XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ THREONINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ L

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------

NGUYỄN THỊ NGỌC CHÂM

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ THREONINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƢỢC

2015

1

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------

NGUYỄN THỊ NGỌC CHÂM

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ THREONINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNGHIỆU NĂNG CAO (HPLC)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƢỢC

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN Ts. NGUYỄN THỊ THU THỦY CN. La Văn Thái CN. Bùi Thị Quỳnh Hoa

2015 2

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Trƣờng Đại Học Cần Thơ Khoa Khoa Học Tự Nhiên Bộ Môn Hóa Học

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự do – Hạnh phúc ----------

Ơ

N

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

Y

N

H

1. Cán bộ hướng dẫn: Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy

TR ẦN

.............................................................................................................................. ..............................................................................................................................  Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp

B

Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

10 00

.............................................................................................................................. ..............................................................................................................................

Ó

A

Những vấn đề còn hạn chế:

Ý

-H

.............................................................................................................................. ..............................................................................................................................

-L

Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:

TO

ÁN

.............................................................................................................................. ..............................................................................................................................

.............................................................................................................................. ..............................................................................................................................

Cần Thơ, ngày... tháng... năm 2015

IỄ N

Đ

ÀN

Kết luận, đề nghị và điểm:

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

H Ư

N

G

4. Nội dung nhận xét:  Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Lớp: Hóa Dƣợc – Khóa: 38

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

2. Tên đề tài: Xác định hàm lƣợng lysine, methionine và threonine trong thức ăn chăn nuôi bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

3. Sinh viên thực hiện:Nguyễn Thị Ngọc Châm MSSV: B1203424

D

Cán bộ hướng dẫn

Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy 3 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Trƣờng Đại Học Cần Thơ Khoa Khoa Học Tự Nhiên Bộ Môn Hóa Học

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự do – Hạnh phúc ----------

TR ẦN

 Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

10 00

B

.............................................................................................................................. ..............................................................................................................................

Những vấn đề còn hạn chế:

-H

Ó

A

.............................................................................................................................. ..............................................................................................................................

Ý

Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:

ÁN

-L

.............................................................................................................................. ..............................................................................................................................

.............................................................................................................................. ..............................................................................................................................

Cần Thơ, ngày... tháng... năm 2015

IỄ N

Đ

ÀN

TO

Kết luận, đề nghị và điểm:

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

H Ư

.............................................................................................................................. ..............................................................................................................................

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

N

G

4. Nội dung nhận xét:  Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

Đ ẠO

Lớp: Hóa Dƣợc – Khóa: 38

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

1. Cán bộ phản biện:......................................................................................

2. Tên đề tài: Xác định hàm lƣợng lysine, methionine và threonine trong thức ăn chăn nuôi bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 3. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Ngọc Châm MSSV: B1203424

Ơ

N

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ CHẤM PHẢN BIỆN

D

Cán bộ phản biện

4 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

___________________________

N

H

Năm học 2015 – 2016

Ơ

____________

N

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-L

Ý

-H

Nguyễn Thị Ngọc Châm

ÁN

Luận văn tốt nghiệp đại học

Đ

ÀN

TO

Chuyên nghành: Hóa Dược Đã bảo vệ và được duyệt

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

Ó

A

10 00

B

Cần Thơ, ngày... tháng... năm 2015

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TR ẦN

H Ư

N

G

Em tên: Nguyễn Thị Ngọc Châm tác giả của luận văn này, em xin cam đoan luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của riêng em, các kết quả nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác và đã được chỉnh sửa theo ý kiến của hội đồng chấm bảo vệ luận văn.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

LỜI CAM ĐOAN

IỄ N D

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

Đề tài: “XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ THREONINETRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNGHIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Hiệu trưởng:.................................................

Trưởng khoa: ...............................................

Trưởng chuyên ngành

Cán bộ hướng dẫn

Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy 5 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

-L

Ý

-H

Ó

A

Xin gửi lời cảm ơn đến Ts. Tôn Nữ Liên Hƣơng, đã dẫn dắt em và lớp Cử nhân Hóa Dược Khóa 38 trong suốt 4 năm học tại trường. Cảm ơn cô đã truyền lại những kiến thức quý báu về chuyên ngành cũng như sự quan tâm sâu sắc và tận tụy, giúp chúng em vượt qua mọi rào cản khó khăn trong học tập.

ÁN

TO ÀN Đ

IỄ N D

Cảm ơn CN. La Văn Thái – Trưởng phòng thí nghiệm Trung tâm Phân Tích và Giám định Vinacert Control – Cần Thơ, CN. Bùi Thị Quỳnh Hoa – kiểm nghiệm viên phòng phân tích sắc ký và các anh chị tại công ty, đã nhiệt tình hướng dẫn, chia sẽ kinh nghiệm và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài tại đây.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

10 00

B

TR ẦN

Đặc biệt, em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy.

Cảm ơn cô đã truyền dạy những kiến thức sâu rộng của mình, tận tình hướng dẫn cùng với sự quan tâm ân cần, âm thầm hỗ trợ và động viên tinh thần, cô đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để em vượt qua mọi khó khăn và hoàn thành luận văn của mình. Xin gửi đến cô lời cảm ơn sâu sắc nhất!

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

Đ ẠO

H Ư

N

G

Ban lãnh đạo Trung tâm Phân Tích và Giám định Vinacert Control – Cần Thơ, đã tạo mọi điều kiện tốt nhất về hóa chất, thiết bị, dụng cụ để giúp em hoàn thành tốt nhất luận văn này.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Khoa Khoa học tự nhiên cùng tất cả quý Thầy Cô đã giảng dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt quá trình học tập của mình.

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Trong suốt quá trình học tập, rèn luyện tại Trường Đại học Cần Thơ cùng với quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, dưới sự quan tâm, giúp đỡ và tận tình chỉ dẫn từ quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè, em đã học hỏi được rất nhiều kiến thức từ sách vỡ, cũng như kinh nghiệm thực tiễn rất bổ ích cho bản thân. Để có được thành quả như ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:

N

LỜI CẢM ƠN ----

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân đã yêu thương, chăm sóc và hỗ trợ con trong suốt quãng thời gian học tập, là chỗ dựa tinh thần cho con vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống, tạo mọi điều kiện để con hoàn thành chương trình học của mình. Cám ơn bạn bè và mọi người xung quanh đã luôn đồng hành, chia sẽ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.

i Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Ơ https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

Từ khóa: amino acid, thức ăn chăn nuôi, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), tạo dẫn xuất tiền cột với OPA.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Để đảm bảo sự cân bằng giữa các amino acid trong sản phẩm thức ăn chăn nuôi cần tiến hành phân tích xác định hàm lượng các amino acid bằng các phương pháp hiện đại có độ chính xác cao , đề tài tiến hành phân tích định lượng lysine, methionine và threonine là các amino acid thiết yếu thường được phối trộn trong thức ăn chăn nuôi nhằm tăng tốc độ sinh trưởng và năng suất sản xuất của vật nuôi, phương pháp ứng dụng phân tích bằng máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). Mẫu thức ăn chăn nuôi được thủy phân với dung dịch HCl 6M (103◦C trong 24 giờ) và tạo dẫn xuất tiền cột với ortho-phthaladehyde với sự có mặt của tác chất 3-mercaptopropanoic acid tạo thành hợp chất có khả năng phát huỳnh quang mạnh, quá trình tạo dẫn xuất tiền cột được tự động hóa với thiết bị bơm và lấy mẫu tự động (autosampler), sự phân tách được thực hiện trên cột Agilent Zorbax EclipseAAA (4,6 150 mm, 5 m) và được phát hiện bằng detector DAD ở bước sóng ( 338nm.

Phương pháp phân tích có độ chọn lọc cao (sự sai khác về thời gian lưu trên mẫu thử và mẫu chuẩn nhỏ hơn 4 %), khoảng tuyến tính rộng (3 - 150 ppm, R2 > 0,995), phương pháp có độ chụm đạt (RSD = 2,6 % với lysine, 2,5 % với methionine, 0,8 % với threonine ). Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp (Lysine: LOD = 1,131 ppm; LOQ = 3,392 ppm, Methionine: LOD = 1,343 ppm; LOQ = 4,029 ppm, Threonine: LOD = 1,593 ppm; LOQ = 4,779 ppm). Kết quả phân tích độ đúng trên mẫu thử có kết quả khá chính xác với độ lệch chuẩn tương đối của mẫu nguyên liệu lysine đạt (RSD = 1,03 %), độ chệch (bias) đạt -1,43 %. Kết quả phân tích thu được hàm lượng phù hợp với tỉ lệ phối trộn trong thức ăn chăn nuôi với hàm lượng lysine khoảng 0,53 – 1,89 %, methionine 0,25 – 0,52 % và threonine 0,32 – 1,44 %.

N

TÓM TẮT

ii Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... i

N

H

DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... vii

Ơ

DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ vi

N

TÓM TẮT .......................................................................................................... ii

U

Y

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... viii

G

1.2 Mục tiêu nghiên cứu................................................................................. 3

H Ư

N

1.3 Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 3

TR ẦN

CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................... 4 2.1 Khái quát về amino acid........................................................................... 4

B

2.1.1 Giới thiệu chung về amino acid ........................................................ 4

10 00

2.1.2 Phân loại amino acid ......................................................................... 4 2.1.3 Tính chất vật lý .................................................................................. 8

Ó

A

2.1.4 Tính chất hóa học .............................................................................. 9

-H

2.2 Lysine ..................................................................................................... 11

Ý

2.2.1 Giới thiệu về lysine ......................................................................... 11

-L

2.2.2 Tác dụng của Lysine........................................................................ 12

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

2.3 Methionine ............................................................................................ 13 2.3.1 Giới thiệu về Methionine................................................................. 13

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................ 2

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Đ ẠO

CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU .............................................................................. 2

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

DANH MỤC ĐƠN VỊ VIẾT TẮT ................................................................... ix

2.3.2 Tác dụng của methionine ................................................................ 13

2.4 Threonine ............................................................................................... 14 2.4.1 Giới thiệu về threonine .................................................................... 14 2.4.2 Tác dụng của threonine ................................................................... 15 2.5 Một số phương pháp định lượng amino acid ......................................... 15 2.5.1 Phương pháp sắc ký giấy................................................................. 15 2.5.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng ........................................................ 17 2.5.3 Phương pháp sắc ký khí .................................................................. 17 iii

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

2.5.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ........................... 17 2.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .................................. 18 2.6.1 Khái niệm ........................................................................................ 18

N

H

2.6.4 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .................................. 20

Ơ

2.6.3 Phân loại .......................................................................................... 19

N

2.6.2 Nguyên lí hoạt động và tách sắc ký................................................. 18

Y

2.7 Tạo dẫn xuất amino acid ổn định ........................................................... 22

G

3.1.1 Địa điểm thí nghiệm ........................................................................ 25

H Ư

N

3.1.2 Thời gian tiến hành thí nghiệm ....................................................... 25 3.1.3 Thiết bị và dụng cụ .......................................................................... 25

TR ẦN

3.1.4 Hóa chất ........................................................................................... 25 3.1.5 Đối tượng thí nghiệm ...................................................................... 26

B

3.2 Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 26

10 00

3.2.1 Chuẩn bị mẫu................................................................................... 26 3.2.2 Khảo sát thời gian lưu ..................................................................... 26

Ó

A

3.2.3 Xây dựng đường chuẩn dựa trên khoảng tuyến tính ....................... 27

-H

3.2.4 Khảo sát giới hạn phát hiện ............................................................. 29

Ý

3.2.5 Khảo sát giới hạn định lượng ......................................................... 30

-L

3.2.6 Độ chính xác (độ chụm và độ đúng) ............................................... 31

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

3.3 Thực nghiệm .......................................................................................... 36 3.3.1 Quy trình xử lý mẫu và phân tích trên HPLC ................................. 36 3.3.2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, pha động và dung dịch phân tích .. 36

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

3.1 Địa điểm phòng thí nghiệm .................................................................... 25

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Đ ẠO

CHƢƠNG 3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM .... 25

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

2.8 Thủy phân protein .................................................................................. 23

3.3.3 Điều kiện chạy máy HPLC .............................................................. 39 3.3.4 Thí nghiệm khảo sát thời gian lưu của mẫu chuẩn lysine, methionine và threonine .............................................................................................. 40 3.3.5 Xây dựng đường chuẩn ................................................................... 40 3.3.6 Xác định giới hạn phát hiện............................................................. 40 3.3.7 Xác định giới hạn định lượng ......................................................... 40 3.3.8 Thí nghiệm khảo sát độ chính xác của phương pháp ...................... 40 iv

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

3.3.9 Tiến hành thí nghiệm trên mẫu ....................................................... 41 3.3.10 Công thức tính toán kết quả .......................................................... 41

N

H

4.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn ............................................................. 42

Ơ

4.1 Kết quả khảo sát thời gian lưu ............................................................... 42

N

CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 42

Y

4.3 Giới hạn phát hiện .................................................................................. 44

TP

4.5 Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp ................................... 44

H Ư

N

G

4.6 Kết quả tiến hành trên mẫu thử .............................................................. 46 CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................. 48

TR ẦN

4.1 Kết luận .................................................................................................. 48

B

4.2 Kiến nghị ................................................................................................ 49

10 00

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 50

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

PHỤ LỤC........................................................................................................ 51

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

4.5.2 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp ................................... 45

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Đ ẠO

4.5.1 Kết quả khảo sát độ chụm của phương pháp................................... 44

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

4.4 Giới hạn định lượng ............................................................................... 44

v Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các amino acid thường gặp ............................................................... 7

Ơ

H

Bảng 3.2 Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC) ....... 35

N

Bảng 3.1 Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) .......................................................................................................................... 33

N

Bảng 3.3 Quy định về độ thu hồi của Hội đồng châu Âu ............................... 35

TP

Bảng 4.1 Thời gian lưu của mẫu chuẩn của 3 loại amino acid ....................... 42

N

G

Bảng 4.4 RSD (%) của hàm lượng lysine trong thức ăn chăn nuôi ................ 45

H Ư

Bảng 4.5 RSD (%) của hàm lượng threonine trong thức ăn chăn nuôi ........... 45

TR ẦN

Bảng 4.6 Hàm lượng lysine trong mẫu nguyên liệu........................................ 45 Bảng 4.7 Độ chệch của phương pháp dựa trên độ chệch của hàm lượng mẫu nguyên liệu ....................................................................................................... 46

10 00

B

Bảng 4.8 Kết quả phân tích hàm lượng lysine, methionine, threonine trong thức ăn chăn nuôi ............................................................................................. 46

