ỨNG DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG PHÂN TÍCH PROLINE VÀ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN AMPICILLIN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y ****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG PHÂN TÍCH PROLINE VÀ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN AMPICILLIN VÀ TETRACYCLINE

Họ và tên sinh viên: NGUYỄN THỊ MINH NHUNG Lớp: DH05DY Ngành: DƯỢC THÚ Y Niên khóa: 2005 - 2010

Tháng 8/2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y ****************

NGUYỄN THỊ MINH NHUNG

ỨNG DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG PHÂN TÍCH PROLINE VÀ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN AMPICILLIN VÀ TETRACYCLINE

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ thú y chuyên ngành Dược

Giáo viên hướng dẫn ThS. PHÙNG VÕ CẨM HỒNG BSTY. ĐẶNG THỊ XUÂN THIỆP

Tháng 8 năm 2010

i

PHIẾU XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ và tên sinh viên thực tập: Nguyễn Thị Minh Nhung Tên luận văn: Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao trong phân tích proline và xây dựng đường chuẩn ampicillin và tetracycline. Đã hoàn thành luận văn theo yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và ý kiến đóng góp của Hội đồng chấm thi tốt nghiệp khóa ngày … tháng … năm 2010.

TP. Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2010 Giáo viên hướng dẫn

ThS. Phùng Võ Cẩm Hồng

BSTY. Đặng Thị Xuân Thiệp

ii

CẢM TẠ

Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành đến: Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho em trong quãng thời gian theo học tại trường.

Ban chủ nhiệm khoa Chăn nuôi thú y cùng các thầy cô trong và ngoài trường đã luôn tận tâm giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho chúng em.

ThS. Phùng Võ Cẩm Hồng và BSTY. Đặng Thị Xuân Thiệp đã tận tình trực tiếp hướng dẫn, theo sát và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện.

TS. Võ Thị Trà An đã hết lòng chỉ bảo, hướng dẫn để em có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp.

Các thầy cô và các anh chị phụ trách phòng thí nghiệm Hóa Lý thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường trường Đại học Nông Lâm đã hỗ trợ, giúp đỡ em trong thời gian thực tập.

Toàn thể các bạn sinh viên lớp Dược Thú Y 31 đã gắn bó và động viên mình trong những ngày tháng học tập cùng nhau.

Thương gửi về ba mẹ và gia đình - nguồn động viên, an ủi và nâng đỡ của cuộc đời con, lòng thành kính yêu thương và tri ân mãi mãi.

Tháng 7 năm 2010

Nguyễn Thị Minh Nhung

iii

TÓM TẮT

Đề tài “Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao trong phân tích proline và xây dựng đường chuẩn ampicillin và tetracycline” được tiến hành từ tháng 3 năm 2010 đến tháng 7 năm 2010 tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường trường Đại học Nông Lâm TP. HCM, với mục đích đánh giá hiệu quả của kỹ thuật HPLC trong phân tích hàm lượng acid amin proline trong mẫu lá cây và xây dựng phương trình đường chuẩn hai loại kháng sinh ampicillin và tetracycline.

Bằng phương pháp HPLC với các điều kiện hiện tại ở Viện, chúng tôi đã phân tích hàm lượng proline trong mẫu lá cây. Đồng thời, chúng tôi cũng đã xây dựng phương trình đường chuẩn của hai loại kháng sinh ampicillin và tetracycline.

Kết quả phân tích 10 mẫu lá cây, nhận thấy hàm lượng của proline trong lá biến thiên từ 1,22 μg/g đến 2,62 μg/g với giới hạn phát hiện của phương pháp LOD = 0,02 μg/g, cho thấy khả năng phát hiện rất cao. Hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích proline là 81,92% nằm trong khoảng cho phép theo quy định của Cục Bảo vệ thực vật thuộc Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn.

Các phương trình đường chuẩn đã xây dựng được khá tốt, có thể áp dụng trong thực tế phân tích: Phương trình đường chuẩn proline: y = 63,70x + 15,24 với hệ số tương quan tuyến tính khá tốt R2 = 0,964; Phương trình đường chuẩn ampicillin: y = 1,996x + 0,119 với hệ số tương quan tuyến tính rất tốt R2 = 1; Phương trình đường chuẩn tetracycline: y = 68,32x – 103,1 với hệ số tương quan tuyến tính tốt R2 = 0,999.

iv

ABSTRACT

"Application of high performance liquid chromatography in proline analysis and the building standard curve of ampicillin and tetracycline", a scientific research study title, was carried out from March to July 2010 at Research Institute for Biotechnology and Environment (RIBE), Nong Lam University, Ho Chi Minh City. The aim of the study was to appriciate the effect of high performance liquid chromatography (HPLC) in proline analysis in leaves and the building of ampicillin and tetracycline standard curve.

By HPLC method under current conditions at RIBE, we have built the standard way of proline, determined recovery efficiency and quantify proline content in leaves. Simultaneously, we have also built ampicillin and tetracycline standard curve.

The analyzed results have been recorded: proline content in leaves samples varies from 1,22 μg/g to 2,62 μg/g with the limit of detection LOD = 0,02 μg/g.

Recovery efficiency of proline is 81,92 % , which can be permitted under the provisions of the Plant Protection Department, Ministry of Agriculture and Rural Development.

The equation has built a standard way: Proline: y = 63,70 x + 15,24; Correlation Cofficient R2 = 0,964 Ampicillin: y = 1,996 x + 0,119; R2 = 1 Tetracycline: y = 68,32 x – 103,1; R2 = 0,999 The results showed that the quantitative ability of HPLC was very positive.

In fact, HPLC can be practically applied in the analysis of compounds.

v

MỤC LỤC TRANG Trang tựa ...................................................................................................................... i Phiếu xác nhận của giáo viên hướng dẫn ....................................................................ii Cảm tạ ....................................................................................................................... iii Tóm tắt ...................................................................................................................... iv Abstract ....................................................................................................................... v Mục lục....................................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... ix Danh sách các hình...................................................................................................... x Danh sách các bảng ...................................................................................................xii Danh sách các sơ đồ, công thức .............................................................................. xiii Chương 1 MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2 Mục đích................................................................................................................ 2 1.3 Yêu cầu.................................................................................................................. 2 Chương 2 TỔNG QUAN .......................................................................................... 3 2.1 Giới thiệu về phương pháp HPLC ........................................................................ 3 2.1.1 Lịch sử ................................................................................................................ 3 2.1.2 Phân loại HPLC.................................................................................................. 4 2.1.3 Nguyên tắc ......................................................................................................... 4

vi

2.1.4 Cấu tạo của một hệ thống HPLC ....................................................................... 6 2.1.5 Ứng dụng của HPLC .......................................................................................... 9 2.2 Sử dụng HPLC trong phân tích một số hoạt chất ............................................... 11 2.2.1 Proline .............................................................................................................. 11 2.2.2 Ampicillin ........................................................................................................ 12 2.2.3 Tetracycline ...................................................................................................... 16 2.3 Một số nghiên cứu trước về việc phân tích HPLC tại Việt Nam ....................... 20 Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 22 3.1 Thời gian và địa điểm.......................................................................................... 22 3.1.1 Địa điểm ........................................................................................................... 22 3.1.2 Thời gian .......................................................................................................... 22 3.2 Nội dung .............................................................................................................. 22 3.3 Phương pháp........................................................................................................ 22 3.3.1 Phân tích proline trong mẫu lá cây................................................................... 22 3.3.1.1 Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................ 22 3.3.1.2 Hóa chất ........................................................................................................ 23 3.3.1.3 Quy trình thực hiện ....................................................................................... 23 3.3.2 Xây dựng phương trình đường chuẩn ampicillin ............................................. 27 3.3.2.1 Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................ 27 3.3.2.2 Hóa chất ........................................................................................................ 27 3.3.2.3 Quy trình thực hiện ....................................................................................... 27 3.3.3 Xây dựng phương trình đường chuẩn tetracycline ......................................... 28 3.3.3.1 Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................ 28

vii

3.3.3.2 Hóa chất ........................................................................................................ 28 3.3.3.3 Quy trình thực hiện ....................................................................................... 28 3.4 Các chỉ tiêu theo dõi ............................................................................................ 29 3.4.1 Phương trình đường chuẩn của proline ............................................................ 29 3.4.2 Hàm lượng proline trong mẫu lá cây ............................................................... 29 3.4.3 Hiệu suất thu hồi R của quy trình định lượng proline ..................................... 30 3.4.4 Giới hạn phát hiện của quy trình phân tích proline.......................................... 30 3.4.5 Phương trình đường chuẩn của ampicillin ....................................................... 30 3.4.6 Phương trình đường chuẩn của tetracycline..................................................... 30 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 31 4.1 Phương trình đường chuẩn của proline ............................................................... 31 4.2 Hàm lượng proline trong mẫu lá cây .................................................................. 33 4.3 Hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích proline trong mẫu lá cây ................... 36 4.4 Giới hạn phát hiện của phương pháp (LOD) ...................................................... 37 4.5 Phương trình đường chuẩn của ampicillin .......................................................... 38 4.6 Phương trình đường chuẩn của tetracycline........................................................ 39 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 43 5.1 Kết luận ............................................................................................................... 43 5.2 Đề nghị ................................................................................................................ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 45 DANH SÁCH PHỤ LỤC ........................................................................................ 48

viii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt

Chữ tiếng Anh

ACN

Acetonitrile

GC

Gas Chromatography

Sắc ký khí

HPTLC

High Performance Thin Layer

Sắc ký bản mỏng hiệu

Chromatography

năng cao

Inductively Coupled Plasma Atomic

Phổ hấp thụ, phát xạ

Absorption Spectroscopy

nguyên tử

Liqid Chromatography/ Mass

Sắc ký lỏng ghép phổ khối

ICP - AAS

LC/MS

Tạm dịch

Spectrometry MS

Mass Spectrometry

phổ khối

ppb

part per billion

phần tỷ

ppm

part per million

phần triệu

ppt

part per trillion

phần nghìn tỷ

ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH

TRANG

Hình 2.1 Nguyên tắc sắc ký ........................................................................................ 5 Hình 2.2 Quá trình sắc ký ........................................................................................... 5 Hình 2.3 Tương tác xảy ra trong cột ........................................................................... 6 Hình 2.4 Quá trình tách các chất trong cột sắc ký ...................................................... 6 Hình 2.5 Mô hình hệ thống HPLC .............................................................................. 7 Hình 2.6 Van bơm mẫu bằng tay ................................................................................ 7 Hình 2.7 Ứng dụng của HPLC .................................................................................. 10 Hình 2.8 Công thức hóa học của proline................................................................... 11 Hình 2.9 Tạo dẫn xuất acid amin - PITC .................................................................. 12 Hình 2.10 Công thức hóa học của ampicillin............................................................ 12 Hình 2.11 6 - aminopenicillic acid ............................................................................ 13 Hình 2.12 Cơ chế kháng khuẩn của ampicillin ......................................................... 14 Hình 2.13 Phổ kháng khuẩn của các penicillin ......................................................... 15 Hình 2.14 Công thức hóa học của tetracycline ......................................................... 16 Hình 2.15 Vị trí tác động của kháng sinh ức chế tổng hợp protein ......................... 18 Hình 3.1 Hệ thống HPLC .......................................................................................... 23 Hình 3.2 Dãy chuẩn định mức ampicillin ................................................................. 27 Hình 4.1 Sắc ký đồ của proline chuẩn 10 mM ở thể tích 2 µl .................................. 31 Hình 4.2 Đường chuẩn proline .................................................................................. 32

