Tảo Chlorella sorokiniana UTEX 2805 trong môi trường mà nhiệt độ, cường độ ánh sáng cao có khả năng

ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG LỚP: 12CMT ----------

Chlorella sorokinianaUTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater.

Giáo viên hướng dẫn: Bộ môn Công Nghệ Môi Trường Nhóm thực hiện: nhóm 2

TP. Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2015

Bộ môn Công nghệ môi trường

Nhóm 2

MỤC LỤC I.

GIỚI THIỆU. ...................................................................................................... 1

II.

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. .................................................................... 3

2.1

Phân lập tảo. ...................................................................................................... 3

2.2

Xác định các tảo. ............................................................................................... 3

2.3

Tăng trưởng của tảo dưới nhiệt độ cực cao và sự phơi nắng. ........................... 4

2.4

Cố định với vi khuẩn A. brasilense trong hạt alginate, loại bỏ nitơ, và phân

tích sắc tố. .................................................................................................................... 6 2.5

Việc thích ứng của tảo với nhiệt độ cao và ánh sáng cực mạnh. ...................... 7

2.6

Thí nghiệm thực nghiệm. .................................................................................. 7

2.7

Phân tích thống kê và tính toán tốc độ tăng trưởng và thời gian nhân đôi. ...... 8

III.

KẾT QUẢ ............................................................................................................ 9

3.1

Ưu thế về nhiệt độ và sự tiếp xúc ánh nắng trong bể chứa nước thải. .............. 9

3.2

Xác định tảo. ................................................................................................... 11

3.3

Sự phát triển của chủng C. sorokiniana ở 40oC trong môi trường nuôi cấy lơ

lửng dưới cường độ ánh sáng cao. ............................................................................ 12 3.4

Sự phát triển của C. sorokiniana cố định với A. brasilensetrong hạt alginate

tăng theo nhiệt độ và cường độ của ánh sáng. .......................................................... 12 3.5

Loại bỏ amoni trong nước thải tổng hợp bởi C. sorokiniana cố định với A.

brasilense dưới điều kiện tăng nhiệt độ và cường độ của ánh sáng.......................... 12 3.6

Thay đổi sắc tố quang hợp của C. sorokiniana cố định với A. brasilense theo

sự tiếp xúc với nhiệt độ khắc nghiệt và cường độ của ánh sáng. .............................. 13 IV.

THẢO U N. ................................................................................................... 13

V.

KẾT LU N. ...................................................................................................... 16

Bộ môn Công nghệ môi trường

Nhóm 2

Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater.

Tảo Chlorella sorokiniana UTEX 2805 trong môi trường mà nhiệt độ, cường độ ánh sáng cao có khả năng khử được ammonium trong nước thải.

Luz E. de-Bashan a,b, Adan Trejo a, Volker A.R. Huss c, Juan-Pablo Hernandez a, Yoav Bashan a,b,* a

Tập đoàn vi sinh môi trường, Trung tâm Nghiên cứu sinh học Northwestern (CIBNOR), Mar Bermejo 195, Colonia Palo de Santa Rita, La Paz 23.090, BCS, Mexico. b

c

Khoa Đất, Nước và Khoa học Môi trường, Đại học Arizona, Tucson, Arizona, USA.

Khoa Sinh học, sinh học phân tử, Đại học Friedrich-Alexander Erlangen-Nürnberg nu (FAU), Staudt Strasse 5, 91058 Erlangen, Đức.

Nhận 02 tháng 04 năm 2007; nhận bản sửa đổi ngày 31 Tháng 8 năm 2007; chấp nhận ngày 9 tháng 9 năm 2007 Bản trực tuyến có ngày 19 Tháng 11 2007

Sơ lƣợc nghiên cứu_abstract.

Vào mùa hè năm 2003, một chủng tảo được phân lập từ tảo lục phát triển trong bể chứa nước thải của một cơ sở xử lý ở Mexico. Lúc đó nhiệt độ không khí là trên 40oC, nhiệt độ nước 37oC và cường độ nắng trên mặt nước lên tới 2400 μmol.m2/s suốt nhiều giờ trong 4 tháng. Chủng tảo được nhận biết là Chlorella sorokiniana dựa vào toàn bộ trình tự gen 18S rRNA. Chủng này có mật độ tăng cao trong nước thải ở nhiệt độ 40-42oC và cường độ ánh sáng 2500 μmol.m2/s trong 5 giờ thì loại bỏ ammonium trong nước thải tốt hơn ở điều kiện nhiệt độ thấp hơn (28oC) và cường độ ánh sáng ít (60 μmol.m2/s). Khi cố định vi khuẩn Azospirillum brasilense sẽ phát triển tảo, số lượng tăng nhanh hơn và tăng khả năng xử lý ammonium nhiều hơn. Dưới điều kiện ánh sáng mạnh số giờ phơi nhiễm cực cao, số lượng của 4 sắc tố quang tổng hợp màu cố định trong nhiều loại tảo khác nhau. Chủng tảo này có tiềm năng như là chất xử lý nước thải trong điều kiện nhiệt độ và cường độ ánh sáng cực cao.