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

Bảng 4.9 Kết quả phân tích hàm lượng mẫu nguyên liệu lysine .................... 47

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

Bảng 4.3 RSD (%) của hàm lượng methionine trong thức ăn chăn nuôi ........ 44

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Đ ẠO

Bảng 4.2 Phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan tuyến tính ............ 42

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

Bảng 3.5 Xây dựng dãy chuẩn lysine, methionine và threonine ..................... 40

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

Bảng 3.4 Điều kiện điều chỉnh máy HPLC trong quá trình phân tích ............ 39

vi Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Công thức cấu tạo chung của amino acid .......................................... 4 Hình 2.2 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm I ......................................... 5

Ơ

H

Hình 2.4 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm III ...................................... 6

N

Hình 2.3 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm II ........................................ 5

N

Hình 2.5 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm IV ...................................... 6

.Q

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

TP

Hình 2.8 Công thức dạng chuyển hóa lưỡng cực của phân tử amino acid ....... 9

G

Hình 2.11 Phản ứng màu Biure ....................................................................... 11

H Ư

N

Hình 2.12 Phản ứng oxi hóa của cystein ......................................................... 11 Hình 2.13 Công thức các dạng đồng phân lập thể của lysine ......................... 12

TR ẦN

Hình 2.14 Công thức các dạng đồng phân lập thể của methionine ................. 13 Hình 2.15 Công thức các dạng đồng phân lập thể của threonine .................. 14

B

Hình 2.16 Mô tả sắc ký giấy đi lên ................................................................. 16

10 00

Hình 2.17 Sơ đồ bể sắc ký giấy một chiều đi lên ............................................ 16 Hình 2.18 Hệ thống máy sắc ký HPLC tại các phòng thí nghiệm .................. 18

Ó

A

Hình 2.19 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC ........................................................ 20

-H

Hình 2.20 Công thức cấu tạo của OPA ........................................................... 22

Ý

Hình 2.21 Phương trình tạo dẫn xuất với thuốc thử OPA............................... 23

-L

Hình 3.1 Thời gian lưu trên sắc ký đồ ............................................................ 27

ÁN

Hình 3.2 Khoảng tuyến tính và khoảng làm việc............................................ 28 Hình 3.3 Minh họa tỉ lệ tín hiệu chia cho nhiễu.............................................. 30

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

Hình 2.10 Phản ứng Sorensen ......................................................................... 10

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Đ ẠO

Hình 2.9 Phản ứng tạo phức với ninhydrin của amino acid............................ 10

TO

http://daykemquynhon.ucoz.com

Hình 2.7 Đồng phân lập thể của amino acid ..................................................... 9

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U

Y

Hình 2.6 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm V ....................................... 6

Hình 4.1 Đồ thị phương trình đường chuẩn của lysine ................................... 42 Hình 4.2 Đồ thị phương trình đường chuẩn của methionine .......................... 43 Hình 4.3 Đồ thị phương trình đường chuẩn của threonine ............................. 43

D

IỄ N

Đ

ÀN

Hình 3.4 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu và phân tích amino acid trên HPLC ...... 36

vii Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

2 – Mercaptoethanol

3-MPA

3 – Mercaptopropanoic acid

ACN

Acetonitrile

AOAC

Association of analytical comunities

AQC

6-Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate

HPLC

High perfomance liquid chromatography

LOD

Limit of detection

LOQ

Limit of quantitation

Lys

Lysine

mAu

Milli absorbance units

MeOH

Methanol

Met

Methionine

Min

Minute

NRC

National Reasearch Council

OPA

ortho-Phthaladehyde

pI

Isoelectric point

Ơ H N Y

ÁN

Sắc ký phân bố Sắc ký pha đảo

SKPT

Sắc ký pha thường

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

Thr

Threonine

USFDA

United States Food and Drug Administration

TO

D

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

Signal to Noise

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP Đ ẠO G N

H Ư

Relative standard deviation

SKPB

SKPĐ

ÀN

.Q

U

-L

Ý

S/N

Đ

TR ẦN

B

10 00

A -H

RSD

IỄ N

N

2-ME

Ó

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

viii Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

ÀN

Đ

A

Ó

-H B

10 00 TR ẦN

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

G

Microliter

N

H Ư

mg Milligram

mL Milliliter

ppb parts per billion

ppm parts per million

Microgram

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

Ơ

N

Liter

H

L

N

Kilogram

Y

Kg

U

gram

.Q

g

TP

Celcius degree

Đ ẠO

C

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Ý

-L

◦

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÁN

TO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

DANH MỤC ĐƠN VỊ VIẾT TẮT

ix

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU

D

Ơ https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Hiện nay, chăn nuôi đóng vai trò quan trọng trong nền nông nghiệp hiện đại ở nước ta. Trong năm 2014, ngành chăn nuôi đạt 24,5% trong tổng giá trị sản xuất nông nghiệp, là một trong hai nguồn cung cấp lương thực – thực phẩm chủ yếu cho đời sống người dân bên cạnh ngành trồng trọt. Chăn nuôi cũng là một mắt xích quan trọng trong sản xuất nông nghiệp bền vững, góp phần tạo việc làm, tăng thu nhập cho người dân. Như chúng ta đã biết, ngành chăn nuôi là nguồn cung cấp thực phẩm chủ yếu cho con người, các sản phẩm chăn nuôi có giá trị dinh dưỡng cao, cung cấp protein và có hàm lượng cao hơn các thức ăn có nguồn gốc thực vật. Vì vậy, thực phẩm từ chăn nuôi có giá trị dinh dưỡng cao đối với đời sống con người. Để đáp ứng nhu cầu đó, đối với ngành chăn nuôi ngoài yếu tố cần có chất lượng con giống tốt, chúng ta cũng cần đảm bảo các yếu tố dinh dưỡng cho vật nuôi bằng việc cung cấp đầy đủ thức ăn và cân bằng giữa các yếu tố dinh dưỡng. Thị trường thức ăn chăn nuôi hiện nay ở nước ta rất đa dạng, các nhà sản xuất đã nghiên cứu và phát triển ra những dòng sản phẩm thức ăn chăn nuôi bổ sung đầy đủ các thành phần như: protein, amino acid, carbohydrate và các thành phần quan trọng khác như: vitamin, khoáng đa lượng và vi lượng,... Trong đó, việc bổ sung và cân đối hàm lượng amino acid là rất quan trọng. Vì amino acid là nhân tố không thể thiếu trong thức ăn chăn nuôi, nó giữ vai trò quan trọng đối với cơ thể gia súc, gia cầm. Thêm vào đó, amino acid là một trong những dưỡng chất quan trọng trong quá trình sinh trưởng, tạo ra sản phẩm và nâng cao hiệu quả, hiệu suất sử dụng thức ăn của vật nuôi, giúp nâng cao tốc độ tăng trưởng và chất lượng thịt của gia súc, gia cầm mà không dùng đến các chất kích thích tăng trọng họ β – agonist bị cấm sử dụng trong chăn nuôi. Đối với gia súc và gia cầm, các loại amino acid đặc biệt quan trọng cần cung cấp hằng ngày gồm: methionine, lysine, threonine. Trong đó, methionine, lysine, threonine là các loại amino acid thiết yếu mà cơ thể động vật không thể tự tổng hợp được, phải lấy từ thức ăn bên ngoài. Do vậy, cần cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng và amino acid trong khẩu phần ăn theo đúng nhu cầu cho từng loại vật nuôi nhằm tăng khả năng sinh trưởng, phát triển và chất lượng thịt của gia súc và gia cầm.

N

1.1 Đặt vấn đề

Để xác định hàm lượng và đảm bảo cân bằng tỉ lệ các thành phần dinh dưỡng nói chung và amino acid nói riêng, bằng các phương pháp phân tích hóa học hiện đại, ta có thể định lượng và đánh giá thành phần các amino acid trong thức ăn chăn nuôi một cách dễ dàng mà vô cùng chính xác.

2 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

Ó

A

10 00

Phân tích định lượng: Xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lệch chuẩn (RSD), độ chính xác của phương pháp.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Tiến hành phân tích định lượng lysine, methionine, threonine trên mẫu thức ăn chăn nuôi tại địa bàn Thành phố Cần Thơ.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

B

Phân tích định tính: lysine, methionine, threonine dựa vào thời gian lưu của mẫu chuẩn và mẫu thử từ kết quả phân tích trên HPLC.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

1.3 Nội dung nghiên cứu

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ ẠO

- Tìm điều kiện tối ưu về quy trình xử lý mẫu, quy trình định lượng lysine, methionine, threonine trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

- Áp dụng và ổn định phương pháp phân tích amino acid trong thức ăn chăn nuôi từ đó đánh giá được chất lượng một số loại thức ăn chăn nuôi được bán trên thị trường ở thành phố Cần Thơ.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U TP

.Q

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

Y

N

H

Do vậy, đề tài “Xác định hàm lƣợng lysine, methionine và threonine trong thức ăn chăn nuôi bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” nhằm khảo sát quy trình định lượng các loại amino acid nói chung và lysine, methionine, threonine nói riêng, góp phần xác định thành phần dinh dưỡng và đánh giá chất lượng các sản phẩm thức ăn chăn nuôi bằng một phương pháp phổ biến, có độ chính xác cao và giới hạn phát hiện thấp. Từ đó, có thể ứng dụng vào thực tiễn để làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về nhu cầu protein, amino acid của người và động vật, cũng như góp phần làm hoàn thiện các phương pháp phân tích protein.

N

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

3 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát về amino acid

Ó

A

2.1.2 Phân loại amino acid [1]

-L

Ý

-H

Có nhiều cách để phân loại amino acid, mỗi loại đều có ý nghĩa và mục đích riêng. Tuy nhiên, có thể phân loại amino acid một cách chung nhất theo hai quan điểm: quan điểm hóa học và quan điểm sinh vật học.

ÁN TO ÀN Đ

IỄ N D

- Quan điểm hóa học (xét về cấu tạo phân tử, hóa tính): có thể chia amino acid ra thành các nhóm.  Amino acid mạch thẳng: Dựa vào số lượng nhóm –NH2 và –COOH mà lại chia ra thành:  Acid monoamine – monocarboxylic (amino acid chứa 1 nhóm – NH2 và 1 nhóm –COOH).  Acid monoamine – dicarboxylic (amino acid chứa 1 nhóm –NH2 và 2 nhóm –COOH).  Diamine – monocarboxylic (amino acid chứa 2 nhóm –COOH và 1 nhóm –NH2).  Amino acid mạch vòng: gồm 2 loại đồng vòng và dị vòng.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

10 00

B

Trong tự nhiên có khoảng 150 loại amino acid khác nhau nhưng chỉ có 20 loại trong số chúng tham gia cấu tạo nên phân tử protein. Hầu hết các protein khi thủy phân đều thu được dưới dạng L-α-amino acid. Như vậy các amino acid chỉ khác nhau ở mạch nhánh hay còn gọi là chuỗi bên (Kí hiệu: R).

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TR ẦN

Hình 2.1 Công thức cấu tạo chung của amino acid

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

H Ư

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein, hormone và enzyme,…là hợp chất hữu cơ mà trong phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxylic (–COOH) và một nhóm amine (–NH2) trừ proline chỉ có nhóm NH (được gọi là imino acid). Trong phân tử amino acid đều có các nhóm –NH2 và –COOH gắn với carbon ở vị trí .

Ơ

N

2.1.1 Giới thiệu chung về amino acid

4 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

Hình 2.3 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm II

 Nhóm III. Gồm 5 amino acid có gốc R phân cực, không tích điện: serine, threonine, aspargine, cystein, glutamine.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

 Nhóm II. Gồm 3 amino acid có R là nhân thơm: phenylalanine, tyrosine, tryptophan.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TR ẦN

Hình 2.2 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm I

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q H Ư

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Ngoài ra, dựa vào tính chất của gốc R người ta còn phân loại amino acid thành 5 nhóm: nhóm không phân cực (nhóm kỵ nước), nhóm phân cực nhưng không tích điện, nhóm tích điện dương, nhóm tích điện âm và nhóm R là nhân thơm.  Nhóm I. Gồm 7 amino acid có gốc R không phân cực kỵ nước: glycine, alanine, proline, leucine, isoleucine, valine, methionine.

N

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

5 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Ý

Hình 2.5 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm IV

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

 Nhóm V. Gồm 2 amino acid có gốc R tích điện âm: aspartate, glutamate.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

 Nhóm IV. Gồm 3 amino acid có gốc R tích điện dương: lysine, histindine, arginine.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Đ ẠO

Hình 2.4 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm III

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Ơ

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Hình 2.6 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm V - Quan điểm sinh vật học (xét về tầm quan trọng đối với dinh dưỡng động vật) được chia thành 2 loại: 

Amino acid không thay thế được hay còn gọi là amino acid thiết yếu: đây là amino acid rất cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cơ thể 6

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

động vật. Cơ thể động vật không thể tự tổng hợp được loại amino acid này mà phải bổ sung vào cơ thể hằng ngày bằng thức ăn.

Ơ

Tên amino acid

Glycine Alanine Proline Valine Leucine Isoleucine Methionine

Tên amino acid gọi theo danh pháp hoá học

-aminoacetic -aminoprpionic -pirolidincarboxylic -aminoiaovaleric -aminonoisocaproic -amino--metylvaleric -amino--metyltiobutiric

Tên Khối Ký viết lượng hiệu tắt (M) Gly Ala Pro Val Leu Ile Met

G A P V L I M

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

G

N

H Ư

TR ẦN

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

Ngoài các amino acid thường gặp ở trên, trong phân tử protein còn có một số amino acid khác, đó là những loại ít gặp. Các amino acid này là dẫn xuất của những amino acid thường gặp như: trong phân tử colagen có chứa 4 – hydrogenxyproline là dẫn xuất của proline, 5 – hydrogenxylysine là dẫn xuất của lysine... Mặt khác, mặc dù không có trong cấu trúc protein, nhưng có rất nhiều loại amino acid khác thể tồn tại ở dạng tự do hoặc liên kết với hợp chất khác trong các mô và tế bào, chúng có thể là chất tiền thân hay là các sản phẩm trung gian của quá trình chuyển hoá trong cơ thể sinh vật.

Bảng 2.1 Các amino acid thường gặp

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U

Đ ẠO

TP

Amino acid thay thế được hay còn gọi là amino acid không thiết yếu: là amino acid mà cơ thể động vật có thể tự tổng hợp được từ các nguyên liệu sẵn có. Nhóm này gồm các amino acid còn lại.