x

Hình 4.3 Sắc ký đồ của mẫu lá M4 ........................................................................... 34 Hình 4.4 Sắc ký đồ của mẫu M4 có thêm chuẩn....................................................... 34 Hình 4.5 Sắc ký đồ của chuẩn ampicillin 50 ppm .................................................... 38 Hình 4.6 Đường chuẩn ampicillin ............................................................................. 39 Hình 4.7 Sắc ký đồ của chuẩn tetracycline 40 ppm .................................................. 40 Hình 4.8 Đường chuẩn tetracycline .......................................................................... 41

xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG

TRANG

Bảng 2.1 Các loại đầu dò dùng cho HPLC ................................................................. 8 Bảng 3.1 Chương trình gradient trong phân tích proline .......................................... 25 Bảng 4.1 Thời gian lưu và diện tích peak chuẩn proline ở các thể tích .................... 32 Bảng 4.2 Kết quả hàm lượng proline trong mẫu lá cây ............................................ 35 Bảng 4.3 Thời gian lưu và diện tích các mẫu thêm chuẩn ........................................ 36 Bảng 4.4 Hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích proline ..................................... 36 Bảng 4.5 Thời gian lưu và diện tích các nồng độ chuẩn ampicillin.......................... 38 Bảng 4.6 Thời gian lưu và diện tích các nồng độ chuẩn tetracycline ...................... 40

xii

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ CÔNG THỨC

SƠ ĐỒ, CÔNG THỨC

TRANG

Sơ đồ 2.1 Dược động học của nhóm tetracycline ..................................................... 18 Sơ đồ 3.1 Quy trình định phân tích proline ............................................................... 26 Công thức 3.1 Hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích proline ............................. 29 Công thức 3.2 Hàm lượng proline trong mẫu lá cây................................................. 30

xiii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1Đặt vấn đề Trong đời sống xã hội ở thời đại công nghệ hiện nay, việc kiểm soát tình hình chất lượng hàng hóa như hàm lượng các hợp chất trong thực phẩm (acid amin, protein, lipid…), dược phẩm, thức ăn chăn nuôi thú y, kiểm tra tình trạng ô nhiễm môi trường, tồn dư hóa chất độc hại, tồn dư các loại kháng sinh (ampicillin, tetracycline…) ... đòi hỏi phải có sự chính xác. Vì thế, việc phát triển và mở rộng hệ thống kiểm định với những kỹ thuật tiên tiến, hiện đại để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao về chất lượng cuộc sống và sức khỏe của con người là một trong những yêu cầu cấp thiết của nông nghiệp cũng như công nghiệp và y tế. Một trong các phương pháp kiểm định có thể kể đến là phương pháp dùng kỹ thuật sắc ký, mà cụ thể là sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography – HPLC). Song song với sự phát triển của các ngành khoa học kỹ thuật, kỹ thuật phân tích HPLC với thiết bị và đầu dò hiện đại có khả năng nhận biết các chất thông qua các tín hiệu điện, cho hiệu quả cao trong việc định tính và định lượng các chất trong hỗn hợp nhiều cấu tử, ngày càng đóng vai trò to lớn và được ứng dụng rộng rãi hơn. Để có thể ứng dụng được HPLC trong phân tích các hoạt chất, việc xây dựng quy trình, thử nghiệm và tối ưu hóa các quy trình trong điều kiện nhất định của các phòng thí nghiệm là một nhiệm vụ của những người làm công tác kiểm nghiệm, trong đó việc xây dựng đường chuẩn là một bước khởi đầu quan trọng giúp nhận diện tín hiệu về chất phân tích. Do đó, việc học tập và tìm hiểu về HPLC là một nhu cầu tất yếu đối với những người đã, đang và sẽ làm công tác này. Được sự đồng ý của khoa Chăn nuôi Thú y và Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường trường ĐH

1

Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của ThS. Phùng Võ Cẩm Hồng và BSTY. Đặng Thị Xuân Thiệp, chúng tôi thực hiện đề tài “Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao trong phân tích proline và xây dựng đường chuẩn ampicillin và tetracycline”.

1.2 Mục đích Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật HPLC trong phân tích hàm lượng acid amin proline trong mẫu lá cây và xây dựng phương trình đường chuẩn hai loại kháng sinh ampicillin và tetracycline.

1.3 Yêu cầu Đánh giá một số chỉ tiêu trong phân tích hàm lượng proline trong mẫu lá cây, trong xây dựng phương trình đường chuẩn ampicillin và tetracycline, từ đó nêu lên được ý nghĩa của việc thực hiện các phân tích này và vai trò của HPLC trong phân tích.

2

Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu về phương pháp HPLC 2.1.1 Lịch sử Phương pháp phân tích sắc ký được phát minh vào năm 1903 bởi nhà thực vật học người Nga Tsvet khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll. Ông đã tách thành công các hợp chất này từ lá cây bằng cách chiết có sử dụng dung môi và cột nhồi. Từ “chromatography” bắt nguồn từ chữ “chroma” nghĩa là chất màu (tiếng Latinh), vừa là tên của Tsvet trong tiếng Nga, vừa là màu của các sắc tố thực vật ông phân tích vào lúc bấy giờ. Tên này vẫn được tiếp tục sử dụng dù các phương pháp hiện đại không còn liên quan đến màu sắc (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

Năm 1954, Martin và Synge được trao giải Nobel Hóa học cho sự phát minh về sắc ký phân bố lỏng (Hồ Viết Quý, 2006). Kỹ thuật sắc ký phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20. Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc của sắc kí Tsvet có thể được áp dụng theo nhiều cách, từ đó họ cải tiến và chuyển đổi thành nhiều loại sắc ký khác nhau. Đồng thời, kỹ thuật thực hiện sắc ký cũng cải tiến liên tục nhằm phân tích các phân tử khác nhau hay tương tự.

Trước kia sắc ký lỏng cổ điển dùng cột hở có nạp những hạt nhồi để tách chất phân tích ở áp suất thường nhưng hiệu suất tách không cao, độ lặp lại thấp và tốn nhiều thời gian. Về sau người ta nhận thấy kích cỡ hạt nhỏ, khả năng tách rất tuyệt vời, nhưng hạt quá bé lại gây cản trở tốc độ dòng chảy pha động, vì vậy người ta lại mong muốn có một áp suất cao để điều chỉnh cũng như kiểm soát tốc độ dòng dung môi. Năm 1967, Horvath là tác giả đầu tiên đã tạo ra máy HPLC nghiên cứu về nucleotide (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Kỹ thuật mới có tên gọi sắc ký lỏng

3

cao áp – HPLC (High Performance Liquid Chromatography hay High Pressure Liquid Chromatography). Chữ HPLC xuất phát từ sự kiện áp suất cao được dùng để tạo ra dòng yêu cầu cho sắc ký lỏng trong cột nhồi.

Ngày nay với việc cải tiến các loại cột tách (thay đổi kích thước hình học, bản chất pha tĩnh), sử dụng các loại đầu dò mới... HPLC đã trở thành một phương pháp tách hữu hiệu được ứng dụng đa dạng trong các lĩnh vực như sinh học, dược phẩm, môi trường… Với độ chính xác cao và đặc hiệu, nó có thể tách nhanh những hỗn hợp phức tạp thành những thành phần riêng lẻ, có thể xác định các hợp chất ở lượng vết ở nồng độ ppt một cách dễ dàng và có thể thu hồi lại mẫu vì hầu hết mẫu không bị phá hủy bởi đầu dò.

2.1.2 Phân loại HPLC (Trần Tử An, 2005): có 4 loại cơ bản: Sắc ký phân bố (Partition chromatography): pha tĩnh là một lớp mỏng hữu cơ phủ lên bề mặt các tiểu phân chất mang silica hoặc các chất liệu khác. Ứng dụng rất nhiều trong công tác kiểm nghiệm thuốc.

Sắc ký hấp phụ (Liquid - solid chromatography): là kỹ thuật phát triển sớm nhất và được dùng phổ biến. Trong kỹ thuật này, chất phân tích bị giữ trên bề mặt pha tĩnh (chất hấp phụ như silicagel…) và bị dung môi đẩy ra (chất phản hấp phụ là các dung môi ít hoặc không phân cực).

Sắc ký trao đổi ion (Ion - exchange chromatography): ứng dụng phân tách các ion hòa tan trong nước, có phân tử lượng nhỏ hơn 1500. Pha tĩnh là các hợp chất hữu cơ cao phân tử chứa các nhóm chức có khả năng trao đổi.

Sắc ký loại cỡ (Size - exclusion chromatography): dùng trong phân tách các chất có phân tử lượng lớn hơn 2000. Pha tĩnh là các hạt silicagel hoặc polymer.

2.1.3 Nguyên tắc HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động dưới áp suất cao (Trần Tử An, 2005).

4

Hình 2.1 Nguyên tắc sắc ký Quá trình tách sắc ký thường gồm 3 giai đoạn chính: (1) Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh. (2) Cho pha động chạy qua pha tĩnh. (3) Phát hiện các chất được tách.

Hình 2.2 Quá trình sắc ký (Levin, 2002)

Dưới áp suất cao, các thành phần phân tích đã được hòa tan trong dung môi sẽ bị kéo đi theo sự di chuyển của pha động qua cột sắc ký với các tốc độ khác nhau và được tách khỏi nhau theo thời gian phụ thuộc vào sự tương tác giữa chất tan với pha động và pha tĩnh. Chất nào có lực tương tác lớn hơn sẽ bị giữ lại lâu hơn trên cột và bị rửa giải chậm hơn. Tín hiệu về từng chất được phát hiện bởi đầu dò đặt sau cột tách và hiện diện dưới dạng các peak nhờ bộ phận xử lý và ghi kết quả.

5

Hình 2.3 Tương tác xảy ra trong cột Sự lưu giữ được tạo thành bởi tổng 3 lực thành phần. F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo nó đi ra khỏi cột. Các chất khác nhau thì F1 và F2 sẽ khác nhau. Chất được rửa giải ra khỏi cột trước tiên khi có lực lưu giữ nhỏ nhất, và ngược lại. Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách hẳn nhau khi ra khỏi cột (Phạm Luân, 2006).

Hình 2.4 Quá trình tách các chất trong cột sắc ký (Phạm Luân, 2006)

2.1.4 Cấu tạo của một hệ thống HPLC Bình chứa dung môi pha động: để việc phân tích định lượng được chính xác, dung môi cần có độ sạch cao và chuyên dụng (HPLC grade). Trong HPLC, pha động có thể là dung môi đơn như: methanol, axetonitril, n-hexan, nước hoặc cũng

6

có thể là hỗn hợp của các dung môi theo thành phần thể tích nhất định. Ví dụ: MeOH : H2O (10 : 90).

Hình 2.5 Mô hình hệ thống HPLC (Phạm Luân, 2006) Bơm tăng áp: đẩy pha động qua cột, làm tăng và ổn định vận tốc dòng pha động trong quá trình sắc kí, rửa giải chất tan ra khỏi cột. Bơm này phải trơ với hóa chất, điều chỉnh được khoảng áp suất rộng (0 – 400 bar) (1bar = 0,987 at).

