171

R=0,9999

R=0,9975

3500 3000

y = 17.398x - 92.037 R² = 0.9998

S (mAU.s)

2500 2000

Đường chuẩn Trp

1500 1000 500 0 0

100 C (ppm)

200

250 y = 5.3972x - 11.171 R² = 0.995

S (mAU.s)

200 150

Đường chuẩn Tyr

100 50 0 0

10

20 C (ppm)

30

40

Hình 3.8. Đường chuẩn Trp và Tyr Nhận xét: Từ đường chuẩn hệ số R đều > 0,995 nên có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic khảo sát.

Kết luận: Phương pháp đã khảo sát có khoảng tuyến tính đạt yêu cầu.

25

3.3.4. Độ chính xác của phương pháp Chuẩn bị các mẫu thử như mục 2.4.1 và tiến hành chạy sắc ký theo phương pháp định lượng đã xây dựng. Kết quả thể hiện trong bảng 3.6.

Bảng 3.6. Kết quả độ chính xác của phương pháp Ngày

1

2

STT

STrp

STyr

%HL Trp

%HL Tyr

(mAU.s)

(mAU.s)

1

2159,6

130,0

103,54%

104.63%

2

2164,1

128,9

103,74%

103.81%

3

2155,3

130,6

103,34%

105.07%

4

2164,3

131,4

103,75%

105.66%

5

2177,2

131,1

104,34%

105.44%

6

2189,0

128,0

104,89%

103.14%

TB1 (n=6)

103,93%

104,63%

RSD1 (n=6)

0,55%

0,94%

1

2189,5

127,8

104,91%

102,99%

2

2192,2

125,5

105,03%

101,29%

3

2187,8

125,4

104,83%

101,22%

4

2188,8

125,5

104,88%

101,29%

5

2191,6

124,6

105,01%

100,62%

6

2193,8

124,8

105,11%

100,77%

TB2 (n=6)

104,96%

101,36%

RSD2 (n=6)

0,10%

0,84%

104,45%

102,99%

0,64%

1,86%

TB (n=12) RSD

Nhận xét: RSD của hàm lượng Trp và Tyr ở 6 mẫu độ lặp lại trong ngày và 12 mẫu độ lặp lại khác ngày đều không lớn hơn 2%.

Kết luận: Phương pháp khảo sát có độ lặp lại tốt.

3.3.5. Độ đúng.

Chuẩn bị các mẫu độ đúng như mục 2.4.1 và tiến hành chạy sắc ký theo phương pháp định lượng đã xây dựng. Kết quả thu được thê hiện trong bảng 3.7.

26

Bảng 3.7. Kết quả độ đúng của phương pháp Mức nồng

Nồng độ

Độ thu hồi

STyr

Nồng độ

Độ thu

Trp (ppm)

Trp

(mAU.s)

Tyr

hồi Tyr

STrp (mAU.s)

độ 80%

(ppm) 1680,5

101,88

97,69%

100,7

20,73

100,66%

1675,6

101,60

96,55%

100,8

20,75

101,03%

1684,0

102,08

98,50%

101,6

20,89

104,00%

TB

97,58%

TB

101,90%

RSD

1,00%

RSD

1,79%

100

2170,0

130,02

103.04%

125,1

25,25

100,44%

%

2163,0

129,61

102.23%

123,9

25,03

98,22%

2172.9

130,18

103.38%

124,0

25,04

98,41%

TB

102,89%

TB

99,02%

RSD

0,57%

RSD

1,25%

120

2543,7

151,50

98,86%

155,6

30,90

101,37%

%

2549,0

151,80

99,27%

154,6

30,71

100,13%

2540,5

151,31

98,61%

156,2

31,01

102,11%

TB

98,91%

TB

101,20%

RSD

0,33%

RSD

0,99%

Nhận xét: các giá trị độ thu hồi ở mỗi múc nồng độ đều nằm trong khoảng 95105%, RSD mỗi nồng độ đều dưới mức 2%.

Kết luận: phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng.

3.4. Ứng dụng phương pháp phân tích chế phẩm trên thị trường Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng chế phẩm Kidmin các lô có số lô: 2909024, 2911007 và 2912010. Chế phẩm lô 2912010 đã qua sử dụng (đã mở chai) và bảo quản trong điều kiện 2-8 º C trong 1 tháng. Kết quả định lượng trong bảng 3.8.

