Tổng hợp một số N-hydroxybutanamid/pentanamid mang khung 1-(triazol-4-yl)methylindolin-2-on...

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  -----

DƯƠNG TIẾN ANH MÃ SINH VIÊN: 1201010

TỔNG HỢP MỘT SỐ N-HYDROXYBUTANAMID/PENTANAMID MANG KHUNG 1-(TRIAZOL-4-YL) METHYLINDOLIN-2-ON HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  -----

DƯƠNG TIẾN ANH MÃ SINH VIÊN: 1201010

TỔNG HỢP MỘT SỐ N-HYDROXYBUTANAMID/PENTANAMID MANG KHUNG 1-(TRIAZOL-4-YL) METHYLINDOLIN-2-ON HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: NCS. Đỗ Thị Mai Dung PGS.TS. Phan Thị Phương Dung Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Dược

HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN Trước khi trình bày nội dung những phần thuộc đề tài của mình, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến những người trong suốt thời gian qua đã luôn hỗ trợ động viên tôi hoàn thành một cách tốt nhất khóa luận tốt nghiệp của mình.

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến với những người thầy, người cô đáng kính của tôi: GS.TS. Nguyễn Hải Nam, PGS.TS. Phan Thị Phương Dung, DS. Đỗ Thị Mai Dung - Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội. Thầy cô đã không chỉ tạo những điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành khóa luận mà đã luôn có những chỉ dẫn chính xác, kịp thời và động viên tôi những lúc khó khăn.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa - Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược Đại học quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận này.

Cuối cùng, tôi muốn cảm ơn gia đình, bạn bè, các anh chị, các bạn của nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược, đặc biệt là anh Lê Văn Cường, anh Lê Xuân Thiện, em Lê Công Trực, Cao Việt Phương, Phạm Nguyễn Khánh Linh và bạn Đào An đã chia sẻ buồn vui, giúp đỡ và khích lệ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2016 Sinh viên Dương Tiến Anh

MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

2

1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC)

2

1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase (HDAC)

2

1.1.2. Phân loại các HDAC

3

1.1.3. Cấu trúc enzym HDAC và cơ chế deacetyl hóa

3

1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

5

1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC

5

1.2.2. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC

6

1.2.3. Liên quan cấu trúc tác dụng của các chất ức chế HDAC

7

1.3. MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TRONG TỔNG HƠP CÁC ACID

9

HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI 1.3.1. Thay đổi nhóm khóa hoạt động 1.3.2. Thay đổi cầu nối 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC VÀ

9 11 12

HÓA HỌC CLICK 1.4.1. Các phương pháp tổng hợp acid hydroxamic

12

1.4.2. Hóa học Click

14

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

17

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

17

2.1.1. Hóa chất

17

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ

17

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

18

2.2.1. Tổng hợp hóa học

18

2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được

18

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

18

2.3.1. Tổng hợp hóa học

18

2.3.2. Thử tác dụng sinh học

19

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. HÓA HỌC

21 21

3.1.1. Tổng hợp hóa học

21

3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết

34

3.1.3. Xác định cấu trúc

35

3.2. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC

40

3.2.1. Thử tác dụng ức chế HDAC

40

3.2.2. Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro

41

3.3. BÀN LUẬN

42

3.3.1. Tổng hợp hóa học

42

3.3.2. Khẳng định cấu trúc

45

3.3.3. Thử hoạt tính sinh học

49

TÀI LIỆU THAM KHẢO

55

PHỤ LỤC

60

DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT 13

C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (Carbon-13 nuclear magnetic resonance)

1

H-NMR

: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton nuclear magnetic resonance)

A549

: Dòng tế bào ung thư phổi người

AcOH

: Acid acetic

ADN

: Acid desoxyribonucleic

AsPC-1

: Dòng tế bào ung thư tuyến tụy người

CU

: Nhóm liên kết (Connecting unit)

d

: Vạch đôi trong phổ NMR (Doublet)

DCM

: Dicloromethan

dd

: Vạch chẻ đôi 2 lần trong phổ NMR (Doublet of doublet)

DMF

: Dimethylformamid

DMSO

: Dimethylsulfoxid

DMSO-d6 : Dimethylsulfoxid deuteri hóa ESI

: Ion hóa phun bụi điện tử (Electrospray ionization)

FBS

: Huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum)

FDA

: Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (U.S. Food and Drug Administration)

H (%)

: Hiệu suất

HAT

: Histon acetyltransferase

HCT116

: Dòng tế bào ung thư ruột kết người

HDAC

: Histon deacetylase

HDACi

: Các chất có tác dụng ức chế HDAC (Histon deacetylase inhibitors)

HepG2

: Dòng tế bào ung thư gan người

IC50

: Nồng độ ức chế 50% (The half maximal inhibitory concentration)

IR

: Hồng ngoại (Infrared)

J

: Hằng số ghép cặp trong phổ NMR.

KRIBB

: Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)

m

: Đa vạch trong phổ NMR (Multiplet)

MeCN

: Acetonitril

MeOH

: Methanol

MS

: Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

NAD+

: Nicotinamid adenin dinucleotid

NST

: Nhiễm sắc thể

PC-3

: Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt người

Rf

: Hệ số lưu giữ trong TLC

s

: Vạch đơn trong phổ NMR (Singlet)

SAHA

: Acid suberoylanilid hydroxamic

SRG

: Nhóm nhận diện bề mặt (Surface recognition group)

SW620

: Dòng tế bào ung thư đại tràng người

t

: Vạch ba trong phổ NMR (Triplet)

tºnc

: Nhiệt độ nóng chảy

THF

: Tetrahydrofuran

TLC

: Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)

TMS

: Tetramethylsilan

TSA

: Trichostatin A

UV

: Tử ngoại (Ultraviolet)

ZBG

: Nhóm kết thúc gắn kẽm (Zinc binding group)

δ (ppm)

: Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu) trong phổ NMR

ν

: Dao động hóa trị trong phổ IR

DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid hydroxamic từ ester.

33

Bảng 3.2. Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (tonc) của các dẫn chất VIa-d, X.

34

Bảng 3.3. Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất VIa-d, X.

35

Bảng 3.4. Kết quả phân tích phổ MS của các dẫn chất VIa-d, X.

36

Bảng 3.5. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các dẫn chất VIa-d, X.

37

Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các dẫn chất VIa-d, X.

39

Bảng 3.7. Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất VIa-d, X.

40

Bảng 3.8. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất VIa-d, X.

41

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1. Cấu trúc của nucleosom và vai trò của HAT, HDAC.

2

Hình 1.2. Bảng phân loại các HDAC.

3

Hình 1.3. Phức hợp HDAC-8 và acid hydroxamic.

4

Hình 1.4. Phân loại các chất ức chế HDAC.

6

Hình 1.5. Cấu trúc của SAHA tương ứng với cấu trúc chung của các chất ức

7

chế HDAC. Hình 1.6. Cấu trúc apicidin và azumamid E.

7

Hình 1.7. Cấu trúc chung các acid hydroxamic mang khung benzothiazol.

9

Hình 1.8. Cấu trúc chung các chất trong nghiên cứu của Feng T.

10

Hình 1.9. Cấu trúc chung các chất trong nghiên cứu của Zhang Z.

11

Hình 1.10. Cấu trúc chung của một số dẫn chất mang khung 2-oxoindolin.

11

Hình 1.11. Cấu trúc HPOB trong nghiên cứu của Lee J.H. và cộng sự.

11

Hình 3.1. Phổ khối lượng MS của dẫn chất VIb.

47

Hình 3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của dẫn chất VIc (giãn rộng)

49

Hình 3.3. Biểu đồ so sánh tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất VIc-d trên 51 các dòng tế bào SW620, PC-3 và AsPC-1.

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 1.1. Tổng hợp một số dẫn chất amid ngược của SAHA.

12

Sơ đồ 1.2. Tổng hợp các acid phenylthiazol hydroxamic.

13

Sơ đồ 1.3. Phản ứng đóng vòng 1,3-lưỡng cực giữa alkyn và azid với xúc tác

14

Cu(I) (CuAAC).

Sơ đồ 3.1. Quy trình tổng hợp chung.

21

Sơ đồ 3.2. Quy trình tổng hợp chất II.

22

Sơ đồ 3.3. Quy trình tổng hợp chất VIII.

22

Sơ đồ 3.4. Quy trình tổng hợp chất IVa.

23

Sơ đồ 3.5. Quy trình tổng hợp chất Va.

24

Sơ đồ 3.6. Quy trình tổng hợp dẫn chất VIa.

25

Sơ đồ 3.7. Quy trình tổng hợp dẫn chất VIb.

26

Sơ đồ 3.8. Quy trình tổng hợp dẫn chất VIc.

28

Sơ đồ 3.9. Quy trình tổng hợp dẫn chất VId.

30

Sơ đồ 3.10. Quy trình tổng hợp dẫn chất X.

32

Sơ đồ 3.11. Cơ chế phản ứng tạo thành IVa-d.

43

Sơ đồ 3.12. Cơ chế phản ứng Click dùng xúc tác Cu(I).

44

Sơ đồ 3.13. Cơ chế phản ứng tạo thành VIa-d, X.

45

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, cùng những thành tựu mang tính đột phá trong lĩnh vực sinh học thì hiểu biết về chức năng và hoạt động của cơ thể sống ở mức độ tế bào, mức độ phân tử ngày càng được làm rõ. Các thuốc chống ung thư mới ra đời hầu hết đều bắt nguồn từ mục tiêu phân tử nhằm tăng hiệu quả điều trị và giảm độc tính so với các phương pháp cổ điển như hóa trị hay xạ trị. Một số đích tác dụng mà các thuốc chống ung thư hiện nay đang hướng đến như các protein kinase, protein gây ung thư Bcl-2, HAT, HDAC… trong đó đích HDAC đang mở ra nhiều triển vọng.

Rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự huy động quá mức các HDAC có khả năng gây nên các sai lệch trong quá trình phiên mã, làm kích thích sự phát triển của các tế bào ung thư [15], [23]. Hiện nay, trong các chất ức chế HDAC được tổng hợp và công bố, nhóm các dẫn chất của acid hydroxamic có hoạt tính khá tốt trong đó điển hình là SAHA (Zolinza®) là chất ức chế enzym HDAC đầu tiên được FDA cấp phép lưu hành năm 2006 cho điều trị u da tế bào lympho T (CTCL) [6]. Sau đó là belinostat (Beleodaq®), gần đây nhất panobinostat (Farydax®) cũng được FDA cấp phép sử dụng trong điều trị một số bệnh ung thư.

Theo hướng tiếp cận này, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội cũng đã thiết kế, tổng hợp, thử hoạt tính và công bố nhiều dãy chất dẫn xuất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt [1], [30], [31]. Một số bài báo gần đây của nhóm nghiên cứu đã cho kết quả rất khả quan khi sử dụng khung benzothiazol hoặc khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol thay cho vòng phenyl trong cấu trúc của SAHA để làm nhóm khóa hoạt động. Nhiều chất đã thể hiện tác dụng ức chế HDAC tốt hơn SAHA từ vài lần đến vài chục lần [31], [32].

Trên cơ sở các nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Tổng hợp một số N-hydroxybutanamid/pentanamid mang khung 1-(triazol-4-yl)methylindolin-2on hướng tác dụng kháng ung thư” với hai mục tiêu: 1. Tổng hợp N-hydroxy-4-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H1,2,3-triazol-1-yl)butanamid và 4 dẫn chất.

2. Thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của các chất tổng hợp được.

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC) 1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase (HDAC) Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cấu trúc của nhiễm sắc thể (NST) đóng một vai trò quan trọng trong điều hòa biểu hiện gen [4], [10]. NST là những phức hợp đại phân tử được cấu tạo từ 3 thành phần chính là ADN, histon và protein không phải histon [10]. Cấu trúc cơ bản của NST là nucleosom, gồm một lõi protein octamer hình đĩa của các histon (1 tetramer H3/H4 và 2 dimer H2A/H2B) được quấn quanh bởi 146 cặp nucleotid của một đoạn ADN [8], [20]. Các cặp histon có cấu trúc 2 phần quan trọng: đầu C nằm bên trong lõi, đầu N nằm bên ngoài nucleosom với acid amin kết thúc là lysin. Đầu N đặc biệt là ở H3, H4 là đích của nhiều biến đổi trong quá trình phiên mã như acetyl/deacetyl hóa, methyl hóa, phosphoryl hóa.

Hình 1.1. Cấu trúc của nucleosom và vai trò của HAT, HDAC. Histon có hai dạng tồn tại là acetyl hóa hoặc deacetyl hóa được chuyển hóa qua nhau nhờ 2 enzym là histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC). Ở dạng acetyl hóa dưới xúc tác của HAT, điện tích dương nhóm ε-NH2 của lysin ở đầu N của histon bị trung hòa, NST được tháo xoắn, quá trình phiên mã được xảy ra [16]. Ngược lại, ở dạng deacetyl hóa dưới tác dụng của HDAC, histon tích điện dương

2

lớn ở đầu N, tương tác mạnh với ADN, đóng xoắn NST, ngăn cản quá trình phiên mã [15] (xem hình 1.1).

1.1.2. Phân loại các HDAC Hiện nay, các nhà khoa học đã xác định được 18 loại HDAC có mặt ở con người và chúng được chia thành 4 nhóm [7], [8], [29]: - Nhóm I: HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-8.

- Nhóm II: HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-9, HDAC-10.

- Nhóm III: Sirtuin 1-7.

- Nhóm IV: HDAC-11.

Hình 1.2. Bảng phân loại các HDAC. Nhóm I, II và IV được coi là những HDAC “kinh điển” là những enzym phụ thuộc Zn2+. Vị trí xúc tác của chúng có dạng túi với một ion Zn2+ ở đáy nên những enzym này có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelat với Zn2+ như các acid hydroxamic. Nhóm III là những sirtuin không bị ức chế bởi những hợp chất như vậy vì chúng có cơ chế hoạt động khác là phụ thuộc vào NAD+ [17].

1.1.3. Cấu trúc enzym HDAC và cơ chế deacetyl hóa 3

Bằng phương pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X, người ta xác định được cấu trúc tinh thể của các HDAC khác nhau.