Gradient: dùng chương trình Gradient với tỉ lệ pha động được thay đổi trong quá trình phân tích (Hà Duyên Tư, 2009).

Bộ phận tiêm mẫu: tiêm mẫu bằng bơm tiêm tiện lợi và đơn giản nhưng ở áp suất cao việc định lượng sẽ không chính xác.

Hình 2.6 Van bơm mẫu bằng tay.

7

Cột sắc ký: là nơi chứa pha tĩnh và nơi diễn ra quá trình tách sắc ký. Hiệu quả tách sắc ký phụ thuộc chủ yếu vào cột, do đó tùy thuộc mức độ sắc ký và chất phân tích để lựa chọn cột cho phù hợp.

Một số loại cột thường gặp: column Gemini 5u C18, Picotag column 3.9*150, HyperClone 3u BDS C18, Nucleosil C18, Chromolith Performance (RP 18, RP 8) (Võ Thị Bạch Huệ và ctv, 2008). Đầu dò (detector): phát hiện và đo nồng độ chất phân tích theo một tính chất hóa học, hóa lý hay vật lý nào đó của chất phân tích hay dạng hợp chất của nó. Đầu dò phải có khoảng động học tuyến tính rộng, là khoảng đo của một chất mà tín hiệu đáp ứng của đầu dò tỉ lệ thuận với hàm lượng chất. Khi nối với các đầu dò, phương pháp cho phép định tính dựa vào thời gian lưu và định lượng dựa vào chiều cao hoặc diện tích peak (Trần Bích Lam, 2006).

Bảng 2.1 Các loại đầu dò dùng cho HPLC (Phạm Luân, 2006) Số

Tính chất để phát hiện

Tên đầu dò

1

Sự phát xạ của nguyên tử

Đo phổ phát xạ nguyên tử (ICP-AS)

2

Hấp thụ quang UV-VIS

Đo phổ UV, hay UV-VIS

3

Huỳnh quang

Đo phổ huỳnh quang

4

Độ dẫn điện, dòng, thế…

Đo dòng (cực phổ)điện trở và đo thế

5

Chỉ số chiết suất

Đo chiết suất

6

Độ dẫn nhiệt

Đo độ dẫn nhiệt

7

Khối lượng ion chất

Khối phổ (MS)

Phổ biến nhất là UV-VIS vì độ chọn lọc cao, sau đó tới đầu dò huỳnh quang, điện hóa và chiết xuất với độ nhạy cao hơn nhiều so với UV-VIS. Đầu dò phổ khối được ứng dụng rộng trong những phân tích kiểm nghiệm phức tạp yêu cầu về giới hạn phân tích thấp mà các loại phân tích khác không thực hiện được (Chu Phạm Ngọc Sơn, 2008).

8

Đầu dò UV - VIS: tín hiệu về sự thay đổi cường độ ánh sáng khi đi qua cốc đo chứa dung dịch phân tích được đo bởi diod quang, sau đó được khuếch đại và truyền tới máy ghi nhận, máy tính tích phân hay máy vi tính. Đầu dò UV - Vis được sử dụng dễ dàng với độ tin cậy cao, giá thành không quá đắt, sử dụng được trong trường hợp chạy gradient, không phá hủy mẫu thử, tương đối nhạy và đặc hiệu. Tuy vậy, UV - Vis lại đáp ứng kém đối với các chất không hấp thu UV tốt. Khắc phục hạn chế của đầu dò này (không có nhiều các chất có khả năng hấp thu tia tử ngoại) bằng cách tạo các dẫn xuất của các hợp chất để chúng trở thành các chất hấp thu tử ngoại (Võ Thị Bạch Huệ và ctv, 2008).

Bộ phận xử lý và ghi tín hiệu: phải thật chính xác và đa năng, có thể đo được thời gian lưu, tự động hóa trong việc phát hiện và đo diện tích peak, điều chỉnh đường nền, có khả năng phân tích định tính thành phần của hỗn hợp. Ngoài ra, phải xác định được nồng độ mẫu và có khả năng giữ lại các dữ kiện trong bộ nhớ để có thể lặp lại tính toán kết quả mà không cần đưa mẫu thử qua hệ sắc ký nhiều lần.

Hiện nay, các hệ thống sắc ký được kết nối với hệ thống máy vi tính cho phép tính toán một cách nhanh chóng và chính xác. Các peak trên sắc ký đồ biểu thị cho sự đáp ứng với các thành phần khi được rửa giải ra khỏi cột sắc ký. Chiều cao hay diện tích peak của từng thành phần có thể dùng để xác định nồng độ khi đối chiếu với peak thu được từ việc tiêm mẫu chất chuẩn (Võ Thị Bạch Huệ và ctv, 2008).

Ngoài ra còn có bộ phận khử khí để loại khí ngay trong bình chứa dung môi hoặc trên dòng chảy của pha động trước khi dung môi được đưa vào bơm, và một tiền cột đặt giữa bộ phận tiêm mẫu và cột tách để loại bỏ tạp trong mẫu cũng như trong pha động; 2.1.5 Ứng dụng của HPLC HPLC tỏ ra ưu việt hơn so với GC khi phân tích các hợp chất hữu cơ. Các thành phần của thực phẩm phần lớn là các hợp chất bay hơi và không bền nhiệt, có thể tiến hành sắc ký mà không cần phân hủy hoặc chuyển thành các dẫn xuất dễ bay

9

hơi, do đó khi phân tích sẽ được hòa tan vào dung môi thích hợp và được thực hiện ở nhiệt độ phòng. Phần lớn phân tích mẫu thực phẩm dựa trên cơ sở sắc ký phân bố và thời gian hoàn tất trong vòng 30 phút. Sự thông dụng của HPLC nhờ vào khả năng phân tích được trên nhiều nhóm đối tượng, hiệu quả tách và tính chọn lọc của phương pháp rất cao, thể tích mẫu phân tích chỉ khoảng 1 – 100 μl (Trần Bích Lam, 2006).

Khoảng 10 năm qua và cho đến nay, kỹ thuật HPLC đã được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều ngành khoa học kĩ thuật, công nghiệp, nông nghiệp và y dược.

Có thể khái quát theo hai hướng sau: (1) Tách và xác định các chất vô cơ: các cation (Mg2+, Na+, Ca2+…), các anion (PO43+, SO42-, BrO3-, NO2-, F-, Cl-…). (2) Tách và xác định các chất hữu cơ: hỗn hợp hydrocacbua của dầu mỏ và các sản phẩm hóa dầu; các acid, bazơ hữu cơ, họ phenol, amine, amino acid và các sản phẩm dẫn xuất; các hóa chất bảo vệ thực vật; các hợp chất màu, phẩm nhuộm; các protein, lipid, peptid; các hợp chất cao phân tử và monomer của nó; dược phẩm, dược liệu…

(Phạm Luân, 2006).

Hình 2.7 Ứng dụng của HPLC (Levin, 2002)

10

2.2 Sử dụng HPLC trong phân tích một số hoạt chất 2.2.1 Proline (S)-Pyrrolidine-2-carboxylic acid (C5H9NO2, M = 115,13).

Hình 2.8 Công thức hóa học của proline (Sigma Aldrich Co, 2010) Proline (Pro, P) được phát hiện bởi Hermamn Emil Fischer vào năm 1904, là một loại α - amino acid, một trong 20 amino acid mã hóa DNA. Proline là amino acid duy nhất thiếu proton amid (- NH2) nên chính xác phải được gọi là một imino acid. Proline do glutamate tạo thành và proline là tiền chất của hydroxyprolin. Cả hai chất là những chất chính trong các collagen của bắp thịt kể cả da, gan, phổi, tim và xương. Thiếu chất nầy có thể bị hư thận và óc ngu đần (Nguyễn Thế Thức, 2005).

Trong cây trồng, proline được tổng hợp từ L - glutamic acid. Lượng proline trong cây vào thời kỳ nhiệt độ cao đóng vai trò rất quan trọng, phụ thuộc vào hệ thống tín hiệu trong cây và khả năng sản sinh của cây (Alia A. và ctv, 2001). Việc tích lũy proline tự do dường như là phương thức phổ biến đối với stress ở thực vật bậc cao (Gzik, 1996).

Trong phân tích proline bằng kỹ thuật HPLC, mẫu thực vật được thủy phân bằng dung dịch HCl 6 N, tiếp đó được tạo dẫn xuất bởi dung dịch tạo dẫn xuất. Sau cùng mẫu được bơm vào máy HPLC để định lượng acid amin proline có trong mẫu.

Nguyên lý của việc tạo dẫn xuất: theo Edman (1950), Edman là một phản ứng hóa học trong đó các tiểu phần acid amin được giải phóng lần lượt từ đầu N của chuỗi polypeptide. Acid amin ở tận cùng đầu N của một chuỗi polypeptide có thể được cải biến khi xử lý với phenylisothyocyanate (PITC) dẫn đến sự thay đổi ở gốc α - amino. Acid amin được cải biến này sau đó được cắt rời khỏi chuỗi polypeptide

11

khi xử lý với acid trong điều kiện không làm phá hủy phần còn lại của chuỗi polypeptide. Việc xác định trình tự các acid amin được tiến hành dựa trên thứ tự hồi lưu đặc trưng của từng acid amin được cắt khỏi chuỗi bằng kỹ thuật HPLC.

Hình 2.9 Tạo dẫn xuất acid amin - PITC 2.2.2 Ampicillin D-(-)-α-Aminobenzylpenicillin (C16H19N3O4S, M: 349,40).

Hình 2.10 Công thức hóa học của ampicillin (Sigma Aldrich Co, 2010) Ampicillin là một kháng sinh bán tổng hợp thuộc họ β – lactamines, nhóm penicillin type A, độc tính thấp (trừ một số cá thể có cơ địa dị ứng), phổ kháng khuẩn rộng hơn nhiều so với các penicillin tự nhiên. Thuốc không bị môi trường acid phá hủy, phân bố rộng khắp trong cơ thể. Nhờ những ưu điểm này nên ampicillin được ứng dụng rộng rãi trong nhân y và thú y.

12

Nguồn gốc và cấu tạo hóa học Cấu tạo phân tử của penicillin gồm 1 vòng β – lactam (azetidin – 2 – on) liên kết với dị vòng thiazolidin. Vòng β – lactam là cấu trúc chính của họ β – lactamines, thay đổi cấu trúc của vòng này sẽ làm mất hoạt tính kháng khuẩn của kháng sinh.

Năm 1929, Flemming ly trích được penicillin G từ môi trường nuôi cấy Penicillium notatum, đến năm 1949, chất này được đưa vào sử dụng trong lâm sàng.

Năm 1957, người ta tách được 6 – APA (acid 6 - amino penicillanic), từ đó một loạt các penicillin bán tổng hợp ra đời. Các penicillin được coi là các amid của 6 – APA.

Hình 2.11 6 – aminopenicillic acid (Doyle và ctv, 1960) Ampicillin có được nhờ sự thay thế trên carbon α của chức carboxamid ở penicillin G một nhóm amin. Sự thay đổi làm mở rộng hoạt phổ trên các vi khuẩn G- và trên những vi khuẩn mà các penicillin kinh điển tác dụng yếu (Huỳnh Thị Ngọc Phương, 2009).