27

Bảng 3.8. Kết quả định lượng chế phẩm Lô

29092024

STrp (mAU.s)

STyr (mAU.s)

%HL Trp

%HL Tyr

2189,5

127,8

104,91%

102,99%

2192,2

125,5

105,03%

101,29%

2187,8

125,4

104,83%

101,22%

104,93%

101,83%

TB

2911007

1827,1

142,2

88,25%

113,67%

1801,2

139,3

87,06%

111,52%

1824,1

139,0

88,11%

111,30%

87,80%

112,16%

TB

2912010

1062,1

59,6

53,07%

52,45%

1091,4

61,0

54,42%

53,49%

1075,0

59,1

53,66%

52,08%

53,72%

52,67%

TB

Yêu cầu theo USP: Hàm lượng đạt từ 85-115% [13].

Theo kết quả lô 29092024 và 2911007 đạt theo tiêu chuẩn USP, còn lô 2912010 không đạt theo tiêu chuẩn USP. Vì tryptophan là một acid amin kém bền, một số nghiên cứu đã đề xuất sử dụng hàm lượng Trp trong các chế phẩm đa acid amin làm yếu tố để đánh giá độ ổn định của chế phẩm [22, 23]. Theo đó chế phẩm lô 2912010 do đã qua sử dụng nên có thể đã bị phân hủy. Kết quả cho thấy phương pháp vừa xây dựng có thể được sử dụng để đánh giá độ ổn định của chế phẩm thay cho việc định lượng toàn bộ acid amin trong chế phẩm.

3.5. Bàn luận Ảnh hưởng của tỷ lệ ACN (phần 3.1.2.1): Giống với sắc ký phân bố truyền thống, khi thay đổi tỷ lệ ACN thì độ phân cực của pha động giảm nên làm giảm rửa giải các chất phân tích phân cực (phần 3.1.2.1). Ảnh hưởng của nồng độ muối (phần 3.1.2.2): Không giống RP-LC. Trong RP-LC, khi tăng nồng độ muối thì làm tăng độ phân cực của pha động, do đó thời gian lưu của các chất phân cực sẽ giảm. Nếu chỉ giải thích bằng tương tác của sắc ký phân bố thì không giải thích được xu hướng này. Cách giải thích được đề xuất cho kết quả này là do sự thay đổi bề dày của lớp pha tĩnh giả trên bề mặt pha tĩnh [10]. Khi bề mặt pha tĩnh 28

thực mang điện, các ion trong muối được hấp phụ nhiều hơn vào pha tĩnh thực do tương tác tĩnh điện, đồng thời làm tăng bề dày của lớp pha tĩnh giả. Lớp pha tĩnh giả dày hơn làm tăng lưu giữ các chất theo cơ chế phân bố, làm tăng thời gian lưu. Khi pha tĩnh hấp phụ bão hòa, bề dày pha tĩnh giả đạt một giới hạn thì tiếp tục tăng nồng độ muối sẽ làm giảm thời gian lưu do tăng nồng độ muối làm tăng tính phân cực của pha động, tăng rửa giải các chất phân tích phân cực. Ảnh hưởng của bàn chất acid/muối (phần 3.1.2.3): Sự cân xứng hơn của pic sắc ký ở pha động bản chất là muối được giải thích như sau: Tương tác tĩnh điện của NH4+ với OH- trên cột silica (pH 6,5 bề mặt silica mang điện âm) làm giảm tương tác tĩnh điện của các nhóm OH- của silica với chất phân tích, nhờ đó làm giảm sự mở rộng dải. Dung dịch acid với nhóm COOH hoặc COO- (chủ yếu là COOH) không có hiệu ứng này.

Việc sử dụng cột amid (pha tĩnh không mang điện) sẽ làm giảm hiện tượng mở rộng dải triệt để hơn, cho pic sắc ký rất cân xứng (như phần 3.1.1).

Như vậy trong HILIC bản chất muối và nồng độ muối/đệm ảnh hưởng cùng một lúc đến nhiều yếu tố/tương tác: hấp phụ, tĩnh điện, phân bố (chất phân tích – pha tĩnh thật, chất phân tích – pha tĩnh giả, chất phân tích – pha động).

Những nhận định này cũng đã được công bố trong bài báo đăng trên Tạp chí Nghiên cứu Dược và Thông tin thuốc (phụ lục 6). Áp dụng những khảo sát này vào xây dựng phương pháp để định lượng Trp và Tyr trong chế phẩm và thẩm định phương pháp thành công. Phương pháp định lượng đã được thẩm định đạt yêu cầu theo hướng dẫn của ICH [12].

29

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Sau thời gian nghiên cứu và làm thực nghiệm, khóa luận đã hoàn thành các mục tiêu sau:  Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên thời gian lưu và khả năng tách một số acid amin : - Pha tĩnh: ở cả 2 pha tĩnh silica và amid thì thứ tự rửa giải đều theo thứ tự là Trp, Phe, Tyr. - Tỷ lệ ACN trong pha động: tăng tỷ lệ ACN làm tăng thời gian lưu và tăng khả năng tách của Trp, Phe, Tyr. - Bản chất muối/acid của dung dịch trong pha động: bản chất muối/acid của pha động không làm thay đổi nhiều thời gian lưu của chất phân tích trên cột silica. Pha động chứa muối cho pic sắc ký cân xứng hơn so với pha động chứa acid.