Hình 1.3. Phức hợp HDAC-8 và acid hydroxamic.

Nhìn chung, các cấu trúc của chúng đều tương tự nhau, bao gồm 2 phần chính là ion Zn2+ và kênh enzym: + Ion Zn2+ là coenzym của HDAC, nằm dưới đáy kênh enzym và cũng là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon qua liên kết phối trí. Trong phân tử HDAC ion Zn2+ có thể tạo 4 liên kết phối trí với các acid amin và 1 liên kết phối trí với nguyên tử oxy của nhóm acetyl của acetyl lysin ở đầu N của histon từ đó xúc tác tách loại nhóm acetyl. Thường các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn2+ thì tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào càng mạnh [36]. Như acid hydroxamic, ức chế HDAC bằng cách tạo hai liên kết phối trí với Zn2+ qua 2 nguyên tử oxy của nó (xem hình 1.3). + Kênh enzym có dạng túi hình ống hẹp, là nơi chứa cơ chất và tham gia liên kết Van der Waals với cơ chất, được cấu tạo bởi các acid amin thân dầu đặc biệt là các acid amin có nhân thơm như: Phe, Tyr, Pro, His. Nó có cấu trúc khá linh động có thể thay đổi kích thước để phù hợp với cơ chất. Miệng túi có một vài vòng xoắn protein để tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC. Đáy túi có một vài phân tử nước, có nhiệm vụ vận chuyển nhóm acetyl trong phản ứng deacetyl hóa và tạo

4

liên kết hydro khi không có -OH của Tyr. Các hợp chất hydroxamic có chiều dài cầu nối khoảng 5-6 liên kết carbon là tối ưu với chiều dài của kênh [36].

1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng HDAC liên quan đến nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thư như chu trình tế bào, chu trình biệt hóa, chu trình chết theo chương trình [16]. Do vậy, mục tiêu phân tử HDAC là một hướng nghiên cứu đầy triển vọng của nhiều thuốc điều trị ung thư mới trong đó có các chất ức chế HDAC. 1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC Dựa vào cấu trúc hóa học, các chất ức chế HDAC được chia thành 6 nhóm: các acid hydroxamic, các acid carboxylic mạch ngắn, các peptid vòng, các aminobenzamid, các epoxyceton và các phân tử lai [34], [41] (xem hình 1.4). Mỗi nhóm chất ức chế HDAC đều có những ưu nhược điểm riêng, trong đó nhóm acid hydroxamic bị nhanh thải trừ, tác dụng ức chế HDAC không chọn lọc nhưng có ưu điểm là ức chế ở nồng độ rất thấp (cỡ nM) và cấu trúc đơn giản [8], [21].

Năm 1990, trichostatin A (TSA) là chất đầu tiên thuộc nhóm acid hydroxamic được tìm thấy có tác dụng ức chế HDAC bởi Yosida và cộng sự [8]. Sau đó, SAHA (vorinostat) với cấu trúc tương tự TSA là chất ức chế HDAC đầu tiên được FDA phê duyệt cho điều trị u da tế bào lympho T (CTCL) [12]. Cho đến nay, FDA đã cấp phép lưu hành trên thị trường 3 thuốc có tác dụng ức chế HDAC trong điều trị ung thư bao gồm: SAHA (2006), belinostat (2014) và panobinostat (2015).

5

Hình 1.4. Phân loại các chất ức chế HDAC. 1.2.2. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC Dựa trên cấu trúc của SAHA, các chất ức chế HDAC thường bao gồm 3 phần chính [13] (xem hình 1.5): - Nhóm nhận diện bề mặt hay còn gọi là nhóm khóa hoạt động (Capping group - SRG): là các vòng thơm hoặc peptid vòng, thường tham gia vào quá trình nhận diện với bề mặt amino acid của enzym.

- Vùng cầu nối (Linker): thường là các nhóm sơ nước, gồm các hydrocarbon thân dầu mạch thẳng hoặc vòng, có thể no hoặc không no, có vai trò tạo liên kết Van der Waals với kênh enzym, tạo nên tương tác với các thành phần nằm trên kênh và giúp cho cơ chất cố định trong kênh.

- Nhóm kết thúc gắn với kẽm (Zinc binding group - ZBG): có thể là acid hydroxamic, các thiol, nhóm o-aminoanilin của benzamid, mercaptoceton... Nhóm kết thúc gắn với kẽm tham gia tạo tương tác với ion Zn2+ tại trung tâm hoạt động của các HDAC.

6

Hình 1.5. Cấu trúc của SAHA tương ứng với cấu trúc chung của các HDACi. 1.2.3. Liên quan cấu trúc tác dụng của các chất ức chế HDAC 1.2.3.1. Ảnh hưởng của nhóm nhận diện bề mặt Cấu trúc của nhóm nhận diện bề mặt có ảnh hưởng rất nhiều đến hoạt tính của các chất ức chế HDAC. Những phân tử không có nhóm nhận diện bề mặt kị nước thì có hoạt tính yếu [37].

Trong một nghiên cứu vào năm 2006 của nhóm tác giả Juvale [22] cho thấy, sự có mặt của nhóm phenyl hay thêm một nhóm thế trên cầu nối ở vị trí sát với nhóm phenyl trong nhóm nhận diện bề mặt sẽ góp phần làm tăng hoạt tính. Ngược lại, khi có nhóm thế sát nhóm acid hydroxamic thì gây bất lợi cho hoạt tính. Tương tự nhóm phenyl, các nhóm chức và cấu trúc giàu mật độ electron ở nhóm nhận diện bề mặt đều góp phần làm tăng hoạt tính.

Cấu trúc của nhóm nhận diện bề mặt và sự tương ứng cấu trúc miệng túi enzym HDAC còn tạo nên tính chọn lọc của các chất ức chế HDAC. Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Di Micco S. đã giải thích sự ức chế chọn lọc của các hợp chất cyclopeptid thiên nhiên mang vòng lớn (azumamid E và apicidi) trên HDAC nhóm I (xem hình 1.6) [9].

O

O O O

N

OH

HN NH HN

NH HN

O

O

O

O

NH HN

O O Azumamid E

N Apicidin

O

Hình 1.6. Cấu trúc apicidin và azumamid E. 7

Nhóm đã chứng minh rằng các hợp chất mang vòng lớn như cyclopeptid cần không gian lớn trong kênh enzym để tương tác. Với kích thước đường kính miệng túi là 11 Å, các HDAC nhóm I dễ dàng cho nhóm nhận diện bề mặt cồng kềnh của các cyclopeptid vào, tương tác tạo liên kết bền vững giữa các chất ức chế HDAC với kênh enzym. Còn với các HDAC nhóm II, do bề mặt enzym lại chứa các phân tử cồng kềnh, khó tạo liên kết với các hợp chất vòng lớn [9].

1.2.3.2. Ảnh hưởng của cầu nối Trung tâm hoạt động của các HDAC là dạng túi kỵ nước, có chiều dài từ miệng túi đến ion Zn2+ ở đáy túi là 4-6 C, do vậy các chất ức chế HDAC có vùng cấu nối dài tương ứng sẽ cho hoạt tính tốt hơn [17]. Trong một nghiên cứu của công ty TopoTarget (Anh), khi thiết kế và tổng hợp gần 40 dẫn chất amid ngược (AH8) của SAHA cũng đã chỉ ra khi cầu nối 5-6 C thì hoạt tính của chúng đạt được là tối ưu [2].

1.2.3.3. Ảnh hưởng cúa nhóm kết thúc gắn kẽm (ZBG) - Cấu trúc ZBG Năm 2005, khi nghiên cứu cấu trúc của vùng chứa ion Zn2+ trong HDAC, Vanommeslaeghe K. và cộng sự thấy rằng, vùng này chứa 1 gốc Tyr và 2 nhóm HisAsp [39]. Từ đó, tác giả đã đưa ra cấu trúc của nhóm kết thúc gắn với kẽm trong phân tử chất ức chế HDAC gồm 5 phần: + Phần A: mang đôi electron không liên kết, có khả năng tạo liên kết hydro với H trong nhóm OH của tyrosin, đồng thời tạo liên kết chelat với ion Zn2+. Tuy nhiên A cũng có thể chứa hydro (để nhận điện tử từ oxy trong nhóm phenol của tyrosin tạo liên kết hydro). + Phần B: nối ZBG với vùng cầu nối, do đó B phải tạo ít nhất 3 liên kết. + Phần C: chứa hydro linh động, tạo liên kết hydro với His132. + Phần D: là nhóm cho proton cho His131, tạo liên kết tĩnh điện với His131 và liên kết chelat mạnh với Zn2+. + Phần L: vùng cầu nối.

1.2.3.4. Ảnh hưởng của các yếu tố khác - Năng lượng solvat hóa của phân tử tăng, hoạt tính ức chế HDAC giảm [41].

8

- Các phân tử thân dầu thường có hoạt tính tốt, tuy nhiên kích thước phân tử quá lớn sẽ bất lợi với hoạt tính [22]. Khi phân tử thuốc quá thân dầu hoặc chứa quá nhiều vòng 6 cạnh sẽ tạo hiệu ứng không gian, do vậy hoạt tính của chất sẽ giảm [5]. Những chất có tính thân dầu - thân nước cân bằng thường có lợi cho hoạt tính của các chất ức chế HDAC-6 [26].

- Phân tử có xu hướng cầu hóa sẽ làm thu nhỏ vùng cho dung môi thâm nhập do các nhóm thân nước bị che khuất. Cấu trúc phân tử càng có xu hướng “mở”, hoạt tính ức chế HDAC sẽ tăng [40].

- Phân tử ở dạng gấp khúc là điều kiện tiên quyết cho tác dụng ức chế chọn lọc HD1-A (tương đồng HDAC nhóm II). Ngược lại, khi phân tử ở dạng thẳng lại cho tác dụng ức chế chọn lọc trên HD1-B (tương đồng HDAC nhóm I) [33].

1.3. MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TRONG TỔNG HƠP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI 1.3.1. Thay đổi nhóm khóa hoạt động Năm 2011, với việc sử dụng SAHA như là một chất dẫn đường, NCS Đào Thị Kim Oanh và cộng sự [1] đã nghiên cứu dãy chất mang nhóm khóa hoạt động benzothiazol với cầu nối là từ 2-6 nhóm methylen. Kết quả cho thấy, việc thay nhóm phenyl của SAHA bằng nhóm benzothiazol tạo ra các chất có hoạt tính khá tốt, thậm chí chất với cầu nối 6C còn có hoạt tính mạnh hơn cả SAHA (xem hình 1.7).

Hình 1.7. Cấu trúc chung các acid hydroxamic mang khung benzothiazol.

Trên thế giới, năm 2013, Feng T. và cộng sự [14] đã nghiên cứu các chất ức chế HDAC dẫn xuất N-hydroxyfurylacrylamid có mạch nhánh ở nhóm khoá hoạt động.

Các hợp chất này được thử hoạt tính kháng ung thư in vitro trên các dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt (PC-3), tế bào ung thư ruột kết (HCT116), tế bào ung thư phổi (A549), tế bào ung thư gan (HepG2) và khả năng ức chế chọn lọc các enzym HDAC-

9

1, HDAC-4, HDAC-6. Kết quả nghiên cứu cho thấy các chất 3a, 3b, 3c, 3d cho tác dụng chọn lọc tốt nhất trên HDAC-6 đồng thời 3a, 3b, 3c còn có khả năng ức chế HDAC-1. Qua nghiên cứu docking, tác giả giải thích tác dụng chọn lọc HDAC-6 của 3b là do mạch nhánh cồng kềnh ở nhóm khoá hoạt động có kích thước đủ lớn, vừa khít với rãnh trên bề mặt HDAC-6, nhưng không khít với rãnh trên bề mặt HDAC-1 và HDAC-4 [14] (xem hình 1.8).

Hình 1.8. Cấu trúc chung các chất trong nghiên cứu của Feng T. Năm 2016, Zhang Z. và cộng sự [42] đã thiết kế, tổng hợp và thử hoạt tính in vitro các acid hydroxamic mà trong nhóm khóa bề mặt có chứa khung dimethylisoxazol. Kết quả nghiên cứu chỉ ra các dẫn chất có hoạt tính tương đối tốt, ví dụ như chất 4 dưới đây có tác dụng ức chế mạnh HDAC-1 với IC50 = 0,15 μM (xem hình 1.9).

Hình 1.9. Cấu trúc chung các chất trong nghiên cứu của Zhang Z. 1.3.2. Thay đổi cầu nối Bên cạnh hướng thay đổi nhóm khóa hoạt động, một số nhà khoa học lại tập trung vào việc thay đổi cầu nối như thay đổi nhóm thế, thay đổi mạch carbon no bằng các mạch chứa liên kết đôi, vòng thơm hay dị vòng nhằm tăng tác dụng ức chế HDAC cũng như tăng tính chọn lọc của các thuốc mới sau này.

10

Cũng trong nghiên cứu của mình năm 2011, cùng với việc thay nhóm khóa hoạt động là benzothiazol, tác giả Đào Thị Kim Oanh còn thay đổi chiều dài cầu nối từ 2 đến 6C. Kết quả thử hoạt tính sinh học trên các HDAC-3,4 của cầu nối 6C được cải thiện đồng thời ức chế 5 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 trung bình là 0,81 µg/ml [1], [32].

Gần đây nhất, NCS Đỗ Thị Mai Dung và cộng sự [11] đã thiết kế nghiên cứu và tổng hợp các hydroxamic mang khung 2-oxoindolin có nhóm thế ở vị trí số 3. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hầu hết các chất trong dãy đều có hoạt tính khá tốt trên các dòng tế bào thử nghiệm (chất 5a, 5b) (xem hình 1.10).

Hình 1.10. Cấu trúc chung của một số dẫn chất mang khung 2-oxoindolin.

Nghiên cứu cấu trúc không gian của các HDAC, các nhà khoa học phát hiện rằng trung tâm hoạt động của HDAC-1 nhỏ hơn trung tâm hoạt động của HDAC-6 [3]. Do vậy, nhằm tăng tác dụng chọn lọc vào HDAC-6, nhóm nghiên cứu của Lee J.H. và cộng sự đã thay thế cầu nối mạch thẳng của SAHA bằng các cầu nối cồng kềnh hơn về không gian. Kết quả cho thấy hợp chất N-hydroxy-4-(2-[(2hydroxyethyl)(phenyl)amino]-2-oxoethyl)benzamid (HPOB) 6 cho hoạt tính ức chế chọn lọc HDAC-6 in vitro và in vivo [27] (xem hình 1.11).