Theo nhiều nghiên cứu, tuy tyrosine và cystein là các amino acid không thiết yếu cơ thể có thể tổng hợp được nhưng với điều kiện phải có phenylalanine cơ thể mới có thể tổng hợp được tyrosine và phải có methionine mới tổng hợp được cystein. Do vậy, nếu trong khẩu phần ăn của người và động vật nếu không bổ sung đầy đủ phenylalanine và methionine sẽ dẫn đến thiếu hụt tyrosine và cystein.

IỄ N D

.Q



Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

Y

N

H

 Đối với trẻ em, do quá trình sinh tổng hợp trong cơ thể chưa hoàn chỉnh nên ngoài 8 amino acid thiết yếu trên còn cần thêm 2 amino acid là arginine và histidine.

N

 Đối với người trưởng thành có 8 loại amino acid thiết yếu: lysine, valine, methionine, threonine, tryptophan, leucine, isoleucine, phenylalanine.

75 89 115 117 131 131 149

7 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

Ơ

121 132 146 146 155 174 133 147

H

C B Q K H R D E

Ý

Tính tan trong nước:

TO

ÁN

-L

Các amino acid thường dễ tan trong nước, khó tan trong alcohol và ether (trừ proline và hydrogenxyproline). Chúng cũng dễ hòa tan trong acid và kiềm loãng (trừ tyrosine).

D

IỄ N

Đ

ÀN

Tính quang học

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

10 00

-H

Ó

A

Các amino acid thường không màu, nhiều loại có vị ngọt kiểu đường như glycine, alanine, valine, serine, histidine, tryptophan; một số loại có vị đắng như isoleucine, arginine hoặc không có vị như leucine. Bột ngọt hay còn gọi là mì chính là muối của natri với acid glutamic (monosodium glutamate).

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

U

Y

N

204 105 119

B

Màu sắc và mùi vị:

W S T

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

2.1.3 Tính chất vật lý [1]

165 181

TR ẦN

H Ư

N

G

amide của aspartate amide của glutamate , diaminocaproic -amino--imidazolpropionic -amino--guanidinvaleric -aminosucinic -aminoglutarate

Cys Asn Gln Lys His Arg Asp Glu

F Y

Đ ẠO

-amino--tiopropionic

Cysteine Aspargine Glutamine Lysine Histidine Arginine Aspartate Glutamate

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

Phenylalanine -amino--phenylpropionic Phe Tyrosine Tyr -amino-hydrogengenxyphenylpropionic -amino--idolylpropionic Tryptophan Trp -amino--hydoxypropionic Serine Ser -amino-Threonine Thr hydrogengenxybutiric

N

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

TP

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Các amino acid trong phân tử protein đều có ít nhất một carbon bất đối (trừ glycine) vì thế nó đều có biểu hiện hoạt tính quang học, nghĩa là có thể làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực sang phải hoặc sang trái. Quay phải được ký hiệu bằng dấu (+), quay trái được ký hiệu bằng dấu (-). Góc quay đặc hiệu của amino acid phụ thuộc vào pH của môi trường. Tuỳ theo sự sắp xếp trong cấu trúc phân tử của các nhóm liên kết với carbon bất đối mà các amino acid có cấu trúc dạng D hay L (Hình 2.7) gọi là đồng phân lập thể. Số đồng phân lập thể được tính theo 2n (n là số carbon bất đối).

8

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

2.1.4 Tính chất hóa học [2]

A

Amino acid có tính lưỡng tính

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

Do trong phân tử có cả nhóm amino (–NH2) và nhóm carboxylic (–COOH) vừa có khả năng nhận proton (H+) thể hiện tính base, vừa có khả năng nhường proton thể hiện tính acid.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

N

10 00

B

TR ẦN

H Ư

Hầu hết các amino acid khác hấp thụ tia cực tím ở bước sóng ( ) khoảng từ 220 - 280 nm. Đặc biệt cùng nồng độ 10-3 M, trong bước sóng khoảng 280 nm tryptophan hấp thụ ánh sáng cực tím mạnh nhất, gấp 4 lần khả năng hấp thụ của tyrosine và phenylalanine là yếu nhất. Phần lớn các protein đều chứa tyrosine nên người ta sử dụng tính chất này để định lượng protein.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

acid D-Amino acid Hình 2.7 Đồng phân lập thể của amino acid

G

L-Amino

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Ơ

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Dạng ion lƣỡng cực

Dạng phân tử

Hình 2.8 Công thức dạng chuyển hóa lưỡng cực của phân tử amino acid

9 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Phản ứng với ninhydrin

H

Ơ

N

Khi đun nóng amino acid với ninhydrin tạo phức màu xanh tím (trừ proline cho màu vàng).Các nhà phân tích cũng lợi dụng tính chất này để định lượng amino acid bằng cách định lượng khí NH3, CO2 hoặc aldehyde vừa tạo thành từ phản ứng.

N

G

Phản ứng Sanger

TR ẦN

H Ư

Đây là một phương pháp phổ biến nhất được ứng dụng để xác định amino acid trong mạch polypeptide từ đầu N.

-H

Ó

A

10 00

B

Khi nghiên cứu tính chất hóa học của amino acid ta phát hiện ra rằng nhóm α– amine có khả năng trùng hợp với dinitrobenzene. Trong mạch chỉ có một nhóm α– amine tự do ở đầu N, khi trùng hợp sẽ tạo thành dinitropheny – polypeptide. Liên kết này rất bền, do đó khi dùng HCl thủy phân protein sẽ giải phóng ra tất cả các amino acid tự do cùng với amino acid liên kết với dinitrobenzene dưới dạng dinitrophenyl – amino acid. Sau đó, với phương pháp sắc ký ta có thể định danh amino acid đó.

Amino acid

Formalin

Hợp chất vinyl của amino acid

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

Phản ứng Sorensen (phản ứng với aldehyde formic – formalin)

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

Đ ẠO

Hình 2.9 Phản ứng tạo phức với ninhydrin của amino acid

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Phức xanh tím

2 x ninhydrin

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

Amino acids

Hình 2.10 Phản ứng Sorensen Ứng dụng: bằng cách chuẩn độ với dung dịch kiềm tiêu chuẩn người ta có thể định lượng được hàm lượng các amino acid có trong dung dịch.

10 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

H

N

Phức Biure có màu đỏ tím

Ơ

N

Phản ứng với kim loại nặng

Y

Hình 2.11 Phản ứng màu Biure

-

Hình 2.12 Phản ứng oxi hóa của cystein

2.2 Lysine [3]

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

B 10 00 Ý

-H

Ó

A

Khử

-L ÁN TO ÀN Đ

IỄ N D

Oxy hóa

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ ẠO

Ngoài ra, do các amino acid có cấu tạo gốc R khác nhau, nên người ta có thể dùng để xác định từng amino acid riêng rẽ nhờ phản ứng đặc trưng của nó, ví dụ phản ứng oxy hoá khử do nhóm –SH của cysteine, phản ứng tạo muối do các nhóm –COOH hay –NH2 của glutamte hay lysine, phản ứng tạo ester do nhóm OH của tyrosine...

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Các amino acid có khả năng phản ứng với các kim loại nặng, tạo thành hợp chất phức nội phân tử với các muối của kim loại đó, đặc biệt là với ion Cu2+, phản ứng tạo thành phức chất Biure có màu đỏ tím.

2.2.1 Giới thiệu về lysine Lysine (viết tắt là Lys hoặc K). Tên khoa học: 2,6-diaminohexanoic acid.

Lysine là một α-amino acid chứa hai nhóm –NH2 và một nhóm –COOH với công thức phân tử: C6H14N2O2.

Công thức hóa học: HOOCCH(NH2)(CH2)4NH2.

Nó là một amino acid thiết yếu, cơ thể không thể tự tổng hợp được.

Trong cấu tạo phân tử có chứa một carbon bất đối xứng nên chúng có hai dạng đồng phân quang học: D-Lysine và L-Lysine. Hai đồng phân này có 11

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Khối lượng phân tử: 146,189 g/mol

-

Nhiệt độ nóng chảy (T◦nc): 224◦C.

-

Lysine là một amino acid thuộc họ aspartate, được tổng hợp qua con đường trao đổi chất phân nhánh. Qua con đường này còn có methionine, threonine, isoleucine cũng được tạo thành.

-

Lysine tồn tại ở dạng rắn và tinh thể trong điều kiện bình thường, bị phân hủy ở 200-300◦C, có màu tím xanh khi tương tác với ninhydrine.

-

Lysine có nhiều trong trứng, thịt, sữa, cá, đậu nành… nhưng dễ bị phá huỷ trong quá trình chế biến, nấu nướng thức ăn.

G N H Ư

TR ẦN

B

10 00

A

Ó

Đ

ÀN

TO

-H

ÁN

-L

Ý

-

2.2.2 Tác dụng của Lysine Lysine là một amino acid rất cần cho hoạt động sống của người và động vật. Nghĩa là cơ thể không tự tổng hợp được nó, phải lấy từ nguồn thức ăn bên ngoài (chúng thuộc loại amino acid thiết yếu). Lysine giữ vai trò sống còn trong sự tổng hợp protein. Nó là chìa khoá trong việc sản xuất các enzyme, hormone và các kháng thể giúp cơ thể tăng cường sức đề kháng và chống trả với bệnh tật, đặc biệt ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh.

Lysine cần thiết cho sự phát triển xương của trẻ, hỗ trợ sự hấp thụ calci, duy trì sự cân bằng nitơ trong cơ thể.

Lysine giúp ăn ngon miệng, gia tăng chuyển hoá và hấp thu tối đa chất dinh dưỡng và phát triển chiều cao.

Cơ thể người và động vật thiếu lysine cơ thể sẽ khó hoạt động bình thường, đặc biệt ở động vật còn non và trẻ em sẽ xảy ra hiện tượng chậm lớn, trí tuệ phát triển kém, dễ thiếu men tiêu hoá và nội tiết tố. Chính vì

-

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

-

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

Điểm đẳng điện ở pI = 9,74

Đ ẠO

-

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

Hình 2.13 Công thức các dạng đồng phân lập thể của lysine

IỄ N D

D-Lysine

.Q

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

L-Lysine

U

Y

N

H

Ơ

N

tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái làm tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác nhau và cơ thể sinh vật chỉ hấp thu được dạng L-Lysine.

12 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

thế lysine là một loại amino acid thường được thêm vào khẩu phần ăn của trẻ em và của gia súc.

Ơ

Y

TO ÀN Đ

IỄ N D

-

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

-L

Ý

-H

Điểm đẳng điện: pI = 5,74 Khối lượng phân tử: 149,21 g/mol Nhiệt độ nóng chảy (T◦nc): 281◦C Khối lượng riêng: 1,34 g/cm3 Độ tan: 3,3 g/100 g nước Do là một amino acid thiết yếu, methionine không được tổng hợp "mới" trong cơ thể người và động vật, mà phải được lấy từ thức ăn bên ngoài. Ở các loài thực vật và vi sinh vật, methionine được tổng hợp từ acid aspartic và cysteine.

ÁN

-

Ó

A

Hình 2.14 Công thức các dạng đồng phân lập thể của methionine

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U

.Q

N

10 00

B

TR ẦN

H Ư

-

G

Đ ẠO

TP

-

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

-

N

H

-

2.3.1 Giới thiệu về Methionine Methionine (viết tắt là Met hay M). Tên khoa học: 2-amino-4(methylthio)butanoic acid.

Methionine là một -amino acid chứa lưu huỳnh. Có công thức phân tử: C5H11NO2S. Công thức cấu tạo: H3CS(CH2)2CH(NH2)COOH. Methionine là một trong 2 amino acid chứa lưu huỳnh (amino acid còn lại là cystein). Nguyên tử lưu huỳnh trong Methionine không có tính thân hạch mạnh mặc dù nó có thể phản ứng với một vài trung tâm thân điện tử. Methionine thường không tham gia vào liên kết hóa học ở trung tâm hoạt động của enzyme.

Methionine có nhiều trong thịt gà, thịt bò, trứng, cá, tỏi, yogurt và các loại đậu.

N

2.3 Methionine [4]

2.3.2 Tác dụng của methionine Khi là một amino acid tự do, methionine đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa của cơ thể. Nó có thể tạo S-Adenosyl-LMethionine (SAM), một chất cho methyl trong các phản ứng.

Methionine cũng được cho là làm giảm hàm lượng chất béo trong cơ thể, giảm nồng độ cholesterol trong máu, giúp giải phóng chất độc trong gan,

13 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

N https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Đ ẠO

G

N

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

-

H Ư

-

TR ẦN

-

2.4.1 Giới thiệu về threonine Threonine (viết tắt Thr hoặc T). Tên khoa học: 2-amino-3hydroxybutanoic acid.

Threonine là một amino acid thiết yếu. Công thức phân tử: C4H9NO3 Công thức cấu tạo: HOOCCH(NH2)CH(OH)CH3. Ở nhiệt độ thường, threonine tồn tại ở dạng tinh thể không màu.

Threonine là một amino acid phân cực, ưa nước và phân tử ái điện tử.

Threonine có chứa nhóm –OH (alcohol). Cả carbon ở vị trí và đều có hoạt tính mạnh.

Threonin là một trong hai trên hai mươi axit amin sinh protein có hai tâm đối xứng. Threonin có thể tồn tại dưới bốn dạng đồng phân lập thể với các cấu hình sau: (2S,3R), (2R,3S), (2S,3S) và (2R,3R). L-Threonin được dùng để chỉ đồng phân không đối quang (2S,3R)-2-amino-3hydroxybutanoic acid. Đồng phân lập thể thứ hai (2S,3S) hiếm khi có mặt trong tự nhiên, được gọi là L-allo-threonin. Hai đồng phân lập thể (2R,3S)- và (2R,3R)-2-amino-3-hydroxybutanoic aicd có vai trò không đáng kể.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U TP

.Q

2.4 Threonine [4]

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

Y

-

H

-

bảo vệ đặc hiệu tế bào gan, ngăn ngừa tế bào gan thoái hóa mỡ, cần thiết trong việc tổng hợp ADN và ARN. Methionine tăng cường tổng hợp glutathion và được sử dụng thay thế cho acetylcysteine để điều trị ngộ độc paracetamol.

Methionine cũng là một chất chống oxi hóa mạnh, có thể khử hoạt tính của gốc tự do. Ngoài ra, do trong phân tử có chứa lưu huỳnh nên nó có thể chống lại các bệnh lở da, tóc và móng.