Lý hóa tính và dược động học Ampicillin có dạng bột trắng, không mùi khi tinh khiết, có tính acid. Dạng muối Na dễ tan trong nước (50 mg/ml), dạng bazơ tan tốt trong NH4OH 1 M. Trong môi trường acid, hiệu quả hút điện tử của nhóm NH2 giúp vòng β – lactam được bảo vệ an toàn (Huỳnh Thị Ngọc Phương, 2009).

Ampicillin có thể được cấp qua đường tiêm (tĩnh mạch, bắp thịt) và uống. Sự hấp thu qua đường tiêu hóa kém hơn amoxicillin (< 40 %) và bị cản trở bởi thức ăn.

13

Thuốc đạt nồng độ cao trong huyết thanh sau khi uống 2 giờ, thời gian bán thải khoảng 60 – 90 phút. Nếu tiêm với nồng độ cao cho đại gia súc, sau 3 giờ đạt được nồng độ rất cao trong mật, có thể gấp 40 lần so với trong huyết thanh, trong khi đó nồng độ thuốc trong các tế bào và các cơ quan khác lại thấp. Ampicillin không qua được dịch não tủy, bao khớp, các xoang và nhau thai (trừ khi các tổ chức này bị viêm). Thuốc duy trì nồng độ hữu hiệu khoảng 5 – 6 giờ, thải trừ chủ yếu qua thận (80 %) ra ngoài dưới dạng còn hoạt lực (Bùi Thị Tho và ctv, 2005).

Hoạt tính dược lực và phổ khuẩn Sự kháng khuẩn của ampicillin phụ thuộc sự nguyên vẹn của vòng β- lactam.

Enzyme transpeptidase tạo phức nhầm với β- lactam (do cấu trúc tương tự với chuỗi peptide D-Ala4-D-Ala5 của vi khuẩn). Phức này bền vững không hồi phục, cản trở phản ứng xuyên mạch peptide của vi khuẩn, làm mất sự tạo vỏ và những chuỗi peptidoglycan trở nên dị dạng. Men autolysin được giải phóng sẽ tham gia thủy phân peptidoglycan, giết chết vi khuẩn (Huỳnh Thị Ngọc Phương, 2009).

Hình 2.12 Cơ chế kháng khuẩn của ampicillin (Huỳnh Thị Ngọc Phương, 2009) Ampicillin là thuốc có phổ tác dụng khá rộng trên invivo và invitro với một số lớn vi khuẩn G-, G+ như: Staphylococcus aureus (không kháng β-lactamase), Streptococcus,

Corynebacterium,

Clostridium,

E.coli,

Klebsiella,

Shigella,

14

Salmonella, Proteus, Brucella và Pasteurella, tuy nhiên không có hiệu quả đối với Mycoplasma, Pseudomonas và các chủng Staphylococcus sản sinh penicillinase (Bùi Thị Tho và ctv, 2005).

Hình 2.13 Phổ kháng khuẩn của các penicillin (Nguyễn Như Pho và Võ Thị Trà An, 2001) Ứng dụng trong điều trị các trường hợp nhiễm trùng trên người và các bệnh cho động vật nuôi như: nhiệt thán, uốn ván, dấu son, viêm màng não, viêm phổi, viêm ruột, viêm đường niệu - dục, viêm chi, các bệnh viêm tai, leptospirosis trên động vật cảnh. Khi chữa các bệnh ở đường tiêu hóa tốt nhất nên cho uống.

Liều lượng: uống 10 mg/kg thể trọng; tiêm 7 mg/kg, 2 lần/ngày.

Tránh kết hợp ampicillin với macrolide và tetracycline. Không dùng thuốc trong trường hợp mẫn cảm với thuốc (chủ yếu xảy ra trên người). Việc dùng thuốc lâu dài dễ gây rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột của thú, đặc biệt là đối với các loài gặm nhấm.

15

Thời gian ngưng thuốc khuyến cáo Thuốc thải được qua sữa, nên loại bỏ sữa của bầu vú bị viêm. Qua 7 ngày kể từ khi tiêm mũi cuối cùng mới được dùng sữa. Thời gian ngưng thuốc trước khi hạ thịt: 15 ngày đối với thuốc tiêm và 1 ngày đối với thuốc uống (Nguyễn Ngọc Tuân, 2002).

Vấn đề tồn dư kháng sinh ampicilline trong thực phẩm Kết quả phân tích kháng sinh tồn dư trong thịt gà công nghiệp trong nghiên cứu khoa học 1998 – 2001 có 4/5 mẫu gan và 5/7 mẫu thịt phân tích tồn dư ampicillin, nồng độ trung bình 5,2 ppm trong mẫu gan và 45,7 ppm trong mẫu thịt (trích dẫn của Dương Thanh Liêm, 2009). Xét nghiệm các mẫu thịt được lấy trực tiếp tại các chợ cho thấy có 26 loại kháng sinh được phát hiện, riêng ampicillin chiếm 7,24 %. Nguồn tin từ Lê Thúy Tươi trong báo Sức khỏe và Đời sống số ra ngày 9/12/2007 cho biết, Viện khoa học nông nghiệp Miền Nam đã khảo sát 26 nghìn con gà của 23 hộ chăn nuôi, kết quả có 87,5% mẫu tồn dư ampicillin. Như vậy, tỉ lệ ampicillin tồn dư trong sản phẩm động vật khá cao và đó vẫn là mối nguy hại đáng kể đối với sức khỏe và đời sống con người. Việc đưa một lượng kháng sinh vào cơ thể, ngoài tác dụng gây hại lại còn thêm nguy cơ kháng thuốc sau này.

2.2.3 Tetracycline 2-(amino-hydroxy-methylidene)-4-dimethylamino-6,10,11,12atetrahydroxy6-methyl-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-1,3,12-trione.

C22H24N2O8; M: 444,435

Hình 2.14 Công thức hóa học của tetracycline (Klajn và ctv, 2007)

16

Nhóm kháng sinh tetracycline được dùng phổ biến từ rất lâu do phổ kháng khuẩn rộng và những ưu điểm về dược động học. Kháng sinh này có khuynh hướng được dùng như kháng sinh hàng đầu trong điều trị bệnh cho bò, heo và một số chỉ định đặc biệt cho chó mèo. Sự lan tràn các chủng vi khuẩn đề kháng thu nhận với tetracycline đang giới hạn việc sử dụng kháng sinh này trong lâm sàng.

Nguồn gốc và cấu tạo hóa học Tên gọi tetracycline xuất phát từ cấu tạo là các dẫn chất (-ine) của 4 (tetra-) vòng (-cycl-) hydrocarbon. Các kháng sinh này đều có cấu trúc 4 vòng 6 cạnh (sườn naphthacen, tetracene). Năm 1948, tiến sĩ B. Duggar ly trích được chlortetracycline từ nấm Streptomyces aureofaciens nên còn gọi là aureomycin. Năm 1950, oxytetracycline được ly trích từ sản phẩm lên men Streptomyces rimosus bởi A.C. Finley và cộng sự. Tiếp đó, tetracycline (1952), doxycycline (1966) là các kháng sinh bán tổng hợp ra đời. Các tetracycline được nhận biết qua tiếp vị ngữ cycline ở tên hoạt chất của chúng (Võ Thị Trà An, 2007).

Lý hóa tính và dược động học Tetracycline dạng bazơ tinh thể lưỡng tính, kém tan trong nước (1 : 2500).

Dạng HCl tinh thể màu vàng, không mùi, dễ tan trong nước (1 : 10), pha thành dung dịch dễ biến màu vàng sậm, bị thủy phân và ngưng kết thành dạng bazơ. Cả hai dạng đều không tan trong dung môi hữu cơ, dễ hòa tan trong acid hay kiềm (Võ Văn Ninh, 2001). Tetracycline có thể tạo phức chelat kém hấp thu với các ion kim loại hóa trị (II) và (III). Ở điều kiện nóng ẩm và có ánh sáng, thuốc bị phân hủy tạo thành anhydrotetracycline, 4 - epitetracycline và anhydro 4 - epitetracycline gây độc tính cao trên thận (Huỳnh Thị Ngọc Phương, 2009).

Tetracycline có thể dùng mọi đường cấp nhưng hấp thu qua đường tiêu hóa tốt hơn, nhất là môi trường acid dạ dày. Việc hấp thu tetracycline giảm nhất khi thức ăn có chứa Ca, Mg, Fe, Zn. Tetracycline tích lũy trong hệ võng mạc nội mô, lách, tủy xương, răng, qua được nhau thai, tuyến sữa, các mô và dịch cơ thể nhưng kém vào dịch não tủy. Kháng sinh này đi qua chu trình gan ruột dưới dạng không

17

chuyển hóa và được bài thải 40 % qua phân và 60 % qua nước tiểu (Võ Thị Trà An, 2007).

Sơ đồ 2.1 Dược động học của nhóm tetracycline (Võ Thị Trà An, 2007) Hoạt tính dược lực và phổ khuẩn

Hình 2.15 Vị trí tác dụng của kháng sinh ức chế tổng hợp protein

18

(1) Ức chế tạo cầu peptide (chloramphenicol). (2) Ngăn cản chuyển động chuyển đoạn của ribosom theo mARN (erythromicin). (3) Ngăn cản sự gắn kết của tARN vào phức hợp ribosom - mARN (tetracycline). (4) Thay đổi tình trạng 30S mã hóa trên mARN nên đọc nhầm (streptomycin) (Đào Văn Phan, 2009).

Tetracycline là một kháng sinh phổ rộng có tác dụng kìm khuẩn do ức chế quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Cơ chế tác dụng của tetracycline là do khả năng gắn vào và ức chế chức năng ribosom của vi khuẩn, đặc biệt là gắn vào đơn vị 30S của ribosom. Do vậy, tetracycline ngăn cản quá trình gắn aminoacyl - tRNA dẫn đến ức chế quá trình tổng hợp protein. Khi vi khuẩn kháng tetracycline, vị trí gắn tetracycline trên ribosom bị biến đổi. Vì vậy, tetracycline không gắn được vào ribosom của vi khuẩn và mất tác dụng (Bộ Y tế, 2006).

Tetracycline là kháng sinh kìm khuẩn với phổ kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn G+ (staphylococci, streptococci, Bacillus anthracis, Erythropelothrix rhusiopathiae, Listeria monocytogenes, Corynebacteria spp., Rodococcus equi, kể cả vi khuẩn G+ kỵ khí như Clostridium spp., Actinomyces spp.); G- (Pasteurella spp., Enterobacteriaceae, Brucella spp.); vi khuẩn nội bào như Mycoplasma spp., Ricketsia spp., Chlamydia spp., Leptospira spp. Riêng Mycobacterium, Proteus, Pseudomonas đề kháng tự nhiên với các tetracycline. Sự phối hợp với các polymyxin, macrolide, chloramphenicol hay sulphonamide cho tác dụng hiệp đồng (Võ Thị Trà An, 2007). Ngoài ra, tetracycline còn được dùng điều trị viêm loét dạ dày do Helicobacter pylori và có hiệu quả tốt đối với trường hợp nhiễm Toxoplasma (Huỳnh Thị Ngọc Phương, 2009).

Việc sử dụng tetracycline lâu dài có thể dẫn đến rối loạn tiêu hóa (tiêu chảy ở ngựa), ảnh hưởng đến quá trình lên men ở dạ cỏ thú nhai lại, gây bội nhiễm nấm mốc. Sự thành lập phức hợp tetracycline calcium - orthophosphate với xương và răng gây biến đổi màu men răng, làm chậm sự phát triển răng và xương.