I. GIỚI THIỆU. Xử lý nước thải ở các đô thị, cả ở những nơi rất nóng hay lạnh điều cần thiết cho môi trường sống con người. Phương pháp xử lý sinh học ở các nơi này phụ thuộc môi trường và điều kiện sẵn có cho vi sinh vật phát triển. Các loài tảo được nghiên cứu thích hợp phổ biến xử lý nước thải ở điều kiện thường (de-Bashan and Bashan, 2004;

1

Bộ môn Công nghệ môi trường

Nhóm 2

Oswald, 1988; Talbot et al., 1991; Valderrama et al., 2002), và hiếm khi thấy khảo sát trong môi trường khắc nghiệt (Tang et al., 1997). Trong trường hợp này nhiều tảo tăng trưởng trong dãy nhiệt độ rộng (de la Nou¨e and de Pauw, 1988; Walker et al., 2005). Điều này đúng với Chlorella sp thích nghi trong nhiệt độ 5-42oC (Kessler, 1985; Maxwell et al., 1994).

Trong số tất cả các loài Chlorella thì Chlorella sorokiniana Shith et Krauss chịu được nhiệt độ, cường độ ánh sáng cao và được nghiên cứu chính tạo sinh khối và quang tổng hợp (Morita et al., 2000a,b, 2001, 2002). Tuy nhiên chỉ được nghiên cứu ứng dụng trong xử lý nước thải ở điều kiện nhiệt và cường độ sáng hợp lý vừa phải (Mũnoz et al., 2004, 2005; Yoshida et al., 2006). Cố định tảo trong polymer để tận dụng sinh khối trong xử lý nước thải được nghiên cứu trong 20 năm qua (Chevalier and de la Nou¨e, 1985; Lau et al., 1997; Tam and Wong, 2000). Trong những năm gần đây những cải tiến hệ thống kỹ thuật, giúp chlorella sp và tảo thúc đẩy sự tăng trưởng vi khuẩn Azosprillum (MGPB) được cố định trong hạt tảo (de-Bashan et al., 2004; Gonzalez and Bashan, 2000).

Một số tương tác của tảo với vi khuẩn được ghi lại. Pseudomonas diminuta và Pseudomonas vesicularias là 2 vi khuẩn hiếu khí được phân lập từ nhiều loại tảo trong phòng thí nghiệm kích thích sự phát triển tảo Scenedesmus bicellularis và chlorella sp (Mouget et al., 1995). Nghiên cứu có kết quả tích cực từ vi khuẩn biển trên tảo biển được biết đến trong các thập kỉ trước (Suminto and Hirayama, 1996; Ukeles and Bishop, 1975). Người ta đã cấy tảo biển Chaetoceros gracilis được sử dụng thức ăn cho giống trai ngọc với MGPB Flavobacterium sp. Tốc độ tăng trưởng của khuê tảo cao hơn đáng kể so với các loài tảo khác (diatom: loài khuê thảo hay còn gọi là tảo cát, tảo trên biển) (Suminto and Hirayama, 1997). Cấy cá nước ngọt ao nuôi trồng thủy sản với Azospirillum sp và Azotobacteria sp làm tăng thực vật phù du, tăng sản lượng cá chép (Garg and Bhatnagar, 1999). Cùng nuôi cấy C.sorokiniana và Ralstonia basilensis suy giảm hàm lượng sodium salicylate và acetonitrile. Cố định Chlorella vulgrais với Azospirillum brasilense (được biết thúc đẩy tăng trưởng vi khuẩn trên thực vật trong nông nghiệp) (Bashan et al., 2004), tăng cường tảo phát triển (Gonzalez and Bashan, 2000), nhưng quy trình cố định tự nhiên xảy ra, sự kết hợp cố

2

Bộ môn Công nghệ môi trường

Nhóm 2

định đạm của C vuglaris và Phyllobacterium myrsinacearum (Gonzalez-Bashan et al., 2000) làm giảm lượng tảo (quá trình lão hóa tảo dẫn tới chết) (Lebsky et al., 2001).

Nghiên cứu đã cố gắng phân lập và mô tả đặc tính của chủng tảo này thích nghi tốt trong điều kiện môi trường nóng như ở môi trường sa mạc và có tiềm năng như là chất dùng để xử lý được nước thải dưới điều kiện không thuận lợi này. Chủng tảo này được cho tiếp xúc dưới điều kiện được điều chỉnh hoàn toàn bằng phản ứng sinh học và điều kiện nhiệt, ánh sáng cao đang có sẵn trong khu vực môi trường đó và có được sự tương tác cần thiết với vi khuẩn MGPB để chủng tảo này phát triển.

II. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 2.1 Phân lập tảo.

Trong các mẫu thu thập thường xuyên vào tháng 08 năm 2003 từ các cơ sở xử lý nước thải của thành phố La Paz, Baja California Sur, Mexico, xảy ra hiện tượng tảo lục nở hoa trên diện rộng được quan sát ở hồ chứa. Trong thời gian lấy mẫu vào giữa trưa, nhiệt độ không khí là hơn 400C và cường độ nắng gần 2500 mol m2s-1. Mẫu nước được thu thập từ bề mặt của ao và được đưa đến các phòng thí nghiệm. Các tảo được phân lập, nuôi cấy, và tinh khiết ở môi trường C-30 (Gonzalez và Ba-san, 2000) sử dụng kỹ thuật tiêu chuẩn vi sinh. Các tảo cũng thường xuyên được nuôi và bảo quản trong ống nghiêng môi trường C-30 dưới ánh sáng trắng liên tục 25- 60mol m2s-1. Và được gửi vào các trường Đại học Texas ở Austin, Texas,Mỹ (UTEX 2805).