Tuy nhiên ở những người đã bị suy gan, methionine có thể làm cho tổn thương gan nặng.

N

-

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Hình 2.15 Công thức các dạng đồng phân lập thể của threonine 14 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

2.4.2 Tác dụng của threonine Threonine có vai trò quan trọng trong việc duy trì hoạt động bình thường của hệ thống sinh học của cơ thể khác nhau như hệ thống thần kinh trung ương, hệ tim mạch, gan và hệ miễn dịch.

Nó cần thiết để giúp duy trì sự cân bằng protein thích hợp trong cơ thể, cũng như hỗ trợ trong việc hình thành collagen và elastin trong da.

Threonine cũng tham gia vào hoạt động của gan (bao gồm cả ngăn cản gan nhiễm mỡ), chức năng lipotropic khi kết hợp với aspartic acid và methionine, cũng như hỗ trợ các hệ thống miễn dịch bằng cách giúp sản xuất kháng thể và thúc đẩy tăng trưởng và hoạt động tuyến ức.

Chất dinh dưỡng khác cũng được hấp thu tốt hơn khi threonine hiện diện, và nó cũng đã được sử dụng như là một phần của điều trị sức khỏe tâm thần.

Threonine cũng được xác nhận trong việc hỗ trợ sự hình thành kháng thể và những thành phần chính của hệ thống miễn dịch của cơ thể. Tạo ra những kháng thể chống lại các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm trùng ngoài da.

Bổ sung threonine cho cơ thể giúp ích cho việc điều trị các bệnh do tổn thương hệ thần kinh trung ương. Nhiều triệu chứng xơ cứng teo cơ cũng được khắc phục bởi loại amino acid này.

Tuy nhiên, liều cao threonine khi dùng có thể gây tổn thương chức năng gan và thận.

N

Điểm đẳng điện: pI = 5,6.

Khối lượng phân tử: 119,12 g/mol.

Nhiệt độ nóng chảy: 256◦C. Độ tan: 20,5 g/100 g nước.

Threonine có nhiều trong thịt, các sản phẩm từ sữa, trứng, có ít hơn trong ngô, ngũ cốc, mầm lúa mì, các loại đậu, đậu phộng, các loại hạt và rau.

Y

Đ

ÀN

TO

ÁN

Có nhiều phương pháp định lượng amino acid ứng dụng nhiều nhất là các phương pháp sắc ký, dưới đây là một số phương pháp thông dụng nhất trong phân tích định lượng các amino acid.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

H Ư

-L

2.5 Một số phƣơng pháp định lƣợng amino acid

IỄ N D

A

Ý

-H

-

Ó

-

10 00

B

-

TR ẦN

-

N

G

-

TP

-

Đ ẠO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

-

N

H

-

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

2.5.1 Phƣơng pháp sắc ký giấy [5] Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự phân bố giữa hai pha dung môi: dung môi cố định và dung môi di động. Dung môi cố định thường là nước giữ ở chân giấy sắc ký. Dung môi di động thường là dung môi hữu cơ bão hòa nước, di chuyển trên giấy theo cơ chế mao dẫn kéo theo các chất trong dung dịch. Vận tốc di chuyển của từng chất phân tích khác nhau thì không giống nhau và mỗi chất được đặc trưng bởi một giá trị nhất định gọi là Rf.

15 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

N

Giới hạn chiều cao dung môi

H

b

TR ẦN

a: khoảng cách dịch chuyển của chất phân tích b: khoảng cách dịch chuyển của dung môi Rf: trị số

-H

Ó

A

10 00

B

Nắp đậy

-L

Ý

Giấy sắc ký

TO

ÁN

Dung môi đi trước

Dung môi

ÀN Đ IỄ N D

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

H Ư

Trong đó:

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

Đ ẠO

N

G

Hình 2.16 Mô tả ắc ký giấy đi lên

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

Vạch xuất phát cho chất phân tích Mực dung môi trong bể sắc ký

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

a

Hình 2.17 Sơ đồ bể sắc ký giấy một chiều đi lên Có nhiều loại sắc ký giấy khác nhau: sắc ký một chiều đi xuống, sắc ký một chiều đi lên, sắc ký võng nằm ngang và sắc ký hai chiều....Loại giấy thường dùng là Whatman số 1 và Shleicher-Schull 2044 a và b, dung môi gồm các chất như 4 Butanol : 1 Acetic acid : 5 nước (dùng cho chiều thứ nhất) : 3 phenol : 1 nước (dùng cho chiều thứ 2).

16

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

2.5.4 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

Vì các amino acid là những chất khó bay hơi, nên với phương pháp sắc ký khí trước tiên ta phải tạo dẫn xuất dễ bay hơi cho các amino acid bằng cách ứng dụng chương trình nhiệt độ trong quá trình sắc ký, thường là để tạo thành dẫn xuất N-acetyl-amine. Đầu tiên, ta cho amino acid tự do (sau quá trình thủy phân protein) tác dụng với cồn amylic và HBr khan. Sau đó, cho hỗn hợp này tác dụng với anhydrid acetic. Cột thường dùng trong sắc ký khí là Chromosorb W (60-80 mesh) có một lớp polyethylenglycol 1 % (carbowax 1564 hoặc 6000). Chương trình nhiệt giữa 125◦C và 155◦C, tốc độ dòng 60-240 mL/phút.

Tuy nhiên, phương pháp này không được ứng dụng rộng rãi vì khả năng tách rất kém và cũng khá lỗi thời.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

Đ ẠO

G

N

H Ư

TR ẦN

2.5.3 Phƣơng pháp sắc ký khí [7]

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

Phương pháp sắc ký bản mỏng nhuộm màu với ninhydrin có thể dùng định tính, bán định lượng đồng thời một số loại amino acid từ dịch thủy phân protein. phương pháp này thường được sử dụng trong kiểm nghiệm thực phẩm, sinh hóa trước đây. Để tăng độ phân giải cho các amino acid người ta phải dùng sắc ký hai chiều với hệ 2 dung môi thích hợp. Trong phương pháp sắc ký bản mỏng có ba hệ dung môi thường được sử dụng là phenol/nước, collidine, butanol/acid acetic/nước. Tùy theo hệ dung môi và tỉ lệ của hệ dung môi mà các amino acid có thứ tự và giá trị Rf khác nhau.

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Nguyên tắc của phương pháp này cũng dựa trên nguyên tắc của phương pháp sắc ký giấy, nghĩa là cũng dựa trên sự phân bố của chất phân tích giữa hai pha. Tuy nhiên, chất hấp phụ pha động được trán trên một phiến kính hoặc nhôm tạo thành một lớp mỏng và pha động là một dung môi thích hợp. Dung môi di chuyển kéo theo sự dịch chuyển của các chất trong mẫu phân tích. Các chất hấp phụ thường là silica gel, alumium oxide, sephadex,... được kết hợp với thạch cao dán vào miếng kính.

N

2.5.2 Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng [6]

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phổ biến nhất hiện nay và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực phân tích, nghiên cứu khoa học và công nghệ trong đó có phân tích amino acid. Nhiều công trình phân tích amino acid dựa trên phương pháp này đã được công bố và nó đã trở thành tiêu chuẩn để phân tích amino acid. Vì phương pháp này có độ nhạy cao, hiệu suất tách cao và ít tốn thời gian cũng như lượng mẫu cần rất ít. Trong khoảng 15 năm trở lại đây thì kỹ thuật này là kỹ thuật được ứng dụng rỗng rãi nhất và chiếm gần 70% các công trình nghiên cứu và ứng dụng về sắc ký.

17

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

2.6.2 Nguyên lí hoạt động và tách sắc ký

Hỗn hợp cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp, tiêm một thể tích chính xác vào bộ phận tiêm mẫu và được mang vào cột bởi một dòng chảy liên tục của cùng dung môi (pha động) trong đó mẫu được hòa tan.

Sự tách diễn ra trong cột có chứa những hạt xốp có diện tích bề mặt lớn (pha tĩnh). Các cấu tử trong mẫu liên tục tương tác với pha tĩnh. Pha động (còn gọi là chất rửa giải) được bơm qua cột được nhồi chặt các hạt sắc kí. Với việc chọn pha động và vật liệu nhồi cột thích hợp, các cấu tử trong mẫu sẽ di chuyển dọc trên cột với những tốc độ khác nhau. Khi những cấu tử lần lượt thoát ra khỏi cột vàđi vào detector thích hợp, ở đây tín hiệu được ghi lại, xử lí

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

H Ư

2.6.1 Khái niệm

IỄ N D

N

G

2.6 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [5]

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Hình 2.18 Hệ thống máy sắc ký HPLC tại các phòng thí nghiệm

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Ơ

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

18 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

và chuyển ra ngoài dưới dạng một sắc kí đồ cho biết sự hiện diện của mỗi cấu tử dưới dạng một peak. Khi đó lượng cấu tử có trong mẫu được tính toán dựa vào chiều cao hoặc diện tích của peak của nó.

Ơ

N

H

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:

N

2.6.3 Phân loại

TR ẦN

H Ư

N

G

Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (< 3000).

B

SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography).

Ó

A

10 00

Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động. Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực. SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động. Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực. Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng SKPĐ. Dung môi sử dụng trong SKPĐ là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền. Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

- Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Đ ẠO

- Sắc ký ion (ion chromatography).

TP

- Sắc ký phân bố (partition chromatography).

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

- Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (absorption/liquid chromatography).

19 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

 Dung môi pha động: dung môi pha động gồm một hoặc nhiều dung môi khác nhau để rửa giải chất cần phân tích ra khỏi cột.

Có thể sử dụng dung môi rửa giải có thành phần không đổi trong suốt quá trình phân tích, tuy nhiên đối với một hỗn hợp phức tạp một thành phần pha động thường không thích hợp từ đầu đến cuối. Do đó thường sử dụng phương pháp gradient nồng độ (thay đổi thành phần pha động theo tỉ lệ đã được chương trình hóa) cho phép tách tốt trong thời gian vừa phải.

Yêu cầu đối với dung môi pha động : o Có độ tinh khiết cao, cần loại bỏ tạp chất và đuổi khí trước khi sử dụng. o Có độ nhớt thấp, không tạo áp lực khi vào cột. o Không tương tác với pha tĩnh, không làm lão hóa cột tách và làm thay đổi các đặc tính của nó. o Không hấp thu trong vùng ánh sáng phân tích.  Bơm (bơm cao áp): để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc ký, rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 – 400 bar) để tạo ra được những tốc độ nhất định của pha động qua cột tách phù hợp cho quá trình sắc ký nằm trong vùng 0,5 – 3,0 mL/phút.  Van bơm mẫu (bộ phận lấy mẫu tự động): để bơm mẫu vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký. Đó là các van 6 chiều có chứa vòng mẫu có thể tích 20, 50, 100 µL. Van 6 chiều chỉ có một vòng mẫu nhưng van 10 chiều thì có 2 vòng mẫu.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Trong đó:

IỄ N D

TR ẦN

Hình 2.19 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q H Ư

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Ơ

N

2.6.4 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

20 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

ÁN TO ÀN Đ

IỄ N D

Nguyên tắc hoạt động: dựa trên sự phát quang của một loại diod đặc biệt khi nó bị chùm sáng tác động vào (tương tự như detector phổ hấp thụ quang phân tử UV – VIS). Mỗi detector có hàng chục diod phát quang tạo thành một mảng diod, có vùng phổ làm việc từ 200 – 1100 nm và có tính không gian 3 chiều. Nên loại này thu nhận được hình không gian của peak hấp thụ của chất, và nhiều peak đồng thời. Loại này có độ nhạy và độ chọn lọc rất cao, tốc độ đo cao hơn và có thể đo được từ 2 đến 42 kênh đồng thời. Chọn sóng đo hấp thụ cho từng chất là dễ dàng. Hạn chế được sự chen lấn và trùng sóng hấp thụ.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

-L

Ý

Trong đề tài này, với những điều kiện có sẵn tại phòng thí nghiệm của Trung tâm Phân Tích và Giám Định Vinacert Control Cần Thơ, em ứng dụng khả năng phân tích của detector diod phát quang (DAD).

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

 Cột HPLC (cột tách): là cột chứa pha tĩnh, trái tim của quá trình sắc ký, nó là một yếu tố quyết định hiệu quả sự sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu. Cột tách có nhiều cỡ khác nhau và thường làm bằng thép không gỉ, tùy thuộc vào mức độ sắc ký thông thường cột tách có chiều dài từ 10 – 25 cm, đường kính trong từ 2 – 5 mm, đường kính của chất nhồi cột từ 3-10 m.

Yêu cầu đối với cột sắc ký: cột phải trơ, có thành thẳng và chịu được áp suất cao.

Trong sắc ký phân bố pha đảo, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu: o Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography). o Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography) Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau: - Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích.

- Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi.

Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này.  Detector: là trang bị phát hiện chất phân tích. Có rất nhiều loại detector khác nhau, tùy theo chất phân tích mà chọn loại detector phù hợp để đạt độ nhạy cao khi phát hiện các chất và định lượng chúng như: detector UV – VIS, AES, AAS, FD, RID, DAD, MS...

N

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

 Trang bị điều khiển và xử lý số liệu: gồm các máy tự ghi (recorder), bộ phân tích kế (intergrator), máy tính, máy in.

21 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

Ý

-L

ÁN

TO ÀN Đ

IỄ N D

Thuốc thử OPA, khi có mặt một hợp chất thiol (có thể dùng 2-ME hoặc 3-MPA) sẽ tác dụng với các amine bậc một để cho một hợp chất isoindole phát huỳnh quang mạnh. Bản thân thuốc thử OPA không phát huỳnh quang, nên không gây trở ngại. Mặt khác, vì OPA dễ tan và ổn định trong nước đồng thời cho phản ứng nhanh. Tuy nhiên, dẫn xuất tạo thành chỉ bền trong vài phút, nên phải tiến hành phản ứng tạo dẫn xuất bằng hệ thống tiêm mẫu tự động (autosample) để tránh mất thời gian với việc tạo dẫn xuất bằng tay cũng như quá trình phân tích với máy. Dù vậy, OPA không cho phản ứng với các amine bậc 2, nên kỹ thuật này không áp dụng được để phân tích các amino acid có chứa nhóm chức amine bậc 2 như proline.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

-H

Hình 2.20 Công thức cấu tạo của OPA

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ ẠO

TP

Vì vây, với các điều kiện có sẵn tại Trung tâm Phân tích và Giám định Vinacert Control Cần Thơ, ứng dụng phương pháp tạo dẫn xuất amino acid tiền cột với thuốc thử ortho-phthalaldehyde (OPA). Đây là phương pháp được ứng dụng khá phổ biến hiện nay, dùng để phân tích hầu hêt các amino acid với khả năng tạo dẫn xuất nhanh và ổn định.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Khoảng một nữa các phép phân tích amino acid dựa trên sự tách các amino acid tự do bằng sắc ký lỏng trao đổi ion rồi tạo dẫn xuất sau cột phân tách. Kỹ thuật tạo dẫn xuất sau cột có thể áp dụng cho các mẫu thử có một lượng nhỏ chất đệm (như các muối và ure) và cần 5-10 g mẫu thử protein cho một lần phân tích. Các kỹ thuật còn lại bao gồm việc tạo dẫn xuất trước cột rồi tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC). Các kỹ thuật tạo dẫn xuất trước cột thường rất nhạy và chỉ cần khoảng 0,5-1,0 g mẫu thử protein/peptide cho mỗi lần phân tích.