- Nồng độ muối trong pha động: trên cột silica, khi tăng dần nồng độ muối thì thời gian lưu ban đầu tăng sau đó giảm dần. Tăng nồng độ muối cũng làm tăng khả năng tách các acid amin Trp, Phe, Tyr.  Xây dựng phương pháp định lượng Trp và Tyr trong chế phẩm Kidmin: - Chuẩn bị mẫu: hút chính xác 1 mL chế phẩm vào bình định mức 20 mL, thêm khoảng 4 mL nước cất, sau đó định mức từ từ đồng thời lắc đều bằng ACN. - Chương trình sắc ký: + Pha tĩnh: cột Luna Silica 250 × 4,6 mm, 5µm. + Pha động: chương trình gradient như bảng 3.3 + Bước sóng phát hiện: 276nm. + Thể tích tiêm mẫu: 20 µL. - Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn ICH, đạt trên các tiêu chí: + Độ phù hợp hệ thống. + Độ chọn lọc. + Đường chuẩn và khoảng tuyến tính. + Độ chính xác. + Độ đúng.

- Định lượng chế phẩm Kidmin trên thị trường (2 lô chế phẩm mới)

30

4.2. Kiến nghị Dựa trên kết quả nghiên cứu, tôi đưa ra một vài đề xuất như sau: -

Khảo sát thêm các yếu tố ảnh hưởng trên pha tĩnh tích điện dương (ví dụ như cột amino).

-

Mở rộng đối tượng khảo sát trên các acid amin có khả năng lưu giữ tốt hơn.

-

Xây dựng phương pháp định lượng các acid amin trên cột amid.

-

Áp dụng phương pháp định lượng đã xây dựng trên các chế phẩm khác chứa nhiều acid amin trên thị trường.

31

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1.

Bộ khoa học và Công nghệ (2012), "Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8764:2012 Thức ăn chăn nuôi – Phương pháp xác định hàm lượng acid amin".

2.

Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, NXB Y học, Hà Nội.

3.

Bộ Y Tế (2014), Hóa sinh học, NXB Y học, Hà Nội.

4.

Lê Duy Cường, Trần Thị Chi Mai (2016), "Định lượng acid amin tự do trong dịch sinh học bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng", Tạp chí nghiên cứu y học, Tập 102(4), tr 62-67.

5.

Lê Thị Hồng Hảo (2008), Nghiên cứu tối ưu các điều kiện để tách và xác định một số acid amin trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Luận án tiến sĩ hóa học, Đại học Khoa học tự nhiên.

Tiếng Anh 6.

Alpert A. J. (2018), "Effect of salts on retention in hydrophilic interaction chromatography", J Chromatogr A, 1538, pp. 45-53.

7.

Alpert A. J. (1990), "Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds", J Chromatogr, 499, pp.

177-196.

8.

Buszewski B., Noga S. (2012), "Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique", Anal Bioanal Chem, 402(1), pp. 23147.

9.

Gray N., Plumb R. S., Wilson I. D., Nicholson J. K. (2019), "A validated UPLCMS/MS assay for the quantification of amino acids and biogenic amines in rat urine", J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1106-1107, pp. 50-57.

10.

Guo Y., Gaiki S. (2011), "Retention and selectivity of stationary phases for hydrophilic interaction chromatography", J Chromatogr A, 1218(35), pp. 592038.

11.

Guo Y., Srinivasan S., Gaiki S. (2007), "Investigating the Effect of Chromatographic Conditions on Retention of Organic Acids in Hydrophilic Interaction Chromatography Using a Design of Experiment", Chromatographia, 66(3-4), pp. 223-229.

12.

ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), "Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1)".

13.

Inc United States Pharmacopeial Convention (2018), USP 41 - NF 36 The United States Pharmacopeia and National Formular.

14.

Kumar P., Rubies A., Companyo R., Centrich F. (2012), "Hydrophilic interaction chromatography for the analysis of aminoglycosides", J Sep Sci, 35(4), pp. 498504.

15.

Li R., Zhang Y., Lee C. C., Lu R., Huang Y. (2010), "Development and validation of a hydrophilic interaction liquid chromatographic method for determination of aromatic amines in environmental water", J Chromatogr A, 1217(11), pp. 1799805.

16.

Malerod H., Rogeberg M., Tanaka N., Greibrokk T., Lundanes E. (2013), "Large volume injection of aqueous peptide samples on a monolithic silica based zwitterionic-hydrophilic interaction liquid chromatography system for characterization of posttranslational modifications", J Chromatogr A, 1317, pp.

