TANIN VÀ DƯỢC LIỆU CHỨA TANIN - ThS.DS. Huỳnh Anh Duy

ThS.DS. Huỳnh Anh Duy

1

NỘI DUNG A. ĐẠI CƢƠNG VỀ TANIN I. ĐỊNH NGHĨA II. CẤU TRÚC HOÁ HỌC III. TÍNH CHẤT IV. ĐỊNH TÍNH – ĐỊNH LƢỢNG B. CÁC DƢỢC LIỆU CHỨA TANIN

2

ĐỊNH NGHĨA • Những hợp chất polyphenol có trong thực vật, có vị

chát được phát hiện dương tính với thí nghiệm

thuộc da.

• Pseudotanin: acid gallic, các chất catechin, acid chlorogenic.

• Cơ chế thuộc da: liên kết hydro tanin và protein.

3

4

Cơ chế thuộc da

5

Đun chảy tanin/kiềm

6

PHÂN LOẠI

Tanin

Tanin pyrogallic

Thủy phân đƣợc

Tanin pyrocatechic

Không thủy phân đƣợc

Tanin hỗn hợp

7

1. Tanin thủy phân đƣợc LK esther

Tanin pyrogallic

Cấu trúc glycosid H+

/tanase

Đƣờng

- Glucose - Hamamelose: đặc biệt

Không đƣờng

- Các acid

8

Các acid hay gặp Acid gallic

Acid m-digallic

Liên kết depsid

Acid m-trigallic

9

Acid ellargic

Acid chebulic

Acid hexahydroxydiphenic

Acid luteolic

10

Ribose

Hamamelose (Hydroxy-methyl-D-ribose)

11

Các đặc trưng của tanin pyrogallic • Pseudoglycosid • Khi cất khô ở 180 - 200 °C sẽ thu được pyrogallol là chủ yếu.

• Khi đun nóng với HCl (thủy phân) sẽ cho acid gallic (gallotanin) hoặc acid ellargic (ellargitanin).

12

acid gallic

pyrogallol

13

Các phản ứng khác • Cho tủa bông với chì acetat 10 %.

• Cho tủa màu xanh đen với muối sắt (III).

• Thường dễ tan trong nước.

15

Một số ví dụ • Ngũ bội tử: Quercus spp. và Rhus spp.

Nhóm galloyl

Penta-O-galloyl--D-glucose

16

• Là và vỏ cây Hamamelis virginiana L.

17

• Ổi: Psidium guajava L.

Casuarinin

Casuarictin

18

2. Tanin ngƣng tụ • Tanin không thủy phân/tanin pyrocatechic/phlobatanin.

• Ngưng tụ flavonoid: flavan-3-ol hoặc flava-3,4-diol.

Tanin pyrocatechic

Acid / Enzym

Đỏ tanin/phlobaphen

19

Đặc điểm tanin pyrocatechic • Khi cất khô thu được pyrocatechin là chính.

• Cho tủa màu xanh lá đậm với muối sắt (III).

• Cho tủa bông với nước brom.

• Khó tan trong nước hơn tanin pyrogallic.

OH

OH

pyrocatechin

21

Tanin pyrogallic vs tanin pyrocatechic

3. Tanin hỗn hợp • Loại này được tạo thành trong cây do sự kết hợp giữa 2 loại tanin.

Ví dụ: tanin trong vỏ cây Quercus stenophylla, lá

ổi và lá chè.

• Chứa cả 2 loại tanin: lá Ổi, lá Bàng...

23

Stenophynin A

G-G=2, 2’, 3, 3’, 4, 4’-hexahydroxydiphenoyl

24

Catechin = Flavan 3-ol

O

*

catechin

* OH

epicatechin OH

OH HO

O

OH

HO

O

OH OH

OH

OH

OH

(3) OH

OH

OH

OH HO

O

OH OH

OH

gallocatechin

HO

O

OH OH

OH

(3)

epigallocatechin

Epigallocatechin gallate (EGCG)

26

Epigallocatechin gallate (EGCG)

27

28

CHIẾT XUẤT • Tanin: không tan / DM kém phân cực.