N

2.7 Tạo dẫn xuất amino acid ổn định [8,9]

22 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

H

Dẫn xuất OPA-amino acids

OPA (không phát huỳnh quang)

Y

TP

TR ẦN

H Ư

N

Ngoài ra, còn một số phương pháp tạo dẫn xuất với các amino acid như tạo dẫn xuất sau cột với thuốc thử ninhydrine, tạo dẫn xuất sau cột với thuốc thử OPA, tạo dẫn xuất trước cột với thuốc thử 6-aminoquinolyl-Nhydroxysuccinimidyl carbamate (AQC),... Ưu điểm của phương pháp tạo dẫn xuất với OPA:

B

10 00

A

Ó

-L

-

-H

-

Tạo dẫn xuất nhanh, rút ngắn thời gian phân tích so với phương pháp tạo dẫn xuất với ninhydrin đã được ứng dụng từ rất lâu, không còn phù hợp nữa.

Lượng mẫu cần dùng phân tích rất nhỏ tiết kiệm được chi phí. Độ nhay cao, giới hạn phát hiện thấp khi phát hiện với detector FLD (khoảng 1picomol đã được công bố).

Phân tích được hầu hết các amino acid bậc 1 với độ chính xác cao.

Ý

-

ÁN

Nhược điểm:

Đ

ÀN

TO

-

Không phân tích được các amino acid bậc hai.

Không bền vững nên sau khi tạo dẫn xuất phải phân tích nhanh chóng trên máy.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

G

Dẫn xuất tạo thành sau khi được phân tích bằng cột pha đảo sẽ được phát hiện bằng detector DAD ở bước sóng kích thích 338 nm.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Đ ẠO

Hình 2.21 Phương trình tạo dẫn xuất với thuốc thử OPA

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U

DAD: 338 nm

FLD: Ex 340 nm, Em 450 nm

IỄ N D

phát huỳnh quang mạnh

.Q

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

Ơ

Tác nhân thiol

N

Amino acids

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

2.8 Thủy phân protein [2] Có nhiều phương pháp thủy phân protein nhưng phương pháp chủ yếu dùng để tách các amino acid ra khỏi mẫu thực phẩm là dùng HCl) với nồng độ cao khoảng 6 M. Tuy nhiên, tùy theo mục đích nghiên cứu định tính hay định lượng mà có các phương pháp thủy phân khác như: Thủy phân bằng kiềm Thủy phân bằng acid mạnh có mặt chất trao đổi ion 23

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ ẠO

TP

Quá trình thủy phân chủ yếu để cắt đứt các liên kết peptide của các amino acid trong protein, trả các amino acid về dạng tự do sau đó tạo dẫn xuất với dẫn chất OPA có mặt tác nhân thiol là 3 – MPA để tạo thành hợp chất có khả năng phát quang mạnh và được phát hiện bằng detector DAD.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Trong quá trình thủy phân protein bằng HCl thì threonine bị phân hủy một phần, methionine có thể bị oxi hóa một phần. Tùy theo từng mục đích nghiên cứu và phân tích mà ta áp dụng các phương pháp thủy phân khác nhau, đối với đề tài này cần định lượng các amino acid một cách chính xác nên tôi áp dụng phương pháp thủy phân bằng HCl nồng độ cao 6 M có mặt chất xúc tác 3 – mercaptopropionic acid, để quá trình thủy phân xảy ra hoàn toàn tiến hành ủ mẫu thủy phân qua đêm ở điều kiện nhiệt độ thích hợp khảo sát từ một số tài liệu và phù hợp với điều kiện tại phòng thí nghiệm.

N

Thủy phân bằng enzyme.

Ơ

-

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

24 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

CHƢƠNG 3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

Ơ

H

3.1.1 Địa điểm thí nghiệm Địa điểm thí nghiệm: Trung tâm Phân tích và Giám định Vinacert Control Cần Thơ.

N

3.1 Địa điểm phòng thí nghiệm

D

-

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

G

N

H Ư

TR ẦN

B

10 00

A

Ó

-H

3.1.4 Hóa chất Chất chuẩn DL-Lysine (87,1 %, Dr. Ehrenstorfer), DL-Methionine (99,5%, Dr. Ehrenstorfer), DL-Threonine (99 %, Dr. Ehrenstorfer).

Boric acid rắn (99 %, Xilong).

Dung dịch o-phthaladehyde (OPA) ( 99 %, Sigma-Aldrich).

Sodium hydoxide rắn (NaOH) (99 %, Merck).

Dung dịch hydrochloride acid (HCl) (37%, Merck).

Dung dịch 3-mercaptopropionic acid (3-MPA) (99 %, ACROS Organic™).

Muối di-potassium hydrophosphate (K2HPO4) (99 %, Merck).

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Đ ẠO

TP

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-

-L

Ý

-

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao UHPLC Ultimate 3000 Thermo. Đầu dò RS Diode Array Detector.

Tủ sấy DSG DSQ – 1500D – Nhật.

Máy ly tâm lạnh NIKRO 220 R. Máy trộn Vortex VM – 1000.

Vial.

Giấy lọc.

Giấy cân.

Cối xay thực phẩm.

Cân phân tích. Ống teflon. Ống thử nghiệm Falcon bằng nhựa 50 mL, 30 115 mm.

Micropipete 10 - 100 µL, Micropipete 100 – 1000 µL và Micropipete 1000 - 5000 µL đã được hiệu chỉnh cùng đầu tuýp Micropipete với cùng thể tích.

Màng lọc millipore 0,22 µm.

Kim tiêm (Vikimco).

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

3.1.2 Thời gian tiến hành thí nghiệm Đề tài được thực hiện trong khoảng thời gian 3 tháng kể từ tháng 9 năm 2015 đến tháng 11 năm 2015.

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

Địa chỉ: F2-62-63, đường số 6, khu dân cư 586, phường Phú Thứ, quận Cái Răng, TP Cần Thơ.

25 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Nước cất HPLC grade (Fisher).

Acetonitrile (ACN) loại HPLC grade (99 %, MACRON).

Methanol (MeOH) (99 %, J.T.Baker).

Dung dịch acetic acid (CH3COOH) (99,5 %, Xilong).

Potassium chloride (KCl) (99,5 %, Merck).

N

-

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

H

Ơ

3.1.5 Đối tƣợng thí nghiệm

3.2.2 Khảo sát thời gian lƣu [5]

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

Thời gian lưu: các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích, khi được nạp vào cột sắc ký, chúng sẽ bị lưu giữ trong cột tách (trên pha tĩnh) theo một thời gian nhất định. Đó là thời gian lưu của nó trong hệ cột đã cho. Thời gian lưu này tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho đến lúc chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở thời điểm đó có nồng độ cực đại. Như vậy, nếu gọi tRi là thời gian lưu tổng cộng của chất tan i thì chúng ta luôn có: tRi = (t0 + t’Ri)

Đ

ÀN

Trong đó:

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

10 00

B

Mẫu thức ăn chăn nuôi được xay nhuyễn để đạt độ mịn thích hợp và lọc qua rây lọc đường kính 0,5 mm. Mẫu qua rây cho vào túi nhựa ép hết khí ra ngoài, buộc kín và bảo quản ở nhiệt độ khoảng 25-30 ◦C cho đến khi phân tích.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

TR ẦN

3.2.1 Chuẩn bị mẫu

H Ư

N

G

Đ ẠO

Dựa trên các tài liệu nghiên cứu đã được công bố và các điều kiện tại phòng thí nghiệm, tiến hành thí nghiệm và tối ưu hóa các điều kiện phân tích với một vài chỉ tiêu: thời gian lưu, độ chính xác, độ tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng LOQ (chất chuẩn).

Phân tích trên mẫu thật thức ăn chăn nuôi.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu

IỄ N D

.Q

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

Thức ăn chăn nuôi dành cho gia súc và gia cầm ở xung quanh Thành phố Cần Thơ.

Số lượng mẫu: 15 mẫu.

t0: thời gian không lưu giữ ( thời gian chất tan nằm trong pha động). t’Ri: thời gian lưu giữ thực chất của chất i ở trong cột tách sắc ký.

Nếu t0 = 0 thì ta sẽ có tRi = t’Ri. Trường hợp này chỉ có khi tRi < 4 phút.

Còn nói chung chúng ta luôn có: t’Ri = tRi – t0

26 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

được gọi là thời gian lưu tương đối của A và B hay hệ số tách của 2 chất đó. Đại lượng này càng lớn thì sự tách của 2 chất này càng rõ rệt. Khi đại lượng này bằng 1, thì không có sự tách sắc ký giữa A và B, lúc này A và B nằm chung trong 1 peak sắc ký. Nếu gần bằng 1 thì 2 peak sắc ký của A, B có chung một vùng nghĩa là chúng chập nhau, không thể tách thành 2 chất riêng biệt đặc trưng cho 2 chất đó.

Giá trị t’Ri của một chất tan trong quá trình sắc ký là phụ thuộc vào nhiều yếu tố: -

Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, kích thước xốp...

Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

TR ẦN

H Ư

Nếu 2 chất A và B kế tiếp nhau trong sắc ký đồ thì chúng ta có

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

N

G

Hình 3.1 Thời gian lưu trên sắc ký đồ

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Ơ

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Trong một số trường hợp còn phụ thuộc cả vào pH của pha động, nồng độ chất tạo phức nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các quá trình cân bằng động trong quá trình sắc ký, nhất là trong sắc ký ion thì yếu tố pH thể hiện rất rõ nét.

3.2.3 Xây dựng đƣờng chuẩn dựa trên khoảng tuyến tính [10]

Định nghĩa khoảng tuyến tính: khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích.

27 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Xây dựng đường chuẩn: sau khi xác định khoảng tuyến tính cần xây dựng đường chuẩn và xác định hệ số hồi quy tương quan. Trong phân tích thực tế, có thể xây dựng các đường chuẩn ngắn trùm lên nồng độ trong mẫu, không nhất thiết phải lập đường chuẩn toàn bộ khoảng tuyến tính. Nồng độ trong mẫu không được vượt ngoài giới hạn cao nhất và thấp nhất của đường chuẩn và tốt nhất phải nằm giữa đường chuẩn.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

Ó

A

10 00

B

Việc xác định khoảng tuyến tính thường bắt đầu từ giới hạn định lượng (LOD hay còn gọi là điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất). Nói chung để xác định khoảng tuyến tính cần dùng 10 (tối thiểu là 6) nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ đo lặp lại ít nhất 6 lần.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Hình 3.2 Khoảng tuyến tính và khoảng làm việc

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q TR ẦN

H Ư

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Ơ

N

Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độgiữa giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích (bao gồm cả các giới hạn này), tại đó được chứng minh là có thể xác định được bởi phương pháp nhất định với độ đúng, độ chính xác và độ tuyến tính.

Có nhiều loại đường chuẩn khác nhau dựa vào phương pháp và kỹ thuật khác nhau như: đường chuẩn với chuẩn tinh khiết, đường chuẩn trên mẫu trắng, đường chuẩn trên mẫu thực, đường chuẩn có sử dụng nội chuẩn.

Với đề tài này, tôi xây dựng đường chuẩn với chuẩn tinh khiết. Đường chuẩn với chuẩn tinh khiết:

Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn (tối thiểu 6 nồng độ), xác định các giá trị đo được y theo nồng độ x (lặp lại 2 lần lấy giá trị trung bình). Nếu sự phụ thuộc tuyến tính ta có sự khoảng khảo sát đường biểu diễn là một phương trình: 28 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

y = ax + b Trong đó: a: giá trị độ dốc (slope)

Ơ

N

b: giá trị hệ số chặn intercept

N Y

̅

1

có tính tương quan tuyến tính rõ rệt

TR ẦN

Cách xác định:  Dựa trên tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu

10 00

B

Phân tích mẫu (mẫu chuẩn, mẫu trắng hoặc mẫu thử) ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện chất phân tích. Lặp lại 3,4 lần. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia nhiễu (S/N = signal to noise ratio)

A

Trong đó:

-H

Ó

S: chiều cao chất phân tích (chiều cao peak).

Ý

N: nhiễu đường nền.

LOD được chấp nhận ở nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 3.

S/N =

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền và tốt nhất là tính nhiễu lân cận 2 bên của peak, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của peak tại nửa chiều cao.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

H Ư

N

G

Đ ẠO

3.2.4 Khảo sát giới hạn phát hiện [10] Định nghĩa giới hạn phát hiện: là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu mà có thể phát hiện được nhưng không định lượng được.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

R2

∑

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

1 hay 0,99

̅

U

√∑

̅

.Q

Nếu 0,995 R

̅

∑

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

R=

H

và hệ số tương quan tuyến tính

29 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

LOD = ̅ + 3

TR ẦN

(với trường hợp mẫu trắng LOD = 3 SD0)

√

Với SD0 =

̅​̅​̅

10 00

B

Trong đó:

∑

̅ : nồng độ trung bình của mẫu trắng hoặc mẫu thử

Ó

A

SD0: độ lệch chuẩn tương đối của mẫu trắng hoặc mẫu thử ̅​̅​̅

Ý

-H

Đánh giá LOD tính được: tính R =

ÁN

-L

Với R 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và kết quả đo được đáng tin cậy.

Đ

ÀN

TO

Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn hoặc thêm một ít chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm sau đó tính lại R.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

H Ư

N

G

Làm trên mẫu trắng hoặc mẫu thử, phân tích mẫu 10 lần song song, tính độ lệch chuẩn (SD). Độ lệch chuẩn này phải khác 0.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

 Dựa trên độ lệch chuẩn

IỄ N D

Đ ẠO

Hình 3.3 Minh họa tỉ lệ tín hiệu chia cho nhiễu.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Ơ

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn hoặc pha loãng dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm, tính lại R. 3.2.5 Khảo sát giới hạn định lƣợng [10] Định nghĩa giới hạn định lượng: là nồng độ tối thiểu của chất phân tích có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp và cho kết quả có độ chụm mong muốn.

