Xác định hàm lượng axit amin thủy phân trong một số loài nấm bằng phương pháp HPLC (2014)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập -Tự do -Hạnh phúc

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên : Khóa Ngành

: :

Nguyễn Duy Trọng Hoàng Thị Nga 51 Công nghệ thực phẩm

Mssv: 1052043902 Mssv: 1052040676

1. Tên đề tài: Xác định hàm lượng axit amin thủy phân trong một số loài nấm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao 2. Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp:

………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………

Cán bộ hướng dẫn : Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày hoàn thành đồ án :

ThS. Hoàng Văn Trung Ngày tháng năm 2014 Ngày tháng năm 2014 Ngày

Chủ nhiệm bộ môn (Ký ghi rõ họ tên)

Sinh viên đã hoàn thành và nộp đồ án vào ngày

tháng

năm 2014

Cán bộ hướng dẫn (Ký, ghi rõ họ tên)

tháng

năm 2014 Người duyệt (Ký, ghi rõ họ tên)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập –Tự do –Hạnh phúc

BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Nguyễn Duy Trọng Hoàng Thị Nga

Msv: 105204 Msv: 1052040676 Ngành: Công nghệ thực phẩm

Khóa: 51 Cán bộ hướng dẫn: ThS. Hoàng Văn Trung Cán bộ duyệt: 1. Nội dung nghiên cứu, thiết kế:

……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………

2. Nhận xét của cán bộ hướng dẫn: ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………............. ….................................................................................................................................

Ngày

tháng năm 2014 Cán bộ hướng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập –Tự do –Hạnh phúc

BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Nguyễn Duy Trọng Hoàng Thị nga Khóa: 51 Cán bộ hướng dẫn: ThS. Hoàng Văn Trung Cán bộ duyệt:

Msv: 105204 Msv: 1052040676 Ngành: Công nghệ thực phẩm

3. Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………

4. Nhận xét của cán bộ duyệt: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ……………………………………..…………………………………………............. ….................................................................................................................................

Ngày

tháng năm 2014 Cán bộ duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên)

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận được thực hiện tại phòng thí nghiệm Trung tâm Kiểm định An toàn Thực phẩm và Môi trường - Trường Đại học Vinh.

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Vinh, bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho chúng tôi trong thời gian học tập tại trường.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, chúng tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến thầy giáo Th.S Hoàng Văn Trung - Khoa Hóa học - Trường Đại học Vinh đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài.

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Chu Thị Thanh Lâm – Trung tâm kiểm định An toàn thực phẩm và Môi trường – T.T Thực hành thí nghiệm - Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ chúng tôi trong quá trình làm thí nghiệm. Đề tài được hoàn thành nhờ sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài Nghị định thư hợp tác Việt Nam – Đài Loan của PGS.TS Trần Đình Thắng – Khoa Hóa học, trường Đại Học Vinh.

Chúng tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các cán bộ trong Trung tâm Thí nghiệm đã giúp đỡ chúng tôi trong quá trình thực hiện đề tài này.

Và lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ chúng tôi hoàn thành đề tài.

Vinh, ngày Sinh

tháng năm 2015 viên

thực

hiện

Nguyễn Duy Trọng Hoàng Thị Nga

1

Tóm Tắt Nguyễn Duy Trọng, Hoàng Thị Nga lớp 51K Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa Hóa Học, Trường Đại học Vinh. Phân tích axit amin thủy phân trên một số loài nấm tự nhiên bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC).

Giảng viên hướng dẫn: Th.s Hoàng Văn Trung Khóa luận được thực hiện trên 7 đối tượng là nấm tự nhiên, đây là các loài nấm lớn, có tác dụng to lớn đối với con người. Vì vậy, thành phần dinh dưỡng, đặc biệt là thành phần amino axit rất được quan tâm. Để thực hiện phân tích chúng tôi tiến hành xử lí mẫu và sử dụng máy sắc kí lỏng cao áp (HPLC) của Trung tâm Kiểm định An toàn Thực phẩm và Môi trường - Trường Đại học Vinh.

Những kết quả đạt được: Chúng tôi xác định được các điều kiện tách và định lượng axit amin bằng HPLC. Xây dựng được đường chuẩn của các axit amin. Khảo sát được giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp.

Từ đó phân tích và định lượng được các loại axit amin trong 7 mẫu nấm tự nhiên.

2

BẢNG KÍ HIỆU CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt AOAC

Tên đầy đủ Hiệp hội các nhà hoá học phân tích chính thống

AQC

Aminoquinolil- Nhydroxysuccinimidyl cacbamat

Dm

Chất khô

EAA

Axit amin thiết yếu

FMOC

9-florenylmetyl cloroformat

GC

Sắc ký khí Sắc ký khí detector ion hóa ngọn lửa

GC/FID

Tên tiếng anh Association of Official Analytical Chemists Aminoquinolil- Nhydroxysuccinimidyl carbamate dry matter Essential amino acid 9-florenylmethyl cloroformate Gas chromatography Gas chromatography/ flame ionization detector Gas chromatography/ mass spectrometry High performance liquid chromatography

GC/MS

Sắc ký khí khối phổ

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

KPH

Không phát hiện

MeOH

Metanol

Methanol

NEAA

Axit amin không thiết yếu ortho-phthalaldehyd/ orthophthaldialdehyd Phenylisothioxyanat

RP-HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha ngược

TAA

Tổng axit amin

Nonessential amino acid ortho-phthalaldehyd/ orthophthaldialdehyd Phenylisothiocyanate Reverse phase - High performance liquid chromatography Total amino acid

TEA

Trietylamin

Triethylamine

THF

Tetrahydrofuran

Tetrahydrofuran

OPA PITC

3

MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học cao trên thế giới với khoảng 12000 loài thực vật bậc cao và 3000 loài động vật có xương sống đã được mô tả, trong đó có những loài đặc hữu. Cấu trúc địa chất độc đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu nhiệt đới gió mùa đã góp phần tạo nên sự đa dạng của hệ nấm Việt Nam, đây là nguồn có giá trị tài nguyên rất to lớn.

Nấm có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống con người, chúng là nguồn thực phẩm giàu chất dinh dưỡng (Termitomyces albuminosus, Macrocybe gegantea), là nguồn thức ăn quý được nhân dân ưa chuộng, chứa nhiều protein, các chất khoáng và vitamin (A, B, C, D, E...). Nhiều loài nấm được ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm, là nguồn nguyên liệu để điều chế các hoạt chất điều trị bệnh như: Laricifomes officinalis là nguyên liệu để chiết aragicin dùng trong chữa bệnh lao hoặc dùng làm thuốc nhuận tràng hay chất thay thế cho quinine. Các chế phẩm từ nấm linh chi (Ganoderma) được dùng để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh như bệnh gan, tiết niệu, tim mạch, ung thư, AIDS. Trong quả thể của Ganoderma lucidum có các hoạt chất khác có hoạt tính kháng virus. Chúng có tác dụng kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của virus HIV. Các hoạt chất từ Ganoderma applanatum có hiệu lực chống khối u cao, chúng được sử dụng trong điều trị ung thư: ung thư phổi, ung thư vú, ung thư dạ dày. Các dẫn xuất adenosine có trong Ganoderma capense và G. amboinense có tác dụng giảm đau, giãn cơ, ức chế kết dính tiền tiểu cầu.

Nhiều hoạt chất từ linh chi có khả năng đào thải phóng xạ, hạn chế và loại trừ những tổn thương do phóng xạ ở mô và tế bào.

Protein trong nấm có giá trị dinh dưỡng cao hơn so với hầu hết các protein thực vật (Belitz & Grosch, 1999) [15]. Axit amin cung cấp cho cơ thể

4

từ thực phẩm giàu protein. Protein khi đi vào cơ thể được chuyển hóa thành 20 axit amin, trong đó có 8 axit amin thiết yếu (bắt buộc phải được cung cấp từ thức ăn, thức uống). Axit amin là thành phần quan trọng thực hiện các chức năng đa dạng của cơ thể sống, là tiền thân của nhiều sinh chất quan trọng trong cơ thể sống. Axit amin tạo nên tế bào, phục hồi mô, tạo nên các kháng thể chống lại vi khuẩn và virut, là một phần của enzym và hệ thống hormone. Nó tạo nên ARN, AND vận chuyển oxi đi khắp cơ thể và tham gia vào hoạt động của các cơ. Sự thiếu hụt axit amin dẫn đến cơ thể mệt mỏi, hạ đường huyết, dị ứn[64].

Hiện nay với sự phát triển của kỹ thuật phân tích, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích đơn giản, nhanh, có độ tin cậy cao. Trong những năm gần đây, HPLC được ứng dụng rộng rãi trong phân tích, đánh giá chất lượng thực phẩm như axit amin, vitamin, kháng sinh, phụ gia thực phẩm... Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi lựa chọn đề tài : “Nghiên cứu xác định hàm lượng các axit amin thủy phân trong một số loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung Bộ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC”.

2. Mục đích nghiên cứu Xây dựng phương pháp tách và định lượng đồng thời các axit amin trong các loại nấm khác nhau, cung cấp số liệu về thành phần dinh dưỡng (axit amin) trong một số loại nấm được nghiên cứu.

3. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu xác định các axit amin trên loại nấm tự nhiên được thu thập từ rừng Quốc gia Pù Mát, Phong Nha Kẻ Bàng thuộc vùng Bắc Trung Bộ. gồm: - Mẫu nấm PL1

5

H1: Mẫu nấmPL1

H2: Mẫu nấm PL2

H4: Mẫu nấm TH

H5: Mẫu nấm Linh Chi

H3:Mẫu nấm PL3

H6: Nấm Linh Chi Đen

4. Nhiệm vụ nghiên cứu

- Tổng quan về nấm, các axit amin và phương pháp định lượng axit amin.

- Xác định các điều kiện tách và định lượng axit amin bằng HPLC. - Xây dựng đường chuẩn của các axit amin.

- Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp.

- Đánh giá thống kê phương pháp phân tích: + Hiệu suất thu hồi.

- Định lượng axit amin bằng phương pháp HPLC.

6

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Nấm 1.1.1. Giới thiệu về nấm - giới nấm ( tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn có thành tế bào bằng kitin (chitin). Phần lớn phát triển dưới dạng các sợi đa bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium), một số nấm khác lại phát triển dưới dạng đơn bào. Quá trình sinh sản (hữu tính hoặc vô tính) của

7

nấm thường qua bào tử, được tạo ra trên những cấu trúc đặc biệt hay thể quả.

Một số loài lại mất khả năng tạo nên những cấu trúc sinh sản đặc biệt và nhân lên qua hình thức sinh sản sinh dưỡng.

Thật ngữ “Nấm” đã được sử dụng với nhiều cách khác nhau tại những thời điểm khác nhau và ở các nước khác nhau. Thuật ngữ nấm được sử dụng rộng rãi bao trùm tất cả các loại nấm lớn, hoặc tất cả các loại nấm với thân và mũ, hoặc tất cả nấm thịt lớn. Một cách sử dụng hạn chế hơn chỉ bao gồm những loại nấm lớn đó là có thể ăn được hoặc có giá trị chữa bệnh. Nấm được định nghĩa theo nghĩa rộng như sau: “Nấm là nấm lớn với quả thể phân biệt rõ mà có thể là mọc trên mặt đất hoặc dưới đất và đủ lớn để thấy được bằng mắt thường và được thu hoạch bằng tay” (Chang và Miles, 1992). Theo định nghĩa này, nấm không cần phải là lớp nấm đảm, hoặc trên không, hoặc có thịt, hoặc ăn được. Nấm có thể là lớp nấm túi hay nấm nang, mọc từ dưới lên, có một kết cấu không nhiều thịt và không nhất thiết ăn được. Định nghĩa này không phải là hoàn hảo nhưng có thể chấp nhận được, nhưng có thể dùng để đánh giá số lượng nấm trên trái đất (Hawksworth,2001).

- nấm được ứng dụng rộng rãi trong đời sống lẫn sản xuất, nhiều loài được sử dụng trong công nghệ thực phẩm, sử dụng làm thức ăn hoặc trong quá trình lên men. Nấm còn được sử dụng làm chất kháng sinh, hooc môn trong y học và nhiều loại enzym. Tuy vậy, nhiều loài nấm lại có chứa các chất hoạt động sinh học được gọi là mycotoxin, như ancaloit và polyketit, là những chất độc đối với động vật và con người. Một số laoif nấm được sử dụng để kích thích hoặc trong các nghi lễ truyền thống với vai trò tác động lên trí tuệ và hành vi của con người. Vài loại nấm có thể gây ra các chứng bệnh cho con người và động vật, cũng như bệnh dịch cho cây trồng, mùa màng và có thể gây tác động lớn đến an ninh lương thực và kinh tế.

1.1.2. Phân loại nấm

8

Nấm là một giới riêng biệt khoảng 1,5 triệu loài, trong đó đã mô tả được 69000 loài (Hawksworth, 1991)[30], sống khắp nơi trên trái đất từ hốc tường đến thực vật, động vật và con người: bao gồm nấm men, nấm mốc và các loài nấm lớn. Nấm là các sinh vật có nhân thực (được xếp vào nhóm eukaryote) có vách tế bào bao bọc bên ngoài thường chứa chitin polysaccharide, chất béo và protein. Nấm không có chất diệp lục và do đó không thể thực hiện quá trình quang hợp. Do đó, nấm phải hấp thu chất dinh dưỡng từ các nguồn khác nhau. Nấm sinh sản hữu tính hoặc vô tính và có bộ máy sinh dưỡng thường là dạng sợi có cấu trúc phân nhánh gọi là sợi nấm.

Năm 1969 nhà khoa học người Mỹ R.H. Whittaker [62] đã đưa ra hệ thống phân loại sinh vật thành năm giới sau đây: - Giới khởi sinh: Bao gồm vi khuẩn và tảo lam.

- Giới nguyên sinh: Bao gồm một số loài đơn bào, một số nấm đơn bào có roi và nhóm các động vật nguyên sinh.

- Giới thực vật.

- Giới nấm.

- Giới động vật.

1.1.3. Đặc điểm dinh dưỡng của nấm 1.1.3.1. Chất khô, giá trị năng lượng Hàm lượng chất khô trong nấm tươi là rất thấp, thường trong khoảng 60-140g/kg và chủ yếu bao gồm carbohydrate, protein, chất xơ và khoáng chất. Thông thường, hàm lượng chất khô 100 g/kg đã được sử dụng để tính toán nếu giá trị thực tế là không rõ. Hàm lượng nước cao và như vậy có ảnh hưởng đến kết cấu và tham gia vào tuổi thọ ngắn của quả thể.

Hàm lượng lipid và chất khô thấp dẫn đến giá trị năng lượng thấp của nấm. Các giá trị 86,4; 165; 126; 101 và 112 kJ/100g nấm tươi đã được báo

9

cáo cho các loài A. bisporus, Lactarius deliciosus, Leucopaxillus giganteus, Sarcodon imbricatus và T. portentosum (Barros et al., 2007a) [12]. Các giá trị 118; 87,3; 131 và 159 kJ đã được tìm thấy cho các loài Cantharellus cibarius, L. nuda, Lycoperdon perlatum và Ramaria

Botrytis (Barros, Venturini,

Baptista, Estevinho, & Ferreira, 2008) [13]. Colak, Kolcuoglu, Sesli, và Dalman (2007) xác định giá trị 155 kJ là của loài A. rubescens và 259 kJ cho loài L. Nuda [20]. Do đó, nấm là một nguồn thực phẩm có giá trị năng lượng thấp.

1.1.3.2. Protein và axit amin Nấm là một nguồn tuyệt vời của protein . Giá trị dinh dưỡng của nấm chủ yếu liên quan đến hàm lượng protein của chúng. Protein nấm được coi là có chất lượng dinh dưỡng cao hơn so với protein thực vật (FAO, 1991) [27].

Hàm lượng protein của nấm không chỉ phụ thuộc vào yếu tố môi trường và các giai đoạn trưởng thành của quả thể, mà còn phụ thuộc vào các loài khác nhau (Colak , Faiz , & Sesli , 2009) [19].

Các giá trị đã được công bố về hàm lượng protein trong 4 loài nấm ăn phổ biến: agaricus bisporus (nấm mỡ), lentinula edodes (nấm hương), pleurotus spp (nấm sò), và volvariella volvacea (nấm rơm), đây là các loài nấm trồng thương mại ở các nước khác nhau, chiếm từ 1,75-3,63% trọng lượng tươi của nấm [17]. Hàm lượng protein trong nấm hoang, nhìn chung, cao hơn 2 lần so với măng tây và cải bắp, gấp 4 lần và 12 lần so với cam và táo tương ứng. Với trọng lượng khô thì nấm thường chứa 19-35% protein, so sánh với 7,3% trong gạo, 13,2% trong lúa mì, 39,1% trong đậu tương và 25,2% trong sữa. Như vậy, hàm lượng protein thô của nấm xếp hạng thấp hơn so với hầu hết thịt các loài động vật nhưng cao hơn hầu hết các loài thực phẩm khác bao gồm sữa, thứ được sản xuất từ động vật [32].

10

Hàm lượng protein thô trong các loài nấm khác nhau cũng được báo cáo bởi Bauer-pettrovska (2001) [14]. Tác giả đã xác định được hàm lượng protein thô trung bình là 32,6% dm (dry matter: chất khô) của 47 loài nấm hoang ở Hy lạp. Hàm lượng cao nhất là 48,8% dm và 51,2% dm có trong loài Calocybe gambosa và Macrolepiota mastoidea và thấp nhất chỉ 16,2% dm là trong loài C. Cibarius.

Hàm lượng protein trong chất khô, hầu như không thay đổi trong suốt quá trình sấy khô nấm ở 40°C hoặc làm lạnh đến -20°C; còn khi đun sôi nấm tươi gây ra sự giảm đáng kể (Barros, Baptista, Correia, Morais, & Ferreira, 2007b) .

Trong "Nấm", Chang và Miles xếp hạng thực phẩm theo axit amin thiết yếu của chúng liên quan đến các yêu cầu chế độ ăn uống dành cho người lớn trong một chỉ số định lượng trên thang điểm từ 0 đến 100. Nấm (98) xếp hạng chỉ dưới thịt (100) và cao hơn rau bina (76). Đặc biệt có sự hiện diện hầu như đủ các loại axit amin, trong đó có 8 loại axit amin cần thiết cho con người.

Thành phần axit amin trong nấm gần bằng hoặc cao hơn so với protein đậu nành, và thậm chí đối với một số loài nấm thành phần có thể tương tự như của trứng gà (Yin and Zhou 2008) [66].

Theo FAO/WHO, nấm được coi là giàu axit glutamic, axit aspartic và arginine, tuy nhiên, các protein của chúng là thiếu methionine và cysteine. Các axit amin hạn chế là leucine và lysine có trong L. edodes và P. ostreatus (nấm sò tím) và P. eryngii (nấm sò vua). Điều thú vị là hai loại axit amin không phổ biến : axit γ -amino butyric và ornithine đã được phát hiện, hai chất này thể hiện các chức năng sinh lí quan trọng [42].

Hàm lượng của axit amin tự do trong nấm là thấp, chỉ khoảng 1% dm.

Vì thế, sự đóng góp thành phần dinh dưỡng của chúng là bị hạn chế. Tuy nhiên, chúng tham gia vào hương vị của nấm. Axit glutamic và alanin được 11

báo cáo là axit amin tự do phổ biến trong T. portentosum and T. terreum (Díez & Alvarez, 2001) [23].

1.1.3.3. Lipid (chất béo) Nấm ăn cung cấp một lượng chất béo thấp. Nói chung, các axit béo không bão hòa chiếm ưu thế hơn các axit béo bão hòa đặc biệt là axit panmitic, axit oleic và axit linoleic, trong khi đó các axit béo còn lại chỉ được tìm thấy với lượng nhỏ, ngoại trừ trường hợp loài Lactarius deliciosus nó có chứa một lượng lớn của axit stearic. Axit linolenic là tiền thân cho 1-octen-3-ol (còn gọi là nấm rượu), là hợp chất thơm chủ yếu có trong hầu hết các loại nấm, nó là thành phần đặc trưng và đặc sắc góp phần vào hương vị nấm [25].

Hàm lượng lipid tổng (chất béo thô) dao động chủ yếu từ 2% đến 6 % hàm lượng chất khô. Trong thành phần axit béo, axit linoleic không bão hòa đa (C18 : 2), axit oleic không bão hòa đơn (C18 : 1) và axit palmitic bão hòa (C16 : 0) là phổ biến. Tỷ lệ dinh dưỡng của axit bão hòa stearic (C18 : 0), và đặc biệt là axit α -linolenic mong muốn (C18 : 2) thì thấp. Hàm lượng các axit béo khác chỉ ở mức độ thấp. Hàm lượng của axit chuỗi nhánh và các axit béo hydroxyl là không đáng kể ( Nedelcheva et al., 2007) [50].

Giá trị dinh dưỡng của chất béo trong nấm hoang là hạn chế vì hàm lượng lipid tổng là thấp và axit béo mong muốn n-3(axit béo omega-3) chiếm tỉ lệ thấp.

1.1.3.4. Cacbohydrat và chất xơ Cacbohydrat thường chiếm một lượng phổ biến trong quả thể.

Cacbohydrat tiêu hóa được tìm thấy trong nấm là mannitol (0,3-5,5 % dm) (Vaz et al., 2011) [59], glucozơ (0,5-3,6% dm) (Kim et al., 2009) [34] và glycogen (1,0-1,6% dm ) (Díez & Alvarez, 2001). Cacbohydrat không tiêu hóa chiếm một phần lớn trong tổng cacbohydrat của nấm, và các hợp chất chính là 12

oligosaccarit và polysaccarit không tinh bột như chitin, β -glucan và mannan [61].

Chất xơ thô là nhóm cacbohydrat khó tiêu hóa. Nó làm giảm mức cholesterol và lượng đường trong máu thấp hơn. Lượng chất xơ hòa tan và không hòa tan trong nấm Boleztus tương ứng khoảng 4-9% và 22-30% dm (Manzi, Marconi, Aguzzi, & Pizzoferrato, 2004) [43]. Một số nấm được tìm thấy là ít chất xơ thô, ví dụ như loài Craterellus aureus và Sarcodon aspratus là 5% dm, trong khi đối với nhiều loài khác, lên đến 40% dm như loài Lactarius volemus (Yin and Zhou (2008). Trong nấm thì hàm lượng chất xơ không hòa tan cao hơn so với chất xơ hòa tan. β-glucan chiếm từ 4-13% tổng lượng chất xơ và sự dao động này phụ thuộc vào các loài nấm khác nhau.

1.1.3.5. Vitamin Nấm chứa nhiều vitamin chính bao gồm thiamin (vitamin B1), riboflavin (vitamin B2), niacin (vitamin B3), tocopherol and vitamin D (Cheung, 2010; Kalac, 2013). Một số tác giả đã xem nấm như một nguồn cung cấp vitamin dựa trên hàm lượng cao của riboflavin (vitamin B2), niacin và của vitamin C, vitamin B1, vitamin D, β-caroten (tiền vitamin A), vitamin E và vitamin B12.

Nấm giống như là nguồn thức ăn không động vật chứa vitamin D, và vì thế chúng là nguồn vitamin D tự nhiên cho người ăn chay. Hàm lượng vitamin D2 là đáng kể trong một số loài nấm hoang dã, nhưng nó gần như vắng mặt trong các loài nấm trồng [45].

Quá trình nấu và chế biến công nghiệp đã được phát hiện là có ảnh hưởng đến hàm lượng vitamin trong sản phẩm. Vitamin B1 và B2 bị mất trong quá trình chế biến công nghiệp (đóng hộp) của loài Boletus ở mức 21-57% và 8-74%, tương ứng (Zhou and Yin, 2008).

1.1.3.6. Thành phần khoáng chất

13

Nấm là một nguồn tốt của các nguyên tố khoáng. Nguyên tố khoáng có hàm lượng cao nhất là kali, tiếp theo là photpho, natri, canxi và magie. Chúng được coi là thành phần nguyên tố khoáng chính, và đồng, kẽm, sắt, mangan, cadimi là những nguyên tố khoáng phụ.

Tính toán nồng độ thành phần của K, P, Na, Ca và Mg chiếm khoảng 56-70% tổng hàm lượng tro [36]. K là phong phú và chiếm khoảng gần 45% tổng hàm lượng tro. Hàm lượng tro trong nấm thường chiếm từ 5-12% trọng lượng khô. Nhìn chung, hàm lượng tro của nấm có phần cao hơn hoặc tương đương với hầu hết các loại rau. Nấm chứa hàm lượng cao của photpho, kali và tương đối cao của magiê. Tuy nhiên, một số nguyên tố còn lại sẵn có trong nấm vẫn chưa được biết hàm lượng. Điểm lưu ý đặc biệt là sự tích tụ trong nấm vết kim loại nặng, đặc biệt là các nguyên tố độc hại như cadimi, chì và thủy ngân, thường có mặt trong các chất nền nuôi cấy. Thật vậy, loài L. edodes được chứng minh là tích trữ một lượng cadimi hiệu quả, trong khi loài A. bisporus, P. ostreatus, L. edodes và một số loài thuộc chi Boletus tự nhiên giàu selen [26].

1.1.3.7. Thành phần hương vị Hương vị đặc trưng của nấm được đánh giá cao bởi nhiều người tiêu dùng. Hàng trăm hợp chất có mùi đã được xác định. Theo cấu trúc hóa học của các hợp chất này thì chúng có thể được phân loại là chất dẫn xuất của octan và octen, tecpen, dẫn xuất của benzandehit, hợp chất của lưu huỳnh và những chất khác (Gross và Asther, 1989) [28].

Hương vị đặc trưng của nấm hoang có thể được phân thành: thành phần không bay hơi (vị) và các thành phần dễ bay hơi (mùi). Các hợp chất dễ bay hơi khác nhau như tecpen, các dẫn xuất của octan, 1- octen và 2 -octen, rượu và este của chúng với các axit béo dễ bay hơi, xeton là những hợp chất

14

thơm chính trong nấm, hình thành nên hương vị rất đặc trưng của nấm. Vai trò chính được gán cho" nấm rượu " 1- octen -3 -ol. Vị độc đáo của nấm được gán cho axit amin tự do, 5’-nucleotit và đường hòa tan. Hàm lượng các axit amin và 5’-nucleotit trong nấm cục lần lượt là 1,5–7,1 và 0,6–1,2 mg/g. Cả hai loại thành phần này đều thấp hơn so với sợi nấm sau khi lên men ( Liu , Li , & Tang, 2012) [37].

1.1.3.8. Thành phần chất chống oxi hóa Ngoài thành phần dinh dưỡng của nấm, một số loài nấm ăn rất giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học, có khả năng chống oxi hóa cao. Hàm lượng của các hợp chất hoạt tính sinh học có thể thay đổi đáng kể trong nấm ăn được, vì nồng độ của các chất bị ảnh hưởng bởi sự khác biệt trong chất nền, điều kiện trồng trọt và điều kiện đậu quả, giai đoạn phát triển, tuổi của nấm tươi, điều kiện bảo quản, chế biến…

Các hợp chất phenolic có thể là phần đóng góp quan trọng nhất cho khả năng chống oxy hóa của nấm ăn (Guo et al., 2012 ) [29]. Barros et al báo cáo rằng nồng độ flavonoit (hợp chất phenolic) từ khoảng thấp hơn 0,47 đến cao hơn 16,56 mg/g trong nấm hoang dã [11]. Quercetin, catechin, axit pcoumaric, axit caffeic và axit gallic là các phenolic chính. Quercetin là thành phần chính trong C. ventricosum (66,7 mg/kg dm) và catechin là thành phần chính trong L. amethystea (34,4 mg/kg dm) (Liu, Sun et al., 2012) [38].

Ergothionin là một hợp chất thiol hòa tan trong nước, là một chất chống oxy hóa tuyệt vời trong cơ thể. Hàm lượng ergothionin từ 48 đến 2851 mg/kg dm cho 29 loài nấm (Chen, Ho, Hsieh, Wang, & Mau, 2012) [18]. Vì vậy, nấm ăn được từ tự nhiên có vẻ phong phú về ergothionin và có thể cải thiện khả năng chống oxy hóa trong các bữa ăn.

1.1.3.9. Thành phần có hại và kháng dinh dưỡng của nấm ăn

15

Các thành phần nguy hiểm của nấm độc đã được nghiên cứu rộng rãi.

Tuy nhiên, một số hợp chất tự nhiên gây hại cũng có ở các loài nấm ăn. Sự quan tâm đã được tập trung vào các hiđrazin với hoạt tính gây ung thư, hợp chất agaritin có trong loài nấm Agaricus spp (Andersson & Gry, 2004) và gyromitrin trong loài Gyromitra esculenta ( Karlson - Stiber & Persson, 2003).

Hoạt tính ức chế của trypsin được quan sát thấy ở nhiều loài nấm phát triển hoang dã với sự khác biệt đáng kể trong các loài khác nhau (Vetter, 2000) [60].

Nicotin là một ankaloit dồi dào có trong thuốc lá. Tuy nhiên, nicotin là lần đầu tiên ngẫu nhiên được chiết xuất từ các mẫu nấm với nước dưới tác động của năng lượng vi sóng. Theo cơ quan an toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) tuyên bố, mức dư lượng tối đa tạm thời (MRLs) của nicotine là 0,036 cho nấm hoang dã tươi và 1,17 mgkg-1 cho nấm hoang dã khô (Cavalieri, Bolzoni, & Bandini, 2010) [16].

1.1.4. Vai trò của nấm trong tự nhiên và trong đời sống con người Một định nghĩa được thừa nhận rộng rãi về thực phẩm chức năng cung cấp bởi Viện Khoa học đời sống quốc tế ở Châu âu ( ILSI Europe) phát biểu rằng "một loại thực phẩm có thể được coi là "chức năng " nếu nó được chứng minh là có tác động có lợi cho một hoặc nhiều chức năng trong cơ thể, ngoài tác dụng cung cấp đầy đủ dinh dưỡng, còn liên quan đến việc cải thiện tình trạng sức khỏe và giảm nguy cơ mắc bệnh" [24]. Nấm từ lâu đã được ưa chuộng như một loại thực phẩm ngon và giàu chất dinh dưỡng. Nấm ăn có lợi trong việc cải thiện điều kiện dinh dưỡng của chế độ ăn khi chúng được dùng như một loại rau trong cuộc sống hàng ngày. Các nghiên cứu rộng rãi đã cho thấy rằng các loài nấm khác nhau có giá trị trong việc ngăn ngừa và điều trị một số bệnh của con người. Vì vậy, các loại nấm được coi là một thực phẩm

16

chức năng .

Nấm là nguồn dược phẩm Y học cũng đã sử dụng nấm từ thời xa xưa. Nấm dược liệu đã có một thời gian dài được dùng trong phương pháp điều trị cổ truyền. Gilmore (1919) cũng đã công bố rằng loài nấm Calvatia gigantean (nấm trứng), được thu hoạch để sử dụng như một chất cầm máu cho bất kì vết thương nào, đặc biệt là dùng cầm máu cho rốn trẻ sơ sinh. Sự quan tâm của các nhà khoa học trên loài nấm là đang được phát triển vì chúng là nguồn chính của dược phẩm mới tiềm năng và bổ sung vào chế độ ăn uống [52].

Nhiều chất kháng sinh quan trọng được chiết rút từ nấm. Chẳng hạn như penicilium được phát hiện và sau đó được phát triển như chất điều trị y tế chống nhiễm khuẩn. Penicillin có lẽ là nổi tiếng nhất của tất cả các loại thuốc kháng sinh, có nguồn gốc từ một loại nấm thông thường gọi là Penicillium. Nhiều loại nấm khác cũng sản xuất các chất kháng sinh, mà hiện nay được sử dụng rộng rãi để kiểm soát bệnh trong người và động vật. Việc phát hiện ra kháng sinh là một cuộc cách mạng chăm sóc sức khỏe trên toàn thế giới.

Nhiều đặc tính có lợi của nấm dùng phòng ngừa và điều trị một số bệnh đã được mô tả bao gồm: chống oxi hóa, kháng u , điều hoà miễn dịch , kháng virut, kháng khuẩn, ký sinh trùng và hiệu quả trong trị đái tháo đường; nấm còn có tác dụng ngăn ngừa các bệnh như cao huyết áp, tăng cholesterol máu, xơ vữa động mạch và ung thư do các thành phần hóa học cụ thể của nấm và các hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau. Sản phẩm chữa bệnh quan trọng có thể được phân lập từ nấm ăn được và nấm không ăn được. Ngày nay khoảng 7000 loài nấm là ăn được ở mức độ khác nhau. Ngoài ra, 2000 loài đã được đề xuất có đặc tính chữa bệnh [44].

17

Ví dụ, hiện nay sự quan tâm lớn đó là β-glucan trong nấm vì những ảnh hưởng tích cực của nó đến sức khỏe [51]. β-glucan trong nấm được coi là hợp chất chức năng bởi vì chúng xuất hiện để điều chỉnh miễn dịch dịch thể và tế bào, và có tác dụng có lợi trong việc đấu tranh chống lại nhiễm trùng, bên cạnh đó nó cũng làm giảm cholesterol trong máu. Gần đây, chất này đã được chứng minh có đặc tính kháng độc tế bào, kháng đột biến, là ứng cử viên đầy hứa hẹn trong dược phẩm [41]. Nhiều loại nấm ăn chất lượng retin cao là yếu tố làm chậm sự phát triển tế bào ung thư, gần đây Nhật Bản còn phát hiện nhiều hợp chất trích từ nấm như glucan (thành phần cấu tạo tế bào vách của nấm), chất leutinan (từ nấm đông cô) có khả năng ngăn chặn sự phát triển của khối u – chống ung thư. Ở Việt Nam, các loài nấm có thể dùng làm dược liệu có khoảng hơn 200 loài trong đó có rất nhiều loài là dược liệu quý như: linh chi một năm, linh chi sò, linh chi nhiều năm, nấm lỗ phấn nhiều năm, nấm vân chi, nấm hương, nấm kim châm, mộc nhĩ,…Những nghiên cứu bước đầu về các chất có hoạt tính sinh học của một số nấm lớn Việt Nam cho thấy chúng rất giàu các chất có trọng lượng phân tử lớn như polysaccarit, lectin…và các chất có trọng lượng phân tử nhỏ như flavonoid, steroid…có tác dụng chống viêm, tăng cường đáp ứng miễn dịch, hỗ trợ điều trị các bệnh hiểm nghèo như ưng thư, suy giảm miễn dịch, tiết niệu, tim mạch…(Trịnh Tam Kiệt, 2011)[5].

Nấm là nguồn thực phẩm Nấm là thực phẩm phổ biến từ thời cổ đại không chỉ vì hương vị , mà còn vì giá trị dinh dưỡng cao. Nấm đã được sử dụng trong nhiều năm như thực phẩm dinh dưỡng và hương liệu thực phẩm trong các món súp và nước sốt.., do hương vị độc đáo và tinh tế của chúng.

Từ rất lâu nấm được coi là một loại thực phẩm đặc biệt. Người Hy lạp

18

đã tin tưởng rằng nấm cung cấp sức mạnh cho các chiến binh trong các trận chiến. Các vị vua tự hào nấm như một món ăn, các vị La mã coi nấm như “ thực phẩm của các vị thần” và chúng chỉ phục vụ vào các dịp lễ hội. Người Trung quốc coi nấm như là nguồn thực phẩm sức khỏe, “ thuốc trường sinh của cuộc sống”. Người Ấn độ Mexico sử dụng nấm như là chất gây ảo giác trong nghi lễ tôn giáo và ma thuật tốt như là trong mục đích chữa bệnh [55].

Thường được nhóm với các loại rau, nấm cung cấp nhiều thuộc tính dinh dưỡng, cũng như các thuộc tính thường được tìm thấy trong thịt, đậu hoặc các loại ngũ cốc. Nấm là ít calo, không có chất béo, cholesterol và natri rất thấp, nhưng chúng cung cấp một số chất dinh dưỡng mà thường được tìm thấy trong các loại thực phẩm động vật hoặc các loại ngũ cốc [57]. Giống như tất cả các loại trái cây và rau quả, nấm tự nhiên không có gluten, nên bổ dưỡng với một chế độ ăn không có gluten. Nấm có đủ các chất hữu cơ cần cho nhu cầu dinh dưỡng của người như protein, gluxit, lipit, vitamin, muối khoáng và nhiều loại enzim rất lợi cho tiêu hoá và có giá trị dinh dưỡng cao.

Nấm ăn Việt Nam có hơn 200 loài trong đó khoảng 50 loài là nấm ăn quý. Tuyệt đại đa số nấm ăn Việt Nam thuộc các đại diện của nấm Đảm Basidiomycota và một số ít thuộc nấm túi Ascomycota. Có thể kể một số ví dụ như: mộc nhĩ, nấm hương, nấm rơm, ngân nhĩ, nấm thong, nấm chàm, nấm bào ngư, nấm kim châm, nấm ngọc châm…(Trịnh Tam Kiệt, 2011)

Ngoài ra, các loài nấm có khả năng ứng dụng trong công nghệ

sinh học và bảo vệ môi trường.

Những loài nấm có khả năng sinh enzim và một số hoạt chất quý có thể được ứng dụng trong công nghệ sinh học và bảo vệ môi trường.

Nấm là bộ phận quan trọng trong công nghệ lên men. Các loài nấm men như saccaromyces được dùng để oxi hóa đường thành etanol và khí cacbonic.

19

Quá trình này gọi là sự lên men rượu. Và ứng dụng trong làm rượu vang, bia và bánh mỳ, phomat và một số các sản phẩm đậu nành….

Các loài nấm hoại sinh đóng vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất và năng lượng trong thiên nhiên. Nấm hoại sinh sử dụng hệ men của chúng để phân giải các chất hữu cơ, các cành lá khô của thực vật thành chất mùn, chất khoáng. Nấm có thể phân giải các chất hữu cơ phức tạp thành các chất đơn giản, đặc biệt là các chất khó phân giải như cellulose, lignin thành chất vô cơ; và có thể đồng hoá các chất đơn giản thành các chất phức tạp. Do đó, nó là yếu tố quan trọng làm tăng độ phì nhiêu của đất.

Các nấm cộng sinh hình thành rễ nấm (mycorrhiza) cộng sinh với thực vật có thể ứng dụng trong lâm nghiệp, đặc biệt trong việc trồng rừng, như loài P.tinctorius hình thành rễ nấm cộng sinh chặt chẽ với rễ cây thông, giúp cây tăng cường sự hấp thụ vận chuyển các yếu tố dinh dưỡng như: N, P, K, Ca... nên nó được ứng dụng trong các dự án tái sinh hoặc trồng mới các rừng thông nhựa, bạch đàn ở các vùng đất nghèo dinh dưỡng hay đất cát.

Ngoài lợi ích của nấm, có một số loài gây hại Một số loài nấm độc có thể gây ngộ độc, đôi khi gây chết người như: Amanita muscaria, A. phalloides hình thành các chất độc amanitin, phalloidin rất độc, nếu ăn khoảng vài miligam (0,003 - 0,005g) có thể làm chết một người.

Một số nấm ký sinh gây bệnh ở thực vật, đặc biệt ở một số cây trồng, cây rừng làm thay đổi tính chất lý hoá và cơ học của cây, làm cho cây chết hoặc bị yếu và gãy đổ, tác hại đến các ngành nông - lâm nghiệp. Nấm ký sinh gây bệnh mục lõi (heart rot pathogens) như: Phellinus conchatus, P.punctatus, Laricifomes officinalis; nấm ký sinh gây bệnh mục rễ (root rot pathogens) như Phaeolus schweinitzii gây bệnh mục rễ ở rễ cây thông.

20

Các loài nấm độc ở Việt Nam cũng khá phong phú. Những nghiên cứu bước đầu đã chỉ ra danh lục của hơn 30 loài (Trịnh Tam Kiệt, 2008)[6]. Trong số đó, nhóm nguy hiểm nhất là các loài gây ngộ độc chết người như: nấm độc xanh đen, nấm độc tán trắng, nấm độc trắng hình nón. Một số loài nấm độc khác gây ngộ độc thần kinh, tiêu hóa, gây ảo giác khác cũng rất nguy hiểm, như: nấm ruồi, nấm độc đỏ, nấm độc nấu, nấm độc rỉ sắt, nấm ô phiến xanh…

1.2. Axit amin 1.2.1. Định nghĩa và cấu trúc Axit amin (amino axit) là loại hợp chất hữu cơ tạp chức mà phân tử chứa đồng thời nhóm amin (NH2) và nhóm cacboxyl (COOH). Trong hóa sinh,thuật ngữ này còn dùng để chỉ alpha axit amin: những axit amin mà trong đó nhóm amin và nhóm cacboxyl gắn vào cùng một nguyên tử cacbon, nên gọi là α–cacbon.

Vì nhóm COOH có tính axit, nhóm NH2 có tính bazơ nên ở trạng thái kết tinh axit amin tồn tại ở dạng ion lưỡng cực. Trong dung dịch, dạng ion lưỡng cực chuyển một phần nhỏ thành dạng phân tử: H

R

N

Cα

H

H

H

O C

H O

Dạng phân tử

H

+

_ O

R

N

Cα

H

H

C O

dạng ion lưỡng cực

Tất cả các axit amin có ít nhất 2 nhóm ion hóa, điện tích chuẩn của axit amin phụ thuộc vào giá trị pH. Nhóm COOH của nguyên tử Cα có pka vào khoảng 1,8 – 2,8 do đó nó có độ axit mạnh hơn các monocacboxylic thông thường khác. Tính bazơ của NH2 ở nguyên tử Cα cũng thay đổi, pka vào khoảng 8,8 – 10,6 tùy thuộc vào từng axit amin.

Trong tự nhiên axit amin tồn tại chính ở dạng α-axit amin, phần lớn các 21

axit amin có bốn phần tử khác nhau có khả năng thay thế ở vị trí C-2 (Cα).

Nguyên tử Cα không có trung tâm đối xứng nên các axit amin có đồng phân quang học là L - và D - axit amin, chỉ có glycin là không có đồng phân quang học (R = H). Trong tự nhiên chủ yếu tìm thấy ở dạng L – axit amin, D – axit amin chỉ tìm thấy trong vi khuẩn, vách tế bào vi khuẩn.

Bảng 2.1: Cấu trúc của 20 axit amin tiêu chuẩn

L-Alanin

L-Arginin

L-Asparagin

Axit L-Aspartic

L-Cystin

L-Histidin

L-Glutamin

L-Glycin

Axit L-Glutamic

L-isoleucin

L-Leucin

L-Lysin

L-Methionin

L-Phenylalanin

L-Prolin

22

L-Serin

L-Thrionin

L-Tryptophan

L-Tyrosin

L-Valin

1.2.2. Phân loại Có hơn 100 axit amin đã được tìm thấy trong tự nhiên. Trong đó có 20 loại axit amin được mã hóa bởi mã di truyền chuẩn và được gọi là proteinogenic hay axit amin tiêu chuẩn. Việc kết hợp các axit amin tiêu chuẩn này tạo ra protein thiết yếu cho việc cấu thành cơ thể người. Axit amin là đơn vị cấu trúc cơ bản xây dựng nên các khối protein.

Có nhiều cách để phân loại axit amin: các axit amin có thể phân loại theo hai quan điểm: Quan điểm hoá học và quan điểm sinh vật học.

Quan điểm hoá học : ( Xét về mặt cấu tạo phân tử và các hoá tính) Có thể phân loại dựa vào cấu trúc của mạch bên (nhóm R): - Nhóm kị nước (Hydrophobic), gồm: glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin tất cả đều chứa mạch bên là ankyl (trừ glycin mạch bên là nguyên tử hidro). Như vậy, mạch bên của chúng đều không phân cực và do đó kị nước.

Các axit amin nhóm này được gọi là axit amin kị nước.

- Nhóm ưa nước (Hydrophilic), gồm: serin và threonin chứa nhóm hydroxyl ở mạch bên. Vì các nhóm hydroxyl là phân cực và có khả năng liên kết hydro, nên các axit amin này là ưa nước.

- Nhóm chứa lưu huỳnh: gồm cystein, methionin. Axit amin cystein trong điều kiện thích hợp có thể liên kết với một phân tử cystin khác qua mạch bên của nó. Kết quả là tạo liên kết giữa hai nguyên tử lưu huỳnh của hai

23

phân tử cystein và được gọi là cầu disunfua. Phân tử mới hình thành được gọi là cystin. Khả năng của cystein để tạo cầu disunfua sẽ tạo ra ý nghĩa quan trọng trong việc duy trì cấu trúc của một số protein.

- Nhóm axit cacboxylic: nhóm này bao gồm các axit amino có một nhóm axit cacboxylic thứ hai như là một phần của mạch bên, gồm axit aspartic và axit glutamic. Do tính axit của nhóm axit cacboxylic mạch bên, các axit amin không chỉ phân cực mà còn có thể trở nên tích điện âm bởi vì, trong dung dịch, các proton axit được chuyển cho một phân tử nước, để lại một ion carboxylat mang điện tích âm.

- Nhóm amit: hai axit amin rất giống với nhóm ở trên, nhưng mạch bên chứa các nhóm amit thay vì nhóm axit cacboxylic. Nhóm amit là -CONH2 trong cấu trúc đặc. Các amit hình thành từ axit glutamic được gọi là glutamin và amit hình thành từ axit aspartic được gọi là asparagin.

- Nhóm amin: nhóm này bao gồm ba axit amin có chứa một hay nhiều nhóm amin trong mạch bên: lysin, arginin và histidin. Vì các nhóm amin có thể nhận proton, chúng là bazơ và các axit amin này được coi là axit amin bazơ. Trong dung dịch chúng có thể nhận một proton từ nước trở nên mang điện tích dương.

- Nhóm thơm: gồm ba axit amin có mạch bên chứa các cấu trúc vòng thơm: phenylalanin, tyrosin và tryptophan. Bởi vì có nhóm hydroxyl nên tyrosine là phân cực. Tryptophan là không phân cực mặc dù có các nguyên tử nitơ trong vòng của nó. Điều này là do kích thước lớn của hai vòng kết hợp.

Phenylalanin cũng không phân cực.

- Nhóm imido là axit amin cuối cùng, prolin, điểm khác thường là mạch bên uốn lại để tạo thành một vòng bằng cách liên kết với nhóm amin. Trên thực tế, phân tử này là một axit imodo hơn là một axit amin.

24

Quan điểm sinh vật học [1, 63] Dựa trên cơ sở sự tăng trưởng hay sự cân bằng nitơ (là tổng hợp protein trong toàn bộ cơ thể) các axit amin có truyền thống được phân loại là chất dinh dưỡng thiết yếu (không thể thiếu) hoặc không thiết yếu đối với người và động vật: - Axit amin thiết yếu (essential amino acid -EAA) hay còn gọi là axit amin không thể thay thế được là những axit amin có bộ khung cacbon không được tổng hợp bởi các tế bào của người và động vật, do đó, phải được cung cấp từ chế độ ăn uống. Trong số 20 axit amin tiêu chuẩn, có chín axit amin thiết yếu: valin, leucin, isoleucin, lysin, threonin, methionin, histidin, phenylalanin và tryptophan, trong đó histidin là axit amin thiết yếu cho trẻ em.

- Axit amin không thiết yếu (nonessential amino acid -NEAA) hay gọi là axit amin thay thế được: tức là loại axit amin mà cơ thể người và động vật có thể tự tổng hợp được từ các nguyên liệu sẵn có (các axit béo, amiac, amit...). Axit amin không thiết yếu bao gồm: alanin, arginin, axit aspartic, cytin, axit glutamic, glycin, serin, prolin, tyrosin, glutamine, asparagin.

Các axit amin không thiết yếu tuyệt đối không được hiểu lầm là không cần, mà chỉ vì chúng có thể được tổng hợp được trong cơ thể, nếu trong thức ăn có thiếu cũng không quan trọng lắm.

1.2.3. Tính chất hóa lý của axit amin 1.2.3.1. Tính chất lưỡng tính Axit amin có tính chất lưỡng tính tức là vừa có tính axít vừa có tính bazơ. Phân tử axit amin có nhóm amin và nhóm cacboxyl trong phân tử. Ở pH trung tính axít amin tồn tại ở dạng ion lưỡng cực và trạng thái ion phụ thuộc vào pH của môi trường. Khi đặt axít amin trong điện trường thì tuỳ thuộc vào

25

pH mà di chuyển về catôt hay anôt, ở một pH nào đó thì axít amin không di chuyển về bên nào, đó là điểm đẳng điện của axít amin.

H2N-R-COOH + H+ H2N-R-COOH + OH-

H3N+-R-COOH H2N-R-COO- + H2O

1.2.3.2. Tác dụng với ancol tạo hợp chất chứa nhóm chức este H2N-R-COOH + R’OH

khí HCl bão hòa

H2N-R-COOR’ + H2O

1.2.3.3. Amino axit tham gia phản ứng trùng ngưng, đồng trùng ngưng tạo đipeptit, tripeptit,…, polipeptit Những peptit có nhiều hơn 50 axit amin được xếp loại là protein.

• Ngoài ra axit amin còn có một số tính chất riêng như sau: - Axit amin có khả năng kết tinh - Bền với nhiệt độ khoảng 100°C đến 200°C trong 2 giờ - Khá bền trong môi trường axit, không bền trong môi trường kiềm (trong môi trường axit chỉ có trytophan bị phá hủy) - Tính chất đồng phân quang học (hoạt quang) - Tất cả các axit amin đều có đồng phân quang học (trừ glyxin) - Đa số các axit amin tự nhiên đều tồn tại ở dạng L - axit amin (chỉ ở dạng này thì các axit amin có giá trị dinh dưỡng cho con người và động vật).

1.2.4. Vai trò của các axit amin Các axit amin là cơ sở của sự sống bởi vì chúng đóng vai trò trung tâm trong việc xây dựng khối protein và còn là hợp chất trung gian của các quá trình trao đổi chất. Axit amin đóng vai trò quan trọng trong chế độ dinh dưỡng của con người, động vật và trong việc duy trì sức khỏe. Để hiểu được axit amin quan trọng như thế nào, chúng ta cần biết protein cần thiết như thế nào cho cuộc sống. Đó là protein cung cấp cấu trúc cho tất cả các sinh vật sống.

26

Mọi sinh vật sống, từ động vật lớn nhất cho tới vi khuẩn nhỏ nhất, đều chứa protein. Nhờ quá trình tiêu hoá protein thức ăn được phân giải thành axit amin.

Các axit amin từ ruột vào máu và tới các tổ chức, tại đây chúng được sử dụng để tổng hợp protein đặc hiệu cho cơ thể [53, 63].

Người ta đã phân loại được nhiều axit amin khác nhau và những axit amin này sẽ giúp cơ thể khỏe mạnh khi chúng được hấp thu vào cơ thể. Trên thực tế, có 8 loại axit amin liên kết chặt chẽ với nhau, kích thích cơ thể phát triển mạnh mẽ. Nếu thiếu 1 trong 8 loại quan trọng này có thể dẫn đến một số bệnh nguy hiểm đáng tiếc xảy ra.

Vai trò của các axit amin không chỉ giới hạn ở sự tham gia của chúng vào tổng hợp protein trong cơ thể mà chúng còn có nhiều chức năng phức tạp và quan trọng khác, sau đây là vai trò của các axit amin thiết yếu: Lysin là một trong các axit amin quan trọng nhất. Đây là một trong bộ ba axit amin được đăc biệt chú ý khi đánh giá chất lượng dinh dưỡng của khẩu phần (lysin, tryptophan, methionin). Nó là cần thiết cho sự phát triển xương ở trẻ em; nó giúp hấp thu canxi và duy trì một sự cân bằng nitơ thích hợp ở người lớn. Amino axit này hỗ trợ trong việc sản xuất các kháng thể, kích thích tố và các enzym, và giúp trong việc hình thành collagen và phục hồi mô.Thiếu lysine trong thức ăn dẫn đến rối loạn quá trình tạo máu, hạ thấp số lượng hồng cầu và hemoglobin. Ngoài ra khi thiếu lysine cân bằng protein bị rối loạn, cơ suy mòn, quá trình cốt hoá bị rối loạn và có hàng loạt các biến đổi ở gan và phổi, không có khả năng tập trung, dễ cáu gắt, thiếu năng lượng, chán ăn, rối loạn sinh sản, tăng trưởng chậm, và giảm cân.

Nguồn cung cấp lysin là những thực phẩm giàu protein như trứng, thịt (đặc biệt là thịt đỏ, thịt cừu, thịt lợn và gia cầm), đậu nành , đậu và đậu Hà Lan, pho mát, và một số loại cá (như cá tuyết và cá mòi )[58].

27

Tryptophan một loại chất dẫn truyền thần kinh quan trọng có thể tạo ra trong não người, chất 5- hydroxytryptamin có tác dụng trung hoà adrenalin và norađrenalin, đồng thời cải thiện được thời gian liên tục của giấc ngủ. Khi chất 5-hydroxytryptamin trong não động vật giảm, sẽ có biểu hiện hành vi không bình thường, kể cả mất ngủ,... Ngoài ra, chất 5- hydroxytryptamin còn có trong các tổ chức tiểu cầu và tế bào niêm mạc ruột,... có tác dụng làm co mạch máu rất mạnh. Con người khi bị thương trong cơ thể sẽ phóng thích chất 5-hydroxytryptamin để cầm máu. Tryptophan giúp chống lại trầm cảm và mất ngủ và để ổn định tâm trạng, tốt cho tim và tăng cường sự giải phóng của hormone tăng trưởng[49].

Các nguồn thực phẩm tốt nhất của tryptophan bao gồm gạo lức, phô mai, thịt, đậu phộng, và protein đậu nành.

Methionin là một axit amin thiết yếu mà hỗ trợ trong quá trình phân hủy chất béo, từ đó giúp ngăn chặn sự tích tụ của chất béo trong gan và động mạch có thể gây cản trở lưu lượng máu đến não, tim và thận. Quá trình tổng hợp các axit amin cystin và taurin có thể phụ thuộc vào sự sẵn có của methionin. Axit amin này sẽ giúp hệ tiêu hóa; giúp giải độc các tác nhân có hại như chì và các kim loại nặng khác; giúp giảm suy nhược cơ bắp, ngăn ngừa tóc giòn, và bảo vệ chống lại bức xạ; và có lợi cho những người bị loãng xương hoặc dị ứng hóa học. Cơ thể có thể chuyển đổi methionin thành cystin, một tiền chất của glutathion. Khi glutathion là một chất trung hòa quan trọng của chất độc trong gan, nó bảo vệ gan khỏi tác hại của các hợp chất độc hại.

Nguồn thực phẩm tốt methionine bao gồm đậu, trứng, cá, tỏi, đậu lăng, thịt, hành tây, đậu nành, hạt và sữa chua.

Phenylalanin: trong cơ thể, nó có thể được chuyển đổi thành axit amin tyrosin, chất này lần lượt được sử dụng để tổng hợp hai dẫn truyền thần kinh

28

quan trọng thúc đẩy sự tỉnh táo: dopamine và norep-inephrine. Do mối liên quan với các hoạt động của hệ thống thần kinh trung ương, axit amin này có thể nâng cao tinh thần, giảm đau, trợ giúp trong bộ nhớ và học tập, và ngăn chặn sự thèm ăn. Nó có thể được sử dụng để điều trị viêm khớp, trầm cảm, đau bụng kinh, đau nửa đầu, béo phì, bệnh Parkinson và tâm thần phân liệt.

Phenylalanine có trong sữa, hạnh nhân, bơ, lạc, các hạt vừng.

Isoleucin, leucin và valin: cả 3 loại này đều là các axit amin thiết yếu.

Trong kết cấu của chúng đều là mạch nhánh (mạch bên hoặc phần nhánh); gọi là các axit amin mạch nhánh.

Các axit amin mạch nhánh chủ yếu là các axit amin tiến hành sự oxy hóa ở cơ xương, còn các axit amin khác phần nhiều là ôxy hóa ở gan. Trong các trạng thái kích ứng như phẫu thuật, chấn thương,... thì sự hợp thành và phân giải protein có vai trò quan trọng riêng biệt. Các axit amin mạch nhánh có thể làm nguyên liệu để tổng hợp protein cơ bắp và sẽ bị cơ bắp dùng làm nguồn cung ứng ôxy hóa cho các chất là nguồn năng lượng; ngoài ra, người ta còn phát hiện thấy leucin cơ thể kích thích sự tổng hợp riêng protein, đồng thời khống chế sự phân giải nó, những năm gần đây đã khiến cho rất nhiều học giả phải chú ý tới trong nghiên cứu về dinh dưỡng ngoại khoa và dinh dưỡng cho vận động viên.

Nguồn tự nhiên của leucine bao gồm gạo lức, đậu, thịt, các loại hạt, bột đậu nành và lúa mì. Nguồn thực phẩm của valin bao gồm các sản phẩm sữa ngũ cốc, thịt, nấm, đậu phộng, và protein đậu nành.

Threonin là một axit amin thiết yếu giúp duy trì sự cân bằng protein thích hợp trong cơ thể. Nó quan trọng cho sự hình thành collagen và elastin. Threonine có ở tim, hệ thống thần kinh trung ương, và cơ xương, và

29

giúp ngăn ngừa chất béo tích tụ trong gan. Nó tăng cường hệ thống miễn dịch bằng cách trợ giúp trong việc sản xuất các kháng thể.

Nguồn thực phẩm chứa nhiều threonin: thịt, cá, trứng, lạc, hạt điều.

Histidin là một axit amin thiết yếu quan trọng trong sự tăng trưởng và phục hồi các mô. Nó còn có tác dụng hình thành màng chắn myelin, một chất bảo vệ bao quanh dây thần kinh và giúp tạo ra dịch vị, kích thích tiêu hóa. Histidin cũng bảo vệ cơ thể khỏi tác hại của bức xạ, và có thể giúp đỡ trong công tác phòng chống AIDS. Histidin ở mức quá cao có thể dẫn đến căng thẳng và thậm chí rối loạn tâm lý như lo âu và tâm thần phân liệt, những người bị tâm thần phân liệt đã được tìm thấy có hàm lượng histidin cao trong cơ thể. Thiếu histidin có thể góp phần cho viêm khớp mãn tính và có thể liên quan với điếc thần kinh. Methionin có khả năng làm giảm nồng độ histidin.

Nguồn tự nhiên của histidin bao gồm cá, gạo, lúa mì, và lúa mạch đen.

Lượng nhu cầu của các axit amin cần thiết được chỉ ra trong bảng 2.2.

Bảng 2.2: Trị số ước lượng về lượng đòi hỏi các axit amin cần thiết (mg/kg cân nặng/ngày)

Axit amin Histidin Isoleucin Leucin Lysin Methionin + Cystin Phenylalanin+ Tyrosin Threonin Tryptophan Valin Tổng cộng

Dưới 1 tuổi 2 tuổi 10-12 tuổi Người lớn Tỷ lệ 28 70 161 103 58 125 87 17 93 714

?

31 73 64 27 69 37 12,5 38 352

?

30 45 60 27 27 35 4 33 261

(8- 12) 10 14 12 13 14 7 3.5 10 84

(2,9) 2,9 4,0 3,4 3,7 4,0 2,0 1,0 2,9

30

Theo FAO/WHO, 1983 * Tính theo người lớn: trị số ước lượng về lượng nhu cầu axit amin được tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức Nông nghiệp và Lương thực thế giới (FAO) đưa ra căn cứ theo các tài liệu nghiên cứu khác nhau, xem bảng 2.2.

Bảng 2.3: Đối chiếu các loại axit amin thiết yếu Axit amin Ile Leu Lys Met + Cys Phe + Tyr Thr Try Val

Gạo Hàm lượng (%) 5,4 9,0 3,8 4,1 4,7 3,9 1,6 5,5

Tỷ lệ lượng đòi hỏi các axit Tỷ lệ 2,1 5,6 2,4 2,7 2,9 2,4 1,0 3,4

amin thiết yếu ở người lớn 2,9 4,0 3,4 3,7 4,0 2,0 1,0 2,9

1.2.5. Axit amin trong nấm Như đã trình bày ở mục 1.1.2.2. nấm là một nguồn tốt của axit amin. Từ sự ước tính protein thô là một khảo nghiệm gián tiếp để tính hàm lượng axit amin tổng được thực hiện bởi mức khác nhau của phi protein thì việc xác định định lượng của tổng số axit amin có mặt sau khi thủy phân protein chắc chắn cung cấp cho một đánh giá chính xác hơn.

Bảng 2.4: Thành phần axit amin thiết yếu trong một số loài nấm hoang (g/100g protein thô)[10, 36] Agaricus Lentinula Pleurotus Pleurotus Axit amin

Bisporus

edodes

florida

(nấm

(nấm

(nấm sò

mỡ)

hương)

tím)

Pleurotus

ostreatus Sajor-caju

Hen’s egg

31

Leusin

7,5

7,9

7,5

6,8

7,0

8,8

Isoleusin

4,5

4,9

5,2

4,2

4,4

6,6

Valin

2,5

3,7

6,9

5,1

5,3

7,3

Tryptophan

2,0

-

1,1

1,3

1,2

1,6

Lysin

9,1

3,9

9,9

4,5

5,7

6,4

Threonin

5,5

5,9

6,1

4,6

5,0

5,1

Phenyalanin

4,2

5,9

3,5

3,7

5,0

5,8

Methionin

0,9

1,9

3,0

1,5

1,8

3,1

Histidin

2,7

1,9

2,8

1,7

2,2

2,4

Tổng

38,9

36,0

46,0

33,4

37,6

47,1

Chú thích: trứng dùng để so sánh Ta biết rằng trứng là một nguồn thực phẩm cung cấp lượng axit amin cao. Từ bảng 2.4 cho thấy nấm có đầy đủ các axit amin thiết yếu, hàm lượng axit amin thiết yếu trong nấm có thể được so sánh với trứng (loài Pleurotus florida có lượng axit amin thiết yếu tổng cao nhất 46,0% gần bằng 47,1% trong trứng).

Tỷ lệ axit amin thiết yếu (EAA) trên tổng số axit amin (TAA) cho một ý tưởng về chất lượng dinh dưỡng của protein trong thực phẩm. Một tập hợp số liệu về thành phần và hàm lượng axit amin được công bố gần đây cho 41 loài nấm từ Vân Nam. Trong nghiên cứu này, loài Dictyophora indusiata (nấm lưới trắng) thì thấp với 8000mgkg-1 trọng lượng tươi và loài Tuber indicum thì cao hơn với 32000mgkg-1 trọng lượng tươi về axit amin, và tỉ lệ EAA/TAA là 0,27-0,51 (Sun, Lin, Wan, Liu, & Xu, 2012) [56]. Tỉ lệ EAA/TAA là 0,53-0,7 cho loài Russula (nấm xốp) và 0,45-0,77 cho loài nấm Boletus (Yin & Zhou, 2008).

32

Bảng 2.5: Hàm lượng axit amin tự do trong loài nấm Calvatia gigantea ở phía Nam Thỗ Nhĩ Kỳ. Kết quả cho số mg axit amin tự do trong 100g nấm khô (mg/100 g ± SD) [33] Axit amin thiết

Loài Calvatia

Axit amin

Loài Calvatia

yếu

gigantea

không thiết yếu

gigantean

Histidin

2,54 ± 0,21

Alanin

4,38 ± 0,52

Isoleucin

28,74 ± 0,93

Arginin

16,51 ± 1,08

aragin

1,23 ± 0,21

Axit Aspartic

0,40 ± 0,08

Cystein

<LOD

Leucin

11,21 ± 0,19

Lysin

2,53 ± 0,22

Methionin

1,11 ± 0,01

Axit Glutamic

1,32 ± 0,05

Phenylalanin

15,45 ± 0,15

Glutamin

3,46 ± 0,13

Threonin

6,57 ± 0,10

Glycin

6,57 ± 0,23

Tryptophan

30,06 ± 0,78

Prolin

10,03 ± 0,07

Serin

6,56 ± 0,11

Valin

15,48 ± 0,18

Tyrosin

17,95 ± 0,39

LOD: giới hạn phát hiện Từ kết quả nghiên cứu mẫu nấm C. gigantean ở bảng 2.5 cho thấy rằng có đầy đủ 20 axit amin tự do trong loài nấm này. Tổng hàm lượng axit amin thết yếu và axit amin không thiết yếu trong nấm này lần lượt là 113,69 mg/100 g và 85,96 mg/100 g, axit amin thiết yếu chiếm hơn 56% tổng axit amin. Như vậy, nấm là một nguồn lý tưởng của các axit amin thiết yếu, nấm C. gigantea có một lượng giá trị axit amin thiết yếu.

33

Bảng 2.6: Thành phần axit amin thiết yếu trong hai loài nấm ở Hàn Quốc (g/100g) (định lượng bằng phương pháp HPLC) [35] Loài P. ostreatus (nấm sò tím) F. velutipes (nấm kim châm)

Thr

Val Met

Ile

Leu Phe

His

Lys EAA

0,42 0,44 0,09 0,33 0,53 0,29 0,18 0,28 2,56 0,22 0,35 0,06 0,24 0,38 0,27 0,13 0,15 1,79

Bảng 2.7: Thành phần axit amin thiết yếu trong hai loài nấm ở Hàn Quốc (g/100g) (định lượng bằng phương pháp HPLC) [35] Loài

Asp Glu

Ser

Gly Cys Arg Ala

P. 0,56 1,04 0,54 0,44 ostreatus F. 0,38 1,00 0,35 0,34 velutipes

0,8

Pro Tyr NEAA

-

0,35

0,37 0,20

4,30

-

0,23 0,94 0,39 0,20

3,83

1.3. Các phương pháp tách và xác định đồng thời axit amin 1.3.1. Các phương pháp sắc ký cổ điển 1.3.1.1. Phương pháp sắc ký bản mỏng Phương pháp sắc ký bản mỏng được triển khai bởi Bailey, J, L. rất dễ thực hiện [8]. Vì thế nó cũng được sử dụng để xác định axit amin. Tác giả Phạm Văn sổ và Bùi Thị Như Thuận (1978) đã dùng pyriđin làm dung môi triển khai chạy sắc ký bản mỏng, sau khi các axit amin được tách riêng trên bản mỏng, dựa vào chiều cao, diện tích vết của mẫu so với vết mẫu chuẩn sẽ tính ra được hàm lượng các axit amin. Phương pháp này tách tốt nhưng phải sử dụng dung môi rất độc, độ chính xác không cao. Ngày nay với sự phát triển của các phương pháp sắc ký hiện đại, việc tách và xác định axit amin không áp dụng trên sắc ký lớp mỏng nữa.

1.3.1.2. Phương pháp sắc ký cột

34

Phương pháp sắc ký cột là một phương pháp sắc ký cơ bản đơn giản, nó là nền tảng của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sau này.

Phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột dùng ninhydrin đã được áp dụng xác định axít amin từ những năm 1940 bởi Moore, S., Stein, W, H. [46, 47, 48] và sau này được nhiều tác giả áp dụng và cải tiến và được áp dụng trong xác định axit amin ở nhiều đối tượng khác nhau.

Nguyên lý cơ bản là axit amin được tách ra bằng cột trao đổi ion, phản ứng với ninhydrin tạo phức chất màu vàng, đo độ hấp thụ quang của phức màu thu được bằng quang kế có bước sóng 440 nm và 570 nm cho giới hạn xác định đến 10 pM với hầu hết các axit amin và 50 pM với prolin. Mặc dù phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã thực sự phát triển và áp dụng xác định axit amin ở nhiều đối tượng, nhưng phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột ninhydrin vẫn được áp dụng và tiếp tục hoàn thiện cho tận đến ngày nay do sử dụng thiết bị rẻ tiền, thuận tiện cho phân tích lượng lớn [54].

Phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột là o-phthalaldehyd (OPA), các axit amin sau khi được tách ra khỏi cột trao đổi ion được dẫn xuất bằng OPA tạo phức chất có tính chất phát huỳnh quang, đo huỳnh quang ở bước sóng kích thích 348nm và bước sóng phát xạ là 450 nm. Phương pháp có thể tách và xác định đồng thời các axit amin bậc 1 với giới hạn phát hiện đạt tới 20 pM. Dẫn xuất OPA có hạn chế lớn là không phản ứng được với các axit amin bậc 2.

Phương pháp tách sắc ký cột cổ điển là phương pháp đơn giản có thể áp dụng cho bất kỳ phòng thí nghiệm nào. Tuy nhiên, do thời gian tách lâu, khả năng tách không cao so với các kỹ thuật hiện đại nên nó chỉ được áp dụng trong các đối tượng tách đơn giản.

1.3.1.3. Phương pháp chuẩn độ điện thế

35

Trong phương pháp này, sau quá trình xử lý mẫu để tách các axit amin ra khỏi nền mẫu và loại các chất ảnh hưởng, các axit amin sẽ được tách trên cột sắc ký: 500 - 22 mm, 30 ml, Dovvex 50W-X8 (dạng H+) và chuẩn độ điện thế theo từng phân đoạn tách. Ser, Thr, Asp sẽ được rửa giải với HCl 0,8M với tốc độ dòng qua cột là 0,5ml/phút, sau khi HC1 0,8M đi ra khỏi cột. Thêm HCl 1M và điều chỉnh tốc độ dòng đến 25-30 giọt/phút để rửa giải Glu và Gly. Các phần dịch rửa giải ở các phân đoạn khác nhau được được cho vào các cốc thuỷ tinh và điều chỉnh pH=7 với NaOH 0,1M. Dung dịch HCHO 37% cũng được điều chỉnh về pH=7 với NaOH 0,1M. Sau đó phần mẫu thử và dung dịch HCHO được trộn với nhau theo tỷ lệ 1:9 bằng máy khuấy từ 10 phút. Chuẩn độ hỗn hợp trên bằng phương pháp đo điện thế với NaOH 0,1M. Song song mẫu trắng được tiến hành bằng việc chuẩn độ tới pH = 8,9 hỗn hợp của HCHO với HC1 IM (1:9) đã được trung hòa tới pH= 7 [7] .

Từ lượng NaOH 0,1 M tiêu tốn để chuẩn độ mẫu thử và mẫu trắng tính ra được hàm lượng các axit amin bằng bảng quy đổi.

1.3.2. Phương pháp sắc ký khí Sắc ký khí (Gas chromatography: GC) là một kỹ thuật tách và phân tích đồng thời các chất trong một hỗn hợp mẫu ở trạng thái khí, phương pháp này rất phát triển trong những năm gần đây sử dụng để phân tích định tính và định lượng các chất hữu cơ trong một hỗn hợp mẫu phức tạp.

Tác giả Y. c. Fiamegos, c. D. Stalikas đã tách và xác định được 19 axit amin trong nước tiểu, nước hoa quả và bột mì bằng phương pháp sắc ký khí với detector khối phổ (GC/MS) và detector ion hóa ngọn lửa (GC/FID). Theo phương pháp này, các axit amin tự do được chuyển thành dạng pentaflorobenzyl nhờ xúc tác chuyển pha tetrabutylamoni bromua, được dẫn xuất hóa thành dạng dễ bay hơi với pentaflorobenzyl bromid, chiết bằng

36

diclorometan rồi phân tích bằng phương pháp GC/MS và GC/FID. Còn đối với các axit amin liên kết với protein sẽ được phân tích sau bước thủy phân bằng NaOH 5M. Giới hạn phát hiện của phương pháp nằm trong khoảng 0,7 2,3 pM với GC/MS và từ 1,7 - 6,9 pM với GC/FID [65].

Phương pháp sắc ký khí là một phương pháp tách rất phát triển và cũng đã được nhiều tác giả trên thế giới áp dụng để tách và xác định axit amin trong một số đối tượng khác nhau, nhưng để áp dụng phân tích axit amin thông dụng là rất phức tạp và giá thành cao do axit amin là hợp chất không dễ bay hơi và không tan tốt trong các dung môi hữu cơ nên quá trình thực hiện khá phức tạp và tốn dung môi. Ngoài ra khí mang là Heli là rất tốn kém nên phương pháp sắc ký khí không được áp dụng rộng rãi trong tách và xác định axit amin.

1.3.3. Phương pháp điện di mao quản Phương pháp điện di mao quản hiệu năng cao, hay còn gọi là điện di mao quản thế cao là một kỹ thuật tách và xác định đồng thời các chất trong một hỗn hợp mẫu dựa theo nguyên lý của sự điện di của các chất trong ống mao quản nhỏ có chứa dung dịch đệm điện di với giá trị pH nhất định và được điều khiển bởi cưòng độ điện trường E do nguồn điện thế cao một chiều V (14-30 KV) đặt vào hai đầu mao quản. Phương pháp này tách các chất là các ion hoặc các chất không ion nhưng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp đặt trong điện trường, do điện tích và linh độ điện di của các chất khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [3].

M. Umrnadi, B. C. Weimer đã phát triển phương pháp điện di mao quản huỳnh quang laze (CE-LIF) để phát hiện và định lượng 17 axit amin tại nồng độ mM, các axit amin được dẫn xuất với 3-(4-carboxybenzoyl)-2quinolin-carboxaldehyd trước khi phân tích bằng CE-LIF. Môi trường tách là

37

hệ đệm chứa: borat 6,25 mM, SDS 150 mM, và THF 10 mM (pH = 9,66) tại 25°C, điện thế 24 kV. Độ biến động của phương pháp trong giới hạn từ 0,3 – 0,9% trong một ngày và từ 0,7 – 1,5% giữa các ngày. Các tác giả đã ứng dụng phương pháp này để theo dõi sự thay đổi nồng độ axit amin trong quá trình chuyển hóa vi khuẩn [40].

1.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Phương pháp HPLC là phương pháp hiện đại và phát triển mạnh trong những năm 80, 90. Nó được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như sinh hóa, hóa học, môi trường và đặc biệt với việc phân tích các vitamin và axit amin. Những nghiên cứu tách và xác định axit amin đã có số lượng lớn các bài báo công bố với các quy trình tách và xác định axit amin. Đây là phương pháp phổ biến nhất để xác định axit amin. Sau thủy phân các axit amin sẽ được dẫn xuất để tạo sản phẩm phát huỳnh quang. Các dẫn xuất này sẽ được tách nhờ hệ thống HPLC, được phát hiện và định lượng bằng detector huỳnh quang (RF).

Bằng phương pháp HPLC/RF, tác giả L. Bosch và cộng sự [39] đã tách và định lượng được 17 axit amin trong thức ăn trẻ em sử dụng tác nhân dẫn xuất 6- aminoquimolyl-N-hydroxysccinimidyl carbamat (AQC). Tất cả các axit amin (trừ Cys và Met) được tách ra khỏi nền mẫu bằng sự thủy phân với HCl 6M trong môi trường khí trơ, ở 110°c trong 23 giờ. Quá trình dẫn xuất với AQC được thực hiện trong môi trường bazơ. Các dẫn xuất được tách trên cột Nova-Pak™, rửa giải bằng hỗn hợp đệm acetat-phosphat, acetonitril, nước theo chương trình gradient, phát hiện bằng detectơ huỳnh quang ( λ ex = 250 nm, λ em = 395 nm). Khoảng tuyến tính: 0,0025 – 0,2 mM; độ chính xác củạ phương pháp CV: 0,2 – 3,5% ; hiệu suất dẫn xuất: 86 - 106%, hiệu suất thu hồi của phương pháp: 88,3 – 118,2%. Giới hạn phát hiện: 0,016 – 0,367 mM; giới

38

hạn định lượng: 0,044 – 1,073 mM. Sử dụng hai tác nhân dẫn xuất o-phthalaldehyd-3-mercaptopropionic axit (OPA) và 9-florenylmethyl cloroformat (FMOC) để dẫn xuất cho cả axit amin bậc 1 và bậc 2, tác giả D. Heems và cộng sự [22] đã tách và định lượng được 25 axit amin trong thức ăn, đồ uống. Các mẫu sau khi thủy phân axit với HCl 6M, được bay hơi tới khô dưới chân không, và hòa tan lại cặn bằng HC1 0,1M. Quá trình dẫn xuất trước cột của các mẫu lỏng được thực hiện tự động bởi thiết bị ASTED, sử dụng phản ứng kết hợp OPA/FMOC và được làm sạch bởi sự thẩm tích, rồi bơm vào hệ thống HPLC. Phổ huỳnh quang của các dẫn xuất OPA-3-MPA được ghi lại tại λ ex = 335 nm, λ em = 440 nm; còn các dẫn xuất FMOC tại λ ex =260 nm, λ em = 315 nm. Với hầu hết các axit amin, giới hạn phát hiện < 100 µ g/l, khoảng tuyến tính từ 0,5 - 100 mg/1.

Bằng quá trình dẫn xuất trước cột tự động (SI) kết hợp với sắc ký lỏng (LC), C.K. Zacharis và cộng sự [21] đã xác định được 14 axit amin trong dược phẩm sử dụng chất dẫn xuất là o-phthaldialđehyd (OPA). Hệ thống SI có tác dụng lấy mẫu và hóa chất dẫn xuất, trộn và tự động đưa đến hệ thống bơm mẫu của LC. Bằng phương pháp sắc ký lỏng pha ngược cho phép tách và xác định 14 axit amin trong vòng 35 phút bằng phổ huỳnh quang với λ ex = 340 nm, λ em = 455 nm. Giới hạn phát hiện dưới 30 µ g/1 cho tất cả các axit amin, khoảng tuyến tính 0,05 - 10 mg/l. Hiệu suất thu hồi của phương pháp nằm trong giới hạn xác định từ 93,8 - 108,6%.

Phương pháp HPLC rất thích hợp để tách và xác định đồng thời nhiều chất trong các hỗn hợp khó như retinoit, carotenoit, axit amin mà trước đây các phương pháp khác gặp khó khăn. Ưu điểm nổi bật của HPLC là tốc độ tách nhanh, độ phân giải tốt, độ nhạy cao, độ lặp lại tốt và có thể phân tích đồng thời nhiều chất. Riêng đối với việc phân tích axit amin, phương pháp

39

HPLC còn có một số ưu điểm mà ít có phương pháp khác có thể được, đó là quá trình tách và xác định là một hệ thống kín, quá trình dẫn xuất có thể sử dụng dẫn xuất trước hoặc sau cột, dung môi chạy chủ yếu là đệm, quá trình thủy phân mẫu và hòa tan mẫu là các axit vô cơ không tốn kém. Chính vì những ưu điểm trên mà nhiều tác giả cho rằng phương pháp HPLC là phương pháp tốt nhất để tách và phân tích axit amin. Phương pháp cần được nghiên cứu và phát triển để ứng dụng phân tích trong mẫu thực phẩm và sinh học.

Hình 1.1: Hệ thống máy sắc ký HPLC Agilent 1100 series

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 2.1.1. Thiết bị và dụng cụ • Thiết bị -

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1100 series.

40

- Cân phân tích độ chính xác 0,0001g.

- Tủ sấy.

- Hệ thống hút chân không.

- Máy đo pH. - Máy nghiền mẫu.

- Máy siêu âm.

• Dụng cụ - Pipet: 1, 2, 5 ,10 ml; micropipet - Ống ly tâm dung tích 10, 50ml - Các bình định mức: 10, 20, 50, 100ml - Cốc có dung tích 25, 50, 250, 500, 1000 ml - Ống đong 50, 100, 200, 250 ml - Màng lọc 0,45 µm 2.1.2. Hóa chất Các loại hóa chất dùng trong phân tích đều thuộc loại tinh khiết phân tích.

- Dung dịch chuẩn: hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 10pmol/ µl , 25pmol/ µl và 100pmol/ µl .

- Natri acetate trihydrate NaCH3COO.3H2O (NaAc) - Dung dịch HCl đặc 37% - Thuốc thử FMOC (9- fluorenylmethylchloroformate in acetonitrile) - Trietylamin (TEA) C6H15N; tetrahidrofuran (THF)

41

- Natri tetraborat (Na2B4O7.10H2O) - Acetonitril và methanol Axit acetic 2%: Dùng pipet hút 2 ml axit acetic cho vào bình định mức 100 ml. Định mức đến vạch bằng nước cất đề ion thu được axit axetic 2%.

Natri tetraborat (Na2B4O7) 0,25M: Cân 47,75g Na2B4O7.10H2O hòa tan trong nước cất đề ion, định mức về 500 ml bằng nước cất đề ion.

Pha động A − Cân 1,36 ± 0,025 g NaCH3COO.3H2O + 500 ml H2O + 90µl triethylamine (TEA). Điều chỉnh pH về pH = 7,2 ± 0,05 bằng axit acetic 2%. Thêm 1,5 ml tetrahydrofuran (THF).

Pha động B − Cân 1,36 ± 0,025 g NaCH3COO.3H2O + 100 ml H2O. Điều chỉnh pH về pH = 7,2 ± 0,05 bằng axit acetic 2%. Thêm hỗn hợp gồm 200 ml acetonitrin và 200 ml methanol.

- Chất tạo dẫn xuất OPA (ortho-phthaladehyde) phản ứng với các axit amin trong sự có mặt của các hợp chất thiol hình thành các sản phẩm huỳnh quang. Phản ứng này được sử dụng cho việc tạo các dẫn xuất trong phân tích các axit amin bằng sắc kí trao đổi ion. Trên cơ sở điều kiện phòng thí nghiệm, để xác định các axit amin trong nấm chúng tôi tiến hành dẫn xuất trước cột các axit amin bằng dẫn xuất OPA và FMOC. Nguyên tắc chung tạo dẫn xuất tiền cột là tạo dẫn xuất của các axit amin với OPA, tiếp theo là tách HPLC pha ngược, sắc kí lỏng được trang bị một đầu dò fluorescence để phát hiện các dẫn xuất axit amin. Cường độ huỳnh quang của phức OPA-axit amin được theo dõi với bước sóng kích thích 340nm và bước sóng phát xạ 450nm. Dẫn xuất này có độ nhạy rất cao.

42

cơ chế phản ứng như sau. (Sản phẩm cuối cùng là Isoindole)

Theo cơ chế trên thì OPA phản ứng bước 1 có thể với cả amin bậc 1 và bậc 2 nhưng chỉ có amin bậc 1 mới cho sản phẩm là isoindol có vòng kín 5 cạnh và phát huỳnh quang. Vì vậy với việc dẫn xuất bằng OPA không cho phép xác định axit amin bậc 2. Để xác định axit amin bậc 1 bằng OPA phải thực hiện khi có mặt của axit 3-mercapto proionic (3-MPA) ở pH=10, cơ chế: S-CH2 - CH2 - COOH CHO CHO

OPA

N -CH -COOH

+ HS-CH2 -CH2 -COOH

+ H2N-CH-COOH

R

R

axit amin bậc 1

axit 3-mecapto propionic

dẫn xuất isoindol

Không như những axit amin bậc 1 ban đầu, các dẫn xuất isoindol được tạo thành sẽ phát huỳnh quang. Bằng cách dẫn xuất các axit amin với OPA và đo ở bước sóng kích thích 340nm và bước sóng phát xạ 450nm. Để xác định được axit amin bậc 2 ta cần sử dụng thêm dẫn xuất FMOC: + H2N-CH-COO-

pH=8-9

+ HCl

R CH2-OCO-Cl FMOC-Cl

axit amin

CH2-OCO-NH-CH-COOR

Dẫn xuất của FMOC

2.2. Thực nghiệm 2.2.1. Thu thập mẫu nấm.

43

Mẫu nấm tự nhiên được thu thập từ các rừng Quốc Gia Phù Mát và rừng Phong Nha Kẻ Bàng, sau khi đưa về phòng thí nghiệm được làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, sau đó bảo quản trong tủ lạnh.

2.2.2. Xử lí mẫu.

Chuẩn bị mẫu nấm đã được đồng nhất, xay nhỏ cho vào lọ đựng.

- Cân chính xác 1g nấm bằng cân phân tích chính xác 0,0001 cho vào ống chịu nhiệt. Cho 3 ml dung dịch HCl 6M vào ống đựng mẫu lắc đều và làm hòa tan mẫu bằng cách đặt ống vào máy siêu âm trong vòng 10 phút, loại bỏ không khí trong vòng 15 phút. Thủy phân mẫu bằng cách cho vào tủ sấy và đặt nhiệt độ tủ sấy ở 1250C trong 24h. Lấy mẫu ra khỏi tủ sấy để nguội, điều chỉnh về pH = 5 ÷ 6 bằng Na2B4O7 0,25M. Lọc qua giấy lọc thường và điều chỉnh về pH = 9 ÷ 10 bằng Na2B4O7 0,25M. Sau đó định mức vào bình 50ml với nước cất đề ion. Lọc qua màng lọc 0,45 µm , cho mẫu vào vial tiến hành chạy trên máy HPLC. Quá trình chẩn bị mẫu được tóm tắt bằng sơ đồ sau:

44

LƯỢC ĐỒ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH Cân 1g mẫu

Ống nghiệm

3ml HCl 6M

Đánh siêu âm mẫu 10 phút

Loại bỏ không khí bằng máy hút chân không Thủy phân mẫu ở nhiệt độ và thời gian thích hợp

Lấy mẫu ra khỏi tủ sấy Để nguội, mở ống nghiệm, điều chỉnh về PH = 5 – 6 bằng Na2B4O7 0,25M Lọc qua giấy lọc Điều chỉnh về PH =9 ÷10 bằng Na2B4O7 0,25M Định mức vào bình 50ml

Lọc qua màng lọc 0,45µm Chạy mẫu trên hệ thống HPLC

2.2.3. Tiến hành phân tích trên máy − Cột sắc ký: cột C18 150 × 4,6mm, kích thước hạt 5µm.

45

− Nhiệt độ cột: 450C. − Tốc độ dòng: 0,5ml/phút. − Pha động: Pha động A: Pha động B theo gradient :

TT

Time (min)

A%

B%

Flow (ml/min)

1 2 3 4 5 6 7

0 18 18,1 18,5 23,9 24 25

100 0 0 0 0 0 100

0 100 100 100 100 100 0

0,5 0,5 0,5 0,8 0,8 0,5 0,5

- Chương trình bơm mẫu: TT

Chương trình

1

Hút 5 µl từ vial 10 – Đệm borate

2

Hút 1 µl từ vial 11 – Dẫn suất OPA

3

Hút 0 µl từ vial 12 – Nước

4

Hút 1 µl từ vial chứa mẫu

5 6 7

Hút 0 µl từ vial 11 – Nước

8 9 10

Trộn mẫu Hút 1 µl từ vial 14 – FMOC Hút 0 µl từ vial 12 – Nước Trộn mẫu Bơm mẫu

- Đầu dò huỳnh quang bước sóng kích thích λ = 340nm, bước sóng phát xạ λ = 450 nm.

46

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xây dựng đường chuẩn Để tiến hành xây dựng đường chuẩn chúng tôi chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ: 10pmol, 25pmol, 100pmol để xác định khoảng tuyến tính của 17 axit amin. Kết quả đo được như sau:

Hình 3.1: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin ở nồng độ 10pmol

47

Hình 3.2: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin ở nồng độ 25pmol

Hình 3.3: Sắc đồ chạy hỗn hợp chuẩn 17 axit amin ở nồng độ 100pmol

Bảng 3.1: Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ (pmol/ µl ) của axit amin

48

TT

Axit

Nồng

Diện tích

Nồng

Diện tích

amin

độ

1

Asp

10

918,90765

25

1710,64294

100

5496,87207

2

His

10

510,25375

25

1177,97742

100

4722,54395

3

Thr

10

948,26996

25

2164,69751

100

8251,57422

4

Tyr

10

878,52673

25

2247,63525

100

8347,11035

5

Ile

10

1316,59045

25

3005,27686

100

11251,700

6

Glu

10

570,48480

25

1088,09412

100

4358,87207

7

Ser

10

1021,77795

25

2183,39722

100

8127,51758

8

Gly

10

1089,90881

25

2269,00244

100

8475,58496

9

Ala

10

1964,74426

25

4545,54541

100

12645,000

10

Cys-

10

278,71521

25

746,77118

100

2604,47350

độ

Nồng

Diện tích

độ

ss-cys 11

Val

10

1036,72620

25

2218,25806

100

8452,68523

12

Met

10

1049,86084

25

2753,15942

100

10393,100

13

Phe

10

725,73773

25

1790,02100

100

6737,20166

14

Leu

10

1069,91785

25

2494,30664

100

9461,74219

15

Lys

10

348,24469

25

912,37457

100

3495,46118

16

pro

10

1648,60986

25

4539,64209

100

6955,32373

Từ kết quả xác định được ở bảng 3.1, vẽ đồ thị sự phụ thuộc diện tích pic sắc ký vào nồng độ axit amin ta có đường chuẩn như sau: (x là nồng độ, y là diện tích pic)

49

Hình 3.4: Đường chuẩn định lượng His Hình 3.5: Đường chuẩn định lượng Thr

y = 47.06720x + 14.91559 R2 = 0.99997

y = 81,82352x + 83.06823 R2 = 0.99989

Hình 3.6: Đường chuẩn định lượng Tyr Hình 3.7: Đường chuẩn định lượng Ile

y = 83.81909x + 55.27848 R2 = 0,99983

y = 111.54817x + 126.72174 R2 = 0,99982

50

Hình 3.8: Đường chuẩn định lượng Glu

Hình 3.9: Đường chuẩn định lượng Ser

y = 43.06935x + 50.69149

y = 79.99255x + 145.80702

R2 = 0.99947

Hình 3.10: Đường chuẩn định lượng Gly y = 83.21861x + 168.42053 R=0.99956

R2 = 0.99965

Hình 3.11: Đường chuẩn định lượng Ala y = 123.43145x + 545.73923 R2= 0.99388

51

Hình 3.12: Đường chuẩn định lượng Asp Hình 3.13: Đường chuẩn định lượng Leu y = 52.48837x + 287.51183

y = 93.90726x + 89.52055

R2 = 0.99692

R2 = 0.99989

Hình 3.14: Đường chuẩn định lượng

Hình 3.15: Đường chuẩn định lượng Val

Cys – SS – Cys y = 25.81115x + 37.63455 R2 = 0.99936

y = 83.32034x + 130.07620 R2 = 0.99973

Hình 3.16: Đường chuẩn định lượng Met Hình 3.17: Đường chuẩn định lượng Phe Met: y = 103.81416x + 38.54980 2

R = 0.99988

Phe: y = 67.09587x + 45.26631 R2 = 0.99989

52

Hình 3.18: Đường chuẩn định lượng Lys Hình 3.19: Đường chuẩn định lượng Pro y = 34.94990x + 7.34645 R2 = 0.99993

y =53.82445x – 13.40806 R2 = 0.99931

3.2. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp • Giới hạn phát hiện ( LOD) Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được (đối với phương pháp định lượng).

LOD được xác định bằng nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó cho các pic có tín hiệu bằng 3 lần nhiễu đường nền. Đây là một thông số đặc trưng cho độ nhạy của phương pháp. Chất nào nhạy hơn sẽ có giới hạn phát hiện nhỏ • Giới hạn định lượng (LOQ) : LOQ được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà phép phân tích vẫn định lượng được chính xác với độ tin cậy 95% . Theo lí thuyết thống kê trong hóa phân tích thì LOQ là nồng độ chất phân tích mà cho tín hiệu gấp 10 lần tín hiệu đường nền.

Công thức tính giá trị LOD và LOQ :

53

LOD =

3 × SD

LOQ =

a

n

i =1

n −1

a

n

∑ ( xi − x) 2 SD =

10 × SD

∑ (x =

i

=

10 × LOD 3

− x) 2

i =1

k

Trong đó: SD là độ lệch chuẩn n là số lần phân tích lặp lại của mẫu i k là số bậc tự do (k= n-1) xi là giá trị nồng độ mẫu tại lần đo thứ i x là giá trị nồng độ trung bình của n lần đo

a : Là hệ số góc của phương trình hồi quy tuyến tính (y = ax +b) Tiến hành đo lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ chuẩn ta có bảng giá trị LOD và LOQ của Aspartic như sau: Bảng 3.2: Giá trị LOD và LOQ của axit Aspartic Nồng độ chuẩn (pmol)

Nồng độ đo được SD

SD(tb)

LOD pmol

LOQ Pmol

Lần 1

Lần 2

Lần 3

10

12,29757

12,20815

12,21738

0,04015

25

24,08097

24,10468

24,06121

0,01777 0,03274 0,0019 0,0063

100

99,04614

99,11618

99,14143

0,04030

Tương tự, khi tiến hành đo lặp lại 3 lần dãy các nồng độ chuẩn (10, 25, 100 pmol) của 16 axit amin còn lại ta có kết quả giới hạn phát hiện và giới hạn

54

định lượng được chỉ ra ở bảng 3.3.

Bảng 3.3: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp TT

Axit amin

LOD (pmol)

LOQ (pmol)

1

Asp

0,0019

0,0063

2

Glu

0,0027

0,0090

3

Ser

0,0021

0,0070

4

His

0,0060

0,0200

5

Gly

0,0037

0,0125

6

Thr

0,0025

0,0084

7

Ala

0,0006

0,0020

8

Try

0,0046

0,0153

9

Cys-ss-cys

0,0029

0,0097

10

Val

0,0036

0,0120

11

Met

0,0010

0,0033

12

Phe

0,0022

0,0073

13

Ile

0,0013

0,0043

14

Leu

0,0014

0,0047

15

Lys

0,0015

0,005

16

Pro

0,0029

0,0097

Kết quả từ bảng 3.3 cho thấy khoảng giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp là rất nhỏ chứng tỏ thiết bị phân tích có độ nhạy cao.

Như vậy phương pháp này hoàn toàn phù hợp để xác định hàm lượng axit amin dạng vết trong mẫu phân tích.

3.3. Khảo sát các điều kiện thủy phân mẫu 3.3.1. Khảo sát nồng độ axit HCl

55

Để chọn nồng độ axit HCl phù hợp cho sự thủy phân mẫu chúng tôi khảo sát một dãy mẫu thực (mẫu nấm Thượng hoàng) cùng với chuẩn axit amin 25pmol được thêm vào và thủy phân trong môi trường HCl ở các nồng độ : 4M; 6M; 7M. Ở nhiệt độ thủy phân 1250C trong thời gian 24h. Kết quả thực nghiệm cho thấy nồng độ HCl ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu suất thủy phân.

Khi nồng độ HCl thấp, mẫu thủy phân không hoàn toàn, hiệu suất thấp, còn khi nồng độ HCl đủ lớn mẫu thủy phân hoàn toàn.

Hình 3.20: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm Thượng hoàng tại nồng độ HCl 4M

56

Hình 3.21: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm Thượng hoàng tại nồng độ HCl 6M

Hình 3.22: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm Thượng hoàng tại nồng độ HCl 7M

57

Bảng3.4: Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi Nồng TT

độ HCl

Nồng độ (pmol) Axit amin Cs+mẫu

Cmẫu

Cs+mẫu - Cmẫu

Cos (pmol)

H%

(M)

1

2

3

4

4

Val

78,20105

58,60855

19,5925

25

78,37

6

Val

77,12652

53,83017

23,29635

25

93,19

7

Val

94,67967

82,07970

12,59997

25

50,40

4

Ser

70,0778

51,12522

18,95251

25

75,81

6

Ser

46,55488

37,16798

9,38690

25

93,87

7

Ser

80,16694

60,07444

20,09250

25

80,37

4

Gly

56,85719

43,16463

15,69256

25

62,77

6

Gly

57,20037

35,11787

22,0825

25

88,33

7

Gly

71,83441

59,46321

12,3712

25

49,48

4

Leu

60,70277

46,69294

14,00983

25

56,04

6

Leu

57,87564

38,27814

19,5975

25

78,39

7

Leu

75,05681

61,20772

14,74909

25

59,00

Trong đó: Cos là nồng độ chuẩn thêm vào (pmol) Cs+mẫu là nồng độ mẫu thêm chuẩn (pmol) Cmẫu là nồng độ mẫu phân tích (pmol)

58

Hình 3.23: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axit amin vào nồng độ HCl Từ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi các axit amin vào nồng độ HCl thủy phân cho thấy khi nồng độ axit HCl chưa đủ để thủy phân mẫu thì hiệu suất thu hồi của một số axit amin nhỏ hơn 100%, có thể do lẫn tạp chất hoặc chưa tách được hoàn toàn. Từ nồng độ 5,5-6M thì hiệu suất thu hồi bắt đầu ổn định và các hiệu suất thu được đều lớn hơn 90%. Từ kết quả này chúng tôi chọn nồng độ axit HCl 6M làm môi trường thủy phân mẫu cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.3.2. Khảo sát thời gian thủy phân mẫu Để chọn thời gian phù hợp cho sự thủy phân các axit amin, chúng tôi chuẩn bị mẫu nấm Thượng hoàng và mẫu nấm Thượng hoàng thêm chuẩn 25pmol tiến hành thủy phân trong môi trường HCl 6M, nhiệt độ 1250C và thủy phân tại các mốc thời gian khác nhau : 20h, 22h, 24h, 26h.

59

Hình 3.24: Sắc đồ các axit amin của mẫu nấm Thượng hoàng thủy phân 20h

Hình 3.24: Sắc đồ các axit amin của mẫu nấm Thượng hoàng thủy phân 22h

60

Hình 3.26 : Sắc đồ các axit amin của mẫu nấm Thượng hoàng tại thời gian thủy phân 24h

Hình 3.27: Sắc đồ các axit amin của mẫu nấm Thượng hoàng thủy phân 26h

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi

61

Thời TT

gian

2

3

Cs+mẫu -

Cos (pmol)

H%

Cs+mẫu

Cmẫu

Cmẫu

20

Met

13,89374

3,74293

10,15081

25

101,51

22

Met

46,39152

32,79879

11,59273

25

115,93

24

Met

31.81972

7,07722

24,74251

25

98,97

26

Met

53.60454

30,87333

22,73

25

90,92

20

Ser

173,41949

164,48299

8,93650

25

89,36

22

Ser

136.45201

113,74197

22.71003

25

90,84

24

Ser

46.55488

37,16798

9,38690

25

93,87

26

Ser

115,10768

104,07405

11,03318

25

110,33

20

Thr

190.99758

169,27693

21.72065

25

86.88

22

Thr

140.40317

119,86729

20.53586

25

82.14

24

Thr

24.48210

0,627899

23.85420

25

95.42

26

Thr

134.14618

109,49253

24.65365

25

98.61

Ala

157.45626

130,81709

26.63917

25

106,56

22

Ala

136.99577

114,66710

22.32867

25

89.31

24

Ala

87.02606

62,92079

24.10527

25

96.42

26

Ala

121,07270

111,74550

9,32720

25

93,21

20

4

Nồng độ (pmol)

amin

(h)

1

Axit

62

Hình 3.28: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axit amin vào thời gian thủy phân

Kết quả ở bảng 3.5 và hình 3.28 cho thấy dưới 20h mẫu chưa được thủy phân hoàn toàn, các axit amin chưa tách hết khỏi tạp chất nên cho hiệu suất thu hồi không ổn định. Khi thời gian thủy phân lớn hơn 20h đủ để tách được các axit amin ra khỏi nền mẫu nên hiệu suất thu hồi bắt đầu ổn định. Thời gian từ 24h-26h cho hiệu suất thu hồi tốt nhất, đều lớn hơn 90%, ở 24h cho hiệu suất rất lớn (> 95%) và ổn định. Vậy nên chúng tôi chọn 24h là thời gian thủy phân mẫu phân tích.

Từ các kết quả thu được khi khảo sát nồng độ axit HCl và thời gian thủy phân đã trình bày ở trên chúng tôi đề xuất lược đồ quy trình phân tích ở mục 2.4.3 cho axit amin thủy phân.

3.5. Độ thu hồi của phương pháp Đây là thông số không thể thiếu khi đánh giá một phương pháp phân tích. Dựa vào việc thêm chuẩn vào mẫu thực cùng với làm mẫu thực không thêm chuẩn song song chúng tôi tiến hành tính độ thu hồi như sau : • Hiệu suất thu hồi: H% =

Cs+m − Cm × 100 C so

63

Trong đó: H%: hiệu suất thu hồi Cs+m: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn Cm : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thực Cso: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên một mẫu nấm đã xác định được hàm lượng các axit amin ở phần xác định độ lặp lại của phương pháp, đó là mẫu nấm Thượng hoàng, nấm Linh chi đen.

Tiến hành thí nghiệm trên nấm Thượng hoàng, nấm Linh chi đen và nấm Thượng hoàng, nấm Linh chi đen thêm chuẩn 25pmol, dựa vào phương trình đường chuẩn thu được kết quả của mẫu thêm chuẩn và đem so sánh với nồng độ chuẩn thêm vào, thực hiện phân tích 5 lần lặp lại và lấy kết quả trung bình. Các kết quả được chỉ ra ở bảng 3.6 và bảng 3.7.

Bảng 3.6: Hiệu suất thu hồi của axit amin trong nấm Thượng Hoàng µg / ml

Cmẫu ( µg / ml )

Asp

20,4077

Glu

Cso+mẫu

Cso

( µg / ml )

H (%)

16,1328

3,2028

133,47

KPH

KPH

3,5528

KPH

Ser

6,4624

3,9026

2,5776

99,31

His

16,1418

12,5187

3,8410

94,32

Gly

4,2489

2,6338

1,8349

88,02

Thr

KPH

0,2749

2,9451

KPH

Ala

7,8525

5,5600

2,2060

103,92

Arg

-

-

-

-

Tyr

4,9700

0,6301

4,5359

95,68

Axit amin

64

Cys – ss – Cys

8,3112

5,4216

3,0462

94,86

Val

9,0238

6,2981

2,9727

94,88

Met

4,4149

1,0545

3,7433

89,77

Phe

13,4033

8,8533

4,1191

110,46

Ile

3,4496

0,4465

3,2420

92,63

Leu

7,9043

5,0144

3,2500

88,92

Lys

7,0297

3,4539

3,6675

97,50

Pro

8,4506

5,6383

2,9027

96,88

Bảng 3.7: Hiệu suất thu hồi của axit amin trong nấm Linh chi đen Cso + mẫu

Cmẫu

Cso

( µg / ml )

( µg / ml )

( µg / ml )

Asp

45,3615

42,0659

3,2028

102,89

Glu

KPH

KPH

3,5528

KPH

Ser

12,5491

10,1270

2,5776

93,97

His

52,5135

48,8215

3,8410

96,12

Gly

12,0672

10,3712

1,8349

92,43

Thr

3,5380

0,6982

2,9451

96,43

Ala

6,9751

4,9373

2,2060

92,37

Arg

-

-

-

-

Tyr

8,9565

4,6159

4,5359

95,69

Cys – ss – Cys

41,0087

38,1906

3,0462

92,51

Axit amin

H(%)

65

Val

29,8559

28,2817

2,8727

89,61

Met

4,9564

1,4930

3,7433

92,52

Phe

13,1158

8,9175

4,1191

101,92

Ile

16,1063

12,9941

3,2420

96,00

Leu

26,6805

22,8014

3,2500

88,58

Lys

7,9765

4,5554

3,6675

93,28

Pro

29,1281

26,4860

2,9027

91,02

Các kết quả về hiệu suất thu hồi giao động từ khoảng 88% đến 105%.

Theo AOCA, ở khoảng nồng độ của các axit amin đang xét thì độ thu hồi chấp nhận được là từ 80 - 110%, như vậy phương pháp áp dụng cho mẫu nấm Thượng hoàng và nấm Linh chi đen có độ thu hồi tốt.

Hình 3.29: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm Thượng hoàng

66

Hình 3.30: Sắc đồ tách axit amin trong dịch nấm Thượng hoàng thêm chuẩn 3.6. Xác định hàm lượng các axit amin trong các mẫu nấm Sau khi tìm được các điều kiện tối ưu cho quá trình xử lý mẫu phân tích axit amin trong mẫu nấm. Đánh giá thống kê quy trình phân tích axit amin đều đạt trong giới hạn cho phép, chúng tôi tiến hành áp dụng phân tích mẫu thực tế gồm 7 mẫu nấm tự nhiên: nấm PL1, nấm PL2, nấm PL3, nấm PL4, nấm Linh chi, nấm Linh chi đen.

Hàm lượng axit amin (µg/g) có trong mẫu được tính theo công thức sau :

C=

CO ×V m

Trong đó : - C là hàm lượng axit amin có trong mẫu, tính theo µg/g - Co: Hàm lượng axit amin có trong dịch chiết tính thông qua đường chuẩn ( µg / ml ) - m: lượng mẫu nấm phân tích (g)

67

- V: Thể tích định mức mẫu (ml) (bảng quy đổi đơn vị pmol/ µl sang µg / ml ở phần phụ lục 2) 3.6. Kết quả phân tích hàm lượng axit amin thủy phân Mẫu nghiên cứu gồm 7 loại nấm được tiến hành phân tích theo lược đồ quy trình phân tích. Kết quả phân tích cụ thể hàm lượng các axit amin trong 1g mẫu nấm Thượng hoàng được chỉ ra ở bảng 3.9 và các sắc đồ từ hình 3.31 đến hình 3.38. Kết quả phân tích cụ thể hàm lượng các axit amin trong 1g mẫu nấm Thượng hoàng được chỉ ra ở bảng 3.8.

Bảng 3.8: Hàm lượng axit amin trong nấm Thượng hoàng Hàm lượng ( µg / g ) 23,0217

TT

Axit amin

Diện tích

1

Thr

134,44516

2

Val

4615,22412

527,4791

3

Met

773,26526

88,3166

4

Ile

506.93848

37,3953

5

Leu

3684,11597

419,9665

6

Phe

3645,38525

741,4824

7

Lys

834,16046

289,2747

8

His

3816,34302

1048,4690

Tổng axit amin thiết yếu

3175,4053

9

Asp

6654,29736

1351,1558

10

Glu

KPH

KPH

68

11

Ser

3118,96802

326,8509

12

Gly

3090,88110

220,5863

13

Cys – ss – Cys

1194,14832

454,0703

14

Ala

8312,14355

469,0075

15

Arg

-

-

16

Tyr

344,86682

52,7696

17

Pro

4175,47900

472,2161

Tổng axit amin không thiết yếu

3346,6565

Tổng

6522,0618

EAA/TAA

48,68%

Hàm lượng các mẫu nấm PL1, PL2, PL3, PL4, Linh chi , Linh chi đen được tính toán tương tự, kết quả được chỉ ra ở bảng 3.9 và các sắc đồ từ hình 3.31 đến 3.38.

69

Hình 3.31: Sắc đồ tách axit amin trong dịch mẫu nấm Linh Chi Đen

Hình 3.32: Sắc đồ tách axit amin trong dịch nấm Linh Chi Đen thêm chuẩn

70

Hình 3.33: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL1

Hình 3.34: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL2

71

Hình 3.35: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL3

Hình 3.36: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL4

72

Hình 3.37: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm Linh Chi

Hình 3.38: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân nấm Linh Chi Đen Bảng 3.9: Hàm lượng axit amin trong các mẫu nấm TT

Axit

Nấm

Nấm

Nấm

Nấm

Nấm

Linh

amin

PL1

PL2

PL4

PL3

Linh Chi

Chi

73

Đen 1

Thr

KPH

7.32

7.62

KPH

27,96

69.56

2

Val

2039.50

KPH

1195.31

1197.4

1498,76

2717.84

3

Met

149.43

51.90

15.11

9.36

321,18

148.73

4

Ile

729.08

108.66

219.41

251.45

396,45

1294.49

5

Leu

1785.60

537.61

1052.79

1062.11

952,02

2271.51

6

Phe

3175.21

747.98

1624.62

1737.25

2258.77

888.37

7

Lys

493.46

207.77

690.36

483.99

672.97

453.82

8

His

4348.93

1037.40

2488.49

2510,92

2421.66

4863.67

12721.1

2698,64

7365.71

7252.48

8549.77

12707.9

Tổng axit amin thiết yếu 9

Asp

3876.80

882.97

1812.52

1797.90

1558.60

4190.67

10

Glu

KPH

KPH

KPH

KPH

KPH

KPH

11

Ser

1286.11

0

771.86

762.50

277.79

1008.87

12

Gly

1052.69

KPH

560.67

609.05

313.02

1033.28

3082.47

1980.87

1410.38

1955.63

1018.8

3804.60

1192.51

270.37

723.62

685.38

935.96

491.86

Cys – 13

ss – Cys

14

Ala

74

15

Arg

_

_

_

_

_

_

16

Tyr

266.17

83.64

102.65

108.27

130.41

459.84

17

Pro

1511.82

556.47

825.85

973.07

1251.27

2638.57

12268.7

3774.32

6207.55

6891.8

5485.85

13627.9

Tổng

24989.8

6472.96

13573.26

14144.8

14035.62

26335.8

EAA/TAA

50.91%

41.69%

54.27 %

51.28%

60.91%

48.25%

Tổng axit amin không thiết yếu

Bảng 3.8 và bảng 3.9 cho thấy trong 7 loại nấm thì nấm Linh Chi Đen có tổng hàm lượng các axit amin cao nhất (26335.8 µg/g), nấm PL2 thấp nhất (6472.96 µg/g).

Nếu so sánh với một số loài nấm trên thế giới đã được nghiên cứu về hàm lượng như nấm sò tím 6,86 g/100g = 68600 µg/g và nấm kim châm Hàn Quốc 5,62 g/100g = 56200 µg/g (Lee, K, J et at., 2011), hay loài Dictyophora indusiata (nấm lưới trắng) là loài có hàm lượng axit amin (8000mgkg-1) thấp nhất trong 41 loài nấm Vân Nam (mục 1.2.5) thì có thể nhận xét các mẫu nấm hàm lượng trung bình còn thấp.

Như vậy, tùy thuộc từng loài nấm, môi trường sống…mà nấm có hàm lượng protein khác nhau.

Trong thành phần của cả 7 loại nấm này đều chứa đầy đủ các axit amin thiết yếu cho cơ thể. Tỉ lệ EAA/TAA từ 41.69% (nấm Pl2) đến 60,91% (nấm Thượng Hoàng) suy ra tỉ lệ EAA/NEAA từ 0,78 – 1.56. Như vậy tỉ lệ

75

EAA/NEAA của 7 loại đáp ứng tốt với giá trị tham khảo là 0,6 đề nghị bởi PAO/WHO (1973), tuy nhiên axit amin Arg không được định lượng trong các mẫu do đó ảnh hưởng khách quan đến kết quả. Cả 7 loại nấm này là nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng có chứa đầy đủ các axit amin thiết yếu.

Hàm lượng Glu và một số acid amin khác quá nhỏ trong một vài loại nấm nên không thể định lượng được.

Chúng tôi cũng tiến hành xác định axit amin thủy phân ở các loại nấm PL1, Pl2, Pl3, Pl4, Thượng Hoàng được xử lí mẫu nguyên liệu theo các phương pháp khác nhau. Kết quả ở bảng 3.10.

Bảng 3.10.Hàm lượng các axit amin trong mẫu nấm theo các phương pháp xử lí mẫu khác nhau Nấm

Nấm TT

Axit

Nấm PL1

Nấm PL1

amin

HL- ĐK

HL- CK

Nấm PL1 HL- T

PL2

Thượng Nấm PL2

HL- T

Hoàng HL- T

PL3 HL- T

Nấm PL4 HL-CK

HL-CK

1

Thr

114,34

KPH

24,04

KPH

0

0

0

0

2

Val

0

1647,34

0

2019,58

2582,3

0

1997,9

2401,8

3

Met

300,80

217,27

107,05

369,65

418,02

128,03

106,10

234,19

4

Ile

160,42

198,67

0

232,34

286,23

0

KPH

0

5

Leu

1219,18

1433,88

464,26

2318,08

3120,5

462,75

2544,2

1251,18

76

6

Phe

135,11

1555,73

481,56

2389,19

2987,1

498,79

2543,5

1233,3

7

Lys

667,68

627,64

201,09

861,04

1091,0

319,69

751,48

1011,4

8

His

1817,90

1688,69

783,28

2587,22

3407,9

1246,9

2770,8

2055,3

4415,43

7369,22

2061,28

10777,1

13893,1

2656,16

10713,9

8187,2

Tổng axit amin thiết yếu 9

Asp

1386,88

1203,08

296,17

2285,56

2818,5

749,18

2860,2

1202,9

10

Glu

KPH

KPH

KPH

KPH

KPH

KPH

KPH

KPH

11

Ser

KPH

KPH

KPH

KPH

KPH

KPH

KPH

KPH

12

Gly

KPH

KPH

KPH

KPH

KPH

KPH

KPH

KPH

4951,88

3601,55

2701,1

4531,36

5943,4

3059,7

1439,6

5905,8

Cys 13

– ss – Cys

14

Ala

KPH

0

KPH

0

0

0

0

0

15

Arg

_

_

_

_

_

_

_

_

16

Tyr

614,84

608,27

294,29

364,36

921,29

279,65

272,96

1033,8

17

Pro

4988,89

3460,9

1536,1

5020,9

4633,5

3519,9

3852,8

5634,6

11942,49

8873,8

4827,66

12202,18

14316,7

7608,43

8425,56

13777,1

16357,92

8947,50

6888,94

22979,28

28209,8

10264,6

19139,5

21964,3

Tổng axit amin không thiết yếu Tổng

77

EAA/TAA

27,00%

82,36%

29,92%

46,90%

49,25%

25,88%

55,98%

37,28%

Từ bảng 3.10 ta thấy ở các điều kiện xử lí mẫu khác nhau làm ảnh hưởng đến hàm lượng các acid amin ở các mức độ khác nhau. Thr bị mất đi khi sử dụng phương pháp chiết hồi lưu, sấy đông khô để xử lí mẫu.

78

KẾT LUẬN Trên cơ sở các nhiệm vụ được đặt ra và các kết quả đã đạt được chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Khảo sát tối ưu hóa một số điều kiện trong quy trình thủy phân xử lý mẫu xác định hàm lượng axit amin trong nấm : + Thời gian thủy phân mẫu tối ưu là 24h + Nồng độ HCl thủy phân tối ưu là 6M 2. Đã xây dựng được các phương trình đường chuẩn của các axit amin và xác định được khoảng nồng độ nghiên cứu nằm trong khoảng tuyến tính.

3. Xác định được giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ của phương pháp là rất nhỏ: LOD từ 0,0006 – 0,0060 pmol, LOQ từ 0,0020 – 0,0153 pmol.

4. Quy trình phân tích đưa ra đã được đánh giá bằng đường chuẩn, độ thu hồi. Độ thu hồi với các loại axit amin nằm trong khoảng 85,6 – 133,8% trong vùng đường chuẩn tuyến tính.

5. Xác định được hàm lượng axit amin thủy phân trong 7 mẫu nấm tự nhiên, cụ thể: TT

Mẫu nấm

Hàm lượng axit amin thủy phân(µg/g)

1.

Nấm PL1

24989.8

2.

Nấm PL2

6472.96

3.

Nấm PL3

13573.26

4.

Nấm PL4

14144.8

79

5.

Nấm Thượng hoàng

6522.06

6.

Nấm Linh chi

14035.62

7.

Nấm Linh chi đen

26335.8

Từ các kết quả thu được chúng tôi thấy phương pháp phân tích hàm lượng axit amin trong các mẫu nấm với độ tin cậy cao và đề nghị được áp dụng phương pháp phân tích axit amin này cho nhiều đối tượng thực phẩm khác nhau.

Chúng tôi mong muốn được tiếp tục nghiên cứu để hoàn chỉnh và mở rộng trong những đề tài khác, tiếp tục đánh giá các kết quả để có thể so sánh được hàm lượng axit amin trong những loài nấm khác nhau từ đó đánh giá được giá trị của các loài nấm và bổ sung số liệu vào bảng thành phần thực phẩm Việt Nam.

80

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Trung thuần, Phạm Thị Thu, (2002), Bách khoa dinh dưỡng, Nhà xuất bản Phụ Nữ- Hà Nội, trang 28-52.

2. Phạm Luận (1987), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, Khoa Hóa học - Trường Đại học Tổng Hợp Hà Nội 3. Phạm Luận (1999), Cơ sở lý thuyết sắc ký điện di mao quản hiệu suất cao, Khoa Hóa học - Trường ĐHKHTN Hà Nội.

4. Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Như Thuận (1978), Kiểm nghiệm lương thực thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật – Hà Nội, trang 128-183.

5. Trịnh Tam Kiệt (2011), Nấm lớn ở Việt Nam tập I, Nhà xuất bản khoa học tự nhiên và công nghệ.

6. Trịnh Tam Kiệt, Trịnh Tam Bảo (2008), Thành phần loài nấm dược liệu của Việt Nam, Tạp chí di truyền học và ứng dụng – chuyên san công nghệ sinh học, 4, 39-42.

Tiếng Anh 7. AOAC Official Method (2000), Monosodium Glutamate in food, Potentiometric Titration Method, C. 970.37.

8. Bailey, J.L. (1962), Estimation of amino acids by ninhydrin, Techniques in Protein Chemistry, Elsevier, Amsterdam, pp 73-81.

9. Bano Z., Rajarathnam, S. (1988), Pleurotus mushroom, CRC Crit Rev Food Sci Nutr, 27, 87–158.

10. Bano, Z., Rajathnam, S. (1982), Tropical Mushroom Biological Nature and Cultivation Methods, Chinese University Press, Hong Kong, 363380, 1982.

11. Barros L, Cruz T, Baptista P, Estevinho LM, Ferreira ICFR. (2008), Food Chem Toxicol, 46:2742–7.

81

12. Barros, L., Baptista, P., Correira, D. M., Casa, S., Oliveira, B., & Ferreira, I. C. F. R. (2007a), Fatty acid and sugar compositions, and nutritional value of five wild edible mushrooms from Northeast Portugal, Food Chemistry, 105, 140–145.

13. Barros, L., Venturini, B. A., Baptista, P., Estevinho, L. M., & Ferreira, I. C. F. R. (2008), Chemical composition and biological properties of Portuguese wild mushrooms: A comprehensive study, Journal of Agricultural and Food Chemistry. doi:10.1021/jf8003114.

14. Bauer-Petrovska, B. (2001). Protein fractions in edible Macedonian mushrooms. European Food Research and Technology, 212, 469–472.

15. Belitz, H.-D., & Grosch, W. (1999), Food chemistry, Berlin: Springer.

16. Cavalieri, C., Bolzoni, L., & Bandini,M. (2010), Nicotine determination in mushrooms by LC-MS/MS with preliminary studies on the impact of drying on nicotine formation. Learning, Media and Technology, 27, 473.

17. Chang, S, T. (1980), Mushroom as human food, Bioscience, 30, 399-401.

18. Chen, S.-Y., Ho, K.-J., Hsieh, Y.-J., Wang, L.-T., & Mau, J.-L. (2012), Contents of lovastatin, c-aminobutyric acid and ergothioneine in mushroom fruiting bodies and mycelia, LWT-Food Science and Technology, 47, 274–278.

19. Colak, A., Faiz, Z., & Sesli, E. (2009), Nutritional composition of some wild edible mushrooms, Turkish Journal of Biochemistry, 34, 25–31.

20. Colak, A., Kolcuoglu, Y., Sesli, E., & Dalman, O. (2007), Biochemical composition of some Turkish fungi, Asian Journal of Chemistry, 19, 2193–2199.

21. Constantinos K. Zacharis, Georgios A. Theodoridis, Anastasios N. Voulgaropoulos (2005), Coupling of sequential injection with liquid chromatography for the automated derivatization and on-line determination of amino acids, Talanta, 68, p.448-458.

22. Dany Heems, Genevieve Luck, Christophe Fraudeau, Eric Verette (1988), Full automated precolumn derivatization, on-line dialysis and highperformance liquid chromatographic analysis of amino acids in food, beverages and feedstuff, Journal of chromatography A, 798, p.9-17.

82

23. Díez, A. A., & Alvarez, A. (2001), Compositional and nutritional studies on two wild edible mushrooms from northwest Spain, Food Chemistry, 75, 417–422.

24. Diplock AT, Aggett PJ, AshwellM, Bornet F, Fern EB, RoberfroidMB (1999), Br J Nutr, 81:S1–S27.

25. Eva Guillamón, Ana García-Lafuente, Miguel Lozano, Matilde D´Arrigo, Mauricio A. Rostagno, Ana Villares, José Alfredo Martínez (2010), Edible mushrooms: Role in the prevention of cardiovascular diseases, Fitoterapia, Volume 81 , Pages 715-723.

26. Falandysz J. (2008). J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev; 26:256–99.

27. FAO (Food and Agriculture Organization) (1991), Protein Quality Evaluation, Rome:Food and Agricultural Organization of the United Nations.

28. Gross, B., & Asther, M. (1989). Flavour of Basidiomycetes: Characteristics, analysis and production, Sciences des Aliments, 9, 427– 454.

29. Guo, Y. J., Deng, G. F., Xu, X. R., Wu, S., Li, S., Xia, E. Q., et al. (2012), Antioxidant capacities, phenolic compounds and polysaccharide contents of 49 edible macro-fungi, Food & Function, 3, 1195–1205.

30. Hawksworth, D.L., (1991), The fungal dimension of biodiversity.

Magnitude, significance and conservasion, Mycol, Res. 95, 640-655.

31. Hawksworth, D.L., (2001), The magnitude of fungal diversity: the 1.5 million species estimate revisited, Mycol, Res. 105, 1422-1432.

32. Hayes, W, A., Haddad, N. (1976). The foof value of the cultivated mushroom and its importance to the mushroom industry, Mushroom J., 40, 104-110.

33. Ibrahim Kıvrak, Seyda Kıvrak, Mansur Harmandar (2014), Free amino acid profiling in the giant puffball mushroom (Calvatia gigantea) using UPLC–MS/MS, Food Chemistry, 158, 88–92

83

34. Kim, M. Y., Chung, L. M., Lee, S. J., Ahn, J. K., Kim, E. H., Kim, M. J., et al. (2009), Comparison of free amino acid, carbohydrates concentrations in Korean edible and medicinal mushrooms, Food Chemistry, 113, 386– 393.

35. Kwang Jae Lee, In Jue Yun, Kyung Hee Kim, Sang Hyun Lim, Hun Ju Ham, Won Sik Eum, Jin Ho Joo (2011), Amino acid and fatty acid compositions of Agrocybe chaxingu, an edible mushroom, Journal of Food Composition and Analysis, 24, 175–178 36. Li, G. S. F., Chang, S.T. (1982), Tropical Mushroom Biological Nature and Cultivation Methods, Chinese University Press, Hong Kong, 199219.

37. Liu, P., Li, H. M., & Tang, Y. J. (2012), Comparison of free amino acids and 5’ -nucleotides between Tuber fermentation mycelia and natural fruiting bodies, Food Chemistry, 132, 1413–1419.

38. Liu, Y. T., Sun, J., Luo, Z. Y., Rao, S. Q., Su, Y. J., Xu, R., et al. (2012), Chemical composition of five wild edible mushrooms collected fromsouthwest China and their antihyperglycemic and antioxidant activity, Food and Chemical Toxicology, 50, 1238–1244.

39. Lourdes Bosch, Amparo Alegria, Rosaura Farre (2006), Application of the 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) reagent to the RP-HPLC determination of amino acids in infant foods, Journal of chromatography B, 831, P. 176-183.

40. M. Ummadi, B. C.Weiner (2002), Use of capillary electrophoresis and laser-induced fluorescence for attomole detection of amino acids, Journal of chromatography A, 964, p.243-253.

41. Mantovani MS, Bellini MF, Angeli JPF, Oliveira RJ, Silva AF, Ribeiro LR.(2008), Mutat Res;658:154–61.

42. Manzi P, Grambelli L, Marconi S, Vivanti V, Pizzoferrato L. (1999), Food Chem, 65, 477–82.

43. Manzi, P., Marconi, P., Aguzzi, A., & Pizzoferrato, L. (2004), Commercial mushrooms: Nutritional quality and effect of cooking, Food Chemistry, 84, 201–206.

84

44. Marekov, L., Momchilova, S., Grung, B., Nikolova-Damyanova, B. (2012), Fatty acid composition of wild mushroom species of order Agaricales—Examination by gas chromatography–mass, Journal of Chromatography B, Volume 910, 54-60.

45. Mattilda P, Könkö K, Eurola M, Pihlava JM, Astola J, Vahteristo L, et al.( 2001), J Agric Food Chem , 49, 2343–8.

46. Moore, S., Stein, W.H., (1948), Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids, Journal of Biological Chemistry, 176, p.367-388.

47. Moore, S., Stein, W.H., (1951), Determination amino acid by postcolumm derivatization, J.Biol. Chem. 192,663.

48. Moore, S., Stein, W.H., (1954), A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds, Journal of Biological Chemistry, 211, p.907-913.

49. Nathalie Le Floc'h, Bernard Seve (2007), Biological roles of tryptophan and its metabolism: Potential implications for pig feeding, Livestock Science, Volume 112, Issues 1-2 23–32.

50. Nedelcheva, D., Antonova, D., Tsvetkova, S., Marekov, I., Momchilova, S., Nikolova-Damyanova, B., et al. (2007). TLC and GC–MS probes into the fatty acid composition of some Lycoperdaceae mushrooms. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 30, 2717–2727.

51. Pavel Kalač (2009), Chemical composition and nutritional value of European species of wild growing mushrooms, Food Chemistry, Volume 113, Pages 9-16.

52. Rai, M., Tidke, G., & Wasser, S. P. (2005), Therapeutic potential of mushrooms, Natural Products Radiance, 246–257.

53. Satoshi Mitsuhashi (2014), Current topics in the biotechnological production of essential amino acids, functional amino acids, and dipeptides, Current Opinion in Biotechnology, 26:38–44.

54. Shih-Wen Sun, Yi-Cheng Lin, Yih-Ming Weng, Min-Jane Chen (2006), Effciency improvement on ninhydrin method for amino acids quantification, Journal of food and analysis, 19, p.112-117.

85

55. Shu-ting Chang and Philip G.Miles, (1930), Mushroom culvation, nutritional value, medicinal effect, and environmental impact, 2nd ed.

56. Sun, C., Lin, J.,Wan, Y. P., Liu, Y., & Xu, H. K. (2012), Amino acids contents of common wild edible mushrooms in Yunnan province, Plant Diversity and Resources, 34,89–92.

57. U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, USDA Nutrient Data Laboratory (2009), USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 22. www.ars.usda.gov/nutrientdata.

58. University of Maryland Medical Center (2009). "Lysine", Retrieved 59. Vaz, J. A., Barros, L., Martins, A., Santos-Buelga, C., Vasconcelos, M. H., & Vasconcelos I. C. F. R. (2011), Chemical composition of wild edible mushrooms and antioxidant properties of their water soluble polysaccharidic and ethanolic fractions, Food Chemistry, 126, 610–616.

60. Vetter, J. (2000), Trypsin inhibitor activity of basidiomycetous mushrooms, European Food Research and Technology, 211, 346–348.

61. Wang, X, M., Zhang, Z., Wu, L, H., Zhao, Y, L., Li, T., Li, Z, Q., Wang, Y, Z., Liu, H, G. (2014), A mini-review of chemical composition and nutritional value of edible wild-grown mushroom from China, Food Chemistry, 151, 279–285.

62. Whittaker, R. H. (1969), “New concepts of kingdoms of organisms”, Science, 163, 150–160 63. Wu G. (2009), Amino acids: metabolism, functions, and nutrition, Amino Acids, 37, 1-17.

64. Yaru Song, Ming Shenwu, Shulin Zhao, Dongyan Hou, Yi-Ming Liu (2005), Enantiomeric separation of amino acids derivatized with 7-fluoro4-nitrobenzoxadiazole by capillary liquid chromatographyltandem mass spectrometry, Journal of chromatography A, 1091, 102-109.

65.

Yiannis C. Fiamegos, Constantine D. Stalikas (2006), Gas chromatographic determination of amino acids via one-step phase-transfer catalytic pentafluorobenzylation-preconcentration, Journal of chromatography A.

86

66. Yin, J. Z., & Zhou, L. X. (2008). Analysis of nutritional components of 4 kinds of wild edible fungi in Yunnan. Food Research and Development, 29, 133â&#x20AC;&#x201C;136.

87