Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng của cốm thuốc Kỷ cúc địa hoàng

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ KHÁNH HUYỀN

XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CỐM THUỐC KỶ CÚC ĐỊA HOÀNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ KHÁNH HUYỀN Mã sinh viên: 1401281

XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CỐM THUỐC KỶ CÚC ĐỊA HOÀNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS. Bùi Hồng Cường Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền

HÀ NỘI – 2019

LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình từ thầy cô, gia đình và bạn bè.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến PGS.TS. Bùi Hồng Cường - người thầy luôn nhiệt tình dạy dỗ, định hướng, tạo mọi điều kiện tốt nhất và trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện khóa luận này.

Tôi xin chân thành cảm ơn chị Bùi Thị Duyên, học viên cao học khóa 22, Trường Đại học Dược Hà Nội đã chia sẻ, giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong thời gian nghiên cứu và thực hiện khóa luận.

Tôi xin trân trọng cảm ơn DS. Đỗ Trung Hiếu và Công ty cổ phần thương mại dược phẩm Quốc tế WINSACOM, DS. Trần Văn Cương và Công ty cổ phần dược phẩm VCP đã cung cấp mẫu cốm thuốc, chất chuẩn và hỗ trợ kinh phí giúp chúng tôi thực hiện đề tài này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy Cô giáo, các chị kỹ thuật viên, cán bộ đang công tác tại Bộ môn Dược học cổ truyền đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, phòng đào tạo Đại học cùng toàn thể các Thầy Cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tận tình dạy dỗ và chỉ bảo tôi trong suốt 5 năm học qua.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập của mình.

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn hạn chế, nên khóa luận này còn có những điểm thiếu xót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 11 tháng 6 năm 2019 Sinh viên Đặng Thị Khánh Huyền

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...................................................................................... 2 1.1. Phương thuốc Kỷ cúc địa hoàng ..................................................................... 2 1.1.1. Xuất xứ ....................................................................................................... 2 1.1.2. Thành phần.................................................................................................. 2 1.1.3. Công năng, chủ trị của phương thuốc .......................................................... 2 1.1.4. Giải thích phương thuốc .............................................................................. 2 1.1.5. Định tính, định lượng .................................................................................. 3 1.2. Thông tin cơ bản về các vị thuốc ..................................................................... 3 1.2.1. Thục địa (Radix Rehmanniae glutinosae praeparata) .................................. 3 1.2.2. Hoài sơn (Rhizoma Dioscoreae persimilis) .................................................. 4 1.2.3. Sơn thù (Fructus Corni officinalis) .............................................................. 5 1.2.4. Mẫu đơn bì (Cortex Paeoniae suffruticosae) ................................................ 6 1.2.5. Bạch linh (Poria) ......................................................................................... 8 1.2.6. Trạch tả (Rhizoma Alisma plantago) ........................................................... 9 1.2.7. Câu kỷ tử (Fructus Lycii) ........................................................................... 10 1.2.8. Cúc hoa vàng (Flos Chrysanthemi indici) .................................................. 11 1.3. Các yêu cầu chung của thuốc cốm ................................................................ 12 1.4. Tổng quan về SKLM hiệu năng cao và sắc ký lỏng hiệu năng cao .............. 13 1.4.1. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) .................................................. 13 1.4.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao.......................................................................... 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 14 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ................................................................................. 14 2.1.1. Cốm .......................................................................................................... 14 2.1.2. Dược liệu chuẩn ........................................................................................ 14 2.1.3. Thiết bị, máy móc ...................................................................................... 14

2.1.4. Hóa chất, chất chuẩn.................................................................................. 15 2.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 15 2.2.1. Nghiên cứu định tính một số thành phần hóa học của cốm bài thuốc và các vị thuốc ............................................................................................................... 15 2.2.2. Định lượng loganin trong cốm bài thuốc bằng HPLC ................................ 15 2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 15 2.3.1. Định tính một số thành phần hóa học của cốm bài thuốc và các vị thuốc ... 15 2.3.2. Định lượng loganin trong cốm bài thuốc bằng HPLC ................................ 16 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ..................................................... 17 3.1. Định tính một số thành phần hóa học của cốm bài thuốc và các vị thuốc .. 17 3.1.1. Định tính một số nhóm chất chính trong mẫu nghiên cứu bằng phản ứng hóa học

............................................................................................................... 17

3.1.2. Định tính so sánh cốm bài thuốc, dược liệu chuẩn và chất chuẩn bằng sắc ký lớp mỏng ............................................................................................................. 19 3.2. Xác định hàm ẩm cốm bài thuốc ................................................................... 34 3.3. Định lượng loganin trong cốm bài thuốc bằng HPLC ................................. 34 3.3.1. Xây dựng đường chuẩn.............................................................................. 34 3.3.2. Định lượng loganin trong cốm bài thuốc .................................................... 35 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ....................................................................................... 37 4.1. Định tính một số thành phần hóa học của cốm bài thuốc và các vị thuốc .. 37 4.2. Định lượng loganin trong cốm bài thuốc bằng HPLC ................................. 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................. 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN

Acetonitrile

BL

Bạch linh

BT

Bài thuốc

CH

Cúc hoa vàng

CKT

Câu kỷ tử

DB

Mẫu đơn bì

DC

Dịch chiết

DĐVN

Dược điển Việt Nam

DĐTQ

Dược điển Trung Quốc

EtOAc

Ethyl acetat

EtOH

Ethanol

HS

Hoài sơn

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

MeOH

Methanol

MNC

Mẫu nghiên cứu

Pư

Phản ứng

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

ST

Sơn thù

TD

Thục địa

TLC

Sắc ký lớp mỏng

TNHH

Trách nhiệm hữu hạn

TrT

Trạch tả

TT

Thuốc thử

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số phương pháp định tính bằng sắc ký lớp mỏng . ................................ 3 Bảng 2.1. Công thức cốm thuốc Kỷ cúc địa hoàng. .................................................... 14 Bảng 3.1. Kết quả định tính thành phần hóa học trong cốm bài thuốc và cốm thành phần .................................................................................................................................. 17 Bảng 3.2. Kết quả SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và TD chuẩn ở bước sóng 254 nm................................................................................................... 21 Bảng 3.3. Kết quả SKLM định tính dịch chiết cloroform từ cốm bài thuốc và HS chuẩn ở bước sóng 254 nm................................................................................................... 22 Bảng 3.4. Kết quả SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và DB chuẩn ở bước sóng 254 nm................................................................................................... 24 Bảng 3.5. Kết quả SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và TrT chuẩn ở bước sóng 254 nm................................................................................................... 26 Bảng 3.6. Kết quả SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và CKT chuẩn ở bước sóng 254 nm................................................................................................... 27 Bảng 3.7. Kết quả SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và BL chuẩn ở bước sóng 254 nm................................................................................................... 29 Bảng 3.8. Kết quả SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và CH chuẩn ở bước sóng 254 nm................................................................................................... 31 Bảng 3.9. Kết quả SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc, ST chuẩn và loganin ở ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử. ....................................................... 33 Bảng 3.10. Kết quả xác định hàm ẩm của cốm bài thuốc............................................ 33 Bảng 3.11. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính .......................................................... 34 Bảng 3.12. Kết quả định lượng loganin trong cốm bài thuốc ...................................... 36 Bảng 4.1. Một số chỉ tiêu đề xuất trong tiêu chuẩn kỹ thuật của cốm bài thuốc Kỷ cúc địa hoàng ................................................................................................................... 38

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 3.1. Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và TD chuẩn ở bước sóng 254 nm. ............................................................................................................. 21 Hình 3.2. Sắc ký đồ định tính dịch chiết cloroform từ cốm bài thuốc và HS chuẩn ở bước sóng 254 nm. ............................................................................................................. 22 Hình 3.3. Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và DB chuẩn ở bước sóng 254 nm. ............................................................................................................. 24 Hình 3.4. Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và TrT chuẩn ở bước sóng 254 nm. ............................................................................................................. 26 Hình 3.5. Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và CKT chuẩn ở bước sóng 254 nm...................................................................................................... 27 Hình 3.6. Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và BL chuẩn ở bước sóng 254 nm. ............................................................................................................. 29 Hình 3.7. Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và CH chuẩn ở bước sóng 254 nm. ............................................................................................................. 31 Hình 3.8. Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc, ST chuẩn và loganin ở ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử. ................................................................... 33 Hình 3.9. Đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính của loganin .................... 34 Hình 3.10. Sắc ký đồ HPLC của mẫu chuẩn loganin và các mẫu thử cốm bài thuốc. .. 35

ĐẶT VẤN ĐỀ Các bệnh lý về mắt ngày càng phổ biến ở mọi đối tượng như: đau mắt đỏ, khô mắt, hoa mắt, chảy nước mắt,… ảnh hưởng đến công việc cũng như chất lượng cuộc sống của người bệnh. Đặc biệt, môi trường ngày càng bị ô nhiễm như bụi, sinh hoạt không hợp lý … nên những rối loạn về thị lực và bệnh lý của mắt có xu hướng xảy ra sớm hơn.

Trên thị trường có rất nhiều sản phẩm thuốc tân dược để điều trị và phòng các bệnh lý về mắt. Các sản phẩm này có thể có tác dụng nhanh nhưng nó cũng kèm theo nhiều tác dụng phụ. Do đó, người ta muốn sử dụng những bài thuốc cổ truyền từ những dược liệu tự nhiên thân thiện với sức khỏe, ít tác dụng không mong muốn so với thuốc tân dược để điều trị các bệnh nói chung và bệnh về mắt nói riêng. Bài thuốc Kỷ cúc địa hoàng gồm 8 vị Thục địa, Hoài sơn, Sơn thù, Mẫu đơn bì, Câu kỷ tử, Trạch tả, Cúc hoa vàng, Bạch linh có tác dụng tư thận dưỡng can, ích tinh sáng mắt được dùng để điều trị cho bệnh nhân can thận âm hư, từ đó điều trị các bệnh về mắt. Trong phương thuốc Kỷ cúc địa hoàng, Thục địa là quân dược, Sơn thù là vị thần, trong đó loganin là glycoside iridoid chính trong Sơn thù, được lựa chọn làm marker định lượng hàm lượng hoạt chất trong bài thuốc. Phương pháp sử dụng thông thường nhất của bài thuốc là phương pháp sắc truyền thống, tuy nhiên, cách sử dụng này tốn nhiều thời gian và phải sử dụng ngay trong thời gian ngắn. Vì thế, việc nghiên cứu để đưa ra một cách sử dụng dễ dàng và thuận tiện hơn mà vẫn phát huy tốt tác dụng của bài thuốc là cần thiết. Cốm thuốc là một dạng bào chế dễ sử dụng và sử dụng được trên cả bệnh nhân không dùng được thuốc dạng viên.

Dạng cốm từ bài thuốc Kỷ cúc địa hoàng đã được Công ty cổ phần dược phẩm VCP bào chế. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nghiên cứu nào tiêu chuẩn hóa dạng cốm của bài thuốc này.

Từ những lý do trên, đề tài “Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng của cốm thuốc Kỷ cúc địa hoàng” được thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu sau: -

Định tính được một số thành phần hóa học trong cốm bài thuốc và các vị thuốc bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng.

-

Định lượng được loganin trong cốm bài thuốc.

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Phương thuốc Kỷ cúc địa hoàng 1.1.1. Xuất xứ Phương thuốc Kỷ cúc địa hoàng có xuất xứ từ cuốn “Y CẤP” [8].

1.1.2. Thành phần Thành phần của phương thuốc Kỷ cúc địa hoàng bao gồm 8 vị: [8].

Thục địa

24 g

Sơn thù

12 g

Hoài sơn

12 g

Trạch tả

9g

Bạch linh

9g

Mẫu đơn bì

9g

Câu kỷ tử

9g

Cúc hoa vàng

9g

1.1.3. Công năng, chủ trị của phương thuốc - Công năng: Tư thận dưỡng can, ích tinh sáng mắt [8].

- Chủ trị: Can thận âm hư cho nên hai mắt hoa mờ không nhìn rõ vật, hoặc lòng mắt khô sáp gặp gió chảy nước mắt [8].

1.1.4. Giải thích phương thuốc - Trong lý luận Y học cổ truyền, can khai khiếu ra mắt, khí của can được biểu hiện ra ở mắt. Khí của can tốt thì thị lực tốt, ngược lại, mắt mờ thị lực suy giảm. Nhìn vào mắt biết được trạng thái của can. Nếu mắt khô sáp, thâm cuồng là can huyết bất túc, đỏ do sung huyết là can hỏa thịnh, mắt vàng (âm hoàng hoặc dương hoàng) là can nhiệt, mắt trắng dã là can huyết hư. Theo thuyết ngũ hành, can thuộc mộc, thận thuộc thủy, thủy sinh mộc nên can mộc được sinh ra từ thận thủy. Khi thận thủy suy lâu thì can mộc không được nuôi dưỡng đầy đủ nên can huyết, can âm dần khô kiệt mà làm phát sinh các chứng bệnh về mắt như hoa mắt, khô mắt, nhức mắt, mắt đỏ, chảy nước mắt…. Vì thế, để điều trị các bệnh lý về mắt, người ta sử dụng các bài thuốc bổ can thận để có thể điều trị từ bên trong, từ căn nguyên của bệnh. Bài thuốc Kỷ cúc địa hoàng với 8 vị Thục địa, Hoài sơn, Sơn thù, Mẫu đơn bì, Câu kỷ tử, Trạch tả, Cúc hoa vàng, Bạch linh được sử dụng để chữa bệnh can thận âm hư, từ đó điều trị các bệnh lý về mắt.

- Trong bài thuốc này Thục địa, Câu kỷ tử bồi bổ thận âm, ích tinh tủy; Sơn thù bồi dưỡng thận ích can; Hoài sơn bồi dưỡng thận bổ tỳ; Trạch tả lợi thấp giáng trọc; Mẫu đơn bì tả can hỏa; Bạch linh thấm tỳ thấp; Cúc hoa vàng thanh can minh mục; toàn bài hợp dụng có công hiệu tư thận dưỡng can, ích tinh sáng mắt [8].

2

1.1.5. Định tính, định lượng - Trong Dược điển Trung Quốc 2015 [17] có 2 chuyên luận về bài thuốc Kỷ cúc địa hoàng (Qiju Dihuang Wan): Viên hoàn mềm (Qiju Dihuang Pills), Viên hoàn cô đặc (Qiju Dihuang Concentrated Pills).

- Định tính viên hoàn mềm và viên hoàn cô đặc bằng sắc ký lớp mỏng được trình bày ở Bảng 1.1.

Bảng 1.1. Một số phương pháp định tính bằng sắc ký lớp mỏng [17] STT 1

Nội dung chính ✓ Hệ dung môi: Toluen – ethyl acetat – acid formic (15:2:1) ✓ So sánh với chất dược liệu Câu kỷ tử

2

✓ Hệ dung môi: Cloroform – methanol (3:1) ✓ So sánh với chất chuẩn morroniside và loganin

3

✓ Hệ dung môi: Toluen – ethyl acetat – acid acetic băng (24:8:1) ✓ So sánh với chất chuẩn acid ursolic

4

✓ Hệ dung môi: Cyclohexan – ethyl acetat (3:1) ✓ So sánh với chất chuẩn paeonol

- Định lượng viên hoàn mềm và viên hoàn cô đặc bằng phương pháp HPLC đối chiếu với chất chuẩn morroniside và loganin, chất chuẩn paeonol.

Yêu cầu: + Viên hoàn mềm 9 g chứa không dưới 3,9 mg tổng morroniside (C17H26O11) và loganin (C17H26O10) trong Sơn thù và không dưới 5,4 mg paeonol (C9H10O3) trong Mẫu đơn bì. + Viên hoàn cô đặc 0,375 g chứa không dưới 0,28 mg tổng morroniside (C17H26O11) và loganin (C17H26O10) trong Sơn thù và không dưới 0,33 mg paeonol (C9H10O3) trong Mẫu đơn bì [17].

1.2. Thông tin cơ bản về các vị thuốc 1.2.1. Thục địa (Radix Rehmanniae glutinosae praeparata) 1.2.1.1. Tên khoa học: Radix Rehmanniae glutinosae praeparata [4].

1.2.1.2. Bộ phận dùng: Rễ củ đã chế biến của cây Địa hoàng [Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch.], họ Hoa mõm chó (Scrophulariaceae) [13].

1.2.1.3. Thành phần hóa học: - Rehmanin, glucose, carotene, mannit [5], [10].

3

- Iridoid glycoside là catalpol, rehmaniosid A, B, C, D, đường khử: D-glucose, Dgalactose, D-fructose, sucrose, raffinose, mannotriose, stachyose 48,3%, verbascose và D-mannitol [13], 15 acid amin và D-glucosamine [1], [10].

- (7S, 8S, 8’S)-9-O-[β-D-glucopyranoy] asarininone; 2α, 3β, 19α, 23-tetrahydroxyolean-12-en-28-oic acid; aeginetic acid, corchorifatty acid B; pinellic acid [48].

1.2.1.4. Tác dụng sinh học: - Catalpol có tác dụng hạ đường huyết rõ rệt [37].

- Các chất phenethyl glycoside có tác dụng ức chế aldose reductase với IC50 từ 10-7 – 106 M và có tác dụng ức chế 5 – lipoxygenase với IC50 là 10-5 M [1].

- Tác dụng đối với huyết quản: liều nhỏ làm co mạch, liều lớn làm giãn mạch [10].

- Tác dụng chống ung thư [44], tác dụng chống viêm đối với viêm da dị ứng [29].