• Tan / DM phân cực: aceton, cồn, cồn loãng và nước.

• Tan tốt nhất là nước nóng.

• Sóng siêu âm: hỗ trợ tăng hiệu suất chiết

29

TÍNH CHẤT VÀ ĐỊNH TÍNH • Tính chất:  Vị chát, làm săn da.  Tan được trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton.  Hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ.

30

Định tính 2.1. Định tính hóa học

Thí nghiệm thuộc da: - “Da sống” ngâm vào HCl 2%, rửa nước.

- Ngâm vào dung dịch thử 5’ phút.

- Rửa sạch bằng nước, nhúng Fe (III) sulfat 1% - Da màu nâu => tanin (+)

31

Phản ứng kết tủa

• Gelatin muối 1% • Phenazon • Alkaloid • Muối kim loại nặng

• K2Cr2O7 đậm đặc 32

- Tủa với gelatin muối + Gelatin 1% có NaCl 10% Dịch chiết

Tủa bông

Tanin (+)

Pseudotanin không cho tủa với dung dịch gelatin loãng ***Pseudotanin: acid gallic, catechin, acid clorogenic.

33

- Tủa với phenazon + phosphat acid natri Dịch chiết

+ phenazon 2% Tủa (màu)

, để nguội, lọc

34

- Tủa với alkaloid - Tạo tủa với alkaloid, một số dẫn chất nitơ...

- Tủa với muối kim loại nặng - Tạo tủa với muối của Pb, Hg, Zn, Fe, Cu. - Tủa với K2Cr2O7 đậm đặc

35

Phản ứng tạo màu - Phản ứng với TT Folin hoặc Folin - Ciocaulteau: Cho màu xanh => định tính & định lƣợng

Cơ chế tanin với TT Folin - Ciocaulteau 36

Phản ứng tạo màu - Phản ứng với kali fericyanid

Dịch chiết

Amoniac

+

Đỏ đậm

Kali fericyanid

37

Phản ứng Stiasny • Dùng để phân biệt 2 loại tanin TT Stiasny: Formol + HCl,  +

Dịch tanin

Tủa vón, đỏ gạch Không tủa

Tanin pyrocatechic Tanin pyrogallic

38

Phát hiện catechin tự do

HCl đậm đặc,  Phloroglucinol

Catechin - Nhuộm lignin - HCl đậm đặc

Hồng, đỏ

39

Phát hiện catechin tự do

TT Stiasny,  Tủa đỏ gạch

Catechin

40

Phát hiện acid chlorogenic (Acid 3-trans-Caffeoylquinic)

NH4OH Dịch chiết (có acid chlorogenic)

Xanh lục

Không khí

41

2.2. Định tính bằng sắc ký * Sắc ký lớp mỏng Silica gel G Toluen - CHCl3 - aceton (40:25:35) Cellulose CHCl3 - acid acetic - nước (50:45:5)

Thuốc thử: - Dung dịch FeCl3*.

- Các catechin: màu hồng với TT Vanilin - HCl. * HPLC * 0,5 ml dung dịch FeCl3 trộn với 20 ml ethanol

42

Định tính tannin bằng sắc ký lớp mỏng

43

Định tính tannin bằng HPLC

ĐỊNH LƢỢNG • Phương pháp bột da*

• Phương pháp tạo tủa với đồng acetat.

• Phương pháp oxy hóa (PP Lowenthal)* • Phương pháp đo màu với thuốc thử Folin* • Phương pháp đo màu với TT Folin - Ciocalteau* • Phương pháp HPLC*

45

Phƣơng pháp bột da • Cách tiến hành: - Chiết kiệt tanin: TT Fe (III).

- Chính xác dịch chiết, bốc hơi, sấy 105 oC, cân => T1.

- Chính xác dịch chiết, thêm bột da, khuấy đều, để yên 15’.

- Lọc. Lấy chính xác dịch lọc, bốc hơi, sấy 105 oC, cân => T2.

