TIỂU LUẬN XÁC ĐỊNH CHẤT BẢO QUẢN ACID SORBIC VÀ ACID BENZOIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC (2016-2017)

BÁO CÁO PHÂN TÍCH HÓA LÝ THỰC PHẨM 1

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection

TIỂU LUẬN XÁC ĐỊNH CHẤT BẢO QUẢN ACID SORBIC VÀ ACID BENZOIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC (2016-2017) WORD VERSION | 2020 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM …………0O0…………

Tiểu luận

PHÂN TÍCH HÓA LÝ THỰC PHẨM 1

XÁC ĐỊNH CHẤT BẢO QUẢN ACID SORBIC VÀ ACID BENZOIC BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC

Tp.HCM, năm 2016-2017

1 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 3 I.TỔNG QUAN .............................................................................................................. 4 1. Chất bảo quản ....................................................................................................... 4 2. Acid sorbic ............................................................................................................. 6 3. Acid benzoic .......................................................................................................... 9 4. Phƣơng pháp HPLC .......................................................................................... 11 II.

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG AXIT BENZOIC VÀ AXIT SORBIC........... 19

1. Phạm vi áp dụng ................................................................................................. 19 2. Nguyên tắc .......................................................................................................... 19 3. Thuốc thử ............................................................................................................ 19 4. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................................ 21 5. Lấy m u .............................................................................................................. 21 6. Chu n bị m u thử .............................................................................................. 21 7. Cách tiến hành .................................................................................................... 22 8. Tính toán và biểu thị kết quả. ........................................................................... 23 9. Độ chụm .............................................................................................................. 24 10. Báo cáo thử nghiệm ........................................................................................... 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO. ......................................................................................... 25

2 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển của xã hội đòi hỏi các mặt hàng thực phẩm ngày càng dồi dào và phong phú về số lượng, chất lượng, cũng như chủng loại và thời gian sử dụng. Để đáp ứng nhu cầu đó, trong quá trình chế biến thực phẩm các nhà sản xuất thường thêm các chất phụ gia vào thực phẩm nhằm cải thiện chúng. Phụ gia thực phẩm là những chất không được coi là thực phẩm hoặc một thành phần của thực phẩm, chúng có ít hoặc không có giá trị dinh dưỡng, được chủ động cho vào với mục đích đáp ứng nhu cầu công nghệ trong quá trình sản xuất, chế biến, xử lí, bao gói, vận chuyển, bảo quản.

Trong đó khâu bảo quản thực phẩm không kém phần quan trọng. Có nhiều cách để bảo quản thực phẩm như phơi, sấy khô, làm lạnh, đóng gói, muối, ngâm tẩm hóa chất. Mỗi phương pháp có những ưu điểm và nhược điểm riêng, trong đó việc sử dụng hóa chất bảo quản là một biện pháp hiện đại, làm chậm hư thối, giữ được phẩm chất và vả hấp dẫn của thực phẩm. Trong nhóm hóa chất bảo quản có axit benzoic và axit sorbic được sử dụng nhiều nhằm mục đích ức chế sự phát triển của nấm men, nấm mốc gây hư hỏng thực phẩm.

Vì lượng nhỏ axit benzoic và axit sorbic trên nền hữu cơ là khó xác định. Do đó phải lựa chọn phương pháp phân tích hữu hiệu nhất. Có thể phân tích hai axit này bằng nhiều phương pháp như quang phổ UV – VIS, sắc kí phối phổ, sắc kí lỏng hiệu nâng cao,…các phương pháp này đo độ nhạy, độ chính xác cao. Tuy nhiên, cho đến nay việc xác định đồng thời hai axit này trong cùng một đối tượng mẫu chưa được nghiên cứu. Để góp phần phục vụ công tác kiểm tra an toàn thực phẩm, đồng thời tiết kiệm chi phí, rút ngắn thời gian phân tích, chúng tôi chọn đề tài: “Xác định đồng thời axit benzoic và axit sorbic trong các loại thực ph m đóng gói bằng phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu nâng cao” với hai mục tiêu: - Xây dựng được qui trình phân tích đồng thới axit benzoic và axit sorbic trong một số thực phẩm đóng gói.

- Áp dụng qui trình phân tích vào thực tế kiểm tra một số thực phẩm đóng gói đang được sử dụng rộng rãi.

