XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI 4 HYDROXYDERRICIN VÀ XANTHOANGELOL TRONG THỰC PHẨM

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÝ TRUNG KIÊN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI 4-HYDROXYDERRICIN VÀ XANTHOANGELOL TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHALCONE BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÝ TRUNG KIÊN 1401338

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI 4-HYDROXYDERRICIN VÀ XANTHOANGELOL TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHALCONE BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: 1. ThS. Nguyễn Lâm Hồng 2. ThS. Lê Hồng Dũng Nơi thực hiện Khoa Hóa Thực phẩm - Viện Dinh Dưỡng Quốc gia

HÀ NỘI - 2019

LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện, khóa luận “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng đồng thời 4-Hydroxyderricin và Xanthoangelol trong thực phẩm chức năng chứa chalcon bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” đã hoàn thành. Để có được kết quả này, em đã nhận được rất nhiều sự động viên, giúp đỡ từ phía nhà trường, bộ môn Hóa phân tích Độc chất và nơi em thực hiện đề tài - Viện Dinh Dưỡng Quốc gia.

Trước tiên, em xin bày tỏ sự biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới ThS. Nguyễn Lâm Hồng - giảng viên Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất, người đã tận tình hướng dẫn và theo sát em trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận.

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Lê Hồng Dũng, người đã trực tiếp hướng dẫn, quan tâm và tạo điều kiện tối đa cho em trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu. Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị tại khoa Hóa thực phẩm - Viện Dinh Dưỡng Quốc gia đã giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu.

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận, việc xuất hiện các thiếu sót trong bài báo cáo là không tránh khỏi. Em rất mong nhận được các đóng góp, chỉ dẫn của thầy cô để khóa luận của em được tiếp tục hoàn thiện hơn.

Em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2019 Sinh viên Lý Trung Kiên

i

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i MỤC LỤC .................................................................................................................. ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .................................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ................................................................... vi ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN...................................................................................... 2 1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu .............................................................. 2 1.1.1. Chalcone ................................................................................................... 2 1.1.2. Xanthoangelol ........................................................................................... 2 1.1.3. 4-Hydroxyderricin ..................................................................................... 3 1.1.4. Sản phẩm chứa Xanhoangelol và 4-Hydroxyderricin ................................. 3 1.1.5. Một số tính chất sinh hóa của Xanhoangelol và 4-Hydroxyderricin ........... 4 1.1.6. Một số phương pháp phân tích 4-Hydroxyderrcin và Xanthoangelol ......... 7 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 9 2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 9 2.2. Nguyên vật liệu ............................................................................................... 9 2.2.1. Chất chuẩn................................................................................................. 9 2.2.2. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn ................................................................... 9 2.2.3. Chuẫn bị dung dịch mẫu placebo ............................................................... 9 2.2.4. Dung môi, hóa chất.................................................................................... 9 2.2.5. Thiết bị, dụng cụ........................................................................................ 9 2.2.6. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 10 2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 10 2.3.1. Kháo sát các điều kiện phân tích xanthoangelol và 4-hydroxyderricin bằng HPLC ........................................................................................................................ 10 2.3.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu................................................................... 11 2.3.3. Thẩm định quy trình ................................................................................ 12 2.4. Xử lý kết quả ................................................................................................. 14 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................... 15 ii

3.1. Xây dựng quy trình phân tích ...................................................................... 15 3.1.1. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký ..................................................................... 15 3.1.2. Điều kiện sắc ký tối ưu ............................................................................ 20 3.1.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu ................................................................... 20 3.1.4. Quy trình chiết tối ưu............................................................................... 23 3.2. Thẩm định phương pháp .............................................................................. 24 3.2.1. Độ ổn định của hệ thống HPLC ............................................................... 24 3.2.2. Tính đặc hiệu của hệ thống ...................................................................... 24 3.2.3. Khoảng tuyến tính ................................................................................... 26 3.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng (LOD và LOQ) ...................... 28 3.2.5. Độ lặp lại ................................................................................................. 29 3.2.6. Độ thu hồi................................................................................................ 30 3.3. Ứng dụng phương pháp phân tích thực phẩm chức năng chalcone ........... 31 3.4. Bàn luận ........................................................................................................ 32 3.4.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 32 3.4.2. Điều kiện sắc ký HPLC ........................................................................... 32 3.4.3. Quy trình xử lý mẫu................................................................................. 32 3.4.4. Thẩm định phương pháp .......................................................................... 33 3.4.5. Ứng dụng định lượng trên thực phẩm chức năng chứa chalcon ................ 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu

Tiếng Anh

Tiếng Việt

4-HD

4-Hydroxyderricin

ACN

Acetonitrile

CV

Coefficient of Variation

Hệ số biến thiên

ESI

Electrospray ionization

Ion hóa phun điện tử

GSH

Glutathion Hàm lượng so với nhãn

HLSVN HPLC

High Performance Liquid Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IC

Inhibitory Concentration

Nồng độ ức chế

LC

Liquid Chromatography

Sắc ký lòng

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LogD

Octanol/water Distribution Coefficient

Hệ số phân bố octanol/nước

LogP (o/w)

Octanol/water Partition Coefficient

Hệ số phân tán octanol/nước

LOQ

Limit of Qualification

Giới hạn định lượng

MeOH

Methanol

MS

Mass Spectrometry

Khối phổ

PDA

Photodiode Array Detector

Detector mảng diod

RS

Resolution

Độ phân giải

RSD %

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn Tiêu chuẩn cơ sở

TCCS UV

Untraviolet

XA

Xanthoangelol

Tử ngoại

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số phương pháp phân tích 4-HD và XA ................................................ 7 Bảng 1.2: Phương pháp định lượng dựa trên TCCS..................................................... 8 Bảng 3.1: Kết quả độ ổn định của hệ thống HPLC .................................................... 24 Bảng 3.2: Thông số peak purity mẫu thử ................................................................... 26 Bảng 3.3: Nồng độ và diện tích peak của 4-HD ......................................................... 27 Bảng 3.4: Nồng độ và diện tích peak của xanthoangelol ............................................ 27 Bảng 3.5: Giá trị S/N của các pic thêm chuẩn và kết quả LOQ, LOD ........................ 28 Bảng 3.6: Kết quả độ lặp lại ...................................................................................... 29 Bảng 3.7: Kết quả độ thu hồi ở ba mức nồng độ thấp, trung bình và cao ................... 30 Bảng 3.8: Kết quả định lượng thực phẩm chức năng Chalcone.................................. 31

v

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Cấu trúc Chalcone ....................................................................................... 2 Hình 1.2: Cấu trúc Xanthoangelol ............................................................................... 2 Hình 1.3: Cấu trúc 4-Hydroxyderricin ......................................................................... 3 Hình 1.4: Một số thực phẩm chức năng chứa 4-HD và XA .......................................... 4 Hình 2.1: Sơ đồ quy trình chiết xuất dự kiến .............................................................. 11 Hình 3.1: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp sử dụng cột Inertsil C8 ....................................... 15 Hình 3.2: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp sử dụng cột Phenomenex Luna C18(2) ............... 16 Hình 3.3: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp sử dụng cột Agilent 5-HC C18(2) ....................... 16 Hình 3.4: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dùng pha động MeOH/H2O (7/3) ....................... 17 Hình 3.5: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dùng pha động MeOH/H2O (8/2) ....................... 18 Hình 3.6: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dùng pha động MeOH/H2O (9/1) ....................... 18 Hình 3.7: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dùng pha động MeOH ........................................ 19 Hình 3.8: Phổ hấp thụ của 4-HD và XA ..................................................................... 19 Hình 3.9: So sánh giữa siêu âm và lắc ngang ............................................................ 20 Hình 3.10: So sánh giữa các tỷ lệ dung môi chiết ...................................................... 21 Hình 3.11: So sánh giữa các khoảng thời gian chiết .................................................. 21 Hình 3.12: So sánh giữa các nhiệt độ chiết ................................................................ 22 Hình 3.13: So sánh giữa số lần chiết ......................................................................... 23 Hình 3.14: Sơ đồ quy trình chiết xuất tối ưu .............................................................. 23 Hình 3.15: Sắc ký đồ mẫu placebo ............................................................................. 25 Hình 3.16: Sắc ký đồ mẫu placebo thêm chuẩn .......................................................... 25 Hình 3.17: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp.......................................................................... 25 Hình 3.18: Kết quả peak purity mẫu thử .................................................................... 26 Hình 3.19: Biểu đồ mối tương quan nồng độ - diện tích peak của 4-HD .................... 27 Hình 3.20: Biểu đồ mối tương quan nồng độ - diện tích peak của xanthoangelol ....... 27 Hình 3.21: Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn LOQ .............................................................. 29

vi

ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, với sự phát triển không ngừng của xã hội, nhu cầu chăm sóc sức khỏe của con người ngày càng cao. Chính vì vậy, ngày càng có nhiều người quan tâm và tìm đến các sản phẩm bảo vệ và nâng cao sức khỏe, trong số đó thực phẩm chức năng với các thành phần được công bố có nguồn gốc tự nhiên đang ngày càng được ưa chuộng.

Những năm trở lại đây, các dịch chiết từ bộ phận của cây Angelica keiskei, một loài cây phân bố chủ yếu ở Nhật Bản, ngày càng được quan tâm. Dịch chiết của giống cây này đã được chức minh khả năng ức chế phát triển khối u, cải thiển tình trạng viêm, béo phì, tiểu đường, tăng huyết áp. Mặt khác, chúng cũng cho thấy hoạt tính chống huyết khối, chống oxy hóa, chống tăng lipid, chống virus và ức chế vi khuẩn [6]. Trong đó, hai chalcon là thành phần chính, 4-hydroxyderricin và xanthoangelol, tồn tại chủ yếu ở dạng aglycon, với hàm lượng tương ứng mỗi chất trong dịch chiết thô của A. keiskei là 1,5% và 2,6%, đã đóng vai trò quan trọng với các tác dụng sinh học này [13]. Bởi vậy, các sản phẩm thương mại hóa cũng được phát triển trên thế giới, đặc biệt là thực phẩm phẩm chứ năng tại Nhật Bản: Chalcone Ashitaba Powder, Percent 36 Energy Booster.

Tuy nhiên, các sản phẩm tương tự hiện nay vẫn chưa phổ biến tại Việt Nam. Chính vì vậy, tại Viện Dinh Dưỡng Quốc gia, với nhu cầu phát triển sản phẩm chứa hai loại chalcon này, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng đồng thời 4-Hydroxiderrcin và Xanthoangelol trong thực phẩm chức năng chứa chalcone bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với các mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình định lượng đồng thời hàm lượng 4-Hydroxyderrcin và Xanthoangelol trong thực phẩm chức năng chứa chalcon.

-

Ứng dụng quy trình đã xây dựng để định lượng sản phẩm chức năng Chalcone

đang lưu hành trên thị trường.

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 1.1.1. Chalcone

O

Hình 1.1: Cấu trúc Chalcone -

Công thức: C15H12O - CAS number: 94-41-7.

-

Tên khoa học: (E)-1,3-diphenylpropenon.

-

Phân tử lượng: 208,3g/mol.

-

LogP (o/w): 3,12 [21].

1.1.2. Xanthoangelol HO

H3C

OH

OH CH3

O

CH3

Hình 1.2: Cấu trúc Xanthoangelol -

Công thức: C25H28O4 - CAS number: 62949-76-2.

-

Tên khoa học: (E)-1- [3-[(2E)-3,7-dimethylocta-2,6-dienyl]-2,4-

dihydroxyphenyl]-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-on.

-

Phân tử lượng: 392,5 g/mol.

-

Độ tan trong nước: 0,0039 mg/L ở 25oC, tan tốt trong dung môi hữu cơ không

phân cực như methanol, acetonitrile,….

-

LogP (o/w): 6,16.

-

LogD (pH = 7,4): 5,84.

-

pKa = 7,57 [22].

2

1.1.3. 4-Hydroxyderricin OH

CH3 O

H3C

OH

O

CH3

Hình 1.3: Cấu trúc 4-Hydroxyderricin -

Công thức: C21H22O4 - CAS number: 55912-03-3.

-

Tên khoa học: (E)-1-[2-hydroxy-4-methoxy-3-(3-methylbut-2-enyl)phenyl]-3-

(4-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-on.

-

Phân tử lượng: 338,4 g/mol.

-

Độ tan trong nước: 0,0038 mg/L ở 25oC, tan tốt trong dung môi hữu cơ không

phân cực như methanol, acetonitrile,…

-

LogP (o/w): 5,18.

-

LogD (pH = 7,4): 5,04.

-

pKa = 7,87 [20].

1.1.4. Sản phẩm chứa Xanhoangelol và 4-Hydroxyderricin XA và 4-HD lần đầu tiên được xác định thông qua nghiên cứu của Kozawa và cộng sự [9]. Từ đó đến nay, các sản phẩm có nguồn gốc từ cây Ashitaba với 2 thành phần chính là XA và 4-HD đã được thương mại hóa tại Nhật Bản dưới nhiều tên gọi khác nhau. Các sản phẩm này hướng đến nhiều tác dụng sinh học khác nhau: điều trị giảm cân, giảm mỡ, chống oxi hóa, v.vv…

3

Hình 1.4: Một số thực phẩm chức năng chứa 4-HD và XA Trong nghiên cứu của chúng tôi, thực phẩm chức năng Chalcone được phát triển hướng tới việc tăng cường chuyển hóa chất béo, qua đó hỗ trợ giảm cân và hướng tới đối tượng người sử dụng trưởng thành có nguy cơ thừa cân, béo phì, người có chỉ số khổi cơ thể BMI > 23 (kg/m2). Tác dụng này đã được chứng minh qua nghiên cứu ngẫu nhiên có đối chứng, mù đôi trên đối tượng cả chuột và người của Katsunori và cộng sự.

Mối đối tượng chia làm 2 nhóm: 1 nhóm sử dụng bột chiết Ashitaba có thành phần chính là XA và 4-HD, 1 nhóm sử dụng giả dược kéo dài trong 8 tuần. Kết quả cho thấy có sự giảm đáng kể về lượng mỡ nội tạng và trọng lượng cơ thể ở nhóm được dùng chế phẩm [16].

1.1.5. Một số tính chất sinh hóa của Xanhoangelol và 4-Hydroxyderricin a. Hấp thu và chuyển hóa  Phân bố: 4-HD và XA được tìm thấy ở tất cả các mô được kiểm tra sau 2 giờ uống, chủ yếu ở dạng aglycon, trừ tế bào mỡ ở màng treo ruột lại là dạng liên hợp. Điều này gợi ý rằng các chalcon Ashitaba có thể đi vào qua tĩnh mạch cửa và ống bạch huyết tương tự như các chất chuyển hóa, sau đó được chuyển lại thành dạng aglycon trong cơ thể [13].  Thải trừ: 4-HD và XA được thải trừ chủ yếu ở dạng aglycon dạng liên hợp (glucuronat và/ hoặc sulfat) trong nước tiểu trong khoảng từ 2 đến 4 giờ sau khi uống.

Trong phân, các chất này chỉ thải trừ dưới dạng aglycon. Thời gian XA được duy trì trong cơ thể chuột dài hơn 4-HD. Tuy nhiên, lượng aglycon phát hiện được trong phân và nước tiểu thấp hơn rất nhiều so với liều dùng [13]. b. Độc tính: Trong một thử nghiệm trên chuột, bột Ashitaba chalcon không có độc tính với di truyền. Với hệ bạch huyết ở hỗng tràng, có xuất hiện độc tính thấp khi sử dụng liều cao 4

(1000 mg/kg) ở cả 2 giới. Bên cạnh đó, có sự liên quan giữu liều và bệnh thận α-2globulin trên chuột đực. Liều cao nhất không gây độc với bột Ashitaba chalcon là 300 mg/kg ở cả chuột đực và chuột cái [11]. Trong một nghiên cứu đối chứng – giả dược, mù đôi trên 26 người lớn béo phì nam và nữ kéo dài 56 ngày, kết quả cho thấy không có sự khác biệt giữa nhóm 2 nhóm thử nghiệm và liều 200 mg Ashitaba chalcon hằng ngày duy trì trong 56 ngày được coi là an toàn [16]. c. Tác dụng dược lý  Hoạt tính chống loét dạ dày Trong một thí nghiệm in-vitro sử dụng tế bào niêm mạc dạ dày lợn, 2 dẫn chất chalcon, XA và 4-HD ức chế bơm H+-K+-ATPase với 2 giá trị IC50 tương ứng là 1,8 và 3,3 µM. Hai chất ức chế cạnh tranh với ATP và không cạnh tranh với K+. Hoạt tính ức chế vận chuyển proton ở thí nghiệm này phụ thuộc liều. Đặc biệt, XA ở nồng độ 100 mg/kg ức chế đáng kể sự tiết acid dạ dày và sự hình thành các tổn thương tại dạ dày do stress [12].  Hoạt tính kháng khuẩn Trong một thí nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên Streptococcus aureus, với việc được làm giàu bằng một bộ liên kết phân tách hóa học, 4-HD ức chế trực tiếp hoạt tính enzyme seryl-tARN synthetase bằng cơ chế alkyl hóa lượng dư cysteine cần thiết có trong enzym và do đó có thể gây chết tế bào do sự suy giảm sinh tổng hợp protein của vi khuẩn [2].  Hoạt tính hạ đường huyết Trong thí nghiệm của Kawataba và cộng sự trên tế bào cơ L6, 4-HD và XA ở nồng độ 10 µg/ml làm tăng hấp thu đáng kể 2-deoxyglucozo trong tế bào lên 1,9 lần so với nhóm chứng dùng dimethyl sulfoxit. Xét trên tính chất phụ thuộc thời gian, cả 2 chalcon này trong 1-2 giờ làm tăng đáng kể nồng đồ 2-deoxyglucozo trong tế bào với mức tương đương với với imsulin. Bên cạnh đó, dích chiết Ashitaba sau khi được làm giàu chứa 150,6 mg/g 4-HD và 146,0 mg/g XG ức chế tăng đường huyết cấp tính trong một thử nghiệm dung nạp bằng đường uống trên chuột [5].  Hoạt tính chống viêm Theo nghiên cứu in vitro của Yasuda và cộng sự trên đại thực bào RAW264 chuột, 4 – hydroxyderricin (10 µg/ml) và XA (10 µg/ml) làm giảm đáng kể sự tiết nito oxit (sản phẩm trung gian của lipopolysaccharid gây viêm) so với chalcon (25 µg/ml).

5

Hai chất này cũng ức chế sự tiết lipopolysaccharide này của tế bào TNF-α và biểu hiện của enzyme cảm ứng tổng hợp nito oxid và cyclooxygenase-2. Mặt khác, cả 2 chalcon đều làm giảm mức độ phosphoryl hóa (ở mức serin 536) của tiểu đơn vị p65 của NFκB. Chính vì vậy, 4-HD và XG hứa hẹn trong việc phòng phừa các bệnh viêm nhiễm [19].  Hoạt tính hạ huyết áp Theo nghiên cứu trên chuột tăng huyết áp tự phát có nguy cơ đột quỵ, kết quả cho thấy chế độ ăn uống có 4-HD ức chế mạnh huyết áp tâm thu, làm giảm nồng độ lipoprotein tỷ trọng rất thấp huyết thanh và hàm lượng triglycerid trong gan [15].  Hoạt tính chống oxy hóa Theo nghiên cứu của Luo và cộng sự, sử dụng phương pháp LC-MS dùng glutathion làm chất nền, XA và 4-HD có khả năng kết hợp với GSH rất nhanh và có thể đem đến việc cảm ứng ở múc độ nhất định enzym nicotinamide adenin dinucleotide (phosphate): quinion oxidoreductase 1. Mặt khác, enzyme này đã được chứng minh là xúc tác cho các quinon, như menadion và hydroquinon giúp chống lại các tổn thương oxi hóa. Chính vì vây, đây là cơ sở hóa học hướng tới các lợi ích của XA và 4-HD với các thuốc chống ung thư [10].  Hoạt tính chống ung thư Thử nghiệm trên chuột mang tế bào ung thư phổi Lewis, kết quả cho thấy XA đường uống (50mg/kg, 2 lần 1 ngày) ức chế chính sự tăng trưởng khối u và di căn đến phổi, giảm trọng lượng phổi, kéo dài thời gian sống và tăng tủ lệ sống sót của chuột.

Hơn thế nữa, XA (50 hoặc 100 mg/kg 1 ngày) ức chế khối u di căn đến gan và sự tăng trưởng của khối u ở gan chuột. Bên cạnh đó, XG phân lập từ Angelica keiskei không gây ra các phản ứng có hại nghiêm trọng như tăng cân hay tử vong trên chuột [7].  Hoạt tính chống trầm cảm Theo nghiên cứu của Kim và cộng sự trên chuột trên chuột, kết quả cho thấy XA có khả năng ức chế enzym monoamine oxidazo không chọn lọc. Khả năng ức chế này tương tự tinh chất của iproniazid. Mặt khác, nghiên cứu còn cho thấy 4-HD là môt chất ức chế enzym monoamine oxidazo - B chọn lọc tiềm năng. Giá trị IC50 của 4-HD tuy cao hơn thuốc chứng (deprenyl) nhưng với do mục đích sử dụng làm thực phẩm, giá trị này vẫn rất thấp [3].

6

1.1.6. Một số phương pháp phân tích 4-Hydroxyderrcin và Xanthoangelol 1. Theo TLTK được trình bày ở bảng 1.1 sau: Bảng 1.1: Một số phương pháp phân tích 4-HD và XA STT

1

Nền mẫu

Phương pháp

Mẫu thử

HPLC –

bột

Cột sắc ký

Pha dung môi

Điều kiện sắc ký

Phương pháp chiết

Cột

A: Acid acetic: nước

Tốc độ dòng: 1 ml/phút.

Chiết 1g mẫu

UV –

Eclipse

(0,1 : 100).

Thời gian cân bằng giữa các

bằng MeOH trong

nghiền

ESI –

XDB-C18 B: Acid acetic: methanol

lần tiêm: 10 phút.

6h, có lắc ở nhiệt

nhỏ

MS

(4,6 x 150 (0,1 : 100).

Thể tích tiệm 10 µl.

độ phòng.

Angelica

mm; 5

Chế độ gradient:

 UV: 200-400 nm.

keiskei

µm)

0-3 phút: 90% B.

Đỉnh: 254 và 310 nm.

trên ly tâm 3000

(lá, rễ, vỏ

(Agilent)

3-8 phút: 60% B.

 Chế độ ion hóa ESI+

vòng/5 phút.

8-13 phút: 60% B.

Áp suất phun: 60 psi.

13-33 phút: 100% B.

Tốc độ thổi khí: 8 lít/phút.

lọc 0,45 µm rồi

33-38 phút: 100% B.

Nhiệt độ làm khô: 550oC.

đem đí sắc ký

Quét từ m/z: 100 - 500

HPLC.

rễ)

7

TLTK

Dịch chiết phía

Lọc qua màng

[17]

2

Rễ, thân

HPLC -

Cột Halo

A: Acid formic: nước

Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút.

lá cấy

PDA

C18 (4,6

(0,1 : 100).

Thể tích tiêm: 5 µl.

Angelica

x 150

B: MeOH.

Nhiệt độ cột: 40oC.

keiskei

mm; 2,7

Chế độ gradient:

Bước sóng: 370 nm.

µm)

0 - 2 phút: 30% A

[18]

2 - 40 phút: 30 - 0% A. 40 - 45 phút: 0% A. 45 - 50 phút: 30% A. 2. Theo tiêu chuẩn cơ sở của công ty Janpan Bio Science Laboratory Co., Ltd trên nền mẫu nguyên liệu và sản phẩm chức năng chứa chalcon [4] trình bày ở bảng 1.2 sau: Bảng 1.2: Phương pháp định lượng dựa trên TCCS Phương pháp

Cột sắc ký

Pha dung môi

Điều kiện sắc ký

HPLC -

Cột Agilent HC – MeOH /H2O : Tốc độ dòng: 1

DAD

C18 (2) 150 x 4,6 8/2

ml/phút.

mm

Thể tích tiêm: 10 µl.

UV: 365 nm

Phương pháp chiết 0,1-1g mẫu vào bình tam giác 100ml, thêm 20 ml MeOH 80%, siêu âm 15 phút.

Chuyển toàn bộ vào bình định mức 25 ml và định mức với MeOH 80%. Lọc qua màng 0,45 µm rồi tiêm HPLC.

8

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là mẫu thực phẩm chức năng Chalcone được sản xuất tại Viện Dinh Dưỡng Quốc gia.

2.2. Nguyên vật liệu 2.2.1. Chất chuẩn -

Xanthoangelol: hàm lượng 98,50%, số lô CXL 0808, Japan Bio Science

Laboratory Co., Ltd. -

4-Hydroxyderricin: hàm lượng 97,54%, số lô CHL 0810, Japan Bio Science

Laboratory Co., Ltd. 2.2.2. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn -

Dung dịch chuẩn gốc: Với mỗi chất XA và 4-HD, tiến hành cân chính xác khoảng

20,0 mg chất chuẩn vào bình đựng mức 20 mL, hòa tan và định mức vừa đủ bằng MeOH/H2O (8/2).

-

Dung dịch chuẩn làm việc: từ dung dịch chuẩn gốc, pha dãy chuẩn hỗn hợp có

nồng độ các chất từ khoảng 2 ppm đến 250 ppm: - Tạo chuẩn hỗn hợp nồng độ mỗi chất khoảng 500 ppm bằng cách hút chính xác đồng thể tích các chuẩn gốc đơn từng chất sau đó pha bằng MeOH/H 2O (8/2).

-

Pha loãng chuẩn hỗn hợp đến nồng độ phù hợp. Dung dịch chuẩn được bảo quản

ở -24oC đến khi dùng.

2.2.3. Chuẫn bị dung dịch mẫu placebo -

Mẫu placebo: Trong đề tài này, mẫu placebo được cung cấp bởi khoa Hóa thực

phẩm - Viện Dinh Dưỡng Quốc gia.

2.2.4. Dung môi, hóa chất -

Methanol của Merck – Đức dùng cho HPLC.

-

Nước khử ion 18 mΩ.

-

MeOH/H2O (8/2): Lấy 80 ml MeOH vào cốc đong 100 mL, thêm H2O vừa đủ tới

vạch.

2.2.5. Thiết bị, dụng cụ Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu: -

Hệ thống HPLC Waters Alliance gồm bơm Waters 2695 và detector PDA 2996

cùng phần mềm Empower software 3471 – Mỹ.

9

-

Máy siêu âm Elmasonic S120H – Đức.

-

Cân phân tích Mettler Toledo ME204T/00 (d = 0,1 mg) - Đức.

-

Máy ly tâm lạnh Universal 32R Hetich – Đức.

-

Tủ âm sâu Panasonic MDF - U5412 - Nhật Bản.

-

Máy lắc ngang WiseShake SHR-2D – Đức

-

Bơm hút chân không New Askir – Ý.

-

Máy lắc Rotex Thermolytex Maxi II Type 37600, M37619-26 – Mỹ.

-

Màng lọc PTFE 0,45 µm – Mỹ.

-

Pipetman 100 – 1000 µL, 10 – 100 µL, 10 – 200 µL.

-

Các dụng khác: Bình tam giác 100 Duran – Đức, bình định mức 25 ml, ống falocn

50ml, pipet thủy tinh, cốc đong, phễu, vial loại 1,5 mL… 2.2.6. Nội dung nghiên cứu -

Xây dựng quy trình chiết xuất đồng thời XA, 4-HD trong mẫu thực phẩm chức

năng chứa chalcon.

-

Khảo sát điều kiện HPLC PDA để định lượng đồng thời 4-HD và XA.

-

Thẩm định phương pháp phân tích đã được xây dựng.

-

Áp dụng phương pháp phân tích để kiểm tra thực phẩm chức năng Chalcone dùng đề tài.

2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Kháo sát các điều kiện phân tích xanthoangelol và 4-hydroxyderricin bằng HPLC Dựa trên các tài liệu [4], [17], các điều kiện được lựa chọn cố định như sau: -

Tốc độ dòng: 1ml/ phút.

-

Thể tích tiêm: 10 µL.

-

Nhiệt độ cột: 35oC.

-

Khoảng bước sóng: 210 – 400 nm.

Dựa trên cơ sở vật chất của khoa Hóa thực phẩm, các điều kiện sau đây của quá trình tách HPLC được khảo sát: -

Cột sắc ký o Cột Inertsil GL Science Inc C8 (250mm x 4,6mm x 5 µm) với cột bảo vệ Agilent 5-HC C18(2) (12.5mm x 4,6mm x 5µm). o Cột Phenomenex Luna C18(2) (250mm x 4,6mm x 5µm).

10

o Cột Agilent 5-HC C18(2) (150mm x 4,6mm x 5µm) với cột bảo vệ Agilent 5-HC C18(2) (12.5mm x 4,6mm x 5µm).

-

Tỷ lệ pha động: tăng dần từ MeOH/ H2O (7/3) đến MeOH 100%.

-

Quét phổ peak XA và 4-HD, chọn bước sóng phát hiện và định lượng.

2.3.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu -

Dựa vào các tài liệu [4], [17] và khả năng hòa tan của hai chất cần phân tích, quy

trình chiết mẫu dự kiến được xây dựng được trình bày ở hình 2.1 sau:

Mẫu thực phẩm chức năng đã đồng nhất Cân chính xác khoảng 0,2g mẫu Thêm khoảng 20 mL dung môi chiết Chiết mẫu theo cách được khảo sát Lọc qua giấy lọc vào bình định mức 25 mL Rửa cắn bằng dung môi đến vừa đủ 25 mL Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 µm Tiêm vào hệ thống sắc ký Hình 2.1: Sơ đồ quy trình chiết xuất dự kiến a. Khảo sát các phương pháp chiết: -

Khảo sát hai phương pháp: siêu âm và lắc ngang.

b. Khảo sát điều kiện chiết -

Dung môi chiết: khảo sát dung môi chiết là hỗn hợp MeOH/H2O ở các tỷ lệ khác

nhau để lựa chọn được tỷ lệ chiết phù hợp nhất -

Thời gian chiết: Khảo sát thời gian chiết: 15 phút, 30 phút, 45 phút và 60 phút.

-

Số lần chiết: Chiết 1 lần, 2 lần.

-

Nhiệt độ chiết: ở ba khoảng nhiệt độ khác nhau bao gồm nhiệt độ thường; 45 oC;

60oC. 11

2.3.3. Thẩm định quy trình Phương pháp xử lý mẫu và điều kiện phân tích XA, 4-HD được thẩm định về các tiêu chí sau: a. Độ ổn định của hệ thống -

Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần một dung dịch

chuẩn hỗn hợp có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại thời gian lưu và diện tích peak của từng chất trong từng lần tiêm sắc ký.

-

Yêu cầu: chênh lệch của diện tích peak, thời gian lưu tR giữa các lần tiêm của

cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) không lớn hơn 2,00 %. b. Tính đặc hiệu -

Chuẩn bị các mẫu sau:  Mẫu chuẩn hỗn hợp XA và 4-HD.  Mẫu placebo, mẫu placebo thêm chuẩn.  Mẫu thử: thực phẩm chức năng Chalcone.

 Điều kiện 1: Tiến hành chạy sắc ký ba mẫu gồm mẫu plaebo, mẫu placebo thêm chuẩn và mẫu chuẩn hỗn hợp, so sánh các peak trên các sắc ký đồ thu được.  Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của mẫu placebo thu được, tại thời điểm xuất hiện peak của các chất cần phân tích không được xuất hiện peak lạ.  Điều kiện 2: Xác định độ tinh khiết Tiến hành chạy sắc ký mẫu thử. Xác định độ tinh khiết qua công cụ peak purity.  Yêu cầu: Thông số Purity Threshold lớn hơn Purity Angle. c. Khoảng tuyến tính -

Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả mối tương quan tuyến tính

trong khoảng xác định (là khoảng nồng độ đảm bảo sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được Y và nồng độ chất cần phân tích X).

-

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ tăng dần phù hợp. Tiến hành

sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính của từng peak giữa nồng độ từng chất và diện tích peak của chất đó.  Yêu cầu:  Đường hồi quy có dạng đường thẳng và giá trị hệ số tương quan: 0,99 ≤ R2 ≤ 1 có tương quán tuyến tính rõ rệt.  Giá trị p-value của intercept > 0,05 [8].

12

d. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng -

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu

thử có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được theo phương pháp đã xây dựng. Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn [1].

-

Cách xác định: Thêm chuẩn với nồng độ giảm dần vào mẫu placebo và xác

định giá trị S/N tương ứng. LOD là giá trị nồng độ mà tại đấy tín hiệu đo lớn hơn gấp 3 lần nhiễu đường nền (S/N=3), LOQ là giá trị nồng độ mà tại đấy tín hiệu đo lớn hơn gấp 10 lần nhiễu đường nền (S/N=10), thường xác định giá trị LOQ dựa trên giá trị LOD qua công thức: LOQ = 3 x LOD. e. Độ lặp lại của phương pháp -

Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả sự thống nhất (mức độ phân

tán) kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mô tả.

-

Cách xác định: Độ lặp lại (độ chính xác trong cùng điều kiện định lượng) xác

định bằng cách tiến hành thí nghiệm 6 lần (mỗi lần bắt đầu từ cân hay đong mẫu) với cùng 1 mức nồng độ trên cùng 1 mẫu tiến hành trong cùng điều kiện.

-

Đánh giá sự phân tán số liệu dựa vào giá trị RSD (%).

SD là độ lệch chuẩn N là số lần thí nghiệm xi là giá trị tính đƣợc của lần thử nghiệm thứ “i”

 Yêu cầu: Theo AOAC 2016, chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của XA và 4-HD phải không lớn hơn 7,3% tại mức nồng độ 10 ppm và 5,3% tại mức nồng độ 10 ppm [14]. f. Độ đúng -

Độ đúng là sự gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị

thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng (µ).

-

Cách xác định: Xác định độ đúng thông qua xác định độ thu hồi của phương pháp

bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu placebo.

13

-

Tiáşżn hĂ nh: Lưᝣng chuẊn thĂŞm vĂ o áť&#x; 3 mᝊc náť“ng Ä‘áť™: náť“ng Ä‘áť™ thẼp, náť“ng Ä‘áť™ trung

bÏnh, nᝓng đ᝙ cao. Tấi m᝗i mᝊc nᝓng đ᝙, phân tích lạp lấi 3 lần. Tính tᝡ lᝇ thu hᝓi cᝧa cåc chẼt XA và 4-HD theo công thᝊc

đ?‘…(%) =

Ct: hà m lưᝣng tÏm thẼy

đ??śđ?‘Ą . 100% đ??śđ?‘?

CC: hà m lưᝣng chuẊn thêm và o

ďƒ˜ YĂŞu cầu: Theo AOAC 2016, tᝡ lᝇ thu háť“i đất 90 - 107% tấi mᝊc náť“ng Ä‘áť™ 10 - 100 ppm [14].

2.3.4 Ă p d᝼ng phĆ°ĆĄng phĂĄp Ä‘ĂŁ xây dáťąng Ä‘áťƒ kiáťƒm tra mẍu tháťąc phẊm chᝊc năng Ä‘ang lĆ°u hĂ nh trĂŞn tháť‹ trĆ°áť?ng.

Nháşąm kiáťƒm tra vĂ cĂ´ng báť‘ hĂ m lưᝣng hai chẼt XA vĂ 4-HD cĂł trong tháťąc phẊm chᝊc năng Chalcone, phĆ°ĆĄng phĂĄp Ä‘ĂŁ xây dáťąng đưᝣc sáť­ d᝼ng Ä‘áťƒ xĂĄc Ä‘áť‹nh hĂ m lưᝣng phần trăm hai chẼt cĂł trong cháşż phẊm nĂ y.

2.4. X᝭ lý kết quả Kết quả đưᝣc phân tích, x᝭ lý bẹng phần mᝠm Empower Software 3471 và Mircrosoft Excel 2013.

14

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Xây dựng quy trình phân tích 3.1.1. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký a. Khảo sát cột sắc ký Cột sắc ký có vai trò quan trọng trong việc tách các chất phân tích ra khỏi nhau, là yếu tố quyết định khả năng của hệ thống sắc ký. Hiện nay, sắc ký pha đảo được sử dụng phổ biến do tính phổ biến, tiết kiệm chi phí và đem lại hiệu quả cao. Do đó, trong nghiên cứu này, sắc ký pha đảo được sử dụng. Dựa vào các tài liệu [4], [17] và cấu trúc của chất cần phân tích, khả năng tách của các chất phân tích trên một số cột được khảo sát gồm: -

Cột Inertsil GL Science Inc C8 (250mm x 4,6mm x 5 µm) với cột bảo vệ Agilent

5-HC C18(2) (12.5mm x 4,6mm x 5µm).

-

Cột Phenomenex Luna C18(2) (250mm x 4,6mm x 5µm).

-

Cột Agilent 5-HC C18(2) (150mm x 4,6mm x 5µm) với cột bảo vệ Agilent 5-HC

C18(2) (12.5mm x 4,6mm x 5µm).

Kết quả được trình bày ở các hình từ 3.1 đến 3.3 sau:

Hình 3.1: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp sử dụng cột Inertsil C8

15

Hình 3.2: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp sử dụng cột Phenomenex Luna C18(2)

Hình 3.3: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp sử dụng cột Agilent 5-HC C18(2) Nhận xét:  Với cột Inertsil GL Science Inc C8: 2 peak có thời gian lưu không quá ngắn (7,018 và 7,954), hình dạng peak đối xứng, khả năng tách khá tốt (R s = 1,89), tuy nhiên có hiện tượng dính chân một chút nhỏ giữa 2 peak. Áp dụng công cụ peak purity factor cho kết quả cả 2 peak lên đều tinh khiết (chỉ số Peak Threshold lớn hơn nhiều Peak Angel), cho thấy khả năng tách cột khá tốt, sự ảnh hưởng của dính chân không đáng kể.  Với cột Phenomenex C18(2), 2 peak không tách hoàn toàn khỏi nhau, dính chân peak quá nhiều.  Với cột Agilent 5-HC C18(2), 2 peak tách nhau rõ ràng (RS = 2,54), peak đối xứng, không có hiện tượng dính chân, thời gian lưu không lớn (4-HD: 8,405 phút và XA: 10,519 phút) nên khi tách trên mẫu thực có thể tránh được hiện tượng chồng peak, dính peak với chất khác.

16

Kết luận: Qua khảo sát, kết quả sắc ký đồ cho thấy hệ cột Inertsil C8 và hệ cột Agilent C18(2) đều thể hiện khả năng tách tốt. Tuy nhiên, với điều kiện cơ sở vật chất cho phép, nghiên cứu quyết định sử dụng cột Agilent 5-HC C18(2) (150mm x 4,6mm x 5µm) với cột bảo vệ Agilent 5-HC C18(2) (12.5mm x 4,6mm x 5µm) để tiến hành khảo sát các yếu tố khác và định lượng mẫu. Với khả năng tách của cột Inertsil C8, đây có thể là lựa chọn thứ 2. b. Khảo sát thành phần pha động Qua tham khảo tài liệu [4], điều kiện pha động chạy sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp được lựa chọn: chế độ chạy đẳng dòng với hỗn hợp MeOH/H2O có tỷ lệ MeOH tăng dần.

Kết quả thu được trình bày ở hình 3.4 đến 3.7 sau:  Pha động 1: MeOH/ H2O (7/3)

Hình 3.4: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dùng pha động MeOH/H2O (7/3) Nhận xét: Ở tỷ lệ này, 2 peak xuất hiện, đối xứng, tách rõ ràng. Tuy nhiên, thời gian lưu của 2 chất quá lớn (4-HD: 29,518 phút và XA: 49,518 phút). Thời gian lưu quá gây hao phí dung môi sử dụng, không kinh tế.

17

 Pha động 2: MeOH/ H2O (8/2)

Hình 3.5: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dùng pha động MeOH/H2O (8/2) Nhận xét: Ở tỷ lệ dung môi này: 2 chất tách tốt, 2 peak đối xứng, đẹp, độ phân giải tốt với hệ số RS > 1,5 (2,55) và thời gian lưu không quá lớn (4-HD: 8,644 phút và XA: 10,605 phút).  Pha động 3: MeOH/ H2O (9/1)

Hình 3.6: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dùng pha động MeOH/H2O (9/1) Nhận xét: Trên sắc ký đồ chỉ xuất hiện một peak duy nhất với thời gian lưu 3,969 phút. Sau đó, tiến hành chạy kiểm tra 2 chuẩn đơn thì thời gian lần lượt 4-HD (3,923 phút) và XA (3,983 phút). Như vậy, tỷ lệ pha động MeOH/H2O (9/1) hông tách được 2 chất cần phân tích ra khỏi nhau, 2 chất cùng ra một thời điểm.

18

 Pha động 4: MeOH 100%

Hình 3.7: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dùng pha động MeOH Nhận xét: Kết quả trên sắc ký đồ tương tự khi chạy với dung môi pha động 4 với thời gian lưu sau khi chạy thêm chuẩn đơn lần lượt là: chuẩn hỗn hợp (2,468 phút), 4HD (2,493 phút) và XA (2,407 phút). Pha động 4 với 100% MeOH không tách được 2 chất ra khỏi nhau, 2 chất bị cùng ra một thời điểm. c. Chọn bước sóng phát hiện Để lựa chọn bước sóng phát hiện đồng thời 4-HD và XA, detector PDA được sử dụng để phát hiện. Kết quả quét phổ chất chuẩn được sử dụng để xác định bước sóng hấp thụ cực đại của từng chất được trình bày ở hình 3.8 sau:

Hình 3.8: Phổ hấp thụ của 4-HD và XA Nhận xét: Cả 2 chất đều có bước sóng hấp thụ cực đại vào khoảng 370 nm. Chính vì vậy, 370 nm được lựa chọn làm bước sóng sử dụng trong nghiên cứu này.

19

3.1.2. Điều kiện sắc ký tối ưu Cột Agilent 5-HC C18(2) (150mm x 4,6mm x 5µm) với cột bảo vệ Agilent 5-HC C18(2) (12.5mm x 4,6mm x 5µm).

-

Dectector PDA bước sóng 370 nm.

-

Pha động gồm 2 kênh: MeOH - H2O (8 - 2).

-

Tốc độ dòng: 1ml/ phút.

-

Nhiệt độ cột: 35oC.

-

Thể tích tiêm mẫu: 10 µL.

3.1.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu Quy trình xử lý mẫu dự kiến theo sơ đồ 2.3.2. Theo quy trình dự kiến này, quá trình xử lý mẫu được khảo sát với tiêu chí kết quả đầu ra là hàm lượng thu được so với nhãn về các yếu tố: thời gian chiết, phương pháp chiết, thời gian chiết, nhiệt độ chiết và số lần chiết trên nền mẫu thực phẩm thực phẩm chức năng Chalcone. a. Khảo sát phương pháp chiết Thông qua tham khảo tài liệu [4], [17]: 2 phương pháp chiết sau được khảo sát: siêu âm với dung môi MeOH/H2O (8/2) trong 30 phút và lắc ngang trong 6h với dung môi MeOH 100% trong 6h. Các yếu tố khác được giữ cố định: duy trì nhiệt độ phòng, chiết 1 lần. Kết quả được trình bày ở hình 3.9 sau: Phương pháp chiết 100

91,75

82,67

80,93

75

72,43

50 25 0

4-HD

Xanthoangelol

Siêu âm

Lắc ngang

Hình 3.9: So sánh giữa siêu âm và lắc ngang Nhận xét: Việc chiết bằng siêu âm bằng MeOH 80% với thời gian 30 phút cho kết quả cao hơn so với việc chiết bằng MeOH 100% lắc ngang trong 6h. Vì vậy, phương pháp chiết siêu âm với MeOH/H 2O được lựa chọn. b. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết 20

Mẫu thử được chiết với nồng độ MeOH tăng dần: từ MeOH/H2O (7/3) lên MeOH 100%. Các yếu tố khác được duy trì: chiết bằng siêu âm, thời gian 30 phút, chiết 1 lần và nhiệt độ phòng. Kết quả được trình bày ở hình 3.10 sau:

Tỷ lệ dung môi chiết 100

89,28 89,25 84,68

83,31

79,28 81,00 77,67

71,12

75 50 25 0

4-HD

XA 7/3

8/2

9/1

100%

Hình 3.10: So sánh giữa các tỷ lệ dung môi chiết Nhận xét: Với 4-HD, kết quả khi chiết với MeOH/H2O (7/3) và MeOH 100% thấp hơn so với 2 tỷ lệ dung môi chiết còn lại. Tuy nhiên, với XA, kết quả chiết với tỷ lệ MeOH/H2O (7/3) thấp hơn hơn so với 3 nồng độ còn lại. Vì vậy, để tiết kiệm hóa chất, MeOH/H2O (8/2) được lựa chọn làm dung môi chiết. c. Khảo sát thời gian chiết Mẫu thử được chiết với MeOH/H2O (8/2) trong các khoảng thời gian tương ứng 15 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút. Các yếu tố khác được duy trì: chiết bằng siêu âm, nhiệt độ phòng, chiết 1 lần. Kết quả được trình bày ở hình 3.11 sau:

Thời gian chiết 100 75

75,68

92,30 87,19 94,12 68,25

82,13 79,36 81,03

50 25 0 4-HD

15 phút

XA

30 phút

45 phút

60 phút

Hình 3.11: So sánh giữa các khoảng thời gian chiết 21

Nhận xét: Với cả 2 chất, kết quả ở thời gian 15 phút thấp hơn ở cả hai chất cần phân tích so với 3 thời gian khảo sát còn lại. Với 4-HD, kết quả ở 30 phút, 60 phút không có sự chênh lệch đáng kể và cao hơn một chút so với thời gian 45 phút. Với XA, không có sự khác biệt đáng kể giữa 3 khoảng thời gian này. Chính vì vậy, 30 phút được lựa chọn là thời gian chiết. d. Khảo sát nhiệt độ chiết Mẫu thử được chiết tại các nhiệt độ khác nhau: nhiệt độ phòng, 45 oC và 60oC. Các yếu tố giữ cố định: chiết bằng siêu âm, dung môi MeOH/H 2O (8/2), thời gian 30 phút và chiết 1 lần. Kết quả được trình bày ở hình 3.12 sau:

Nhiệt độ chiết 100

90,88

85,29

87,86

78,91

75

76,36

78,51

50 25 0 4-HD

XA

Nhiệt độ phòng

45

60

Hình 3.12: So sánh giữa các nhiệt độ chiết Nhận xét: Với cả 2 chất, kết quả không quá khác nhau giữa các khoảng nhiệt độ với cả 2 chất. Chính vì vậy, nhiệt độ phòng được lựa chọn là nhiệt độ trong nghiên cứu. e. Khảo sát số lần chiết Mẫu thử được khảo sát lần lượt với 1 lần chiết (20 ml) và 2 lần chiết (10ml x 2).

Các yếu tố được giữ nguyên: chiết bằng siêu âm, dung môi MeOH/H2O (8/2) thời gian 30 phút, nhiệt độ phòng. Kết quả thu được được trình bày ở hình 3.13 sau:

22

Số lần chiết 100

90,88

87,51

78,91

78,56

75 50 25 0

4-HD

XA

Chiết 1 lần

Chiết 2 lần

Hình 3.13: So sánh giữa số lần chiết Nhận xét: Với 4-HD, hàm lượng thu được khi chiết 2 lần cho thấy giảm đi một lượng nhỏ. Còn với XA, không có sự khác biệt đáng kể giữa việc chiết 1 lần và chiết 2 lần với XA. Chính vì vậy, cách chiết 1 lần với 20 ml MeOH/H 2O (8/2) được lựa chọn.

3.1.4. Quy trình chiết tối ưu Qua quá trình khảo sát, điều kiện tối ưu của quá trình chiết được lựa chọn được trình bày ở hình 3.14 sau:

Mẫu thực phẩm chức năng đã đồng nhất Cân chính xác khoảng 0,2g mẫu Thêm khoảng 20 mL MeOH/H2O (8/2) Chiết siêu âm trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Lọc qua giấy lọc vào bình định mức 25 mL Rửa cắn bằng dung môi đến vừa đủ 25 mL Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 µm Tiêm vào hệ thống sắc ký Hình 3.14: Sơ đồ quy trình chiết xuất tối ưu 23

3.2. Thẩm định phương pháp 3.2.1. Độ ổn định của hệ thống HPLC Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp: 4-HD 23.5 ppm và XA 26.75 ppm như mục 2.2.2. Tiêm mẫu lặp lại 6 lần với điều kiện sắc ký như mục 3.1.2.

Xác định các thông số mỗi lần tiêm mẫu: thời gian lưu, diện tích peak của các chất. Tính toán các giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn tương đối. Kết quả thực nghiệm được trình bày ở bảng 3.1 sau: Bảng 3.1: Kết quả độ ổn định của hệ thống HPLC 4-Hydroxyderricin

Xanthoangelol

Lần chạy

tR (phút)

Diện tích (mAU.s)

tR (phút)

Diện tích (mAU.s)

1

8,405

1496965

10,519

1555733

2

8,414

1549671

10,555

1587660

3

8,436

1545220

10,581

1583049

4

8,437

1543328

10,585

1590028

5

8,439

1539481

10,585

1581718

6

8,444

1523831

10,605

1564688

Trung bình

8,429

1533083

10,572

1577146

SD

0,016

19791,3

0,030

13754,7

RSD (%)

0,19

1,30

0,29

0,87

Nhận xét: Với cả 2 chất phân tích 4-HD và X, độ lệch chuẩn tương đối đều dưới 2,00 %, điều đó chứng tỏ hệ thống sắc ký phù hợp, có thể ứng dụng để phân tích mẫu trong thực tế.

3.2.2. Tính đặc hiệu của hệ thống Tiến hành chẩn bị và chạy theo điều kiện sắc ký mục 3.1.2 các mẫu sau:  Mẫu chuẩn hỗn hợp: 4-HD 23,5 ppm và XA 26,75 ppm như mục 2.2.2.  Mẫu placebo: như mục 2.2.3, cân chinh xác khoảng 0,2g mẫu placebo và chiết mẫu theo quy trình ở mục 3.1.4.

24

 Mẫu placebo thêm chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,2g mẫu placebo, tiến hành nạp 40 µL chuẩn dung dịch 4-HD 940 ppm và 50 µL XA 1070 ppm rồi chiết theo quy trình ở mục 3.1.4.  Mẫu thử: Chuẩn bị mẫu rồi chiết theo quy trình ở mục 3.1.4.

Kết quả được trình bày từ hình 3.15 đến 3.17 sau: a. Theo điều kiện 1:

Hình 3.15: Sắc ký đồ mẫu placebo

Hình 3.16: Sắc ký đồ mẫu placebo thêm chuẩn

Hình 3.17: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp 25

Nhận xét: Trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn hỗn hợp tại thời điểm 8,436 phút phút xuất hiện peak của 4-HD và tại 10,585 phút là peak của XA (R = 2,69). Kết quả trên sắc ký đồ mẫu placebo, không có bất cứ peak nào xuất hiên trong các thời điểm này, và trên sắc ký đồ mẫu placebo thêm chuẩn, tương ứng với thời điểm 8,423 phút và 10,639 phút là 2 peak của 4-HD và XA (R = 2,54). Từ đó, chúng tôi kết luận phương pháp đã lựa chọn có độ đặc hiệu tốt với 2 chất cần phân tích thỏa mãn điều kiện 1. b. Điều kiện 2: Tiến hành chạy mẫu thử. Áp dụng công cụ Peak Purity được kết quả được trình bày ở hình 3.18 và bảng 3.2 sau:

4-HD

XA

Hình 3.18: Kết quả peak purity mẫu thử Bảng 3.2: Thông số peak purity mẫu thử Chất phân tích

Purity Angle

Match

Purity Threshold

4-HD

0,467

999,934

1,957

XA

0,269

999,978

1,743

Nhận xét: Với cả 2 chất,Purity Angle xấp xỉ 0 tương ứng với hệ số Match xấp xỉ 1000 cho thấy hình ảnh peak đồng nhất. Thông số purity threshold đều lớn hơn purity angle cho thấy cả 4-HD và XA ở cả mẫu thử theo phương pháp định lượng đã chọn đều tinh khiết trong giới hạn nhiễu gây ra bởi dung môi pha động và nền mẫu. Kết hợp với hình ảnh peak của điều kiện 1, phương pháp có độ đặc hiệu tốt với 4-HD và XA. 3.2.3. Khoảng tuyến tính Xây dựng đường chuẩn với các khoảng nồng độ:  4-HD: từ 4,7 ppm đến tới 235 ppm.  XA: từ 5,35 ppm đến 267,5 ppm.

Thiết lập phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn mối tươn quan giữa nồng độ chất và diện tích peak. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3, 3.4 và hình 3.19, 3.20 sau: 26

Bảng 3.3: Nồng độ và diện tích peak của 4-HD Nồng độ (ppm) Diện tích (mAu.s)

4-HD

4,7

9,4

230781

494512

23,5

47

94

235

1293162 2443557 5475786 14058875

4-HYDROXYDERRICIN 1.5E+07 1.0E+07

y = 60261x - 154578 R² = 0.9994

5.0E+06 0.0E+00 0

50

100

150

200

250

Hình 3.19: Biểu đồ mối tương quan nồng độ - diện tích peak của 4-HD Áp dụng công cụ Hồi quy tuyến tính với đường chuẩn 4-HD trong Excel 2013, thu được: p-value (intercept) > 0,05 (0,107). Kết quả cho thấy trong khoảng tin cậy 95%, giá trị intercept lớn hơn 0 không có ý nghĩa thống kê, phương pháp không mắc sai số hệ thống với 4-HD. Bảng 3.4: Nồng độ và diện tích peak của xanthoangelol

XA

Nồng độ (ppm) Diện tích (mAu.s)

5,35

10,7

238412

542065

26,75

54

107

267,5

1441376 2762160 5649034 14391623

XANTHOANGELOL 2.0E+07 1.5E+07 1.0E+07

y = 54338x - 138234 R² = 0.9997

5.0E+06 0.0E+00 0

50

100

150

200

250

300

Hình 3.20: Biểu đồ mối tương quan nồng độ - diện tích peak của xanthoangelol 27

Áp dụng công cụ Hồi quy tuyến tính với đường chuẩn XA trong Excel 2013, thu được: p-value (intercept) > 0,05 (0,070). Kết quả cho thấy, trong khoảng tin cậy 95%, giá trị intercept của đường chuẩn này lớn hơn 0 không có ý nghĩa thống kê, phương pháp không mắc sai số hệ thống với XA. Nhận xét: Trong khoảng nồng độ khảo sát với mỗi chất, có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ với diện tích peak: -

4-HD: tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 4,7 ppm đến 235 ppm.

-

XA: tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 5,35 ppm đến 267,5 ppm.

3.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng (LOD và LOQ) -

Giới hạn phát hiện và định lượng của phương pháp được xác định bằng phương

pháp thêm chuẩn nồng độ giảm dần vào placebo và xác định giá trị S/N tương ứng.

-

Giá trị LOD được xác định tại S/N = 3; LOQ = 3 x LOD.

-

Giá trị S/N được tính toán tự động thông quan phần mềm Empower 3471 với

nhiễu đường nền lấy về 2 phía của peak chất nghiên cứu và tốt nhất là tính nhiễu lân cận 2 bên của peak sao cho bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 5 lần chiều rộng của peak tại nửa chiều cao. Với mỗi nồng độ nạp, chúng tôi tiến hành chạy 3 lần khi giá trị S/N đạt yêu cầu.

-

Kết quả thu được được trình bày tại bảng 3.5 và hình 3.21 sau: Bảng 3.5: Giá trị S/N của các pic thêm chuẩn và kết quả LOQ, LOD Tên chất

Lần thêm chuẩn (ppm)

Nồng độ thêm chuẩn (ppm)

1 4-HD

XA

2

Kết quả thẩm định S/N

LOD (ng/g)

37,6

12,5

53,5

17,8

9,1 1,504

9,2

3

9,4

1

10,0

2

LOQ (ng/g)

2,14

9,0

3

9,0

28

Hình 3.21: Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn LOQ 3.2.5. Độ lặp lại Tiến hành định lượng độc lập 6 lần mẫu thử thực phẩm chức năng Chalcone với quy trình chiết như mục 3.1.4 và điều kiện chạy sắc ký như mục 3.1.2.

Kết quả RSD (%) thu được và yêu cầu AOAC được trình bày tại bảng 3.6 sau: Bảng 3.6: Kết quả độ lặp lại

Mẫu

Lượng cân (g)

LL - 01

4-Hydroxyderricin

Xanthoangelol

Diện tích (mAu.s)

Nồng độ (mg/g)

Diện tích (mAu.s)

Nồng độ (mg/g)

0,2039

1752738

3,88

2650696

6,29

LL - 02

0,2010

1695188

3,82

2494237

6,03

LL - 03

0,2000

1657305

3,76

2548363

6,18

LL - 04

0,2075

1732014

3,77

2696148

6,28

LL - 05

0,1998

1686167

3,79

2523047

6,16

LL - 06

0,2015

1689236

3,77

2628806

6,13

TB

3,79

6,15

SD

0,05

0,12

RSD (%)

1,37

1,87

Yêu cầu

< 7,3

< 7,3

Nhận xét: Kết quả trên bảng cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt, với các giá trị RSD đều nhỏ hơn 7,3% ở tất cả các mẫu thí nghiệm.

29

3.2.6. Độ thu hồi Với mồi nồng độ thấp, trung bình và cao, tiến hành phân tích 3 mẫu placebo thêm chuẩn độc lập với điều kiện chạy sắc ký như mục 3.1.2.

-

Nồng độ thấp: Thêm 500 µL chuẫn hỗn hợp 4-HD 470 ppm, XA 535 ppm vào

0,2g mẫu placebo.

-

Nồng độ trung bình: Thêm 750 µL 4-HD 940 ppm và 1250 µL XA 1070 ppm

vào 0,2g mẫu placebo.

-

Nồng độ cao: Thêm 1500 µL 4-HD 940 ppm và 2500 µL XA 1070 ppm vào

0,2g mẫu placebo.

Tính toán độ thu hồi với từng lần nạp. Kết quả thể hiện tại bảng 3.7 sau: Bảng 3.7: Kết quả độ thu hồi ở ba mức nồng độ thấp, trung bình và cao Mức thêm chuẩn

Nồng độ thêm chuẩn

4-Hydroxyderricin

Xanthoangelol

1

102,3

93,2

2

103,2

97,7

3

103,9

97,6

TB

103,1

96,1

RSD

0,81

2,69

1

98,1

96,6

4-HD: 28,2

2

102,9

96,2

ppm

3

102,1

93,5

TB

101,0

95,4

RSD

2,52

1,74

1

101,9

93,4

4-HD: 56,4

2

99,9

90,4

ppm

3

100,0

91,1

TB

100,6

91,6

RSD

1,10

1,68

Nồng độ

4-HD: 9,4 ppm

thấp

XA: 10,7 ppm

Nồng độ trung bình

Nồng độ cao

Độ thu hồi Lần nạp

XA: 53,5 ppm

XA: 107 ppm

30

Nháş­n xĂŠt: Theo AOAC 2016, tᝡ láť&#x2021; thu háť&#x201C;i trong khoảng náť&#x201C;ng Ä&#x2018;áť&#x2122; 10 - 100 ppm phải Ä&#x2018;ất 80 - 110%.

Káşżt quả trĂŞn bảng cho thẼy Ä&#x2018;áť&#x2122; thu háť&#x201C;i cᝧa 4-HD vĂ XA Ä&#x2018;áť u náşąm trong giáť&#x203A;i hấn cho phĂŠp. Váş­y phĆ°ĆĄng phĂĄp cĂł Ä&#x2018;áť&#x2122; thu háť&#x201C;i táť&#x2018;t váť&#x203A;i cả hai chẼt cần phân tĂ­ch áť&#x; ba mᝊc náť&#x201C;ng Ä&#x2018;áť&#x2122; thĂŞm chuẊn thẼp, trung bĂŹnh vĂ cao.

3.3. ᝨng d᝼ng phĆ°ĆĄng phĂĄp phân tĂ­ch tháťąc phẊm chᝊc nÄ&#x192;ng chalcone Tháťąc phẊm chᝊc nÄ&#x192;ng Ä&#x2018;ưᝣc tiáşżn hĂ nh Ä&#x2018;ưᝣc xáť­ lĂ˝ vĂ chấy sắc kĂ˝ váť&#x203A;i Ä&#x2018;iáť u kiáť&#x2021;n nhĆ° m᝼c 3.1.4. Tiáşżn hĂ nh Ä&#x2018;áť&#x2039;nh lưᝣng 3 lần, lẼy káşżt quả trung bĂŹnh.

HĂ m lưᝣng phần trÄ&#x192;m cᝧa 4-HD vĂ XA trong tháťąc phẊm chᝊc nÄ&#x192;ng Chalcone Ä&#x2018;ưᝣc tĂ­nh theo cĂ´ng thᝊc sau: đ?&#x2018;&#x2039; (%) =

đ??śĂ&#x2014;đ?&#x2018;&#x2030; đ?&#x2018;&#x20AC; Ă&#x2014; đ?&#x2018;&#x161; Ă&#x2014; 1000 đ?&#x2018;&#x17D;

Trong Ä&#x2018;Ăł: X: HĂ m lưᝣng phần trÄ&#x192;m so váť&#x203A;i hĂ m lưᝣng trĂŞn nhĂŁn.

C: náť&#x201C;ng Ä&#x2018;áť&#x2122; chẼt phân tĂ­ch theo Ä&#x2018;Ć°áť?ng chuẊn (ppm).

V: tháť&#x192; tĂ­ch Ä&#x2018;áť&#x2039;nh mᝊc: 25 mL. m: kháť&#x2018;i lưᝣng cân. Îą: hĂ m lưᝣng trĂŞn nhĂŁn. ď&#x201A;§ 4-HD: 2,2 mg/viĂŞn. ď&#x201A;§ XA: 4 mg/viĂŞn.

M: kháť&#x2018;i lưᝣng trung bĂŹnh viĂŞn: 0,511 g/viĂŞn.

Káşżt quả thu Ä&#x2018;ưᝣc trĂŹnh bĂ y trong bảng 3.8 sau: Bảng 3.8: Káşżt quả Ä&#x2018;áť&#x2039;nh lưᝣng tháťąc phẊm chᝊc nÄ&#x192;ng Chalcone ChẼt

4-Hydroxyderricin

Xanthoangelol

Kết quả

88,14 %

78,91 %

NhĆ° váş­y, qua kiáť&#x192;m tra hĂ m lưᝣng hai chẼt 4-HD vĂ XA trong Chalcone, tᝡ láť&#x2021; hĂ m lưᝣng thu Ä&#x2018;ưᝣc so váť&#x203A;i nhĂŁn cᝧa cả hai chẼt trong mẍu Ä&#x2018;ất cao. Tuy nhiĂŞn, sáť&#x2018; lưᝣng nghiĂŞn cᝊu mẍu cháť&#x2030; cĂł máť&#x2122;t mẍu do sáťą chĆ°a pháť&#x2022; biáşżn cᝧa cĂĄc sản phẊm chᝊa hai chẼt nĂ y tấi Viáť&#x2021;t Nam nĂŞn chĆ°a Ä&#x2018;Ć°a ra Ä&#x2018;ưᝣc Ä&#x2018;ĂĄnh giĂĄ chĂ­nh xĂĄc váť hĂ m lưᝣng cᝧa 2 chẼt nĂ y trĂŞn tháť&#x2039; trĆ°áť?ng.

31

3.4. Bàn luận 3.4.1. Đối tượng nghiên cứu Hai chất cần phân tích: 4-HD và XA và nhóm chalcon nói chung được sử dụng nhiều tại Nhật Bản với các mục đích khác nhau. Tuy nhiên, các sản phẩm thương mại chứa 2 chất này vẫn chưa phổ biến tại Việt Nam. Bên cạnh đó, quy định vể hàm lượng của 2 chất này cũng chưa có tại VIệt Nam. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ có điều kiện thử nghiệm trên một đối tượng duy nhất là sản phẩm Chalcone của Viện Dinh Dưỡng và công bố hàm lượng theo kết quả nghiên cứu.

3.4.2. Điều kiện sắc ký HPLC Trong nghiên cứu này, khả năng tách 2 chất đã được khảo sát trên 3 hệ cột khác nhau. Kết quả cho thấy hệ cột Agilent 5-HC C18(2) (150mm x 4,6mm x 5µm) với cột bảo vệ Agilent 5-HC C18(2) (12.5mm x 4,6mm x 5µm) cho khả năng tách tốt nhất, tiếp đến là hệ Inertsil C8 (250mm x 4,6mm x 5µm) với cột bảo vệ Agilent 5-HC C18(2) (12.5mm x 4,6mm x 5µm) với các hệ số RS > 1,5. Ngược lại, cột Phenomenex Luna C18(2) lại cho peak sắc ký dính chân nhiều. Tuy nhiên, một nhược điểm của nghiên cứu là các cột trong khảo sát đều đã qua quá trình sử dụng. Điều này có thể là một nguyên nhân ảnh hưởng đến khả năng tách của các cột, hình ảnh peak sắc ký, trong đó có cột Phenomenex Luna C18(2).

Nghiên cứu cũng đã khảo sát được dung môi pha động gồm MeOH/H2O ở các tỷ lệ khác nhau. Kết quả cho thấy MeOH/H2O (8/2) là điều kiện tối ưu cho hệ dung môi với thời gian lưu phù hợp và hình ảnh peak đẹp, rõ ràng, cân đối.

So với điều kiện chạy sắc ký theo TCCS [4], các điều kiện chạy trong nghiên cứu này tương đồng. Tuy nhiên, nghiên cứu khảo sát có sử dụng cột bảo vệ cho kết quả hình ảnh peak đẹp, từ đó giúp làm giảm nguy cơ gây bẩn, tăng thời gian sử dụng cột sắc ký.

Sau khi sử dụng, do nhu cầu của nhiều chỉ tiêu nghiên cứu khác nhau của khoa, hệ thống máy HPLC và cột sắc ký đều được rửa theo quy trình với ACN và H 2O nhằm đảm bảo tính chính xác cho các kết quả định lượng và cột sử dụng được lâu dài.

3.4.3. Quy trình xử lý mẫu Mẫu TPCN Chalcone được chiết một lần bằng cách siêu âm sử dụng dung môi MeOH/H2O (8/2) trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ phòng. Các điều kiện này tương tự với quy trình chiết theo TCCS [4]. Tuy nhiên, thời gian siêu âm dài hơn (30 phút trong 32

nghiên cứu so với 15 phút theo TCCS). Điều này có thể do sự khác nhau về thiết bị máy siêu âm và thành phần nền mẫu áp dụng giữa phòng thí nghiệm và công ty.

Mặt khác, trong nghiên cứu này, sau khi đã khảo sát các yếu tố, cắn mẫu sau khi chiết lại tiếp tục được chiết lần 2 với quy trình như mục 3.1.4. Kết quả tổng hàm lượng sau 2 lần chiết thu được không khác nhau đáng kể so với chiết 1 lần theo quy trình 3.1.4.

Chính vì vậy, quy trình cho thấy khả năng chiết với hiệu suất tốt.

Quy trình xử lý mẫu có ưu điểm là dễ thực hiện, trang thiết bị đơn giản, dung môi hóa chất rẻ tiền cho thấy khả năng có thể được áp dụng trên nhiều cơ sở phòng thí nghiệm tại Việt Nam. 3.4.4. Thẩm định phương pháp Sau khi xây dựng quy trình phân tích, chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp theo quy định tại AOAC 2016. Với việc quy trình xử lý mẫu và chạy sắc ký gần như tương đồng với TCCS [4] của nhà sản xuất, kết quả cho thấy việc áp dụng phương pháp trên đối tượng là nguyên liệu và thực phẩm chức năng chứa chalcon tại Nhật Bản vào chế phẩm tại Việt Nam vẫn đảm bảo kết quả độ lặp lại và độ đúng theo tiêu chuẩn của AOAC. Tuy nhiên, do số lượng chất chuẩn hạn chế, nghiên cứu này chưa thể tiến hành thẩm định độ đúng 6 mẫu placebo thêm chuẩn theo quy định tại AOAC 2016.

3.4.5. Ứng dụng định lượng trên thực phẩm chức năng chứa chalcon Phương pháp đã tiến hành định lượng hàm lượng hai chất 4-HD và XA trên chế phẩm Chalcone của Viện Dinh Dưỡng.

Trong bối cảnh các sản phẩm thương mại hóa chứa hai chất này chưa phổ biến tại Việt Nam, việc xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời 4-HD và XA trong thực phẩm chức năng chứa chalcon sẽ trở thành nguồn tài liệu tham khảo và tiền đề cho định lượng và tiêu chuẩn hóa hai chất này trong tương lai.

33

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trên cơ sở các kết quả thực nghiệm trong các bài báo nghiên cứu tham khảo, chúng tôi tiến hành khảo sát quá trình định lượng 4-hydroxyderricin và xanthoangelol sử dụng HPLC và detector PDA với kết quả thu được như sau: 1. Tối ưu hóa các điều kiện sắc ký HPLC  Cột Agilent 5-HC C18(2) (150mm x 4,6mm x 5µm) với cột bảo vệ Agilent 5-HC C18(2) (12.5mm x 4,6mm x 5µm).  Dectector PDA: 370 nm.  Pha động gồm 2 kênh: MeOH - H2O tỷ lệ tương ứng 8 - 2.  Tốc độ dòng: 1mL/ phút.  Nhiệt độ cột: 35oC.  Thể tích tiêm mẫu: 10 µL. 2. Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu Qua quá trình khảo sát các điều kiện xử lý mẫu, chúng tôi lựa chọn quy trình xử lý sau:

Mẫu thực phẩm chức năng đã đồng nhất Cân chính xác khoảng 0,2g mẫu Thêm khoảng 20 mL MeOH/H2O (8/2) Chiết siêu âm trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Lọc qua giấy lọc vào bình định mức 25 mL Rửa cắn bằng dung môi đến vừa đủ 25 mL Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 µm Tiêm vào hệ thống sắc ký 3. Thẩm định quy trình định lượng theo yêu cầu của AOAC 2016 Kết quả thẩm định: -

Phương pháp có tính chọn lọc tốt với 4-hydroxyderricin và xanthoangelol.

34

-

Phương pháp cho thấy có sự tương quan tuyến tính rõ rệt giữa diện tích peak sắc

ký và nồng độ chất:  4-HD: khoảng nồng độ từ 4,7 ppm đến 235 ppm với r2 = 0,9994.  XA: khoảng nồng độ từ 5,35 ppm đến 267,5 ppm với r2 = 0,9997.

-

Phương pháp cho độ nhạy tốt để sàng lọc hai chất với các giá trị LOD và LOQ

tương ứng như sau:  4-HD: LOD = 37,6 ng/g, LOQ = 12,5 ng/g.  XA: LOD = 53,5 ng/g, LOQ = 17,8 ng/g.

-

Phương pháp có độ lặp lại ở các mức nồng thấp, trung bình và cao đáp ứng

yêu cầu của AOAC 2016.

-

Phương pháp cho kết quả độ thu hồi tốt đáp ứng yêu cầu AOAC 2016.

4. Định lượng thực phẩm chức năng Nghiên cứu đã xác định được hàm lượng 4-hydroxyderricin và xanthoangelol trong mẫu thực phầm chức năng Chalcone với hàm lượng tương ứng là 88,14% và 78,91% so với hàm lượng trên nhãn.

5. Kiến nghị Phương pháp mới được ứng dụng trên nền mẫu rắn với thực phẩm chức năng Chalcone, cần được ứng dụng trên nhiều nền mẫu hơn.

35

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1.

Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, Viện Kiểm Nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm Quốc gia, pp. 32-39.

TIẾNG ANH 2.

Batttenberg O.A., Yang Y., et al. (2013), "Target profiling of 4-hydroxyderricin in S. aureus reveals seryl-tRNA synthetase binding and inhibition by covalent modification", Mol BioSyst, 9, pp. 343-351.

3.

Ho K.J., Kyung S.Y., et al. (2013), "Xanthoangelol and 4-hydroxyderricin are the major active principles of the inhibitory activities against monoamine oxidases on Angelica keiskei", K. Biomol Ther, 21, pp. 231-240.

4.

Janpan Bio Science Laboratory Co. L. (2009), "Assay method of chalcone", HPLC method, the first edition, pp.

5.

Kawabata K., Sawada K., et al. (2011), "Prenylated chalcones 4hydroxyderricin and xanthoangelol stimulate glucose uptake in skeletal muscle cells by inducing GLUT4 translocation", Mol. Nutr. Food Res, 55, pp. 467-475.

6.

Kil Y.-S., T.Pham S., et al. (2017), "Angelica keiskei, an emerging medicinal herb with various bioactive constituents and biological activities", Archives of Pharmacal Research, 40(6), pp. 655-675.

7.

Kimura Y., Baba K. (2003), "Antitumor and Antimetastatic activities of Angelica keiskei roots, part 1: isolation of an active substance, xanthoangelol", Int. J. Cancer, 106, pp. 429-437.

8.

Konieczka P., Namiesnik J. (2016), "Method Validation", Quality Assuarance and Quality Control in the Analytical Chemical Laboratory: A pratical Approach, CRC Press, pp. 136-143.

9.

Kozawa M., Morita N., et al. (1977), "The Structure of Xanthoangelol, a New Chalcone from the Roots of Angelica keiskei Koidzumi (Umbellifera)", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 25(3), pp. 515-516.

10.

Luo L., Wang R., et al. (2012), "Compounds from Angelica keiskei with NQO1 induction, DPPH scavenging and a-glucosidase inhibitory activities", Food Chemistry, 131, pp. 992-998.

11.

Maronpot R.R. (2015), "Toxicological assessment of ashitaba chalcone", Food and Chemical Toxicology, 77, pp. 111-119.

12.

Murakami S., Kijima h., et al. (1990), "Inhibition of gastric H+, K+, ATPase by chalcone derivatives, xanthoangelol and 4-hydroxyderricin, from Angelica keiskei Koidzumi. ", J Pharm Pharmacol, 42, pp. 723-726.

13.

Nakamura T., Tokushima T., et al. (2012), "Absorption and metabolism of 4hydroxyderricin and xanthoangelol after oral administration of Angelica keiskei (Ashitaba) extract in mice", Archives of biochemistry and biophysics, 521(1-2), pp. 71-76.

14.

Official Methods of Analysis AOAC, Appendix F: Guidelines for standard method performance requirement. 2016.

15.

Ogawa H., Ohno M., et al. (2005), "Hypotensive and lipid regulatory actions of 4-hydroxyderricin, a chalcone from angelica keiskei in stroke-prone spontaneously hypertensive rats", Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 32, pp. 19-23.

16.

Ohnishi K., Hackel V. (2017), "A Two Part Randomized, Placebo Controlled Double Blind Pilot Study to Determine the Effect of Ashitaba (Angelica keiskei) Chalcone Powder (ChalCurbR) on Body Weight and Visceral Fat in Slightly Obese Adults", Adv Obes Weight Manag Control, 7(2), pp. 00189.

17.

Wook K.D., Marcus C.-L.J., et al. (2014), "Quantitative analysis of phenolic metabolites from different parts of Angelica keiskei by HPLCâ&#x20AC;&#x201C;ESI MS/MS and their xanthine oxidase inhibition", Food chemistry, 153, pp. 20-27.

18.

Yali L., Yulan L., et al. (2016), "Determination of 4-Hydroxyderricin and Xanthoangelol in Different Parts of Angelica keiskei by HPLC-PDA", Food Science, 37(6), pp. 142-145.

19.

Yasuda M., Kawabata K., et al. (2014), "Inhibitory effects of 4-hydroxyderricin and xanthoangelol on lipopolysaccharide-induced inflammatory responses in RAW264 macrophages", Journal of agricultural and food chemistry, 62(2), pp.

462-467.

WEBSITE 20.

Institute E.M.B.L.-E.B. (2018), "Compound Report Card: 4-Hydroxyderricin", Retrieved 20-05, 2019, from https://www.ebi.ac.uk/chembl/compound_report_card/CHEMBL458094/.

21.

Institute E.M.B.L.-E.B. (2018), "Compound Report Card: Chalcone", Retrieved 10-06, 2019, from https://www.ebi.ac.uk/chembl/compound_report_card/CHEMBL7976/.

22.

Institute E.M.B.L.-E.B. (2018), "Compound Report Card: Xanthoangelol", Retrieved 20-05, 2019, from https://www.ebi.ac.uk/chembl/compound_report_card/CHEMBL494083/.

PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: THÀNH PHẦN THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHALCONE Xanthoangelol

4 mg

4-Hydroxyderricin

2,2 mg

Vitamin E

3 mg

Vitamin C

35 mg

Vitamin D

200 IU

β - caroten

3 mg

PHỤ LỤC 2: SẮC KÝ ĐỒ DUNG DỊCH CHUẨN

Sắc ký đồ chuẩn đơn 4-hydroxyderricin 188 ppm

Sắc ký đồ chuẩn đơn xanthoangelol 214 ppm

Sắc ký đồ chuẩn đơn hỗn hợp 4-HD 235,5 ppm và XA 262,5 ppm

PHỤ LỤC 3: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ QUÁ TRÌNH THẨM ĐỊNH

Sắc ký đồ độ ổn định của hệ thống

Sắc ký đồ độ lặp lại - mẫu LL-06

PHỤ LỤC 4: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ QUÁ TRÌNH KHẢO SÁT

Sắc ký đồ khảo sát chiết 1 lần

Sắc ký đồ khảo sát chiết 2 lần

PHỤ LỤC 5: MỘT SỐ KẾT QUẢ QUÁ TRÌNH KHẢO SÁT QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU PL 5.1 Hàm lượng nhãn Chất phân tích

Nhãn

Khối lượng trung bình viên

4-HD

2,2mg/ viên

XA

4mg/ viên

0,511

Hàm lượng nhãn mg/g

ppm

4,31

172,21

7,83

313,11

PL 5.2: Phương pháp chiết 4-HD Mẫu

Khối lượng cân

Diện tích (mAu.s)

Nồng độ (ppm)

XA HLSVN (%)

Diện tích (mAu.s)

Nồng độ (ppm)

HLSVN (%)

Siêu âm 30 phút PP - 01

0,3000

2478920

47,33

91,61

3669179

77,26

82,25

PP - 02

0,2965

2456001

46,91

91,88

3663423

77,14

82,31

Trung bình

91,75

82,67

Lắc ngang 6 giờ PP - 03

0,2012

1409442

27,95

80,67

2140662

46,44

73,71

PP - 04

0,1993

1404696

27,87

81,19

2039696

44,40

71,15

Trung bình

80,93

72,43

PL 5.3: Nhiệt độ chiết và số lần chiết Mẫu

Khối lượng cân

Diện tích (mAu.s)

4-HD Nồng độ HLSVN (%) (ppm) Nhiệt độ chiết

Diện tích (mAu.s)

XA Nồng độ (ppm)

HLSVN (%)

45oC 45 - 1

0,1952

1476565

27,76

82,58

2225162

45,26

74,05

45 - 2

0,2014

1659887

30,94

87,99

2487079

50,30

78,67

Trung bình

85,29

76,36

60oC 60 - 1

0,2057

1670919

31,14

87,89

2501039

50,57

78,52

60 - 2

0,2058

1670309

31,12

87,82

2501668

50,58

78,50

Trung bình

87,86

78,51

Nhiệt độ phòng - 1 lần chiết Ph - 01

0,3021

2565417

46,67

89,72

3800387

75,59

79,91

Ph - 02

0,2969

2587668

47,06

92,04

3636689

72,43

77,92

Trung bình

90,88

78,91

Nhiệt độ phòng - 2 lần chiết 2C - 1

0,2223

1778719

33,01

86,69

2740760

55,19

79,71

2C - 2

0,2011

1650201

30,78

88,34

2421285

49,03

77,41

Trung bình

87,51

78,56

PL 5.4: Tỷ lệ dung môi chiết

Mẫu

Khối lượng cân

4-HD Diện tích (mAu.s)

Nồng độ (ppm)

XA HLSVN (%)

Diện tích (mAu.s)

Nồng độ (ppm)

HLSVN (%)

MeOH/H2O : 7/3 KS - 01

0,1993

1657041

29,47

85,86

2357612

45,56

73,00

KS - 02

0,2082

1625969

28,95

80,75

2377681

45,92

70,45

Trung bình

83,31

71,12

MeOH/H2O : 8/2 KS - 03

0,2991

2563015

48,12

93,42

3288762

77,17

82,40

KS - 04

0,2947

2484579

43,80

85,15

3701571

70,67

76,17

Trung bình

89,28

79,28

MeOH/H2O : 9/1 KS - 05

0,1964

1662609

29,56

87,41

2592742

49,88

81,12

KS - 06

0,1989

1761318

31,20

91,09

2619596

50,38

80,89

Trung bình

89,25

81,00

MeOH 100% KS - 07

0,1992

1551798

27,72

80,81

2393403

46,21

74,09

KS - 08

0,2013

1730955

30,70

88,55

2664619

51,20

81,24

Trung bình

84,68

77,67

PHỤ LỤC 6: KẾT QUẢ ĐỘ THU HỒI PL 6.1: Kết quả độ thu hồi với 4-HD Mức chuẩn Nồng độ thấp: 9,4 ppm Nồng độ trung bình 28,2 ppm Nồng độ cao 56,4 ppm

Mẫu

Diện tích peak (mAu,s)

Nồng độ thu hồi (ppm)

Độ thu hồi (%)

TH - 01

478819

9,61

102,3

TH - 02

484394

9,70

103,2

TH - 03

488255

9,77

103,9

TH - 04

1570791

27,67

98,1

TH - 05

1652048

29,01

102,9

TH - 06

1638037

28,78

102,1

TH - 07

3371603

57,44

101,9

TH - 08

3305693

56,35

99,9

TH - 09

3307093

56,38

100,0

PL 6.2: Kết quả độ thu hồi với XA Mức thêm chuẩn Nồng độ thấp: 10,7 ppm Nồng độ trung bình 53,5 ppm Nồng độ cao 107 ppm

Mẫu

Diện tích peak (mAu,s)

Nồng độ thu hồi (ppm)

Độ thu hồi (%)

TH - 01

477777

9,97

93,2

TH - 02

503759

10,45

97,7

TH - 03

503500

10,44

97,6

TH - 04

2726678

51,68

96,6

TH - 05

2714982

51,46

96,2

TH - 06

2638465

50,04

93,5

TH - 07

5327165

99,92

93,4

TH - 08

5157096

96,76

90,4

TH - 09

5196300

97,49

91,1

PHỤ LỤC 6: QUY ĐỊNH AOAC PL 6.1: Độ lặp lại tối đa chấp nhận theo AOAC 2016 TT

Hàm lượng (%)

Tỷ lệ chất phân tích

Đơn vị

RSD (%)

1

100

1

100%

1,3

2

≥ 10

10-1

10%

1,9

3

≥1

10-2

1%

2,7

4

≥ 0,1

10-3

0,1%

3,7

5

0,01

10-4

100 ppm

5,3

6

0,001

10-5

10 ppm

7,3

7

0,0001

10-6

1 ppm

11

8

0,00001

10-7

100 ppb

15

9

0,000001

10-8

10ppb

21

10

0,0000001

10-9

1 ppb

30

PL 6.2: Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo AOAC 2016 TT

Hàm lượng (%)

Tỷ lệ chất phân tích

Đơn vị

Độ thu hồi (%)

1

100

1

100%

98-102

2

≥ 10

10-1

10%

98-102

3

≥1

10-2

1%

97-103

4

≥ 0,1

10-3

0,1%

95-105

5

0,01

10-4

100 ppm

90-107

6

0,001

10-5

10 ppm

80-110

7

0,0001

10-6

1 ppm

80-110

8

0,00001

10-7

100 ppb

80-110

9

0,000001

10-8

10ppb

60-115

10

0,0000001

10-9

1 ppb

40-120