KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG CỦA QUERCETIN-3-O-α-L-RHAMNOPYRANOSIDE-2’’-GALLATE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ KHOA HÓA HỌC ----- -----

TIỂU LUẬN Đề tài: PHÂN LẬP, ĐỊNH TÍNH, NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG CỦA QUERCETIN-3-O-α-LRHAMNOPYRANOSIDE-2’’-GALLATE (Tác giả: R. Manivannan, K. Prabakaran, S. Ilayaraja)

Môn: Một số vấn đề chọn lọc trong hóa hữu cơ

Huế, tháng 12 năm 2016 1

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com/

NỘI DUNG 1. Giới thiệu

Ơ

H

thiên nhiên. Nó được coi là các “chất bổ sinh học tự nhiên” vì bằng thực nghiệm,

N

Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất phong phú và đa dạng nhất trong

U Y

bằng cách phá vỡ cấu trúc chức năng của vi rút, vi khuẩn; làm thay đổi phản ứng của

.Q

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

ẠO

loại thuốc kháng sinh, tuy nhiên sự xuất hiện của một số mầm kháng thuốc cũng như

Đ

các tác dụng phụ không mong muốn của một sô loại thuốc kháng sinh đã dẫn đến nhu

N

G

cầu tìm kiếm những nguồn kháng sinh mới, đắc biệt là từ các cây thuốc.

H Ư

Trái với các loại thuốc tổng hợp, kháng sinh có nguồn gốc thực vật không gây

TR ẦN

ra nhiều tác dụng phụ và có tiềm năng điều trị các bệnh lây nhiễm rất lớn. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cây thuốc sản sinh ra một lượng lớn các chất chuyển hóa thứ cấp với tác dụng kháng khuẩn trên các mầm bệnh. Vì vậy, việc nghiên cứu các hoạt

10 00

B

tính kháng khuẩn của cây thuốc cổ truyền Ấn Độ cũng như ứng dụng của chúng đã trở thành một mối quan tâm và cũng là một thách thức lớn.

A

Vết thương là bất kỳ những tổn thương nào làm rách da hoặc các mô cơ bản.

Ó

Các tổn thương có thể bị gây ra bởi tai nạn, vết mổ sau phẫu thuật hoặc các chấn

Í-

H

thương khác. Quá trình chữa lành vết thương là quá trình sinh hóa để tái lập lại sự toàn

-L

vẹn về cấu trúc, lấy lại sức mạnh của mô bị thương. Các phương pháp được chọn để

ÁN

điều trị là các phương pháp cải thiện được một hay nhiều giai đoạn chữa lành vết thương mà không gây ra những tác dụng phụ có hại một cách lý tưởng nhất.

Từ những lý do trên, nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá hoạt động

D

IỄ N

Đ

ÀN

kháng khuẩn và điều trị vết thương của cao chiết clorofom của cây Salvia leucantha.

Skype : daykemquynhon@hotmail.com https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

TP

Việc điều trị các bệnh nhiễm trùng đã cho hiệu quả rõ rệt từ khi phát hiện ra các

TO

http://daykemquynhon.ucoz.com

cơ thể đối với các chất gây dị ứng, chất gây ung thư.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

N

flavonoid được chứng minh là có khả năng hoạt động trực tiếp như thuốc kháng sinh

2. Thực nghiệm 2.1. Phân lập và định tính Hoa tươi (2kg) của cây S. leucantha được thu thập từ những đoạn đường dốc vùng Kodaikanal, Dindugul,Tỉnh Tamilnadu, Ấn Độ và được định danh bởi Prof. N.

Ramakrishnan (Khoa thực vật học); mẫu được gửi đến Khoa thực vật học Trường đại học Bharathidasan, Ấn Độ.

2

Article Collection # Nguyen Thanh Tu M.S.

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com/

phươ pháp hồi Hoa của cây S. leucantha được chiết với metanol 90% bằng phương lưu. Dịch chiết ancol được cô đặc trong chân không thu được cao chiết. Sau đó cao

-L

Phân đoạn ete được cô đặc trong chân không và làm lạnh trong khoảng một

ÁN

tuần, thu được chất rắn màu vàng. Đem lọc, kết tinh lại với metanol thì thấy những

TO

tinh thể hình kim màu vàng nhạt được tách ra, có nhiệt độ nóng chảy: 313 - 3150C (kí

ÀN

hiệu là Chất 1). Nó tan dễ dàng trong dung môi hữu cơ và tan ít trong nước nóng. Chất

D

IỄ N

Đ

un nóng. Ngoài ra, 1 khử được AgNO3/NH3 khi làm lạnh và thuốc thử Fheling khi đun

Skype : daykemquynhon@hotmail.com https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

Hình 1. Sơ đồ phân lập

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U Y

N

H

Ơ

N

chiết được phân đoạn bằng ete và cloroform.

chất 1 còn tác dụng với thuốc thử Horhammer-Hansal, Wilson’s boric acid và Gibb’s.

Quá trình sắc kí và dữ liệu phổ UV của nó đều tương tự như aglycone flavonoid. Chất 1 được xác định là quercetin, được định tính bằng sắc kí bản mỏng và nhiệt độ nóng chảy (so sánh với chất chuẩn là quercetin được phân lập từ Physalisminima). Giá trị Rf được trình bày ở bảng 1.

3

Article Collection # Nguyen Thanh Tu M.S.

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com/

ẠO

2) Glycoside - Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside-2”-gallate

Đ

Hệ dung môi:

N

TR ẦN

c) Dung dịch acid actic 60%

H Ư

b) Dung dịch acid actic 30%

G

a) Dung dịch acid actic 15%

d) n-Butanol : acid acetic : nước = 4:1:5 e) Dung dịch phenol bão hòa

10 00

B

Phân đoạn cloroform được cô đặc trong chân không là được làm lạnh trong vài ngày cũng thu được một chất rắn màu vàng. Kết tinh lại với metanol thì cũng tách ra

A

được những tinh thể màu vàng nhạt, nhiệt độ nóng chảy: 316 - 3180C (kí hiệu là Chất

H

Ó

2). Chất 2 khử được AgNO3/NH3 nhưng không tác dụng với thuốc thử Fheling. Nó

Í-

hiện vết màu tím dưới tia UV và màu vàng xanh với NH3. Chất 2 phản ứng với các

-L

thuốc thử Wilson’s boric acid, Molisch, Gibb’s nhưng không phản ứng với thuốc thử

ÁN

Horhammer-Hansal.

TO

Dựa vào các dữ liệu phổ UV và NMR cho thấy chất 2 có cấu trúc của glycoside

D

IỄ N

Đ

ÀN

flavonol.

Skype : daykemquynhon@hotmail.com https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

1) Aglycone - Quercetin

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q TP

Hợp chất:

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U Y

N

H

Ơ

N

Bảng 1. Giá trị Rf (x100) của thành phần của hoa Salvia leucantha

2.2. Thủy phân Glycoside

4

Article Collection # Nguyen Thanh Tu M.S.

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com/

Glycoside được thủy phân toàn phần bằng dung dịch H2SO4 5% ở 1000C trong khoảng 2 tiếng và thủy phân từng phần bằng acid formic 10% trong cyclohexane. (mục đích của việc thủy phân glycoside là để tách phần phi đường và phần đường, sau

N

đó xác định cấu trúc của từng phần).

H

Ơ

2.3. Thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch

N

Hoạt động kháng khuẩn của hợp chất phân lập từ cao chiết cloroform được thực

.Q

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

TP

vi khuẩn được ủ trong 24h; nhiệt độ 370C; đường kính vùng bị ức chế được đo bằng

Đ

Chloramphenicol (30µg).

G

2.4. Điều chế Gel

H Ư

N

Từ 1gam chất phân lập được từ dịch chiết cloroform điều chế được 100gam Vaselin.

TR ẦN

2.5. Hoạt động chữa lành vết thương bằng mô hình

Lựa chọn các con vật có trọng lượng phù hợp với thí nghiệm và chia thành 4

B

nhóm. Chúng được gây mê và gây các vết thương tương đương nhau, có kích thước

10 00

2,5cm ×0,2cm. Nhóm 1 được để lành tự nhiên ở điều kiện bình thường. Nhóm 2, nhóm 3 được điều trị bằng chất phân lập được với liều lượng 100 mg và 200 mg. Nhóm 4

Ó

A

được điều trị bằng thuốc kháng sinh Soframycin. Theo dõi 4 nhóm trong 16 ngày, diện

H

tích vùng bị thương được đo ở các ngày 0,4, 8, 12, 16 cho tất cả các nhóm.

-L

Í-

2.6. Phân tích thống kê

ÁN

Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng các phương pháp thống kê (trung bình, anova).

TO

3. Kết quả và thảo luận

Hoa của cấy S. leucantha có chứa quercetin và quercetin-3-O-α-L-

Skype : daykemquynhon@hotmail.com https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

ẠO

mm.Chất chuẩn để so sánh là các chất kháng sinh Novobiocin (30µg),

ÀN

http://daykemquynhon.ucoz.com

Laboratory Standards) ở hai nồng độ khác nhau. Chất sau khi được đưa vào đĩa đã cấy

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

hiện bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (National Committee for Clinical

D

IỄ N

Đ

rhamnopyranoside-2”-gallate.

Quercetin Phổ UV của quercetin có hai pic chính ở 370nm và 250 nm, điều này cho thấy chất có bộ khung flavonoid. Sự phân hủy xảy ra khi thêm NaOMe vào aglycone.

Flavonoid mà có chứa các nhóm -OH tự do ở vị trí C-3, C-3’ và C-4’ thì không bền trong NaOMe và pic hấp thụ bị suy biến trong vài phút; điều này chứng tỏ rằng có các 5

Article Collection # Nguyen Thanh Tu M.S.

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com/

nhóm -OH ở vị trí C-3, C-3’, C-4’ trong hợp chất. Có sự gia tăng bước sóng +58 nm khi thêm AlCl3/HCl chứng tỏ sự có mặt của nhóm -OH tự do tại vị trí C-5 ở vòng A. Sự dịch chuyển +30nm được quan sát thấy trong trường hợp thêm AlCl3 nhưng không

Ơ

A

Glycoside flavonol

Ó

Phổ UV của glycoside flavonol từ phân đoạn cloroform cho thấy có pic hấp thụ

Í-

H

t bước sóng +54 nm khi thêm NaOMe chỉ ra sự có ở 255 nm và 340 nm. Sự gia tăng

-L

mặt của nhóm -OH tự so ở vị trí C-4’. Khi thêm AlCl3/HCl bước sóng dịch chuyển

ÁN

+60 nm chứng tỏ có nhóm-OH tự do ở C-5. Dải hấp thụ I trong phổ AlCl3 tăng +30nm

TO

suy ra có nhóm O-dihydroxyl ở vòng B. Sự có mặt của -OH tự do ở C-7 được xác định bởi sự gia tăng bước sóng +17 khi thêm NaOAc. Nhóm dihydroxyl ở vòng B cũng

D

IỄ N

Đ

ÀN

được xác định bởi sự gia tăng bbước sóng +27 nm khi thêm H3BO3.

Skype : daykemquynhon@hotmail.com https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

Quercetin có cấu trúc:

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q G

Đ

ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U Y

N

ở vòng B còn được xác định bở sự dịch chuyển bước sóng +16 nm khi thêm H3BO3.

H

tăng bước sóng + 20nm chứng tỏ có nhóm -OH ở vị trí C-7. Ngoài ra nhóm dihyroxyl

N

có mặt của HCl cho thấy vòng B có nhóm O-dihydroxyl. Khi thêm NaOAc có sự gia

6

Article Collection # Nguyen Thanh Tu M.S.

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com/

Trong phổ 1H-NMR của hơp chất phân lập được xuất hiện các pic ở δ 5,9 ppm và δ 6,2 ppm tương ứng với hiđro ở C-6, C-8. Hidro của nhóm 5-OH cộng hưởng ở δ 12,7 ppm và các singulet ở δ 7,3 ppm tương ứng với các hiđro ở C-2’ và C-6’. Các

H

Ơ

ro nhóm -CH3 của rhamnose xuất hiên ở δ 0,9 ppm. Các hiđro còn ở δ 4,4 ppm. Ba hiđro

N

hiđro ở C-5’ xuất hiện ở δ 6,8 ppm. Hiđro ở vị trí 1” của đường rhamnose cộng hưởng

C-NMR cho thấy có 27 cacbon trong hợp chất, trong đó có 15

B

cacbon là điển hình cho bộ khung flavone, những cacbon còn lại là của glycoside. Các

10 00

pic ở δ: 102,0; 71,9; 71,7; 71,3; 70,6, 17,3 là của đường và được đối chiếu với α-Lrhamnopyranoside.

Ó

A

Phổ 1H-NMR cho thấy sự có mặt của H anome ở δ 5,30 ppm suy ra có liên kết

H

α-glycoside. Mặt khác phổ 13C-NMR có C-3 ở δ 133,4 ppm chứng tỏ rằng có sự axyl

-L

Í-

hóa ở C-3. Căn cứ vào những dữ liệu trên, chất phân lập được từ cao chiết cloroform

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

có cấu trúc là:

Skype : daykemquynhon@hotmail.com https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

13

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q Dữ liệu phổ

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

http://daykemquynhon.ucoz.com

U Y

N

lại của đường xuất hiện trong khoảng δ 3,2 - 3,9 ppm.

7

Article Collection # Nguyen Thanh Tu M.S.

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com/

3.2. Nghiên cứu hoạt động kháng khuẩn

Nhiều loài cây và thành phần của chúng đã được nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn. Quercetin được sử dụng để ức chế các loại vi khuẩn - nguyên nhân gây bệnh

Ơ

H

các tác giả khảo sát hoa của S. leucantha và hoạt tính kháng khuẩn của nó bằng

N

về hô hấp, đường tiêu hóa, rối loạn về da và đường tiết niệu. Trong nghiên cứu này,

N

phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Thử nghiệm với cao chiết cloroform ở 3 nồng

.Q

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

TP

Thông thường, miền ức chế của thuốc kháng sinh thương mại là từ 26,0 và 36,0 mm ở

G

được hầu hết các vi sinh vật thử nghiệm (trừ C. albicans).

Đ

quả trên, ở nồng độ 200 µg, cao chiết cloroform có vùng ức chế cao nhất, nó ức chế

H Ư

N

Bảng 2. Kết quả khả năng kháng khuẩn của quercetin glycoside

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

(Vùng bị ức chê - mm)

Í-

H

3.3. Hoạt động chữa lành vết thương

-L

Hệ thống cây thuốc cổ truyền của Ấn Độ, đặc biệt là hệ thống Ayurveda,

ÁN

Siddha và Unani có một số lượng lớn các cây thuốc để điều trị các tổn thương về da bao gồm vết cắt và bỏng. Cuộc điều tra khảo sátkhả năng chữa lành vết thương của hợp chất quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside-2”-gallated được chiết từ S. leucantha

Nghiên cứu trên mô hình vết thương do bị cắt cho thấy cả 4 nhóm đều giảm vùng bị thương qua từng ngày và hợp chất phân lập được cũng có tác dụng điều trị vết thương (khi so sánh với với nhóm được để tự nhiên và nhóm được điều trị bằng thuốc).

D

IỄ N

Đ

ÀN

được so sánh với thuốc chuẩn (Soframycin). Kết quả được trình bày ở bảng sau:

Skype : daykemquynhon@hotmail.com https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

ẠO

50µg; sự ức chế của quercetin glycosides là từ 2,0 đến 28 µg. Căn cứ vào những kết

TO

http://daykemquynhon.ucoz.com

so sánh với các chất kháng sinh chuẩn là Novobiocin và Chloramphenicol (bảng 2).

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U Y

độ khác nhau: 50, 100, 200 µg. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết cloroform được

8

Article Collection # Nguyen Thanh Tu M.S.

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com/

H

Ơ

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

U Y

Nghiên cứu này đã chứng minh rằng hợp chất quercetin-3-O-α-L-

.Q

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

ẠO

vật. Vùng có hiệu quả ức chế cao nhất được quan sát thấy ở khuẩn S. aureus (28mm)

Đ

và E. coli (24mm). Từ đó xác định được giá trị của cây S. leucantha và thấy được

H Ư

N

G

hướng nghiên cứu cần được quan tâm để phát triển các loại thuốc mới.

TR ẦN

----------------------------------

10 00

B

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. R. Manivannan, K. Prabakaran, S. Ilayaraja (2014), “Isolation, Identification and

A

Antibacterial and Wound Healing Studies of Quercetin-3-O-α-L-Rhamnopyranoside-

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

2”-Gallate”, International Journal of Applied Science and Engineering, 99-106.

D

IỄ N

Đ

Skype : daykemquynhon@hotmail.com https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

TP

chữa lành vết thương. Những thuốc này có khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi sinh

ÀN

http://daykemquynhon.ucoz.com

rhamnopyranoside-2”-gallated phân lập từ S. leucantha có khả năng kháng khuẩn và

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

N

4. Kêt luận

9

Article Collection # Nguyen Thanh Tu M.S.

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

International Journal of Applied Science and Engineering 2014. 12, 2: 99-106

Isolation, Identification and Antibacterial and Wound Healing Studies of Quercetin-3-O- α-L- Rhamnopyranoside -2- Gallate R. Manivannan, K. Prabakaran*, and S. Ilayaraja Department of Chemistry, Government Arts College (Autonomous), Kumbakonam, Tamilnadu, India Abstract: Flavonoids were isolated from flowers of Salvia leucantha using chromatography separation techniques. The structure of the isolated compound was analyzed by chemical tests and spectroscopic methods such as UV, 1H-NMR, and 13C-NMR. The spectral data’s proved its structure confirmed as Quercetin-3-O- α-L- rhamnopyranoside -2- gallate. The present study was to evaluate the agar diffusion antibacterial against gram positive and gram negative microorganisms and wound healing activities to excision wound model in albino rats, respectively. The highest inhibitory zone was observed in S. aurous (28mm), and E. coli (24mm).

The results revealed most valuable information and also support the continued sustainable use of Quercetin-3-O- α-L- rhamnopyranoside -2- gallate isolated from Salvia leucantha in traditional system of medicine for future development of new antibiotic agents.

Keywords: Quercetin-3-O- -L- rhamnopyranoside -2‫ ׀׀‬- gallate; antibacterial activity; Salvia leucantha; wound healing.

1. Introduction Flavonoids have been referred to as “nature’s biological response modifiers” because of strong experimental evidence of their inherent ability to modify the body’s reaction to allergens, viruses, and carcinogens [1]. Microbiological growth commonly induces undesirable organoleptic and appearance change. In classifying the antibacterial activity as gram- positive or gram-negative, it would generally be expected that a much greater number would be active against gram-positive than gram-negative bacteria [2]. However, treatment of infections has been remarkably effective since the discovery of antibacterial drugs, appearance of some resistant pathogens as well as undesirable side effect of certain antibiotics have led to the search for new antibacterial agents, in particular from medicinal plants [3-5]. Contrary to the synthetic drugs, antimicrobials of plant origin are not associated with many side effects and have an enormous therapeutic potential to heal many infectious diseases [6]. Numerous studies have reported that medicinal plants produce a large number of secondary metabolites with antimicrobial effects on pathogens [7, 8].

Therefore, the study of the antibacterial activity of some Indian traditional medicinal plants and the application in edible film has become an important research interest and a big challenge.

Wounds are any damage to or break of the skin or underlying tissues. The damage may be *

Corresponding author; e-mail: manickam_mani@yahoo.co.in

© 2014 Chaoyang University of Technology, ISSN 1727-2394

Received 18 June 2013 Revised 5 February 2014 Accepted 13 February 2014

Int. J. Appl. Sci. Eng., 2014. 12, 2

99

R. Manivannan, K. Prabakaran, and S. Ilayaraja

caused by accidents, incisions from surgery or others traumas [9]. The process of wound healing consists of integrated cellular and biochemical events leading to the reestablishment of structural and functional integrity with regain of strength of injured tissue. A therapeutic agent selected for the treatment of wounds should ideally improve one or more phases of healing without producing deleterious side effects [10]. By considering these above and other factors the present investigation was undertaken to evaluate the antibacterial and wound healing activities by using the chloroform extract of Salvia leucantha.

2. Materials and methods 2.1. Isolation and identification Fresh flowers (2kg) of S. leucantha collected from the slopes of Kodaikanal, Dindugul District, Tamilnadu (India) and authenticated by Prof. N. Ramakrishnan, (Department of Botany) and voucher specimens (GACBOT-160) were deposited at the Herbarium of the Department of Botany, Government Arts College (Autonomous), Kumbakonam, Bharathidasan University, India. The flowers of S. leucantha were extracted with 90% methanol (MeOH) (4x500mL) under reflux. The alcoholic extract was concentrated in vacuo and the aqueous concentrate was fractionated with peroxide free ether (3x250mL) and chloroform (4x250mL).

The ether fraction was concentrated in vacuo and left in an ice-chest for a week. A yellow solid that separated was filtered and studied. On crystallization from MeOH, pale yellow needles were obtained [melting point: 313-315˚C]. It was readily soluble in organic solvents and sparingly in hot water. It reduced ammoniacal AgNO3 in the cold and Fehling’s solution on heating. It answered the Horhammer-Hansal, Wilson’s boric acid and Gibb’s tests. It chromatographic behavior and UV spectral data were all similar to those for the free aglycone flavonoid. It was identified as quercetin and the identity was confirmed by paper chromatography (p.c) and melting point (m.p) with an authentic sample of quercetin from Physalisminima [11, 12]. The Rf values are indicated in Table 1.

Table 1. Rf (X100) values of the constituents of the flowers of salvia leucantha (Whatmann no.1, ascending, 30±2˚C) *Developing solvents Compounds a b c d e 1 Aglycone 04 17 38 85 39 Quercetin (authentic) 04 17 38 85 39 2 Glycoside 48 65 60 78 51 Glycoside (authentic) 48 65 60 78 51 Compounds 1) Aglycone - Quercetin 2) Glycoside - Quercetin-3-O- α-L-rhamnopyranoside-2‫ ׀׀‬-gallate *Solvent key a) 15% aqueous acetic acid, b) 30% aqueous acetic acid, c) 60% aqueous acetic acid, d) n-Butanol (B): Acetic acid (A): Water (W)=4:1:5 BAW (upper phase), e) Phenol saturated with water.

100

Int. J. Appl. Sci. Eng., 2014. 12, 2

Isolation, Identification and Antibacterial and Wound Healing Studies of Quercetin-3-O- α-L- Rhamnopyranoside -2- gallate

The chloroform fraction was concentrated in vacuo and left in an ice-chest for a few days. A yellow solid [m.p. 316-318˚C] that separated was filtered and studied. It came out as pale yellow crystals on recrystallization from MeOH. It reduced ammoniacal AgNO3 solution but not Fehling’s solution. It appeared deep purple under UV that turned yellowish green on exposure to NH3. It responded to Wilson’s boric acid, Molisch and Gibb’s tests, but did not answer the Horhammer-Hansal tests.

Supporting evidence for the structure of the flavonol glycoside is provided by the UV and NMR (100 MHz, DMSO-d6 and TMS) spectral data were recorded on a Bruker AMX 400 NMR spectrometer.

1

H-NMR spectrum δ (400MHz, DMSO-d6, TMS):δ ppm 12.64 (1H, s, 5-OH), 7.62 (1H, d, J=2.5Hz, H-2), 7.60 (1H, dd, J=8.5, 2.5Hz, H-6), 6.85 (1H, d, J=8.5Hz, H-5), 6.80 (1H, d, J=2.5Hz, H-8 ), 6.43 (1H, d, J=2.5Hz, H-6 ), 5.49 (1H, d, J=6.9Hz, H-1 ), 5.55 (1H, s, H-1), 5.4~3.0 (17H, m, glc and rha ), 1.12 ( 3H, d, J = 6.0 Hz, -CH3).

13

C- NMR(400 MHz, DMSO-d6 and TMS):δ ppm 177.4 (C-4); 164.1 (C-7); 161.2 (C-5); 156.3 (C-2,9); 148.4 (C-4); 144.8 (C-3); 133.4 (C-3); 121.5 (C-6); 121.2 (C-1); 115.2 (C-2,5); 104.0 (C-10); 102.0 (C-6,1); 93.5 (C-8); 71.9 (C-2); 71.7 (C-3); 71.3 (C-4); 70.6 (C-5); 17.6 (C-6).

2.2. Hydrolysis of the glycoside The glycoside dissolved in hot aqueous methanol was hydrolyzed with H2SO4 (5%) at 100˚C for about 2 hrs. The excess of alcohol was distilled off in vacuo and the resulting aqueous solution was extracted with ether. The residue from ether fraction was studied as described below.

The glycoside was subjected to partial hydrolysis by treatment with 10% formic acid in cyclohexane and the resulting solution extracted with chloroform.

2.3. Antibacterial activity by agar diffusion method The antibacterial activity of the isolated compound from chloroform extract was carried out by agar diffusion assay (National Committee for Clinical Laboratory Standards) using two different concentrations. The test microbe was taken from broth culture with an inoculating loop and transferred to a test tube containing 5.0mL sterile distilled water. The inoculum was added until the turbidity was equal to 0.5 McFarland standards. Cotton swab was then used to inoculate the test tube suspension onto the surface of Muller Hinton agar plate and the plate was allowed to dry. By using sterilized Whatmann paper disks (6mm in diameter) were transferred onto the agar surface. Two different concentrations of isolated compound were poured into the plates. The plates were incubated for 24 hours at 37°C and the zone of inhibition was measured in mm.

Standard discs of the antibiotic Novobiocin (30µg), Chloramphenicol (30µg) served as the positive antibacterial controls.

2.4. Gel formulation The chloroform extract thus obtained was evaporated at 40°C to dryness in a rotary evaporator in vacuum. The product thus obtained was used for gel formulation. 1g of the isolated compound was made up to 100g using Vaseline.

Int. J. Appl. Sci. Eng., 2014. 12, 2

101

R. Manivannan, K. Prabakaran, and S. Ilayaraja

2.5. Wound healing activity by excision wound model The animals were weight matched and placed into four groups (n=6 per group) for the experiment. They were anaesthetized and a full-thickness 2.5cm (width) x0.2cm (depth) excision wound was created. Group I animals served as normal control; animals in Groups II and III served as experimental animals with isolated drug at 100 and 200mg respectively and Group IV served as standard controls per day for sixteen days. Before starting the experiment on animals, the experimental protocol was subjected to the scrutiny of the Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), Bharathidasan University, Trichirappalli, Tamilnadu, India (Approval No. BDU/IAEC/2011/31/29.03.2011). The treatment was done topically in all the cases. Changes in wound areas were calculated, giving an indication of the rate of wound contraction. Wound areas were measured on days 0, 4, 8, 12 and 16 for all the groups. Wound contraction was calculated as percentage of the reduction in wound area Percentage of wound contraction=[(Initial wound area-Specific day wound area)/Initial wound area]x100.

2.6. Statistical analysis The experimental results were expressed as multiple comparisons of Mean±SEM were carried out by one way analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnet Multiple Comparisons Test and statistical significance was defined as p < 0.05.

3. Results and discussion 3.1. Chemical constituents The flowers of S. leucantha have been found to contain quercetin and its Quercetin-3-O- α-Lrhamnopyranoside -2- gallate (Figure 1). The UV spectrum of the aglycone exhibited two major peaks at 370 nm (band-I) and 255 nm (band-II), to reveal a flavonoid skeleton. Decomposition was observed on the addition of NaOMe to the aglycone. Since flavonoid which has free hydroxyl groups at the 3, 3 and 4-positions are unstable in NaOMe and the absorption peaks degenerated in a few minutes, it was inferred that there was free -OH group at C-3, C-3 and C-4 in the compound. A shift of +58nm on the addition of AlCl3-HCl showed the presence of a free 5-OH in the A-ring. A shift of +30nm was observed in the case of AlCl3 without acid, which also revealed a B-ring showed O-dihydroxyl group. The presence of a free -OH at C-7 was ascertained by a shift of +20nm (band-II) on the addition of NaOAc. The catechol type of dihydroxyl group in B-ring was further evidenced by the bathochromic shift +16nm on the addition of H3BO3.

The UV spectrum of the flavonol glycoside from the chloroform fraction showed two absorption peaks at 255nm and 340nm. A bathochromic shift of 54nm (band-I) showed that the NaOMe spectrum indicated the presence of a free -OH at C-4. The AlCl3/HCl spectrum showed a bathochromic shift of +60nm ascertained the presence of a free 5-OH. The band-I absorption in AlCl3 spectrum is +30nm more than that showed on the addition of AlCl3/HCl. This indicates that O-dihydroxyl group presents in the B- ring. The presence of a free -OH at C-7 was evident from the bathochromic shift of +17nm (band-II) on the addition of NaOAc. The dihydroxyl group in B- ring was further evidenced by the bathochromic shift of +27nm on the addition of H3BO3.

In the 1H-NMR spectrum of the isolated compound appears at δ 5.90ppm and δ 6.20ppm corresponding to C-6 and C-8 protons respectively. The 5-OH proton resonates at δ 12.70ppm

102

Int. J. Appl. Sci. Eng., 2014. 12, 2

Isolation, Identification and Antibacterial and Wound Healing Studies of Quercetin-3-O- α-L- Rhamnopyranoside -2- gallate

and the signals at δ 7.30ppm correspond to the protons at C-2 and C-6. The protons at C-5 appear at δ 6.80ppm and H-1 of rhamnose resonates at δ 4.40ppm respectively. The three methyl protons of the sugar rhamnose appear at δ 0.90ppm. The rest of the sugar protons appear in the range δ 3.20-3.90ppm. The 13C NMR data indicated that were 27 carbons in this structure, 15 of which were typical for a flavone skeleton, and the others were assigned to glycoside.

Analysis of 1H and 13C-NMR data revealed that the aromatic signals are close to those reported for quercetin moiety [13, 14]. The sugar signals 13C-NMR, δ ppm 102.0, 71.9, 71.7, 71.3, 70.6 and 17.6 are comparable with those reported for α-L-rhamnopyranoside [15], 1H showed the presence of anomeric proton signal at , δ ppm 5.30 (1H, brs) indicated the presence of α- Linked sugar. The sugar moiety was proved to be acylated at C-3 of the aglycone as deduced from the correlation between the anomeric proton at δ ppm 5.30 and the C-3 at δ ppm 133.4.

Based on the above mentioned physical and chemical evidences the aglycone and glycoside obtained from S. leucantha flowers has been characterized as the quercetin-3-O- α-Lrhamnopyranoside -2 -gallate with those reported for similar compounds [11-13].

Figure 1. Quercetin-3-O- α-L- rhamnopyranoside -2 -gallate 3.2. Antibacterial activity study Many plants and their constituents have been investigated for their antibacterial activity [16].

Quercetin seems to exert antibacterial activity against almost all the strains of bacteria known to cause respiratory, gastrointestinal, skin and urinary disorders [17]. In the present study we investigated the flowers of S. leucantha for their antibacterial properties using agar diffusion method. The clinically important strains at three different concentrations at 50, 100 and 200μg of chloroform extract from S. leucantha were tested. The antibacterial activity against clinical isolates of Staphylococcus aureus, Bacillus subtillis, Sarcina lutea gram positive group and E. coli, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans gram negative group. These bacteria were chosen to be studied as they are important pathogens and also due to rapidly developed antibiotic resistance as antibiotic use increases.

The antibacterial activity of chloroform extract was compared with the standard antibiotics such as Novobiocin and Chloramphenicol in Table 2. In general, the mean zone of inhibition produced by the commercial antibiotics was between 26.0 and 36.0mm at 50μg and the inhibition produced by quercetin glycosides which was between 2.0 and 28.0mm. Based on the results, the chloroform extract at 200μg showed the maximum zone of inhibition when compared with the commercial antibiotic against all the tested microorganisms and also it was more active against S. aureus and E. coli, no growth was observed in both organisms. A slight decrease inhibition zone was observed for S. aureus at 200μg when compared with other tested microorganisms. However, the quercetin glycosides did not exhibit any activity against C. albicans.

Int. J. Appl. Sci. Eng., 2014. 12, 2

103

R. Manivannan, K. Prabakaran, and S. Ilayaraja

Table 2. Anti-microbial effects of quercetin glycoside drug determined by agar diffusion method (zone of inhibition in mm) Quercetin Quercetin Quercetin Standard-1 Standard-2 Microorganisms glycoside glycoside glycoside novobiocin chloramphenicol (50µg) (100µg) (200µg) (50µg) (50µg) S. aureus 16 22 28 33 B. subtillis 6 13 17 36 S. lutea 8 15 19 27 E. coli 9 17 24 28 P. aeruginosa 2 5 10 31 C. albicans 26 Note: (-) indicates no inhibition.

3.3. Wound healing activity The classical system of Indian medicine especially Ayurveda, Siddha and Unani employ a large number of medicinal plants for treatment of skin disease, which includes cut wounds and burns [10]. The present investigation revealed that the quercetin-3-O- α-L- rhamnopyranoside -2 -gallate extracted from S. leucantha was investigated for its wound healing activity by comparing it with the standard soframycin ointment. Albino rats were used as animal models where a control is used for the purpose of deciding the healing property. The clinical observations on wound healing were discussed below. The studies on excision wound healing model reveals that all the four groups showed decreased wound area day by day. On complete wound closure, epithelization was observed on the 16th day (Table 3). All readings are found to be statistically significant and comparable with control. However, on 16th post wounding day, the period of epithelization 62.46±2.29 was found to be control animals (which may be due to self-immunity) whereas soframycin treated animals showed 18.93±2.21. On the other hand, the quercetin treated groups showed 46.18±1.79 (Group-II) and 31.50±1.56 (Group-III) respectively.

On the 12th day, the standard and chloroform extract at 200mg treated animals showed significantly greater wound closure when compared to control animals.

Table 3. Effect of drug on excision wound [wound area (mm2)] Wound contraction (mm2/rat) (M±SD) Oral treatment 0 day 4th day 8th day 12th day 16th day Group I 365.83±1.52 274.00±2.89 260.30±1.23 124.14±1.08 62.46±2.29 Group II 348.87±2.17 251.67±1.58 182.87±2.03 98.02±2.26 46.18±1.79 Group III 378.10±3.02 236.80±2.16 164.11±2.98 78.45±1.68 31.50±1.56 Group IV 386.43±3.27 258.43±1.54 134.10±3.61 48.23±1.64 18.93±2.21 Values are expressed by mean ± stranded deviation (M±SD) One-way ANOVA (Dunnetts method) Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

Subset for alpha=0.05 level Group (I): No treatment and served as controlled.

Group (II): Test group with wound and treated with isolated Quercetin glycoside (100mg/day).

Group (III): Test group with wound and treated with isolated Quercetin glycoside (200mg/day).

Group (IV): Test group with standard drug ointment (Soframycin).

104

Int. J. Appl. Sci. Eng., 2014. 12, 2

Isolation, Identification and Antibacterial and Wound Healing Studies of Quercetin-3-O- α-L- Rhamnopyranoside -2- gallate

4. Conclusions The present investigations our results demonstrate that quercetin-3-O- α-Lrhamnopyranoside -2- gallate extracted from S. leucantha possess significant antibacterial and wound healing activity. The drugs are capable of inhibiting the growth of the organism. The highest inhibitory zone was observed in S. aureus (28mm), and E. coli (24mm). Thus the study ascertains the value of plants used in ayurveda, which could be of considerable interest to the development of new drugs.

References [ 1] Manivannan, R. and Sukumar, D. 2007. The RBC memebrane stablisation in an in vitro method by the drug isolated from Leucas aspera. Internation Journal of Applied Science and Engineering, 5, 2: 133-138. [ 2] MC Cutcheon, A. R., Ellis, S. M., Hancock, R. E. W., and Towers, G. H. N. 1992. Antibiotic screening of medicinal plants of the British Columbian native peoples. Journal of Ethnopharmcology, 37: 213-223. [ 3] Shahidi, B. 2004. Evaluation of antibacterial properties of some medicinal plants used in Iran. Journal of Ethnopharmcology. 94: 301-305. [ 4] Zaidan, M. R. S., Noor Rain, A., Badrul, A. R., Adlin, A., Norazah, A., and Zakiah, I. 2005.

In vitro screening of five local medicinal plants for antibacterial activity using disc diffusion method. Trop Biomed, 22, 2: 165-170. [ 5] Kelmanson, J. E., Jagar, A. K., and Van Staden, J. 2000. Zulu medicinal plants with antibacterial activity. Journal of Ethnopharmcology, 69: 241-246. [ 6]--Iwu, M. W., Duncan, A. R., and Okunji, C. O. 1999. “New Antimicrobials of Plant Orgin, In: Janick. J. (ed.): Perspectives on New Crops and New Uses”. ASHS Press, Alexandria, 457-462. [ 7] Mari, M., Bertolini, P., and Pratella, G. C. 2003. Non-Conventional methods for the control of Post-Harvest pear diseases. Journal of Applied Microbiology, 94, 5: 761-766. [ 8] Obagwu, J., and Korsten, L. 2003. Control of citrus green and blue molds with garlic extracts. European Journal of Plant Pathol, 109: 2-7. [ 9] Ramzi, S. C., Vinay, K., and Stanley, R. 1994. Pathologic basis of diseases. Philadelphia: WB Saunders Company, 5: 86.

[10] Savanth, S. S. and Shah, R. A. 1998. “Text book and atlas of Dermatology and Cosmetology”. Mumbai: ASCAD, 12-17.

[11] Harborne, J. P. and Mabry, T. J. 1982. “The flavonoids Advances in Research”. Chapman and Hall, London.

[12] Abe, F., Iwase, Y., Yamuchi, T., Yahara, S., and Nohara, T. 1995. Flavonol sinupoyl glycosides from leaves of Thevetia peruviana. Phytochem, 40: 577-581.

[13] Agarwal, P. K., and Bansal, M. C. 1989. Flavonoid glycoside. In: Agarwal, P. K. (ed.)

“Carbon 13 NMR of flavonoid”. Elsevier, Amesterd, 283-364.

[14] Markharn, K. R., Ternai, B., Stanley, R., Geiger, H., and Mabry, T. J. 1978. Carbon 13 NMR studies of flavonoids-III, Naturally occurring flavonoid glycosides and their acylated derivatives. Tetrahed, 34: 1389-1397.

[15] Myers, K. A., Marshal, R. D., and Friedin, J. 1980. “Principles of pathology in surgery, 1st edn”. London, Blackwell Scientific Publications, 58-82.

[16] Manivannan, R. and Ilayaraja, S. 2013. Kaempferol-3-O-α -L-arabinopyranosyl

Int. J. Appl. Sci. Eng., 2014. 12, 2

105

R. Manivannan, K. Prabakaran, and S. Ilayaraja

(1â&#x2020;&#x2019;6)-β-D- galactopyranoside from Phytolacca octandra and its antimicrobial activity.

Chemistry of Natural Compounds, 49: 336-337.

[17] Parul Lakhanpal, and Deepak Kumar Rai. 2007. Quercetin: a versatile flavonoid. Internet Journal of Medical Update, 2: 722-737.

106

Int. J. Appl. Sci. Eng., 2014. 12, 2