3 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

I. TỔNG QUAN 1. Chất bảo quản Bảo quản thực phẩm là làm cho thực phẩm có thể giữ nguyên được trạng thái như lúc tươi mới mà không bị thối hỏng trong một thời gian dài. Đây là một nhu cầu tất yếu cũng như một biện pháp bắt buộc để lưu thông chuyên chở, phân phối, buôn bán cũng như dự trữ thực phẩm.

Sự bảo quản thực phẩm còn nhằm lưu giữ những giá trị thành phần dinh dưỡng.

Thực phẩm không được bảo quản thì những thành phần dinh dưỡng trong chúng dễ dàng bị biến tính. Đáp ứng nhu cầu, chất bảo quản ra đời.

Chất bảo quản là những chất có khả năng ức chế, trì hoãn cũng như là đình chỉ quá trình lên men, hóa chua và biến chất của thực phẩm, ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật, làm chậm quá trình thối rữa. Chúng có thể sử dụng như là một hóa chất duy nhất mà cũng có thể trong tổ hợp với nhiều loại hóa chất có các tác dụng khác.  Các loại chất bảo quản thường dùng: - Các chất chống oxy hóa: Acd ascorbic, acid citric, acid tactric, dẫn xuất tocopherol,..có tác dụng làm chậm sự biến chất, ôi khét, biến màu trong quá trình bảo quản thực phẩm tươi.

- Các chất kháng sinh: Steptomixin, các loại penixilin,…

- Chất sát khuẩn: acid acetic, acid sorbic, acid benzoic, natri nitrat, .. có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn.  Tác động bất lợi về việc sử dụng chất bảo quản: - Gây ung thư Theo tiến sĩ Lê Quang Hưng, Trưởng Bộ môn Cây công nghiệp Đại học Nông Lâm TPHCM, chất 2,4D nếu sử dụng liều lượng cao sẽ có công dụng diệt cỏ. Sử dụng nồng độ thấp sẽ trở thành chất kích thích cực mạnh làm cho củ quả tăng kích thước nhanh bất thường. Ngoài ra, còn có công dụng làm chậm quá trình lão hóa, tươi lâu cũng như giữ được màu sắc củ quả khá tốt. Nó còn diệt cả côn trùng, vi khuẩn…

4 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

- Gây quái thai: o Gây ra các biểu hiện của nhiễm độc thực phẩm, những chất này còn gây ra thiếu máu do thiếu hemoglobin, giảm hàm lượng phosphat và magie máu, tăng hàm lượng canxi huyết. o Ở hệ thống da, niêm mạc, chúng gây tăng tiết và làm tăng kích thích như tăng tiết dịch phế quản. Trên phụ nữ có thai, chúng là tác nhân gây ra quái thai. Do đó mà liều cho phép với chất này là dưới 50mg/l nước.

- Tác hại của một số hóa chất bảo quản thực phẩm: o Clorin là một chất bảo quản thịt hay được dùng. Chất này có khả năng gây kích thích mạnh hệ hô hấp. Mặc dù không có những bằng chứng rõ ràng về ung thư và quái thai nhưng đây là một chất oxi hoá mạnh và có thể gây ra các phản ứng viêm trong phổi. Ở một nồng độ cao có thể gây ra phá huỷ phổi. o Cacbon monoxit (CO) được sử dụng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm và rau quả tươi, thực phẩm tươi sống nhìn có màu sắc đỏ tươi và bắt mắt hơn. , nồng độ cao của chất CO sẽ gây những phản ứng phụ ảnh hưởng trên hệ thần kinh, nhức đầu, chóng mặt… o Khác với các hợp chất nitrit và nitrat, formaldehyt (thường gọi là foc-môn) là một chất cực độc và có thể gây tử vong. Đây là một hợp chất vẫn dùng để ướp xác. Nếu sử dụng hoá chất này trong xử lý thực phẩm, thực phẩm có thể lưu giữ được thời gian vô cùng lâu. Nhưng tác hại mà nó gây ra thì cũng vô cùng lớn.Cố tình dùng quá nhiều trong công nghệ xử lý thì nó có thể gây tử vong do ngộ độc. o Đây là một chất hoá học gây quái thai mạnh, ngay từ liều nhỏ, chưa đến 200µg/kg. Về tác hại trên các mô bề mặt như da, niêm mạc, đây là một chất kích thích mạnh. Hơi của chúng hoặc mùi của chúng dễ dàng làm chảy nước mắt, nước mũi, dịch phế quản. Các tác hại khác có thể gặp đó là kích ứng da, viêm da, giảm tế bào lympho ngoại vi. Một số báo cáo cho thấy nó có thể làm biến đổi DNA.