Hình 1.11. Cấu trúc HPOB trong nghiên cứu của Lee J.H. và cộng sự.

11

1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC VÀ HÓA HỌC CLICK 1.4.1. Các phương pháp tổng hợp acid hydroxamic Acid hydroxamic là sản phẩm thu được của phản ứng giữa các dẫn chất của acid carboxylic như ester, clorid acid, anhydrid… với hydroxylamin. Dưới đây, khóa luận xin trình bày một số phương pháp phổ biến tổng hợp acid hydroxamic đi từ nguyên liệu ester và acid carboxylic cho tác dụng với hydroxylamin.

1.4.1.1. Tổng hợp acid hydroxamic từ ester Đây là phương pháp được nhiều nhóm nghiên cứu áp dụng để tổng hợp các acid hydroxamic, ví dụ như Andrianov và cộng sự (năm 2008) [2] hay Hanessian và cộng sự (năm 2007) [18]. Các nhóm nghiên cứu trên đều tổng hợp acid hydroxamic từ methyl ester phản ứng với hydroxylamin trong dung môi MeOH ở môi trường kiềm NaOH. Phản ứng xảy ra ở điều kiện từ 0-25°C với hiệu suất khá cao (xem sơ đồ 1.1).

Sơ đồ 1.1. Tổng hợp một số dẫn chất amid ngược của SAHA. Tuy nhiên, ở một số trường hợp, điều kiện phản ứng và dung môi phản ứng có thể thay đổi phụ thuộc vào bản chất của ester tham gia. Ví dụ, trong nghiên cứu tổng hợp các acid hydroxamic mang cầu nối chứa vòng triazol giữa methyl ester với hydroxylamin của Chen và cộng sự [6], dung môi phản ứng lại là hỗn hợp KCN:THF (1:1) ở nhiệt độ phòng. Hiệu suất phản ứng vẫn đạt trên 80%.

1.4.1.2. Tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic Ngoài phương pháp tổng hợp acid hydroxamic từ ester, người ta có thể đi từ acid carboxylic nếu phản ứng trực tiếp giữa methyl ester và hydroxylamin khó xảy ra. Khi đó, trong một số trường hợp cần sử dụng tác nhân hoạt hóa acid carboxylic và sử dụng hydroxylamin có nhóm bảo vệ -OH [1].

12

Năm 2008, trong nghiên cứu tổng hợp acid phenylthiazol hydroxamic, Kozikowski và cộng sự [26] đã sử dụng tác nhân isobutyl cloroformat để hoạt hóa acid carboxylic trong điều kiện 0°C tạo thành anhydrid ngay trong phản ứng. Tuy nhiên hiệu suất của phương pháp này không cao, chỉ khoảng 26-30% (xem sơ đồ 1.2).

Sơ đồ 1.2. Tổng hợp các acid phenylthiazol hydroxamic.

Như vậy, trong hai phương pháp tổng hợp acid hydroxamic từ 2 nguồn ester và acid carboxylic, phương pháp đi từ ester có điều kiện phản ứng đơn giản hơn và cho hiệu suất cao hơn. Tuy nhiên, phụ thuộc vào nguyên liệu ban đầu và sản phẩm, các nhà hóa học có thể chọn phương pháp và các tác nhân hoạt hóa phù hợp.

1.4.2. Hóa học Click Khái niệm “hóa học Click’’ lần đầu tiên được đưa ra vào năm 2001 bởi ba nhà khoa học Kolb H. C., Finn M. G. và Sharpless K. B. mô tả quá trình tổng hợp một chất mới bằng cách kết nối những phân tử cấu trúc nhỏ lại với nhau thông qua liên kết dị tố.

Theo Sharpless và cộng sự, phản ứng Click là “những phản ứng lưỡng cực, phạm vi rộng, hiệu suất cao, cho các sản phẩm phụ không độc hại, có thể được loại bỏ bằng những phương pháp đơn giản như kết tinh hoặc chưng cất và có tính chọn lọc lập thể” [24], [25].

1.4.2.1. Đặc điểm của phản ứng Click Phản ứng Click có một số đặc điểm: điều kiện đơn giản (phản ứng không nhạy cảm với oxy và nước), nguyên liệu và tác nhân sẵn có, không sử dụng dung môi hoặc nếu sử dụng thì chỉ dùng các dung môi dễ kiếm, dễ tách loại và tinh chế sản phẩm.

Quá trình tinh chế có thể sử dụng các phương pháp đơn giản như kết tinh hoặc chưng cất. Sản phẩm thu được bền vững trong điều kiện thường [24].

13

1.4.2.2. Một số phản ứng Click thường gặp Các phản ứng Click hay được sử dụng trong tổng hợp hữu cơ bao gồm [24]: - Phản ứng cộng đóng vòng các hợp chất không no, đặc biệt là phản ứng đóng vòng 1,3-lưỡng cực bao gồm cả phản ứng Diels-Alder. Trong đó, phản ứng giữa azid và alkyn tạo vòng 1,2,3-triazol có tính ứng dụng cao của hóa học Click.

- Phản ứng mở vòng ái nhân, đặc biệt là các dị vòng ái điện tử như epoxid, aziridin.

- Phản ứng không aldol hóa của nhóm carbonyl như sự hình thành ure, thioure, dị vòng thơm, oxim ether, hydrazon, amid.

- Phản ứng cộng vào liên kết bội carbon-carbon, đặc biệt là các phản ứng oxy hóa như epoxid hóa, dihydroxyl hóa, aziridin hóa, phản ứng cộng sulfenyl halogenid, phản ứng cộng Micheal của các hợp chất Nu-H.  Phản ứng đóng vòng alkyn-azid xúc tác Cu(I) (CuAAC) Cả alkyn và azid đều là những nhóm chất nhiều năng lượng nhưng khả năng phản ứng kém. Trong tự nhiên, phản ứng giữa hai nhóm chất này xảy ra chậm, cần điều kiện nhiệt độ cao và không chọn lọc, thường tạo hai đồng phân cấu tạo có nhóm thế ở vị trí 1,4 và 1,5 với tỉ lệ ngang nhau.

Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Fokin và Sharpless [35], Meldal và cộng sự [38] đã độc lập công bố về ảnh hưởng của xúc tác Cu(I) đến tốc độ phản ứng Huisgen.

Với quy trình mới này phản ứng xảy ra nhanh, hoàn toàn và chọn lọc cho ra sản phẩm chính là sản phẩm thế 1,4-1,2,3-triazol.

Sơ đồ 1.3. Phản ứng đóng vòng 1,3-lưỡng cực giữa alkyn và azid với xúc tác Cu(I).

14

Một số nhóm xúc tác thường dùng trong phản ứng CuAAC: - Các hợp chất Cu(I) (CuBr hoặc CuOAc) với các phối tử (ligand) base hoặc amin và một tác nhân khử (thường dùng natri ascorbat) để ức chế quá trình oxy hóa hiếu khí cho Cu(II).

- Muối Cu(II) (thường dùng CuSO4) cùng với một chất khử (natri ascorbat) để tạo thành hợp chất Cu(I).

- Một số muối Cu(II) hoặc phức chất như Cu(OAc)2 được sử dụng luôn làm xúc tác mà không cần thêm chất khử vì chúng là những chất oxy hóa mạnh dễ dàng bị alkyn khử hóa thành Cu(I).

- Kim loại Cu được oxy hóa thành Cu(I).

Hiện nay, các chất xúc tác cho phản ứng CuAAC vẫn đang tiếp tục được tìm kiếm nhằm nâng cao hiệu quả phản ứng. Gần đây, nhóm nghiên cứu của Lipshutz và cộng sự [29] đã sử dụng chất xúc tác Cu trong than hoạt tính (Copper-in-charcoal), là chất xúc tác dị thể đơn giản, không tốn kém và hiệu quả cao. Nó có thể kết hợp được trong nhiều loại dung môi, loại được dễ dàng bằng phương pháp lọc và tái sử dụng được ít nhất trong hai vòng phản ứng mà không bị mất hoạt tính.

Một số dung môi thường dùng trong phản ứng đóng vòng alkyn-azid xúc tác Cu(I) theo Meldal và Tornøe [19]: - Dung môi không phân cực: toluen, cloroform, dicloromethan.

- Dung môi phân cực yếu: tetrahydrofuran, pyridin, dioxan.

- Dung môi phân cực: aceton, MeCN, DMF, DMSO, alcol.

Ngoài ra, người ta còn có thể sử dụng hỗn hợp nước và các dung môi aceton, THF, MeCN, DMSO, đi kèm theo đó là các nhóm xúc tác Cu(0) hoặc CuSO4 kèm chất khử như natri ascorbat. Ngược lại, với nhóm dung môi không chứa nước thường được sử dụng với nhóm xúc tác Cu(I).

Như vậy, với xúc tác Cu(I) trong dung môi phù hợp, phản ứng đóng vòng Huisgen xảy ra nhanh, hiệu suất cao, chọn lọc cho ra sản phẩm thế 1,4 của vòng 1,2,3triazol.

15

Vòng 1,2,3-triazol tương đối trơ về mặt hóa học, không bị thủy phân, hầu như không bị khử hay oxy hóa, có moment lưỡng cực lớn (~ 5D), dễ dàng kết hợp với mục tiêu sinh học thông qua liên kết hydro và tương tác lưỡng cực-lưỡng cực. Nó có thể coi như là một nhóm liên kết (CU) được đưa vào cấu trúc nhằm tăng khả năng tương tác giữa nhóm khóa hoạt động với các amino acid bề mặt gần lối vào túi thân dầu của HDAC, đồng thời cải thiện dược động học và tăng tính chọn lọc với đích cụ thể, hạn chế độc tính của thuốc hơn so với khi sử dụng nhóm amid hay ceton [6].

Từ những kết quả nghiên cứu về HDAC, các chất ức chế HDAC cũng như về hóa học Click đã tạo nền tảng cho khóa luận tiếp cận hướng nghiên cứu thiết kế, tổng hợp

một

số

N-hydroxybutanamid/pentanamid

mang

khung

1-(triazol-4-

yl)methylindolin-2-on với vòng 1,2,3-triazol là cầu nối. Khóa luận hy vọng tìm ra các dẫn chất hydroxamic mới có tác dụng ức chế HDAC với hoạt tính kháng tế bào ung thư vượt trội.

16

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 2.1.1. Hóa chất Dung môi, hoá chất dùng phân tích, kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn HPLC. Các dung môi, hóa chất dùng cho tổng hợp hóa học được nhập từ công ty SigmaAldrich hoặc Merck. Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp, không trải qua thêm bất kỳ quá trình tinh chế nào. Bao gồm: - Các isatin:

- Propargyl bromid

+ Isatin

- Natri azid

+ 5-Fluoroisatin

- Methyl 4-bromobutanoat

+ 5-Bromolisatin

- Methyl 5-bromopentanoat

+ 5-Methoxyisatin

- Hydroxylamin hydroclorid

Các dung môi, hóa chất khác như: nước cất, N,N-dimethylformamid (DMF), acetonitril (MeCN), dicloromethan (DCM), methanol (MeOH), acid acetic (AcOH), aceton, ethyl acetat, K2CO3, KI, NaCl, Na2SO4, NaOH, HCl, CuI, FeCl3…

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ - Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC. - Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 và 100 ml có nút mài, bình nón, bình chiết, phễu thủy tinh, pipet, ống đong, cốc có mỏ các loại.

- Bình chạy sắc ký Camag.

- Bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh để chạy sắc ký lớp mỏng.

- Đèn tử ngoại VILBER LOURMAT bước sóng 254 nm và 366 nm.

- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimadzu.

- Máy cất quay chân không Buchi R-200.

- Tủ lạnh, tủ sấy Memmert, máy siêu âm.

- Máy Melting point apparatus Smp3 để xác định nhiệt độ nóng chảy.

- Máy Cary 660 FTIR để xác định phổ IR.

17

- Máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM để ghi phổ MS, đặt tại khoa Hóa học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

- Máy cộng hưởng từ Bruker AV-500 để ghi phổ 1H-NMR,

13

C-NMR đặt tại

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1. Tổng hợp hóa học - Tổng hợp 5 chất:  N-hydroxy-4-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3triazol-1-yl)butanamid (VIa).  N-hydroxy-4-(4-((5-fluoro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)1H-1,2,3-triazol-1-yl)butanamid (VIb).  N-hydroxy-4-(4-((5-bromo-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)1H-1,2,3-triazol-1-yl)butanamid (VIc).  N-hydroxy-4-(4-((3-(hydroxyimino)-5-methoxy-2-oxoindolin-1-yl)methyl)1H-1,2,3-triazol-1-yl)butanamid (VId).  N-hydroxy-5-(4-((3-(hydroxyimino)-5-methoxy-2-oxoindolin-1-yl)methyl)1H-1,2,3-triazol-1-yl)pentanamid (X).

- Kiểm tra độ tinh khiết.

- Xác định cấu trúc của các chất vừa tổng hợp được.

2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được - Thử tác dụng ức chế HDAC. - Thử độc tính trên một số tế bào ung thư: ung thư đại tràng (SW620), ung thư tuyến tụy (AsPC-1), ung thư biểu mô tuyền tiền liệt (PC-3).

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Tổng hợp hóa học 2.3.1.1. Tổng hợp - Dựa trên các nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tiến hành tổng hợp các chất theo thiết kế. Các phản ứng sử dụng: + Phản ứng N-alkyl hoá với tác nhân propargyl bromid.

18

+ Phản ứng Click 1,2,3-triazol với tác nhân là dẫn chất của azid, xúc tác CuI. + Một số phản ứng cơ bản khác.

- Theo dõi tiến trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC).

2.3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC (xác định thời điểm kết thúc phản ứng, độ tinh khiết của sản phẩm sau quá trình tinh chế) và xác định nhiệt độ nóng chảy.

2.3.1.3. Xác định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được Các chất sau khi được tổng hợp và đánh giá sơ bộ là tinh khiết được xác định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR).

- Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy Cary 660 FTIR tại bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội với kỹ thuật viên nén KBr, quét phổ trong vùng 4000400 cm-1. Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân không để loại bỏ hơi ẩm. Ghi phổ ở độ phân giải 4 cm-1.

- Phổ khối lượng (MS): được ghi bằng máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM tại Khoa Hóa - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, hoạt động theo phương pháp ion hóa phun bụi điện tử ESI, chế độ ESI(-)-MS, dung môi MeOH. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và

13

C-NMR): được ghi bằng máy

Bruker AV-500 tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz. Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300 K, dung môi DMSO-d6.

2.3.2. Thử tác dụng sinh học 2.3.2.1. Thử tác dụng ức chế HDAC

19

Tác dụng ức chế HDAC của dẫn chất tổng hợp được thử tại Khoa Dược trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc. Enzym HDAC-2 được cung cấp bởi BPS Bioscience (San Diego, CA, USA) sử dụng bộ kit định lượng Fluoregenic HDAC Assay Kit (BPS Bioscience).

Kết quả độ hấp thụ được đưa vào phần mềm excel tính toán thu được phần trăm trung bình mẫu thử gắn với HDAC. Phần trăm này chuyển sang phần mềm GraphPad prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) để tính toán IC50. Độ lệch chuẩn tương đối không quá 10%.

2.3.2.2. Thử độc tính tế bào Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người (thử độc tính tế bào) in vitro được tiến hành tại Khoa Dược, Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc. Dòng tế bào thử nghiệm: PC-3 (tế bào ung thư tuyến tiền liệt), SW620 (tế bào ung thư đại tràng) và AsPC-1 (tế bào ung thư tuyến tuỵ). Các dòng tế bào ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò).

Thử độc tính tế bào theo phương pháp Sulforhodamin B (SRB). * Nguyên tắc thử Dựa trên khả năng gắn thuốc nhuộm với các acid amin cơ bản của protein trong tế bào, sử dụng phương pháp đo màu để tính tổng lượng protein, từ đó suy ra số lượng tế bào. * Tính kết quả Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy). Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 3 lần đo độc lập với độ khác nhau không quá 5%. Giá trị IC50 được tính dựa theo phương pháp Probits.

20

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. HÓA HỌC 3.1.1. Tổng hợp hóa học Quá trình tổng hợp 5 chất VIa-d, X trong khóa luận được thực hiện theo sơ đồ quy trình chung như sau:

Sơ đồ 3.1. Quy trình tổng hợp chung.

Tác nhân và điều kiện: 1,5: NaN3, MeOH, 6 h.

2: Propargyl bromid, K2CO3, KI, DMF, 50°C, 3 h.

3,6: Acetonitril, CuI, 50°C, 4 h.

4,7: NH2OH.HCl, NaOH, MeOH-H2O, -5°C, 30 phút.

3.1.1.1. Tổng hợp nguyên liệu methyl 4-azidobutanoat (II) Hợp chất II được tổng hợp từ methyl 4-bromobutanoat (I) bằng phản ứng thế nucleophin với tác nhân NaN3 theo sơ đồ 3.2:

21

Sơ đồ 3.2. Quy trình tổng hợp chất II.  Tiến hành phản ứng: - Hòa tan 1,09 g (6,0 mmol) chất I và 0,59 g (9,0 mmol) NaN3 vào 20,0 ml MeOH trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 ml.

- Khuấy ở nhiệt độ phòng trong 12 h.  Xử lý phản ứng: - Cất quay chân không ở 60°C loại dung môi.

- Phân tán cắn thu được vào 50 ml DCM. - Lọc bỏ tủa NaN3 và NaBr không tan.

- Cất quay chân không ở 40°C loại dung môi.

- Bảo quản sản phẩm trong ngăn mát tủ lạnh ở 0-5°C, đậy nút kín.  Kết quả: + Cảm quan: Chất lỏng, màu vàng nhạt. + Hiệu suất: 85,08% (0,73 g).

3.1.1.2. Tổng hợp nguyên liệu methyl 5-azidopentanoat (VIII) Hợp chất VIII được tổng hợp từ methyl 5-bromopentanoat (VII) bằng phản ứng thế nucleophin với tác nhân NaN3 theo sơ đồ 3.3:

Sơ đồ 3.3. Quy trình tổng hợp chất VIII. Chất VIII được tổng hợp từ 0,39 g (2,0 mmol) chất VII. Quy trình tổng hợp được thực hiện tương tự như tổng hợp chất II. Kết thu được như sau: + Cảm quan: Chất lỏng, màu vàng nhạt. + Hiệu suất: 82,8% (0,26 g).

3.1.1.3. Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-4-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)butanamid (VIa) 22

a. Tổng hợp chất IVa: Tổng hợp chất 1-(prop-2-yn-1-yl)indolin-2,3-dion (IVa) từ nguyên liệu isatin (IIIa) qua phản ứng alkyl hóa với propargyl bromid có mặt xúc tác là K2CO3 và KI theo sơ đồ 3.4 sau:

Sơ đồ 3.4. Quy trình tổng hợp chất IVa.  Tiến hành phản ứng: - Hòa tan 0,29 g (2,0 mmol) chất IIIa vào 1,5 ml DMF khan trong bình cầu sạch đáy tròn dung tích 50 ml; thêm 0,28 g (2,0 mmol) K2CO3.

- Khuấy hỗn hợp trong bình ở 50ºC trong 1 h đến khi toàn bộ khối phản ứng đổi màu sẫm hoàn toàn.

- Thêm 0,33 g (2,0 mmol) KI và 0,29 g (2,4 mmol) propargyl bromid vào bình phản ứng.

- Tiếp tục tiến hành phản ứng trong 3 h vẫn ở 50ºC. - Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là DCM:MeOH = 100:1.  Xử lý phản ứng: - Làm lạnh bình phản ứng.

- Trung tính hóa hỗn hợp phản ứng bằng HCl 5% lạnh.

- Thêm vào 40 ml nước cất lạnh để tạo tủa.

- Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh.

- Sấy khô tủa bằng tủ sấy ở 60ºC.  Kết quả: - Cảm quan: Chất rắn, màu vàng cam.

- Hiệu suất: 89,2% (0,33 g).

- tonc = 148,3-149,1ºC. - Rf = 0,61 (với hệ dung môi là DCM:MeOH = 100:1).

23

b. Tổng hợp chất Va: Điều chế chất methyl 4-(4-((2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1yl)butanoat (Va) từ chất IVa thông qua phản ứng Click với chất II sử dụng xúc tác là CuI. Phản ứng theo sơ đồ 3.5 sau:

Sơ đồ 3.5. Quy trình tổng hợp chất Va.  Tiến hành phản ứng: - Hòa tan 0,19 g (1,0 mmol) chất IVa, 0,17 g (1,2 mmol) chất II và 0,19 g (1,0 mmol) CuI vào 4,0 ml MeCN trong bình cầu sạch dung tích 50 ml.

- Khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ 50oC trong 3 h.

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là DCM:MeOH = 10:1.  Xử lý phản ứng: - Cất quay chân không ở 60ºC loại dung môi MeCN. - Phân tán cắn vào 30 ml DCM, gia nhiệt đến 40ºC để hòa tan hết chất Va và còn CuI không tan lắng ở đáy bình.

- Lọc loại bỏ CuI, làm khan dịch lọc bằng Na2SO4.

- Cất quay loại dung môi thu hỗn hợp 2 chất Va và II (có thể còn dư).

- Hòa tan cắn vào một lượng MeCN tối thiểu, thêm từ từ nước cất vào đến khi thấy tủa không tăng nữa thì dừng. Để lạnh để ổn định tủa.

- Gạn, lọc lấy tủa, rửa tủa với nhiều lần nước cất để loại chất II. - Sấy khô tủa bằng tủ sấy ở 60ºC.  Kết quả: - Cảm quan: Chất rắn, màu da cam.

- Hiệu suất: 88,4 % (0,29 g).

- tºnc = 161,2-162,4°C. - Rf = 0,45 (với hệ dung môi DCM:MeOH = 10:1). c. Tổng hợp chất VIa: 24

Dẫn chất N-hydroxy-4-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H1,2,3-triazol-1-yl)butanamid (VIa) được tổng hợp qua phản ứng tạo hydroxamic giữa chất Va và hydroxylamin hydroclorid theo sơ đồ phản ứng 3.6 sau:

Sơ đồ 3.6. Quy trình tổng hợp dẫn chất VIa.  Tiến hành phản ứng: - Phân tán 0,20 g (0,6 mmol) chất Va và 0,42 g (6,0 mmol) NH2OH.HCl vào 5,0 ml MeOH trong bình cầu sạch dung tích 50 ml.

- Làm lạnh bình phản ứng đến -5ºC bằng hỗn hợp đá muối.

- Khuấy phân tán hỗn hợp trong bình phản ứng.

- Chuẩn bị dung dịch NaOH bão hòa trong nước, đã được làm lạnh. Chuyển từ từ dung dịch NaOH vào bình phản ứng đến pH = 12.

- Tiếp tục cho phản ứng thêm 30 phút ở -5ºC. - Theo dõi phản ứng bằng thuốc thử FeCl3 5% và TLC, tiến trình thực hiện như sau: + Lấy 0,05 ml dịch từ bình phản ứng lên khay sứ, acid hóa bằng dung dịch HCl 5%. Nhỏ 1 giọt thuốc thử FeCl3 5% vào hỗn hợp trên, nếu thấy xuất hiện màu đỏ vang chứng tỏ đã có sản phẩm acid hydroxamic. + Acid hóa 0,05 ml dịch lấy từ bình phản ứng bằng dung dịch HCl loãng 5% trong vial, thêm ethyl acetat để chiết lấy sản phẩm. Đưa pha dung môi hữu cơ lên bản mỏng. Tiến hành TLC với pha động DCM:MeOH = 5:2. Phản ứng kết thúc khi thấy vết ester Va đã mất đi hoàn toàn.  Xử lý phản ứng: - Trung tính hóa hỗn hợp trong bình phản ứng bằng HCl lạnh 5%.

- Thêm vào 20 ml nước cất lạnh.

- Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh.

- Tinh chế sản phẩm: 25

+ Kết tinh lại bằng hệ MeOH - H2O: Hòa tan sản phẩm thu được trong lượng MeOH tối thiểu. Nhỏ từ từ nước cất vào cho đến khi bắt đầu xuất hiện tủa mịn và ổn định. Để lạnh ở 0-5ºC trong 48 h. + Lọc tủa, sấy ở 60ºC.  Kết quả: - Cảm quan: Chất rắn, màu vàng.

- Hiệu suất: 53,3% (0,11 g).

- Nhiệt độ nóng chảy (tºnc) và Rf được trình bày trong bảng 3.2.

- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR,

13

C-NMR. Kết quả được

trình bày cụ thể trong bảng 3.3, 3.4, 3.5 và 3.6.

3.1.1.4. Tổng hợp dẫn chất 4-(4-((5-fluoro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-N-hydroxybutanamid (VIb) Dẫn chất VIb được tổng hợp qua chuỗi các phản ứng được trình bày theo sơ đồ 3.7.

Sơ đồ 3.7. Quy trình tổng hợp dẫn chất VIb. Tác nhân và điều kiện: i) Propargyl bromid, K2CO3, KI, DMF, 50°C, 3 h. ii) Acetonitril, CuI, 50°C, 3 h. iii) Hydroxylamin hydroclorid, NaOH, MeOH-H2O, -5°C, 30 phút.

a. Tổng hợp chất IVb:

26

Tổng hợp chất 5-fluoro-1-(prop-2-yn-1-yl)indolin-2,3-dion (IVb) từ nguyên liệu 5-fluoroisatin (IIIb) bằng phản ứng alkyl hóa với propargyl bromid có mặt xúc tác là K2CO3 và KI.  Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất IVa, sử dụng 0,33 g (2,0 mmol) chất IIIb.  Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất IVa.  Kết quả: - Cảm quan: Chất rắn, màu cam vàng.

- Hiệu suất: 88,7% (0,36 g).

- tºnc = 138,3-139,6ºC. - Rf = 0,62 (với hệ dung môi là DCM:MeOH = 100:1). b. Tổng hợp chất Vb: Điều chế chất methyl 4-(4-((5-fluoro-2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3triazol-1-yl)butanoat (Vb) từ chất IVb thông qua phản ứng Click với chất II sử dụng xúc tác là CuI.  Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất Va, sử dụng 0,20 g (1,0 mmol) chất IVb.  Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất Va.  Kết quả: - Cảm quan: Chất rắn, màu da cam.

- Hiệu suất: 86,7% (0,30 g).

- tºnc = 195,3-196,8ºC. - Rf = 0,50 (với hệ dung môi là DCM:MeOH = 10:1). c. Tổng hợp chất VIb: Dẫn

chất

4-(4-((5-fluoro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-

1,2,3-triazol-1-yl)-N-hydroxybutanamid (VIb) được tổng hợp qua phản ứng tạo hydroxamic giữa chất Vb và hydroxylamin hydroclorid.  Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng 0,21 g (0,6 mmol) chất Vb. 27

 Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng hệ dung môi kết tinh lại là MeOH - H2O.  Kết quả: - Cảm quan: Chất rắn, màu vàng.

- Hiệu suất: 55,3% (0,12 g).

- Nhiệt độ nóng chảy (tºnc) và Rf được trình bày trong bảng 3.2.

- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR,

13

C-NMR. Kết quả được

trình bày cụ thể trong bảng 3.3, 3.4, 3.5 và 3.6.

3.1.1.5. Tổng hợp dẫn chất 4-(4-((5-bromo-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-N-hydroxybutanamid (VIc) Dẫn chất VIc được tổng hợp theo các phản ứng trình bày trong sơ đồ 3.8:

Sơ đồ 3.8. Quy trình tổng hợp dẫn chất VIc. Tác nhân và điều kiện: i) Propargyl bromid, K2CO3, KI, DMF, 50°C, 4 h. ii) Acetonitril, CuI, 50°C, 3 h. iii) Hydroxylamin hydroclorid, NaOH, MeOH-H2O, -5°C, 30 phút.

a. Tổng hợp chất IVc: Tổng hợp chất 5-bromo-1-(prop-2-yn-1-yl)indolin-2,3-dion (IVc) từ nguyên liệu 5-bromoisatin (IIIc) bằng phản ứng alkyl hóa với propargyl bromid có mặt xúc tác là K2CO3 và KI.  Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất IVa, sử dụng 0,45 g (2,0 mmol) chất IIIc. 28

 Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất IVa.  Kết quả: - Cảm quan: Chất rắn, màu vàng.