Tetracycline còn gây nhạy cảm quang học (nổi mẩn, viêm da).

19

Thời gian ngưng thuốc khuyến cáo (Võ Thị Trà An, 2007): Viên tetracycline 500 mg uống: 12 ngày đối với bê, 5 ngày với cừu.

Bột pha nước uống: 4 ngày đối với heo và gia cầm, 5 ngày đối với bê.

Vấn đề tồn dư kháng sinh tetracycline trong thực phẩm Dương Văn Nhiệm (2005), xác định tồn dư kháng sinh tetracycline bằng phương pháp HPLC trong 290 mẫu thịt lợn trên thị trường Hà Nội có 5,5 % cho kết quả dương tính. Tỷ lệ mẫu dương tính cao trong nghiên cứu này cho thấy nguy cơ ảnh hưởng của tetracyline tồn dư đối với sức khỏe cộng đồng, đặc biệt là nguy cơ dẫn đến hiện tượng khác thuốc của các vi sinh vật gây bệnh. Theo trích dẫn của Dương Thanh Liêm (2009), ở các nước EU, giới hạn tồn dư tối đa của tetracycline trong thịt, gan, thận, mỡ động vật là 50 μg/kg, và trong sữa là 4 μg/kg .

2.3 Một số nghiên cứu trước về việc phân tích HPLC tại Việt Nam. Sử dụng HPLC trong nghiên cứu tình hình sử dụng và dư lượng kháng sinh trong thịt gà tại các cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp của TP. Hồ Chí Minh, Võ Thị Trà An (2001) đã xác định các kháng sinh enrofloxacin, norfloxacin, sulfadimidine và sulfadiazine tồn dư trong thịt gà với hàm lượng trung bình lần lượt là 58,35 μg/kg, 7360 μg/kg, 2039 μg/kg và 3625 μg/kg, vượt quá giới hạn cho phép từ khoảng 2 – 400 lần.

Lê Thị Thiên Hương và ctv (2008) đã tiến hành định lượng acid folic và pyridoxine hydrochloride trong viên nang Feroglobin B12 bằng HPLC. Kết quả hàm lượng trung bình của pyridoxine hydrochloride là 104,6 %; aicd folic 95,8 %; giới hạn định lượng là 20 μg/g dối với pyridoxine hydrochloride và 2 μg/g đối với acid folic.

Hà Diệu Thúy (2009) khi phân tích kháng sinh cycline trong thức ăn chăn nuôi heo và trên heo thịt được giết mổ tại TP. Hồ Chí Minh với HPLC cũng đã cho kết quả các mẫu thức ăn có hàm lượng kháng sinh cycline vượt từ 1,07 đến 5,71 lần

20

giới hạn quy định, các mẫu cám dương tính tetracycline với nồng độ 33,74 ppm, tỷ lệ tồn dư cycline trên thận là 18,1 %, gan 8,57 % và trên thịt 3,81 %.

Qua một số nghiên cứu này, nhận thấy việc sử dụng kỹ thuật HPLC trong thực tế phân tích là khá phổ biến, kết quả đem lại rất tốt với khả năng phát hiện chất phân tích chính xác và đặc hiệu.

21

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm 3.1.1 Thời gian Đề tài được thực hiện từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2010.

3.1.2 Địa điểm Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – trường ĐH Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.

3.2 Nội dung Phân tích proline trong mẫu lá cây và xây dựng phương trình đường chuẩn của hai kháng sinh ampicillin và tetracycline.

3.3. Phương pháp 3.3.1 Phân tích proline trong mẫu lá cây 3.3.1.1 Thiết bị và dụng cụ Hệ thống HPLC 1100 Hawlett Packerd; cân phân tích 4 số Precisa XT 22A; Vortex IKA; bồn đánh siêu âm Power Sonic 510; máy đo pH (Jenway 5310); bình lọc chân không với màng lọc 0,45 µm; ống nhựa thủy phân Teflon 50ml; micropipett các loại (0,5 – 10 µl, 10 – 100 µl, 100 – 1000 µl); đầu tip các loại; bình định mức; pipett định mức; cốc thủy tinh chịu nhiệt; đũa khuấy; kim bơm 50 µl; giấy lọc; màng lọc 0,2 µm Whatman PVDF; bơm tiêm 3cc; lọ thủy tinh vial.

22

Hình 3.1 Hệ thống HPLC (Viện Công nghệ sinh học và môi trường, ĐH Nông Lâm) 3.3.1.2 Hóa chất Proline

chuẩn;

HCl;

ethanol

(EtOH);

Triethylamine

(TEA);

Phenylisothiocyanate (PITC); Sodium acetate trihydrate C2H3NaO2.3(H2O), Na2HPO4 (tinh thể); H3PO4; nước cất 2 lần…

3.3.1.3 Quy trình thực hiện Pha các dung dịch chuẩn, dẫn xuất, pha động (xem phần phụ lục): (1) Dung dịch HCl 6 N; (2) Dung dịch HCl 0,1 N; (3) Dung dịch pha mẫu (Na2HPO4 + H2O) (pH 7,4); (4) Dung dịch tạo dẫn xuất 1 (EtOH + H2O + TEA); (5) Dung dịch tạo dẫn xuất 2 (EtOH + H2O + TEA + PITC); (6) Dung dịch chuẩn proline 10 mM (chuẩn proline dạng bột, pha trong dung dịch HCl 0,1 N); (7) Pha động A (ACN + H2O); (8) Pha động B (C2H3NaO2.3(H2O) + H2O + TEA + ACN) (pH 6,4).

Chuẩn bị đường chuẩn: Hút lần lượt 2 µl, 4 µl, 6 µl dung dịch chuẩn 10 mM cho vào bình quả lê. Tiến hành thổi khí đến khô, sau đó cho vào bình quả lê 20 µl dung dịch tạo dẫn xuất 1. Tiếp tục làm khô mẫu bằng dòng khí N2, sau đó cho vào 30 µl dung dịch tạo dẫn xuất 2. Đậy nắp, lắc 5 giây, để yên trong 20 phút ở nhiệt độ

23

phòng rồi thổi khí N2 cho đến khô. Cho vào tiếp 2 ml dung dịch pha mẫu, vortex 10 – 15 giây, sau đó lọc qua màng Whatman 0,2 µm cho vào lọ thủy tinh nhỏ (vial), trữ ở 2 – 8oC cho đến khi đem phân tích trên máy.

Chuẩn bị mẫu: mỗi mẫu gồm 3 lá được lấy từ cùng một cây, cho vào túi nylon, đánh kí hiệu. Bảo quản trong tủ mát nếu chưa xử lý mẫu ngay. Cắt nhỏ lá, xay nhuyễn trong 1 phút để đồng nhất mẫu. Cân 2 ± 0,05 g mẫu lá cho vào ống nghiệm thủy phân Teflon. Thêm 10 ml HCl 6 N, lắc đều, đem thổi khí N2 trong 1,5 phút. Đậy nắp, cho vào tủ sấy tiến hành thủy phân ở 152 oC trong 1 giờ. Sau khi thủy phân, lấy ống nhựa thủy phân để ở nhiệt độ phòng. Lọc dịch thủy phân qua giấy lọc Trung Quốc, dùng micropipett hút lấy 2 µl dịch lọc cho vào bình quả lê.

Tiến hành thổi khí và tạo dẫn xuất tương tự như đối với chất chuẩn.

Chuẩn bị mẫu cho xác định hiệu suất thu hồi: Trong quá trình phân tích, chất cần phân tích có thể bị mất đi một phần do thao tác kỹ thuật. Vì vậy, kết quả hàm lượng thực tế của chúng chỉ đạt giá trị nhỏ hơn 100 % so với lý thuyết. Giá trị này chính là hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích, nằm trong khoảng 0 – 100 % (hay từ 0 – 1). Hiệu suất thu hồi càng gần về 1, đồng nghĩa lượng chất phân tích bị mất mát càng ít, hiệu quả của phương pháp phân tích càng cao. Việc tính toán hiệu suất thu hồi giúp chúng ta tính được hàm lượng thực sự chất phân tích có trong mẫu.

Nguyên tắc của phương pháp này là thêm chất chuẩn vào mẫu, tiến hành phân tích theo quy trình rồi so sánh đồng thời sắc ký đồ của mẫu ban đầu và mẫu có thêm chuẩn. Việc tạo các mẫu thêm chuẩn được thực hiện như sau: hút 2 µl mẫu vào bình quả lê, thêm vào 2 µl chuẩn 10 mM, lặp lại với 3 bình quả lê. Tiến hành các bước tiếp theo tương tự như đối với mẫu không thêm chuẩn. Lấy sắc ký đồ của mẫu không thêm chuẩn và mẫu thêm chuẩn. Điều kiện sắc ký: (1) Cột Water Pico-Tag C18 – 3,9 x 150 mm; (2) Tốc

độ

dòng: 0,8 ml/phút; (3) Đầu dò: VWD 254 nm; (4) Nhiệt độ cột: 25 oC; (5) Thể tích bơm mẫu: 150 µl; (6) Gradient: trình bày trong bảng 3.1.

24

Bảng 3.1 Chương trình Gradient trong phân tích proline Thời gian

%A

%B

Tốc độ dòng

0,0

100

0

0,8

10,0

70

30

0,8

10,5

30

70

1,0

14,0

0

100

1,0

14,5

0

100

0,8

(phút)

Sau khi đã chuẩn bị đầy đủ các điều kiện như trên, tiến hành bơm mẫu vào máy HPLC để phân tích mẫu.

25

Sơ đồ 3.1 Quy trình phân tích proline (Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường)

26

3.3.2 Xây dựng phương trình đường chuẩn ampicillin 3.3.2.1 Thiết bị và dụng cụ Hệ thống máy HPLC 1100 Hawlett Packerd; cân phân tích Precisa XT 22A; Vortex IKA; bồn đánh siêu âm Power Sonic 510; bình lọc chân không với màng lọc 0,45 µm; máy đo pH Jenway 5310; micropipett các loại; đầu tip các loại; bình định mức; pipett định mức; cốc thủy tinh chịu nhiệt; màng lọc 0,45 µm; đũa khuấy; kim bơm 50 µl.

3.3.2.2 Hóa chất Kháng sinh chuẩn ampicillin anhydrous (Sigma A9393); Acetonnitrile (Merk); KH2PO4 (tinh thể, Merk); H3PO4 đậm đặc (Merk); nước cất lọc khử.

3.3.2.3 Quy trình thực hiện Pha các dung dịch chuẩn: cân chính xác 10 mg chuẩn, cho vào bình định mức 10ml, hoà tan bằng nước cất lọc khử (lọc chân không qua màng 0,45 μm), đánh siêu âm 5 phút, được chuẩn 1000 ppm. Từ chuẩn 1000 ppm, pha thành các chuẩn 200 ppm; 100 ppm; 50 ppm; 10 ppm; 5 ppm; 2,5 ppm; 1 ppm (xem chi tiết trong phần phụ lục).

Hình 3.2 Dãy chuẩn định mức ampicillin

27

Pha các pha động: (1) Pha động A (dung dịch đệm KH2PO4 0,1M; pH 2,5) (KH2PO4 + nước cất); (2) Pha động B (ACN).