LOQ chỉ áp dụng cho các phương pháp định lượng.

30 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Có nhiều cách xác định LOQ, phụ thuộc vào từng phương pháp cụ thể mà ta lựa chọn cho phù hợp.

Ơ H

N

 LOQ trong nhiều trường hợp là điểm thấp nhất của khoảng tuyến tính.  Dựa trên độ lệch chuẩn.

N

Việc xác định LOQ cần tính đến các yếu tố ảnh hưởng trong mẫu phân tích, do đó ta thực hiện trên nền mẫu thật.

10 00

B

Cách xác định LOQ tương tự như LOD nhưng điều kiện với giá trị nồng độ được chấp nhận mà tại đó tỉ lệ tín hiệu peak gấp 20 – 30 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy giá trị S/N = 10.

A

3.2.6 Độ chính xác (độ chụm và độ đúng) [10]

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

Định nghĩa: theo quan điểm mới nhất của tiêu chuẩn quốc tế (ISO 5725 1-6:1994) và tiêu chuẩn quốc gia (TCVN 6910 1-6 : 2005) độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng . Độ chụm chỉ mức độ dao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh giá trị trung bình. Độ chính xác được khái quát thông qua việc đánh giá độ chụm và độ đúng. Độ chính xác (accuracy) = độ chụm (precision) + độ đúng (trueness)

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

TR ẦN

 Dựa trên tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu

H Ư

LOQ =

N

G

Cách tiến hành tương tự như LOD nhưng với công thức tính sau:

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

 Dựa trên đường chuẩn

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q Đ ẠO

Đối với mẫu thử: LOQ = 10 SD

IỄ N D

TP

Đối với mẫu trắng: LOQ = ̅​̅​̅ + 10 SD

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

Cách tiến hành tương tự như xác định LOD nhưng công thức tính giá trị khác nhau:

Độ chụm (precision)

Trong nhiều trường hợp các phép thử nghiệm trên những đối tượng và với những điều kiện khác nhau thường không cho kết quả giống nhau. Điều này do các sai số ngẫu nhiên của mỗi quy trình gây ra, ta không thể kiểm soát được hoàn toàn tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm. Do đó, để kiểm soát được các sai số này, phải dùng đến khái niệm độ chụm. Độ chụm chỉ phụ thuộc vào sai số ngẫu nhiên và không liên quan đến giá trị thực. Độ chụm là một khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng độ lệch

31 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

chuẩn hay hệ số biến thiên. Độ chụm càng thấp thì độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên càng lớn. Độ chụm có thể được phân ra thành ba trường hợp sau: - Độ lặp lại (repeatability)

N

- Độ chụm trung gian (intermediate precision)

H

Ơ

- Độ tái lập (reproducibility).

N

 Dựa trên độ lặp lại

.Q

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

dtb =

̅

∑̅

̅

TO

ÁN

-L

Ý

-H

|

∑

Ó

A

10 00

B

di = |

Đ

RSD % =

̅

100

Nếu các mẫu có nồng độ xi khác nhau nhiều thì thay cho độ lệch di, tính độ lệch tương đối Di, và độ lệch tương đối trung bình Dtb và sau đó tính độ lệch chuẩn tương đối:

D

IỄ N

s=

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

TR ẦN

H Ư

Trường hợp các mẫu có nồng độ, hàm lượng gần như nhau. Tính độlệch giữa hai kết quả lặp của mỗi mẫu di rồi tính độ lệch trung bình dtb, sau đó tính độ lệch chuẩn s:

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

N

G

Đ ẠO

TP

Trong một số trường hợp việc ước lượng độ lặp lại có thể thông qua tính toán dựa trên kết quả phân tích các mẫu thực. Do đó việc lưu giữ các kết quả phân tích có vai trò rất quan trọng. Dựa trên kết quả phân tích làm trên mẫu thực trong nhiều tuần, ít nhất là 10 mẫu, có thể là các nền mẫu khác nhau, nồng độ khác nhau nhưng phải có kết quả làm lặp 2 lần.

ÀN

http://daykemquynhon.ucoz.com

làm:

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U

Y

Cách tiến hành: Tính toán dựa trên các kết quả phân tích mẫu thực đã

Di =

Dtb=

∑

32 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

N

H

Tiêu chí đánh giá: đối chiếu giá trị tính được với giá trị mong muốn hay giá trị yêu cầu hoặc so với RSD (%) lặp lại cho trong Bảng 3.1 (RSD (%) tính được không được lớn hơn giá trị trong bảng ở hàm lượng chất tương ứng). Độ chụm thay đổi theo nồng độ chất phân tích. Nồng độ chất càng thấp thì kết quả càng dao động nhiều (không chụm) nghĩa là RSD (%) càng lớn.

N

100

RSD % =

Đơn vị

1

100

1

100 %

1,3

2

10

10-1

10 %

1,8

3

1

10-2

1%

2,7

4

0,1

10-3

0,1 %

3,7

5

0,01

10-4

100 ppm

5,3

6

0,001

10-5

10 ppm

7,3

7

0,0001

10-6

1 ppm

11

8

0,00001

10-7

100 ppb

15

9

0,000001

10-8

10 ppb

21

10

0,0000001

10-9

1 ppb

30

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

-H

Ý

-L

ÁN

TO ÀN Đ

Giống như độ chụm, độ đúng là một khái niệm định tính.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

.Q

TP

G N

H Ư

TR ẦN B

10 00

A

RSD(%)

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

Tỉ lệ chất

Đ ẠO

U

Hàm lượng %

Độ đúng (trueness) Định nghĩa độ đúng: Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng (μ). Đối với đa số mẫu phân tích, giá trị thựckhông thể biết một cách chính xác, tuy nhiên nó có thể có một giá trị quy chiếu được chấp nhận là đúng (gọi chung là giá trị đúng).

IỄ N D

TT

Ó

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

Y

Bảng 3.1 Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC)

Cách xác định độ đúng:Muốn xác định độ đúng cần phải tìm được giá trị đúng (giá trị quy chiếu được chấp nhận), có nhiều cách khác nhau để xác định độ đúng, bao gồm việc so sánh kết quả thực nghiệm với kết quả thực hiện bởi một phương pháp đối chiếu hoặc sử dụng mẫu đã biết nồng độ (mẫu kiểm tra hoặc mẫu chuẩn được chứng nhận) và phương pháp xác định độ thu hồi (độ tìm lại).

Phương pháp nghiên cứu trong đề tài này dựa vào việc xác định độ chệch (bias) của mẫu nguyên liệu lysine, methionine, threonine.

33

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

̅

100 Trong đó:

N

: độ chệch (bias) %

H

Ơ

̅: giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm

N

: giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng

10 00

Trong đó:

Ó

A

R%: độ thu hồi %

-H

Cm+c: nồng độ thu hồi trong mẫu thêm chuẩn

-L

Ý

Cm: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

ÁN

Ctt: nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn

Đ

ÀN

TO

Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết).

Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

100

B

R% =

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Đối với mẫu trắng:

100

TR ẦN

R% =

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

H Ư

N

Đối với mẫu thử:

IỄ N D

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

Trong nhiều trường hợp không thể tìm hoặc áp dụng một phương pháp tiêu chuẩn để so sánh kết quả, cũng như không thể dễ dàng có được các mẫu chuẩn hoặc mẫu chuẩn được chứng nhận phù hợp với phương pháp. Việc xác định độ đúng do đó có thể thực hiện thông qua xác định độ thu hồi (còn gọi là độ tìm lại) của phương pháp. Thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử hoặc mẫu trắng, phân tích các mẫu thêm chuẩn đó, làm lặp lại tối thiểu bốn lần bằng phương pháp khảo sát, tính độ thu hồi theo công thức sau đây:

lặp lại.

Tiêu chí đánh giá: Sau khi đánh giá độ thu hồi, so sánh kết quả với các giá trị cho trong Bảng 3.2 . Độ thu hồi ở các nồng độ khác nhau có kỳ vọng khác nhau. Trong trường hợp phân tích các chất hàm lượng vết có thể tham khảo tiêu chuẩn của Hội đồng châu Âu (Bảng 3.3)

34 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Độ thu hồi (%)

1

100

1

100 %

98-102

2

10

10-1

10 %

98-102

3

1

10-2

1%

97-103

4

0,1

10-3

0,1 %

95-105

5

0,01

10-4

100 ppm

6

0,001

10-5

10 ppm

7

0,0001

10-6

1 ppm

80-110

8

0,00001

10-7

100 ppb

80-110

9

0,000001

10-8

10

0,0000001

10-9

Y

60-115

1 ppb

40-120

B

Đơn vị

10 00

Hàm lượng chất ( g/kg)

ppb

50-120 %

1-10 ppb

70-110 %

ppb

80-110 %

A

1

Độ thu hồi (%)

Ó

đến

-H

2

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

3

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

10 ppb

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

H Ư

N

G

Đ ẠO

80-110

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U .Q TP

90-107

Bảng 3.3 Quy định về độ thu hồi của Hội đồng châu Âu TT

N

Đơn vị

Ơ

Tỉ lệ chất

H

Hàm lượng %

N

TT

TR ẦN

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

Bảng 3.2 Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC)

35 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

3.3 Thực nghiệm 3.3.1 Quy trình xử lý mẫu và phân tích trên HPLC [6-9, 11, 12] Hút chính xác 10 mL dung dịch HCl 6M và 50 L dung dịch 3mercaptopropionic acid cho vào ống teflon chứa mẫu vừa rồi.

Vặn chặt nắp teflon và cho vào tủ sấy, ủ ở 103◦C trong 24 giờ

Sau 24 giờ, lấy ống teflon ra khỏi tủ sấy và tiến hành làm lạnh trong tủ lạnh trong khoảng 30 phút

ÁN

-L Đ

ÀN

TO

Hình 3.4 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu và phân tích amino acid trên HPLC

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

Ý

Tiến hành phân tích trên máy HPLC

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Ó

-H

Vortex 1 phút, sau đó rút dung dịch từ vial lọc qua màng lọc millipore 0,22 m và bơm vào một vial khác

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q TP

Đ ẠO

Rút 50 L dịch chiết cho vào vial và định mức đến 1 mL bằng nước cất dùng riêng cho HPLC

A

10 00

B

Lọc dung dịch qua giấy lọc để loại bã

IỄ N D

TR ẦN

H Ư

N

G

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Ơ

N

Cân khoảng 0,3 g mẫu thức ăn chăn nuôi cho vào ống teflon

3.3.2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, pha động và dung dịch phân

tích  Dung dịch chuẩn gốc C0 (1000 ppm) Cân chính xác 11,481 g lysine cho vào bình định mức 10 mL và định mức tới 10 mL bằng nước cất loại HPLC, vortex, siêu âm 2 phút và cho vào hủ bi tối màu bảo quản và sử dụng khi cần thiết.

Cân chính xác 10,050 g methionine và cho vào bình định mức 10 mL và định mức tới 10 mL bằng nước cất loại HPLC, vortex siêu âm 2 phút và cho vào hủ bi tối màu bảo quản và sử dụng khi cần thiết.

36

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

-H

Ó

A

Hút chính xác 4,8 dung dịch chuẩn trung gian 250 ppm cho vào bình định mức 10 mL và định mức bằng nước cất loại HPLC grade. Vortex, siêu âm 2 phút. Bảo quản ở 2-8◦C và sử dụng trong 7 ngày.

Ý

 Chuẩn C3 (90 ppm)

ÁN

-L

Hút chính xác 3,6 dung dịch chuẩn trung gian 250 ppm cho vào bình định mức 10 mL và định mức bằng nước cất loại HPLC gradde. Vortex, siêu âm 2 phút. Bảo quản ở 2-8◦C và sử dụng trong 7 ngày.

Đ

ÀN

TO

 Chuẩn C4 (60 ppm)

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

10 00

 Chuẩn C2 (120 ppm)

B

TR ẦN

Hút chính xác 6 mL dung dịch chuẩn trung gian 250 ppm cho vào bình định mức 10 mL và định mức bằng nước cất loại HPLC grade. Vortex, siêu âm 2 phút. Bảo quản ở 2-8◦C và sử dụng trong 7 ngày.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

 Chuẩn C1 (150 ppm)

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

H Ư

N

Dung dịch chuẩn làm việc

IỄ N D

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Cân chính xác 10,101 g threonine cho vào bình định mức 10 mL và định mức tới 10 mL bằng nước cất loại HPLC, vortex, siêu âm 2 phút và cho vào hủ bi tối màu bảo quản và sử dụng khi cần thiết.

Nồng độ của 3 dung dịch chuẩn tương đương: Lysine: 1000 ppm.

Methionine: 1000 ppm.

Threonine:1000 ppm.

Dung dịch chuẩn được lưu trữ ở điệu kiện tránh ánh sáng, ở nhiệt độ 2 – ◦ 8 C và sử dụng trong 7 ngày.

- Dung dịch chuẩn trung gian (chuẩn mix của 3 amino acid) Chuẩn trung gian 150 ppm Hút chính xác 5 mL dung dịch chuẩn gốc (C0) của mỗi dung dịch chuẩn lysine, methionine, threonine cho vào bình định mức 20 mL và định mức tới 20 mL bằng nước cất loại HPLC grade, vortex, siêu âm 2 phút, cho vào hủ bi tối màu bảo quản ở 2-8◦C và sử dụng trong 7 ngày.

N

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Hút chính xác 2,4 dung dịch chuẩn trung gian 250 ppm cho vào bình định mức 10 mL và định mức bằng nước cất loại HPLC gradde. Vortex, siêu âm 2 phút. Bảo quản ở 2 - 8◦C và sử dụng trong 7 ngày.  Chuẩn C5(30 ppm) Hút chính xác 1,2 dung dịch chuẩn trung gian 250 ppm cho vào bình định mức 10 mL và định mức bằng nước cất loại HPLC gradde. Vortex, siêu âm 2 phút. Bảo quản ở 2 – 8◦C và sử dụng trong 7 ngày.