- Hiệu suất: 89,0% (0,47 g).

- tºnc = 157,2-158,8°C. - Rf = 0,63 (với hệ dung môi là DCM:MeOH = 100:1). b. Tổng hợp chất Vc: Điều chế chất methyl 4-(4-((5-bromo-2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3triazol-1-yl)butanoat (Vc) từ chất IVc thông qua phản ứng Click với chất II sử dụng xúc tác là CuI.  Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất Va, sử dụng 0,26 g (1,0 mmol) chất IVc.  Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất Va.  Kết quả: - Cảm quan: Chất rắn, màu da cam.

- Hiệu suất: 88,5% (0,36 g).

- tºnc = 177,9-179,2ºC. - Rf = 0,54 (với hệ dung môi là DCM:MeOH = 10:1). c. Tổng hợp chất VIc: Dẫn chất 4-(4-((5-bromo-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H1,2,3-triazol-1-yl)-N-hydroxybutanamid (VIc) được tổng hợp qua phản ứng tạo hydroxamic giữa chất Vc và hydroxylamin hydroclorid.  Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng 0,24 g (0,6 mmol) chất Vc.  Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng hệ dung môi kết tinh lại là MeOH - H2O.  Kết quả: - Cảm quan: Chất rắn, màu vàng.

- Hiệu suất: 51,3% (0,13 g).

29

- Nhiệt độ nóng chảy (tºnc) và Rf được trình bày trong bảng 3.2.

- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR,

13

C-NMR. Kết quả được

trình bày cụ thể trong bảng 3.3, 3.4, 3.5, 3.6.

3.1.1.6. Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-4-(4-((3-(hydroxyimino)-5-methoxy-2oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)butanamid (VId) Dẫn chất VId được tổng hợp theo các phản ứng trình bày trong sơ đồ 3.9:

Sơ đồ 3.9. Quy trình tổng hợp dẫn chất VId. Tác nhân và điều kiện: i) Propargyl bromid, K2CO3, KI, DMF, 50°C, 4 h. ii) Acetonitril, CuI, 50°C, 3 h. iii) Hydroxylamin hydroclorid, NaOH, MeOH-H2O, -5°C, 30 phút.

a. Tổng hợp chất IVd: Tổng hợp chất 5-methoxy-1-(prop-2-yn-1-yl)indolin-2,3-dion (IVd) từ nguyên liệu 5-methoxyisatin (IIId) bằng phản ứng alkyl hóa với propargyl bromid có mặt xúc tác là K2CO3 và KI.  Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất IVa, sử dụng 0,35 g (2,0 mmol) chất IIId.  Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất IVa.  Kết quả: - Cảm quan: Chất rắn, màu nâu sẫm.

- Hiệu suất: 76,7% (0,33 g).

30

- tºnc = 143,6-144,8ºC. - Rf = 0,53 (với hệ dung môi là DCM:MeOH = 100:1). b. Tổng hợp chất Vd: Điều chế chất methyl 4-(4-((5-methoxy-2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H1,2,3-triazol-1-yl)butanoat (Vd) từ chất IVd thông qua phản ứng Click với chất II sử dụng xúc tác là CuI.  Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất Va, sử dụng 0,22 g (1,0 mmol) chất IVd.  Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất Va.  Kết quả: - Cảm quan: Chất rắn, màu nâu sẫm.

- Hiệu suất: 83,8% (0,30 g).

- tºnc = 193,2-194,8ºC. - Rf = 0,51 (với hệ dung môi là DCM:MeOH = 10:1). c. Tổng hợp chất VId: Dẫn

chất

N-hydroxy-4-(4-((3-(hydroxyimino)-5-methoxy-2-oxoindolin-1-

yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)butanamid (VId) được tổng hợp qua phản ứng tạo hydroxamic giữa chất Vd và hydroxylamin hydroclorid.  Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng 0,21 g (0,6 mmol) chất Vd.  Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng hệ dung môi kết tinh lại là MeOH - H2O.  Kết quả: - Cảm quan: Chất rắn, màu nâu.

- Hiệu suất: 53,5% (0,12 g).

- Nhiệt độ nóng chảy (tºnc) và Rf được trình bày trong bảng 3.2.

- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, trình bày cụ thể trong bảng 3.3, 3.4, 3.5 và 3.6.

31

13

C-NMR. Kết quả được

3.1.1.7. Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-5-(4-((3-(hydroxyimino)-5-methoxy-2oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)pentanamid (X) Dẫn chất X được tổng hợp theo các phản ứng trình bày trong sơ đồ 3.10:

Sơ đồ 3.10. Quy trình tổng hợp dẫn chất X. Tác nhân và điều kiện: i) Propargyl bromid, K2CO3, KI, DMF, 50°C, 4 h. ii) Acetonitril, CuI, 50°C, 3 h. iii) Hydroxylamin hydroclorid, NaOH, MeOH-H2O, -5°C, 30 phút.

a. Tổng hợp chất IVd: Tổng hợp chất 5-methoxy-1-(prop-2-yn-1-yl)indolin-2,3-dion (IVd) từ nguyên liệu 5-methoxyisatin (IIId) bằng phản ứng alkyl hóa với propargyl bromid có mặt xúc tác là K2CO3 và KI.  Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất IVa, sử dụng 0,35 g (2,0 mmol) chất IIId.  Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất IVa.  Kết quả: - Cảm quan: Chất rắn, màu nâu sẫm.

- Hiệu suất: 76,7% (0,33 g).

- tºnc = 143,6-144,8ºC. - Rf = 0,53 (với hệ dung môi là DCM:MeOH = 100:1). b. Tổng hợp chất IX:

32

Điều chế chất methyl 5-(4-((5-methoxy-2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H1,2,3-triazol-1-yl)pentanoat (IX) từ chất IVd thông qua phản ứng Click với chất VIII sử dụng xúc tác là CuI.  Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất Va, sử dụng 0,23 g (1,0 mmol) chất IVd.  Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất Va.  Kết quả: - Cảm quan: Chất rắn, màu nâu sẫm.

- Hiệu suất: 86,0% (0,32 g).

- tºnc = 194,7-196,1ºC. - Rf = 0,52 (với hệ dung môi là DCM:MeOH = 10:1). c. Tổng hợp chất X: Dẫn

chất

N-hydroxy-5-(4-((3-(hydroxyimino)-5-methoxy-2-oxoindolin-1-

yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)pentanamid (X) được tổng hợp qua phản ứng tạo hydroxamic giữa chất IX và hydroxylamin hydroclorid.  Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng 0,22 g (0,6 mmol) chất IX.  Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng hệ dung môi kết tinh lại là MeOH - H2O.  Kết quả: - Cảm quan: Chất rắn, màu nâu.

- Hiệu suất: 55,8% (0,13 g).

- Nhiệt độ nóng chảy (tºnc) và Rf được trình bày trong bảng 3.2.

- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR,

13

C-NMR. Kết quả được

trình bày cụ thể trong bảng 3.3, 3.4, 3.5 và 3.6.  Hiệu suất tổng hợp và chỉ số lý hóa của các dẫn chất VIa-d, X được trình bày trong bảng 3.1.

33

Bảng 3.1. Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid hydroxamic từ ester.

VIa

5-H

1

C15H16N6O4

344,1

Dung môi kết tinh lại MeOH - H2O

VIb

5-F

1

C15H15FN6O4

362,1

MeOH - H2O

Vàng

55,3

VIc

5-Br

1

C15H15BrN6O4

422,0

MeOH - H2O

Vàng

51,3

VId

5-OCH3

1

C16H18N6O5

374,1

MeOH - H2O

Nâu

53,5

X

5-OCH3

2

C17H20N6O5

388,1

MeOH - H2O

Nâu

55,8

Chất

R

n

CTPT

KLPT

Vàng

H (%) 53,3

Màu

3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết Các sản phẩm sau khi được tổng hợp, xử lý và tinh chế bao gồm các dẫn chất VIa-d, X và các sản phẩm trung gian IVa-d, Va-d, IX đều được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và đo nhiệt độ nóng chảy. Các kết quả về Rf và tonc của các dẫn chất VIa-d, X được trình bày cụ thể ở bảng 3.2.  Sắc ký lớp mỏng: Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck 70230 mesh, với 4 hệ dung môi khác nhau là DCM, DCM:MeOH (100:1 và 10:1), DCM:MeOH:AcOH (100:40:1), tiến hành quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm. Kết quả TLC cho thấy các sản phẩm đều có vết gọn, rõ, không có vết phụ.  Đo nhiệt độ nóng chảy: Các dẫn chất VIa-d, X sau khi được kết tinh lại đều ở thể rắn, có thể tiến hành xác định nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2, nhận thấy các dẫn chất VIa-d, X đều có nhiệt độ nóng chảy xác định (khoảng dao động nhiệt độ hẹp, từ 1-2oC).

34

Bảng 3.2. Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (tonc) của các dẫn chất VIa-d, X.

Chất

R

n

Dung môi kết tinh lại

VIa

5-H

1

MeOH - H2O

VIb

5-F

1

MeOH - H2O

VIc

5-Br

1

MeOH - H2O

VId

5-OCH3

1

MeOH - H2O

X

5-OCH3

2

MeOH - H2O

Sắc ký lớp mỏng Hệ dung môi Rf DCM:MeOH:AcOH 0,26 = 100:40:1 DCM:MeOH:AcOH 0,29 = 100:40:1 DCM:MeOH:AcOH 0,32 = 100:40:1 DCM:MeOH:AcOH 0,24 = 100:40:1 DCM:MeOH:AcOH 0,25 = 100:40:1

tºnc (ºC) 181,3-182,1 201,5-202,8 212,3-213,7 179,9-181,4 204,5-206,4

Dựa trên các kết quả khảo sát về Rf và nhiệt độ nóng chảy có thể sơ bộ khẳng định được các dẫn chất VIa-d, X là tinh khiết và có thể sử dụng để thực hiện các bước xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR. 3.1.3. Xác định cấu trúc Các phương pháp ghi phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR) được sử dụng để khẳng định cấu trúc của các dẫn chất VIa-d, X đã tổng hợp được.

Kết quả ghi phổ cụ thể của các chất được trình bày trong phần phân tích phổ và phụ lục.

3.1.3.1. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các dẫn chất VIa-d, X được trình bày trong bảng 3.3.

35

Bảng 3.3. Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất VIa-d, X.

Số sóng ứng với các dao động νCH νCH νC=C νC=O 3 2 (sp ) (sp ) (anken) 1722 1609 2859 3023 1640 1463

Chất

R

n

VIa

5-H

1

VIb

5-F

1 3411 3208

2872

3029

VIc

5-Br

1 3407 3139

2853

3024

3282

2916

3071

5-OCH3 2 3421 3135

2838

3048

VId 5-OCH3 1 X

νO-H

νN-H 3136

1722 1640

1477

1732 1704 1712 1673 1718 1628

1606 1463 1630 1480 1598 1480

νN-O (oxim) 940 954 946 947 946

Ghi chú: ν là dao động hóa trị.

Nhận xét: Dựa trên bảng 3.3 và phổ đồ (phụ lục 1, 2, 3, 4 và 5) có thể sơ bộ nhận ra sự hiện diện của các nhóm chức thông qua vị trí, cường độ, hình dạng pic, ví dụ như của các nhóm chức O-H, N-H và C=O của acid hydroxamic; C=O của nhóm carbonyl; N-O và O-H của oxim.

Tuy nhiên các phổ IR này chưa thể cung cấp đầy đủ dữ liệu để khẳng định cấu trúc của các dẫn chất VIa-d, X. 3.1.3.2. Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS) Kết quả phân tích phổ khối lượng của các dẫn chất VIa-d, X được trình bày trong bảng 3.4.

36

Bảng 3.4. Kết quả phân tích phổ MS của các dẫn chất VIa-d, X.

Chất

R

n

CTPT

KLPT

m/z (ESI-MS)

VIa 5-H

1

C15H16N6O4

344,1

343,2 [M-H]-

VIb 5-F

1

C15H15FN6O4

362,1

361,2 [M-H]-

VIc

1

C15H15BrN6O4

422,0

421,1 [M-H]-

1

C16H18N6O4

374,1

373,1 [M-H]-

2

C17H20N6O5

388,1

387,1 [M-H]-

5-Br

VId 5-OCH3 X

5-OCH3

Nhận xét: Dựa trên bảng tổng hợp kết quả phổ khối lượng MS (bảng 3.4) và phân tích phổ đồ của các chất VIa-d, X (phụ lục 6, 7, 8, 9 và 10) cho thấy trên tất cả các phổ đồ đều có pic của ion phân tử đúng bằng giá trị khối lượng phân tử dự kiến với cường độ mạnh, các pic phân mảnh ít và có cường độ nhỏ. Như vậy, có thể khẳng định được phổ đồ phù hợp với công thức dự kiến của 5 dẫn chất VIa-d, X. 3.1.3.3. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR được trình bày trong bảng 3.5.

Bảng 3.5. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các dẫn chất VIa-d, X.

37

Chất

Số liệu phân tích 1H-NMR

R 1

H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, ppm): δ 13,58 (1H, s, NOH); 10,52 (1H, s, NHOH); 10,40 (1H, s, NHOH);

VIa

8,12 (1H, s, H-6); 7,97 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-4’); 7,39

5-H

(1H, td, J = 8,0 Hz, J’ = 1,0 Hz, H-6’); 7,11 (1H, d, J =

C15H16N6O4

7,5 Hz, H-7’); 7,07 (1H, t, J = 7,5 Hz, H5’); 4,97 (2H, s, H-7a, H-7b); 4,30 (2H, t, J = 6,5 Hz, H-4a, H-4b); 1,951,99 (4H, m, H-2a, H-2b, H-3a, H-3b).