Chuẩn bị điều kiện chạy máy HPLC: (1) Cột HyperClone 3u BDS C18 100 x 4.6 mm; (2) Tỉ lệ pha động (A : B = 70 : 30); (3) Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút; (4) Bước sóng: 254 nm; (5) Thời gian: 10 phút.

Dựng đường chuẩn: bơm các chuẩn đã chuẩn bị, lấy sắc ký đồ và dựng đường chuẩn y = f(x) bằng phần mềm Microsoft Excel 2007, với y là diện tích peak chuẩn (Sm), x là nồng độ các chất chuẩn ampicillin (Cm) (100ppm; 50ppm; 10ppm; 5ppm; 2,5 ppm; 1 ppm).

3.3.3 Xây dựng phương trình đường chuẩn tetracycline 3.3.3.1 Thiết bị và dụng cụ Hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC 1100, đầu dò UV; bình lọc chân không với màng lọc 0,45 µm; bồn đánh sóng siêu âm Power Sonic 510; pipet 1ml, 2ml; cốc thủy tinh 250ml; đũa khuấy; kim bơm 50 µl; giấy lọc.

3.3.3.2 Hoá chất Kháng sinh chuẩn tetracycline hydrochloride (95%) (Sigma T - 4062); Methanol (CH3OH); Acetonitrile CH3CN; H2SO4; nước cất.

3.3.3.3 Quy trình thực hiện Pha các dung dịch chuẩn và pha động: cân chính xác 10 mg chuẩn, cho vào bình định mức 10ml, hoà tan bằng dung môi Methanol (MeOH). Từ chuẩn 1000 ppm, pha thành các chuẩn 100 ppm; 50 ppm; 40 ppm; 20 ppm; 10 ppm; 5 ppm; 1 ppm. Tiếp đó tiến hành pha các dung môi pha động cho HPLC: pha động A (H2O; pH 2,1); pha động B (ACN) (xem chi tiết trong phần phụ lục). Điều kiện chạy máy HPLC: (1) Cột HyperClone 3u BDS C18 100 x 4.6 mm; (2) Tỉ lệ pha động (A: B = 7 : 3) ; (3) Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút; (4) Bước sóng 355 nm.

28

Sau khi chuẩn bị đầy đủ về chuẩn, pha động và các điều kiện, tiến hành bơm mẫu chuẩn vào máy HPLC, lấy sắc ký đồ. Dựng đường chuẩn: y = f(x) từ các kết quả thu được bằng phần mềm Microsoft Excel 2007, với y là diện tích peak chuẩn (Sm), x là nồng độ các chất chuẩn tetracycline (Cm) (100ppm; 50ppm; 40 ppm; 20 ppm; 10ppm; 5ppm; 1 ppm).

3.4 Các chỉ tiêu theo dõi 3.4.1 Phương trình đường chuẩn proline Được xây dựng dựa trên 3 điểm chuẩn proline ở 3 thể tích: 2 μl, 4 μl và 6 μl.

3.4.2 Hàm lượng proline trong lá cây Chuẩn L - proline = 10 (mM) = 10 x 10-3 (mol/l) = 10 (mM/l) Lấy 2 µl dd chuẩn pha với 2 ml dd pha mẫu, ta có: = 0,01 (mM)

Nồng độ (µmol/ml) =

Hàm lượng proline trong mẫu lá cây (Cm):

Cm kl proline/kl mẫu

Cm μg proline/g mẫu

Cm μg/g

(Công thức 3.1)

Sm: diện tích mẫu; Sc: diện tích chuẩn M: phân tử lượng proline (115,15 g) m: khối lượng mẫu đem phân tích (g) V: thể tích dung dịch mẫu (ml)

29

3.4.3 Hiệu suất thu hồi R của quy trình định lượng proline Hiệu suất thu hồi chỉ độ mất mẫu trong quá trình phân tích mẫu, cho biết hiệu quả của phương pháp phân tích.

R

(Công thức 3.2)

Ssp: diện tích mẫu thêm chuẩn.

Sm: diện tích mẫu không thêm chuẩn Sc: diện tích chuẩn proline ở một thể tích xác định 3.4.4 Giới hạn phát hiện của quy trình phân tích proline Giới hạn phát hiên LOD (Limit of Detection) là cực tiểu phát hiện của thiết bị, là nồng độ tối thiểu của một chất mà thiết bị có thể phát hiện được. LOD được đo bằng cách chuẩn bị một dung dịch chất chuẩn trong một dung môi tinh khiết và bơm vào một thể tích xác định V (μl). Lấy sắc ký đồ và đo S/N (Signal to noise – tín hiệu so với độ nhiễu, tức là tỉ lệ giữa diện tích peak chất chuẩn và diện tích peak nhiễu của đường nền trên sắc ký đồ), trên nguyên tắc LOD là nồng độ tương ứng với S/N = 3 (Chu Phạm Ngọc Sơn, 2008).

3.4.5 Phương trình đường chuẩn của ampicillin Đường chuẩn được xây dựng dựa trên 5 điểm chuẩn từ các nồng độ 100 ppm; 50 ppm; 10 ppm; 5 ppm; 2,5ppm; 1 ppm.

3.4.6 Phương trình đường chuẩn của tetracycline Đường chuẩn được xây dựng dựa trên 5 điểm chuẩn từ các nồng độ 100 ppm; 50 ppm; 40 ppm; 20 ppm; 10 ppm; 5 ppm; 1 ppm.

30

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phương trình đường chuẩn proline Việc xây dựng đường chuẩn của một chất là bước khởi đầu cho công tác phân tích chất đó trên các đối tượng mẫu thí nghiệm khác nhau. Kết quả về diện tích peak chất cần phân tích khi thay thế vào phương trình đường chuẩn sẽ cho nồng độ tương ứng của chất phân tích có trong mẫu. Đường chuẩn được xây dựng dựa trên 3 điểm chuẩn ở các thể tích 2 μl, 4 μl, 6 μl proline chuẩn 10 mM. Kết quả được trình bày trong hình 4.1 và bảng 4.1.

Hình 4.1 Sắc ký đồ của chuẩn proline 10 mM ở thể tích 2 μl

31

Từ các sắc ký đồ thu được, chúng tôi nhận thấy tín hiệu về proline xuất hiện dưới dạng peak vào thời điểm phút thứ 8, trong khoảng từ 8,503 đến 8,512. Thời gian này được gọi là thời gian lưu (TR). Các peak proline trong các sắc ký đồ đều giống nhau về hình dạng. Sự khác nhau về chiều cao của các peak proline cho kết quả khác nhau về diện tích (Sm). Các peak còn lại trên sắc ký đồ là peak của các dung môi pha động.

Bảng 4.1 Thời gian lưu và diện tích peak chuẩn proline ở các thể tích V (μl)

2

4

6

TR

8,503

8,512

8,509

Sm

128,51151

298,37341

383,34103

Bảng 4.1 cho thấy sự gia tăng tuyến tính của diện tích chuẩn proline theo thể tích mà chúng tôi đã thực hiện. Từ diện tích các chuẩn trên, chúng tôi đã xây dựng được đường chuẩn của proline (hình 4.1).

Hình 4.2 Đường chuẩn proline

32

Phương trình đường chuẩn y = 63,70x + 15,24 được áp dụng cho việc xác định hàm lượng proline có trong mẫu lá thí nghiệm. Kết quả thu được từ sắc ký đồ phân tích về diện tích peak proline (Sm), được thế vào phương trình (tương ứng với y), từ đó suy ra được x là nồng độ proline (Cm) có trong mẫu lá. Hệ số tương quan R2 cho thấy quan hệ giữa thể tích chuẩn và diện tích chuẩn, mức độ tuyến tính. Hệ số tương quan càng gần về giá trị 1, ý nghĩa của phương trình càng lớn, việc tính toán càng chính xác hơn. Thông thường, R2 ≥ 0,99 là tốt nhất. Ở phương trình đường chuẩn proline, R2 = 0,964 vẫn còn chưa cao. Nguyên nhân có thể do có sự sai số về thể tích khi pha chuẩn và một phần do mất mẫu trong quá trình tạo dẫn xuất (thổi khô mẫu). Do đó khi tính toán hàm lượng proline trong mẫu lá, chúng tôi xác định thêm với công thức riêng (Công thức 3.1) 4.2 Hàm lượng proline trong mẫu lá cây Thực hiện việc phân tích trên 10 mẫu lá cây (M1 – M10) đã được lấy và xử lý như trong phần 3.3.1.3. Kết quả về hàm lượng proline trong lá cây được ghi nhận ở bảng 4.2. Thay các nồng độ của dịch chiết mẫu vào công thức 3.1 ở phần 3.4.2, ta được nồng độ proline có trong mẫu (Cm).

33

Hình 4.3 Sắc ký đồ của mẫu M4

Hình 4.4 Sắc ký đồ mẫu M4 có thêm 2 μl chuẩn proline

34

Bảng 4.2 Kết quả hàm lượng proline trong mẫu lá cây Kí

m

VHCl

Sm

Sc

TR

Cm

hiệu

(g)

(ml)

M1

2,0072

10

25,11

67,80

8,656

2,12

M2

2,0080

10

27,42

67,80

8,460

2,32

M3

2,0122

10

15,11

67,80

8,345

1,28

M4

2,0009

10

14,35

67,80

8,521

1,22

M5

2,0018

10

30,88

67,80

8,492

2,62

M6

2,0074

10

19,71

67,80

8,537

1,67

M7

2,0090

10

18,49

67,80

8,558

1,56

M8

2,0060

10

29,55

67,80

8,444

2,51

M9

2,0024

10

28,10

67,80

8,386

2,38

M10

2,0036

10

23,24

67,80

8,514

1,97

(µg/g)

Kết quả cho thấy hàm lượng proline có trong lá cây dao động từ 1,22 μg/g đến 2,62 μg/g (hay từ 1,22 – 2,62 ppm), trong đó tập trung cao nhất ở mẫu lá M5 (2,62 μg/g). Proline là acid amin có khá phổ biến trong cây trồng và khi cây bị tác động của ngoại cảnh, đặc biệt là khô hạn, thường thấy proline xuất hiện với nồng độ khá cao. Được biết đến như chất tự vệ cơ bản của cây trồng, proline còn tham gia vào quá trình làm ổn định cấu trúc của các protein, điều chỉnh trạng thái cân bằng nước, cấu tạo nên thành tế bào và màng tế bào, đồng thời là chất có khả năng quét dọn các radical tự do trong cây. Hàm lượng proline trong lá ở mức trung bình, cho thấy được cây đang sống trong điều kiện không quá bất lợi. Việc điều chỉnh lại môi trường sống tốt hơn và cung cấp đầy đủ nước sẽ giúp cây sinh trưởng, phát triển và cho năng suất cao.

35

4.3 Hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích proline trong mẫu lá cây.

Các mẫu thêm chuẩn và không thêm chuẩn được tiến hành phân tích như đã trình bày ở phần 3.3.1.3. Sau phân tích trên HPLC, ta được thời gian lưu (TR) và diện tích peak (Sm) proline của các mẫu đã thêm lặp lại 2 μl chuẩn 10 mM (lần 1, lần 2, lần 3) và mẫu M4.