129-37.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

McCalley D. V. (2017), "Understanding and manipulating the separation in hydrophilic interaction liquid chromatography", J Chromatogr A, 1523, pp. 4971.

Omar M. M. A., Elbashir A. A., Schmitz O. J. (2017), "Capillary electrophoresis method with UV-detection for analysis of free amino acids concentrations in food", Food Chem, 214, pp. 300-307.

Prinsen Hcmt, Schiebergen-Bronkhorst B. G. M., Roeleveld M. W., Jans J. J. M., de Sain-van der Velden M. G. M., Visser G., van Hasselt P. M., Verhoeven-Duif N. M. (2016), "Rapid quantification of underivatized amino acids in plasma by hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) coupled with tandem mass-spectrometry", J Inherit Metab Dis, 39(5), pp. 651-660.

Rodríguez-Gonzalo Encarnación, García-Gómez Diego (2018), "Hydrophilic Interaction Chromatography: Current Trends and Applications", Reference Module in Chemistry, Molecular Sciences and Chemical Engineering.

Rutherfurd S. M., Gilani G. S. (2009), "Amino acid analysis", Curr Protoc Protein Sci, Chapter 11, Unit 11.9.

Unger N., Ferraro A., Holzgrabe U. (2020), "Investigation of tryptophan-related yellowing in parenteral amino acid solution: Development of a stabilityindicating method and assessment of degradation products in pharmaceutical formulations", J Pharm Biomed Anal, 177, pp. 112839.

Unger N., Holzgrabe U. (2018), "Stability and assessment of amino acids in parenteral nutrition solutions", J Pharm Biomed Anal, 147, pp. 125-139.

Vancompernolle B., Croes K., Angenon G. (2016), "Optimization of a gas chromatography-mass spectrometry method with methyl chloroformate derivatization for quantification of amino acids in plant tissue", J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1017-1018, pp. 241-249.

PHỤ LỤC Danh mục các phụ lục: Phụ lục 1. Cấu trúc các acid amin cơ bản

PL-2

Phụ lục 2. Thành phần của chế phẩm tiêm truyền Kidmin

PL-5

Phụ lục 3. Sắc ký đồ thẩm định độ chọn lọc

PL-6

Phụ lục 4. Sắc ký đồ thẩm định độ phù hợp hệ thống

PL-8

Phụ lục 5. Sắc ký đồ thẩm định khoảng xác định

PL-10

Phụ lục 6. Bài báo khoa học đã được công bố

PL-15

PL-1

Phụ lục 1. Cấu trúc các acid amin cơ bản

Tên gọi (Tên viết tắt)

Công thức cấu tạo

Glycine (gly)

Alanine (ala)

Proline (Pro)

Valin (Val)

Leucin (Leu)

Isoleucine (Ile)

PL-2

Methionine (Met)

Serine (Ser)

Threonine (Thr)

Cysteine (Cys)

Asparagine (Asn)

Glutamine (Gln)

Phenylalanine (Phe)

PL-3

Tyrosine (Tyr)

Tryptophan (Trp)

Lysine (Lys)

Arginine (Arg)

Histidine (His)

Acid aspatic (Asp)

Acid glutamic (Glu)

PL-4

Phụ lục 2. Thành phần của chế phẩm tiêm truyền Kidmin Mỗi 200 mL chế phẩm chứa: L-leucine 2.8g, L-isoleucine 1.8g, L-valine 2g, L-lysine acetate 1.42g (tương đương L-lysine 1.01g), L-methionine 0.6g, L-phenylalanine 1g, L-threonine 0.7g, L-tryptophan 0.5g, L-histidine 0.7g, L-arginine 0.9g, L-tyrosine 0.1g, L-alanine 0.5g, L-aspartic acid 0.2g, L-cysteine 0.2g, L-glutamic acid 0.2g, Lproline 0.6g, L-serine 0.6g. Tổng lượng acid amin 14.4g, tỉ lệ acid amin thiết yếu/ acid amin không thiết yếu E/N = 2.6, lượng acid amin phân nhánh 45.8%, Na+ 0.4mEq/L, Acetate- 9mEq/L, áp suất thẩm thấu 580mOsm/L.

PL-5

Phụ lục 3. Sắc ký đồ thẩm định độ chọn lọc

PL-6

PL-7

Phụ lục 4. Sắc ký đồ thẩm định độ phù hợp hệ thống

PL-8

PL-9

Phụ lục 5. Report thẩm định đường chuẩn và khoảng xác định

PL-10

PL-11

PL-12

PL-13

PL-14

Phụ lục 6. Bài báo khoa học đã công bố

PL-15

PL-16

PL-17

PL-18

PL-19

PL-20

PL-21

PL-22