1

H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, ppm): δ 10,40 (1H, s, NHOH); 8,72 (1H, s, NHOH); 8,11 (1H, s, H-6); 7,76

VIb

(1H, dd, JH4’-F = 8 Hz, J’H4’-H6’ = 2,5 Hz, H-4’); 7,28 (1H,

5-F

td, JH6’-F = 9,0 Hz; J’H6’-H4’ = 2,5 Hz, H-6’); 7,13 (H, dd, J

C15H15FN6O4

= 8,5 Hz, J’ = 4 Hz, H-7’); 4,98 (2H, s, H-7a, H-7b); 4,29-4,32 (2H, m, H-4a, H-4b); 1,92-1,99 (4H, m, H-2a, H-2b, H-3a, H-3b).

1

H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, ppm): δ 10,42 (1H, s, NHOH); 8,72 (1H, s, NHOH); 8,11 (1H, s, H-6); 8,08-

VIc

5-Br

8,10 (1H, m, H-4’); 7,59-7,61 (1H, m, H-6’); 7,09-7,11

C15H15BrN6O4

(1H, m, H-7’); 4,98 (2H, s, H-7a, H-7b); 4,29-4,32 (2H, m, H-4a, H-4b); 1,94-2,00 (4H, m, H-2a, H-2b, H-3a, H3b).

1

H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, ppm): δ 13,53 (1H, s, NOH); 10,40 (1H, s, NHOH); 8,07 (1H, s, H-6); 7,58

VId

5-OCH3

(1H, t, J = 5,5 Hz, H-4’); 6,98-7,04 (2H, m, H-6’, H-7’);

C16H18N6O4

4.93 (2H, d, J = 8 Hz, H-7a, H7b); 4,29-4,33 (2H, m, H4a, H-4b); 3,72 (3H, s, H-5-OCH3); 1,92-2,00 (4H, m, H2a, H-2b, H-3a, H-3b).

38

1

H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, ppm): δ 10,35 (1H, s, NHOH); 8,67 (1H, s, NHOH); 8,05 (1H, s, H-7); 7,57

5-OCH3

X

C17H20N6O5

(1H, m, H-4’); 6,98-7,03 (2H, m, H-6’, H-7’); 4,93 (2H, d, J = 6 Hz, H-8a, H-8b); 4,30 (2H, t, J = 7 Hz, H-5a, H5b); 3,72 (3H, s, H-5-OCH3); 1,95 (2H, t, J = 7,25 Hz; H2a, H-2b); 1,74 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-4a. H-4b); 1,401,45 (2H, m, H-3a, H-3b).

Ghi chú: δ: độ chuyển dịch hóa học (ppm); s: singlet, vạch đơn; d: doublet, vạch đôi; dd: doublet of doublet, vạch đôi hai lần; t: triplet, vạch ba; m: multiplet, đa vạch.

Nhận xét: Từ kết quả biện giải phổ 1H-NMR được trình bày trong bảng 3.5 và phổ đồ (phụ lục 11, 12, 13, 14 và 15) của các chất tổng hợp được có thể thấy số lượng proton, độ dịch chuyển hóa học, độ bội của pic và các hằng số cộng hưởng là phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến của cả 5 dẫn chất VIa-d, X. 3.1.3.4. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13C-NMR được trình bày trong bảng 3.6.

Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các dẫn chất VIa-d, X.

Chất

Số liệu phân tích 13C-NMR

R 13

VIa

5-H C15H16N6O4

C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, ppm): δ 168,16 (C1);

162,83 (C2’); 143,36 (C3’); 142,60 (C2’’); 141,87 (C5); 131,94 (C6’); 126,83 (C4’); 123,39 (C6); 122,77 (C5’); 115,32 (C1’’); 109,68 (C7’); 48,93 (C7); 34,67 (C4); 29,01 (C2); 25,85 (C3).

39

13

C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, ppm): δ 168,05 (C1);

162,64 (C2’); 158,00 (C6’, JC6’-F = 236,25 Hz); 143,13 VIb

5-F C15H15FN6O4

(C3’); 141,73 (C2’’); 138.93 (C5); 123,34 (C6); 118,11 (C5’, JC5’-F = 23,38 Hz); 115,80 (C4’, JC4’-F = 9 Hz); 113,80 (C1’’, JC1’’-F = 25,75 Hz); 110,75 (C7’); 48,91 (C7); 34,79 (C4); 28,96 (C2); 25,77 (C3).

13

5-Br

VIc

C15H15BrN6O4

C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, ppm): δ 168,07 (C1);

162,34 (C2’); 142,52 (C3’); 141,72 (C2’’); 141,60 (C5); 134,17 (C6’); 128,76 (C4’); 123,35 (C6); 116,88 (C5’); 114,20 (C1’’); 111,78 (C7’); 48,92 (C7); 34,79 (C4); 28,97 (C2); 25,78 (C3).

13

VId

5-OCH3 C16H18N6O4

C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, ppm): δ 168,05 (C1);

162,62 (C2’); 155,21 (C3’); 143,68 (C2’’); 141,94 (C5); 136,24 (C6’); 123,28 (C4’); 116,86 (C6); 115,85 (C5’); 113,09 (C1’’); 110,26 (C7’); 55,65 (OCH3); 48,90 (C7); 34,70 (C4); 28,97 (C2); 25,78 (C3).

13

X

5-OCH3 C17H20N6O5

C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, ppm): δ 168,74 (C1);

162,66 (C2’); 155,25 (C3’); 143,71 (C2’’); 141,87 (C6); 136,25 (C6’); 123,24 (C4’); 116,90 (C7); 115,87 (C5’); 113,14 (C1’’); 110,28 (C7’); 55,68 (OCH3); 49,07 (C8); 34,73 (C5); 31,54 (C2); 29,22 (C4); 22,06 (C3).

Ghi chú: δ: độ chuyển dịch hóa học (ppm).

Nhận xét: Qua kết quả phân tích phổ ở bảng 3.6 và phổ đồ của các chất (phụ lục 16, 17, 18, 19 và 20) cho thấy số lượng carbon, độ dịch chuyển hóa học phù hợp với công thức dự kiến của các chất VIa-d, X. Sau khi tổng hợp các kết quả phổ trên mỗi dẫn chất có thể khẳng định rằng: đã tổng hợp được 5 dẫn chất theo như thiết kế ban đầu. Trên cơ sở đó, các acid hydroxamic này tiếp tục được tiến hành thử hoạt tính sinh học.

40

3.2. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 3.2.1. Thử tác dụng ức chế HDAC Các dẫn chất VIa-d, X được thử tác dụng ức chế HDAC bằng phương pháp huỳnh quang tại khoa Dược, Đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc). Kết quả được trình bày bảng 3.7.

Bảng 3.7. Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất IVa-d, X.

Chất

R

n

VIa VIb VIc VId X

5-H 5-F 5-Br 5-OCH3 5-OCH3 SAHA

1 1 1 1 2

Tác dụng ức chế HDAC-2 (IC50) (μM) (μg/ml) 6,16 2,12 8,27 3,00 3,53 1,49 0,91 0,34 4,14 1,61 1,06 0,28

Ghi chú: IC50: Nồng độ ức chế 50% hoạt động deacetyl hoá của HDAC-2.

Nhận xét: Kết quả thu được trong bảng 3.7 cho thấy các dẫn chất tổng hợp được có khả năng ức chế HDAC-2 với IC50 từ 0,91-8,27 µM. Đặc biệt, dẫn chất VId có IC50 = 0,91 µM trong khi đó IC50 của SAHA = 1,06 µM. Điều này đồng nghĩa với việc dẫn chất VId ức chế HDAC-2 ở mạnh hơn so với SAHA. Tác dụng ức chế HDAC quyết định tác dụng chống ung thư, tuy nhiên để gây ra độc tính với tế bào các chất phải có khả năng thấm qua màng sinh học vào trong tế bào để tiếp cận với HDAC. Vì vậy, các dẫn chất VIa-d, X được tiếp tục tiến hành thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro trên các dòng tế bào ung thư: SW620, PC-3 và AsPC-1 nhằm tìm ra những chất thực sự có hoạt tính sinh học tốt.

41

3.2.2. Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro Các dẫn chất VIa-d, X được đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư người trên các dòng tế bào ung thư: ung thư tuyến tuỵ (AsPC-1), ung thư biểu mô tiền liệt tuyến (PC-3) và ung thư đại tràng (SW620). Kết quả giá trị IC50 cụ thể của các chất được trình bày ở bảng 3.8.

Bảng 3.8. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất VIa-d, X.

VIa

H

1

Độc tính tế bào (IC50) SW620 PC-3 AsPC-1 (µM) (µg/ml) (µM) (µg/ml) (µM) (µg/ml) 26,26 9,04 >30 >30 26,87 9,25

VIb

5-F

1

23,64

8,57

>30

>30

>30

>30

VIc

5-Br

1

2,93

1,24

6,08

2,57

3,01

1,27

VId

5-OCH3

1

1,61

0,60

1,74

0,65

1,49

0,56

X

5-OCH3

2

>30

>30

>30

26,16

>30

>30

3,20

0,86

3,70

0,98

3,75

0,99

Chất

R

n

SAHA

Ghi chú: IC50: Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư; SW620: Dòng tế bào ung thư đại tràng; PC-3: Dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt; AsPC-1: Dòng tế bào ung thư tuyến tụy; SAHA: acid suberoylanilid hydroxamic.

Nhận xét: Từ bảng 3.8 có thể thấy: + Dẫn chất VIa có tác dụng ức chế trên dòng tế bào ung thư SW620 và AsPC-1. + Dẫn chất VIb thể hiện tác dụng ức chế trên dòng tế bào ung thư SW620. + Dẫn chất X có tác dụng ức chế trên dòng tế bào PC-3. + Các dẫn chất VIc và VId đều có tác dụng ức chế trên cả 3 dòng tế bào ung thư SW620, PC-3 và AsPC-1.

42

Tuy nhiên độc tính lên từng dòng tế bào nhìn chung đều thấp hơn SAHA, ngoại trừ hợp chất VId có tác dụng tốt hơn SAHA trên 3 dòng tế bào, hợp chất VIc cho tác dụng ức chế tốt hơn SAHA trên 2 dòng tế bào SW620 và AsPC-1.

3.3. BÀN LUẬN 3.3.1. Tổng hợp hóa học Các chất VIa-d, X và các chất trung gian nhìn chung là các chất có cấu tạo phức tạp, cần phải qua nhiều bước tổng hợp, đồng thời lại chứa một số nhóm chức nhạy cảm với các yếu tố của môi trường phản ứng, vì vậy cần kiểm soát các điều kiện phản ứng để nâng cao hiệu suất của từng bước phản ứng tổng hợp, đồng thời đảm bảo sản phẩm có độ tinh khiết và ổn định cao.

3.3.1.1. Phản ứng tổng hợp các chất IVa-d Cơ chế phản ứng tổng hợp các dẫn chất IVa-d:

Sơ đồ 3.11. Cơ chế phản ứng tạo thành IVa-d. Đây là phản ứng alkyl hóa, xảy ra khá dễ dàng và đạt hiệu suất cao (đều trên 90%). Các isatin có tính nucleophin yếu, khả năng tấn công kém nên cần hoạt hóa phản ứng bằng K2CO3 tạo môi trường base yếu, để chuyển các isatin từ dạng phân tử sang dạng anion có tính nucleophin mạnh hơn. Bên cạnh đó, thêm một lượng nhỏ KI vào hỗn hợp phản ứng để tạo thành nhóm đi ra dễ hơn, làm tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng.

Riêng bước tổng hợp chất IVd hiệu suất chỉ đạt 76,7%. Nguyên nhân là do chất IVd bị tan một phần trong hỗn hợp dung môi DMF/H2O nên đã bị mất đi một phần trong quá trình lọc. Đồng thời, do dạng tủa tạo thành rất mịn, nhẹ nên khi lọc hút chân không, một lượng tủa đã bám sâu vào giấy lọc, rất khó thu hồi.

43

3.3.1.2. Phản ứng tổng hợp các chất II, VIII Đối với phản ứng tổng hợp chất II và VIII, do N3− là tác nhân nucleophin mạnh, có khả năng phản ứng nhanh nên không cần hoạt hóa nên hiệu suất của quá trình đều đạt trên 80%. Do sản phẩm phụ NaBr và chất tham gia dư NaN3 đều là những hợp chất phân cực, dễ dàng tủa trong DCM và được loại bỏ bằng phương pháp lọc.

3.3.1.3. Phản ứng tổng hợp chất Va-d, IX Đây là phản ứng Click nhằm tạo ra vòng 1,2,3-triazol - một hợp phần được thiết kế có trong cấu trúc của các dẫn chất trong đề tài. Phản ứng Click này được thực hiện đơn giản, thời gian phản ứng ngắn, hiệu suất thu sản phẩm cao, sản phẩm dễ thu tách và có độ tinh khiết cao.

Cơ chế phản ứng:

Sơ đồ 3.12. Cơ chế phản ứng Click dùng xúc tác Cu(I) [19].

Vòng 1,2,3-triazol là một trong những đơn vị cấu trúc quan trọng được tìm thấy trong một loạt các phân tử có hoạt tính sinh học như chống nấm, kháng khuẩn, chống dị ứng, chống HIV… Một số thuốc có hoạt chất chứa dị vòng 1,2,3-triazol trong phân tử như tazobactam, cefatrizin, carboxyamidotriazol, fluconazol, voriconazol... Ưu điểm của khung 1,2,3-triazol là trơ về mặt hóa học, không bị thủy phân, hầu như không bị khử hay oxy hóa, có moment lưỡng cực lớn, dễ dàng kết hợp với mục tiêu sinh học thông qua liên kết hydro và tương tác lưỡng cực - lưỡng cực. Do vậy, phản 44

ứng tạo khung 1,2,3-triazol đang được ứng dụng trong tổng hợp rất nhiều thuốc tiềm năng. Các chất ức chế HDAC cũng không phải là một ngoại lệ.

Việc sử dụng xúc tác CuI đã định hướng chọn lọc cho phản ứng tạo sản phẩm theo hướng đã thiết kế, tiến trình phản ứng đơn giản, thời gian phản ứng nhanh, hiệu suất cao và sản phẩm bền vững, dễ tinh chế.