5 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

Các chất bảo quản và hàm lượng cho phép STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Tên chất Axit sorbic Natri sorbat Kali sorbat Canxi sorbat Axit benzoic Natri benzoat Kali benzoat Canxi benzoat Natri hydro sulfit Natri meta disulfit Kali sulfit Canxi hydro sulfit Kali bisulfit Nisin Natri nitrat Kali nitrat Axit propionic Natri propionat Canxi fomat Axit ascorbic

Chức năng

Chống oxy hóa, ổn định

Điều chỉnh độ axit, chống oxi hóa, làm rắn chắc, ổn định, xử lý bột, tạo phức kim loại Ổn định màu Bảo quản Chống oxy hóa, bảo quản

ADI 0-25 CXD 25 0-25 0-5 5 CXD 0-5 0-0,7 0-0,7 CXD 0-0,7 0-0,7 0-33000 0,2 0-3,7 CXD CXD CXD

ML 1000 1000 1000 1000

3000 150 50-150 3000 3000 3000

CXD

2000

1000 1000

<500

2. Acid sorbic Tên sản ph m: Acid Sorbic_Chất bảo quản_Chống nấm mốc.

Tên gọi khác: Chất bảo quản E200, axit sorbic.

Công thức hóa học: C6H8O2 Tính chất vật lý: - Có dạng bột tinh thể màu trắng, vị chua nhẹ, khó tan trong nước lạnh (0,16%), tan dễ hơn trong nước nóng (100°C, 3,9%).

- Sorbic axit và các muối của nó, chẳng hạn như sorbat natri, kali sorbat, calcium sorbat, là các tác nhân kháng khuẩn thường được sử dụng như là chất bảo quản trong thực phẩm và thức uống.

6 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

- Hòa tan trong nước, pH tối ưu cho hoạt động kháng khuẩn thấp hơn pH = 6,5.

- Sorbates thường được sử dụng ở nồng độ 0,025% đến 0,10%. Sorbates ảnh hưởng rất nhiều đến pH trong thực phẩm. Cần phải điều chỉnh pH phù hợp để đảm bảo chất lượng thực phẩm - Nó được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm khác, chẳng hạn như pho mát và bánh mì.

Quy trình sản xuất acid sorbic: từ một polyester thu được bằng phản ứng của crotonaldehyde với ketene và sử dụng muối kẽm acid hữu cơ như một chất xúc tác, trong đó bao gồm quá trình hòa tan polyester trong dung môi hydrocarbon, hòa tan trong nước từ 92°C đến 100°C. Sau khi rửa lọc polyester với nước hoặc axít để loại bỏ chất kẽm và tiếp tục tiếp xúc với các dung dịch có axit mạnh, trao đổi ion, tạo acid sorbic.

Công dụng và ứng dụng: - Có tác dụng ức chế nấm men, nấm mốc, ít tác dụng đến vi khuẩn, nên được dùng để bảo quản: rau quả chua, sữa chua. Các sản phẩm này được bảo quản bằng acid sorbic vẫn đảm bảo vi khuẩn lactic phát triển và lên men được.

- Không độc hại, không có mùi vị lạ, không làm mất mùi vị tự nhiên nên được sử dụng khá phổ biến trong chế biến thực phẩm, đồ hộp, cá, thịt, bánh mì - Việc sử dụng axit sorbic trong sản xuất đồ hộp có thể giảm được nhiệt thanh trùng.

- Phối hợp axit sorbic hoặc sorbat với các chất bảo quản khác: Dùng axit sorbic với natri benzoat trong bảo quản nước quả. Dùng axit sorbic cho sản phẩm ướp đường có thể giảm một nửa lượng đường để ướp.

7 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

- Dùng nhiều trong chế biến rau quả, rượu vang, sản xuất đồ hộp, chế biến sữa, bảo quản và chế biến cá, thịt, sản phẩm bánh mì, bảo quản nước mắm, nước chấm, cá ngâm dấm.

Liều lƣợng trong thực ph m: - Các loại sản phẩm rau quả có Axit (kết hợp với xử lý nhiệt nhẹ) và các loại bánh: 0,05-0,1%.

- Cá ngâm dấm, patê cá: a.sorbic 0,2% + K.sorbate 0,27% - Thức ăn chế biến từ cua, tôm (không thanh trùng): a.sorbic 0,25% + K.sorbate 0,33%.

- Mứt quả: phun lên bề mặt sản phẩm dd K.sorbate 7%, chống mốc được 4 tháng.

- Thịt gà tươi nhúng vào dd Axit sorbic 7,5% (71℃) có thể giữ được 18 ngày.

Thuộc tính và sử dụng: Với pKa là 4,76, nó có tính axit như axit axetic.

Các số E là: - E200 Sorbic axit - E201 Sodium sorbate - E202 Kali sorbat - E203 Canxi sorbat LD50: LD 50 giá trị của axit sorbic được ước tính từ 10-7,4 g/kg, là khá cao. Hợp chất này là tương đối không ổn định và nhanh chóng bị phân hủy trong đất, do đó nó thường được coi là thân thiện với môi trường.

8 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

3. Acid benzoic Tên sản ph m: Acid benzoic_Chất bảo quản_Chống vi sinh vật Tên gọi khác: Chất bảo quản E210 Công thức hoá học: C6H5COOH Công thức phân tử:

Tính chất vật lý: - Acid benzoic tinh khiết có ở dạng tinh thể hình kim hoặc tấm nhỏ, màu trắng lụa óng ánh, dễ tan trong rượu và ête và nước nóng, ít tan trong nước lạnh (ở nhiệt độ phòng tan không quá 0.2%) tan vô hạn trong etanol. tnc = 121,70C; ts = 2490C; tthh = 1000C. - Acid benzoic là một acid tương đối mạnh (pH=4,19) nên có tính kháng khuẩn cao.

Quy trình sản xuất acid benzoic: Điều chế theo con đường hoá học bằng cách: oxi hoá toluen bằng acid nitric hoặc acid cromic hoặc bằng oxi không khí (trong pha lỏng), decacboxyl hoá anhidrit phtalic trong pha khí ở 34oC với chất xúc tác ZnO. Một số loại cây chứa nhiều Acid benzoic: Acid benzoic có nhiều trong vỏ cây anh đào, quất, mận, hồi và cây chè.

Cơ chế tác dụng: Acid benzoic tác dụng theo cơ chế trực tiếp: Khi các phân tử acid benzoic khuếch tán vào bên trong tế bào vi sinh vật nó sẽ tác động lên một số enzyme gây hạn chế sự trao 9 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

đổi chất, làm ức chế quá trình hô hấp của tế bào, ức chế quá trình oxy hóa glucose và pyruvate, đồng thời làm tăng nhu cầu oxy trong suốt quá trình oxy hóa glucose nên có tác dụng ngăn cản sự phân đôi của vi khuẩn, ức chế sự phát triển của nấm men và nấm mốc gây hư hỏng thực phẩm. Khả năng chống nấm mốc của acid benzoic cao hơn nấm men và vi khuẩn. Acid benzoic còn có khả năng tác dụng lên màng tế bào để hạn chế sự hấp thu axit amin của tế bào vi sinh vật và các túi màng.

Hoạt tính và sử dụng: Hoạt tính kháng khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào pH, tác dụng bảo quản chỉ xảy ra ở môi trường pH = 2,5 – 3,5, khi pH càng thấp hoạt tính kháng khuẩn càng cao.

- pH = 2 – 2.5: cần hàm lượng acid benzoic 0,02 – 0,03% - pH = 3.5 – 4: cần 0.08% tiêu diệt mốc, 0.1- 0.15% diệt nấm men, 0,15 – 0.2% diệt vi khuẩn lactic.

- pH trung tính: hiệu quả giảm 300 lần so với pH =3.

Công dụng: Acid benzoic để sử dụng trong thực phẩm: sữa lên men, quả ngâm giấm, hoa quả ngâm đường,các loại sản phẩm nước trái cây, rau thanh trùng…

LD50: - Liệu lượng cho phép tối đa là 0.1-0.12%, thường dùng 0.05-0.075% đối với nước quả chua và 0.075-0.1% đối với nước quả ít chua.

- Liều lượng gây độc ở người là 6mg/kg thể trọng. Nên sử dụng liều lượng nhỏ hơn 1g/kg thực phẩm.

Lưu ý: Nhược điểm của acid benzoic là có thể gây thâm đen khi sử dụng để bảo quản các sản phẩm có nguồn gốc từ rau quả.

10 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

Bảng liều lượng sử dụng trong thực phẩm STT

Nhóm thực phẩm

ML

1

Sữa lên men (nguyên kem), có xử lý nhiệt sau lên men

50

2

Quả ngâm dấm, dầu, nước muối

1000

3

Hoa quả ngâm đường

1000

4

Rau, củ ngâm dấm, dầu, nước muối

2000

5

Rau thanh trùng pasteur đóng hộp, đóng chai hoặc đóng túi

1000

6

Necta quả thanh trùng pasteur đóng hộp hoặc đóng chai

2000

4. Phƣơng pháp HPLC HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).

4.1.

Khái niệm

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.

Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

11 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

Sơ đồ máy phân tích HPLC 4.2.

Phânloại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:    

Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).

Sắc ký phâAn bố (partition chromatography).

Sắc ký ion (ion chromatography).

Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).

Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000). SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography). Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động. Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực. SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm.

SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động.

Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực. Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng 12 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

SKPĐ. Dung môi sử dụng trong SKPĐ là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền. Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT. 4.3.

Pha t nh trong sắc ký pha đảo

Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:  Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography).  Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography).

Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:  Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích.  Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi.

Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này.

4.4.

Pha động trong sắc ký pha đảo

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:     

Hòa tan mẫu phân tích.

Phù hợp với đầu dò.

Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh.

Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao.

Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade).

Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất. Nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải.

Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý như chỉ số khúc xạ (refractive index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân cực (polarity index), độ 13 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

rửa giải (eluent strength)…. Trong đó độ phân cực và độ rửa giải có tác động lớn lên khả năng phân tách của các mũi sắc ký.

Có ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách các mũi sắc ký: số đĩa lý thuyết N, hệ số dung lượng K’, độ chọn lọc α . Khi sự thay đổi thành phần pha động không đem lại kết quả tách mũi theo yêu cầu thì chúng ta phải thay đổi bản chất pha động (sử dụng dung môi khác), tức thay đổi α. Đôi khi có thể phải thay đổi cả pha tĩnh.

Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích và pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid (cho proton) hoặc tính baz (nhận proton) của dung môi. Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước hoặc dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước.

Nước là một dung môi rất phân cực nên nó không tương tác với những nhóm alkyl không phân cực trong pha tĩnh, do đó nó được coi như pha động yếu nhất và có tốc độ rửa giải chậm nhất trong tất cả các dung môi động của SKPĐ. Hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc tăng áp suất cột.

Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25oC Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động được tối ưu hóa cho những hợp chất cần phân tích. Thông thường, người ta sử dụng hỗn hợp dung môi MeOH/nước trước, rồi ACN/nước hay THF/nước. Với một hỗn hợp chất phân tích phức 14 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

tạp thì sẽ có sự trộn lẫn của các dung môi hữu cơ với nước. Khi lựa chọn thì phải chọn các hỗn hợp MeOH, ACN và THF với nước có độ rửa giải tương đồng. Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn.

Một số đại lƣợng cơ bản trong phân tích sắc ký Hệ số phân bố: Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký được mô tả bằng phương trình như sau:

Hằng số cân bằng K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hằng số phân bố (partition coefficient) và được tính như sau:

CS: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh CM: nồng độ cấu tử trong pha động Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích.

15 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

Thời gian lưu:

Thời gian lưu của cấu tử phân tích tR: Thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra ngồi cột. tO: Thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết. t′R: Thời gian lưu thật của một cấu tử.

Hệ số dung lượng k’ k’ được định nghĩa theo công thức sau:

VS: thể tích pha tĩnh VM: thể tích pha động

Nếu k’~ 0, tR~ tO: chất ra rất nhanh, cột không có khả năng giữ chất lại.

16 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

Nếu k’ càng lớn (tR càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng lâu, mũi có khả năng bị tù.

Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp, k’ có thể chấp nhận trong khoảng rộng 1-20.

Hiệu năng: Hiệu năng hay số đĩa lý thuyết N của cột đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc ký của các cấu tử trên cột. N càng lớn, hiệu năng tách càng cao.

Số đĩa lý thuyết có thể đo trên sắc ký đồ. Người ta chứng minh được: W1/2 là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao mũi (phút).

W là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi (phút).

Độ chọn lọc: Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột.

17 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

Độ phân giải: Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp, sự chọn lọc và hiệu quả tách. Nó được xác định qua phương trình sau:

Hay

Với N được xác định từ phương trình (2.5) hoặc (2.6).

18 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

II.

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG AXIT BENZOIC VÀ AXIT SORBIC. 1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng axit benzoic và axit sorbic trong sữa và các sản phẩm sữa.

Phương pháp này có thể áp dụng cho sữa, sữa bột, sữa chua và các sản phẩm sữa lên men khác, phomat và các sản phẩm phomat chế biến, thích hợp để xác định hàm lượng cả hai hợp chất ở mức lớn hơn 5 mg/kg.

2. Nguyên tắc Chất b o và protein được tách khỏi dung dịch kiềm nhẹ của sản phẩm bằng kết tủa Carrez. Sau đó pha loãng phần dung dịch còn lại với metanol, lọc phần chất lỏng phía trên Axit benzoic và axit sorbic được tách bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) với cột pha đảo C18, đo độ hấp thụ ở bước sóng 227 nm và 250 nm.

3. Thuốc thử Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.  Metanol (CH3OH).  Thuốc thử tạo kết tủa, chuẩn bị như sau: ung d ch kali hexaxyanoferat (II) Hoà tan 10,6 g kali hexaxyanoferat (II) ngậm ba phân tử nước (K 4[Fe(CN)6].3H2O) với nước trong bình định mức một vạch dung tích 100 ml (6.3). Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn.

CHÚ THÍCH 100 ml dung dịch này đủ cho 40 lần chạy sắc ký. ung d ch kẽm axetat Hòa tan 21,9 g kẽm axetat ngậm hai phân tử nước [(CH3COO)2Zn.2H2O] và 32 ml axit axetic (CH3COOH) với nước trong bình định mức một vạch dung tích 100 ml (6.3). Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn.

Nếu kẽm axetat ngậm hai phân tử nước không hoà tan hoàn toàn, thì đun nóng bình định mức 100 ml với dung dịch chứa trong bình trên nồi cách thuỷ (6.2), duy trì nhiệt độ 70 oC trong khi vẫn xoay bình. Khi kẽm axetat ngậm hai phân tử nước đã hoà tan hoàn toàn, thì làm nguội dung dịch về nhiệt độ phòng.

CHÚ THÍCH 100 ml dung dịch này đủ cho 40 lần chạy sắc ký.

19 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

 Dung dịch đệm phosphat ( pH 6,7) Hoà tan 2,5 g kali dihydro phosphat (KH2PO4) và 2,5 g kali hydro phosphat ngậm ba phân tử nước (K2HPO4.3H2O) trong 1 I nước và trộn. Lọc dung dịch thu được qua hệ thống lọc dung môi (6.8).  Pha động (dùng cho HPLC) Trộn 10 thể tích metanol (5.1) với 90 thể tích dung dịch đệm phosphat (5.3). Tách khí hoà tan trong dung dịch bằng cách sử dụng chân không nhẹ.  Dung dịch natri hydroxit (C(NaOH)= 0,1 mol/l) Hoà tan 4,0 g natri hydroxit dạng hạt bằng nước trong bình định mức một vạch dung tích 1 000 ml (6.3). Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn.  Axit sulfuric (C(H2SO4) = 0,5 mol/l) Rót cẩn thận 15 ml axit sulfuric đậm đặc, nồng độ ít nhất 95 % đến 98 % khối lượng vào 250 ml nước trong bình định mức một vạch dung tích 500 ml (6.3) và làm nguội. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn.  Dung dịch axit sorbic và axit benzoic chu n ung d ch chuẩn gốc Hoà tan 50 mg axit sorbic và 50 mg axit benzoic bằng metanol (5.1) trong bình định mức một vạch dung tích 100 ml (6.3). Pha loãng bằng metanol (5.1) đến vạch và trộn.

Dung dịch chuẩn gốc có thể bền ít nhất ba tuần nếu bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 oC đến 7 oC. ung d ch chuẩn làm việc Trộn 500 ml metanol (5.1) với 500 ml nước thu được dung dịch nước-metanol 50 % thể tích.

Trong ngày sử dụng, dùng pipet lấy 5 ml dung dịch chuẩn gốc (5.7.1) cho vào bình định mức một vạch dung tích 250 ml (6.3). Pha loãng bằng dung dịch nước-metanol 50 % tới vạch và trộn. Dung dịch chuẩn làm việc thu được chứa 10 g/ml tổng hàm lượng axit sorbic và axit benzoic.

20 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 1 mg, có khả năng đọc đến 0,1 mg.  Nồi cách thuỷ, có thể duy trì nhiệt độ 70 oC ± 2 oC.  Bình định mức một vạch, dung tích 100 ml, 250 ml, 500 ml và 1 000 ml, phù hợp với cấp A của TCVN 7153 (ISO 1042).  Sắc kí lỏng được gắn với bơm tạo áp suất lên đến 4,37 MPa (6000 psi), bộ bơm mẫu, detector UV bước sóng k p hoặc lưỡng cực, và máy ghi hoặc bộ tích phân.

Detector bước sóng k p có cuvet 1 cm và có thể đo độ hấp thụ ở bước sóng 227 nm (đối với axit benzoic) và 250 nm (đối với axit sorbic).  Cột HPLC, làm bằng th p không gỉ, dài 250 mm, đường kính trong 4 mm, chứa pha đảo, octađexyl (ODC) xử lí với chất hấp thụ silic, ví dụ Micro-Bondapak C181) hoặc loại tương tự.  Xyranh dùng cho HPLC.  Bộ lọc trong máu, có màng Iọc với cỡ lỗ 0,45 μm sử dụng với dung dịch nước.  Hệ thống lọc dung môi, có màng lọc với cỡ lỗ 0,45 μm sử dụng với dung dịch nước.  Thiết bị siêu âm.  Máy đo pH. 5. Lấy m u Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc không bị biến đổi chất lượng trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).

Mẫu thử được bảo quản sao cho tránh hư hỏng hoặc biến đổi thành phần.

6. Chu n bị m u thử  Sữa chua và các sản ph m sữa lên men khác Trước khi bắt đầu tiến hành thử, đồng hoá mẫu bằng cách làm ấm từ từ tới 40 oC trong khi khuấy. Cân, 20 g mẫu thử đã đồng hoá, chính xác đến 0,1 g, vào bình định mức một vạch (6.3).

21 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

 Các sản ph m sữa khác Cân 3 g mẫu, chính xác đến 0,1 g, vào cốc thuỷ tinh có mỏ dung tích 20 ml. Hoà tan hoàn toàn mẫu thử trong 10 ml nước, thêm từng lượng nhỏ trong khi khuấy bằng đũa thuỷ tinh. Chuyển hết dung dịch này vào bình định mức một vạch dung tích 100 ml (6.3), tráng cốc có mỏ hai lần mỗi lần dùng 5 ml nước.

7. Cách tiến hành  Kết tủa chất b o, protein và làm trong Thêm 25 ml dung dịch natri hydroxit (5.5) vào mẫu thử (xem 8.1 hoặc 8.2) và trộn. Có thể đặt bình cùng với dung dịch vào trong thiết bị siêu âm (6.9) trong 15 min hoặc đặt trên nồi cách thuỷ (6.2) duy trì ở nhiệt độ 70 oC và gia nhiệt trong 15 min, sau đó để dung dịch nguội tới nhiệt độ phòng.

Chỉnh pH đến 8 1 bằng cách thêm dung dịch axit sulfuric (5.6) trong khi trộn. Sau đó thêm 2 ml dung dịch kali hexaxyanoferat (II) (5.2.1) và 2 ml dung dịch kẽm axetat (5.2.2) để làm kết tủa chất b o và protein. Lắc mạnh rồi để yên huyền phù thu được trong 15 min. Sau đó thêm khoảng 40 ml metanol (5.1) và trộn. Để nguội đến nhiệt độ phòng.

Pha loãng bằng metanol (5.1) đến vạch và tiếp tục trộn. Giữ yên hỗn hợp thêm 15 min.

Lọc phần chất lỏng nổi lên bằng bộ lọc trong mẫu (6.7).  Sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC Tiến hành phân tích HPLC ở nhiệt độ phòng, dùng pha động (5.4) với tốc độ dòng khoảng 1,2 ml/min. Để cho hệ thống cân bằng trong ít nhất 30 min trước khi bơm các dung dịch. Sau đó bơm 5 μl đến 20 μl dung dịch đã lọc trong trong 9.1 và một thể tích tương đương dung dịch chuẩn làm việc (5.7.2). Kiểm tra dòng chảy của cột bằng detector UV ở bước sóng 227 nm và 250 nm, dùng detector liên tiếp ở hai bước sóng cài đặt hoặc dùng đồng thời bước sóng kép.