Lƣợng tanin = (T1 - T2) 46

- Chính xác nước cất, thêm bột da, khuấy đều, để yên 15’.

- Lọc, lấy chính xác dịch lọc, bốc hơi, sấy 105 oC, cân => To Lƣợng tanin = (T1 + To) - T2

- WHO, Quality control methods for medicinal plant materials, Geneva, 1998.

- Dược điển VN IV (phương pháp 1) 47

Phƣơng pháp oxy hóa (Lowenthal) • Tanin bị KMnO4 oxy hóa/môi trường acid.

• Từ lượng KMnO4  lượng chất oxy hóa quy theo một

tanin chuẩn.

• Chỉ thị: Sulfo indigo (Xanh dương - Vàng)

KMnO4

Tanin + Chất chỉ thị 48

Phương pháp oxy hóa (Lowenthal) • Cách tiến hành - Chiết kiệt tanin - Chuẩn độ với KMnO4, chỉ thị màu là sulfo indigo.

- Định lượng dung dịch chuyển sang vàng.

1 ml KMnO4 tương ứng với 4,157 mg tanin.

49

Phương pháp tạo tủa với Cu acetat • Cách tiến hành - Chiết tanin bằng cồn 60%.

- Thêm Cu acetat 15%, được  Cu tannat.

- Lọc tủa, sấy, cân.

- Nung tủa được Cu oxyd - Lấy hiệu số giữa đồng tanat và đồng oxyd rồi qui về phần trăm.

50

Phương pháp tạo tủa với Cu acetat • Kết hợp - Chiết tanin trong dược liệu bằng nước, nếu có pectin thì tủa bằng cồn, - Thêm một lượng chính xác dung dịch Cu acetat. Lọc tủa đồng

tanat.

- Dịch lọc được thêm H2SO4 10% và KI. Acetat đồng thừa sẽ tác dụng lên KI trong môi trường acid để giải phóng Iod.

2Cu(CH3COO)2 + 4 KI  4KCH3COO + Cu2I2 + I2

51

Phương pháp tạo tủa với Cu acetat o Chuẩn độ iod bằng Natri thiosulfat, công thức sau: E = D - C trong đó C = (A–B) x 1,2517 o E là lượng tanin trong dung dịch đem định lượng. o D là lượng đồng tanat xác định bằng phương pháp cân. o C là lượng đồng oxyd kết hợp với tanin. o A là lượng đồng cho vào dung dịch lúc ban đầu. o B là lượng đồng thừa trong dung dịch sau khi lọc loại đồng tanat xác định bằng phương pháp đo Iod. o (1ml natrithiosulfat 0,1N ứng với 0,00635g đồng) o 1,2517 là hệ số CuO/Cu 52

Phương pháp đo màu với TT Folin - Ciocalteu • TT Phosphomolybdostungtic / TT Folin - Denis

• Cách tiến hành - Dịch chiết nước + TT Phosphomolybdostungtic/kiềm  Màu xanh.

- Đo A ở 755 - 760 nm.

- Tiến hành 2 mẫu: + Mẫu 1: dịch chiết đã loại tanin  Polyphenol không phải tanin + Mẫu 2: Không loại tanin  Polyphenol toàn phần.

- Sự chênh lệch hai độ hấp thu là lượng tanin trong mẫu.

53

Phương pháp đo màu với TT Folin - Ciocalteu • TT dùng để loại tanin: bột da, casein, polyvinyl polypyrrolidon (PVPP).

• Tanin chuẩn: acid tannic. Xây dựng đường chuẩn • Tính toán kết quả: %tanin/dược liệu

54

Acid tannic

• Bột dược liệu (0.75 g) được chiết xuất với nước nóng ở 70 °C trong 15 phút.

• Để nguội và lọc, dịch chiết được cho vào bình định mức 100 mL, bổ sung đến vạch bằng methanol 30%.

• Dung dịch 1: Trộn 2 mL dịch chiết trên với 8 mL nước cất và 10 mL đệm natri acetat (pH = 5).

• Dung dịch 2: thu được bằng cách lắc 10 mL dung dịch 1 với 50 mg casein trong 1 giờ, lọc.

56

• Mẫu 1: Cho 1 mL dung dịch 1, thêm 0,5 mL thuốc thử Folin-

Ciocalteu, thêm tiếp Na2CO3 33% vừa đủ 10 mL. • Mẫu 2: Cho 1 mL dung dịch 2, thêm 0,5 mL thuốc thử FolinCiocalteu, thêm tiếp Na2CO3 33% vừa đủ 10 mL. • Mẫu trắng: nước cất.

• Độ hấp thu được đo ở 720 nm.

57

• Độ hấp thu A1 từ mẫu 1.

• Độ hấp thu A2 từ mẫu 2.

• Độ hấp thu A được đo 3 lần, lấy kết quả trung bình.

• Độ chênh lệch độ hấp thu: A = (A1 - A2) tương ứng với hàm lượng tannin trong mẫu.

• Chất chuẩn: acid tannic (khoảng nồng độ 10–60 μg/mL).

58

Phương trình hồi quy: y = 19,346x + 0,0185

Lấy A thế vào phƣơng trình hồi quy:

Trong đó:

=> C của mẫu thử quy về acid tannic

- x: nồng độ (C) - y: Độ hấp thu (A)

Phƣơng pháp đo màu với TT Folin • TT acid phospho wolframic • Cách tiến hành - Dịch chiết nước + TT Folin/Na bicarbonat  Màu xanh.

- Đo A, 715 nm, 2 phút.

- Tiến hành 2 mẫu: + Mẫu 1: dịch chiết đã loại tanin bằng bột da + TT Folin + Mẫu 2: Không loại tanin

- Lấy hiệu mật độ quang của 2 mẫu trên.

- Tiến hành song song mẫu chuẩn là pyrogallol.

60

Chuẩn bị dịch chiết: • Lấy 0,75 g dược liệu (m), thêm 150 mL nước cất.

• Đun nóng trong 15 phút. Để nguội, lọc. Cho dịch lọc vào

bình định mức 250 mL, bổ sung nước tới vạch.

• Lọc tiếp, loại bỏ 50 mL dịch lọc đầu tiên.

• 200 mL còn lại được sử dụng cho thử nghiệm (G).

61

Mẫu trắng: nước cất.

Mẫu chuẩn: pyrogallol.

Mẫu 1: Polyphenol toàn phần • Lấy 5 mL dịch lọc (G) trên, bổ sung nước vừa đủ thành 25 mL. • Lấy 5 mL vừa pha, thêm 2 mL acid phosphowolframic (TT Folin), bổ sung vừa đủ 50 mL bằng dung dịch Na2CO3 15%.

• Sau 3 phút, đo độ hấp thu A ở 715 nm • Được giá trị A1.

62

Mẫu 2:

• Lấy 20 mL dịch lọc (G) thêm 0.2 g bột da. Lắc kỹ 60 phút, lọc.

• Lấy 5 mL dịch lọc bổ sung vừa đủ thành 25 mL bằng nước cất.

• Lấy 5 mL vừa pha, thêm 2 mL acid phosphowolframic (TT Folin), bổ sung vừa đủ 50 mL bằng dung dịch Na2CO3 15%.

• Sau 3 phút, đo độ hấp thu A ở 715 nm

• Được giá trị A2.

63

Tính toán: • 50 mg pyrogallol pha trong nước cất thành 100 mL dung dịch.

• Tiếp tục, lấy 5 mL pha thành 25 mL bằng nước cất.

• Lấy 5 mL vừa pha, thêm 2 mL acid phosphowolframic (TT Folin), bổ sung vừa đủ 50 mL bằng dung dịch Na2CO3 15%.

• Sau 3 phút, đo độ hấp thu A ở 715 nm, được A3.

• Hàm lượng tannin được tính theo công thức:

13,12.(A1  A 2 ) %tannin  A 3 .m

m: khối lƣợng dƣợc liệu 64

Phương pháp HPLC • Pha tĩnh: RP-18, đôi khi rây phân tử (Sephadex).

• Pha động: Hỗn hợp nước, MeOH, ACN. • Chất điều chỉnh pH: acid phosphoric, NH4H2PO4, acid

trifluoroacetic (TFA).

• Detector: UV. • Riêng lẻ hay đồng thời.

65

- Cột sắc ký: RP-18 (SunFire,Waters, USA) (150 mm x 4,6mm, 5 m) - Đầu dò: PAD - Hệ dung môi: acetonitril - TFA 0,05% trong nước (pH 2.25).

- Kiểu rửa giải: gradient - Tốc độ dòng: 1.0 mL/phút, - Thể tích tiêm mẫu: 20 L.

- Nhiệt độ cột: 25 oC. - Bước sóng: 272 nm 66

A – acid tannic B – procyanidin B2 C – acid gallic

TÁC DỤNG - CÔNG DỤNG • Đối với thực vật: - Chất bảo vệ: khỏi nấm mốc, côn trùng...

- Tham gia trao đổi chất, oxy hóa khử.

70

Đối với con người • Thuốc săn da.

• Kháng khuẩn • Viêm ruột, tiêu chảy.

• Chữa ngộ độc (kim loại nặng và alkaloid) • Tác dụng đông máu

71

• Các ellagitanin có tính kháng ung thư: gemin A, agrimoniin, rugosin D kháng Sarcoma 180 / chuột.

• Chống oxy hóa

• Trong công nghiệp: thuộc da.

72

DƢỢC LIỆU CHỨA TANIN • Ngũ bội tử • Ổi • Măng cụt • Lá Bàng

• Chiêu liêu, Chè, Sim...

73

Ngũ bội tử • Tổ đã phơi hay sấy khô của ấu trùng sâu Ngũ bội tử (Melaphis chinensis (Bell.) Baker = Schlechtendalia

chinensis Bell.) ký sinh trên cây Muối/cây Diêm phu mộc (Rhus chinensis Muell.), họ Đào lộn hột (Anacardiaceae) • Tên khoa học: Galla sinensis

74

• Thành phần hóa học - TP chính: tanin pyrogallic.

- Còn có acid gallic, acid ellargic.

- Tanin là pentagalloyl--D-glucose

75

76

• Tác dụng, công dụng - Kháng HIV - Ức chế peroxid hóa / chuột.

- Viêm ruột, nhiễm trùng da...

77

Ổi • Tên khoa học: Psidium guajava L., Myrtaceae.

78

79

• Thành phần hóa học: - 10% tanin: Búp và lá - Cả 3 loại tanin:  Thủy phân được.  Không thủy phân.  Hỗn hợp.

80

• Thủy phân được: gallotanin, ellargitanin

gallotanin 81

• Không thủy phân: procyanidin-B1, prodelphinidin-B1

procyanidin-B1

prodelphinidin-B1

82

• Tanin hỗn hợp: acutissimin A, B; guajavin A & B.

acutissimin A

Acutissimin B

83

- Catechin, gallocatechin, leucocyanidin.

- Flavonoid: quercetin, avicularin, guajaverin...

84

quercetin

avicularin

gallocatechin

leucocyanidin

guajaverin 85

Công dụng • Kháng khuẩn mạnh.

• Kháng các dòng tế bào ung thư.

• Chữa lỵ, tiêu chảy.

86

Măng cụt • Tên khoa học: Garcinia mangostana L., Clusiaceae

87

• Thành phần hóa học - Vỏ chứa tanin 8%: Procyanidin A-2, B-2.

- Xanthon: dẫn chất isoprenyl hóa, vd: -mangostin.

88

Procyanidin A-2

Procyanidin B-2

89

Công dụng • Kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm.

• Chữa lỵ, tiêu chảy.

90

Terminalia nigrovenulosa Kiene

Rhodomyrtus tomentosa Wight.

Terminalia catappa L.

Camellia sinensis (L.) Kuntze

91

92