Bảng 4.3 Thời gian lưu và diện tích các mẫu thêm chuẩn Mẫu

Chuẩn

Mẫu M4

Mẫu thêm

Mẫu thêm

Mẫu thêm

lần 1

lần 2

lần 3

2 µl

TR

8,503

8,521

8,556

8,528

8,554

Sm

67,80255

14,34766

70,3903

66,10349

73,1808

So sánh kết quả diện tích (Sm) của các mẫu thêm chuẩn với thể tích chuẩn 2 μl, mẫu M4 và mẫu chuẩn 2 μl, thế vào công thức 3.2, từ đó tính được hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích mẫu như trong bảng 4.3.

Bảng 4.4 Hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích proline Sspike

Sc

Hiệu suất thu hồi

Mẫu thêm lần 1

70,3903

67,80255

82,66 %

Mẫu thêm lần 2

66,10349

67,80255

76,33 %

Mẫu thêm lần 3

73,1808

67,80255

86,77 %

Trung bình

81,92 %

Ở bảng 4.3, hệ số thu hồi của các mẫu thêm chuẩn từ 76,33 % đến 86,77 %.

Hệ số thu hồi trung bình là 81,92 %, nằm trong khoảng hệ số thu hồi cho phép 70 %

36

- 130 % theo quy định của Cục Bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn (2008). Điều đó cho thấy quy trình phân tích proline đảm bảo độ tin cậy, mức độ mất mẫu trong quá trình phân tích có thể chấp nhận được. Hàm lượng mẫu mất đi một phần có thể do đuổi khí không kĩ trước lúc thủy phân, oxy còn trong lọ thủy phân gây ra sự oxy hóa proline. Phần khác cũng có thể do mẫu bị dính lại trên giấy lọc khi lọc dịch thủy phân, hoặc bị mất trong quá trình tạo dẫn xuất. Ngoài ra, sự chênh lệch này còn có thể do sự thay đổi của dung môi pha động về pH và nhiệt độ xung quanh. Do vậy, thực hiện việc phân tích trong cùng một điều kiện nhất định sẽ làm giảm bớt đi sự sai lệch về thời gian lưu.

4.4 Giới hạn phát hiện của phương pháp (LOD) Dùng nồng độ chuẩn proline ở thể tích 2 μl, xác định được diện tích của peak proline S = 67,8; diện tích peak nhiễu đường nền N = 0,284  tỷ lệ S/N = 238,5. Để đạt được S/N = 3 cần 0,025 μl proline hay nồng độ proline là 0,02 μg/g (ppm). Vậy giới hạn phát hiện hay LOD của phương pháp là 0,02 μg/g (xem chi tiết trong phần phụ lục).

So với hàm lượng proline trong các mẫu lá cây đã phân tích, giới hạn phát hiện trên rất có ý nghĩa, cho thấy khả năng phát hiện proline của quy trình là rất cao.

4.3 Phương trình đường chuẩn ampicillin Các chuẩn ampicillin đã chuẩn bị ở phần 3.3.2 được dùng để chạy trên máy HPLC cho các sắc ký đồ tương ứng. Kết quả thời gian lưu (TR) và diện tích peak ampicillin của các nồng độ chuẩn (Sm) thu được từ sắc ký đồ HPLC được trình bày trong bảng 4.5.

37

Bảng 4.5 Thời gian lưu và diện tích các nồng độ chuẩn ampicillin C

1

2,5

5

10

50

100

TR

5,796

5,800

5,833

5,828

5,821

5,816

Sm

1,5738

4,8472

10,5000

20,3292

100,3590

199,5650

(ppm)

Hình 4.5 Sắc ký đồ chuẩn ampicillin 50 ppm Lập phương trình đường chuẩn ampicillin dựa vào giá trị Sm thu được.

38

Hình 4.6 Đường chuẩn ampicillin Ở các sắc ký đồ, peak ampicillin xuất hiện trong khoảng phút thú 5, từ phút thứ 5,796 tới phút thứ 5,833. Các peak đẹp và rõ, đường nền ổn định. Diện tích peak ampicillin (Sm) tăng dần theo nồng độ ampicillin.

Phương trình đường chuẩn ampicillin: y = 1,996x + 0,119 Hệ số tương quan của phương trình là R2 = 1 Hệ số tương quan R2 là 1, đồng nghĩa với mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích chuẩn rất chặt chẽ, tương quan tuyến tính rất tốt. Phương trình có thể áp dụng trực tiếp cho việc xác định hàm lượng ampicillin trên một đối tượng mẫu cụ thể.

4.4 Phương trình đường chuẩn tetracycline Xây dựng phương trình đường chuẩn tetracycline dựa vào các điểm chuẩn với các nồng độ 5 ppm; 10 ppm; 20 ppm; 40 ppm; 50 ppm; 100 ppm. Kết quả về thời gian lưu (TR1, TR2) và diện tích peak tetracycline (Sm1, Sm2, Sm) ở các nồng độ được trình bày trong bảng 4.6.

39

Bảng 4.6 Thời gian lưu và diện tích các nồng độ chuẩn tetracycline C

5

10

20

40

50

100

TR1

8,183

8,181

8,188

8,141

8,103

8,037

Sm1

153,755

294,568

645,234

1309,701

1655,624

3060,938

TR2

8,640

8,632

8,675

8,604

8,581

8,510

Sm2

123,555

238,975

603,607

1304,969

1709,338

3654,508

Sm

277.3105

533,5443

1248,842

2614,670

3364,9635

6715,4473

(ppm)

Hình 4.7 Sắc ký đồ của chuẩn tetracycline 40 ppm

40

Tín hiệu về tetracycline xuất hiện dưới dạng peak đôi vào khoảng phút thứ 8, từ 8,103 đến 8,188 đối với peak thứ nhất, và từ 8,510 đến 8,675 đối với peak thứ hai. Do đó từ diện tích các nồng độ chuẩn có được trong bảng 4.5, lấy giá trị theo Sm ta dựng được phương trình đường chuẩn tetracycline.

Phương trình đường chuẩn tetracycline: y = 68,32x – 103,1 Hệ số tương quan R2 = 0,999

Hình 4.8 Đường chuẩn tetracycline Trong các mẫu chuẩn đem chạy HPLC, chúng tôi nhận thấy tín hiệu về tetracycline xuất hiện dưới dạng peak đôi đi liền và tuyến tính gần như nhau.

Nguyên nhân có thể do tính chất của tetracycline. Tetracycline dạng bazơ là tinh thể lưỡng tính, hòa tan trong nước kém (1 : 2500). Dạng HCl tinh thể hút ẩm, dễ tan trong nước (1 : 10), khi pha thành dung dịch dễ biến màu vàng sậm, bị thủy phân và ngưng kết thành dạng bazơ. Cả hai dạng đều không tan trong dung môi hữu cơ, nhưng dễ hòa tan trong acid hay chất kiềm (Võ Văn Ninh, 2001). Một nguyên nhân nữa cũng có thể do sự tách không tốt của cột sắc ký. Do vậy, khi xử lý số liệu để lập

41

phương trình đường chuẩn tetracycline, chúng tôi lấy giá trị Sm, tức là giá trị tổng của peak đôi (Sm1 và Sm2).

Chúng tôi không nhận được tín hiệu tetracycline ở sắc ký đồ nồng độ 1 ppm (không xuất hiện peak tetracycline). Thí nghiệm lặp lại 3 lần, trên cơ sở pha lại chuẩn và thay thử một cột khác nhưng vẫn không có kết quả. Kết luận có thể do giới hạn phát hiện (LOD – Limit of Detection) của quy trình chưa cao.

Hệ số tương quan khá cao (R2 = 0,999), cho thấy nồng độ và diện tích chuẩn tetracycline có liên quan chặt chẽ với nhau, tương quan tuyến tính tốt. Phương trình có thể được dùng trong việc tính toán hàm lượng tetracycline trong một đối tượng mẫu cụ thể.

42

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua quá trình thực hiện đề tài “Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong phân tích proline và xây dựng đường chuẩn ampicillin và tetracycline”, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: Quy trình phân tích proline có hiệu quả khá cao với hiệu suất thu hồi trung bình của quy trình là 81,92 % nằm trong khoảng cho phép của Cục Bảo vệ thực vật thuộc Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn, và giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,02 μg/g (ppm) có thể áp dụng trong định lượng proline trong mẫu lá cây.

Hàm lượng proline trong mẫu lá cây phân tích từ 1,22 μg/g đến 2,62 μg/g cho thấy cây sống trong điều kiện không quá khô hạn. Phương trình đường chuẩn proline y = 63,70x + 15,24 với hệ số tương quan tuyến tính khá tốt R2 = 0,964, áp dụng trong tính toán hàm lượng proline trong mẫu lá cây. Đã xây dựng được phương trình đường chuẩn của ampicillin y = 1,996x + 0,119 với hệ số tương quan tuyến tính rất tốt R2 = 1, và phương trình đường chuẩn tetracyclline y = 68,32x – 103,1 với hệ số tương quan tuyến tính tốt R2 = 0,999 làm cơ sở bước đầu cho các phân tích định lượng ampicillin và tetracycline trên các loại mẫu cụ thể.

Hạn chế của đề tài: do sự hạn chế về thời gian và kinh tế, chúng tôi chỉ thực hiện phân tích proline trên mẫu lá cây, cùng với xây dựng được phương trình đường chuẩn ampicillin và tetracycline, chưa thực hiện việc phân tích hàm lượng 2 loại kháng sinh này trên các đối tượng mẫu cụ thể (thịt, gan…). Đồng thời chưa áp dụng

43

phương pháp HPLC trong phân tích các acid amin khác, các acid và bazơ hữu cơ, lipid, các hợp chất cao phân tử…

5.2 Đề nghị Nên lặp lại thí nghiệm nhiều lần và khảo sát thêm các mức khác nhau ở các điều kiện khác nhau. Có thể điều chỉnh về hệ dung môi, pha động, cách thức tiến hành… xem xét sự thay đổi, từ đó lựa chọn được quy trình hoàn thiện nhất và có hiệu quả nhất.

Tiến hành việc phân tích hàm lượng ampicillin và tetracycline trên đối tượng mẫu cụ thể (gan, thịt, dược phẩm, thức ăn gia súc…).

Dùng phương pháp HPLC phân tích các acid amin khác, các acid và bazơ hữu cơ…

44

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1.Võ Thị Trà An, 2007. Kháng sinh dùng cho vật nuôi. Nhà xuất bản Đà Nẵng.

2.Võ Thị Trà An, 2001. Tình hình sử dụng kháng sinh và dư lượng kháng sinh trong thịt gà tại các cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp của thành phố Hồ Chí Minh.

Luận văn thạc sĩ Khoa học nông nghiệp, ĐH. Nông Lâm TP. HCM. 3.Nguyễn Như Pho và Võ Thị Trà An, 2001. Bài giảng Dược lý thú y. Đại học Nông Lâm TP.HCM. 3.Trần Tử An, 2005. Kiểm nghiệm dược phẩm. Nhà xuất bản Y học Hà Nội.

5.Bộ Y tế, 2006. Dược thư Quốc gia Việt Nam. Nhà xuất bản Y học.

6.Bùi Thị Tho, Nghiêm Thị Anh Đào, 2005. Giáo trình Dược lý thú y. Nhà xuất bản Hà Nội.

7.Võ Thị Bạch Huệ và Vĩnh Định, 2008. Hóa phân tích, tập 2, sách đào tạo dược sĩ đại học. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội.