2.2 Xác định các tảo.

Trình tự gen 18S rDNA được xác định như sau: tảo đã được nuôi tại môi trường C30 trong 10 ngày, thu được bằng cách ly tâm, rửa sạch hai lần với nước muối, và làm khô lạnh. Một mẫu 0,5g của các tế bào Chlorella khô được ủ trong 30 phút trong 30 mL đệm TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). Sau khi ly tâm, các tế bào được chiết xuất với một số giọt TE đệm và phần cặn được làm khô với nitơ lỏng. Việc tách DNA ra và thanh lọc được thực hiện theo phương pháp chuẩn. PCR và lớp lót bên trong được liệt kê bởi Huss và cộng sự (1999). Trình tự đã được thực hiện theo chu trình phân tích nguồn gốc với lăng kính ABI 310 (Perkin- Elmer / Cetus, Boston, MA, USA). Trình tự xác định 18S rRNA thủ công phù hợp với một số tài liệu tham khảo để so sánh và nhận dạng với tảo lục.

3

Bộ môn Công nghệ môi trường

Nhóm 2

2.3 Tăng trƣởng của tảo dƣới nhiệt độ cực cao và sự phơi nắng.

Tảo này đã được phát triển trong nước thải cacbon tổng hợp có chứa (mgl-1): NaCl, 7; CaCl2, 4; MgSO4. 7H2O, 2; K2HPO4, 21,7; KH2PO4, 8.5; Na2HPO4, 33,4; và NH4Cl, 10; (Gonzalez và cộng sự, 1997), vi khuẩn được nuôi cấy lơ lửng hoặc cố định trong hạt NaNO2 (giải thích dưới đây) trong một môi trường được thiết kế đặc biệt được xây dựng với những điều sau đây (Hình 1) a: 1-1 lên men kín (vi khuẩn Omni, VIRTIS, NY, USA 400 ml chất lỏng) với kiểm soát thông khí dưới đáy và trộn kết nối với một hệ thống làm mát bên ngoài (Model 1160S, VWR, Niles, IL, USA) tại nhiệt độ nước 11-13oC. Cái này được đặt trong buồng tiêu chuẩn nuôi cấy cho thực vật (Biotronette Mark III, Melrose Park, IL, USA) được bao phủ bởi lá nhôm ở mặt trong của buồng để tăng cường phản xạ ánh sáng ở 28-40 ± 2oC dưới mật độ thông lượng của photon 30 -2500 ± 3µmol m2s-1. Từ buồng tăng trưởng cung cấp đầy đủ ánh sáng với phổ lên đến 250µmol m2s-1, ánh sáng bổ sung được cung cấp bởi 4 bóng đèn sợi đốt (200 W) và thêm 4 bóng (100 W) gắn trên một cột vào hai bên của bình lên men, hai bên đặt đèn halogen 400W cho nên khoảng cách của các đèn được bố trí sao cho các phản ứng sinh học có thể được thay đổi bởi cường độ ánh sáng khác nhau. Các thiết lập có thể cung cấp và điều khiển cường độ ánh sáng lên đến 2500 µmol m2s-1 với nhiệt độ không khí và nước ở 40-42oC. Cường độ ánh sáng được đo bằng quang kế (Model 840.010, Sper Scientific, Scott..). Nhiệt độ trong buồng tăng trưởng và buồng lên men được kiểm soát bởi hệ thống làm mát và điều hòa không khí. Ngoài ra, nhiệt còn rất lớn ở những cường độ ánh sáng cao xung quanh nơi lên men. Sự biến đổi của nhiệt độ đo trong buồng môi trường là <1oC. Ở cường độ ánh sáng thấp, nhiệt độ được kiểm soát bởi hệ thống sưởi ấm và làm mát lên men của femeter với sự thay đổi ± 1oC.

4

Bộ môn Công nghệ môi trường

Nhóm 2

5

Bộ môn Công nghệ môi trường

Nhóm 2

Sơ đồ biểu diễn (A) và hình chụp (B) của buồng môi trường, với các phụ kiện của nó, được sử dụng ở nhiệt độ cao và các thí nghiệm cường độ ánh sáng cao. (a) fementor bao gồm (1) lọ, (2) nhiệt kế, (3) khuấy, (4) sục khí, (5) lò, (6) cổng nhận để chiết mẫu, (7) làm mát nước đầu vào, (8) làm mát nước đầu ra; (b) hai đèn halogen (400W) nằm ở phía trước của lọ; (c) hai cột với bốn đèn sợi đốt (600W mỗi cột) nằm trên cả hai mặt của lọ; (d) ba quạt(một lớn và hai nhỏ); (e) nước tuần hoàn làm mát hệ thống; lá nhôm được phủ lên buồng môi trường.

(Schematic không phải là quy mô.)

2.4 Cố định với vi khuẩn A. brasilense trong hạt alginate, loại bỏ nitơ, và phân tích sắc tố.

Cố định tảo với vi khuẩn được thực hiện theo de-Bashan et al. (2004). Tóm lại, nuôi cấy axenic, dùng C. sorokiniana (ở mức 0,5 x 106 cfu ml-1) hoặc tảo thúc đẩy tăng trưởng vi khuẩn A. brasilense (DSM 1843, Braunschweig, Đức; ở mức 1,3 ± 0,2 x 106 cfu ml-1) trộn với dung dịch alginate 2%. Dung dịch trên được nhỏ giọt từ một ống tiêm vô trùng vào dung dịch CaCl2 2%, pha trộn dung dịch theo định kỳ. Để cố định hai vi sinh vật trong hạt như nhau, cấy 1 lớp mỏng, mỗi lớp được lơ lửng trong 10 ml dung dịch nước muối 0,85% và sau đó trộn với nhau trong alginate trước khi các hạt định hình. Vì quy trình cố định và phối hợp cố định thường làm giảm số lượng tế bào Azospirillum trong các hạt, cần thiết ủ qua đêm thứ hai trong chất dinh dưỡng đã pha loãng. Để đếm tế bào, các hạt này được hòa tan bằng cách ngâm hạt trong dung dịch NaHCO3 4% trong 30 phút, và không có ảnh hưởng xấu đến vi sinh vật. A. brasilense, đếm bằng cách cấy chuỗi pha loãng (ở muối 0,85% ) lên đĩa thạch dinh dưỡng (Sigma) và Chlorella sau đó đếm dưới ánh sáng kính hiển vi với huyết tốc kế Neubauer.

Amoni được đo bằng cách sử dụng các kỹ thuật phân tích nước tiêu chuẩn (APHA, AWWA, WPCF, 1992) sử dụng bộ dụng cụ (Hach, Loveland, CO, USA) và một quang phổ kế (Hach DR / 2000, Loveland, CO, USA) theo nhà sản xuất. Sắc tố (chlorophyll a và b, violaxanthin, và zeaxanthin) được xác định sau khi hòa tan các hạt và giải phóng tế bào C. sorokinina, đo bằng HPLC, như được mô tả bởi de-Bashan et al. (2002a). Trong phương pháp này, sắc tố ngay lập tức được chiết bởi HPLC 6

Bộ môn Công nghệ môi trường

Nhóm 2

acetone ủ qua đêm tại -40oC ngay sau đó, phân tích mà không cần lưu trữ. Sắc tố đã được phát hiện với những tín hiệu hấp thụ mảng diode ở bước sóng 440 nm. Việc xác định được thực hiện bằng cách so sánh thời gian lưu và peak chuẩn thương mại được cung cấp bởi DHI (Cơ quan quốc tế do

14

C xác định, Đan Mạch,

http://www.c14.dhi.dk/index.htm). Xác định số lượng trong kết quả sử dụng các yếu tố phản ứng sắc tố (khu vực đỉnh cao HPLC / khối màu) thu được từ peak thương mại, như mô tả của Mantoura và Repeta (1997). Kết quả được thể hiện như ng sắc tố/tế bào.

2.5 Việc thích ứng của tảo với nhiệt độ cao và ánh sáng cực mạnh.

Vì tiếp xúc đột ngột với nhiệt độ cao hoặc ánh sáng cường độ cao hoặc cả hai kết quả là tan vỡ tế bào C. sorokiniana (S. Fendrich, 2005, luận án Diploma, Đại học Kỹ thuật, Hamburg- Harburg, Đức), nên cần thiết có thời gian để thích ứng. Do có ít kiến thức về nhiệt độ và ánh sáng cần cho chế độ thích nghi của các loài tảo này, theo đó có ba cơ chế thích ứng, mỗi cơ chế bao gồm năm ngày, đã được thử nghiệm. (i) Nhiệt độ của việc nuôi cấy đã được nâng lên 40oC trong hai bước (30-35oC trong 30 phút và 35- 40oC 30 phút) ở cường độ ánh sáng 45 μmol m2s-1. Một khi đạt 40oC, nhiệt độ được duy trì trong 5h và trở về 30oC. Cơ chế này đã được lặp đi lặp lại trong bốn ngày tiếp theo. (ii) Cường độ của ánh sáng đã được nâng lên 1032 μmol m2s-1 trong ba bước, tất cả ở 30oC (115 μmol m2s-1 trong 25 phút, 115-500 μmol m2s-1 cho 20 phút, và 500-1032 μmol m2s-1 trong 15 phút). Khi cường độ ánh sáng cao, điều kiện là duy trì trong 5 giờ và sau đó giảm xuống 60 μmol m2s-1. Quá trình này được lặp lại như mô tả trong năm ngày. (iii) Tăng nhiệt độ lên 40oC và cường độ ánh sáng tới 2500 μmol m2s-1 được thực hiện trong cùng một lúc, như được mô tả trong hai cơ chế đầu tiên, với thời gian thích nghi là 1032-2500 μmol m2s-1 trong 30 phút.

2.6 Thí nghiệm thực nghiệm.

Mỗi thí nghiệm lên men sử dụng 17g hạt aginate trong 400ml nước thải tổng hợp trong năm ngày. Việc tiếp xúc với điều kiện khắc nghiệt (ánh sáng, nhiệt độ, hoặc cả hai) kéo dài 5 giờ mỗi ngày. Còn lại 19h thí nghiệm được duy trì ở 30oC và 60 μmol m2s-1. Nồng độ amoni clorua (NH4Cl) ban đầu được sử dụng trong xử lý nước thải tổng hợp là 25 và 50 mgl-1. Dữ liệu được thể hiện ở số lượng các ion NH4+ bị loại bỏ.

Bởi vì quá trình lên men kín, nên amoniac không thể bốc hơi và thoát. Các kỹ thuật 7

Bộ môn Công nghệ môi trường

Nhóm 2

khác nhau (hạt mà không có vi sinh vật, một mình nước thải, và tảo và vi khuẩn cố định riêng) (de-Bashan et al., 2004) cũng thường xuyên được sử dụng. Dữ liệu có liên quan đến tảo và vi khuẩn cố định riêng biệt được trình bày.

2.7 Phân tích thống kê và tính toán tốc độ tăng trƣởng và thời gian nhân đôi.

Mỗi thí nghiệm thực hiện ba lần, mà mỗi lần đều lặp lại quá trình lên men. Ba mẫu 20 ml cho mỗi lần phân tích được đưa đi phân tích nước trong khoảng thời gian 24h.

Các sắc tố được phân tích trong sáu lần. Mỗi thí nghiệm, bao gồm việc thích ứng với điều kiện khắc nghiệt, được lặp đi lặp lại hai lần. Kết quả được phân tích một chiều của ANOVA cùng với phân tích post-hoc của Tukey và phân tích t-test của sinh viên, tất cả đều ở mức P ≤ 0.05, với Statistica, phần mềm phiên bản 6 (StatSoft, Tulsa, OK, USA) . Tốc độ tăng trưởng (K) của tảo đã được tính toán là K = ln (N1 / N0) / t1 – t0, khi N1 và N0 là những tế bào ở thời điểm 1 (t1) và thời gian 0 (t0). Thời gian hình thành (gt) đã được tính toán gt = ln2 / K (Levasseur et al., 1993) để xác nhận dữ liệu tính toán tốc độ tăng trưởng.

8

Bộ môn Công nghệ môi trường

Nhóm 2

Biểu đồ Thời gian nuôi cấy. 2. Sự tăng trưởng Chlorella sorokiniana UTEX 2805 trong nước thải tổng hợp, cố định riêng hoặc với Azospirillum brasilense Cd trong hạt alginate, được nuôi cấy ở 28 và 40oC dưới hai cường độ ánh sáng (60 và 2500 μmol m2s-1) và hai nồng độ amoni clorua ban đầu (25 và 50 mgl-1) (a-d). Quần thể vi khuẩn A. brasilense Cd trong điều kiện tăng trưởng (e, f). Vị trí cho mỗi lần nuôi cấy, trong mỗi subfigure riêng biệt được ký hiệu bằng chữ viết hoa khác nhau và khác đáng kể trong phân tích t-test của sinh viên tại P ≤ 0.05. Đơn vị đo áp xuất đại diện trong SE là bars. Dữ liệu được trình bày đầy đủ chu kì của mỗi 24h.

III.

KẾT QUẢ

3.1 Ƣu thế về nhiệt độ và sự tiếp xúc ánh nắng trong bể chứa nƣớc thải.

Nhiệt độ và cường độ ánh sáng trong khu vực này đã được đo trong ba năm liên tiếp (2003-2005) từ tháng 6 đến tháng 9. Mặc dù các giá trị thay đổi từ năm này sang 9

Bộ môn Công nghệ môi trường

Nhóm 2

năm khác và những ngày này sang ngày khác khi các phép đo được thực hiện, nhưng nhìn chung các đặc điểm tương tự nhau. Nhiệt độ vào buổi trưa được đo ( thấp – cao): tháng 6 ( 39.2 -40.6oC), tháng 7 (40-41.4oC), tháng 8 ( 38.9-39.2oC), tháng 9 ( 37.239.5oC). Cường độ ánh sáng vào buổi trưa (µmol m2s-1): ( thấp đến cao) tháng 6 (1969–2176), tháng 7 (2048–2137), tháng 8 (2002–2434), tháng 9 (1878–2040). Nhiệt độ bề mặt nước, nơi nuôi cấy tảo, là 36,6oC khi nhiệt độ không khí là 41oC (05 tháng 7 năm 2005 tại buổi trưa).

Hình 3: Tốc độ tăng trưởng (K) (a, b) của Chlorella sorokiniana UTEX 2805 cố định đơn bào hoặc với Azospirillum brasilense Cd trong hạt alginate và nuôi cấy trong nước thải tổng hợp tại 28 và 40oC dưới hai cường độ ánh sáng(60 và 2500 µmol m2s-1) và hai nồng độ amoni clorua ban đầu (25 và 50 mgl-1).

10

Bộ môn Công nghệ môi trường

Nhóm 2

3.2 Xác định tảo.

Chuổi di truyền 18S rDNA hoàn chỉnh của UTEX 2805 có sẵn trong ngân hàng Gen ( mã số AM423162). Với hai nucleotide trao đổi là nơi đa dạng nhất của gen ( Huss và cộng sự, 1986 ), có có tới 99 % kiểu di truyền tương tự với chủng SAG 211 – 8k (Sammlung Für Algenkulturen ở Gottingen, Đức) của C. sorokiniana (X62441).

Tương tự với các chủng sorokiniana khác (X73993, X74001, AB080307) dao động từ 99,6% đến 99,9%, tương ứng với bảy, ba, và một nucleotide trao đổi. Tương tự với các chủng khác liên quan mật thiết với loài Chlorella, C. vulgaris SAG 211-11b (X13688) và Chlorella lobophora Andreyeva 750-I (X63504), giống tới 99,5% .Dựa trên những dữ liệu phân biệt của nó, đó là một đặc điểm quan trọng cho C. sorokiniana (Kessler,1985), UTEX 2805 rõ ràng có thể được gán với C. sorokiniana.

Hình 4: Khả năng loại bỏ amoni của Chlorella sorokiniana UTEX 2805 từ nước thải tổng hợp, cố định đơn bào hoặc với Azospirillum brasilense Cd trong hạt alginate, ở 28 và 40oC dưới hai cường độ ánh sáng (60 và 2500 µmol m2s-1) Và hai nồng độ amoni clorua ban đầu (a, b) 25 và 50 (c, d) mgl-1. Các điểm là thời điểm mỗi lần ủ.

11

Bộ môn Công nghệ môi trường

Nhóm 2

3.3 Sự phát triển của chủng C. sorokiniana ở 40oC trong môi trƣờng nuôi cấy lơ lửng dƣới cƣờng độ ánh sáng cao.

Trong hệ thống giá thể lơ lửng, chủng C. sorokiniana UTEX 2805 một mình có thể không phát triển, tiếp xúc liên tục NH3 tại bất kỳ cường độ ánh sáng nào và bị chết (S. Fendrich, 2005 luận án Diploma, Technische Universität, Hamburg-Harburg, Đức).

Tiếp xúc khoảng NH3 5h ở 40oC, trong mỗi 24h (sau giai đoạn thích ứng), được cung cấp tảo và chúng đã tăng trưởng thành công ở tất cả các cường độ ánh sáng. Tại 45 µmol m2s-1, theo tính toán, tỷ lệ tăng trưởng cụ thể là 0,22 (thời gian nhân đôi 3.27 ngày). Ở 1032 µmol m2s-1, theo tính toán, tỷ lệ tăng trưởng cụ thể là 0,28 (thời gian nhân đôi 2.47 ngày), chứng tỏ sự tồn tại và tăng trưởng khá cao. Tại 2500 µmol m2s-1, tốc độ tăng trưởng cụ thể tính toán được là 0,06 (thời gian nhân đôi 11,43 ngày). Theo thử nghiệm, giới hạn tăng trưởng của tảo này là 42oC. 3.4 Sự phát triển của C. sorokiniana cố định với A. brasilensetrong hạt alginate tăng theo nhiệt độ và cƣờng độ của ánh sáng.

Dưới ảnh hưởng của nồng độ amoni khác nhau và được tiêm thêm MGPB A. brasilense, nhiệt độ cao (40oC) và cường độ của ánh sáng (2500 µmol m2s-1) so với trong điều kiện tăng trưởng chung (28oC và 60 µmol m2s-1) , cải thiện tăng trưởng đáng kể tăng trưởng của chủng C. sorokiniana (Fig. 2). Thúc đẩy tăng trưởng bởi A. brasilense thì thấy C. sorokiniana được phát hiện nhiều hơn ở nồng độ amoni clorua cao hơn (50 mgl-1) (Hình 2c.và d). Tương tự quần thể tảo đã được quan sát ở điều kiện nhiệt độ và ánh sáng giới hạn và dưới điều kiện tăng trưởng chung (Hình 2b và d.) .Tỉ lệ tăng trưởng lớn nhất khi A. brasilense đã được đồng cố định với C. sorokiniana khi tiếp xúc với điều kiện nuôi cấy giới hạn (Hình 3b.) dưới điều kiện nồng độ amoni cao. Hiệu quả tăng trưởng không được quan sát dưới điều kiện nồng độ amoni thấp (Hình 3a). Đồng thời, các quần thể của A. brasilense giảm ở các mức độ amoni thấp, nhưng vẫn cao hơn đáng kể trong điều kiện khắc nghiệt (Hình 2e.), trong khi duy trì quần thể tương tự theo nồng độ amoni cao bất kể điều kiện tăng trưởng.

3.5 Loại bỏ amoni trong nƣớc thải tổng hợp bởi C. sorokiniana cố định với A. brasilense dƣới điều kiện tăng nhiệt độ và cƣờng độ của ánh sáng. Ở mức độ amoni ban đầu thấp hơn, trong cùng môi trường chứa C. sorokiniana và A. brasilense loại bỏ amoni tốt hơn môi trường chỉ chứa C. sorokiniana (Hình 4a. và 12

Bộ môn Công nghệ môi trường

Nhóm 2

b), hiệu quả loại bỏ 100 % đã đạt được sau 96h dưới điều kiện ủ giới hạn (Hình 4b).

Dưới điều kiện tăng trưởng đều đặn, môi trường kết hợp đã không đạt được mức độ loại bỏ amoni này, nhưng cũng gần được (so sánh 4a và b sau 96 giờ ủ). Tại độ amoni ban đầu cao hơn trong điều kiện tăng trưởng đều đặn, môi trường kết hợp loại bỏ amoni tương tự như môi trường của các tảo đơn bào (Hình 4c). Tuy nhiên, trong điều kiện khắc nghiệt, môi trường kết hợp luôn luôn loại bỏ amoni hiệu quả hơn (Hình 4d).

3.6 Thay đổi sắc tố quang hợp của C. sorokiniana cố định với A. brasilense theo sự tiếp xúc với nhiệt độ khắc nghiệt và cƣờng độ của ánh sáng.

Với các vi khuẩn A. brasilense hiện diện dưới điều kiện môi trường xung quanh khắc nghiệt, tăng sự sản sinh sắc tố xảy ra trong C. sorokiniana (Fig. 5). Những sắc tố đó là chlorophyll a và b và hai phụ sắc tố bảo vệ , violaxanthin và zeaxanthin. Dưới điều kiện khắc nghiệt, cùng cố định luôn mang lại hiệu suất cao hơn của các sắc tố quang hợp (Hình. 5).

IV. THẢO U N. Đề ra phương pháp xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học phụ thuộc nhiều vào những nhu cầu của con người hơn là dựa vào sự sẵn có của các sinh vật và vi sinh vật. Sự hữu ích của bất kỳ chủng tảo nào để xử lý nước thải đều phụ thuộc vào hai thông số chính: (i) khả năng của các chủng để phát triển ở điều kiện môi trường hiện tại trong khu vực và (ii) khả năng của chúng để loại bỏ hiệu quả các chất ô nhiễm. Vì vậy, khi các nhà máy xử lý nước thải được đặt tại vùng có điều kiện môi trường khắc nghiệt ( rất lạnh với ánh nắng mặt trời thấp (Talbot et al., 1991) hoặc rất nóng với ánh nắng mặt trời rất cao (de-Ba-san et al., 2004). Sự lựa chọn của các vi sinh vật có thể sinh sôi nảy nở trong điều kiện môi trường khắc nghiệt là tối quan trọng. Tìm kiếm các vi sinh vật trong nước có khả năng phát triển trong các thiết bị xử lý nước thải cục bộ đòi hỏi một chiến lược cách ly cho các vi sinh vật chỉ định. Những gì cần được xác định là liệu chúng có vượt qua sự nghiên cứu cẩn thận các khả năng thích nghi trong đề án xử lý nước thải cục bộ.

13

Bộ môn Công nghệ môi trường

Nhóm 2

Hình 5. Sắc tố quang hợp của tảo Chlorella sorokiniana UTEX 2805 hoặc Azospirillum brasilense Cd cố định trong hạt alginate, được nuôi cấy trong nước thải tổng hợp tại 28 và 40oC dưới hai cường độ ánh sáng (60 và 2500 µlmol m2s-1). Và nồng độ clorua amoni ban đầu 50 mgl-1. Cột cho mỗi sắc tố, biểu hiện bằng một chữ in hoa khác nhau, có sự khác biệt đáng kể bởi một chiều ANOVA và post-hoc phân tích Tukey tại P ≤ 0.05.

Sau khái niệm này, chúng tôi phân lập một chủng tảo có khả năng hình thành nên những vùng tảo khổng lồ ổn định trong ao nuôi để xử lý nước thải. Tảo này được xác định là C.sorokiniana, một loài phát triển được cả ở nhiệt độ tương đối cao 35-400C (Morita et al, 2000a, b, 2002;.. Yamamoto et al, 2003). Nó tồn tại vài tháng ở sa mạc ở Baja California Peninsula (nơi nhiệt độ giữa ngày nơi bóng râm là 38-440C và trên 500C ở nơi có ánh sáng mặt trời trực tiếp. Đạt cực đại lên đến 2500 µmol photon m2s1

).

Chủng này đặc biệt không đòi hỏi nhiệt độ cao và ánh nắng dữ dội cho sự tăng

trưởng và thông thường có thể phát triển ở 280C và 30-60 µmol m2s- 1. Sự thích nghi của tảo thường đòi hỏi thời gian thích nghi (Claustre và Gostan, 1987;. Maxwell et al, 1994; Vonshak et al., 1996). Do đó, sau một thời gian nhân rộng sự thích nghi, Chủng vi tảo này có thể phát triển ở 400C và 2500 µmol m2s- 1 trong 5 giờ mỗi ngày. Với này, C.sorokiniana UTEX 2805 thích hợp cho sự phát triển trong điều kiện hiện tại ở các vùng sa mạc của bang California, Baja Peninsula của Mexico trong mùa hè cũng như tại những địa điểm có điều kiện khắc nghiệt tương tự.

14

Bộ môn Công nghệ môi trường

Nhóm 2

Mọi vi sinh vật được chỉ định để xử lý nước thải phải có khả năng loại bỏ các chất ô nhiễm trong các điều kiện môi trường nhất định. Amoni là một chất gây ô nhiễm phổ biến của nước thải sinh hoạt (de-Ba-san et al., 2004) và đã bị loại bỏ hoàn toàn khỏi nước thải trong điều kiện khắc nghiệt nhất. Thí nghiệm về cơ chế để loại bỏ amoni trong hệ thống xử lý nước thải này là do sự hấp thụ amoni vào trong tế bào vi tảo và sự loại bỏ chúng cùng với các hạt mà chúng cố định được (de-Ba-san et al., 2002b). Amoni ở nhiệt độ thấp khó bị loại bỏ hơn. Khi tảo đã được cố định trong các hạt alginate và A. brasilense [(một công nghệ hiện đang được phát triển cho xử lý nước thải) (de-Ba-san et al, 2004;.. Yabur et al, 2007) thì tốc độ tăng trưởng của C. sorokiniana tăng kích thích và loại bỏ amoni nhiều hơn. Một lời giải thích hợp lý cho hiệu quả gia tăng của MGPB vào sự tăng trưởng của tảo khi nồng độ amoni cao có thể liên quan với độ pH của quá trình nuôi cấy.

Thông thường, trong quá trình tăng trưởng, độ pH của môi trường tăng nhẹ, lên đến 0,5 đơn vị pH (de-Ba-san et al, 2002b;. Gonzalez & Ba-san, 2000). Nghiên cứu này cho thấy rằng mức độ amoni hỗ trợ là một tập hợp của MGPB. MGPB đã được chứng minh làm giảm ứng suất pH tăng trưởng của C. vulgaris và cũng được sử dụng để xử lý nước thải nhưng ở nhiệt độ thấp hơn và cường độ ánh sáng nhỏ hơn (de-Basan et al., 2005). Do đó một tác dụng tương tự của các tập hợp lớn A. brasilense cũng có khả năng đó dưới điều kiện khắc nghiệt.

Những đặc điểm này là tương tự như chủng C. vulgaris và C. sorokiniana khác đã được thử nghiệm trong điều kiện ít khắc nghiệt hơn (cường độ ánh sáng, nhiệt độ thấp) (Gonzalez và Ba-san, 2000; Gonzalez-Ba-san et al, 2000;. De-Ba-san et al., 2002b, 2004),. Nhưng chúng đã không thể phát triển trong điều kiện môi trường khắc nghiệt thử nghiệm trong bài này.

Tảo trong tự nhiên hay trong nuôi cấy luôn luôn liên kết với vi khuẩn (Litchfield ết al, 1969.). Những trường hợp này có thể gây ảnh hưởng tích cực hoặc tiêu cực đến sự phát triển của các loài tảo. Như đã chứng minh trong nghiên cứu này, trong điều kiện nhất định sự tăng trưởng và loại bỏ amoni bằng C. sorokiniana UTEX 2805 khi cố định với MGPB đã tạo tương tác tích cực. Tương tự như loài Chlorella được sử dụng để xử lý nước thải (de-Ba-san et al ., 2002b, 2004;. Hernandez et al, 2006).

15

Bộ môn Công nghệ môi trường

Nhóm 2

Khả năng loại bỏ các chất ô nhiễm một cách nhanh chóng và hiệu quả từ nước thải của các tác nhân vi sinh vật được sử dụng (de-Ba-san và Ba-san, 2004). Tác nhân sinh học tốt có thể loại bỏ các chất ô nhiễm trong thời gian lưu ngắn 1- 4 ngày (de-Ba-san et al., 2002b, 2004). Sorokiniana UTEX 2805 đáp ứng yêu cầu cơ bản này. Trong điều kiện nuôi cấy, chủng này ảnh hưởng đến cả mức độ kiểm soát nitơ lẫn ảnh hưởng đến việc loại bỏ amoni trong nước thải của C. vulgaris (de-Ba-san et al., 2005). Nghiên cứu này cho thấy rằng, khi nồng độ amoni cao hơn điều kiện nhiệt độ, cường độ ánh sáng là cực đại và sự có mặt của MGPB thì việc loại bỏ amoni bằng C. sorokiniana UTEX 2805 hiệu quả hơn. Mặc dù vậy, chủng tảo này loại bỏ amoni trong điều kiện trung bình thì kém hiệu quả hơn. . Điều tương tự từ kết quả thu được cho việc khử photpho bởi loài này (S. Fendrich, 2005, Diploma luận án, Technische Universität, Hamburg-Harburg, Đức).

C. sorokiniana có thể tăng trưởng dưới ánh sáng và nhiệt độ có cường độ mạnh trong lò phản ứng (46,50C; 1737 µmol m2s-1) (. Morita et al, 2000a, b) hoặc trong điều kiện thực để sản xuất nhiên liệu sinh học (Morita et al, 2002. ). Tuy nhiên, thực tế để xử lý nước thải , phytoremediation (cơ chế làm sạch môi trường bằng thực vật) sử dụng một cường độ ánh sáng (250-300 µmol m2s- 1) và nhiệt độ (30 – 350C) đã được thử nghiệm (Lee et al. năm 1996; Mun ~oz et al 2004, năm 2005;.. VONA et al, 2004;. Yoshida et al, 2006). Bởi vì chúng được thiết kế để sử dụng trong điều kiện môi trường khắc nghiệt (> 2000 µmol m2s-1trong vài giờ, hàng ngày) đã vượt xa các điều kiện báo cáo cho loài này.

Khi cường độ ánh sáng tăng lên, sắc tố quang hợp ở tảo (Scenedesmus quadricauda và C.sorokiniana) tăng lên. Khi điều này xảy ra, như trong thực vật bậc cao các sắc tố chu kỳ của xanthofin có tham gia tán xạ lượng dư thừa ánh sáng đã hấp thụ (Masojı'dek et al., 1999). Điều đó cũng được biết rằng khi cấy truyền bằng MGPB, A. brasilense tăng cường sản xuất các sắc tố quang hợp phụ trợ trong cây lúa mì (Ba-san et al., 2006). Hiện tượng tương tự xảy ra trong C. sorokiniana UTEX 2805.

V. KẾT LU N. Một chủng của C. sorokiniana được phân lập từ ao nuôi nước thải ổn định nằm trong khu vực sa mạc với điều kiện cực kỳ nóng (40-42oC và có cường độ ánh sáng 16

Bộ môn Công nghệ môi trường

Nhóm 2

lên đến 2500 µmol m2s-1). Các chủng này được xác định là có khả năng phát triển ở nhiệt độ cao hoặc môi trường xung quanh có mức độ ánh sáng cao, tương tự điều kiện ở sa mạc. Các chủng phản ứng tích cực, đó là, tăng trưởng số lượng, để cấy vi khuẩn làm thúc đẩy sự tăng trưởng của tảo. Các chủng này có thể làm giảm nồng độ ammonium trong nước thải (từ 10 mgl-1 NH4+ đến mức không phát hiện trong bốn ngày).

Lời cảm ơn.

Yoav Ba-san tham gia trong nghiên cứu này của Avner Ba-san và Uzi Ba-san.

Chúng tôi cảm ơn Lina-Maria Gonzalez tại Universidad Nacional de Colombia, Bogota, và Silke Fendrich tại Technische Universität Hamburg- Harburg, Đức cho hỗ trợ kỹ thuật trong giai đoạn ban đầu của nghiên cứu và Francisco Hernandez tại CIBNOR ở Mexico để phân tích sắc tố. Nghiên cứu này đã được hỗ trợ bởi chủ yếu Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologı'a (CONACYT Investigacion CIENTIFICA Basica 2005 đồng 50.560-Z), Secretaria de Medio Ambiente y Recursos Naturales của Mexico (hợp đồng SEMARNAT 23.510) và một phần tài trợ của Ba-san Foundation, USA.

17