3.3.1.4. Phản ứng tổng hợp các chất VIa-d, X Cơ chế phản ứng:

Sơ đồ 3.13. Cơ chế phản ứng tạo thành VIa-d, X. - Theo cơ chế phản ứng trên, phải sử dụng tác nhân là NH2OH base trong phản ứng tạo thành VIa-d, X. Tuy nhiên, dạng base không bền, dễ phân huỷ, khó bảo quản.

Vì vậy, chúng tôi đã sử dụng nguyên liệu ban đầu là dạng muối NH2OH.HCl với sự có mặt của NaOH và NH2OH.HCl phải được sử dụng ngay. Lượng NaOH cần dùng dư để chuyển hết NH2OH.HCl thành NH2OH tự do, đồng thời trong quá trình phản ứng tạo muối với acid hydroxamic, giúp sản phẩm tạo thành tan hết trong dung dịch phản ứng.

- Tuy nhiên, lượng NaOH dư có nhược điểm là tạo môi trường kiềm mạnh sẽ làm các ester Va-d, IX dễ bị thuỷ phân tạo tạp (là các acid carboxylic rất khó để loại bỏ). Vì vậy cần tiến hành phản ứng trên trong điều kiện nhiệt độ thấp (khoảng -5oC), đồng thời nhỏ từ từ dung dịch NaOH đã được làm lạnh vào bình phản ứng để tránh nhiệt độ tăng lên đột ngột làm phân huỷ NH2OH tự do.

45

- Cần lưu ý thời gian, nhiệt độ phản ứng, kiểm tra phản ứng thường xuyên bằng sắc ký lớp mỏng và thử phản ứng màu với FeCl3/HCl để xác định thời điểm kết thúc phản ứng và tránh tạo sản phẩm phụ.

3.3.2. Khẳng định cấu trúc Khóa luận đã khẳng định cấu trúc các dẫn chất tổng hợp thông qua các loại phổ: phổ hồng ngoại (IR), khổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR).

3.3.2.1. Phổ hồng ngoại Có thể nhận dạng sơ bộ sự xuất hiện của một số nhóm chức, một số liên kết thông qua các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ IR (xem phụ lục từ 1 đến 5). Cụ thể: - Trong khoảng 3421-3407 cm-1 có sự xuất hiện của dao động hóa trị liên kết O-H trong nhóm chức acid hydroxamic.

- Ở khoảng 3282-3135 cm-1 cũng thể hiện khá rõ nét dao động hóa trị của liên kết N-H trong nhóm chức acid hydroxamic hoặc oxim.

- Từ 2916-2838 cm-1 có thể nhận biết dao động hóa trị của liên kết C-H sp3 và 3071-2929 cm-1 là dao động hóa trị của liên kết C-H sp2.

- Đặc biệt ở dải hấp thụ khoảng 1732-1628 cm-1 với cường độ mạnh và tín hiệu sắc nét giúp nhận biết được dao động hóa trị của liên kết C=O, trong đó vùng 1732 1712 cm-1 là tín hiệu của C=O trên vòng indolin; liên kết C=O trong acid hydroxamic trong khoảng 1673-1628 cm-1 (do chịu hiệu ứng cộng hưởng với N của -NH- mạnh hơn nên pic dịch chuyển về dải số sóng bé hơn).

- Trong vùng từ 1630-1598 cm-1 cũng có thể nhận ra dao động hóa trị của liên kết C=C ở vòng triazol trên cầu nối. Còn khoảng từ 1480-1463 cm-1 là dao động hóa trị của liên kết C=C của vòng benzen.

- Ngoài ra, ở khoảng 954-940 cm-1 có thể là dao động hóa trị của liên kết N-O trong cấu trúc oxim.

Như vậy, có thể thấy rằng dữ liệu phổ IR phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến của 5 chất VIa-d, X đã tổng hợp được. Tuy nhiên, phổ IR chưa thể cung cấp đầy đủ

46

thông số để khẳng định cấu trúc của các chất. Để khẳng định chắc chắn cấu trúc của các chất, cần thêm dữ liệu của phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân.

3.3.2.2. Phổ khối lượng Trên phổ đồ của 5 chất VIa-d, X (phụ lục 6-9) đều xuất hiện pic ion có giá trị bằng [M-H]- (chế độ đo ESI(-)) với cường độ mạnh. Từ đó, có thể sơ bộ khẳng định được các chất VIa-d, X đã tổng hợp được có đúng số khối như dự kiến.

Trên phổ đồ MS của dẫn chất VIb có thể thấy giá trị của pic ion phân tử bằng khối lượng phân tử C15H15FN6O4 với cường độ mạnh nhất. Ngoài ra, các pic phân mảnh khác có cường độ yếu hơn.

Hình 3.1. Phổ khối lượng MS của dẫn chất VIb. 3.3.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân a. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Trên phổ đồ của các chất (phụ lục 10-15 và bảng 3.5) ta nhận thấy: - Các proton của vòng indolin nằm trong vùng dịch chuyển từ 7,00-7,60 ppm.

- Hai proton của nhóm methylen nối giữa vòng indolin và vòng 1,2,3-triazol nằm trong vùng dịch chuyển từ 4,93-4,98 ppm.

47

- Bên cạnh đó, trên phổ đồ còn xuất hiện 1 proton của vòng 1,2,3-triazol có độ dịch chuyển trong khoảng 8,05-8,12 ppm.

- Ngoài ra, các nhóm methylen còn lại vùng cầu nối nằm trong vùng dịch chuyển từ 1,42-4,31 ppm.

- Tín hiệu của nhiều proton ở nhóm -OH (trong oxim) và nhóm -NH-OH (trong acid hydroxamic) tương đối không ổn định trên phổ đồ của các chất. Nguyên nhân có thể do proton của các nhóm này linh động dễ bị trao đổi hay hỗ biến với dung môi pha chúng (DMSO) nên cho tín hiệu rất yếu hoặc không cho tín hiệu trên phổ đồ. Tuy nhiên, trong đa số phổ đồ vẫn có thể nhận biết được proton của các nhóm này thông qua một số tín hiệu cụ thể khá rõ nét.

- Proton trong nhóm -OH (trong oxim) xuất hiện trên phổ đồ của chất VIa và VId với độ dịch chuyển tương ứng là 13,58 và 13,53 ppm (xem phụ lục 11 và 14).

Proton của nhóm -NH (trong acid hydroxamic) xuất hiện trên phổ đồ của tất cả các chất VIa-d, X nằm trong vùng dịch chuyển là 10,35-10,42 ppm. Còn proton trên nhóm OH (trong nhóm hydroxamic) ở các chất VIb-c và X lại xuất hiện trong khoảng 8,67-8,72 ppm.

- Phổ đồ chất VId, X có thêm pic của nhóm thế -OCH3 trên vòng indolin với độ dịch chuyển là 3,72 ppm.

- Đặc biệt với dẫn chất VIb, do hạt nhân F có spin khác 0 nên phổ đồ chất VIb cho thấy có tương tác cộng hưởng giữa F với một số proton lân cận trên vòng indolin.

Vì vậy làm xuất hiện nhiều pic chẻ hay multiplet. b. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13Carbon Phổ 13C-NMR có ưu điểm là toàn bộ carbon trong phân tử các chất đều cho tín hiệu được tách rõ ràng dạng mũi tên đơn do được đo ở dạng phổ 13C khử hoàn toàn tương tác spin-spin. Trên phổ đồ các chất VIa-d, X đã thể hiện đầy đủ số lượng carbon có trong phân tử.

Trên phổ đồ

13

C-NMR của dẫn chất VIc có thể thấy xuất hiện đầy đủ 15 pic

tương ứng với 15C trong công thức C15H15BrN6O4 với cường độ mạnh và sắc nét.

48

Hình 3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của dẫn chất VIc (giãn rộng).

Như vậy, kết hợp kết quả phân tích các phổ IR, MS, 1H-NMR và 13C-NMR có thể khẳng định 5 dẫn chất IVa-d, X đã tổng hợp được có công thức cấu tạo hoàn toàn đúng như dự kiến.

3.3.3. Thử hoạt tính sinh học Tác dụng sinh học của 5 dẫn chất VIa-d, X được thể hiện thông qua tác dụng ức chế HDAC và tác dụng gây độc lên tế bào ung thư in vitro.

3.3.3.1. Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC Từ kết quả của bảng 3.7 cho thấy, tất cả các dẫn chất VIa-d, X đều có tác dụng ức chế HDAC-2. Trong đó, nổi bật nhất là chất VId (IC50 = 0,91 µM) có hoạt tính cao hơn so với SAHA (IC50 = 1,06 µM). Các chất còn lại trong dãy đều có hoạt tính thấp hơn so với SAHA từ 3-8 lần. So sánh các giá trị IC50 của các dẫn chất có thể thấy, hoạt tính ức chế HDAC-2 của các chất sắp xếp theo chiều giảm dần khi các nhóm thế ở vị trí số 5 trên vòng indolin lần lượt là -OCH3 > -Br > -H > -F. 49

So sánh các nhóm thế trên cùng vị trí 5, ta có thể nhận thấy với dẫn chất mang nhóm hút điện tử như -F hay -Br, hoạt tính ức chế HDAC-2 của các chất VIb và VIc đều giảm. Ngược lại với dẫn chất mang nhóm đẩy điện tử như -OCH3, hoạt tính của chất VId được cải thiện. Chúng tôi đưa ra giả thiết rằng, có thể do các dẫn chất VIbc gắn nhóm thế hút điện tử sẽ có mật độ điện tử trên nhóm khóa hoạt động giảm. Từ đó, tương tác Van der Waals với các acid amin trong kênh enzym giảm, dẫn đến tác dụng ức chế HDAC của chất VIb và VIc đều kém hơn chất VId. Ngoài ra, dẫn chất VIa không chứa nhóm thế nên không tạo được cấu trúc không gian phù hợp với miệng túi enzym HDAC-2 nên hoạt tính của nó thấp hơn dẫn chất chứa nhóm thế 5-Br. So sánh hai chất khác nhau về chiều dài cầu nối là VId (3C) và X (4C), ta có thể nhận thấy cầu nối 3C tối ưu hơn so với 4C. Giả thiết có thể đưa ra rằng 3C là chiều dài phù hợp hơn để đưa nhóm kết thúc có thể gắn với Zn2+ và giúp nhóm khoá hoạt động ở vị trí phù hợp tạo liên kết với các acid amin bề mặt. Do vậy, hoạt tính ức chế HDAC-2 của VId cao hơn X. 3.3.3.2. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro Tác dụng ức chế HDAC quyết định tác dụng kháng tế bào ung thư, tuy nhiên để tiếp cận được với HDAC từ đó gây ra độc tính tế bào, các chất còn phải có khả năng thấm qua màng sinh học vào trong tế bào. Do đó các dẫn chất VIa-d, X được tiếp tục đánh giá hoạt tính sinh học dựa trên kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro.

Kết quả thử hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư đã được trình bày trong bảng 3.9. So sánh giá trị IC50 của các dẫn chất tổng hợp được với giá trị IC50 của SAHA, cho thấy các dẫn chất VIa-b, X có hoạt tính thấp hoặc không thể hiện trên 3 dòng tế bào thử nghiệm. Riêng chất VIa có tác dụng ức chế trên dòng tế bào ung thư SW620 và AsPC-1, dẫn chất VIb có tác dụng ức chế trên dòng tế bào ung thư SW620, dẫn chất X có tác dụng ức chế trên dòng tế bào PC-3. Đặc biệt, các dẫn chất VIc và VId có độc tính tế bào tốt hơn hoặc tương đương với SAHA. Điều này được minh họa bằng biểu đồ dưới đây.

50

Độc tính tế bào IC50 (µM)

7 6 5 4 3 2 1 0

SW620

PC-3 VIc

VId

AsPC-1

SAHA

Hình 3.3. Biểu đồ so sánh tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất VIc-d trên các dòng tế bào SW620, PC-3 và AsPC-1.

Cụ thể, với dẫn chất VIc, kết quả cho thấy khả năng gây độc tế bào vượt trội hơn so với SAHA trên hai dòng thế bào thử nghiệm là SW620 và AsPC-1. Tuy nhiên, trên dòng tế bào PC-3 thì VIc vẫn có khả năng ức chế nhưng kém hơn so SAHA. Dẫn chất VId có hoạt tính tốt hơn SAHA trên cả 3 dòng tế bào thử nghiệm (từ 2-3 lần). Đặc biệt trên dòng AsPC-1, VId tỏ ra mạnh hơn hẳn so với SAHA. Có thể là do khả năng thấm qua màng tế bào của VId tốt hơn SAHA hoặc dẫn chất này có khả năng tương tác mạnh hơn với các loại HDAC nên góp phần mang lại tác dụng tốt hơn.

Tóm lại, kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro cho thấy trong 5 dẫn chất VIa-d, X tổng hợp được, các dẫn chất VIc-d có hoạt tính là lớn hơn cả. Tuy nhiên, nhìn chung, khi đưa vòng 1,2,3-triazol vào khung, hoạt tính của các dẫn chất không được cải thiện, nhiều chất bị mất hoạt tính ức chế HDAC-2 hoặc gây độc tế bào trên 3 dòng tế bào ung thư SW620, AsPC-1 và PC-3. Hướng nghiên cứu này vẫn có ý nghĩa khoa học trong việc xác định hoạt tính cũng như kiểm chứng giả thiết tạo ra tác dụng chọn lọc bởi vòng triazol có trong cấu trúc phân tử trên HDAC-2. Do 51

nghiên cứu mới thử tác dụng sinh học trên HDAC-2 và 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm nên nó vẫn còn tiềm năng trên các HDAC và trên các dòng tế bào ung thư khác.

52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN Từ các kết quả nghiên cứu đã trình bày có thể rút ra một số kết luận sau: 1.1. Về tổng hợp và khẳng định cấu trúc - Đã tổng được 5 dẫn chất như dự kiến và cả 5 dẫn chất IVa-d, X chưa từng được công bố trong bất kỳ tài liệu nào:  N-hydroxy-4-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H1,2,3-triazol-1-yl)butanamid (VIa).  4-(4-((5-fluoro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3triazol-1-yl)-N-hydroxybutanamid (VIb).  4-(4-((5-bromo-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3triazol-1-yl)-N-hydroxybutanamid (VIc).  N-hydroxy-4-(4-((3-(hydroxyimino)-5-methoxy-2-oxoindolin-1yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)butanamid (VId).  N-hydroxy-5-(4-((3-(hydroxyimino)-5-methoxy-2-oxoindolin-1yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)pentanamid (X).

- Đã khẳng định cấu trúc các dẫn chất tổng hợp được nhờ phân tích các dữ liệu phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR. 1.2. Về hoạt tính sinh học Đã thử tác dụng ức chế HDAC và hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được, kết quả cho thấy: - Về tác dụng ức chế HDAC: cả 5 dẫn chất đều có tác dụng ức chế HDAC-2.

- Về tác dụng kháng tế bào ung thư: cả 5 dẫn chất đều có hoạt tính ức chế với ít nhất 1 trong 3 dòng tế bào ung thư (ung thư đại tràng SW620, ung thư tuyến tiền liệt PC-3, ung thư tuyến tuỵ AsPC-1) trong đó tác dụng gây độc tế bào tốt nhất là chất VId trên cả 3 dòng tế bào thử nghiệm.

2. KIẾN NGHỊ - Tiếp tục tiến hành thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro của các dẫn chất tổng hợp được trên các enzym HDAC khác hoặc những dòng tế bào ung thư khác 53

nhằm sàng lọc được các dẫn chất có tác dụng mạnh, làm cơ sở cho việc thử tác dụng in vivo.

- Đánh giá tác dụng ức chế HDAC tổng, ví dụ sử dụng ức chế trên hỗn hợp HDAC tổng chiết từ tế bào HeLa. - Thử nghiệm tác dụng của các dẫn chất tổng hợp được trên các đích khác như virus HIV. - Thay đổi hướng nghiên cứu bằng cách thay vòng 1,2,3-triazol bằng các nhóm đẳng cấu điện tử hoặc thay đổi các nhóm thế trên khung 3-hydroxyimino2-oxoindolin.

54

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Đào Thị Kim Oanh (2011), Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế enzym histon deacetylase, Luận án tiến sỹ, Đại học Dược Hà Nội.

Tiếng Anh 2. Andrianov V., et al. (2009), “Novel amide derivatives as inhibitors of histone deacetylase: Design, synthesis and SAR”, European journal of medicinal chemistry, 44(3), pp. 1067-1085.

3. Bergman J.A., et al. (2012), “Selective Histone Deacetylase 6 Inhibitors Bearing Substituted Urea Linkers Inhibit Melanoma Cell Growth”, Journal of medicinal chemistry, 55(22), pp. 9891-9899.

4. Bertrand P., et al. (2010), “Inside HDAC with HDAC inhibitors”, European Journal of Medicinal Chemistry, 45(6), pp. 2095-2116.

5. Bozorgi A.H., et al. (2013), “A structure-activity relationship survey of histone deacetylase (HDAC) inhibitors”, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 125, pp. 132-138.

6. Chen P.C., et al. (2008), “Synthesis and structure-activity relationship of histone deacetylase (HDAC) inhibitors with triazole-linked cap group”, Bioorganic & medicinal chemistry, 16(9), pp. 4839-4853.

7. Damaskos C., et al. (2017), “Histone Deacetylase Inhibitors: An Attractive Therapeutic Strategy Against Breast Cancer”, Anticancer Research, 37(1), pp.

35-46.

8. De Ruijter A.J., et al. (2003), “Histone deacetylases (HDACs): characterization of the classical HDAC family”, Biochemical Journal, 370(3), pp. 737-749.

9. Di Micco S., et al. (2013), “Structural basis for the design and synthesis of selective HDAC inhibitors”, Bioorganic & medicinal chemistry, 21(13), pp.

3795-3807.

10. Dokmanovic M., Marks P.A. (2005), “Prospects: Histone deacetylase inhibitors”, Journal of cellular biochemistry, 96(2), pp. 293-304.

11. Dung do TM, et al. (2015), “Novel 3-substituted-2-oxoindoline-based Nhydroxypropenamides as Histone Deacetylase Inhibitors and Antitumor Agents”, Medicinal Chemistry, 11(8), pp. 725-735.

12. Duvic M., et al. (2007), “Phase 2 trial of oral vorinostat (suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA) for refractory cutaneous T-cell lymphoma (CTCL)”, Blood, 109(1), pp. 31-39.

13. Falkenberg K.J., Johnstone R.W. (2014), “Histone deacetylases and their inhibitors in cancer, neurological diseases and immune disorders”, Nature reviews Drug discovery, 13(9), pp. 673-691.

14. Feng T., et al. (2013), “Novel N-hydroxyfurylacrylamide-based histone deacetylase (HDAC) inhibitors with branched CAP group (Part 2)”, Bioorganic & medicinal chemistry, 21(17), pp. 5339-5354.

15. Giannini G., et al. (2012), “Histone deacetylase inhibitors in the treatment of cancer: overview and perspectives”, Future medicinal chemistry, 4(11), pp. 14391460.

16. Glozak M.A., Seto E. (2007), “Histone deacetylases and cancer”, Oncogene, 26(37), pp. 5420-5432.

17. Gołąbek K., et al. (2015), “Potential use of histone deacetylase inhibitors in cancer therapy”, Contemp Oncol (Pozn), 19(6), pp. 436-440.

18. Hanessian S., et al. (2007), “ω-Alkoxy analogues of SAHA (vorinostat) as inhibitors

of

HDAC:

A

study

of

chain-length

and

stereochemical

dependence”, Bioorganic & medicinal chemistry letters, 17(22), pp. 6261-6265.

19. Hein J.E., Fokin V.V. (2010), “Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper (I) acetylides”, Chemical Society Reviews, 39(4), pp. 1302-1315.

20. Johnstone R.W. (2002), “Histone-deacetylase inhibitors: novel drugs for the treatment of cancer”, Nature reviews Drug discovery, 1(4), pp. 287-299.

21. Jones P., et al. (2006), “A series of novel, potent, and selective histone deacetylase inhibitors”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 16(23), pp. 5948-5952.

22. Juvale D.C., et al (2006), “3D-QSAR of histone deacetylase inhibitors: hydroxamate analogues”, Organic & biomolecular chemistry, 4(15), pp. 28582868.

23. Kim H.J., Bae S.C. (2011), “Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs”, Am J Transl Res, 3(2), pp. 166-179.

24. Kolb H.C., Finn M.G., Sharpless K.B. (2001), “Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions”, Angewandte Chemie International Edition, 40(11), pp. 2004-2021.

25. Kolb H.C., Sharpless K.B. (2003), “The growing impact of click chemistry on drug discovery”, Drug discovery today, 8(24), pp. 1128-1137.

26. Kozikowski A.P., et al. (2008), “Chemistry, Biology, and QSAR Studies of Substituted

Biaryl

Hydroxamates

InhibitorsNanomolar-Potency

and

Inhibitors

Mercaptoacetamides of

Pancreatic

as

HDAC

Cancer

Cell

Growth”, ChemMedChem, 3(3), pp. 487-501.

27. Lee J.H., et al. (2013), “Development of a histone deacetylase 6 inhibitor and its biological effects”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(39), pp. 15704-15709.

28. Lipshutz B.H., Taft B.R. (2006), “Heterogeneous Copper-in-Charcoal-Catalyzed Click Chemistry”, Angewandte Chemie, 118(48), pp. 8415-8418.

29. Mottamal M., et al. (2015), “Histone Deacetylase Inhibitors in Clinical Studies as Templates for New Anticancer Agents”, Molecules, 20(3), pp. 3898-3941.

30. Nam N.H., et al. (2013), “Novel isatin-based hydroxamic acids as histone deacetylase inhibitors and antitumor agents”, European journal of medicinal chemistry, 70, pp. 477-486.

31. Nam N.H., et al. (2014), “Synthesis, bioevaluation and docking study of 5substitutedphenyl-1,3,4-thiadiazole-based

hydroxamic

acids

as

histone

deacetylase inhibitors and antitumor agents”, Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry, 29(5), pp. 611-618.

32. Oanh D.T.K., et al. (2011), “Benzothiazole-containing hydroxamic acids as histone deacetylase inhibitors and antitumor agents”, Bioorganic & medicinal chemistry letters, 21(24), pp. 7509-7512.

33. Ragno R., et al. (2008), “Class II-selective histone deacetylase inhibitors. Part 2: Alignment-independent

GRIND

3-D

QSAR,

homology

and

docking

studies”, European journal of medicinal chemistry, 43(3), pp. 621-632.

34. Rasheed W.K., Johnstone R.W., Prince H.M. (2007), “Histone deacetylase inhibitors in cancer therapy”, Expert opinion on investigational drugs, 16(5), pp.

659-678.

35. Rostovtsev V.V., et al. (2002), “A stepwise huisgen cycloaddition process: copper (I)-catalyzed regioselective ligation of azides and terminal alkynes”, Angewandte Chemie, 114(14), pp. 2708-2711.

36. Somoza J.R., et al. (2004), “Structural Snapshots of Human HDAC8 Provide Insights into the Class I Histone Deacetylases”, Structure, 12(7), pp. 1325-1334.

37. Thangapandian S., et al. (2010), “Docking-enabled pharmacophore model for histone deacetylase 8 inhibitors and its application in anti-cancer drug discovery”, Journal of Molecular Graphics and Modelling, 29(3), pp. 382-395.

38. Tornøe C.W., Christensen C., Meldal M. (2002), “Peptidotriazoles on solid phase:[1, 2, 3]-triazoles by regiospecific copper (I)-catalyzed 1, 3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides”, The Journal of organic chemistry, 67(9), pp. 3057-3064.

39. Vanommeslaeghe K., et al. (2005), "DFT-based ranking of zinc-binding groups in histone deacetylase inhibitors", Bioorganic & medicinal chemistry. 13(21), pp.

6070-6082.

40. Wang D.F., et al. (2004), “QSAR Studies of PC-3 cell line inhibition activity of TSA and SAHA-like hydroxamic acids”, Bioorganic & medicinal chemistry letters, 14(3), pp. 707-711.

41. West A.C., Johnstone R.W. (2014), “New and emerging HDAC inhibitors for cancer treatment”, The Journal of clinical investigation, 124(1), pp. 30-39.

42. Zhang Z., et al. (2016), “Targeting epigenetic reader and eraser: Rational design, synthesis and in vitro evaluation of dimethylisoxazoles derivatives as BRD4/HDAC dual inhibitors”, Bioorganic & medicinal chemistry letters, 26(12), pp. 2931-2935.

PHỤ LỤC Phụ lục 1. Phổ hồng ngoại IR của VIa. Phụ lục 2. Phổ hồng ngoại IR của VIb. Phụ lục 3. Phổ hồng ngoại IR của VIc. Phụ lục 4. Phổ hồng ngoại IR của VId. Phụ lục 5. Phổ hồng ngoại IR của X. Phụ lục 6. Phổ khối MS của VIa. Phụ lục 7. Phổ khối MS của VIb. Phụ lục 8. Phổ khối MS của VIc. Phụ lục 9. Phổ khối MS của VId. Phụ lục 10. Phổ khối MS của X. Phụ lục 11. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của VIa. Phụ lục 12. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của VIb. Phụ lục 13. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của VIc. Phụ lục 14. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của VId. Phụ lục 15. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của X. Phụ lục 16. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của VIa. Phụ lục 17. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của VIb. Phụ lục 18. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của VIc. Phụ lục 19. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của VId. Phụ lục 20. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của X. Phụ lục 21. Kết quả hoạt tính ức chế HDAC-2 và độc tính tế bào.

Chú thích: 48A = VIa Phụ lục 1. Phổ hồng ngoại IR của VIa.

Chú thích: 48B = VIb Phụ lục 2. Phổ hồng ngoại IR của VIb.

Chú thích: 48D = VIc Phụ lục 3. Phổ hồng ngoại IR của VIc.

Chú thích: 48G = VId Phụ lục 4. Phổ hồng ngoại IR của VId.

Chú thích: 49G = X Phụ lục 5. Phổ hồng ngoại IR của X.

Chú thích: C4 = VIa Phụ lục 6. Phổ khối MS của VIa.

Chú thích: 48B = VIb

Phụ lục 7. Phổ khối MS của VIb.

Chú thích: 48D = VIc

Phụ lục 8. Phổ khối MS của VIc.

Chú thích: 48G = VId

Phụ lục 9. Phổ khối MS của VId.

Chú thích: 49G = X Phụ lục 10. Phổ khối MS của X.

Chú thích: C4 = VIa Phụ lục 11. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của VIa.

Chú thích: 4C = VIa Phụ lục 11. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của VIa (phổ giãn rộng).

Chú thích: 48B = VIb

Phụ lục 12. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của VIb.

Chú thích: 48B = VIb

Phụ lục 12. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của VIb (phổ giãn rộng).

Chú thích 47D = VIc

Phụ lục 13. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của VIc.

Chú thích: 47D = VIc Phụ lục 13. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của VIc (phổ giãn rộng).

Chú thích: 48G = VId

Phụ lục 14. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của VId.

Chú thích: 48G = VId Phụ lục 14. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của VId (phổ giãn rộng).

Chú thích: 49G = X Phụ lục 15. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của X.

Chú thích: 49G = X Phụ lục 15. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của X (phổ giãn rộng).

Chú thích 4C = VIa Phụ lục 16. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của VIa.

Chú thích: 4C = VIa

Phụ lục 16. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của VIa (phổ giãn rộng).

Chú thích: 48B = VIb

Phụ lục 17. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của VIb.

Chú thích: 48B = VIb

Phụ lục 17. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của VIb (phổ giãn rộng).

Chú thích: 47D = VIc

Phụ lục 18. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của VIc.

Chú thích: 47D = VIc

Phụ lục 18. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của VIc (phổ giãn rộng).

Chú thích: 48G = VId Phụ lục 19. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của VId.

Chú thích: 48G = VId Phụ lục 19. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của VId (phổ giãn rộng).

Chú thích: 49G = X

Phụ lục 20. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của X.

Chú thích: 49G = X

Phụ lục 20. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của X (phổ giãn rộng).

Phụ lục 21. Kết quả hoạt tính ức chế HDAC-2 và độc tính tế bào.

Phụ lục 21. Kết quả hoạt tính ức chế HDAC-2 và độc tính tế bào.