Ch thích: Đường chuẩn phải tuyến tính, do vậy chỉ cần một điểm hiệu chuẩn là đủ.

Lượng metanol trong dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử cao hơn nhiều trong pha động, điều này có thể ảnh hưởng đến hình dạng pic và sự phân tách pic ở một số trường hợp. Khi đó. cần kiểm tra hình dạng pic và sự phân tách pic bằng cách so sánh với pic thu được khi bơm dung dịch chuẩn làm việc (5.7.1) trong đó metanol (5.1) được thay bằng pha động (5.4) với thể tích tương đương. Thời gian lưu của axit benzoic và axit sorbic trong các điều kiện nêu trên tương ứng khoảng 5,5 min và 7 min. Nếu các pic được tạo thành bị ảnh hưởng bởi các chất gây nhiễu khác, thì chuẩn bị độ pha loãng thích hợp trong nước-metanol 50 % và bơm 5 μl đến 20 μl dung dịch đã pha loãng để thu được chiều cao pic thích hợp. Để phát hiện xem có bất k hợp chất gây nhiễu nào bị phân giải 22 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

cùng với axit sorbic hay không, cần kiểm tra tỉ lệ các tín hiệu UV ở cả bước sóng 250 nm và 227 nm.

Khi phân tích sữa hoặc sữa bột, sẽ quan sát được pic thứ ba sau khi rửa giải 8 min. Pic này được tạo thành bởi axit hippuric, một thành phần tự nhiên của sữa. Pic của axit hippuric có thể chồng một phần lên pic của axit sorbic. Độ phân giải cột giữa axit sorbic và axit hippuric tốt nhất là > 1.

8. Tính toán và biểu thị kết quả.  Tính toán Tính hàm lượng axit sorbic, ws, và/hoặc hàm lượng axit benzoic, wb, bằng miligam trên kilogam, theo công thức sau:

Trong đó: -

Hts là chiều cao hoặc diện tích của pic thu được từ dung dịch mẫu thử (xem 9.2), tính theo đơn vị thích hợp;

-

Hst là chiều cao hoặc diện tích của pic thu được từ dung dịch chuẩn làm việc (xem 9.2), tính theo cùng đơn vị;

-

ms là khối lượng chuẩn làm việc (5.7.2) đã bơm, tính bằng microgam (μg);

-

m là khối lượng của mẫu thử (xem 8.1 hoặc 8.2), tính bằng gam (g);

-

V1 là thể tích dịch chiết được chuẩn bị trong 9.1 (= 100 ml), tính bằng mililit (ml);

-

V2 là thể tích dung dịch mẫu thử (xem 9.2) đã bơm, tính bằng microlit (μl).

 Biểu thị kết quả Biểu thị kết quả đến số nguyên gần nhất.

23 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

9. Độ chụm  Ph p thử liên ph ng thử nghiệm Các giá trị nhận được từ ph p thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu. Các giá trị về độ lặp lại và độ tái lập thu được từ các kết quả của hai ph p thử liên phòng thử nghiệm tiến hành năm 1984 và 2004 (xem Phụ lục A). Các ph p thử được tiến hành trên mẫu có hàm lượng axit benzoic và axit sorbic dao động từ 6 mg/kg đến 920 mg/kg.  Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một loại vật liệu thử, trong cùng phòng thử nghiệm, do cùng một người thao tác và sử dụng cùng một thiết bị trong cùng một khoảng thời gian ngắn như nhau, không quá 5 % trường hợp lớn hơn 2,235 + 0,031x ϖs,(hoặc ϖb ) mg/kg.  Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một loại vật liệu thử, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người thao tác khác nhau thực hiện và sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn 8,987 + 0,130 x ϖs,(hoặc ϖb ) mg/kg.

10. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: -

Mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử; Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; Mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả; Kết quả thử nghiệm thu được, và nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

24 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

TÀI LIỆU THAM KHẢO. 1. http://www.foodnk.com/tim-hieu-ve-phu-gia-bao-quan-acid-benzoic.html 2. http://luanvan.co/luan-van/chat-bao-quan-trong-thuc-pham-2951/ 3. http://www.case.vn/viVN/34/96/118/details.casehttps://www.google.com.vn/search?tbm=isch&q=m%C 3%A1y+s%E1%BA%AFc+k%C3%BD+HPLC#imgrc=PYkpOVmS2quWiM: 4. TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.

25 Phát hành PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com