8.Lê Thị Thiên Hương và Phan Thị Thùy Chi, 2008. Định lượng đồng thời acid folic và pyridoxine hydrochloride trong viên nang Feroglobin B12 bằng phương pháp HPLC. Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc số 1 – 2008, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương.

9.Dương Thanh Liêm, 2009. Giáo trình Độc chất học. Đại học Nông Lâm TP.HCM. 10.Phạm Luân, 2006. Bài giảng Cơ sở lý thuyết HPLC. Đại học Quốc gia Hà Nội.

11.Võ Văn Ninh, 2001. Kháng sinh trong thú y. Nhà xuất bản Trẻ.

12.Đào Văn Phan, 2009. Dược lý học, tập 1. Nhà xuất bản Giáo Dục.

13.Nguyễn Phi Kim Phụng, 2007. Phương pháp cô lập chất hữu cơ. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.

45

14.Huỳnh Thị Ngọc Phương, 2009. Giáo trình hóa dược. Đại học Y dược TP.HCM. 15.Hồ Viết Quý, 2007. Các phương pháp phân tích công cụ trong hóa học hiện đại.

Nhà xuất bản Đại học Sư phạm Hà Nội.

16.Hồ Viết Quý, 2006. Cơ sở Hóa học phân tích hiện đại, tập 3. Nhà xuất bản Đại học Sư phạm Hà Nội.

17.Chu Phạm Ngọc Sơn, 2008. Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Trung tâm đào tạo và phát triển sắc ký TP. Hồ Chí Minh.

18.Chu Phạm Ngọc Sơn, 2008. HPLC/MS. Trung tâm đào tạo và phát triển sắc ký TP. Hồ Chí Minh.

19.Hà Diệu Thúy, 2009. Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh họ cycline trong thức ăn chăn nuôi heo và trên heo thịt được giết mổ tại địa bàn TP. Hồ Chí Minh. Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược Thú y, ĐH. Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.

20.Nguyễn Ngọc Tuân, 2002. Vệ sinh thịt. Nhà xuất bản Nông nghiệp TP.HCM. 21.Hà Duyên Tư, 2009. Phân tích hóa học thực phẩm. Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội.

22.Lê Thúy Tươi, 2007. Chế độ ăn cân bằng dưỡng chất. Báo Sức khỏe và Đời sống.

Tài liệu tiếng nước ngoài 23.Levin S., 2002. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) for Clinical and Biomedical (HPLC handouts). Truy cập ngày 5 tháng 1 năm 2010. <URL://www.forumsci.co.il/HPLC>.

24.Christine Miller, John Jaskowiak, 2001. HPLC for food analysis, a Primer. Truy cập ngày 4 tháng 5 năm 2010. <URL://www.aligent.com/chem>.

25.Edman, 1950. Acta Chemica Scandinavica, pp 283.

26.Gzik A., 1996. Accumulation of proline and pattern of acid in sugar beet plants in response to osmotic, water and salt stress. Enviromental and Experimental Botany, 39 (1): 29 - 38.

46

Tài liệu Internet 27.Alia A., Mohanty P. và Matysik J., 2001. Effect of proline on the production of singlet oxygen. Truy cập ngày 18 tháng 8 năm 2009. <URL://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11665815>.

28.Dương Văn Nhiệm, 2005. Phân tích bước đầu tồn dư tetracycline trong thịt lợn trên thị trường Hà Nội. Truy cập ngày 8 tháng 5 năm 2010. <URL://tusach.thuvienkhoahoc.com>.

29.Cục bảo vệ thực vật, 2008. Nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích đa dư lượng thuốc BVTV trong rau bằng máy sắc ký khí, phục vụ kiểm soát nông sản an toàn. Tập san Bảo vệ thực vật số 1 - 2008. Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn. Truy cập ngày 7 tháng 7 năm 2010. <URL://www.ppd.gov.vn>.

30.Doyle, F.P., J.H.C. Nayler, G.N. Rolinson, 1960. Recovery of solid 6 aminopenicillanic acid. Truy cập ngày 15 tháng 4 năm 2010. <URL://en.wikipedia.org/wiki/6-APA>.

31.Klajn, Rafal, 2007. Chemistry and chemical biology of tetracyclines. Truy cập ngày 24 tháng 12 năm 2009. <URL: //en.wikipedia.org/wiki/Tetracycline>.

32.Nguyễn Thế Thức, 2005. Protein. Truy cập ngày 10 tháng 7 năm 2010. <URL://www.vietlove.com/board/index.php?showtopic=637>3 33.Sigma-Aldrich Co. Ampicillin. Truy cập ngày 20 tháng 5 năm 2010. <URL://www.sigmaaldrich.com>.

34.Sigma-Aldrich Co. Proline. Truy cập ngày 20 tháng 5 năm 2010. <URL://www.sigmaaldrich.com>.

47

PHỤ LỤC Phụ lục 1 PHA CÁC DUNG DỊCH CHUẨN VÀ CÁC DUNG MÔI 1.1 Trong qui trình định lượng proline  Pha các dung dịch chuẩn, dẫn xuất, pha động * Dung dịch HCl 6 N: từ dung dịch HCl đậm đặc 37 % pha thành 100 ml dung dịch HCl 6 N: nHCl = 6 (N) . 0,1 (l) = 0,6 (mol) VHCl = (nHCl . MHCl . 100)/(C % . D) = (0,6 . 36,5 . 100)/(37 . 1,18) = 50,16 (ml) VH2O = 100 – VHCl = 100 – 50,16 = 49, 84 (ml)  Hút 50,16 ml dung dịch HCl 37 % pha với 49,84 ml H2O được 100 ml dung dịch HCl 6 N. * Dung dịch HCl 0,1 N: Hút 1 ml dung dịch HCl 6 N pha với 59 ml H2O được 60 ml dung dịch HCl 0,1 N. * Dung dịch pha mẫu: 710 mg Na2HPO4 +1 l nước cất. Điều chỉnh pH = 7,4 bằng H3PO4 10 %. * Dung dịch tạo dẫn xuất 1: EtOH: H2O: TEA = 2 : 2 : 1 (v:v:v) * Dung dịch tạo dẫn xuất 2: EtOH: H2O: TEA: PITC = 7 : 1 : 1 : 1 (v:v:v:v) * Dung dịch chuẩn gốc: 10 mg chuẩn proline dạng bột, hòa tan trong 10ml dd HCl 0,1 N được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 100 mM. Hút 100 µl dung dịch chuẩn gốc 100 mM + 900 µl dd HCl 0,1 N  dung dịch chuẩn 10 mM. * Pha động: đánh sóng siêu âm, lọc chân không qua màng lọc 0,45 µm.

- Pha động A: 600 ml ACN + 400 ml H2O (lọc, khử)

48

- Pha động B: 19 g aceton de sodium trihydrate + 1 l H2O lọc khử + 0,5 ml TEA. Chỉnh pH 6,4 bằng acid acetic. Lấy 940 ml dung dịch này + 60 ml ACN  dd B. 1.2 Trong xây dựng đường chuẩn ampicillin  Chuẩn bị đường chuẩn: Cân chính xác 10 mg chuẩn, cho vào bình định mức 10ml, hoà tan bằng nước cất lọc khử (lọc chân không qua màng 0,45 μm), đánh siêu âm 5 phút, được chuẩn 1000 ppm. Từ chuẩn 1000 ppm, ta pha thành các chuẩn 200 ppm; 100 ppm; 50 ppm; 10 ppm; 5 ppm; 2,5 ppm; 1 ppm - Chuẩn 200 ppm: hút chính xác 1 ml chuẩn 1000 ppm cho vào bình định mức 5 ml, thêm nước cất tới vạch, lắc đều.

- Chuẩn 100 ppm: hút chính xác 2,5 ml chuẩn 200 ppm cho vào bình định mức 5 ml, thêm nước cất tới vạch, lắc đều.

- Chuẩn 50 ppm: hút chính xác 2,5 ml chuẩn 100 ppm cho vào bình định mức 5 ml, thêm nước cất tới vạch, lắc đều.

- Chuẩn 10 ppm: hút chính xác 1 ml chuẩn 50 ppm cho vào bình định mức 5 ml, thêm nước cất tới vạch, lắc đều.

- Chuẩn 5 ppm: hút chính xác 2,5 ml chuẩn 10 ppm cho vào bình định mức 5 ml, thêm nước cất tới vạch, lắc đều.

- Chuẩn 2,5 ppm: hút chính xác 2,5 ml chuẩn 5 ppm cho vào bình định mức 5 ml, thêm nước cất tới vạch, lắc đều.

- Chuẩn 1 ppm: hút chính xác 1 ml chuẩn 5 ppm cho vào bình định mức 5 ml, thêm nước cất tới vạch, lắc đều.  Pha động - Pha động A: dd đệm phosphate (KH2PO4 0,1M): 13,6 g KH2PO4 hòa tan với nước cất trong bđm 1000 ml (chỉnh tới vạch), đánh siêu âm 10 phút, chỉnh pH 2.5 với H3PO4 đđ, lọc chân không qua màng 0,45 μm, đánh siêu âm 15 phút.

- Pha động B: ACN 100%

49

1.3 Trong xây dựng đường chuẩn tetracycline  Chuẩn bị đường chuẩn: Cân chính xác 10 mg chuẩn, cho vào bình định mức 10ml, hoà tan bằng dung môi Methanol (MeOH). Từ chuẩn 1000 ppm, ta pha thành các chuẩn 100 ppm; 50 ppm; 40 ppm; 20 ppm; 10 ppm; 5 ppm; 1 ppm: - Chuẩn 100 ppm: hút chính xác 1 ml chuẩn 1000 ppm cho vào bình định mức 10 ml, thêm MeOH tới vạch, lắc đều.

- Chuẩn 50 ppm: hút chính xác 2,5 ml chuẩn 100 ppm cho vào bình định mức 5 ml, thêm MeOH tới vạch, lắc đều.

- Chuẩn 40 ppm: hút chính xác 4 ml chuẩn 50 ppm cho vào bình định mức 5 ml, thêm MeOH tới vạch, lắc đều.

- Chuẩn 20 ppm: hút chính xác 2,5 ml chuẩn 40 ppm cho vào bình định mức 5 ml, thêm MeOH tới vạch, lắc đều.

- Chuẩn 10 ppm: hút chính xác 2,5 ml chuẩn 20 ppm cho vào bình định mức 5 ml, thêm MeOH tới vạch, lắc đều.

- Chuẩn 5 ppm: hút chính xác 2,5 ml chuẩn 10 ppm cho vào bình định mức 5 ml, thêm MeOH tới vạch, lắc đều.

- Chuẩn 1 ppm: hút chính xác 1 ml chuẩn 5 ppm cho vào bình định mức 5 ml, thêm MeOH tới vạch, lắc đều.  Pha động: - Pha động A: nước cất 2 lần, chỉnh pH 2,1 bằng H2SO4 với pH kế, đánh siêu âm 15 phút. Sau đó đem lọc qua màng lọc 0,45 μm với bình lọc chân không.

- Pha động B: ACN 100 %.

50

Phụ lục 2 Tính LOD của quy trình phân tích proline Từ bảng 4.2, xét mẫu M1: Ở nồng độ Cm = 2,12 μg/g  Sm = 25,11 Chuẩn proline ở thể tích 2 μl, Sm = 67,8  Nồng độ Cm = 5,72 μg/g.  Chuẩn proline ở thể tích 0,025 μl có nồng độ: 0,02 μg/g

Cm

51