37 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

Đong chính xác 900 mL ACN, 900 mL MeOH và 200 mL nước cất HPLC cho vào bình đựng pha động, khuấy đều và đánh siêu âm 30 phút.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

- Pha động B

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

Đ ẠO

G

TR ẦN

H Ư

N

Cân chính xác 13,92 g K2HPO4 cho vào bình định mức 2000 mL và định mức tới vạch bằng nước cất. Điều chỉnh pH tới 7,8 bằng dung dịch H3PO4 đậm đặc. Lọc chân không và siêu âm 30 phút.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

- Dung dịch OPA Cân 50 mg OPA hòa tan trong 1,25 mL methanol. Hút chính xác 50 L 3MPA và 11,2 mL dung dịch đệm borate pH = 10,4 thêm vào dung dịch. Bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8◦C, chỉ pha khi cần sử dụng.

- Pha động A

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Cân 0,6189 g acid boric và 0,7456 g KCl hòa tan trong 50 mL nước cất, hút chính xác 36,85 mL NaOH 0,2 M thêm vào dung dịch trên và điều chỉnh pH tới 10,4 bằng dung dịch NaOH đậm đặc. Bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8◦C và sử dụng trong 7 ngày.

N

 Chuẩn C6 (3 ppm) Hút chính xác 1 mL dung dịch chuẩn C5 (30 ppm) cho vào bình định mức 10 mL và định mức bằng nước cất loại HPLC gradde. Vortex, siêu âm 2 phút. Bảo quản ở 2 – 80◦C và sử dụng trong 7 ngày.

- Dung dịch đệm borate pH = 10,4

38 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

3.3.3 Điều kiện chạy máy HPLC Bảng 3.4 Điều kiện điều chỉnh máy HPLC trong quá trình phân tích Đệm K2HPO4 40 mM pH = 7,8

Pha động B

MeOH:ACN:H2O (45:45:10)

3

85

18

55

22

55

45

85

15

Đ

ÀN

7.

Y https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

.Q

U

45

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

TO

6.

15

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

G

N

H Ư

TR ẦN

10 00

Ó

-H

-L

ÁN

5.

15

32 85 15 Cài đặt autosampler (Injection program) Bơm 5 từ vial chứa đệm borate 8. Chờ 60 giây. pH 10,4, tốc độ bơm 1 mL/phút.

Bơm 1 từ vial chứa mẫu thử, 9. Bơm vào 100 từ vial chứa dung tốc độ bơm 1mL/phút. dịch rửa kim và thải ra để rửa sạch kim.

Trộn 6 dung dịch vừa bơm vào 10. Bơm 3 từ vial chứa dung dịch trong vòng đệm (van nạp mẫu), acetic acid 1 M để làm giảm pH của tốc độ bơm tối đa (cài đặt lặp lại dung dịch, tốc độ bơm 5 mL/phút. bước này 3 lần).

Chờ 3 giây.

11. Trộn 10 dung dịch phản ứng trong cột dẫn, tốc độ tối đa (cài đặt lặp lại bước này 4 lần).

Bơm vào 100 từ vial chứa 12. Tiêm vào cột phân tích 3 . dung dịch rửa kim và thải ra để làm sạch kim tiêm.

Bơm 1 từ vial chứa tác chất 13. Rửa vòng đệm bằng 100 từ OPA, tốc độ bơm 1 mL/phút. bình chứa dung dịch rửa vòng đệm để chuẩn bị cho lần bơm mẫu kế tiếp.

Trộn 7 dung dịch trong vòng đệm, tốc độ bơm tối đa (cài đặt lặp lại bước này 6 lần).

Ý

4.

Ơ

85

H

0

A

3.

15

N

85

B

2.

IỄ N D

0

25

1.

B%

TP

Gradient

A%

Đ ẠO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

Thời gian (phút)

N

Pha động A

Tốc độ dòng: 1 mL/phút Cột: Agilent Zorbax Eclipse AAA 4,6 150 mm, 5 m Nhiệt độ cột: 30◦C Đầu dò DAD, bước sóng: 338 nm 39

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

H

3.3.4 Thí nghiệm khảo sát thời gian lƣu của mẫu chuẩn lysine, methionine và threonine Từ các dung dịch chuẩn làm việc, lấy dung dịch có nồng độ tương đối cao chuẩn trung gian 250 ppm của mỗi mẫu chuẩn lysine, methionine, threonine và tiến hành đo trên máy HPLC, xác định thời gian lưu của mỗi chất trên sắc ký đồ với cùng điều kiện chạy máy như phần 3.3.3

N

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

3

30

60

Methionine

3 – 150

3

30

Threonine

3 – 150

3

30

90

120

150

60

90

120

150

60

90

120

150

N

G

6

TR ẦN

B

10 00

Ý

-H

Ó

A

3.3.6 Xác định giới hạn phát hiện Từ kết quả tỉ lệ S/N hiển thị trên chương trình máy tính sau khi tiến hành đo trên mẫu thử, xác nhận giới hạn phát hiện của phương pháp (LOD) tại giá trị có tỉ lệ S/N .

-L

S/N: tỉ lệ tín hiệu chia cho nhiễu.

Đ

ÀN

TO

ÁN

3.3.7 Xác định giới hạn định lƣợng Tương tự như thí nghiệm 3.3.6 nhưng từ kết quả thu được trên chương trình máy tính, xác nhận giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ) tại nồng độ có giá trị S/N 10 hoặc xác nhận nhận giá trị LOQ = 3 LOD.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

3 – 150

5

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Lysine

4

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

3

TP

2

Đ ẠO

1

Vẽ đồ thị từ kết quả thu được thể hiện mối liên quan giữa diện tích peak (S) hoặc chiều cao peak (H) và nồng độ chất phân tích (Cc) trong mẫu chuẩn, từ đó xác định khoảng tuyến tính với hệ số tương quan tuyến tính phù hợp R2 > 0,999.

IỄ N D

Nồng độ (ppm)

Dãy chuẩn (ppm)

Amino acid

H Ư

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

3.3.5 Xây dựng đƣờng chuẩn Thực hiện: pha một dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp của lysine, methionine và threonine có nồng độ thay đổi như bảng bên dưới.

Bảng 3.5 Xây dựng dãy chuẩn lysine, methionine, threonine

3.3.8 Thí nghiệm khảo sát độ chính xác của phƣơng pháp Độ chụm: Tiến hành phân tích trên 3 mẫu thức ăn chăn nuôi khác nhau, cách tiến hành như trong phần 3.2.6. Mỗi mẫu làm lặp lại 2 lần.

Từ kết quả thu được, tiến hành tính toán để tìm được giá trị RSD (%) cho phép của độ lặp lại ở nồng độ nhất định, xác nhận độ chụm của phương pháp.

40

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Độ đúng:

Ơ

A

10 00

B

3.3.9 Tiến hành thí nghiệm trên mẫu Tiến hành quy trình phân tích trên 15 mẫu thức ăn chăn nuôi và 1 mẫu nguyên liệu lysine với quy trình như phần 3.2.2, riêng đối với mẫu nguyên liệu cân khối lượng xấp xỉ 0,01 g và làm lặp 2 mẫu để đánh giá độ lệch chuẩn và có hàm lượng chính xác nằm trong khoảng tuyến tính.

%

TO

Trong đó:

Đ

ÀN

% m: hàm lượng (g/100g) của lysine, methionine hoặc threonine trong mẫu

IỄ N D

%m=

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

3.3.10 Công thức tính toán kết quả

X: nồng độ ppm ( đường chuẩn

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

TR ẦN

Từ kết quả trung bình thu được xác nhận giá trị độ chệch (bias) của mẫu nguyên liệu, từ đó đánh giá được độ đúng của phương pháp.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

H Ư

N

G

Đ ẠO

Tiến hành phân tích mẫu nguyên liệu lysine như trong phần 3.3.1 trong cùng điều kiện như phần 3.3.3. Cân một lượng khoảng 0,01 g Mẫu nguyên liệu đo lặp lại 2 lần để xác định giá trị trung bình hàm lượng của chất phân tích trong mẫu.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Tiến hành cân một lượng chính xác khoảng 0,003 g mẫu nguyên liệu lysine định mức 50 mL bằng nước cất HPLC và tiến hành lọc qua giấy lọc và rút 1 mL dung dịch qua lọc tiếp tục lọc qua màng lọc millipore 0,22 m, bơm vào vial và tiến hành phân tích trên máy HPLC.Từ kết quả thu được sau khi so sánh với RSD (%) cho phép của độ lặp lại ở hàm lượng nhất định, xem giá trị hàm lượng mẫu nguyên liệu lysine như là vật liệu chuẩn (giá trị đo được từ mẫu nguyên liệu được chấp nhận là một giá trị đúng).

N

Phân tích trên mẫu nguyên liệu lysine dùng phối trộn trong thức ăn chăn nuôi để kiểm tra hàm lượng chính xác của mẫu nguyên liệu.

có được từ diện tích peak mẫu so với phương trình

V: thể tích pha loãng (mL) M: khối lượng mẫu cân ban đầu (g) f: hệ số pha loãng

41 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả khảo sát thời gian lƣu Bảng 4.1 Thời gian lưu của mẫu chuẩn của 3 loại amino acid

11,40

Y 0,9991

Threonine

3 – 150

y = 0,1125x + 0,2695

0,9995

TR ẦN

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

* Nhận xét: Đường chuẩn có độ tuyến tính cao với hệ số tương quan tuyến tính đạt yêu cầu R2 > 0,995.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

y = 0,0275x + 0,0270

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

3 – 150

N

Methionine

H Ư

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Bảng 4.2 Phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan tuyến tính Amino acid Khoảng Phương trình S = a.Cc + b Hệ số tương quan nồng độ (hay y = ax + b) tuyến tính R2 (ppm) Lysine 3 – 150 y = 0,029x + 0,0202 0,9998

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

U

4.2 Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

3,50

N

17,62

Threonine

Ơ

Thời gian lưu (tR) phút

Methionine

H

Lysine

Hình 4.1 Đồ thị phương trình đường chuẩn của lysine

42 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

ÀN

Đ

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

A

Ó

-H B

10 00 TR ẦN G

N

H Ư

Đ ẠO

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Ý

-L Hình 4.2 Đồ thị phương trình đường chuẩn của methionine

TP

Y

U

.Q

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÁN

TO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Ơ

H

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Hình 4.3 Đồ thị phương trình đường chuẩn của threonine

43

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

4.3 Giới hạn phát hiện Giới hạn phát hiện của phương pháp:

N

Xác nhận giá trị LOD từ kết quả phân tích trên chương trình máy tính tại nồng độ thấp nhất có tỉ lệ S/N = 3

H

Ơ

Lysine: LOD = 1,131 ppm

N

Methionine: LOD = 1,343 ppm

Y G

Methionine: LOQ = 4,029 ppm

H Ư

N

Threonine: LOQ = 4,779 ppm

TR ẦN

4.5 Kết quả khảo sát độ chính xác của phƣơng pháp 4.5.1 Kết quả khảo sát độ chụm của phƣơng pháp

B

Bảng 4.3 %RSD của hàm lượng methionine trong thức ăn chăn nuôi

0,2263

5,2566

0,3082

6,4774

0,4203

0,3052

6,4997

0,3997

0,3041

5,7217

0,3763

0,3022

5,8450

0,3869

10 00

0,3033

Kết quả đo trên máy (ppm) 6,9856

Khối lượng cân (g)

-H

Ý

TACNA1

Ó

A

Ký hiệu mẫu

ÁN

-L

TACNA2

0,4100

RSD (%)

2,5

0,3816

 RSD = 2,5% < 2,7% phương pháp có độ chụm về hàm lượng methionine (theo AOAC so sánh Bảng 3.1)

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

TACNA3

Kết quả Giá trị trung thực bình (% m) 0,4605 0,4625 0,4644

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

Lysine: LOQ = 3,393 ppm

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Đ ẠO

.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U

Giới hạn định lượng của phương pháp LOQ = 3

TP

.Q

4.4 Giới hạn định lƣợng

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

Threonine: LOD = 1,593 ppm

44 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Bảng 4.4 RSD (%) của hàm lượng lysine trong thức ăn chăn nuôi

0,3052

16,0447

0,9868

TACNA3

0,3041

13,6271 13,8890

0,9247

0,3022

0,9193

Ơ H N Y U

1,0085

2,6

0,9220

H Ư

N

G

 RSD = 2,6% < 2,7% phương pháp có độ chụm về hàm lượng lysine (theo AOAC so sánh Bảng 3-1).

Bảng 4.5 RSD (%) của hàm lượng threonine trong thức ăn chăn nuôi

0,3033

0,5625

0,3082

8,5019

0,5517

8,5517

0,5259

0,3041

4,6871

0,3083

-H

0,3052

RSD (%)

0,5655 0,5388

1,99

0,3096 0,3022 4,6972 0,3109 RSD = 1,99 % < 2,7 % phương pháp có độ chụm về hàm lượng threonine (theo AOAC so sánh Bảng 3.1)

TO

-L

ÁN



6,3654

Giá trị trung bình

Ý

TACNA3

0,2263

A

TACNA2

Kết quả thực (% m) 0,5685

TR ẦN

10 00

TACNA1

Kết quả đo trên máy (ppm) 8,6216

B

Khối lượng cân (g)

Ó

Ký hiệu mẫu

4.5.2 Kết quả khảo sát độ đúng của phƣơng pháp

Đ

ÀN

Bảng 4.6 Hàm lượng lysine trong mẫu nguyên liệu Ký hiệu mẫu

D

IỄ N

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

1,0302

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

15,8759

N

0,3082

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

14,6336

RSD (%)

.Q

TACNA2 Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

0,2263

Kết quả Giá trị trung thực bình (% m) 1,2437 1,2684 1,2931

TP

TACNA1

http://daykemquynhon.ucoz.com

0,3033

Kết quả đo trên máy (ppm) 18,8637

Khối lượng cân (g)

Đ ẠO

Ký hiệu mẫu

NL-Lys

Khối lượng cân (g)

Kết quả đo trên máy (ppm)

0,00319

50,763

0,00319

50,215

Kết quả Giá trị trung thực bình (% m) (% mtb) 79,566 79,075 78,584

RSD (%) 1,11%

45 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Kết quả được tổng hợp từ nhiều lần đo và phân tích trong nhiều ngày.