1.2.1.5. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền: - Tính vị, quy kinh: Vị cam, tính ôn, quy vào các kinh can, thận, tâm [4] .

- Công năng, chủ trị: Tư âm, dưỡng huyết, nuôi dưỡng và bổ thận âm, làm sáng mắt, điều kinh bổ huyết, sinh tinh, làm cho cơ thể tráng kiện [10], [13].

- Liều dùng: 12 – 20 g/ngày [13].

- Kiêng kị: Kỵ sắt, tỳ hư kém ăn, bụng đầy trướng [4], [5].

1.2.1.6. Định tính, định lượng: - Định tính bằng SKLM: + DĐVN, DĐTQ: So sánh với chất chuẩn verbascosid [4], [17].

- Định lượng: + DĐVN, DĐTQ: Định lượng verbascosid bằng phương pháp HPLC. Dược liệu phải chứa không dưới 0,02 % verbascosid (C29H36O15) tính theo dược liệu khô kiệt [4], [17].

1.2.2. Hoài sơn (Rhizoma Dioscoreae persimilis) 1.2.2.1. Tên khoa học: Tuber Dioscoreae persimilis [4].

1.2.2.2. Bộ phận dùng: Thân rễ phơi hay sấy khô của cây Củ mài (Dioscorea persimilis Prain et Burkill), họ Củ nâu (Dioscoreaceae) [1], [13].

1.2.2.3. Thành phần hóa học: - Glucid, mucin và một số chất: alloatoin, cholin, arginin, men maltose, saponin có nhân sterol, chất béo [1], [5], [6], [10].

- Chất nhày, mantaza, acid amin, tinh bột, protid [1], [10], [25].

1.2.2.4. Tác dụng sinh học: 4

Chất muxin hòa tan trong nước, trong điều kiện acid loãng và nhiệt độ phân giải thành chất protid và hydrat cacbon có tính chất bổ, Hoài sơn chữa khỏi một trường hợp đi đái đường đã dùng insulin không khỏi [10].

1.2.2.5. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền: - Tính vị, quy kinh: Vị ngọt, tính bình [4], [6], quy vào các kinh phế, tỳ, vị, thận [4].

- Công năng, chủ trị: Kiện tỳ, chỉ tả, bổ phế, ích thận, cố tinh [6], [13].

- Liều dùng: 12 – 40 g/ngày [13].

- Kiêng kị: Có thực tà thấp nhiệt thì không dùng [4], [13].

1.2.2.6. Định tính, định lượng: - Định tính bằng SKLM: + DĐVN, DĐTQ: So sánh với dược liệu chuẩn Hoài sơn [4], [17].

- Định lượng: + DĐVN, DĐTQ: Chưa có chỉ tiêu định lượng [4], [17] 1.2.3. Sơn thù (Fructus Corni officinalis) 1.2.3.1. Tên khoa học: Fructus Corni officinalis [4].

1.2.3.2. Bộ phận dùng: Quả chín đã phơi hay sấy khô, bỏ hạt của cây Sơn thù du (Cornus officinalis Sieb. Et Zucc.), họ Thù du (Cornaceae) [4], [13].

1.2.3.3. Thành phần hóa học: - Glucoside (cornin), chất keo, acid hữu cơ: acid malic, acid tartric [5], [10], [26], acid ursolic, acid gallic [16], [26], 13 % saponizit, longixerozit, secologanin, vitamin E và C, quả sơn thù du chứa moronisid, 7-O-methylmoronisid, swerosid, loganin [10].

- Ngoài ra, còn có acid amin, vitamin A, saponin 13 % [15], longicerosid [10], [16], tanin [10], [18], [26], iridoids, tinh dầu [26], flavonoid, triterpenes, polysaccharid, monoterpenes và sesquiterpenes [18], [26], phenylpropanoids, sterol, carboxylic acid, furan và một số chất khoáng, 5-hydroxymethylfurfural [18]. ❖ Hoạt chất loganin:

5

+ Loganin thuộc nhóm glycoside iridoid, tan trong nước, ít tan trong ethanol 96 % và ethanol tuyệt đối, không tan trong ether, petroleum ether, ethyl acetat và aceton. + Loganin là một glycoside iridoid chính của Sơn thù và được chứng minh là có tác dụng chống viêm, chống khối u và chống loãng xương [27], [30].

1.2.3.4. Tác dụng sinh học: - Cho chuột nhắt trắng uống, thuốc có tác dụng làm ngừng đi ngoài, tác dụng làm tăng khả năng dung nạp glucose trong thử nghiệm dung nạp glucose [16].

- Tác dụng hạ đường máu, chống viêm, hạ nhiệt, lợi tiểu, hạ huyết áp [10], [16].

- Cao sơn thù du có tác dụng chống loạn nhịp tim, làm sáng mắt, tăng thị lực [16].

- Bảo vệ gan và thận, tác dụng điều trị đái tháo đường, bảo vệ tim mạch, bảo vệ thần kinh, hoạt tính chống ung thư [18], [21], [26].

- Giảm đau, kháng khuẩn và diệt côn trùng, chống oxy hóa và chống lão hóa, chống mất trí nhớ, chống loãng xương và điều hòa miễn dịch [26], [38].

1.2.3.5. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền: - Tính vị, quy kinh: Vị toan, sáp, tính vi ôn, quy vào các kinh can, thận [4].

- Công năng, chủ trị: Ích thận, cố tinh, cố biểu liễm hãm, cố tinh chỉ huyết, bổ gan thận, cường dương, ích tinh [4], [13].

- Liều dùng: 4 – 12 g/ngày [13].

- Kiêng kị: Thấp nhiệt, tiểu tiện khó, ít , hỏa thịnh không nên dùng [4].

1.2.3.6. Định tính, định lượng: - Định tính bằng SKLM: + DĐVN: So sánh với chất chuẩn acid ursolic hoặc chất chuẩn loganin hoặc dược liệu chuẩn Sơn thù [4]. + DĐTQ: So sánh với chất chuẩn acid ursolic hoặc chất chuẩn morroniside và loganin [17].

- Định lượng: Định lượng loganin bằng phương pháp HPLC. + DĐVN: Dược liệu phải chứa không dưới 0,6 % loganin (C17H26O10) tính theo dược liệu khô kiệt [4]. + DĐTQ: Dược liệu phải chứa không dưới 1,2% tổng morroniside (C17H26O11) và loganin (C17H26O10) tính theo dược liệu khô kiệt [17].

1.2.4. Mẫu đơn bì (Cortex Paeoniae suffruticosae) 1.2.4.1. Tên khoa học: Cortex Radicis Paeoniae suffruticosae [4].

6

1.2.4.2. Bộ phận dùng: Vỏ rễ phơi khô của cây Mẫu đơn (Paeonia suffr]uticosa Andr.), họ Mẫu đơn (Paeoniaceae) [4].

1.2.4.3. Thành phần hóa học: - Paeonolide, paeonol, paeoniflorin, alcaloid, saponin [6], [15], acid benzoic, phytosterol, glycosid [5], [10].

- Oxypaeoniflorin, benzoylpaeoniflorin, D-catechin sachrose, sterol và 1 lượng tinh dầu từ 0,15 đến 0,4 %, acetophenone [15], P. metoxy-o-oxyaxetophenola [10].

1.2.4.4. Tác dụng sinh học: - Hạ huyết áp, chống viêm khớp, thông kinh [13], tác dụng điều trị trầm cảm [15].

- Paeoniflorin có tác dụng chống co thắt, giảm đau và có độc tính rất thấp, có tác dụng dự phòng loét dạ dày do stress [15].

- Paeonol có tác dụng ức chế phù bàn chân chuột gây bởi caragenin, có tác dụng an thần, gây giảm hoạt động tự nhiên, giảm sự tăng hoạt động gây bởi cafein, làm mất phản xạ đứng lên, giảm đau đối với các triệu chứng quặn đau gây bởi tiêm phúc mạc acid acetic và đối với đau do kẹp đuôi trên chuột nhắt trắng, có tác dụng chống đột biến [15].

- Tác dụng kháng khuẩn [13], chất 1, 2, 3, 4, 6-pentagalloyglucose trong vỏ rễ Mẫu đơn bì có tác dụng kháng virus [15].

- Paeonola có tác dụng gây sung huyết ở vùng tử cung động vật, do đó có tác dụng điều kinh, nhưng tác dụng yếu và chậm [10], [15].

- Kháng HBV, chống viêm nhiễm, chống đái tháo đường và chống ung thư [23], [31].

- Palbinone từ Paeonia suffruticosa có tác dụng bảo vệ tế bào gan [24].

1.2.4.5. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền: - Tính vị, quy kinh: Vị khổ, tân, tính vi hàn [4], quy vào các kinh tâm, can, thận [4], tâm bào [5].

- Công năng, chủ trị: Thanh can nhiệt, hoạt huyết, khứ ứ, hạ huyết áp [4], [13].

- Liều dùng: 8 – 16 g/ngày [13].

- Kiêng kị: Không dùng cho người tỳ vị hư hàn,nhiệt nhập vào phần khí, ỉa chảy, kinh nguyệt ra nhiều, phụ nữ có thai [4], [13].

1.2.4.6. Định tính, định lượng: - Định tính bằng SKLM: + DĐVN: So sánh với chất chuẩn paeonol hoặc dược liệu chuẩn Mẫu đơn bì [4]. + DĐTQ: So sánh với chất chuẩn paeoniflorin (C23H28O11) [17].

7

- Định lượng: + DĐVN: Định lượng paeonol bằng phương pháp đo quang. Dược liệu phải chứa không dưới 1,2 % paeonol (C9H10O3) tính theo dược liệu khô kiệt [4]. + DĐTQ: Định lượng paeoniflorin bằng phương pháp HPLC. Dược liệu phải chứa không dưới 1,6 % paeoniflorin (C23H28O11) [17].

1.2.5. Bạch linh (Poria) 1.2.5.1. Tên khoa học: Poria [4] 1.2.5.2. Bộ phận dùng: Thể quả nấm đã phơi hay sấy khô của nấm Bạch linh [Poria cocos (Schw.) Wolf], họ Nấm lỗ (Polyporceae), mọc ký sinh trên rễ một số loài Thông [4].

1.2.5.3. Thành phần hóa học: - Acid pachymic, acid tumulosic, acid eburicoic, acid pinicolic, pachyman [6].

- Chất đường đặc biệt: pachymose, glucose, fructose và chất khoáng [5].

- Polysaccharides [40], [43], [49], triterpenoids [32].

1.2.5.4. Tác dụng sinh học: - Hạ huyết áp, cường tim ếch cô lập, tác dụng trấn tĩnh, chống nôn do acid pachymie [13], [15], lợi tiểu [1], [13].

- Kháng khuẩn: ức chế tụ cầu vàng, trực khuẩn đại tràng [13].

- Polysaccharides được tinh chế từ Bạch linh có tác dụng chống trầm cảm và ức chế miễn dịch, chống ung thư, chống oxy hóa [35], [42], [49] làm giảm sinh xương [40], bảo vệ gan đối với tổn thương gan do acetaminophen gây ra ở chuột [43].

- Triterpenoids có tác dụng chống viêm [32].

1.2.5.5. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền: - Tính vị, quy kinh: Vị cam, đạm, tính bình, quy kinh tâm, phế, thận, tỳ, vị [4] - Công năng, chủ trị: Lợi thủy, thẩm thấp, kiện tỳ, ninh tâm an thần [4], [5].

- Liều dùng: 9 – 15 g/ngày [4].

- Kiêng kị: Âm hư thấp nhiệt không nên dùng [4], [5].

1.2.5.6. Định tính, định lượng: - Định tính bằng SKLM: + DĐVN, DĐTQ: So sánh với dược liệu chuẩn Bạch linh [4], [17].

- Định lượng: + DĐVN, DĐTQ: chưa có chỉ tiêu định lượng [4], [17].

8

1.2.6. Trạch tả (Rhizoma Alisma plantago) 1.2.6.1. Tên khoa học: Rhizoma Alismatis [4].

1.2.6.2. Bộ phận dùng: Thân rễ khô của cây Trạch tả [Alisma orientalis (Sam.) Juzep.], họ Trạch tả (Alismataceae) [1], [4].

1.2.6.3. Thành phần hóa học: - Thân rễ chứa tinh dầu có alisol A.B.C và epalisol A, chất nhựa 7 %, protid và 23 % tinh bột [5], [6], [10].

- Alismol, alismoxyd, alimalacton 23-acetat, alismacetol-A, β-sitosterol-3-O-stearate, tricosan, daucosterol-6’-stearate, emodin, alizexol A, các sulfoorientalol a, b, c, d, hydroxyalismol [15].

- Polysaccharide: alisma PH bao gồm L-arabinose, D-galactose, acid D-glucuronic, Oacetyl , alisma PIII F bao gồm L- arabinose, D-galactose, L-rhamnose, D-acid galacuronic, acid glucuronic [15], [22], [47].

- Triterpenoid có cấu trúc protostan: alisol B và các dẫn chất của chất này gồm: 16-oxo (alisol C), 23-Ac, 16-β-hydroxy-23-acetyl, 16-β-methoxy-23-Ac, 16-oxo-23-acetyl, alisol D và sitosterol 3-O-6-stearoyl-β-D glucopyranosid [1], [22], [47].

- Sesquiterpenoids, diterpenoids, flavonoids, phytosterols and amino acids, khusinol, germacron, alismol [47].

1.2.6.4. Tác dụng sinh học: - Hạ lipid máu [10], hạ huyết áp, lợi tiểu [13], [15], tác dụng hạ đường huyết [47] - Chống xơ vữa động mạch [15], hạ thấp lượng ure [10], [13], chống viêm [15], [33].

- Các alisol A, B, C monoacetat có tác dụng bảo vệ gan, chống các tổn thương gan do tetrachloride carbon gây nên [15], [47].

- Chống loãng xương, chống ung thư, kháng khuẩn và kháng virus, chống béo phì, điều hòa miễn dịch [47].

1.2.6.5. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền: - Tính vị, quy kinh: Vị cam, hàm, tính hàn [4], quy vào các kinh thận, bàng quang [4], can [13].

- Công năng, chủ trị: Lợi thủy trừ thấp, tả hỏa chỉ di, bổ, kích thích nhuận tràng, lợi sữa, long đờm, chống nôn, thanh thấp nhiệt ở đại tràng và can, ích khí, dưỡng ngũ tạng [4], [13].

- Liều dùng: 4 – 12 g/ngày [13].

9

- Kiêng kị: Thận hỏa hư, tiểu tiện không cầm, tỳ hư không nên dùng, di tinh không dùng [4], [5].

1.2.6.6. Định tính, định lượng: - Định tính bằng SKLM: + DĐVN: So sánh với chất chuẩn 23-acetat alisol B hoặc dược liệu chuẩn Trạch tả [4]. + DĐTQ: So sánh với chất chuẩn 23-acetat alisol B [17].

- Định lượng: Định lượng 23-acetat alisol B bằng phương pháp HPLC. + DĐVN: Dược liệu phải chứa không dưới 0,050 % 23-acetat alisol B (C32H50O5), tính theo dược liệu khô kiệt [4]. + DĐTQ: Dược liệu phải chứa không dưới 0,04 % 23-acetat alisol B (C32H50O5), tính theo dược liệu khô kiệt [17].

1.2.7. Câu kỷ tử (Fructus Lycii) 1.2.7.1. Tên khoa học: Fructus Lycii [4].

1.2.7.2. Bộ phận dùng: Quả chín phơi hay sấy khô của cây Câu kỷ (Lycium barbarum L.), họ Cà (Solanaceae) [4].

1.2.7.3. Thành phần hóa học: - Trong rễ có lyciumanid, sugiol, acid malissic. Trong quả có acid ascorbic, acid nicotianic. Cành lá chứa protein 3,5 %, lipid 0,72 %, glucid 2,25 %, tro 1,37 %, rất giàu vitamin A [6].

- Lysin, cholin, chất béo, protein, acid cyanhydric. Acid nicotic, vitamin C, sắt, calci, amon sulfat [5], [10], betain [4], [51], [52], atropin [10], zeaxanthin [15], [46].

- Quả câu kỷ chứa tinh dầu, 36 thành phần trung tính đã được phân dạng bằng sắc ký khí liên hợp phối phổ [15].

- Các acid amin: acid aspartic, prolin, glutamic, arginin, serin, lutein [15].

1.2.7.4. Tác dụng sinh học: - Tác dụng hạ đường huyết [13], [15], tăng cường miễn dịch [15].

- Hạ cholesterol, bảo vệ gan, làm chậm sự suy lão [15], chống oxy hóa [45], [50].

- Tác dụng trên hệ thống máu: tăng bạch cầu trên chuột nhắt trắng, ngăn ngừa hiện tượng giảm bạch cầu do cyclophosphamide gây nên trong điều trị ung thư thực nghiệm trên chuột cống trắng [15].

- Lutein và zeaxanthin có thể bảo vệ các tế bào sắc tố võng mạc biểu mô ARPE-19 được điều trị bằng hydrogen peroxide (H2O2) trong ống nghiệm [46].

10

1.2.7.5. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền: - Tính vị, quy kinh: Vị cam, tính bình [4], quy kinh phế, can, thận [4], tỳ [13].

- Công năng, chủ trị: Bổ can thận dưỡng huyết sáng mắt, bổ phế âm, ích khí huyết, có tác dụng làm hạ đường huyết [4], [13].

- Liều dùng: 8 – 16 g/ngày [13].

- Kiêng kị: Tỳ vị hư yếu, đại tiện sống phân hoặc phân lỏng không nên dùng [4], [13].

1.2.7.6. Định tính, định lượng: - Định tính bằng SKLM: + DĐVN, DĐTQ: So sánh với dược liệu chuẩn Câu kỷ tử [4], [17].

- Định lượng: + DĐVN, DĐTQ: chưa có chỉ tiêu định lượng [4], [17].

1.2.8. Cúc hoa vàng (Flos Chrysanthemi indici) 1.2.8.1. Tên khoa học: Flos Chrysanthemi indici [4].

1.2.8.2. Bộ phận dùng: Cụm hoa (quen gọi là hoa) đã chế biến hay phơi hay sấy khô của cây Cúc hoa vàng (Chrysanthemum indicum L.), họ Cúc (Asteraceae) [4], [13].

1.2.8.3. Thành phần hóa học: - Chrysol, chrysantheone, yejuhualactone, artoglasin A, acaciin, linarin, luteolin (glycoside), hydrocarbon, chrysanthemin, carotenoid (chrysanthemoxanthin) [5], [6], [10], [15].

- Tinh dầu trong đó có α-pinen, β-pinen, sabinen, myrcen, α-terpinen, p.cymen, cineol, α-thuyon, chrysanthenon, borneol, linalyl acetat, bornyl acetat, β-farnesen, germacrene D,

α-selinene,

γ-cadinene,

nerolidol,

caryphyllen

oxyd,

muurolol,

cadinol,

chrysanthetriol [5], [6], [10], [15].

- Sesquiterpen: angeloyl cumambrin B, arteglasin A, angeloylajadin, yejuhua lacton, handelin, chrysetunon, tuncfulin, cumambrin A [15], [20].

- Flavonoid: luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside, acacetin-7-O-β-D-galactopyranosid, chrysanthemin, acaciin [15].

- Luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside [15], [36], [41], linarin, apigenin-7-O-glycoside, quercetin và acacetin, luteolin, apigenin [36], [39], [41].

- Acid amin: adenin, cholin, stachydrin và các thành phần khác gồm: indicumenon, βsitosterol, α-amyrin, β-amyrin, friedelin, sesamin, vitamin A [5], [10], [15].

11

- polysaccharide [19], luteolin-7-O-(6’’-O-acetyl)-beta-D-glucopyranoside, diosmetin, diosmetin-7-O-beta-D-glucopyranoside, eupatilin [41].

1.2.8.4. Tác dụng sinh học: - Liều cao có tác dụng hạ nhiệt, hạ huyết áp [13], [15] - Tác dụng kháng khuẩn: ức chế nhiều loại vi khuẩn như tụ cầu, liên cầu khuẩn, lỵ trực khuẩn, trực khuẩn đại tràng, bạch hầu và virus cúm, Bacilus mycoides và Escherichia coli [13], [15].

- Chống viêm thực nghiệm trên chuột cống trắng [15].

- Bảo vệ gan [28], chống loãng xương [34].

1.2.8.5. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền: - Tính vị, quy kinh: Vị ngọt hơi đắng, tính mát [4], quy kinh phế, thận, can [4], tâm, đởm, vị, tỳ, đại tràng, tiểu tràng [13].

- Công năng, chủ trị: Giải cảm nhiệt, thanh can sáng mắt, bình can hạ huyết áp, giải độc chữa mụn nhọt, đinh độc [4], [13].

- Liều dùng: 4 – 24 g/ ngày [13].

- Kiêng kị: Tỳ vị hư hàn ỉa chảy, đau đầu do phong hàn không nên dùng [4], [5].

1.2.8.6. Định tính, định lượng: - Định tính bằng SKLM: + DĐVN: So sánh với dược liệu chuẩn Cúc hoa vàng [4]. + DĐTQ: So sánh với chất chuẩn buddleoside [17].

- Định lượng: + DĐVN: chưa có chỉ tiêu định lượng [4]. + DĐTQ: Định lượng buddleoside bằng phương pháp HPLC. Dược liệu phải chứa không dưới 0,80 % buddleoside (C28H32O14), tính theo dược liệu khô kiệt [17].

1.3. Các yêu cầu chung của thuốc cốm -

Tính chất: Thuốc cốm phải khô, đồng đều về kích thước hạt, không có hiện tượng hút ẩm, không bị mềm và biến màu.

-

Độ ẩm: Xác định nước trong các thuốc cốm nói chung theo phương pháp. Xác định mất khối lượng do làm khô (Phụ lục 9.6 DĐVN V tập 2), trong các thuốc cốm chứa tinh dầu theo phương pháp cất với dung môi (Phụ lục 12.13 DĐVN V tập 2). Các thuốc cốm có độ ẩm không quá 5,0 %, trừ các chỉ dẫn khác.

12

-

Ä?áť™ Ä‘áť“ng Ä‘áť u kháť‘i lưᝣng: Thuáť‘c cáť‘m khĂ´ng quy Ä‘áť‹nh tháť­ Ä‘áť™ Ä‘áť“ng Ä‘áť u váť hĂ m lưᝣng thĂŹ phải tháť­ Ä‘áť™ Ä‘áť“ng Ä‘áť u kháť‘i lưᝣng (Ph᝼ l᝼c 11.3 DÄ?VN V táş­p 2).

-

Ä?áť™ Ä‘áť“ng Ä‘áť u hĂ m lưᝣng: Trᝍ khi cĂł chᝉ dẍn khĂĄc, phĂŠp tháť­ nĂ y ĂĄp d᝼ng cho cĂĄc thuáť‘c cáť‘m Ä‘oĚ ng goĚ i máť™t liáť u, cĂł chᝊa máť™t hoạc nhiáť u dưᝣc chẼt, phải tháť­ Ä‘áť“ng Ä‘áť u hĂ m lưᝣng váť›i cĂĄc dưᝣc chẼt coĚ hĂ m lưᝣng dĆ°áť›i 2 mg hoạc dĆ°áť›i 2 % (kl/kl) so váť›i kháť‘i lưᝣng cáť‘m trong 1 liáť u ( Ph᝼ l᝼c 11.2 DÄ?VN V táş­p 2).

-

Ä?áť™ rĂŁ: Cho máť™t lưᝣng cáť‘m Ä‘oĚ ng goĚ i trong máť™t Ä‘ĆĄn váť‹ phân liáť u vĂ o cáť‘c chᝊa 200 ml nĆ°áť›c áť&#x; 15 oC Ä‘áşżn 25 oC, phải cĂł nhiáť u báť?t khĂ­ bay ra, cáť‘m đưᝣc coi lĂ rĂŁ háşżt náşżu hòa tan hoạc phân tĂĄn háşżt trong nĆ°áť›c. Tháť­ váť›i 6 liáť u, cháşż phẊm đất yĂŞu cầu phĂŠp tháť­ náşżu máť—i liáť u rĂŁ trong vòng 5 phĂşt, trᝍ khi cĂł cĂĄc chᝉ dẍn khĂĄc trong chuyĂŞn luáş­n riĂŞng.

-

Ä?áť‹nh tĂ­nh, Ä‘áť‹nh lưᝣng vĂ cĂĄc yĂŞu cầu káťš thuáş­t khĂĄc: Theo chuyĂŞn luáş­n riĂŞng [4].

1.4. Táť•ng quan váť SKLM hiᝇu năng cao vĂ sắc kĂ˝ láť?ng hiᝇu năng cao 1.4.1. Sắc kĂ˝ láť›p máť?ng hiᝇu năng cao (HPTLC) 1.4.1.1. CĆĄ sáť&#x; lĂ˝ thuyáşżt cᝧa cᝧa phĆ°ĆĄng phĂĄp sắc kĂ˝ láť›p máť?ng (TLC) -

Sắc kĂ˝ láť›p máť?ng (TLC) lĂ máť™t káťš thuáş­t tĂĄch cĂĄc chẼt đưᝣc tiáşżn hĂ nh khi cho pha Ä‘áť™ng di chuyáťƒn qua pha tÄŠnh trĂŞn Ä‘oĚ Ä‘ĂŁ chẼm háť—n hᝣp cĂĄc chẼt cần tĂĄch. Pha tÄŠnh lĂ chẼt hẼp ph᝼ đưᝣc cháť?n phĂš hᝣp theo tᝍng yĂŞu cầu phân tĂ­ch, đưᝣc trải thĂ nh láť›p máť?ng Ä‘áť“ng nhẼt và đưᝣc cáť‘ Ä‘áť‹nh trĂŞn cĂĄc phiáşżn kĂ­nh hoạc phiáşżn kim loấi.

Pha Ä‘áť™ng lĂ máť™t hᝇ dung mĂ´i Ä‘ĆĄn hoạc Ä‘a thĂ nh phần đưᝣc tráť™n váť›i nhau váť›i tᝡ lᝇ phĂš hᝣp. Trong quĂĄ trĂŹnh di chuyáťƒn qua láť›p hẼp ph᝼, cĂĄc cẼu táť­ trong háť—n hᝣp mẍu tháť­ đưᝣc di chuyáťƒn trĂŞn láť›p máť?ng, theo hĆ°áť›ng pha Ä‘áť™ng, váť›i nhᝯng táť‘c Ä‘áť™ khĂĄc nhau. Káşżt quả thu đưᝣc lĂ sắc kyĚ Ä‘áť“ trĂŞn láť›p máť?ng. CĆĄ cháşż cᝧa sáťą tĂĄch cĂł tháťƒ lĂ cĆĄ cháşż hẼp ph᝼, phân báť‘, trao Ä‘áť•i ion, sĂ ng láť?c phân táť­ hay sáťą pháť‘i hᝣp Ä‘áť“ng tháť?i cᝧa nhiáť u cĆĄ cháşż tĂšy thuáť™c vĂ o tĂ­nh chẼt cᝧa chẼt lĂ m pha tÄŠnh vĂ dung mĂ´i lĂ m pha Ä‘áť™ng.

-

Ä?ấi lưᝣng đạc trĆ°ng cho mᝊc Ä‘áť™ di chuyáťƒn cᝧa chẼt phân tĂ­ch lĂ hᝇ sáť‘ di chuyáťƒn Rf đưᝣc tĂ­nh báşąng tᝡ lᝇ giᝯa khoảng dáť‹ch chuyáťƒn cᝧa chẼt tháť­ vĂ khoảng dáť‹ch chuyáťƒn cᝧa dung mĂ´i: Rf =

đ?‘Ž đ?‘?

Trong Ä‘oĚ : a lĂ khoảng dáť‹ch chuyáťƒn cᝧa chẼt phân tĂ­ch. b lĂ khoảng dáť‹ch chuyáťƒn cᝧa dung mĂ´i tĂ­nh tᝍ Ä‘iáťƒm chẼm mẍu.

13

1.4.1.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) -

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức tân tiến nhất của công cụ TLC. So với TLC, HPTLC cho ưu điểm trội hơn: cho vết sắc ký gọn hơn, khả năng tách tốt hơn. Đồng thời các bước của quá trình phân tích bao gồm phun mẫu, khai triển sắc ký, nhận diện vết được thực hiện bằng máy giúp cho các thông số được kiểm soát một cách chặt chẽ và làm giảm thiểu tối đa các sai số ngẫu nhiên gặp phải, nhất là ở khâu đưa mẫu lên bản mỏng làm cho kết quả có độ lặp lại và độ đúng cao hơn TLC. Trong quá trình khai triển, điều kiện về nhiệt độ và độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ và ghi lại đầy đủ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả ở các phòng thí nghiệm khác nhau [3], [9], [11].

1.4.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao -

HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý.

-

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được di chuyển qua bộ phận xử lý kết quả. Đường cong rửa giải sau một quá trình gọi là sắc ký đồ [2], [3], [7], [9].

14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 2.1.1. Cốm Cốm bài thuốc và cốm thành phần được cung cấp bởi Công ty cổ phần dược phẩm VCP (117 Trần Duy Hưng, Cầu Giấy, Hà Nội) (phụ lục 1).

Công thức cốm thuốc Kỷ cúc địa hoàng được trình bày ở Bảng 2.1.

Bảng 2.1. Công thức cốm thuốc Kỷ cúc địa hoàng.

STT

Tên vị thuốc

Khối lượng dược liệu/túi (g)

Khối lượng cốm/túi (g)

1

Thục địa

12

4,8

2

Hoài sơn

6

0,3

3

Sơn thù

6

0,6

4

Mẫu đơn bì

4,5

0,75

5

Bạch linh

4,5

0,45

6

Trạch tả

4,5

0,45

7

Câu kỷ tử

4,5

1,8

8

Cúc hoa vàng

4,5

0,9

Tổng

10,05

2.1.2. Dược liệu chuẩn Dược liệu chuẩn được mua tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (Sơn thù, Câu kỷ tử, Thục địa, Cúc hoa vàng, Bạch linh, Mẫu đơn bì) và Viện Dược liệu (Hoài sơn, Trạch tả) (phụ lục 1), có phiếu kiểm nghiệm của từng dược liệu.

2.1.3. Thiết bị, máy móc -

Bếp đun cách thủy Bath HH- S4 (Trung Quốc).

-

Tủ sấy Memmerk, Shellab (Đức).

-

Cân phân tích Sartorius – TE214S (Đức).

-

Cân kỹ thuật Precisa – XB320C (Thụy Sĩ).

-

Đèn tử ngoại Viber Lourmat (Pháp).

-

Máy siêu âm.

-

Hệ thống thiết bị sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Linomat 5 (Camag Switzeland).

14

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Shimadzu bao gồm: Bơm LC-30AD,

-

detector SPD-M20A DAD, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-30AC, bộ phận ổn định nhiệt CTO-10AS của Shimadzu.

Và các thiết bị, dụng cụ khác.

2.1.4. Hóa chất, chất chuẩn Chất chuẩn loganin. Độ tinh khiết 98 %, hãng sản xuất: weikeqi – biotech. Số lô:

-

wkq17112205 được cung cấp bởi Công ty cổ phần dược phẩm VCP (117 Trần Duy Hưng, Cầu Giấy, Hà Nội).

-

Bản sắc ký lớp mỏng Silica gel 60F254 của Merck.

-

Hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích, được mua tại Công ty TNHH Sela, 48 dốc Thọ Lão, phường Đống Mác, quận Hai Bà Trưng, Hà Nội: Ethanol tuyệt đối, n-hexan, ethyl acetat, acid formic, methanol (Merck), acetonitrile (Merck), cloroform…

2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Nghiên cứu định tính một số thành phần hóa học của cốm bài thuốc và các vị thuốc -

Định tính các nhóm chất chính trong cốm bài thuốc và cốm thành phần bằng phản ứng hóa học.

-

Định tính bằng sắc ký lớp mỏng so sánh giữa cốm bài thuốc, dược liệu chuẩn và chất chuẩn loganin.

2.2.2. Định lượng loganin trong cốm bài thuốc bằng HPLC 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Định tính một số thành phần hóa học của cốm bài thuốc và các vị thuốc 2.3.1.1. Định tính một số nhóm chất chính trong mẫu nghiên cứu bằng phản ứng hóa học Định tính một số nhóm chất chính: flavonoid, saponin, glycoside tim, tanin, alkaloid, polysaccharide, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, sterol bằng phản ứng hóa học với thuốc thử chung và thuốc thử đặc hiệu của từng nhóm [12], [14]. (phụ lục 4).

2.3.1.2. Định tính so sánh cốm bài thuốc, dược liệu chuẩn và chất chuẩn bằng sắc ký lớp mỏng • Mẫu nghiên cứu: Cốm bài thuốc, dược liệu chuẩn (Thục địa, Hoài sơn, Sơn thù, Mẫu đơn bì, Câu kỷ tử, Cúc hoa vàng, Bạch linh, Trạch tả), chất chuẩn loganin.

15

• Chiết xuẼt: Cᝑm bà i thuᝑc, cåc dưᝣc liᝇu chuẊn (đã xay thô) bẹng dung môi thích hᝣp .

Tiáşżn hĂ nh chẼm sắc kyĚ Ä‘áťƒ xĂĄc Ä‘áť‹nh cĂĄc váşżt vĂ Rf so sĂĄnh cáť‘m bĂ i thuáť‘c váť›i chẼt chuẊn vĂ cĂĄc dưᝣc liᝇu chuẊn [4], [12], [17].

2.3.2. Ä?áť‹nh lưᝣng loganin trong cáť‘m bĂ i thuáť‘c báşąng HPLC Tham khảo tĂ i liᝇu tham khảo, láťąa cháť?n quy trĂŹnh xáť­ lĂ˝ mẍu vĂ Ä‘iáť u kiᝇn sắc kĂ˝. Tiáşżn hĂ nh Ä‘áť‹nh lưᝣng loganin dáťąa trĂŞn cĂĄc thĂ´ng sáť‘ Ä‘ĂŁ nháş­n đưᝣc [4], [17].

-

Hà m lưᝣng % loganin tính theo cᝑm khô kiᝇt theo công thᝊc: � (%) =

đ??ś Ă— 25 Ă— 100 đ?‘€ Ă— (100 − Ă‚)

Ă— 100

Trong Ä‘oĚ : C: náť“ng Ä‘áť™ mẍu tháť­ tĂ­nh theo phĆ°ĆĄng trĂŹnh háť“i quy tuyáşżn tĂ­nh (mg/ml) M: kháť‘i lưᝣng mẍu cáť‘m Ä‘em phân tĂ­ch (mg) Ă‚: Ä‘áť™ Ẋm cᝧa cáť‘m.

16

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Định tính một số thành phần hóa học của cốm bài thuốc và các vị thuốc 3.1.1. Định tính một số nhóm chất chính trong mẫu nghiên cứu bằng phản ứng hóa học -

Mẫu nghiên cứu: Cốm bài thuốc và cốm thành phần.

-

Tiến hành: Theo mục 2.3.1.1.

-

Kết quả: Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học của cốm bài thuốc và cốm thành phần được trình bày ở Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả định tính thành phần hóa học trong cốm bài thuốc và cốm thành phần.

TT

1

2

Kết quả

Nhóm

Phản ứng

chất

định tính

TD

ST

HS

ĐB

BL

TrT

CH

CKT

Cyanidin

-

+

-

-

-

+

++

-

++

Kiềm

-

++

-

-

-

+

++

-

++

-

++

-

-

-

+++

+++

Flavonoid

Saponin

FeCl3

+

-

Cốm BT

+++

Diazo

-

-

-

-

-

-

++

-

+

Tạo bọt

-

+

++

++

-

-

-

-

++

-

+

+

+

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Pư Legal

-

-

-

-

-

-

-

-

Pư Baljet

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

FeCl3

-

++

-

-

-

-

-

-

+

Chì acetat

-

+

-

-

-

-

-

-

+

Gelatin

-

+

-

-

-

-

-

-

+

TT Mayer

-

-

-

++

-

-

-

+

+

Pư Salkowski Pư Lieberman – Burchardat

3

Glycoside tim

Pư Keller – Kiliani

4

5

Tanin

Alkalo-id

17

TT

Nhóm

Phản ứng

chất

định tính TT Bouchar-dat

Kết quả Cốm

TD

ST

HS

ĐB

BL

TrT

CH

CKT

-

-

-

++

-

-

-

+

++

-

-

-

+

-

-

-

++

+

-

+

-

-

+

+

++

-

+

-

+

+

-

-

-

++

+

+

-

+

-

+

-

-

++

+

++

+

-

++

-

+

-

-

-

+

-

+

++

+

-

+

-

++

++

BT

TT Dragenndorff Polysac-

6

charide

7

Acid

TT

amin

Ninhydrin

Acid hữu

8

cơ

9

TT Lugol

TT Na2CO3

Đường

TT Fehling

khử

A và B Pư

10

Sterol

Liebermann – Burchard

Ghi chú (-): Phản ứng âm tính

(+): Phản ứng dương tính

(++): Phản ứng dương tính rõ

(+++): Phản ứng dương tính rất rõ

Nhận xét: Kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy: -

Cốm bài thuốc có flavonoid, saponin, tanin, alkaloid, polysaccharide, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, sterol.

-

Cốm TD có đường khử.

-

Cốm ST có saponin, flavonoid, tanin, acid hữu cơ, acid amin, polysaccharide, sterol.

-

Cốm HS có saponin, đường khử, acid amin, sterol.

-

Cốm DB có saponin, alkaloid, acid hữu cơ, sterol.

-

Cốm BL có đường khử, polysaccharide.

-

Cốm TrT có flavonoid, polysaccharide, sterol.

-

Cốm CH có flavonoid, acid hữu cơ, acid amin, polysaccharide.

18

-

Cốm CKT có alkaloid, acid hữu cơ, acid amin, sterol.

3.1.2. Định tính so sánh cốm bài thuốc, dược liệu chuẩn và chất chuẩn bằng sắc ký lớp mỏng ✓ Mẫu nghiên cứu: - Mẫu dịch chiết methanol cốm bài thuốc: Cân 2g cốm bài thuốc vào bình nón riêng biệt, thêm 20 ml methanol, lắc siêu âm 30 phút ở 40 oC, lọc qua giấy lọc được thấm methanol. Cô dịch lọc cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml methanol, lọc qua giấy lọc làm dung dịch chấm sắc ký.

-

Mẫu dịch chiết cloroform cốm bài thuốc: Cân 2g cốm bài thuốc vào bình nón riêng biệt, thêm 10 ml hỗn hợp CHCl3 – MeOH (4:1), đun sôi dưới sinh hàn hồi lưu khoảng 10 phút. Để nguội, lọc, cô dịch lọc còn 1ml được dung dịch chấm sắc ký.

-

Mẫu DL chuẩn: Thục địa, Hoài sơn, Sơn thù, Mẫu đơn bì, Câu kỷ tử, Trạch tả, Cúc hoa vàng, Bạch linh. Các dịch chấm sắc ký được chuẩn bị theo từng dược liệu chuẩn mỗi loại rồi được triển khai sắc ký theo điều kiện chung như sau: Điều kiện chung:

✓ Điều kiện sắc ký: -

Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel 60F254, hoạt hóa ở 110 oC trong 60 phút.

-

Pha động: Khảo sát trên các hệ dung môi khác nhau tùy từng dược liệu mỗi loại.

-

Phun mẫu: Thiết bị Linomat 5 (Camag), tốc độ phun 150nl/s.

-

Triển khai: + Dùng máy triển khai sắc ký tự động ADC2. + Kiểm soát độ ẩm: dung dịch KSCN bão hòa trong 10 phút. + Bão hòa bình triển khai 20 x 10 trong 20 phút (giấy lọc) bằng 25 ml dung môi pha động. + Thể tích dung môi khai triển: 10 ml. + Khoảng cách triển khai là 85 mm kể từ đáy bản mỏng. Sấy khô bản mỏng trong 5 phút.

✓ Phát hiện: Soi UV ở bước sóng 254 nm, 366 nm hoặc thuốc thử hiện màu đặc trưng tùy loại dược liệu. ✓ Chụp ảnh sắc ký đồ: Buồng chụp Camag. ✓ Xử lý kết quả : Phần mềm Wincats, Videoscan.

19

3.1.2.1. Định tính so sánh mẫu dịch chiết methanol cốm bài thuốc và dược liệu chuẩn Thục địa Mẫu nghiên cứu: Thục địa chuẩn

1g

Dịch chiết methanol cốm bài thuốc ✓ Chiết mẫu: Cho Thục địa chuẩn vào bình nón riêng biệt, thêm 20 ml methanol, lắc siêu âm 30 phút ở 40 oC, lọc qua giấy lọc được thấm methanol. Cô dịch lọc cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml methanol, lọc qua giấy lọc làm dung dịch chấm sắc ký. ✓ Pha động: Khảo sát trên các hệ dung môi sau: 1. Ethyl acetat – methanol – acid formic (16:0,5:2).

2. CHCl3 – methanol – NH4OH (50:9:1).

3. Toluen – ethyl acetat – acid acetic (12:4:1).

4. CHCl3 – ethyl acetat (9:1). ✓ Thể tích chấm mẫu: o Cốm bài thuốc : 5 μl. o TD chuẩn

: 15 μl.

Tiến hành: Chấm các mẫu trên băng dài 6 mm, cách cạnh dưới bản mỏng 10 mm, cách cạnh bên 15 mm. Triển khai theo điều kiện chung.

Kết quả: Qua khảo sát nhận thấy, hệ dung môi số 3: Toluen – ethyl acetat – acid acetic (12:4:1) cho kết quả tách vết tốt nhất ở bước sóng 254 nm. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.2 và Hình 3.1.

Nhận xét: Kết quả ở Bảng 3.2 và Hình 3.1 cho thấy: Trên sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 254 nm, các vết tách tốt và có vết tương đương với nhau. Trong đó: ✓ Cốm bài thuốc có 5 vết, Thục địa chuẩn có 9 vết. ✓ Cốm bài thuốc và Thục địa chuẩn có 3 vết tương đương với nhau (Rf = 0,19, Rf = 0,29, Rf = 0,64). ✓ Thục địa chuẩn có 6 vết khác với cốm bài thuốc (Rf = 0,11, Rf = 0,33, Rf = 0,34, Rf = 0,51, Rf = 0,55, Rf = 0,78). ✓ Cốm bài thuốc có 2 vết khác với Thục địa chuẩn (Rf = 0,32, Rf = 0,41).

20

Bảng 3.2. Kết quả SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và TD chuẩn ở bước sóng 254 nm.

Mẫu nghiên cứu Vết

Rf

Màu

Cốm

TD

sắc

bài

chuẩn

thuốc 1

0,11

Đen

2

0,19

Đen

+++

++

3

0,29

Đen

+

+

4

0,32

Đen

+++

5

0,33

Đen

++

6

0,34

Đen

+

7

0,41

Đen

8

0,51

Đen

+

9

0,55

Đen

+

10

0,64

Đen

11

0,78

Đen

++

+

+

+ +

Ghi chú: (+): Có vết; (++): Vết đậm; (+++): Vết rất đậm

Hình 3.1. Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và TD chuẩn ở bước sóng 254 nm.

3.1.2.2. Định tính so sánh mẫu dịch chiết methanol cốm bài thuốc và dược liệu chuẩn Hoài sơn Mẫu nghiên cứu: Hoài sơn chuẩn

1g

Dịch chiết cloroform cốm bài thuốc ✓ Chiết mẫu: Cho Hoài sơn chuẩn vào bình nón riêng biệt, thêm 10 ml hỗn hợp CHCl3 methanol (4:1), đun sôi dưới sinh hàn hồi lưu khoảng 10 phút. Để nguội, lọc, cô dịch lọc còn 1ml được dung dịch chấm sắc ký. ✓ Pha động: Khảo sát trên các hệ dung môi sau: 1. CHCl3 – methanol (19:1).

21

2. Ethyl acetat – methanol – NH3 (9:1:0,5).

3. Toluen – ethyl acetat – acid formic (5,5:4:1).

4. CHCl3 – aceton (95:5). ✓ Thể tích chấm mẫu: o Cốm bài thuốc : 15 μl. o HS chuẩn

: 30 μl.

Tiến hành: Chấm các mẫu trên băng dài 6 mm, cách cạnh dưới bản mỏng 10 mm, cách cạnh bên 15 mm. Triển khai theo điều kiện chung.

Kết quả: Qua khảo sát nhận thấy, hệ dung môi số 3: Toluen – ethyl acetat – acid formic (5,5:4:1) cho kết quả tách vết tốt nhất ở bước sóng 254 nm. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.3 và Hình 3.2.

Bảng 3.3. Kết quả SKLM định tính dịch chiết cloroform từ cốm bài thuốc và HS chuẩn ở bước sóng 254 nm.

Mẫu nghiên cứu Vết

Rf

Màu

Cốm

HS

sắc

bài

chuẩn

thuốc 1

0,08

Đen

+

2

0,11

Đen

+

3

0,25

Đen

++

4

0,32

Đen

+++

5

0,38

Đen

++

6

0,40

Đen

7

0,44

Đen

8

0,49

Đen

+

9

0,56

Đen

+

10

0,62

Đen

++

11

0,69

Đen

+

+ +

+++

++

+

+

Ghi chú: (+): Có vết; (++): Vết đậm; (+++): Vết rất đậm

22

Hình 3.2. Sắc ký đồ định tính dịch chiết cloroform từ cốm bài thuốc và HS chuẩn ở bước sóng 254 nm.

Nhận xét: Kết quả ở Bảng 3.3 và Hình 3.2 cho thấy: Trên sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 254 nm, các vết tách tốt và có vết tương đương với nhau. Trong đó: ✓ Cốm bài thuốc có 7 vết, Hoài sơn chuẩn có 8 vết. ✓ Cốm bài thuốc và Hoài sơn chuẩn có 4 vết tương đương với nhau (Rf = 0,25, Rf = 0,38, Rf = 0,44, Rf = 0,69). ✓ Hoài sơn chuẩn có 4 vết khác với cốm bài thuốc (Rf = 0,40, Rf = 0,49, Rf = 0,56, Rf = 0,62). ✓ Cốm bài thuốc có 3 vết khác với Hoài sơn chuẩn (Rf = 0,08, Rf = 0,11, Rf = 0,32).

3.1.2.3. Định tính so sánh mẫu dịch chiết methanol cốm bài thuốc và dược liệu chuẩn Mẫu đơn bì Mẫu nghiên cứu: Mẫu đơn bì chuẩn

1g

Dịch chiết methanol cốm bài thuốc ✓ Chiết mẫu: Cho Mẫu đơn bì chuẩn vào bình nón riêng biệt, thêm 20 ml methanol, lắc siêu âm 30 phút ở 40 oC, lọc qua giấy lọc được thấm methanol. Cô dịch lọc cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml methanol, lọc qua giấy lọc làm dung dịch chấm sắc ký. ✓ Pha động: Khảo sát trên các hệ dung môi sau: 1. Ethyl acetat – acid formic – nước (8:2:2).

2. Toluen – ethyl acetat – acid formic (5,5:4:1).

3. Cyclohexan – ethyl acetat (3:1).

4. Toluen – ethyl acetat – acid formic (20:5:0,5). ✓ Thể tích chấm mẫu: o Cốm bài thuốc: 5 μl. o DB chuẩn

: 5 μl.

Tiến hành: Chấm các mẫu trên băng dài 6 mm, cách cạnh dưới bản mỏng 10 mm, cách cạnh bên 15 mm. Triển khai theo điều kiện chung.

Kết quả: Qua khảo sát nhận thấy, hệ dung môi số 2: Toluen – ethyl acetat – acid formic (5,5:4:1) cho kết quả tách vết tốt nhất ở bước sóng 254 nm. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.4 và Hình 3.3.

23

Bảng 3.4. Kết quả SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và DB chuẩn ở bước sóng 254 nm.

Mẫu nghiên cứu Vết

Rf

Màu

Cốm

DB

sắc

bài

chuẩn

thuốc 1

0,08

Đen

++

++

2

0,14

Đen

+

++

3

0,24

Đen

+++

+++

4

0,31

Đen

+++

5

0,35

Đen

+

6

0,39

Đen

+

7

0,40

Đen

8

0,44

Đen

+++

+++

9

0,57

Đen

+

+

10

0,68

Đen

+

+++

+++

+

Ghi chú: (+): Có vết; (++): Vết đậm; (+++): Vết rất đậm

Hình 3.3. Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và DB chuẩn ở bước sóng 254 nm.

Nhận xét: Kết quả ở Bảng 3.4 và Hình 3.3 cho thấy: Trên sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 254 nm, các vết tách tốt và có vết tương đương với nhau. Trong đó: ✓

Cốm bài thuốc có 9 vết, Mẫu đơn bì chuẩn có 8 vết.

✓

Cốm bài thuốc và Mẫu đơn bì chuẩn có 7 vết tương đương với nhau (Rf =

0,08, Rf = 0,14, Rf = 0,24, Rf = 0,35, Rf = 0,44, Rf = 0,57, Rf = 0,68). ✓

Mẫu đơn bì chuẩn có 1 vết khác với cốm bài thuốc (Rf = 0,40).

✓

Cốm bài thuốc có 2 vết khác với Mẫu đơn bì chuẩn (Rf = 0,31, Rf = 0,39).

24

3.1.2.4. Định tính so sánh mẫu dịch chiết methanol cốm bài thuốc và dược liệu chuẩn Trạch tả Mẫu nghiên cứu: Trạch tả chuẩn

1g

Dịch chiết methanol cốm bài thuốc ✓ Chiết mẫu: Cho Trạch tả chuẩn vào bình nón riêng biệt, thêm 20 ml methanol, lắc siêu âm 30 phút ở 40 oC, lọc qua giấy lọc được thấm methanol. Cô dịch lọc cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml methanol, lọc qua giấy lọc làm dung dịch chấm sắc ký. ✓ Pha động: Khảo sát trên các hệ dung môi sau: 1. Ethyl acetat – acid formic – nước (7:1:1).

2. Toluen – ethyl acetat – acid formic (5,5:4:1).

3. Toluen – ethyl acetat – acid acetic (24:8:1).

4. Cyclohexan – ethyl acetat (1:1). ✓ Thể tích chấm mẫu: o Cốm bài thuốc : 5 μl. o TrT chuẩn

: 15 μl.

Tiến hành: Chấm các mẫu trên băng dài 6 mm, cách cạnh dưới bản mỏng 10 mm, cách cạnh bên 15 mm. Triển khai theo điều kiện chung.

Kết quả: Qua khảo sát nhận thấy, hệ dung môi số 2: Toluen – ethyl acetat – acid formic (5,5:4:1) cho kết quả tách vết tốt nhất ở bước sóng 254 nm. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.5 và Hình 3.4.

Nhận xét: Kết quả ở Bảng 3.5 và Hình 3.4 cho thấy: Trên sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 254 nm, các vết tách tốt và có vết tương đương với nhau. Trong đó: ✓ Cốm bài thuốc có 8 vết, Trạch tả chuẩn có 9 vết. ✓ Cốm bài thuốc và Trạch tả chuẩn có 4 vết tương đương với nhau (Rf = 0,31, Rf = 0,35, Rf = 0,43, Rf = 0,69). ✓ Trạch tả chuẩn có 5 vết khác với cốm bài thuốc (Rf = 0,10, Rf = 0,17, Rf = 0,28, Rf = 0,40, Rf = 0,51). ✓ Cốm bài thuốc có 4 vết khác với Trạch tả chuẩn (Rf = 0,08, Rf = 0,13, Rf = 0,23, Rf = 0,39 25

Bảng 3.5. Kết quả SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và TrT chuẩn ở bước sóng 254 nm.

Mẫu nghiên cứu Vết

Rf

Màu

Cốm

TrT

sắc

bài

chuẩn

thuốc 1

0,08

Đen

2

0,10

Đen

3

0,13

Đen

4

0,17

Đen

5

0,23

Đen

6

0,28

Đen

7

0,31

Đen

+++

+++

8

0,35

Đen

+

++

9

0,39

Đen

+

10

0,40

Đen

11

0,43

Đen

12

0,51

Đen

13

0,69

Đen

++ +++ + + +++ ++

+ +++

++ Hình 3.4. Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và TrT chuẩn ở bước sóng 254 nm.

+ +

+

Ghi chú: (+): Có vết; (++): Vết đậm; (+++): Vết rất đậm

3.1.2.5. Định tính so sánh mẫu dịch chiết methanol cốm bài thuốc và dược liệu chuẩn Câu kỷ tử Mẫu nghiên cứu: Câu kỷ tử

1g

Dịch chiết methanol cốm bài thuốc ✓ Chiết mẫu: Cho Câu kỷ tử chuẩn vào bình nón riêng biệt, thêm 20 ml methanol, lắc siêu âm 30 phút ở 40 oC, lọc qua giấy lọc được thấm methanol. Cô dịch lọc cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml methanol, lọc qua giấy lọc làm dung dịch chấm sắc ký. ✓ Pha động: Khảo sát trên các hệ dung môi sau: 26

1. Toluen – ethyl acetat – aceton – acid formic (5:2:2:1).

2. Toluen – ethyl acetat - acid formic (5,5:4:1).

3. Ethyl acetat – methanol – acid formic (16:0,5:2).

4. Cloroform - ethyl acetal - acid formic (2:3:1). ✓ Thể tích chấm mẫu: o Cốm bài thuốc : 5 μl. o CKT chuẩn

: 15 μl.

Tiến hành: Chấm các mẫu trên băng dài 6 mm, cách cạnh dưới bản mỏng 10 mm, cách cạnh bên 15 mm. Triển khai theo điều kiện chung.

Kết quả: Qua khảo sát nhận thấy, hệ dung môi số 2: Toluen – ethyl acetat – acid formic (5,5:4:1) cho kết quả tách vết tốt nhất ở bước sóng 254 nm. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.6 và Hình 3.5.

Bảng 3.6. Kết quả SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và CKT chuẩn ở bước sóng 254 nm.

Mẫu nghiên cứu Vết

Rf

Màu

Cốm

CKT

sắc

bài

chuẩn

thuốc 1

0,09

Đen

++

2

0,15

Đen

+

3

0,21

Đen

+

4

0,24

Đen

+

5

0,25

Đen

+++

6

0,31

Đen

+++

7

0,35

Đen

8

0,36

Đen

++

9

0,44

Đen

+++

++ ++

+++ Hình 3.5. Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và CKT chuẩn ở bước sóng 254 nm.

Ghi chú: (+): Có vết; (++): Vết đậm; (+++): Vết rất đậm

27

Nhận xét: Kết quả ở Bảng 3.6 và Hình 3.5 cho thấy: Trên sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 254 nm, các vết tách tốt và có vết tương đương với nhau. Trong đó: ✓ Cốm bài thuốc có 6 vết, Câu kỷ tử chuẩn có 5 vết. ✓ Cốm bài thuốc và Câu kỷ tử chuẩn có 2 vết tương đương với nhau (Rf = 0,31, Rf = 0,44). ✓ Câu kỷ tử chuẩn có 3 vết khác với cốm bài thuốc (Rf = 0,21, Rf = 0,24, Rf = 0,35). ✓ Cốm bài thuốc có 4 vết khác với Câu kỷ tử chuẩn (Rf = 0,09, Rf = 0,15, Rf = 0,25, Rf = 0,36).

3.1.2.6. Định tính so sánh mẫu dịch chiết methanol cốm bài thuốc và dược liệu chuẩn Bạch linh Mẫu nghiên cứu: Bạch linh chuẩn

1g

Dịch chiết methanol cốm bài thuốc ✓ Chiết mẫu: Cho Bạch linh chuẩn vào bình nón riêng biệt, thêm 20 ml methanol, lắc siêu âm 30 phút ở 40 oC, lọc qua giấy lọc được thấm methanol. Cô dịch lọc cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml methanol, lọc qua giấy lọc làm dung dịch chấm sắc ký. ✓ Pha động: Khảo sát trên các hệ dung môi sau: 1. Toluen – ethyl acetat – acid formic (20:5:0,5).

2. CHCl3 – methanol (9:1).

3. Toluen – ethyl acetat – acid formic (5,5:4:1). ✓ Thể tích chấm mẫu: o Cốm bài thuốc: 5 μl. o BL chuẩn

: 15 μl.

Tiến hành: Chấm các mẫu trên băng dài 6 mm, cách cạnh dưới bản mỏng 10 mm, cách cạnh bên 15 mm. Triển khai theo điều kiện chung.

Kết quả: Qua khảo sát nhận thấy, hệ dung môi số 3: Toluen – ethyl acetat – acid formic (5,5:4:1) cho kết quả tách vết tốt nhất ở bước sóng 254 nm. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.7 và Hình 3.6.

28

Bảng 3.7. Kết quả SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và BL chuẩn ở bước sóng 254 nm.

Mẫu nghiên cứu Vết

Rf

Màu

Cốm

BL

sắc

bài

chuẩn

thuốc 1

0,08

Đen

++

2

0,13

Đen

+

3

0,23

Đen

+++

4

0,31

Đen

+++

5

0,35

Đen

++

6

0,40

Đen

7

0,42

Đen

8

0,48

Đen

++

9

0,59

Đen

+

10

0,63

Đen

++

11

0,67

Đen

+ +

+++

+

Hình 3.6. Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và BL chuẩn ở bước sóng 254 nm.

+

Ghi chú: (+): Có vết; (++): Vết đậm; (+++): Vết rất đậm

Nhận xét: Kết quả ở Bảng 3.7 và Hình 3.6 cho thấy: Trên sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 254 nm, các vết tách tốt và có vết tương đương với nhau. Trong đó: ✓ Cốm bài thuốc có 7 vết, Bạch linh chuẩn có 6 vết. ✓ Cốm bài thuốc và Bạch linh chuẩn có 2 vết tương đương với nhau (Rf = 0,35, Rf = 0,42). ✓ Bạch linh chuẩn có 4 vết khác với cốm bài thuốc (Rf = 0,40, Rf = 0,48, Rf = 0,59, Rf = 0,63). ✓ Cốm bài thuốc có 5 vết khác với Bạch linh chuẩn (Rf = 0,08, Rf = 0,13, Rf = 0,23, Rf = 0,31, Rf = 0,67).

3.1.2.7. Định tính so sánh mẫu dịch chiết methanol cốm bài thuốc và dược liệu chuẩn Cúc hoa vàng 29

Mẫu nghiên cứu: Cúc hoa vàng chuẩn

1g

Dịch chiết methanol cốm bài thuốc ✓ Chiết mẫu: Cho Cúc hoa vàng chuẩn vào bình nón riêng biệt, thêm 20 ml methanol, lắc siêu âm 30 phút ở 40 oC, lọc qua giấy lọc được thấm methanol. Cô dịch lọc cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml methanol, lọc qua giấy lọc làm dung dịch chấm sắc ký. ✓ Pha động: Khảo sát trên các hệ dung môi sau: 1. Toluen – ethyl acetat (93:7).

2. Ethyl acetat – acid formic – nước (7:1:0,8).

3. CHCl3 – ethyl acetat – acid formic (9:3:0,5).

4. Ethyl acetat – acid formic – nước (8:1:1). ✓ Thể tích chấm mẫu: o Cốm bài thuốc: 5 μl. o CH chuẩn

: 5 μl.

Tiến hành: Chấm các mẫu trên băng dài 6 mm, cách cạnh dưới bản mỏng 10 mm, cách cạnh bên 15 mm. Triển khai theo điều kiện chung.

Kết quả: Qua khảo sát nhận thấy, hệ dung môi số 2: Ethyl acetat – acid formic nước (7:1:0,8) cho kết quả tách vết tốt nhất ở bước sóng 254 nm. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.8 và Hình 3.7.

Nhận xét: Kết quả ở Bảng 3.8 và Hình 3.7 cho thấy: Trên sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 254 nm, các vết tách tốt và có vết tương đương với nhau. Trong đó: ✓ Cốm bài thuốc có 12 vết, Cúc hoa vàng chuẩn có 10 vết. ✓ Cốm bài thuốc và Cúc hoa vàng chuẩn có 8 vết tương đương với nhau (Rf = 0,21, Rf = 0,29, Rf = 0,35, Rf = 0,42, Rf = 0,49, Rf = 0,62, Rf = 0,76, Rf = 0,87). ✓ Cúc hoa vàng chuẩn có 2 vết khác với cốm bài thuốc (Rf = 0,12, Rf = 0,74). ✓ Cốm bài thuốc có 4 vết khác với Cúc hoa vàng chuẩn (Rf = 0,26, Rf = 0,68, Rf = 0,80, Rf = 0,85).

30

Bảng 3.8. Kết quả SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và CH chuẩn ở bước sóng 254 nm.

Mẫu nghiên cứu Vết

Rf

Màu

Cốm

CH

sắc

bài

chuẩn

thuốc 1

0,12

Đen

2

0,21

Đen

+

3

0,26

Đen

+

4

0,29

Đen

++

+

5

0,35

Đen

++

++

6

0,42

Đen

++

+++

7

0,49

Đen

++

+

8

0,62

Đen

++

++

9

0,68

Đen

+

10

0,74

Đen

11

0,76

Đen

+

12

0,80

Đen

+

13

0,85

Đen

+

14

0,87

Đen

+

+ ++

++ +++

+++

Ghi chú: (+): Có vết; (++): Vết đậm; (+++): Vết rất đậm

Hình 3.7. Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc và CH chuẩn ở bước sóng 254 nm.

3.1.2.8. Định tính so sánh mẫu dịch chiết methanol cốm bài thuốc, dược liệu chuẩn Sơn thù và chất chuẩn loganin Mẫu nghiên cứu: Sơn thù chuẩn

1g

Chất chuẩn loganin

10 mg

Dịch chiết methanol cốm bài thuốc ✓ Chiết mẫu: - Cho Sơn thù chuẩn vào bình nón riêng biệt, thêm 20 ml methanol, lắc siêu âm 31

30 phút ở 40 oC, lọc qua giấy lọc được thấm methanol. Cô dịch lọc cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml methanol, lọc qua giấy lọc làm dung dịch chấm sắc ký.

- Hòa tan 10 mg chất chuẩn loganin trong 10ml methanol được dung dịch có nồng độ 1 mg/ml để chấm sắc ký. ✓ Pha động: Khảo sát trên các hệ dung môi sau: 1. Toluen – ethyl acetat – acid formic (5,25:4:1).

2. Ethyl acetat – acid formic – nước (7:1:0,8).

3. CHCl3 – ethyl acetat – acid formic (5:4:1).

4. Toluen - ethyl acetat - acid formic (20:4:0,5).

5. Toluen – ethyl acetat – acid acetic (24:8:1). ✓ Thể tích chấm mẫu: o Cốm bài thuốc: 5 μl. o ST chuẩn

: 5 μl.

o loganin

: 5 μl.

Tiến hành: Chấm các mẫu trên băng dài 6 mm, cách cạnh dưới bản mỏng 10 mm, cách cạnh bên 15 mm. Triển khai theo điều kiện chung.

Kết quả: Qua khảo sát nhận thấy, hệ dung môi số 2: Ethyl acetat – acid formic – nước (7:1:0,8) cho kết quả tách vết tốt nhất ở ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử.. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.9 và Hình 3.8.

Nhận xét: Kết quả ở Bảng 3.9 và Hình 3.8 cho thấy: Trên sắc kí đồ quan sát ở ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử, các vết tách tốt và có vết tương đương với nhau.

Trong đó: ✓ Cốm bài thuốc có 7 vết, Sơn thù chuẩn có 6 vết, loganin chuẩn có 1 vết. ✓ Cốm bài thuốc và Sơn thù chuẩn có 4 vết tương đương với nhau (Rf =0,25, Rf = 0,46, Rf = 0,59, Rf = 0,96). ✓ Sơn thù chuẩn có 2 vết khác với cốm bài thuốc (Rf = 0,66, Rf = 0,89). ✓ Cốm bài thuốc có 3 vết khác với Sơn thù chuẩn (Rf = 0,70, Rf = 0,80, Rf = 0,92). ✓ Cốm bài thuốc và Sơn thù chuẩn có 1 vết tương đương với loganin chuẩn (Rf = 0,46).

32

Bảng 3.9. Kết quả SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc, ST chuẩn và loganin ở ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử.

Mẫu nghiên cứu Vết

Rf

Màu

Cốm

ST

loganin

sắc

bài

chuẩn

chuẩn

thuốc 1

0,25

Nâu

+

+

2

0,46

Tím

++

+++

3

0,59

Tím

++

+

4

0,66

Tím

5

0.70

Tím

+

6

0,80

Tím

+

7

0,89

Tím

8

0,92

Tím

+

9

0,96

Tím

+

++

+

+

+

Hình 3.8. Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm bài thuốc, ST chuẩn và loganin ở ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử.

Ghi chú: (+): Có vết; (++): Vết đậm; (+++): Vết rất đậm

3.2. Xác định hàm ẩm cốm bài thuốc Kết quả xác định hàm ẩm của cốm bài thuốc được trình bày ở Bảng 3.10.

Bảng 3.10. Kết quả xác định hàm ẩm của cốm bài thuốc Hàm ẩm (%) Mẫu cốm BT

Hàm ẩm trung bình (%)

Lần 1

Lần 2

Lần 3

4,6

4,7

4,2

4,5

Hàm ẩm trung bình của cốm bài thuốc: 4,5 %.

Nhận xét: Theo quy định về thuốc cốm trong DĐVN V tập 2, các thuốc cốm có độ ẩm không quá 5,0 %, do đó hàm ẩm của cốm bài thuốc là đạt tiêu chuẩn.

33

3.3. Định lượng loganin trong cốm bài thuốc bằng HPLC 3.3.1. Xây dựng đường chuẩn Chuẩn bị mẫu chuẩn: Cân chính xác 10,59 mg chất chuẩn loganin (98 %) hòa tan với 10 ml MeOH 50 % trong bình định mức 10 ml thu được dung dịch có nồng độ 1,038 mg/ml, pha loãng mẫu thành dãy các nồng độ 0,0104; 0,0208; 0,0312; 0,0416; 0,0830; 0,1038 (mg/ml), lọc qua màng lọc 0,45 µm được dãy các dung dịch chuẩn rồi tiến hành chạy sắc ký. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn được trình bày ở Bảng 3.11. Đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính được thể hiện ở Hình 3.9.

Bảng 3.11. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính Nồng độ (mg/ml)

0,0104

0,0208

0,0312

0,0416

0,0830

0,1038

218156

445321

523457

751263

1423070

1783053

Spic (mAU.s)

Hình 3.9. Đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính của loganin Nhận xét: Với khoảng nồng độ của loganin từ 0,0104 mg/ml đến 0,1038 mg/ml có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic với phương trình: Y = 16580768,47 x + 53772,09 (R = 0,9987) Trong đó: Y: Diện tích pic loganin (mAU.s).

34

x: nồng độ loganin (mg/ml).

Nhận xét: Đường chuẩn được đánh giá thông qua hệ số tương quan R. Kết quả đánh giá đường chuẩn được trình bày trong bảng cho thấy hệ số tương quan của loganin là R = 0,9987 > 0,99 bởi vậy đường chuẩn được xây dựng đảm bảo độ tuyến tính để thực hiện phép phân tích định lượng loganin.

3.3.2. Định lượng loganin trong cốm bài thuốc -

Quy trình xử lý mẫu: ✓ Cốm bài thuốc: Cân chính xác khoảng 2 g cốm bài thuốc vào bình nón có nút mài, thêm chính xác 50ml methanol 70 %, đậy nút, cân. Chiết siêu âm trong 45 phút ở 40 oC, để nguội, cân lại, bổ sung lượng mất đi bằng methanol 70 %, lắc đều, lọc, cô tới cắn. Hòa tan cắn trong bình định mức 25 ml bằng methanol 70 % được dung dịch thử.

-

Điều kiện sắc ký: ✓ Pha động: Methanol – acetonitrile – acid phosphoric 0,1 % (5:9:86). ✓ Cột Agilent Eclipse XDB-C18 (150 × 4,6 mm; 5µm). ✓ Detector UV, bước sóng phát hiện: 236 nm. ✓ Tốc độ dòng: 1.0 ml/min. ✓ Nhiệt độ cột: 40 oC. ✓ Thể tích tiêm: 10 µl.

-

Kết quả: + Sắc ký đồ các mẫu chuẩn và thử được trình bày ở Hình 3.10.

Hình 3.10. Sắc ký đồ HPLC của mẫu chuẩn loganin và các mẫu thử cốm bài thuốc.

(1): dung dịch chuẩn loganin.

(2): dung dịch thử 1.

(3): dung dịch thử 2.

(4): dung dịch thử 3.

(5): dung dịch thử 4.

35

+ Hàm lượng loganin trong cốm bài thuốc được trình bày ở Bảng 3.12.

Bảng 3.12. Kết quả định lượng loganin trong cốm bài thuốc TT

Lượng cân (mg)

Diện tích pic (mAU.s)

Hàm lượng (%)

1

2121,8

578061

0,0390

2

2104,5

559288

0,0379

3

2097,4

556469

0,0378

4

2089,4

560845

0,0383 0,0383

X

Nhận xét: Hàm lượng loganin trung bình trong mẫu cốm bài thuốc là 0,0383 %.

36

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Định tính một số thành phần hóa học của cốm bài thuốc và các vị thuốc ➢ Định tính bằng phản ứng hóa học: - Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học cho thấy thành phần hóa học cơ bản trong cốm bài thuốc tương tự thành phần của các vị thuốc bao gồm: flavonoid, saponin, tanin, alkaloid, polysaccharide, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, sterol.

- Dựa vào kết quả định tính bằng phản ứng hóa học cho thấy, các nhóm chất flavonoid, acid hữu cơ, sterol là các nhóm hoạt chất chính và cho phản ứng rõ nhất. Do đó, chúng tôi đưa ra tiêu chuẩn định tính cốm bài thuốc Kỷ cúc địa hoàng như sau: + Định tính sự có mặt của nhóm acid hữu cơ bằng phản ứng với TT Na2CO3. + Định tính sự có mặt của nhóm flavonoid bằng phản ứng Cyanidin, phản ứng với dung dịch NaOH 10 %, phản ứng với dung dịch FeCl3 5 %. + Định tính sự có mặt của nhóm sterol bằng phản ứng Liebermann – Burchard. ➢ Định tính bằng sắc ký lớp mỏng: - Sắc ký lớp mỏng được coi là dấu vân tay hóa học của dược liệu. Để thẩm định dấu vân tay của các dược liệu trong cốm bài thuốc bằng sắc ký lớp mỏng, có 2 phương pháp chiết hoạt chất như sau: + Chiết chọn lọc theo từng nhóm chất: Phương pháp này loại được nhiều tạp chất và các nhóm chất khác, vì vậy sẽ cho kết quả chính xác hơn, tuy nhiên tốn dung môi và nhiều công đoạn phức tạp. + Chiết không chọn lọc: Dùng dung môi methanol để chiết toàn bộ các thành phần có cốm bài thuốc và dược liệu (methanol là dung môi có khả năng hòa tan rộng). Phương pháp này nhanh, tốn ít dung môi; tuy nhiên do chiết không chọn lọc nên có thể có nhiều tạp chất và khó đưa ra nhận định cụ thể về từng hoạt chất riêng biệt.

-

Trên sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 254 nm: Cốm bài thuốc có rất nhiều vết tương đương với dược liệu chuẩn, cụ thể: Với Thục địa chuẩn (dịch chiết methanol) có 3 vết, Hoài sơn chuẩn (dịch chiết chloroform) có 4 vết, Mẫu đơn bì chuẩn (dịch chiết methanol) có 7 vết, Trạch tả chuẩn (dịch chiết methanol) có 4

37

vết, Câu kỷ tử (dịch chiết methanol) có 2 vết, Bạch linh chuẩn (dịch chiết methanol) có 2 vết, Cúc hoa vàng chuẩn (dịch chiết methanol) có 8 vết.

Trên sắc ký đồ quan sát ở ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử: Cốm bài thuốc

-

và Sơn thù chuẩn (dịch chiết methanol) có 1 vết tương đương với loganin chuẩn, ngoài ra cốm bài thuốc có 3 vết khác tương đương với Sơn thù chuẩn.

Một số vết trong cốm bài thuốc có màu đậm hơn hoặc nhạt hơn so với các vết

-

tương ứng của dược liệu chuẩn có thể do các chất có sự biến đổi trong quá trình chiết xuất cốm, dược liệu hoặc thể tích phun mẫu. o Từ kết quả của phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng có thể kết luận sơ bộ cốm bài thuốc Kỷ cúc địa hoàng do công ty VCP sản xuất có thành phần hóa học giống với các vị thuốc của bài thuốc. o Qua quá trình nghiên cứu và triển khai sắc ký lớp mỏng để xác định dấu vân tay của các vị thuốc, chúng tôi nhận thấy rằng, để có kết quả tốt thì cần phải thực hiện các bước khảo sát về khối lượng mẫu nghiên cứu cần dùng, hệ dung môi khai triển, lượng mẫu chấm trên bản mỏng, và tính lặp lại của kết quả. Từ các kết quả trên, chúng tôi đề xuất một số chỉ tiêu trong tiêu chuẩn kỹ thuật của cốm bài thuốc được trình bày ở Bảng 4.1. o Kết quả phân tích SKLM với 2 loại cắn chiết bằng các dung môi khác nhau từ cốm bài thuốc, dược liệu chuẩn và chất chuẩn đối chiếu cho thấy, trên sắc ký đồ, cốm bài thuốc đều có các vết tương ứng với các vết của dược liệu chuẩn và chất chuẩn. Như vậy có thể sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để xác định dấu vân tay hóa học các vị thuốc trong cốm bài thuốc, nhằm góp phần xây dựng tiêu chuẩn cốm bài thuốc.

Bảng 4.1. Một số chỉ tiêu đề xuất trong tiêu chuẩn kỹ thuật của cốm bài thuốc Kỷ cúc địa hoàng Chỉ tiêu định tính

Yêu cầu

Acid hữu cơ

Pư với TT Na2CO3

+

Flavonoid

Pư Cyanidin

+

ứng

Pư với kiềm

+

hóa

Pư với FeCl3

+

Pư Liebermann – Burchard.

+

Phản

học

Sterol

38

Cốm - TD

Hệ dung môi Toluen – ethyl

Cốm bài thuốc và TD

acetat – acid acetic (12:4:1),

có 3 vết tương đương

quan sát ở bước sóng 254 nm Cốm – HS

Cốm bài thuốc và HS có 4 vết tương đương

Cốm - DB

Cốm - TrT Sắc ký

Cốm bài thuốc và DB Hệ dung môi Toluen – ethyl

có 7 vết tương đương

acetat – acid formic (5,5:4:1),

Cốm bài thuốc và TrT

quan sát ở bước sóng 254 nm

có 4 vết tương đương

Cốm – CKT

Cốm bài thuốc và CKT có 2 vết tương đương

lớp mỏng

Cốm – BL

Cốm bài thuốc và BL có 2 vết tương đương

Cốm - CH

Hệ dung môi Ethyl acetat – acid

Cốm bài thuốc và CH

formic – nước (7:1:0,8), quan sát

có 8 vết tương đương

ở bước sóng 254 nm Cốm – ST –

Hệ dung môi Ethyl acetat – acid

Cốm bài thuốc và ST

loganin

formic – nước (7:1:0,8), quan sát

có 4 vết tương đương

ở ánh sáng trắng sau khi phun

trong đó có 1 vết tương

thuốc thử

đương với loganin chuẩn.

4.2. Định lượng loganin trong cốm bài thuốc bằng HPLC - Trong phương thuốc Kỷ cúc địa hoàng, Thục địa là quân dược, chiếm khối lượng lớn nhất (24 g), Sơn thù đóng vai trò là vị thần, chiếm khối lượng lớn thứ 2 (12g). Theo Dược điển Việt Nam V tập 2 và Dược điển Trung Quốc, loganin là marker được lựa chọn để định lượng hàm lượng hoạt chất có trong Sơn thù và trong bài thuốc Kỷ cúc Địa hoàng. Do đó, chúng tôi lựa chọn loganin làm marker định lượng cho cốm bài thuốc Kỷ cúc địa hoàng là hợp lý.

- Từ các tài liệu tham khảo về định lượng loganin bằng HPLC, chúng tôi nhận thấy đa số đều các nghiên cứu đều sử dụng sắc ký pha đảo, cột C18. Đối với định lượng loganin trong dược liệu Sơn thù thì hệ dung môi pha động sử dụng là acetonitrile: nước (15:85), đối với định lượng loganin trong bài thuốc Kỷ cúc địa hoàng thì hệ dung môi pha động 39

sử dụng là methanol, acetonitrile và acid phosphoric 0.1 %. Do đó chúng tôi lựa chọn hệ dung môi gồm 3 thành phần trên làm hệ dung môi pha động khảo sát.

- Theo kết quả định lương loganin trong cốm bài thuốc: Hàm lượng loganin trung bình trong mẫu cốm bài thuốc là 0,0383 %.

- Trong khóa luận này, chúng tôi mới sơ bộ định lượng được hàm lượng loganin trên 4 mẫu cốm bài thuốc là 0,0383 %, với quy mô lớn hơn, đề tài có thể tiếp tục triển khai định lượng loganin trên cơ mẫu lớn hơn và xây dựng quy trình thẩm định phương pháp định lượng này.

40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ❖ KẾT LUẬN Xây dựng một số chỉ tiêu định tính ➢ Định tính một số thành phần hóa học: -

Định tính bằng phản ứng hóa học: Thành phần các nhóm chất trong cốm bài thuốc gồm có: flavonoid, saponin, tanin, alkaloid, polysaccharide, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, sterol.

-

Định tính bằng sắc ký lớp mỏng: + Hệ dung môi: Toluen – ethyl acetat – acid acetic (12:4:1): Cốm bài thuốc và Thục địa chuẩn có 3 vết có Rf và màu sắc tương đương. + Hệ dung môi: Toluen – ethyl acetat – acid formic (5,5:4:1): Cốm bài thuốc và Hoài sơn, Mẫu đơn bì, Câu kỷ tử, Trạch tả, Bạch linh chuẩn có các vết có Rf và màu sắc tương đương lần lượt là 4, 7, 2, 4, 2 vết. + Hệ dung môi: Ethyl acetat – acid formic – nước (7:1:0,8): Cốm bài thuốc và Cúc hoa chuẩn có 8 vết có Rf và màu sắc tương đương; Cốm bài thuốc, Sơn thù chuẩn và loganin có 1 vết có Rf và màu sắc tương đương.

Xây dựng chỉ tiêu định lượng loganin Hàm lượng loganin trung bình trong mẫu cốm bài thuốc Kỷ cúc địa hoàng là 0,0383 %. ❖ KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu:

➢ Hoàn thiện các tiêu chuẩn kiểm nghiệm cốm bài thuốc Kỷ cúc địa hoàng. ➢ Xây dựng phương pháp định lượng một số thành phần khác trong cốm bài thuốc. ➢ Nghiên cứu độ ổn định của cốm thuốc và bao bì của cốm thuốc Kỷ cúc địa hoàng để xác định hạn dùng và thời gian bảo quản.

41

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội (2011), Dược liệu học, tập 1, NXB Y Học, Hà Nội, tr. 118-119, 120-121.

2. Bộ môn Hoá phân tích - Độc chất (2011), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học Hà Nội, tr. 84-104.

3. Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất (2016), Hóa phân tích, tập II, NXB Y Học, Hà Nội, tr. 168-200, 205-212.

4. Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam, lần xuất bản thứ năm, tập 2, NXB Y học, Hà Nội, tr. 1105-1106, 1127-1128, 1130-1131, 1248, 1292-1293, 1318-1319, 1345-1346, 1355-1356.

5. Tào Duy Cần (2007), Cây thuốc vị thuốc Bài thuốc Việt Nam, NXB Hà Nội, tr. 57, 64, 95-96, 143,174, 191, 217, 224-225.

6. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr. 200-201, 328-329, 340-341, 559, 733, 901-902.

7. Nguyễn Thị Thùy Dương (2009), Nghiên cứu định tính, định lượng Linarin trong Cúc hoa vàng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ khóa 2004-2009, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr. 9-13.

8. Trình Nhu Hải - Lý Gia Canh (2004), Trung Quốc danh phương toàn tập, NXB Y học, Hà Nội, tr. 323.

9. Trần Lệ Hoa (2018), Xây dựng phương pháp xác định một số dược chất nhóm hạ huyết áp trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC và HPLC, Luận văn Thạc sỹ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr. 14-18.

10. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr.

217, 222-223, 604, 620-621, 837-841, 848-850, 850-851, 911-912.

11. Tống Xuân Quang (2015), Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng Rutin trong phát triển của hoa hòe và nụ hoa hòe chế biến theo y học cổ truyền bằng phương pháp HPTLC, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ khóa 65, Trường Đại học Dược Hà Nôi, Hà Nội, tr. 1117.

12. Đỗ Quyên (2015), Chiết xuất và phân lập hợp chất thiên nhiên, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam, tr. 18-26, 70-79.

13. Phạm Xuân Sinh, Phùng Hòa Bình (2014), Dược học cổ truyền, NXB Y học, Hà Nội, tr. 136-137, 180-181, 227, 248-249, 267-268, 277, 304-305.

14. Nguyễn Viết Thân (2010), Thực tập Dược liệu, Trung tâm thông tin - Thư viện Đại học Dược Hà Nội, tr. 61-76.

15. Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam - tập 1, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 362-366, 576-580.

16. Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam - tập 2, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 253-255, 756-757, 984-987.

Tài liệu Tiếng Anh 17. Chinese Pharmacopoeia Commission (2015), Chinese pharmacopoeia, Volume 1, The Stationery Office, China, pp. 23-24, 111, 137-138, 165, 273-274, 322-323, 369, 389-390, 1338-1340.

18. Dong Y., Feng Z.L., Chen H.B., Wang F.S., Lu J.H. (2018), "Corni Fructus: a review of chemical constituents and pharmacological activities", Chin Med, 13, pp. 34.

19. Fang H., Guo Q., Shen H. (2009), "[Pre-treatment in determining total polysaccharide in flos Chrysanthemum indicum by response surface design]", Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 34(13), pp. 1665-1667.

20. Fu L., Wang P., Sun Y., Wang Y., Zhao J., Ye Y., Zhang Y., Bi Y. (2015), "High performance liquid chromatography time of flight electrospray ionization mass spectrometry for quantification of sesquiterpenes in Chrysanthemi indici Flos active extract", Pharmacogn Mag, 11(44), pp. 740-744.

21. Gao D., Li Q., Gao Z., Wang L. (2012), "Antidiabetic effects of Corni Fructus extract in streptozotocin-induced diabetic rats", Yonsei Med J, 53(4), pp. 691-700.

22. Gao X., Sun C., Yu Z., Cang J., Tian X., Huo X., Feng L., Liu X., Wang C., Zhang B., Ma X. (2018), "Correlation analysis between the chemical contents and bioactivity for the quality control of Alismatis Rhizoma", Acta Pharm Sin B, 8(2), pp. 242-251.

23. Gao Y., He C., Ran R., Zhang D., Li D., Xiao P.G., Altman E. (2015), "The resveratrol oligomers, cis- and trans-gnetin H, from Paeonia suffruticosa seeds inhibit the growth of several human cancer cell lines", J Ethnopharmacol, 169, pp. 24-33.

24. Ha do T., Phuong T. T., Oh J., Bae K., Thuan N.D., Na M. (2014), "Palbinone from Paeonia suffruticosa protects hepatic cells via up-regulation of heme oxygenase-1", Phytother Res, 28(2), pp. 308-311.

25. He B., Jiang J., Mo J., Huang D., Zhou L., Ban H., He Y. (2002), "[Study on the quality of Rhizome of Dioscorea persimilis]", Zhong Yao Cai, 25(4), pp. 233-237.

26. Huang J., Zhang Y., Dong L., Gao Q., Yin L., Quan H., Chen R., Fu X., Lin D. (2018), "Ethnopharmacology, phytochemistry, and pharmacology of Cornus officinalis Sieb. et Zucc", J Ethnopharmacol, 213, pp. 280-301.

27. Hwang E. S., Kim H. B., Lee S, Kim M. J, Lee S. O., Han S. M., Maeng S., Park J. H. (2017), "Loganin enhances long-term potentiation and recovers scopolamineinduced learning and memory impairments", Physiol Behav, 171, pp. 243-248.

28. Jeong S.C., Kim S.M., Jeong Y.T., Song C.H. (2013), "Hepatoprotective effect of water extract from Chrysanthemum indicum L. flower", Chin Med, 8(1), pp. 7.

29. Kim M.C., Lee C.H., Yook T.H. (2013), "Effects of anti-inflammatory and Rehmanniae radix pharmacopuncture on atopic dermatitis in NC/Nga mice", J Acupunct Meridian Stud, 6(2), pp. 98-109.

30. Kim M. J., Bae G. S., Jo I. J., Choi S. B., Kim D. G., Shin J. Y., Lee S. K., Kim M. J., Shin S., Song H. J., Park S. J. (2015), "Loganin protects against pancreatitis by inhibiting NF-kappaB activation", Eur J Pharmacol, 765, pp. 541-550.

31. Lam I. F., Huang M., Chang M.D., Yao P.W., Chou Y.T., Ng S.K., Tsai Y.L., Lin Y.C., Zhang Y.F., Yang X.Y., Lai Y.K. (2017), "Identification of anti-HBV activities in Paeonia suffruticosa Andr. using GRP78 as a drug target on Herbochip((R))", Chin Med, 12, pp. 11.

32. Lee S. R., Lee S., Moon E., Park H.J., Park H.B., Kim K.H. (2017), "Bioactivityguided isolation of anti-inflammatory triterpenoids from the sclerotia of Poria cocos using LPS-stimulated Raw264.7 cells", Bioorg Chem, 70, pp. 94-99.

33. Li H. M., Fan M.,Xue Y., Peng L.Y., Wu X.D., Liu D., Li R.T., Zhao Q.S. (2017), "Guaiane-Type Sesquiterpenoids from Alismatis Rhizoma and Their Anti-inflammatory Activity", Chem Pharm Bull (Tokyo), 65(4), pp. 403-407.

34. Li J., Lin X.,Zhang Y., Liu W., Mi X., Zhang J., Su J. (2016), "Preparative Purification of Bioactive Compounds from Flos Chrysanthemi Indici and Evaluation of Its Antiosteoporosis Effect", Evid Based Complement Alternat Med, 2016, pp. 2587201.

35. Li X., He Y., Zeng P., Liu Y., Zhang M., Hao C., Wang H., Lv Z., Zhang L. (2019), "Molecular basis for Poria cocos mushroom polysaccharide used as an antitumour drug in China", J Cell Mol Med, 23(1), pp. 4-20.

36. Liu F., Yang Y., Tan X., Bi K., Jia Y. (2009), "[Simultaneous determination of six flavonoids in Flos Chrysanthemi Indici by RP-HPLC]", Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 34(16), pp. 2067-2070.

37. Matsumoto Y., Sekimizu K. (2016), "A hyperglycemic silkworm model for evaluating hypoglycemic activity of Rehmanniae Radix, an herbal medicine", Drug Discov Ther, 10(1), pp. 14-18.

38. Park C. H., Xu F. H., Roh S.S., Song Y.O., Uebaba K., Noh J.S., Yokozawa T. (2015), "Astaxanthin and Corni Fructus protect against diabetes-induced oxidative stress, inflammation, and advanced glycation end product in livers of streptozotocininduced diabetic rats", J Med Food, 18(3), pp. 337-344.

39. Shen H., Guo Q., Fang H., Wang Y., Jin M. (2010), "[Determination of quercetin, luteolin, apigenin and acacetin in Flos Chrysanthemi Indici by RP-HPLC]", Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 35(2), pp. 191-193.

40. Song D., Cao Z., Tickner., Qiu H., Wang C., Chen K., Wang Z., Guo C., Dong S., Xu

J.

(2018),

"Poria

cocos

polysaccharide

attenuates

RANKL-induced

osteoclastogenesis by suppressing NFATc1 activity and phosphorylation of ERK and STAT3", Arch Biochem Biophys, 647, pp. 76-83.

41. Tang Y., Gao M.H., Yao M.C. (2009), "[Studies on flavones from Flos Chrysanthemi Indici]", Zhong Yao Cai, 32(10), pp. 1532-1534.

42. Wang N., Zhang Y., Wang X., Huang X., Fei Y., Yu Y., Shou D. (2016), "Antioxidant property of water-soluble polysaccharides from Poria cocos Wolf using different extraction methods", Int J Biol Macromol, 83, pp. 103-110.

43. Wu K., Fan J., Huang X., Wu X., Guo C. (2018), "Hepatoprotective effects exerted

by Poria Cocos polysaccharides against acetaminophen-induced liver injury in mice", Int J Biol Macromol, 114, pp. 137-142.

44. Xu L., Zhang W., Zeng L., Jin J.O., (2017), "Rehmannia glutinosa polysaccharide induced an anti-cancer effect by activating natural killer cells", Int J Biol Macromol, 105(Pt 1), pp. 680-685.

45. Xu W., Saiki S., Myojin T., Liu Y., Zhu B., Murata Y., Ashida H., Tsunenaga M., Nakamura Y. (2018), "Lycii fructus extract ameliorates hydrogen peroxide-induced cytotoxicity through indirect antioxidant action", Biosci Biotechnol Biochem, 82(10), pp. 1812-1820.

46. Xu X., Hang L., Huang B., Wei Y., Zheng S., Li W. (2013), "Efficacy of Ethanol Extract of Fructus lycii and Its Constituents Lutein/Zeaxanthin in Protecting Retinal Pigment Epithelium Cells against Oxidative Stress: In Vivo and In Vitro Models of AgeRelated Macular Degeneration", J Ophthalmol, 2013, pp. 862806.

47. Zhang L.L., Xu W., Xu Y.L., Chen X., Huang M., Lu J.J. (2017), "Therapeutic potential of Rhizoma Alismatis: a review on ethnomedicinal application, phytochemistry, pharmacology, and toxicology", Ann N Y Acad Sci, 1401(1), pp. 90101.

48. Zhang Lei, Zou Y., Xu J.K., Zhang J., Ye X.S., Zhang W.K., Lin P. (2015), "[Chemical constituents from aerial part of Rehmannia glutinosa]", Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 40(16), pp. 3214-3219.

49. Zhang W., Chen L., Li P., Zhao J., Duan J. (2018), "Antidepressant and immunosuppressive activities of two polysaccharides from Poria cocos (Schw.) Wolf", Int J Biol Macromol, 120(Pt B), pp. 1696-1704.

50. Zhang X.F., Chen J., Yang J.L., Shi Y.P. (2018), "UPLC-MS/MS analysis for antioxidant components of Lycii Fructus based on spectrum-effect relationship", Talanta, 180, pp. 389-395.

51. Zhang X., Yang J., Chen J., Shi Y. (2018), "[Fast determination of betaine in Lycii Fructus

by

ultra-performance

convergence

chromatography-tandem

mass

spectrometry]", Se Pu, 36(5), pp. 417-424.

52. Zhao B. T., Jeong S. Y., Hwangbo K., Moon D.C., Seo E.K., Lee D., Lee. J.H., Min B.S., Ma E.S., Son J.K., Woo. (2013), "Quantitative analysis of betaine in Lycii Fructus

by HILIC-ELSD", Arch Pharm Res, 36(10), pp. 1231-1237.

PHỤ LỤC Phụ lục 1. Bài thuốc “Kỷ cúc địa hoàng”: Dược liệu chuẩn và chất chuẩn, cốm thành phần và cốm bài thuốc.

Phụ lục 2. Hệ thống thiết bị sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Linomat 5 (Camag Switzeland).

Phụ lục 3. Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Phụ lục 4. Ảnh sắc ký lớp mỏng của cốm bài thuốc so với chất chuẩn và các dược liệu chuẩn.

Phụ lục 5. Định tính một số nhóm chất chính trong mẫu nghiên cứu bằng phản ứng hóa học.

Phụ lục 6. Phương pháp định tính và định lượng các vị thuốc trong bài thuốc Kỷ cúc đia hoàng theo Dược điển Việt Nam V, tập 2.

Phụ lục 1. Bài thuốc “Kỷ cúc địa hoàng”: Dược liệu chuẩn, cốm thành phần và cốm bài thuốc.

1. Dược liệu chuẩn và chất chuẩn

Thục địa

Hoài sơn

Sơn thù

Mẫu đơn bì

Thục địa

Hoài sơn

Sơn thù

Mẫu đơn bì

Câu kỷ tử

Trạch tả

Cúc hoa vàng

Bạch linh

Câu kỷ tử

Trạch tả

Cúc hoa vàng

Bạch linh

Chất chuẩn loganin

2. Cốm

Câu kỷ tử

Cúc hoa vàng

Câu kỷ tử

Cúc hoa vàng

Câu kỷ tử

Cúc hoa vàng

Câu kỷ tử

Cúc hoa vàng

Thục địa

Sơn thù

Thục địa

Sơn thù

Thục địa

Sơn thù

Thục địa

Sơn thù

Hoài sơn

Trạch tả

Hoài sơn

Trạch tả

Hoài sơn

Trạch tả

Hoài sơn

Trạch tả

Bạch linh

Mẫu đơn bì

Mẫu đơn bì Phục linh Mẫu đơn bì

Mẫu đơn bì

Bạch linh

Phục linh

Cốm bài thuốc

Cốm bài thuốc

Phụ lục 2. Hệ thống thiết bị sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Linomat 5 (Camag Switzeland).

(1)

(2)

(3)

(1): Thiết bị phun mẫu Linomat 5.

(4)

(4)

(2): Bình khai triển dung môi.

(3): Máy tính xử lý kết quả: phần Videoscan.

(2) mềm Wincats và (3) (1) (4): Buồng chụp Camag.

(4)

(4)

Phụ lục 3. Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.

Hệ thống máy HPLC gồm một số bộ phận chính được kết nối với nhau: -

Hệ thống cấp pha động.

-

Bơm sắc ký lỏng.

-

Bộ phận tiêm mẫu.

-

Cột và pha tĩnh.

-

Detector.

-

Hệ thu nhận và xử lý số liệu.

Phụ lục 4. Ảnh sắc ký lớp mỏng của cốm bài thuốc so với chất chuẩn và các dược liệu chuẩn.

1. Sắc ký đồ định tính cốm bài thuốc và Thục địa.

254 nm

366 nm

Ánh sáng thường sau khi phun TT

2. Sắc ký đồ định tính cốm bài thuốc và Hoài sơn.

254 nm

254 nm

254 nm

366 nm

366 nm

366 nm

Ánh sáng thường sau khi phun TT

Ánh sáng thường sau khi phun TT

3. Sắc ký đồ định tính cốm bài thuốc và Mẫu đơn bì.

254 nm

366 nm

Ánh sáng thường sau khi phun TT

4. Sắc ký đồ định tính cốm bài thuốc và Trạch tả.

254 nm

366 nm

254 nm

366 nm

Ánh sáng thường sau khi phun TT

Ánh sáng thường sau khi phun TT

254 nm

254 nm

254 nm

366 nm

366 nm

366 nm

ÁnhÁnh sáng thường sau sáng thường khi khi phun TT TT sau phun

Ánh sáng thường sau khi phun TT

5. Sắc ký đồ định tính cốm bài thuốc và Câu kỷ tử.

254 nm

366 nm

Ánh sáng thường sau khi phun TT

6. Sắc ký đồ định tính cốm bài thuốc và Bạch linh.

254 nm

254 nm

254 nm

366 nm

366 nm

366 nm

Ánh sáng thường sau khi phun TT

Ánh sáng thường sau khi phun TT

Ánh sáng thường sau khi phun TT

Ánh sáng thường sau khi phun TT 254 nm

366 nm 366 nm

7. Sắc ký đồ định tính cốm bài thuốc và Cúc hoa vàng

254 nm

366 nm

Ánh sáng thường sau khi phun TT

8. Sắc ký đồ định tính cốm bài thuốc, Sơn thù và loganin.

Ánh sáng thường sau khi phun TT 254 nm

254 nm 254 nm

366 nm

366 nm

Ánh sáng thường sau khi phun TT Ánh sáng thường sau khi phun TT

366 nm

Ánh sáng thường sau

Phụ lục 5. Định tính một số nhóm chất chính trong mẫu nghiên cứu bằng phản ứng hóa học. ❖ Định tính flavonoid ✓ Mẫu nghiên cứu: -

Cốm bài thuốc: Cân 4 g cốm bài thuốc cho vào bình nón, pha loãng bằng 50 ml nước cất. Đun trên bếp cách thủy cho tan hết, để lắng, lọc. Dịch lọc đem lắc với n-hexan để loại tạp, lắc 3 lần, mỗi lần 15 ml n-hexan. Dịch chiết nước thu được lắc với EtOAc 3 lần, mỗi lần 15 ml. Gộp các dịch chiết EtOAc lại, bốc hơi dung môi, cắn thu được hòa tan trong 10 ml ethanol 900 làm phản ứng định tính.

-

Cốm thành phần: Cân 2 g cốm mỗi loại cho vào các bình nón, thêm 50 ml EtOH 900. Đun cách thủy sôi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch lọc được tiến hành các phản ứng định tính.

✓ Tiến hành: -

Phản ứng Cyanidin: Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết, thêm một ít bột Mg kim loại (khoảng 20 mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5 giọt), để yên một vài phút. Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ.

-

Phản ứng với dung dịch NaOH 10 %: Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10 %. Phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện tủa vàng, thêm 1 ml nước cất, tủa tan và màu vàng của dung dịch được tăng thêm.

-

Phản ứng diazo hóa: Cho 2 ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (NaOH), thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều (hoặc đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút). Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ.

-

Phản ứng với FeCl3: Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5 %. Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa xanh đen.

❖ Định tính saponin ✓ Mẫu nghiên cứu: -

Cốm bài thuốc: Cân 4 g cốm bài thuốc cho vào bình nón, pha loãng bằng 20 ml nước cất. Đun trên bếp cách thủy cho tan hết, để lắng, lọc. Dịch lọc đem

lắc với n-hexan để loại tạp, lắc 3 lần, mỗi lần 10 ml n-hexan. Dịch chiết nước thu được lắc với n-butanol 3 lần, mỗi lần 10 ml. Gộp các dịch chiết n-butanol lại, bốc hơi dung môi, cắn thu được hòa tan trong 10 ml ethanol 900 làm phản ứng định tính.

-

Cốm thành phần: Cân 2 g cốm mỗi loại cho vào các bình nón riêng biệt, thêm 50 ml EtOH 90 %. Đun cách thủy sôi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch lọc được tiến hành các phản ứng định tính.

✓ Tiến hành: - Hiện tượng tạo bọt: Cho một ít MNC vào ống nghiệm lớn, thêm khoảng 10 ml nước cất, lắc mạnh theo chiều dọc trong ống nghiệm khoảng 5 phút. Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt. Phản ứng dương tính khi cột bọt bền vững sau 15 phút.

- Phản ứng Salkowski: Lấy 1 ml DC vào ống nghiệm, bốc hơi đến cắn, hòa tan cắn trong 1 ml cloroform. Nghiêng ống nghiệm 45°, nhỏ từ từ đồng lượng dung dịch acid sulfuric đặc theo thành ống. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vùng màu đỏ tím giữa hai lớp. ❖ Định tính glycoside tim ✓ Mẫu nghiên cứu: -

Cốm bài thuốc và cốm thành phần: Cân 4 g cốm bài thuốc, 2 g cốm thành phần mỗi loại sau đó chiết hồi lưu với ethanol 90 % bằng bình cách thủy trong 30 phút, lọc. Dịch lọc được loại tạp bằng chì acetat 30 %, khuấy kỹ và lọc bỏ tủa.

Thêm vào dịch lọc một lượng vừa đủ natri sulfat để loại chì thừa. Lọc, thu lấy dịch chiết. Cất loại một phần dung môi cồn rồi chiết với dung môi cloroform.

Lấy dịch chiết cloroform đem bốc hơi tới cắn, để làm các phản ứng định tính glycoside tim.

✓ Tiến hành: - Phản ứng Lieberman – Burchardat: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 1 ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Phản ứng dương tính nếu ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ. Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá.

- Phản ứng Legal: Chuẩn bị 1 ống chứng. Cho vào ống nghiệm chứa cắn đã chuẩn bị ở trên và ống chứng mỗi ống 0,5 ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5 % và 2 giọt dung dịch NaOH 10 %. Lắc đều. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ cam. Khi so sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycoside tim thấy ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng.

- Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90 %.

Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (1 phần dung dịch acid picric 1 % và 9 phần dung dịch NaOH 10 %) mới pha. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ da cam. Khi so sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycoside tim thấy ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng.

- Phản ứng Keller – Kiliani: Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5 ml ethanol 90 %. Lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5 % pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Phản ứng dương tính khi ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện 1 vòng màu tím đỏ. Khi lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên sẽ có màu xanh lá. ❖ Định tính tanin ✓ Mẫu nghiên cứu: -

Cốm bài thuốc và cốm thành phần: Cân 4 g cốm bài thuốc, 2 g cốm thành phần mỗi loại cho vào các bình nón riêng biệt, thêm 30 ml nước cất. Đun sôi trong 2 phút. Để nguội, lọc. Dịch chiết thu được làm các phản ứng định tính.

✓ Tiến hành: -

Phản ứng với dung dịch FeCl3 5 %: Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5 %. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt.

-

Phản ứng với dung dịch gelatin 1 %: Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1 %. Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa bông trắng.

-

Phản ứng với chì acetat 10 %: Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10 %.

Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa bông.

❖ Định tính alkaloid ✓ Mẫu nghiên cứu:

- Cốm bài thuốc và cốm thành phần: Cân 4 g cốm bài thuốc, 2 g cốm thành phần mỗi loại cho vào bình nón dung tích 50 ml có nút mài riêng biệt. Thêm 25 ml dung dịch H2SO4 đun đến sôi, để nguội, lọc lấy dịch lọc. Cho dịch lọc vào bình gạn 100 ml. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac đặc đến pH = 9 - 10 (thử bằng chỉ thị màu vạn năng). Chiết alkaloid base bằng CHCl3 (3 lần x 10 ml), gạn lấy lớp CHCl3, bốc hơi đến cách thủy tới khô, thu được cắn.

Hòa tan cắn bằng 3 ml H2SO4 1N. Dùng dịch chiết để định tính ✓ Tiến hành: - Phản ứng với TT Mayer: Nhỏ 2 - 3 giọt TT Mayer. Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng đến vàng - Phản ứng với TT Bouchardat: Nhỏ 2- 3 giọt TT Bouchardat. Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa nâu đến đỏ nâu.

- Phản ứng với TT Dragendorff: Nhỏ 2 - 3 giọt TT Dragendorff. Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa vàng cam đến đỏ. ❖ Định tính polysaccharide ✓ Mẫu nghiên cứu: - Cốm bài thuốc và cốm thành phần: Cân 4 g cốm bài thuốc, 2 g cốm thành phần mỗi loại cho vào từng bình nón riêng biệt, thêm 30 ml nước cất. Đun sôi trong 10 phút. Để nguội, lọc. Dịch chiết thu được làm các phản ứng định tính. ✓ Tiến hành: - Đun cách thủy 2 ml dịch lọc với 0,5 ml dung dịch Lugol (TT) trong vài phút. Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển sang màu tím đỏ - xanh tím. ❖ Định tính acid amin ✓ Mẫu nghiên cứu: - Cốm bài thuốc và cốm thành phần: Cân 4 g cốm bài thuốc, 2 g cốm thành phần mỗi loại cho vào từng bình nón riêng biệt, thêm 30 ml nước cất. Đun sôi trong 10 phút. Để nguội, lọc. Dịch chiết thu được làm các phản ứng định tính. ✓ Tiến hành: - Đun cách thủy 2 ml dịch lọc với 3 giọt TT Ninhydrin trong 2 - 3 phút. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu tím. ❖ Định tính acid hữu cơ ✓ Mẫu nghiên cứu:

- Cốm bài thuốc và cốm thành phần: Cân 4 g cốm bài thuốc, 2 g cốm thành phần mỗi loại cho vào từng bình nón riêng biệt, thêm 30 ml nước cất. Đun sôi trong 10 phút. Để nguội, lọc. Dịch chiết thu được làm các phản ứng định tính. ✓ Tiến hành: - Cho 2 ml dịch lọc vào 2 ống nghiệm, thêm vào ít bột Na2CO3. Phản ứng dương tính khi thấy có bọt khí bay lên. ❖ Định tính đường khử ✓ Mẫu nghiên cứu: - Cốm bài thuốc và cốm thành phần: Cân 4 g cốm bài thuốc, 2 g cốm thành phần mỗi loại cho vào từng bình nón riêng biệt, thêm 30 ml nước cất. Đun sôi trong 10 phút. Để nguội, lọc. Dịch chiết thu được làm các phản ứng định tính. ✓ Tiến hành: - Đun cách thủy 2 ml dịch lọc với 0,5 ml TT Fehling A và 0,5 ml Fehling B trong vài phút. Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa đỏ gạch. ❖ Định tính sterol ✓ Mẫu nghiên cứu: - Cốm bài thuốc và cốm thành phần: Cân 4 g cốm bài thuốc, 2 g cốm thành phần mỗi loại cho vào từng cốc có mỏ 100 ml, thêm 10 ml ether dầu hỏa, lọc kín, ngâm 12 giờ. Lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc. Dịch chiết thu được làm các phản ứng định tính. ✓ Tiến hành: - Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2 ml dịch chiết ether dầu hỏa của dược liệu, cô cách thủy đến cắn. Thêm vào ống nghiệm khoảng 1 ml anhydride acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn. Để nghiêng ống nghiệm 450, thêm từ từ H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm. Phản ứng dương tính nếu mặc phân cách có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá.

Phụ lục 6. Phương pháp định tính và định lượng các vị thuốc trong bài thuốc Kỷ cúc đia hoàng theo Dược điển Việt Nam V, tập 2.

1. Thục địa ✓ Định tính bằng SKLM: -

Bản mỏng: Silica gel GF254.

-

Dung môi khai triển: Ethyl acetat - methanol - acid formic (16:0,5:2).

-

Dung dịch thử: Lấv 1 g dược liệu đã cắt nhỏ, thêm 50 ml methanol (TT) 80 %, lắc siêu âm 30 min, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến cắn, hòa cắn trong 5 ml nước. Lắc với n-butanol đã bão hòa nước (TT) 4 lần, mỗi lần 10 ml. Gộp dịch chiết n-butanol, cô đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml methanol (TT) làm dung dịch chấm sắc ký.

-

Dung dịch đối chiếu: Hòa tan verbascosid chuẩn trong methanol (TT) để được dung dịch có nồng độ khoảng 1 mg/ml.

-

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai, để khô bản mỏng ở nhiệt độ phòng, phun dung dịch 2 'aminoethyl diphenylorinat 1 % trong methanol (TT), sấy bản mỏng ở 105 oC trong 5 min. Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại tại bước sóng 366 nm. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng màu và cùng giá trị Rf với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.

✓ Định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng: -

Pha động: Acetonitrile - dung dịch acid acetic 0,1 % (16:84).

-

Dung dịch thử: Cắt một lượng dược liệu thành những mảnh nhỏ (kích thước khoảng 5 mm x 5 mm), sấy ở 80 oC, dưới áp suất giảm trong 24 h rồi nghiền thành bột thô. Cân chính xác khoảng 2 g bột dược liệu vảo một bình nón nút mài, thêm chính xác 100 ml methanol (TT), đậy nút, cân. Đun sôi hồi lưu 30 min, để nguội và cân lại. Bổ sung khối lượng mất đi bằng methanol (TT), lắc đều, lọc. Lấy chính xác 50 ml dịch lọc, cất thu hồi dung môi trong chân không đến gần khô. Dùng pha động để hòa tan và chuyển toàn bộ cắn vào bình định mức 10 ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µl.

-

Dung dịch chuẩn: Hòa tan verbascosid chuẩn trong pha động để được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 10 µl/ml.

-

Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm), được nhồi pha tĩnh C (5 µl).

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 334 nm.

Tốc độ dòng: 0,8 ml/min.

Thể tích tiêm: 20 µl.

-

Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn. Tính số đĩa lý thuyết của cột. Số đĩa lý thuyết của cột tính trên pic verbascosid phải không dưới 5000. Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn và dung dịch thử.

Tính hàm lượng verbascosid trong dược liệu dựa vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn, hàm lượng C29H36O15 trong verbascosid chuẩn. Dược liệu phải chứa không dưới 0,02 % verbascosid (C29H36O15) tính theo dược liệu khô kiệt.

2. Hoài sơn ✓ Định tính bằng SKLM: -

Bản mỏng: Silica gel 60GF254.

-

Dung môi khai triển: Cloroform - methanol (9:1).

-

Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm 5 ml hỗn hợp chloroform methanol (4 : 1), đun sôi dưới ống sinh hàn hồi lưu khoảng 10 min. Để nguội, lọc, cô dịch lọc đến cắn, hòa cắn trong 1 ml ethanol (TT) làm dung dịch chấm sắc ký.

-

Dung dịch đối chiếu: Lấy 0,5 g bột Củ mài (mẫu chuẩn), tiến hành chiết như mô tả ở phần Dung dịch thử.

-

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 15 µl mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai sắc ký, phun dung dịch vanillin (TT) 1 % trong hỗn hợp acid phosphoric - methanol (1:1). Sấy bản mỏng ở 120 oC đến khi hiện rõ vết.

Quan sát dưới ánh sáng thường hoặc ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm.

Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có cùng màu và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.

✓ Định lượng: chưa có chỉ tiêu định lượng.

3. Sơn thù: ✓ Định tính bằng SKLM: ➢ Phương pháp 1:

-

Bản mỏng: Silica gel G.

-

Dung môi khai triển: Toluen - ethyl acetat - acid formic (20:4:0,5).

-

Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethyl acetat (TT), siêu âm 15 min, lọc, bốc hơi dịch lọc trên cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml ethanol (TT) được dung dịch thử.

-

Dung dịch đối chiếu: Hòa tan acid ursolic chuẩn trong ethanol (TT) để được dung dịch chứa 1 mg/ml. Nếu không có chất chuẩn, dùng 0,5 g bột Sơn thù (mẫu chuẩn) chiết như mô tả ở phần Dung dịch thử.

-

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô ngoài không khí, phun dung dịch acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT), sấy ở 105 oC tới khi các vết xuất hiện rõ. Quan sát dưới ánh sáng ban ngày. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải xuất hiện vết màu đỏ tím có cùng màu và giá trị Rf với vết của acid ursolic hoặc phải có các vết có cùng màu và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đổ của dung dịch đối chiếu. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải xuất hiện vết có huỳnh quang màu vàng cam có cùng màu và giá trị Rf với vết của acid ursolic hoặc trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng màu và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.

➢ Phương pháp 2: -

Dung môi khai triển: Ethyl acetat - ethanol - acid acetic băng (50:10:1).

-

Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethanol (TT), lắc siêu âm 15 min, lọc, bốc hơi dịch lọc trên cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml ethanol (TT) được dung dịch thử.

-

Dung dịch đối chiếu: Hòa tan một lượng loganin chuẩn trong ethanol (TT) để được dung dịch chứa 1 mg/ml. Nếu không có loganin chuẩn, lấy 0,5 g bột Sơn thù (mẫu chuẩn) chiết như mô tả ở phần Dung dịch thử.

-

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô ngoài không khí, phun dung dịch vanillin 5 % trong acid sulfuric (TT), sấy ở 105 oC tới khi các vết xuất hiện rõ. Quan sát dưới ánh sáng thường. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử

phải xuất hiện vết có cùng màu và giá trị với vết của loganin hoặc có các vết cùng màu và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. ✓ Định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng: -

Pha động: Acetonitrile - nước (15:85).

-

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,1 g bột dược liệu (qua rây số 355) vào một bình nón nút mài, thêm chính xác 25 ml methanol 80 % (TT), đậy nút, cân. Đun hồi lưu trong 1 h, để nguội, cân lại. Bổ sung khối lượng mất đi bằng methanol 80 % (TT), lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µl.

-

Dung dịch chuẩn: Hòa tan loganin chuẩn trong methanol 80% (TT) để được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 40 µl /ml.

-

Điều kiện sắc ký:

Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µl).

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 240 nm.

Tốc độ dòng: 1 ml/min.

Thể tích tiêm: 10 µl.

Cách tiến hành: Tiêm dung dịch chuẩn. Tiến hành sắc ký và tính số đĩa lý thuyết của cột. Số đĩa lý thuyết của cột tính trên pic loganin phải không dưới 3000.

Tiêm lần lượt dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính hàm lượng của loganin trong dược liệu dựa vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn, hàm lượng C17H26O10 của loganin chuẩn.

Dược liệu phải chứa không dưới 0,6 % loganin (C17H26O10) tính theo dược liệu khô kiệt.

4. Mẫu đơn bì ✓ Định tính bằng SKLM: -

Bản mỏng: Silica gel G.

-

Dung môi khai triển: Cyclohexan - ethyl acetat (3:1).

-

Dung dịch thử: Lấy 1 g bột dược liệu, thêm 10 ml ether ethylic (TT), lắc kỹ, để yên 10 min, lọc. Bốc hơi dịch lọc trên cách thủy đến khô, thêm 2 ml aceton (TT) để hòa tan cắn, được dung dịch thử.

-

Dung dịch chất đối chiếu: Hòa tan paeonol chuẩn trong aceton (TT) để được dung dịch có nồng độ 5 mg/ml.

-

Dung dịch dược liệu đối chiếu: Nếu không có paeonol, lấy 1 g bột Mẫu đơn bì (mẫu chuẩn), chiết như mô tả ở phần Dung dịch thử.

-

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí, rồi phun dung dịch sắt (III) clorid 5 % trọng ethanol (TT). Quan sát dưới ánh sáng thường.

Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng màu sắc và giá trị Rf với vết trên sắc ký đồ của dung dịch chất đối chiếu. Hoặc có các vết cùng màu sắc và giá tri Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch dược liệu đối chiếu.

✓ Định lượng bằng phương pháp đo quang: Cân chính xác khoảng 0,2 g bột dược liệu (qua rây số 355) cho vào trong bình cầu, cất kéo hơi nước cho đến khi dịch cất ra được khoảng 450 ml, thêm nước vừa đủ 500 ml, lắc đều. Đo độ hấp thụ của dung dịch thu được ở bước sóng 274 nm. Tính hàm lượng paeonol trong dược liệu theo A (1 %, 1 cm). Lấy 862 là giá trị A (1 %, 1 cm) của paeonol ở bước sóng 274 nm. Dược liệu phải chứa paeonol (C9H10O3) không dưới 1,2 % tính theo dược liệu khô kiệt.

5. Bạch linh ✓ Định tính bằng SKLM: -

Bản mỏng: Silica gel G.

-

Dung môi khai triển: Toluen - ethyl acetat - acid formic (20:5:0,5).

-

Dung dịch thử: Lấy 1 g bột dược liệu, thêm 50 ml ether (TT), siêu âm 10 min, lọc, bay hơi dịch lọc đến cắn, hòa cắn trong 1 ml methanol (TT).

-

Dung dịch đối chiếu: Lấy 1 g bột Bạch linh (mẫu chuẩn), tiến hành chiết như mô tả ở phần Dung dịch thử.

-

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 5 µl mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra đề khô ở nhiệt độ phòng. Phun dung dịch vanillin 2 % trong hỗn hợp acid sulfuric - ethanol (4:1), sấy bản mỏng ở 105 oC đến khi các vết hiện rõ. Quan sát dưới ánh sáng thường. Các vết trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tương ứng về màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.

✓ Định lượng: chưa có chỉ tiêu định lượng.

6. Trạch tả: ✓ Định tính bằng SKLM:

-

Bản mỏng: Silica gel G.

-

Dung môi khai triển: Cyclohexan - ethyl acetat (1:1).

-

Dung dịch thử: Lấy 2 g bột dược liệu, thêm 20 ml ethyl acetat (TT), siêu âm 30 min, lọc. Chuyển toàn bộ dịch lọc vào cột (đường kính trong 1 cm, được nhồi 5 g bột nhôm oxyd trung tính dùng cho sắc ký cột bằng phương pháp nhồi khô, kích thước hạt nhồi khoảng 200 mesh đến 300 mesh). Rửa giải bằng 10 ml ethỵl acetat (TT). Thu dịch rửa giải và bay hơi tới khô. Hòa tan cắn thu được trong 1 ml ethyl acetat (TT) được dịch chấm sắc ký.

-

Dung dịch chất đối chiếu: Hòa tan 23-acetat alisol B chuẩn trong ethyl acetat (TT) để được dung dịch có nồng độ 2 mg/ml.

-

Dung dịch dược liệu đối chiếu: Nếu không có chất chuẩn trên, dùng 2 g bột Trạch tả (mẫu chuẩn) chiết như mô tả ở phần Dung dịch thử.

-

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng. Phun dung dịch natri tungstat 5 % trong acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT). Sấy bản mỏng ở nhiệt độ 105 oC đến khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng ban ngày.

Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng màu sắc và giá trị Rf với vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. Hoặc trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết cùng màu sắc vá giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch dược liệu đối chiếu.

✓ Định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng: -

Pha động: Acetonitrile - nước (73:27).

-

Dung dịch chuẩn: Hòa tan 23-acetat alisol B chuẩn trong acetonitrile (TT) để được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 20 µg/ml.

-

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,5 g bột dược liệu (qua rây số 180) vào một bình nón nút mài, thêm chính xác 25 ml acetonitrile (TT), đậy nút và cân. Siêu âm (công suất 250 W, tần số 50 kHz) trong 30 min, để nguội và cân lại. Bổ sung acetonitrile (TT) để được khối lượng ban đầu, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µl.

-

Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm), được nhồi pha tĩnh C (5 µm).

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 208 nm.

Tốc độ dòng: 1 ml/min.

Thể tích tiêm: 10 µl.

Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn và tính số đĩa lý thuvết của cột. Số đĩa lý thuyết của cột tính theo pic 23-acetat alisol B phải không dưới 3000.

Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính hàm lượng 23-acetat alisol B trong dược liệu dựa vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn, hàm lượng C32H50O5 của 23acetat alisol B chuẩn. Dược liệu phải chứa không dưới 0,050 % 23-acetat alisol B (C32H50O5), tính theo dược liệu khô kiệt.

7. Câu kỷ tử ✓ Định tính bằng SKLM: -

Bản mỏng: Silica gel G.

-

Dung môi khai triển: Cloroform - ethyl acetat - acid formic (2:3:1 ).

-

Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu cho vào bình nón 50 ml thêm 20 ml nước, đun trong cách thủy trong 20 min, để nguội, lọc lấy dịch lọc. Lắc dịch lọc với ethyl acetat (TT) 3 lần, mỗi lần 5 ml. Gộp chung dịch chiết ethyl acetat, bay hơi đến cắn trên cách thủy. Hòa tan cắn với 1 ml ethyl acetat (TT), được dung dịch thử.

-

Dung dịch đối chiếu: Lấy khoảng 0,5 g bột Câu kỷ tử (mẫu chuẩn), chiết như mô tả ở phần Dung dịch thử.

-

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai xong, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.

✓ Định lượng: chưa có chỉ tiêu định lượng.

8. Cúc hoa vàng ✓ Định tính bằng SKLM: ➢ Phương pháp 1: -

Bản mỏng: Silica gel G.

-

Dung môi khai triển: Ethyl acetat - acid formic - nước (8:1:1).

-

Dung dịch thử: Lấy 10 ml dịch lọc A, bốc hơi tới cắn, hòa tan cắn trong 20 ml nước nóng, lọc, dịch lọc được lắc 2 lần với ethyl acetat (TT), mỗi lần 10 ml, tập trung dịch chiết ethyl acetat, cô trên cách thủy tới cắn, hòa cắn trong 1 ml ethanol (TT) được dung dịch thử.

-

Dung dịch đối chiếu: Lấy 3 g bột Cúc hoa vàng (mẫu chuẩn), tiến hành chiết như mô tả ở phần Dung dịch thử.

-

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 15 cm, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, hiện màu bằng hơi amoniac (TT). Quan sát dưới ánh sáng thường. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết (6 vết, trong đó có 4 vết màu vàng nâu và 2 vết màu vàng xanh) có cùng giá trị Rf và màu sắc với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.

➢ Phương pháp 2: -

Bản mỏng: Silica gel 60F254.

-

Dung môi khai triển: Ethyl acetat - 2-butanol - nước – acid formic (25:3:1:1).

-

Dung dịch thử: Lấy 1 g bột dược liệu, thêm 20 ml methanol (TT), lắc siêu âm trong 10 min, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 1 ml ethanol (TT) được dung dịch thử.

-

Dung dịch đối chiếu: Lấy 1 g bột Cúc hoa vàng (mẫu chuẩn), tiến hành chiết như mô tả ở phần Dung dịch thử.

-

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch trên. Sau khi khai triển, lấy bản mỏng ra khỏi bình sắc ký, để bay hơi hết dung môi ở nhiệt độ phòng. Phun dung dịch sắt (III) clorid 5 % trong ethanol (TT) đến khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.

✓ Định lượng: chưa có chỉ tiêu định lượng.