0,3429

25,5945

7,2886

19,5446

1,4929

0,4252

1,1400

AA02

0,3139

28,6263

8,1169

22,6371

1,8240

0,5172

1,4424

ÁN

-L

Ý

AA01

-H

Ó

A

10 00

B

Bảng 4.8 Kết quả phân tích hàm lượng lysine, methionine, threonine trong thức ăn chăn nuôi Kết quả đo trên Khối Kết quả thực Ký máy lượng (% m) hiệu (ppm) cân mẫu (g) Lys Met Thr Lys Met Thr

0,3066

24,6200

6,0543

18,5328

1,6061

0,395

1,2090

AA04

0,3616

9,5872

4,9927

7,0178

0,5303

0,2761

0,3882

AA05

0,3020

10,9189

4,4622

6,9597

0,7232

0,2956

0,4610

AA06

0,3157

13,7869

4,6733

9,3138

0,8735

0,2961

0,5901

AA07

0,3593

14,8867

4,9382

7,5338

0,8287

0,2748

0,4194

AA08

0,3116

11,2955

4,9368

5,8312

0,7250

0,2527

0,3743

AA09

0,3073

15,8565

4,9265

8,0434

1,0320

0,3206

0,5235

D

IỄ N

Ơ

Đ

ÀN

TO

AA03

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

G

N

H Ư

TR ẦN

4.6 Kết quả tiến hành trên mẫu thử

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

77,945 1,03 -1,43 0,01138 54,0887 78,394  Nhận xét: Phương pháp phân tích có độ chệch âm và nhỏ hơn 15 % (theo quy định của USFDA).  Phương pháp phân tích có độ đúng đạt yêu cầu

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

77,496

Độ chệch (%)

N

52,4642

RSD (%)

Y

0,01135

Giá trị trung bình (%mtb)

U

Kết quả thực (% m)

.Q

Kết quả đo trên máy (ppm)

Đ ẠO

NL-Lys

Khối lượng cân (g)

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

Ký hiệu mẫu

H

Bảng 4.7 Độ chệch của phương pháp dựa trên độ chệch của hàm lượng mẫu nguyên liệu

N

 RSD (%) của mỗi mẫu nguyên liệu lysine < 1,3 %. Độ lệch chuẩn hàm lượng lysine đạt (theo tiêu chuẩn của AOAC so sánh Bảng 3.1). Xác nhận giá trị hàm lượng lysine bằng 79,075 % là giá trị quy chiếu được chấp nhận là đúng.

46 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

0,3089

17,4949

7,6280

8,3901

1,1328

0,4939

0,5433

AA11

0,3118

14,8801

6,8050

11,9855

0,9545

0,4365

0,7688

AA12

0,3546

22,081

9,4425

9,7833

1,2455

0,5326

0,5518

AA13

0,3077

29,2035

6,1282

9,3142

1,8982

0,3984

0,6055

AA14

0,3009

10,0644

4,9156

4,7783

0,6690

0,2603

0,3177

AA15

0,3188

20,3316

5,1451

10,5021

1,2756

0,3228

U

0,98

Độ chệch (bias) -2,54

Kết quả phân tích trên mẫu nguyên liệu lysine có RSD (%) < 1,3 % (theo AOAC so sánh Bảng 3.1) và có độ chệch (bias) âm sai lệch -2,54 % nhỏ hơn 15 % (theo quy định của USFDA) Kết quả nhận được đối với các mẫu thử thức ăn chăn nuôi là đáng tin cậy.

10 00

A Ó -H Ý -L ÁN TO

D

IỄ N

Đ

ÀN

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

G

N

77,065

RSD (%)

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

77,18 78,03

B



0,0115 0,0121

Giá trị trung bình (%mtb)

H Ư

NLLys01

Kết quả thực (% m)

TR ẦN

Ký hiệu mẫu

Kết quả đo trên máy (ppm) 44,3785 47,2082

Khối lượng cân

Đ ẠO

Bảng 4.9 Kết quả phân tích hàm lượng mẫu nguyên liệu lysine

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

0,6589

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

Y

N

H

AA10

N

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

47 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Ơ

TO ÀN Đ

IỄ N D

- Kết quả cho thấy các mẫu thức ăn chăn nuôi có hàm lượng lysine khá cao, cụ thể hàm lượng lysine dao động từ 0,53 – 1,89 %, có 8 mẫu thức ăn chăn nuôi phối trộn hàm lượng lysine lớn hơn 1%. Trong khi đó, hàm lượng của methionine và threonine được phối trộn ở mức thấp hơn, cụ thể hàm lượng methionine dao động từ 0,25 – 0,52 % và hàm lượng threonine dao động từ 0,32 – 1,44 %, 3 trong số 15 mẫu có hàm lượng threonine lớn hơn 1 % và hàm lượng methionine chỉ được phối trộn ở mức dưới 0,6 %.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Đề tài “Xác định hàm lƣợng lysine, methionine và threonine trong thức ăn chăn nuôi bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” đạt một số kết quả sau: Khảo sát quy trình định lượng lysine, methionine và threonine trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), với các thông số thẩm định :  Độ tuyến tính khá cao với hệ số tương quan tuyến tính R2 > 0,995 + Phương trình tương quan tuyến tính của lysine: y = 0,029x + 0,0202 R2 = 0,9998 + Phương trình tương quan tuyến tính của methionine: y = 0,0275x + 0,0270 R2 = 0,9991 + Phương trình tương quan tuyến tính của threonine: y = 0,1125x + 0,2695 R2 = 0,9995  Độ chụm đạt yêu cầu (theo tiêu chuẩn của AOAC) + RSD = 2,6 % đối với lysine + RSD = 2,5 % đối với methionine + RSD = 1,99 % đối với threonine  Độ đúng đạt yêu cầu (theo tiêu chuẩn của USFDA) + Độ chệch (bias) = -1,43 % đối với mẫu nguyên liệu lysine  Giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện thấp: + Lysine: LOD = 1,131 ppm LOQ = 3,393 ppm + Methionine: LOD = 1,343 ppm LOQ = 4,029 ppm + Threonine: LOD = 1,593 ppm LOQ = 4,779 ppm - Phân tích trên 15 mẫu thức ăn chăn nuôi và 1 mẫu nguyên liệu cho kết quả tốt, với độ lệch chuẩn của mẫu nguyên liệu đạt RSD = 0,98 % (theo tiểu chuẩn của AOAC), độ chệch (bias) âm với sai lệch -2,54 % nhỏ hơn 15 % cho phép theo tiêu chuẩn của USFDA.

N

4.1 Kết luận

- Từ kết quả phân tích có được ta có thể xác nhận giá trị hàm lượng của lysine, methionine, threonine phù hợp với nhu cầu amino acid trong khẩu phần

48 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

Y

N

H

- Với kết quả trên cho thấy phương pháp xác định hàm lượng của lysine, methionine, threonine có thể áp dụng để phân tích hầu hết các loại amino acid bậc 1, giúp đánh giá một cách chính xác giá trị dinh dưỡng thức ăn chăn nuôi nói riêng và các sản phẩm dinh dưỡng khác nói chung thông qua việc phân tích trên máy HPLC.

N

ăn của gia súc và gia cầm (theo tiêu chuẩn của NRC – 1994, NRC – 1998, TCVN 2265: 1994).

-L

Ý

-H

- Có thể ứng dụng cơ sở của phương pháp để phân tích thêm các loại amino acid và các loại hợp chất khác như: glycine, serine, cystein, amine, acid nucleic,... để mở rộng phạm vi ứng dụng của phương pháp.

Đ

ÀN

TO

ÁN

- Tiến hành tạo dẫn xuất các amino acid với tác chất khác và so sánh hiệu suất thu hồi giữa hai phương pháp.

- Tiến hành xử lý mẫu bằng phương pháp khác như: thủy phân mẫu bằng kiềm, enzyme...

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

Ó

A

10 00

B

- Vì thời gian thực hiện đề tài khá ngắn, nên phương pháp vẫn chưa khảo sát được các điều kiện của quy trình xử lý mẫu như: nhiệt độ, nồng độ dung dịch thủy phân, nồng độ tác chất, thời gian ủ mẫu,..và thực hiện trên các loại nền mẫu khác nhau, để giúp đề tài phong phú và đa dạng hơn. Đồng thời, đánh giá lại các thông số thẩm định một cách bài bản hơn để xác định giá trị của phương pháp phân tích.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

TR ẦN

H Ư

N

G

- Các công ty đơn vị sản xuất và phân phối thức ăn chăn nuôi trên thị trường nên ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng amino acid trong quá trình kiểm tra đánh giá chất lượng sản phẩm nhằm nâng cao chất lượng cũng như tiết kiệm được chi phí và nguyên liệu phối trộn để mang lại hiệu quả kinh tế hơn nữa.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Đ ẠO

TP

Từ các kết quả phân tích trong quá trình thực hiện đề tài em có một số kiến nghị như sau:

IỄ N D

U .Q

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

4.2 Kiến nghị

- Tối ưu hóa điều kiện phân tích trên máy hoặc phát hiện chất phân tích với các loại đầu dò khác như: UV-VIS, FLD... hoặc tiến hành phân tích với một phương pháp khác như: GC-MS, GC-FID, LC-MS... và so sánh khả năng phân tích amino acid giữa các phương pháp.

49 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Tố (Chủ biên), 2008. Sinh hóa học động vật. Giáo trình. Nhà xuất bản Nông nghiệp. Hà Nội. Trang 20-27.

[2] Cao Đăng Nguyên (Chủ biên), 2006. Công nghệ protein. Giáo trình. Nhà xuất bản Đại học Huế. Huế. Trang 13-25.

[3] Nguyễn Tiến Toàn, 2012. Nghiên cứu ảnh hưởng của lysine và probiotics trong thức ăn hỗn hợp đến khả năng sinh trưởng và chất lượng thịt gà ta nuôi thương phẩm. Luận văn thạc sĩ kỹ thuật. Đại học Nha Trang. Nha Trang.

[4] Ngô Anh Thư và Nguyễn Anh Thư, 2008. Acid amin không thay thế.

Tiểu luận. Trường Đại học Bách Khoa. Thành phố Hồ Chí Minh.

[5] Nguyễn Thị Diệp Chi, 2008. Các phương pháp phân tích hiện đại. Giáo trình. Nhà xuất bản trường Đại học Cần Thơ. Cần Thơ.

[6] Đoàn Bảo Quốc, 2005. Nuôi trồng và xác định thành phẩn amino acid của một số loài nấm bào ngư (Pleurotus spp.) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (high performance liquid chromatography - HPLC). Luận văn tốt nghiệp. Đại học Nông Lâm. Thành phố Hồ Chí Minh.

[7] Lê Thị Hồng Thảo, 2005. Nghiên cứu úng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) tối ưu hóa một số điều kiện phân tích acid amin trong cá. Đề tài nghiên cứu cấp viện. Viện dinh dưỡng. Hà Nội.

[8] Nguyễn Huy Du, Nguyễn Văn Đông, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Nguyễn Thị Thùy Luyên và Nguyễn Ánh Mai, 2012. Cải tiến quy trình xác đinh thành phần axit amin. Tạp chí phát triên KH&CN. Tập 14.

[9] Silvia Marten and Mareike Margraf, 2012. Determination of Amino acids by UHPLC with automated OPADerivatization by the Autosampler.

[10] Trần Cao Sơn (Chủ biên), 2010. Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nội.

Trang 16-57.

[11] TCVN 8764 : 2010 ISO 13903 : 2005. Thức ăn chăn nuôi – xác định hàm lượng acid amin.

[12] AOAC Official Method 999.13, 2002.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U

Y

N

H

Ơ

N

[1]

50 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

ÀN

Đ

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

A

Ó

-H B

10 00 TR ẦN G

N

H Ư

Đ ẠO

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Ý

-L

PHỤ LỤC TP

Y

U

.Q

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÁN

TO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Ơ

H

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

51

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

ÀN

Đ

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

A

Ó

-H B

10 00 TR ẦN G

N

H Ư

Đ ẠO

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Ý

-L

TP

Y

U

.Q

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÁN

TO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Ơ

H

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

ĐỒ THỊ ĐƢỜNG CHUẨN VÀ PHƢƠNG TRÌNH ĐƢỜNG CHUẨN

52

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

ÀN

Đ

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

A

Ó

-H B

10 00 TR ẦN G

N

H Ư

Đ ẠO

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Ý

-L

TP

Y

U

.Q

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÁN

TO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Ơ

H

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

SẮC KÝ ĐỒ CỦA CÁC ĐIỂM CHUẨN

53

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

ÀN

Đ

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

A

Ó

-H B

10 00 TR ẦN G

N

H Ư

Đ ẠO

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Ý

-L

TP

Y

U

.Q

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÁN

TO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Ơ

H

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

54

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

ÀN

Đ

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

A

Ó

-H B

10 00 TR ẦN G

N

H Ư

Đ ẠO

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Ý

-L

TP

Y

U

.Q

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÁN

TO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Ơ

H

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

55

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

ÀN

Đ

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

A

Ó

-H B

10 00 TR ẦN G

N

H Ư

Đ ẠO

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Ý

-L

TP

Y

U

.Q

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÁN

TO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Ơ

H

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

56

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

ÀN

Đ

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

A

Ó

-H B

10 00 TR ẦN G

N

H Ư

Đ ẠO

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Ý

-L

TP

Y

U

.Q

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÁN

TO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Ơ

H

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

57

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

ÀN

Đ

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

A

Ó

-H B

10 00 TR ẦN G

N

H Ư

Đ ẠO

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Ý

-L

TP

Y

U

.Q

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÁN

TO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Ơ

H

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

58

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

ÀN

Đ

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

A

Ó

-H B

10 00 TR ẦN G

N

H Ư

Đ ẠO

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Ý

-L

TP

Y

U

.Q

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÁN

TO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Ơ

H

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT ĐỘ CHỤM CỦA PHƢƠNG PHÁP

59

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

ÀN

Đ

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

A

Ó

-H B

10 00 TR ẦN G

N

H Ư

Đ ẠO

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Ý

-L

TP

Y

U

.Q

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÁN

TO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Ơ

H

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

60

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

ÀN

Đ

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

A

Ó

-H B

10 00 TR ẦN G

N

H Ư

Đ ẠO

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Ý

-L

TP

Y

U

.Q

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÁN

TO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Ơ

H

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT ĐỘ ĐÚNG MẪU NGUYÊN LIỆU LYSINE

61

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

ÀN

Đ

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

A

Ó

-H B

10 00 TR ẦN G

N

H Ư

Đ ẠO

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Ý

-L

TP

Y

U

.Q

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÁN

TO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Ơ

H

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

SẮC KÝ ĐỒ CỦA MẪU THỨC ĂN CHĂN NUÔI

62

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

ÀN

Đ

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

A

Ó

-H B

10 00 TR ẦN G

N

H Ư

Đ ẠO

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Ý

-L

TP

Y

U

.Q

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÁN

TO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Ơ

H

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

63

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial