PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT SAPONIN TRONG CAO SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis) ĐÃ BẢO QUẢN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT SAPONIN TRONG CAO SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis) ĐÃ BẢO QUẢN

Sinh viên thực hiện: PHẠM DUY LINH Ngành: Công nghệ Hóa học Niên khóa: 2008 - 2012

Tháng 8/2012

PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT SAPONIN TRONG CAO SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis) ĐÃ BẢO QUẢN

Tác giả

PHẠM DUY LINH

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành Công nghệ hóa học

Giảng viên hướng dẫn: ThS. BÙI THẾ VINH

Tháng 8/2012

LỜI CẢM ƠN Lời cảm ơn đầu tiên em xin gửi đến Ban Giám Hiệu cùng các thầy cô Bộ môn Công nghệ Hóa học trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM đã tạo điều kiện cho em học tập và thực hành tốt, tạo nền tảng kiến thức vững chắc cho tương lai sau này.

Em xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS Trần Công Luận, giám đốc Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em được thực hành và nghiên cứu để hoàn thành đề tài luận văn này.

Em vô cùng cảm ơn thầy ThS. Bùi Thế Vinh đã tận tình hướng dẫn em từ lúc em bắt đầu đến khi hoàn thành đề tài, thầy luôn theo dõi, quan tâm chỉ dạy em giúp em giải đáp những thắc mắc, khó khăn trong quá trình thực hiện để hiểu rõ hơn về nhiệm vụ luận văn của mình và thực hiện nhiệm vụ đó cách tốt nhất có thể.

Em xin cảm ơn các thầy cô khác của Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM, cùng các anh chị đã giúp đỡ, động viên em hoàn thành tốt đề tài luận văn của mình.

Con xin chân thành gửi đến gia đình lòng biết ơn sâu sắc, gia đình đã tạo cho con mọi điều kiện tốt nhất về tinh thần và vật chất, làm chỗ dựa vững chắc để con yên tâm học tập và hoàn thành tốt bài luận văn của mình.

Sau cùng, tôi xin cảm ơn tất cả các bạn lớp DH08HH và tại Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM đã chia sẻ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

i

TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT SAPONIN TRONG CAO SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis) ĐÃ BẢO QUẢN” được tiến hành tại Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM, thời gian từ tháng 01/2012 đến tháng 8/2012.

Saponin là một hợp chất chính có hoạt tính sinh học, có nhiều trong các cây thuộc chi Sâm (Panax), họ Nhâm Sâm (Araliaceae). Panax vietnamensis (sâm Ngọc Linh hay sâm Việt Nam, sâm K5,…) là một loài sâm đặc hữu của Việt Nam, ngoài các thành phần giống như các loài sâm nổi tiếng như sâm Triều Tiên (Panax ginseng) hay sâm Mỹ (Panax quinquefolium L) với cấu trúc protopanaxadiol, protopanaxatriol. Sâm Việt Nam còn có hợp chất saponin dammaran kiểu ocotillol là majonosid R2 (MR2) chiếm hơn 50% hàm lượng saponin có trong sâm. Thành phần này quyết định những khác biệt của sâm Việt Nam so với sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc trong trị liệu.[27] Dựa trên kĩ thuật sắc kí: sắc kí cột cổ điển, sắc kí bản mỏng, đề tài đã phân lập và định danh được hai hợp chất saponin là majonoside R2 (MR2) và Ginsenoside Rb1. Ngoài ra, còn xác định được cấu trúc một phân tử đường là bằng kĩ thuật phổ học NMR.

ii

-D-Fructo pyranose

ABSTRACT

The thesis "Isolation of the saponin compounds from Panax vietnamensis extract preserved" was conducted at HCMC Research Center of Ginseng and Medicinal Materials from 01/2012 to 8/2012.

Saponin were the major compounds which have biological activity, can be found in the genus Ginseng (Panax), araliaceae. Panax vietnamensis (ginseng or ginseng Vietnam Ngoc Linh, K5 ginseng, ...) is an endemic species of ginseng in Vietnam, in addition to the ingredients like ginseng species known as Korean ginseng (Panax ginseng) or American ginseng (Panax quinquefolium L) with the structure of protopanaxadiol, protopanaxatriol, the Vietnam ginseng has the saponin compounds with majonosid dammaran ocotillol type (majonosid R2, MR2) over 50% concentration of saponin in ginseng. This component was the remarkable differences compared with Korean ginseng and Chinese ginseng[27].

Basing on the chromatographic techniques: column chromatography, thin layer chromatography. This study has isolated and identified two compounds are saponins majonoside R2 (MR2) and ginsenoside Rb1. In addition, a sugar was also isolated and elucidared,it’s structure was determited that ι-D-fructo-pyranose by NMR spectroscopy techniques.

iii

MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................i TÓM TẮT ..................................................................................................................... ii ABSTRACT ................................................................................................................. iii MỤC LỤC .....................................................................................................................iv Chương 1 ........................................................................................................................1 GIỚI THIỆU ..................................................................................................................1 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ.......................................................................................................1 1.2 MỤC ĐÍCH VÀ PHẠM VI CỦA ĐỀ TÀI ...........................................................2 1.3 Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI.......................................................................................2 Chương 2 ........................................................................................................................3 TỔNG QUAN.................................................................................................................3 2.1 HỌ NHÂN SÂM (ARALIACEAE)......................................................................3 2.2 CHI SÂM (PANAX) .............................................................................................3 2.3 PHÂN BỐ .............................................................................................................4 2.4 GIỚI THIỆU VỀ SÂM NGỌC LINH ..................................................................4 2.4.1 Nguồn gốc và lịch sử phát hiện .....................................................................4 2.4.2 Danh pháp khoa học ......................................................................................5 2.4.3 Hình thái thực vật...........................................................................................5 2.4.4 Dược tính .......................................................................................................8 2.4.5 Quá trình nghiên cứu TPHH của sâm Ngọc Linh ........................................10 2.5 TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT SAPONIN .......................................................11 2.5.1 Định nghĩa....................................................................................................11 2.5.2 Tính chất của saponin ..................................................................................12 2.5.3 Phân loại saponin (theo thành phần hóa học) ..............................................13 2.5.4 Sự phân bố trong thực vật ............................................................................15 2.6 KỸ THUẬT SẮC KÍ ..........................................................................................16 2.6.1 Sắc kí nhanh .................................................................................................17 2.6.2 Sắc kí cột cổ điển .........................................................................................17 2.6.3 Sắc kí lớp mỏng ...........................................................................................18 Chương 3 ......................................................................................................................20 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................20

iv

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ....................................................20 3.1.1 Thời gian ......................................................................................................20 3.1.2 Địa điểm .......................................................................................................20 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ...............................................................................20 3.3 VẬT LIỆU...........................................................................................................20 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................20 3.3.2 Dụng cụ ........................................................................................................20 3.3.3 Hoá chất .......................................................................................................21 3.4.1 Sắc kí cột nhanh ...........................................................................................23 3.4.2 Sắc ký cột cổ điển ........................................................................................24 3.4.2.1 Sắc ký cột T2 ........................................................................................24 3.4.2.2 Sắc kí cột T4 .........................................................................................25 Chương 4 ......................................................................................................................26 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................................................26 4.1 KẾT QUẢ SẮC KÝ CỘT NHANH ...................................................................26 4.2 KẾT QUẢ SẮC KÝ CỘT CỔ ĐIỂN..................................................................27 4.2.1 Kết quả cột T2 ..............................................................................................27 4.2.2 Kết quả sắc kí cột tổng kết các phân đoạn cột T4 .......................................31 4.2.3 Tổng kết toàn bộ kết quả..............................................................................34 4.3 THẢO LUẬN......................................................................................................34 Chương 5 ......................................................................................................................35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................35 5.1. KẾT LUẬN ........................................................................................................35 5.2 KIẾN NGHỊ ........................................................................................................35 TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................36 PHỤ LỤC .....................................................................................................................39

v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CTPT

công thức phân tử

H2O

nước

H2SO4

acid sulfuric

MeOH

methanol

CHCl3

chloroform

EtOH

ethanol

TPHH

thành phần hóa học

SKLM

sắc kí lớp mỏng

SNL

sâm Ngọc Linh

SVN

sâm Việt Nam

Tp.HCM

thành phố Hồ Chí Minh

NXB

nhà xuất bản

vi

DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Kết quả khảo sát hạt thu hái trong tự nhiên ..................................................... 7 Bảng 3.1 Thông số cột sắc kí cao áp (sắc kí cột nhanh) ............................................... 24 Bảng 3.2 Thông số cột sắc kí của các phân đoạn cột thường ...................................... 24 Bảng 3.3 Các phân đoạn của cột T2.............................................................................. 24 Bảng 3.4 Các phân đoạn của cột T2-3 .......................................................................... 25 Bảng 3.5 Các phân đoạn của cột T4.............................................................................. 25 Bảng 4.1 Kết quả sắc ký cột nhanh ............................................................................... 26 Bảng 4.2 Kết quả sắc ký cột T2 .................................................................................... 27 Bảng 4.3 Kết quả các phân đoạn tách được từ phân đoạn cột T2-3 ........................... 28 Bảng 4.4 Kết quả các phân đoạn tách được từ phân đoạn cột T4 ................................ 31

vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 2.1 Cây sâm Ngọc Linh ......................................................................................... 5 Hình 2.2 Rễ sâm Ngọc Linh trong tự nhiên .................................................................... 8 Hình 2.3 Rễ sâm Ngọc Linh trồng .................................................................................. 8 Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của saponin MR2 ............................................................... 11 Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của saponin Rb1 ................................................................ 11 Hình 2.6 Cấu trúc hóa học của saponin Rd .................................................................. 11 Hình 2.7 Cấu trúc hóa học của saponin Rg1 ................................................................ 11 Hình 2.8 Phân loại saponin theo cấu trúc hóa học ........................................................ 13 Hình 2.9 Một số khung triterpen (tt) ............................................................................. 15 Hình 3.1 Sơ đồ quy trình tách, tinh sạch và xác định cấu trúc một chất ...................... 22 Hình 3.2 Sơ đồ tóm tắt các kết quả thu được................................................................ 23 Hình 4.1 Bản SKLM các phân đoạn cột nhanh ............................................................ 26 Hình 4.2 Kết quả các phân đoạn tách được từ phân đoạn T2 ....................................... 27 Hình 4.3 Bản SKLM tất cả các phân đoạn cột T2-3 ..................................................... 30 Hình 4.4 Kết quả SKLM của phân đoạn T2-3-6 so với chuẩn MR2 ............................ 30 Hình 4.5 Cấu trúc hóa học của Saponin MR2 .............................................................. 31 Hình 4.6 Bản SKLM tất cả các phân đoạn cột T4 ........................................................ 32 Hình 4.7 T4-6 chấm so với các chuẩn .......................................................................... 33 Hình 4.8 Cấu trúc Ginsenoside Rb1 ............................................................................. 33

viii

Chương 1 GIỚI THIỆU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm Ngọc Linh là loài sâm đặc hữu ở Việt Nam đã được chứng minh có nhiều tác dụng dược lý như tăng cường miễn dịch, tăng sức đề kháng cho cơ thể, bảo vệ tế bào gan, cải thiện trí nhớ, giúp chống viêm, phục hồi sự suy giảm chức năng giúp cho tình trạng của cơ thể trở lại bình thường, kháng các độc tố gây hại tế bào, ngăn ngừa sự lão hóa, giúp kéo dài sự sống của tế bào và tăng các tế bào mới. Đặc biệt, sâm Ngọc Linh còn có những tính năng mà sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc không có là tính kháng khuẩn, chống trầm cảm, giảm lo âu, chống oxy hóa, và hiệp lực tốt với thuốc kháng sinh, thuốc trị bệnh tiểu đường.[12,24,30] Sâm Ngọc Linh ngoài thành phần ginsenoside như các sâm khác, còn chứa hợp chất majonoside R2 (MR2), đây là điểm khác biệt mà các loài sâm khác không có.[15] Do vậy, việc đánh giá định tính, định lượng ginsenoside, đặc biệt là majornoside R2 (MR2) góp phần tiêu chuẩn hóa nguyên liệu, đánh giá chất lượng sâm Việt Nam, cũng như để so sánh, phân biệt với các loài sâm khác hay các mẫu dược liệu có hình dạng giống sâm là rất quan trọng.

Hiện nay, nguồn dược liệu sâm rất phong phú và đa dạng, tuy nhiên nguồn sâm Ngọc Linh là loại sâm quý hiếm được xếp đầu bảng trong sách đỏ thực vật Việt Nam năm 1994 và có giá trị kinh tế rất cao,[11,16] chính vì giá trị này mà không ít các nhà kinh doanh vô tình hay cố ý khẳng định nguồn sâm của mình là sâm Ngọc Linh mặc dù chưa có đánh giá một cách chính xác về mặt khoa học: đặc điểm hình thái, thành phần hoá học,... Đứng trước thực trạng này, về mặt hoá phân loại, cần có các chất chuẩn được tinh sạch từ nguyên liệu sâm Ngọc Linh rõ nguồn gốc như các ginsenoside , đặc biệt là hợp chất majonoside R2 (MR2), dùng làm chuẩn đánh giá tiêu chuẩn nguyên liệu sâm Việt Nam. Với mong muốn tiếp tục tìm kiếm các thành phần hoá học tồn tại trong sâm Ngọc Linh có nguồn gốc rõ ràng để làm các chuẩn đánh giá, kiểm

1

định sâm mà tôi thực hiện đề tài: “Phân lập các hợp chất saponin trong cao sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) đã bảo quản”.

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ PHẠM VI CỦA ĐỀ TÀI Phân lập các hợp chất saponin từ cao chiết methanol của cây sâm Ngọc Linh (Panax Vietnamensis).

1.3 Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI Cung cấp chất chuẩn đánh dấu (marker compound) phục vụ công tác đánh giá, kiểm tra chất lượng nguyên liệu cây sâm Ngọc Linh.

Làm tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn về thành phần, hoạt tính sinh học của những hợp chất saponin đã tách được.

2

Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 HỌ NHÂN SÂM (ARALIACEAE) Theo thống kê năm 1985 (Grushvitsky, Hà Thị Dung), họ Araliaceae ở Việt Nam có 110 loài, thuộc 18 chi. Trong đó, có 46 loài và 11 thứ là đặc hữu trong hệ thực vật Việt Nam, đã có 40 loài được sử dụng làm thuốc. Đến nay, số loài chưa được cập nhật và thống kê đầy đủ nhưng trên thực tế số loài trong họ đã tăng lên trên 130 loài (Shang, 1983, 1997) với trên 60 loài đặc hữu.[15] 2.2 CHI SÂM (PANAX) Chi Panax thuộc giới Thực vật (Plantae), ngành Thực vật có hoa (Magnoliophyta), lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida), bộ Hoa tán (Apiales), họ Cam Tùng (Araliaceae) theo hệ thống phân loại mới nhất của Jun Wen thống kê lại 11 loài và 1 thứ loài của chi Panax.[22] Ở Việt Nam, ghi nhận có sự hiện diện của 4 loài thuộc chi sâm: Panax pseudoginseng Wall, Panax bipinnatifidus Seem, Panax stipuleanatus H. T. Tsaiet K. M. Feng và Panax vietnamensis Ha et Grushv. Đây là loài thứ 11 được phát hiện trong vòng 30 năm gần đây, là loài mới đối với khoa học và là loài đặc hữu trong hệ thực vật Việt Nam.[22] Panax là cây thảo mộc, sống nhiều năm, cao 0,4-0,8 m. Thân rễ (củ) nạc gồm nhiều đốt, phân nhánh, nằm ngang, đường kính 1,5-2,5 cm, phần đầu có nhiều vết sẹo do thân khi sinh tàn lụi, người ta dựa vào sẹo trên thân rễ để tính tuổi của sâm, chiều dài rễ tùy theo số năm sinh trưởng. Lá kép chân vịt, gồm 2-3 cái, mọc vòng, lá chét thuôn, dài 10-14 cm, rộng 3-5 cm, gốc nhọn, đầu vuốt nhọn, mép khía răng cưa, cuống lá chét ngắn dưới 1 cm.[22] Cụm hoa tán, mọc ở ngọn, thường gồm 1 tán, cá biệt có tán phụ, cuống cụm hoa dài 15-30 cm. Hoa nhỏ, màu trắng ngà, cuống hoa 1-1,5 cm, đài 5, hợp ở gốc, hình tam

3

giác, 5 cánh hoa hình tam giác rộng, nhị 5, chỉ nhị mảnh, bầu 2 ô, cá biệt 1 ô, bầu nhụy có 2-3 lá noãn, đầu nhụy chẻ đôi.[22] Quả hình cầu hoặc hình cầu hơi dẹt, đường kính 0,6-1,0 cm, khi chín màu đỏ hoặc cam, có chấm đen. Hạt 1-2, gần tròn, đường kính 2-3 mm, dài 3-4 mm, màu trắng xám.[22] 2.3 PHÂN BỐ Vùng phân bố của chi này ở Bắc Bán Cầu, từ Himalaya đến Đông Bắc Trung Quốc, vùng Viễn Đông nước Nga, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam. Sâm có tác dụng tốt và được nhiều người ưa dùng, cho nên một số loài như Nhân sâm đã được trồng hàng nghìn hecta tại Hàn Quốc, Trung Quốc và Bắc Mỹ.[22] 2.4 GIỚI THIỆU VỀ SÂM NGỌC LINH 2.4.1 Nguồn gốc và lịch sử phát hiện Sâm Ngọc Linh cũng là một loại nhân sâm thứ 20 được phát hiện trên thế giới.[5] Tên khác: Sâm Việt Nam, sâm khu Năm (K5), sâm Đốt Trúc (Trúc Tiết Nhân Sâm), củ Ngải Rọm Con (Xê Đăng), hay cây Thuốc Giấu, Vietnam ginseng (Anh).[3] Năm 1973, lúc 16 giờ ngày 19 tháng 3, đoàn điều tra Dược Liệu ban Dân Y khu 5 do dược sĩ Đào Kim Long và Nguyễn Châu Giang hướng dẫn, đã phát hiện được một loài Panax mọc thành quần thể ở độ cao 1800 m tại vùng Ngọc Lây, huyện Đắc Tô, tỉnh Kon Tum, và đặt tên là “sâm Đốt Trúc” với tên khoa học sơ bộ xác định là Panax articulates L., họ Araliaceae.[3] Theo đánh giá của Tiến sĩ Trần Chí Liêm, Thứ trưởng Bộ Y tế Việt Nam: đây là cống hiến quan trọng cho khoa học, bổ sung tri thức mới về vùng phân bố chi Panax xuống tới vĩ tuyến 15 và bổ sung cho chi Panax họ Araliaceae một loài mới. Sau khi sâm được phát hiện, khu uỷ Khu 5 đã bí mật bảo vệ và khai thác, giao cho xưởng Dược Trung Trung Bộ chế biến làm thuốc phục vụ cán bộ, chiến sĩ và nhân dân, đồng thời gửi mẫu ra Bộ Y tế, Viện Dược Liệu Hà Nội nghiên cứu.[6] Trải qua hơn 30 năm, sâm Ngọc Linh, một loài sâm đặc hữu của nước ta đã được thế giới biết đến với tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv. [5]

4

2.4.2 Danh pháp khoa học Dược sĩ Đào Kim Long đã đặt tên khoa học của cây sâm Ngọc Linh này là Panax articulatus KL Dao, hay Panax articulatus Kim Long Đào theo tên người phát hiện.[3] 12 năm sau, tên Nhân Sâm Việt Nam và tên khoa học là Panax vietnamesis Ha et Grushy, họ Cam Tùng Araliaceae, được công bố tại Viện Thực Vật Kamarov (Liên Xô cũ) năm 1985, do Hà Thị Dung và I. V. Grushvistky đặt tên.

[5]

Áp dụng quy tắc

quốc tế về danh pháp thực vật công bố năm 1994 (ICBN - Tokyo code), điều 1, mục 3, phần C, danh pháp khoa học của sâm Ngọc Linh có thể được nối tên của người thứ hai công bố với tên người thứ nhất qua chữ ex, và khi đó tên khoa học của cây nhân sâm Ngọc Linh được viết hợp pháp theo luật quốc tế hiện nay sẽ phải là Panax articulatus KL Dao (1973) ex Ha et Gruskv (1985).[5] Giới (regnum):

Plantae

(không phân hạng):

Angiospermae

(không phân hạng):

Eudicots

(không phân hạng):

Asterids

Bộ (ordo):

Apiales

Họ (familia):

Araliaceae

Phân họ (subfamilia):

Aralioideae

Chi (genus):

Panax

Phân chi (subgenus):

Panax

Đoạn (section):

Panax

Loài (species):

P. vietnamensis

Hình 2.1: Cây sâm Ngọc Linh

2.4.3 Hình thái thực vật Sâm Ngọc Linh thuộc dạng cây thân thảo, sống nhiều năm nhờ thân rễ, cao khoảng 40-60 cm, đôi khi trên 1 m. Thân rễ nạc, đường kính 1-3,5 cm, chiều dài tùy

5

theo số năm sinh trưởng, màu vàng nhạt hay màu vàng đất, có nhiều đốt, mang nhiều vết sẹo, mỗi vết sẹo tương đương với 1 năm tuổi. Thân rễ mang nhiều rễ con và những vết nhăn dọc, dễ bẻ gãy, mùi thơm nhẹ, vị đắng hơi ngọt. Ở cuối thân rễ có rễ củ thường ít phát triển, có dạng con quay, hình trụ, đôi khi có dạng hình người, màu vàng nhạt, mang nhiều rễ con và có vân ngang. Thân rễ to nhất được phát hiện năm 1978 dài 90 cm, có 62 vết sẹo và nặng 710 g.[8] Thân mọc thẳng đứng, màu xanh hoặc hơi tím, đường kính 5-8 mm, thường rụng hằng năm sau mùa sinh trưởng. Tuy vậy, đôi khi có 2-3 thân vẫn tồn tại vài năm.

Thân rễ có thể phân nhánh nhiều lần và hình thành một bụi sâm, nhưng rất hiếm. Cây sâm thường héo chết vào mỗi mùa đông, để rồi mọc trở lại từ củ sâm vào đầu mùa xuân.[8] Lá kép hình chân vịt, mọc ở đỉnh thân. Cuống lá kép dài 2-12 cm, mỗi lá kép thường có 5 lá chét hình trứng ngược, hình mác hoặc bầu dục, mép khía răng cưa, đầu lá nhọn, đôi khi có mũi nhọn, gốc lá hình nêm. Lá chét ở giữa lớn nhất, dài 15 cm, rộng 3-5 cm. Gân lá hình lông chim, thường có 10 cặp, gân phụ hình mạng. Phiến lá màu xanh lục, mảnh, dễ rách, có nhiều lông cứng dài 1-2 mm, mặt dưới ít hơn.[18] Cây nảy mầm từ hạt chỉ có 1 lá kép với 5 lá chét, năm thứ 3 đa số 2 lá kép, năm thứ 4 đa số 3 lá kép, năm thứ 5 và 6 đa số 4-5 lá kép, rất hiếm gặp cây 6 lá kép.[18] Cụm hoa thường xuất hiện ở cây có 3 lá kép trở lên. Cuống cụm hoa dài 10-12 cm mang 1 tán đơn ở tận cùng, đôi khi có thêm 1-4 tán phụ hay 1 hoa đơn ở phía dưới tán chính. Mỗi cụm hoa có 50-120 hoa, cuống dài 1-1,5 cm.[19] Hoa màu vàng lục nhạt, đường kính 3-4 mm, gồm 5 lá dài hợp thành hình chuông, trên chia thành 5 răng nhỏ, hình tam giác, dài 1-1,5 mm, 5 cánh hoa, 5 nhị màu trắng, dài 1,5-2 mm. Bao phấn hình xoan, đính lưng, đĩa hoa hơi lồi. Bầu cao 11,5 mm, có 2 lá noãn, nhưng thường chỉ có 1 lá noãn phát triển. Hoa thường nở vào buổi sáng từ 9 giờ đến 11 giờ, lúc này nhiệt độ không khí khoảng 18-20°C và độ ẩm 85-90%. Hoa nở dần từ ngoài vào và từ dưới lên. Đài hoa rụng 1-2 ngày sau khi nở và tán bắt đầu kết quả. Mùa hoa thay đổi tùy theo vùng nhưng thường bắt đầu từ tháng 4 đến tháng 6.[19]

6

Quả mọng, khi chín màu đỏ tươi, có chấm đen không đều ở đỉnh. Quả chủ yếu có 1 hạt hình thận, một số ít quả hình cầu dẹt chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả. Quả có chứa 3 hạt hay hơn đến nay chưa tìm thấy.[19] Trọng lượng trung bình 1 quả là 275mg (ghi nhận trên quả). Thỉnh thoảng gặp quả khi chín không có chấm đen giống như quả của nhân sâm. Hạt màu trắng hay vàng nhạt, dài 6-8 mm, rộng 5-6 mm, dày 2 mm, bề mặt có nhiều chỗ lồi lõm. Trọng lượng trung bình của 1 quả là 275 mg và 1 hạt là 75 mg. Số quả chín tối đa trên 1 tán có thể đến 40 nhưng thường số hạt thu được đáp ứng yêu cầu gieo trồng chỉ từ 10- 15 hạt.

Quả chín rải rác trong tháng 5-tháng 6, chín rộ vào tháng 8 và giảm dần vào các tháng cuối năm. Ở triền phía đông Ngọc Linh thuộc tỉnh Quảng Nam, mùa ra hoa kết trái có thể chậm hơn 1 tháng so với vùng sâm thuộc triền phía tây thuộc tỉnh Kon Tum.[17] Cây sâm Ngọc Linh đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác hoặc thành đám nhỏ dưới tán rừng kín xanh ẩm, độ cao 1900-2300 m. Nhiệt độ trung bình ở vùng o

có sâm mọc tự nhiên từ 15-18 C, độ ẩm 90%, lượng mưa khoảng 3000 mm/năm, đất nhiều mùn, giàu chất dinh dưỡng.

Bảng 2.1: Kết quả khảo sát hạt thu hái trong tự nhiên.[14] Khảo sát trên 4910 quả thu hái tự nhiên

%

Tỷ lệ quả 1 hạt

85,3

Tỷ lệ quả 2 hạt

14,7

Tỷ lệ quả có chấm đen

98,8

Tỷ lệ quả không chấm đen

1,2

7

Hình 2.2: Rễ sâm Ngọc Linh trong tự nhiên

Hình 2.3: Rễ sâm Ngọc Linh trồng 2.4.4 Dược tính Trong hai năm 1974 và 1975, Viện Dược Liệu thuộc Bộ Y tế nghiên cứu thấy thành phần saponin triterpen của Tam Thất, Nhân Sâm và sâm Ngọc Linh có 9 hoặc 11 chất có Rf ngang nhau, màu giống nhau ở hai hệ dung môi khác nhau. Theo đánh giá của Nguyễn Minh Đức, Võ Duy Huấn trong nǎm 1994 thì từ sâm Ngọc Linh đã chiết được 50 hợp chất, xác định cấu trúc hóa học cho thấy 26 hợp chất có cấu trúc đã biết (thường thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật) và 24 saponin dammaran có cấu trúc mới không bắt gặp tại các loại sâm khác trên thế giới. Sâm Ngọc Linh chứa chủ yếu các saponin triterpen, nhưng cũng là một trong những cây sâm có hàm lượng saponin khung dammaran cao nhất (khoảng 12-15%) và số lượng saponin nhiều nhất so với các loài khác của chi Panax. Ngoài ra trong sâm Ngọc Linh còn có 14 acid béo,

8

16 acid amin (trong đó có 8 acid amin không thay thế được) và 18 nguyên tố đa lượng, vi lượng.[27] Những kết quả nghiên cứu, phân lập thành phần hóa học mới nhất được công bố còn kéo dài danh sách saponin của sâm Ngọc Linh hơn nữa, lên tổng cộng 52 loại.[22] Những kết quả nghiên cứu mới nhất bổ sung thêm danh sách saponin và acid amin dài hơn nữa. Theo tiến sĩ Nguyễn Bá Hoạt, cán bộ Viện Dược liệu thì về mặt hoá học, thân rễ và rễ củ sâm Ngọc Linh hiện nay (2007) đã phân lập được 52 saponin. Trong lá và cọng đã phân lập được 19 saponin dammaran, trong đó có 8 saponin có cấu trúc mới. Đã xác định được trong sâm Ngọc Linh 17 acid amin, 20 chất khoáng vi lượng và hàm lượng tinh dầu là 0,1%.[8] Sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc mọc ở vùng ôn đới và hàn đới. Chỉ riêng sâm Việt Nam mọc ở vùng khí hậu nhiệt đới. Khác biệt chính ở các loài sâm này là đều có hoạt chất chính là saponin nhưng thành phần các nhóm chất khác nhau. Sâm Việt Nam được xếp cùng nhóm với sâm Triều Tiên là nhóm có hầu hết hoạt chất saponin thuộc khung dammaran với số lượng và hàm lượng ginsenosid cao, chỉ có 1-2 saponin olean có hàm lượng không đáng kể. Riêng sâm Trung Quốc chỉ có nhóm saponin dammaran, không có saponin olean. Cả ba được xem là những loài sâm quý hiện nay. Tuy nhiên chỉ có sâm Việt Nam mới có hợp chất saponin dammaran kiểu ocotillol với majonosid R2 (MR2) chiếm hơn 50% hàm lượng saponin có trong sâm Việt Nam. Thành phần này quyết định những khác biệt của sâm Việt Nam so với sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc trong trị liệu.[25] Đặc biệt MR2 chiếm gần 50% hàm lượng saponin toàn phần từ phần dưới mặt đất của SVN và trở thành 1 hợp chất chủ yếu của SVN so với thành phần saponin trong các loài sâm khác trên thế giới và gấp 48 lần hiệu suất chiết được từ Đại Diệp Tam Thất (Panax japonicum C.A. Mey. Var. major (Burk.) C.Y.Wu et K.M.Feng).[31]Hoạt chất majonoside R2 (MR2) có tác động ức chế cả giai đoạn bắt đầu và giai đoạn tiến triển của tế bào ung thư biểu mô da chuột được gây bằng nitric oxide phối hợp với 12-O-tetradecanoylphorbol-13 acetate (TPA) hay bằng peroxynitrite phối hợp với TPA.[25] Như vậy, sâm Việt Nam là một trong những loại sâm có hàm lượng saponin nhiều nhất, tương tự một số cây sâm quý đã từng được nghiên cứu sử dụng từ lâu trên thế giới. Hợp chất hóa học đa dạng và tác dụng thực tiễn đối với sức khỏe của con

9

người khiến sâm Ngọc Linh hiện nay được bán trên thị trường với giá càng ngày càng cao, thậm chí còn cao hơn sâm Triều Tiên nhiều lần.[13] 2.4.5 Quá trình nghiên cứu TPHH của sâm Ngọc Linh 1973: Nguyễn Thới Nhâm, Nguyễn Văn Bàn (Viện Dược Liệu). Sơ bộ phân tích trên SKLM so sánh sâm Việt Nam với Hồng Sâm Triều Tiên và Sâm Tam Thất.

1976: Nguyễn Thới Nhâm, Lutomski, J ( Viện cây thuốc Poznan-Balan). Phân lập 13 hợp chất saponin đặt tên K5VN Panax osid 1-13 tương tự như saponosid có trong Sâm Triều Tiên.

1978- 1981: Nguyễn Thới Nhâm và các cộng sự (Đơn vị nghiên cứu chuyên đề SK5). Nghiên cứu thành phần hóa học cơ bản và hợp chất saponin SVN: Xác định các acid béo, acid amin, các yếu tố vi đa lượng v.v... Phân lập được các saponin G.Rb1, G.Rg1 và MR2.

1987: Nguyễn Thới Nhâm, Trần Công Luận, Lutomski, J (Viện cây thuốc Poznan- Balan). Phân lập và xác định cấu trúc 5 hợp chất saponin (MR2, PG.RT4, G.Rg1, G.Rd, G.Rb1).

1987-1990: Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự (Trung tâm Sâm VN). Nghiên cứu thành phần hoá học trong callus SVN nuôi cấy mô. Phân lập được 5 saponin và xác định được cấu trúc của PG-F11 và VG-R1. Các thành phần khác như acid béo, acid amin, b- sitosterol, daucosterin và các yếu tố vi đa lượng cũng được xác định.

1987-1990: Trần Công Luận, Lutomski, J (Viện cây thuốc Poznan-Ba lan).

Phân lập và xác định cấu trúc 7 polyacetylen trong sâm VN. 1990: Nguyễn Minh Đức, Yamasaki K (Viện nghiên cứu khoa học Dược, Trường đại học Y Hiroshima - Nhật). Phân lập và xác định cấu trúc 49 saponin trong SVN, phát hiện 24 saponin mới, đặt tên VG.R1-R24.

1999-2001: Võ Duy Huấn, Yamasaki, K (Viện nghiên cứu khoa học Dược, Trường đại học Y Hiroshima – Nhật). Phân lập và xác định cấu trúc 19 saponin trong lá SVN, phát hiện 8 saponin mới đặt tên VG.L1-L8.

1999-2001: Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM và Sở Y tế Quảng Nam. Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu: phần thân rễ và rễ củ (đã đưa vào Dược điển Việt Nam tập 3) và phần lá (dự thảo).

10

2001-2002: Trần Lê Quan, Kadota, S (Viện nghiên cứu Y học Phương Đông, trường Đại học Y Dược Toyama, Nhật bản). Phát hiên thêm 3 saponin và 1 genin trong SVN, 2 saponin mới là 20-O-Me-G.Rh1 và VG-R25.

Một vài cấu trúc các hợp chất saponin

Hình 2.4:

Hình 2.5:

Cấu trúc hóa học của saponin MR2

Cấu trúc hóa học của saponin Rb1

Hình 2.6:

Hình 2.7:

Cấu trúc hóa học của saponin Rd

Cấu trúc hóa học của saponin Rg1

2.5 TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT SAPONIN 2.5.1 Định nghĩa

11

Saponin là một nhóm glycosid lớn mà cấu trúc hóa học gồm có hai phần: phần đường và phần không đường thường gọi là aglycon, gặp rộng rãi trong thực vật, có tính chất đặc trưng. Saponin còn gọi là saponosid do chữ latinh “sapo” nghĩa là “xà phòng” (vì tạo bọt như xà phòng). Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài saponin.Ví dụ: sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức với cholesterol.[9] Saponin cũng có trong một số động vật như hải sâm, cá sao.[1] Một số dược liệu chứa saponin: Atisô, Bạch Thược, Cam Thảo, Cát Cánh, Cỏ Nhọ Nồi, Dâm Dương Hoắc, Dứa Bà, Đại, Hoa Hoè, Hoàng Kỳ, Kim Ngân, Mạch Môn, Ngưu Tất, Nhân Sâm, Phục Linh, Rau Má, Râu Mèo, Ngũ Gia Bì Chân Chim, Sài Đất, Sài Hồ, Sài Hồ Nam Sơn Thù, Tam Thất, Táo Nhân, Thất Diệp Đởm, Thiên Môn, Trạch Tả, Trinh Nữ Hoàng Cung, Viễn Chí, Vối.[2] 2.5.2 Tính chất của saponin Saponin thường kết tinh ở dạng vô định hình , vị đắng, khó tinh chế, điểm nóng chảy từ 200°C trở lên . Bị tủa bởi acetat chì , sulfat amonium, hydroxid barium...Phần genin tức là sapogenin và dẫn chất acetyl sapogenin thường dễ kết tinh hơn saponin. [9] Saponin triterpenoid thì có loại trung tính và loại acid, saponin steroid thì có loại trung tính và loại kiềm.[9] Tan trong nước, cồn, rất ít tan trong aceton, eter, hexan.[9] Tạo bọt nhiều và bền khi lắc với nước vì có hoạt tính bề mặt cao. Có thể giải thích là do phân tử saponin có phần ưa nước và phần kị nước. Tính chất này làm cho saponin giống với xà phòng: có tính nhũ hóa và tẩy sạch.[9] Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng . Saponin làm vỡ tế bào hồng cầu còn gọi là tính phá huyết

. Tính phá huyết có liên quan đến sự tạo phức giữa

saponin với cholesterol và các ester của cholesterol trong màng hồng cầu, nhưng lại thấy có nhiều trường hợp chỉ số phá huyết và khả năng phá huyết không tỉ lệ thuận với nhau nên phải xét đến ảnh hưởng của saponin trên các thành phần khác của màng hồng cầu. Qua việc theo dõi tính phá huyết, người ta thấy rằng cấu trúc của phần aglycon có tác dụng trực tiếp đến tính phá huyết còn phần đường ảnh hưởng đến mức độ phá

12

huyết. Hồng cầu của các động vật khác nhau cũng bị ảnh hưởng khác nhau đối với một loại saponin.[1] Ðộc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên.[1] Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu, liều cao gây nôn mửa, đi lỏng.[4] Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-b-hydroxysteroid khác.[9] Dưới tác dụng của enzym có trong thực vật hay vi khuẩn hoặc do axit loãng, saponin bị thuỷ phân thành các phần gồm sapogenin và phần đường gồm một hoặc nhiều phân tử đường. Các đường phổ biến là D-glucose, D-galactose, L-arabinose ...

Phần sapogenin có thể là sapogenin steroid hoặc sapogenin triterpenoid.[4] 2.5.3 Phân loại saponin (theo thành phần hóa học) Saponin được phân loại thành hai nhóm lớn dựa vào phần aglycon là: saponin steroid và saponin triterpen. Trong đó, saponin triterpen còn được chia thành pentacyclic (khung oleanan, ursan, hopan, lupan…) và tetracyclic (khung dammaran, nostan, cucurbitan…), còn saponin steroid thì có các nhóm như spirostan, furostan…[7] Saponin

Saponin triterpenoid (30C) Pentacyclic

(5vòng 6 cạnh) 1. Olean 2. Ursan (4 vòng 6 cạnh, 1 vòng 5 cạnh) 3. Lupan 4. Hopan

Saponin steroid (27C)

Tetracyclic

1. Spirostan 2. Furostan 3. Aminofurostan 4. Spirosolan 5. Solanidan 6. Cấu trúc khác

5. Dammaran 6. Lanostan 7. Cucurbitan

Hình 2.8: Phân loại saponin theo cấu trúc hóa học.[7]

13

30

19 12

29

21 19

18

12

22

17

1

15

2

1

16

7

4

5

27

3

6

28

19

18

17

14

9

15

2

16

12

22

8

1

7

28 15

8

5 3

6 24 23

17

2 27

7

4 6

Hopan 24 23

14

22

14

9 10

4

18

26

25

29

21

13

11

5 3

29

20 19

30

26

25

30

20 21

13

11

10

27

Ursan

24 23

12

1

7

4 6

Oleanan

24 23

16

15 7

10

5 3

28

14

9

2

8

22

17

26

25

28

14

9 10

18 13

11

26

25

20

30

21

20

13

11

29

Lupan

27

16

Hình 2.9: Một số khung triterpen[7] 2.5.4 Sự phân bố trong thực vật Saponin steroid thường gặp trong những cây một lá mầm. Các họ hay gặp là: Amaryllidaceae, Dioscoreaceae, Liliaceae, Smilacaceae. Ðáng chú ý nhất là một số loài thuộc chi Dioscorea L. Agave L.Yucca L.[22] Saponin triterpenoid thường gặp trong những cây hai lá mầm thuộc các họ như: Acanthaceae,

Amaranthaceae,

Araliaceae,

Campanulaceae,

Caryophyllaceae,

Fabaceae, Polygalaceae, Rubiaceae, Sapindaceae, Sapotaceae.[22] Trong cây saponin thường tích lũy ở những bộ phận khác nhau: tích lũy ở quả như Bồ Kết, Bồ Hòn, rễ như Cam Thảo, Viễn Chí, Cát Cánh, lá như Dứa Mỹ.[2] 2.5.5 Hoạt tính của saponin Kháng khuẩn và kháng nấm: Do có khả năng tạo phức với sterol của màng tế bào nấm làm màng nấm tan rã.[12,15] Kháng viêm.[30]

15

Ngăn ngừa ung thư: Saponin nhóm spirostan có nhiều chất có hoạt tính kháng ung thư. Các glycosid spirostanol có chứa trên bốn đơn vị đường thì thấy có tác dụng chống ung thư rõ rệt). Hoạt chất majonoside R2 (MR2) có tác động ức chế cả giai đoạn bắt đầu và giai đoạn tiến triển của ung thư biểu mô da chuột được gây bằng nitric oxide phối hợp với 12-O-tetradecanoylphorbol-13 acetate (TPA) hay bằng peroxynitrite phối hợp với (TPA).[24] Tác dụng hướng sinh dục.[12] Tác dụng lên hệ thần kinh.[12] Tác dụng lên động vật máu lạnh và côn trùng: được ứng dụng để chống mối, làm liệt giun.[30] Tổng hợp nội tiết tố: Saponin steroid được dùng để tổng hợp các nội tiết tố steroid như testosteron, progesteron, cortison.[17] 2.6 KỸ THUẬT SẮC KÍ Sự sắc kí là một phương pháp vật lí để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng chất đơn lẻ, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh).[9] Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc chất lỏng. Pha tĩnh tách riêng các hợp chất trong một hỗn hợp nào đó là nhờ vào tính chất hấp thu của nó. Pha tĩnh là chất rắn thường là alumin hoặc silicagel đã được xử lý, nó có thể được nạp nén vào trong một cột (sắc kí cột hở), hoặc được tráng thành một lớp mỏng, phủ lên trên bề mặt một tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm nhựa (sắc kí lớp mỏng). Pha tĩnh là chất lỏng có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất mang rắn hoặc một chuỗi dây carbon dài được gắn bằng một nối hóa trị lên trên chất mang rắn.[9] Pha động: có thể là chất lỏng hoặc chất khí. Chất khí được sử dụng trong kĩ thuật sắc kí khí, trường hợp này chất khí được gọi là khí mang hoặc khí vectơ. Chất lỏng dùng trong sắc kí giấy, sắc kí lớp mỏng, sắc kí cột, lúc này chất lỏng gọi là dung môi giải ly (eluant).[9] Có rất nhiều loại hệ sắc kí khác nhau và người ta có thể phân chia chúng dựa vào bản chất pha, cơ chế tách hay cấu hình của hệ sắc kí như sắc kí phân chia, sắc kí hấp thu, sắc kí trao đổi ion, sắc kí lọc gel.[9]

16

2.6.1 Sắc kí nhanh Kĩ thuật sắc kí nhanh - cột khô được triển khai từ năm 1986 bởi hai nhóm nhà hóa học John C.Coll và S.William Pelletier. Hai ông đề nghị mô hình sắc kí này áp dụng cho các phòng thí nghiệm còn hạn hẹp trang thiết bị, có thế dễ dàng tìm thấy trong phòng thí nghiệm các dụng cụ cần thiết.

Sắc kí nhanh cột khô là một biến đổi của sắc kí chớp nhoáng (SKCN), với một vài khác biệt như sau: Để gia tăng vận tốc giải ly của pha động, SKCN sử dụng một lực đẩy từ trên đầu cột xuống, còn sắc kí nhanh - cột khô dùng một lực hút tạo chân không ở đầu ra của cột nhờ một máy bơm hút loại nhẹ.

SKCN sử dụng pha tĩnh là silicagel loại dùng cho sắc kí cột (hạt có kích cỡ 4063 µm) còn sắc kí nhanh - cột khô sử dụng silicagel loại dùng cho sắc kí lớp mỏng (SKLM) (Merck 60H hoặc 60G; cỡ hạt 15-40 µm) hoặc alumina loại dùng cho SKLM (10 µm, diện tích bề mặt riêng lớn: 500m2.g-1).

Trong quá trình giải ly, SKCN vẫn giữ một lớp dung môi ở trên đầu cột (cột không được khô); còn với sắc kí nhanh, cột sắc kí được rút khô sau mỗi phân đoạn thu được.

Sắc kí nhanh có các ưu điểm sau: -

Dụng cụ dễ dàng tìm được trong bất kỳ phòng thí nghiệm hóa học nào: phễu lọc xốp, bình tam giác, vòi nước tạo áp suất kém hoặc máy bơm hút loại yếu…

-

Thời gian sắc kí nhanh nhờ lực hút bên dưới để hút dung môi giải ly.

-

Thuận tiện cho người thao tác: quá trình sắc kí có thể bị gián đoạn mà không bị ảnh hưởng.

-

Khi muốn tạm dừng giữa chừng, hút khô cột, che chắn phần đầu cột để tránh bụi (đậy phễu bằng một tấm kiếng). Silicagel được hút khô, mẫu chất ở trạng thái khô, nằm nguyên tại vị trí trong cột.

2.6.2 Sắc kí cột cổ điển Sắc kí cột là tên gọi để chỉ loại sắc kí được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển, gồm một ống hình trụ, được đặt dựng đứng với đầu trên có thể hở hoặc kín, đầu dưới có gắn một khóa. Pha tĩnh là những hạt silicagel được nhồi vào ống hình trụ. Mẫu

17

chất cần tách được đưa lên đầu cột trên bề mặt của pha tĩnh. Pha động là dung môi sẽ được rót liên tục vào đầu cột. Nhờ trọng lực, dung môi chảy từ trên xuống sẽ kéo theo những phân tử thích hợp làm chúng tách ra khỏi hỗn hợp. Hợp chất không phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau. Như vậy, yếu tố quyết định đến hiệu quả của sắc kí cột phụ thuộc vào việc lựa chọn pha động, độ đặc khít của cột, dung môi sử dụng, tốc độ giải ly… nên cần phải lưu ý chúng.[9] Ưu điểm của phương pháp này là pha tĩnh và dụng cụ thí nghiệm tương đối rẻ, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng lớn mẫu chất. Đây là phương pháp thường được sử dụng để phân tách các chất ra khỏi hỗn hợp.[9] 2.6.3 Sắc kí lớp mỏng Trong sắc kí lớp mỏng, pha tĩnh rắn sẽ được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kính, nhôm hay plastic. Chất hấp thụ trên tấm giá đỡ nhờ sulfat calci khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polymer hữa cơ. Để đưa mẫu lên những lớp mỏng đã được tráng này, người ta dùng ống vi quản (còn gọi là ống mao quản), vi quản là một ống thủy tinh có đường kính trong rất nhỏ, một đầu được vút nhọn. Sau khi mẫu đã được chấm lên bản, người ta sẽ cho bản vào một cốc chứa sẵn dung môi (pha động) với lượng thích hợp để giải ly.[9] -

Bình sắc kí: là chậu, hũ, lọ…bằng thủy tinh, nhiều kích cỡ và hình dạng, có nắp đậy.

-

Pha tĩnh: là một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thụ như silicagel, alumin.

-

Pha động: là một loại dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chậm dọc theo tấm sắc kí lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Vận tốc di chuyển dung môi tùy thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh (hiện tượng hấp thụ của pha tĩnh) và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi.

-

Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác. Sử dụng khoảng 1 microlit (1µL) dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một ống vi quản để chấm mẫu thành một điểm (vết) gọn trên pha tĩnh, ở vị trí cao hơn một chút so với mặt thoáng của dung môi đang chứa trong bình. Để quá trình sắc kí lớp mỏng đạt kết quả tốt, ta thấy cần phải lưu ý một số điểm như sau: khi chấm mẫu không được để vết chấm loang quá rộng, không chấm quá

18

nhiều mẫu lên bản mỏng, phải sấy khô bản mỏng trước khi giải ly. Bình (hay cốc) giải ly phải được bão hòa dung môi, phải che kín để dung môi tránh bị bay hơi, làm sai lệch tỷ lệ, quan sát quá trình giải ly để biết các vết chấm có tách hay không.[9] Người ta sử dụng sắc kí lớp mỏng để lựa chọn dung môi phù hợp cho việc giải ly, xác định một cách tương đối độ tinh khiết của chất thu được, biết được số các hợp chất trong mẫu ban đầu hay để theo dõi quá trình sắc kí cột.[9] Sắc kí lớp mỏng có nhiều ưu điểm như: sử dụng ít chất hấp thu, cần rất ít mẫu chất nghiên cứu, quá trình triển khai sắc kí diễn ra nhanh nên trong một thời gian ngắn có thể biết ngay kết quả mẫu cần phân tích có bao nhiêu chất khác nhau. Ngoài ra còn có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích. Do đó, đây là phương pháp cũng được nhiều nhà nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên sử dụng nhiều trong phòng thí nghiệm.[9]

19

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 3.1.1 Thời gian Đề tài được tiến hành từ tháng 1 năm 2012 đến tháng 8 năm 2012.

3.1.2 Địa điểm Nơi thực hiện đề tài: Bộ môn Hoá – Chế Phẩm, Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM..

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Phân lập một (hoặc nhiều hơn có thể) hợp chất saponin từ cao chiết methanol của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis).

Xác định cấu trúc hoá học của hợp chất saponin tách được.

3.3 VẬT LIỆU 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu Cao chiết methanol của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) được cung cấp từ phòng Hóa - Chế Phẩm, Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM. 3.3.2 Dụng cụ Cân điện tử Meltler Toledo AB-204.

Tủ sấy KC-65.

Dụng cụ chứa: hũ thuỷ tinh nhỏ, becher.

Bể điều nhiệt.

Bếp điện.

Bản silicagel F254 tráng sẵn trên nền nhôm (Merck, Art. 1,05554).

Cột sắc kí nhiều kích cỡ, ống nghiệm.

Bình lắng gạn.

20

Ống đong các loại, pipet các loại, ống bóp cao su.

Bông thuỷ tinh (có thể thay thế bằng bông gòn thông thường).

Máy cô quay BUCHI (Đức).

Bồn siêu âm Elma LC60H (Đức).

Tủ hút chân không VWR S/P. 3.3.3 Hoá chất Hệ dung môi dùng trong sắc kí Chloroform: CHCl3 Methanol: MeOH Nước cất: H2O Thuốc thử: Acid sulfuric: H2SO4 Ethanol 960: C2H5OH 3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Quy trình nghiên cứu được tóm tắt theo sơ đồ sau

21

Hình 3.1: Sơ đồ quy trình tách, tinh sạch và xác định cấu trúc một chất

22

Cao tổng (cao MeOH) SKCN SKC thường T1

T2

T2 -1

SKC thường

T3

T2 -2

T2 -3

T4 -1

T4

T4 -2

T44

T43

T5

T45

T46

T47

SKC thường KT T23-1

T23-2

T23-3

T23-4

T23-5

T23-6

Rb1

T23-7

MR2

Hình 3.2: Sơ đồ tóm tắt các kết quả thu được 3.4.1 Sắc kí cột nhanh Từ cao tổng methanol tiến hành chạy sắc kí cột nhanh thu được 5 phân đoạn lần lượt là: •

oT1: CHCl3

•

T2: CHCl3:MeOH (9:1)

•

T3: CHCl3:MeOH (8:2)

•

T4: CHCl3:MeOH (65:35)

•

T5: MeOH: 100%

23

T48

Bảng 3.1: Thông số cột sắc ký cao áp (Sắc ký cột nhanh) Thông số cột Lượng mẫu nạp, g Lượng chất hấp phụ, g Quy cách cột Đường kính trong, cm Chiều cao, cm Dung môi giải ly Tốc độ chảy, giọt/phút Thể tích hứng, l/phân đoạn Tồng số phân đoạn hứng

Giá trị 100 700 22 15 CHCl3 CHCl3:MeOH MeOH 200 2 5

3.4.2 Sắc ký cột cổ điển Bảng 3.2: Thông số cột sắc kí của các phân đoạn cột thường Thông số cột Lượng mẫu nạp, g Lượng chất hấp phụ, g Quy cách cột - Đường kính tròn, cm - Chiều cao, cm Dung môi giải ly Tốc độ chảy, giọt/phút Thể tích hứng, ml/ống nghiệm Tổng số phân đoạn hứng

Cột T2 15,7 200

3 60 CHCl3:MeOH:H2O 50 50 3

Cột T2-3 4 200

Cột T4 15,56 250

3 60

3,5 60

CHCl3:MeOH:H2O CHCl3:MeOH:H2O MeOH 50 50 50

50

7

8

3.4.2.1 Sắc ký cột T2 Từ phân đoạn T2: CHCl3:MeOH (9:1) sau khi chạy sắc kí cột thu được 3 phân đoạn nhỏ.

Bảng 3.3: Các phân đoạn của cột T2 Tên phân đoạn Vị trí phân đoạn Ghi chú T2-1 1-10 T2-2 11-55 T2-3 56-220 Chọn rửa giải tiếp

24

Sắc kí cột T2-3 Từ phân đoạn T2-3 sau khi chạy sắc ký thu được 7 phân đoạn nhỏ Bảng 3.4: Các phân đoạn của cột T2-3 Tên phân đoạn Vị trí phân đoạn Ghi chú T2-3-1 1-76 T2-3-2 77-100 T2-3-3 101-130 T2-3-4 131-280 T2-3-5 281-520 T2-3-6 521-680 Chất MR2 gần sạch T2-3-7 680-hết 3.4.2.2 Sắc kí cột T4 Từ sắc kí cột nhanh chọn một phân đoạn nữa là phân đoạn T4 CHCl3:MeOH (65:35) để tiến hành giải ly bẳng sắc kí cột cổ điển.

Từ phân đoạn T4 sau khi chạy cột ta thu được 8 phân đoạn nhỏ Bảng 3.5: Các phân đoạn của cột T4 Tên phân đoạn Vị trí phân đoạn Ghi chú T4-1 1-8 T4-2 9-70 T4-3 71-150 T4-4 151-226 T4-5 227-353 Kết tinh T4-6 354-394 Chất gần sạch T4-7 395-474 T4-8 475-hết

25

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ SẮC KÝ CỘT NHANH Từ 100 g cao chiết tổng, qua 5 hệ dung môi chiết, thu được 5 phân đoạn nhỏ của các hệ dung môi.

Bảng 4.1: Kết quả sắc kí cột nhanh Dung môi khai triển Tên phân đoạn Khối lượng cao thu hồi, g CHCl3 T1 8,3 90:10 T2 15,7 80:20 T3 17,9 65:35 MeOH 100%

T4

15,56

T5

34,24

Hình 4.1: Bản sắc kí các phân đoạn cột nhanh

26

Theo kết quả của sắc kí bản mỏng, nhận thấy ở phân đoạn T2 có chứa nhiều saponin và có một số vạch riêng biệt, dự đoán dễ tách – tinh sạch. Do đó ta chọn phân đoạn này để qua sắc kí cột tiếp tục tách tinh sạch saponin.

4.2 KẾT QUẢ SẮC KÝ CỘT CỔ ĐIỂN 4.2.1 Kết quả cột T2 (85:15:10)

T2-1

T2-2

T2-3

Hình 4.2: Kết quả các phân đoạn tách được từ phân đoạn T2 Bảng 4.2: Kết quả sắc kí cột T2 Dung môi khai triển Tên phân đoạn Khối lượng cao thu hồi, g CHCl3:MeOH:H2O T2-1 1,462 85:15:10 CHCl3:MeOH:H2O T2-2 4,126 75:25:10 CHCl3:MeOH:H2O T2-3 5,089 65:35:10 Theo sắc k í bản mỏng, ta thấy phân đoạn T 2-3 có vết rỏ ràng , ít tạp nên được dùng để thực hiện rửa giải tiếp tục.

27

Kết quả sắc kí cột tổng kết các phân đoạn cột T2-3 Bảng 4.3: Kết quả các phân đoạn tách được từ phân đoạn cột T2-3 Dung môi khai triển

CHCl3:MeOH:H2O 85:15:10

CHCl3:MeOH:H2O 75:25:10

100% MeOH Ghi chú:

Phân đoạn

Phân đoạn hứng

Khối lượng, g

Sắc kí lớp mỏng

Ghi chú

T23-1

1-76

0,059

3 vết (a)

Nhiều tạp

T23-2

77-100

0,108

Không rõ vết, có đường (a)

Có tủa xuất hiện

T23-3

101-130

0,179

4 vết (b)

Có tủa xuất hiện

T23-4

131-280

0,474

3 vết (b)

Có 1 vết tạp

T23-5

281-520

0,836

3 vết, tạp ít (b)

Chọn rửa giải

T23-6

521-680

0,275

1 vết (a,b)

Tủa trùng vết MR2

T23-7

681-hết

2,016

1 vết kéo dài (b)

(a): hệ dung môi sắc kí lớp mỏng là CHCl3:MeOH:H2O (70:30:10) (b): hệ dung môi sắc kí lớp mỏng là CHCl3:MeOH:H2O (65:35:10)

Nhận xét các phân đoạn Phân đoạn T2-3-1 (1-76) vết rất mờ, nhận thấy hợp chất saponin chưa phân giải xuống được cần tiếp tục rửa giải.

Phân đoạn T2-3-2 (77-100) vết kéo dài không tách rời, vết có màu tím nhạt, đếm được 4 vết chính trong đó vết saponin nằm giữa các vết tạp. Cần tăng hệ giải ly trên SKLM để vết tách rõ hơn có thể nhận thấy vết saponin chính xác. Xuất hiện tủa màu trắng.

Phân đoạn T2-3-3 (101-130) có 4 vết trong đó dễ dàng nhận thấy 1 vết saponin chính rất to màu tím đậm nằm trên cùng, còn 3 vết tạp ở dưới nhỏ hơn, màu nâu nhạt do có gắn đường.

Phân đoạn T2-3-4 (131-280) còn 3 vết với 1 vết saponin chính nằm trên cùng nhưng màu nhạt hơn và nhỏ hơn vết saponin trong phân đoạn T2-3-3, 2 vết tạp ở dưới

28

cũng nhỏ và màu nhạt. Cần tăng hệ để giải ly những chất phân cực hơn ra khỏi cột sắc kí.

Phân đoạn T2-3-5 (281-520) chỉ còn 2 vết không tách rời, vết saponin rất to và đậm màu, vết dưới trùng vết MR2 và vết trên nằm trên vết MR2, khả năng tách được vết trên khi giải ly trong cột sắc kí sau.

Phân đoạn T2-3-6 (521-680) vết trên từ phân đoạn T2-3-5 đã giải ly hết ra khỏi cột,vết dưới đã tinh sạch có Rf trùng với MR2, cần chấm kiểm tra trên hai hệ sắc kí khác nhau với bản SKLM dài 10 cm, tiến hành đo Rf xem có phải hoàn toàn giống chuẩn MR2.

Phân đoạn T2-3-7 (681-hết) vết mờ và nhỏ chỉ thấy một vết chính. Tiến hành xả cột lấy kiệt phần chất còn bị giữ lại trong cột. Chọn phân đoạn dễ tách tiến hành giải ly trong cột sắc kí sau.

Phân lập các chất đã tách được Tổng kết cột T2-3 thu được 7 phân đoạn trong đó 2 phân đoạn kết tủa là phân đoạn hứng T2-3-2 (77-100) và T2-3-3 (101-130). Sau khi cô cắn mẫu trên bếp điều nhiệt, đem cân lấy số liệu sau đó cho một lượng nhỏ methanol vào để bảo quản mẫu trong điều kiện thường Ta tách được MR2 từ phân đoạn T2-3-6 (521-680). Chấm chung T2-3-6 với MR2 ở 2 hệ SKLM khác nhau là CHCl3:MeOH:H2O (70:30:10) và CHCl3:MeOH:H2O (65:35:10) trên bản SKLM dài 10 cm dùng để đo Rf xác định độ tinh sạch và so sánh sự khác nhau, giống nhau giữa chất tách được với chuẩn MR2.

29

T2-3- 5

chọn rửa giải

Hình 4.3: Bản SKLM tất cả các phân đoạn từ cột T2-3 Chú thích: các phân đoạn hứng được từ cột T2-3: T2-3-1(1-76), T2-3-2(77-100), T2-33(101-130), T2-3-4(131-280), T2-3-5(281-520), T2-3-6(521-680), T2-3-7(681-hết).

Hình 4.4: Kết quả SKLM của phân đoạn T2-3-6 (521-680) so với chất chuẩn MR2 Theo kết quả so sánh Rf giữa mẫu và chất chuẩn MR2 ở hai hệ dung môi khác nhau nhưng luôn cho các giá trị giống nhau. Kết luận đã tách được saponin MR2 từ cao chiết methanol của sâm Ngọc Linh.

Cấu trúc hóa học của saponin tách được chính là cấu trúc của saponin majonoside R2 (MR2).

30

Hình 4.5: Cấu trúc hóa học của saponin MR2 4.2.2 Kết quả sắc kí cột tổng kết các phân đoạn cột T4 Bảng 4.4: Tổng kết các phân đoạn tách được từ sắc kí cột T4 Dung môi rửa giải

Phân đoạn

Phân đoạn hứng

Khối lượng, g

T4-1

1-8

0,376

T4-2

9-70

1,125

T4-3

71-150

1,317

T4-4

151-226

3,101

4 vết đậm (b)

Tạp mờ

T4-5

227-353

2,513

2 vết đậm (b)

Kết tinh

T4-6

354-394

2,120

1 vết mờ và 1 vết đậm (b)

Chất gần sạch

CHCl3:MeOH:H2O 65:35:10

T4-7

395-474

3,116

2 vết mờ (b)

100% MeOH

T4-8

Rửa cột

1,692

1 vết mờ bị kéo (b)

CHCl3:MeOH:H2O 85:15:10

CHCl3:MeOH:H2O 75:25:10

Sắc kí lớp mỏng 2 vết kém phân cực (a) 3 vết kém phân cực (a) 3 vết, 2 vết đậm (a)

Ghi chú Tạp nhiều Còn tạp Còn tạp

Nhận xét các phân đoạn Phân đoạn T4-1 (1-8) 2 vết mờ kém phân cực, vết bị kéo dài do tạp còn nhiều.

Mới rửa giải do đó chất chưa giải ly.

31

Phân đoạn T4-2 (9-70) 3 vết kém phân cực, chất bắt đầu giải ly đã thấy 1 vết saponin mờ ở giữa 2 vết tạp.

Phân đoạn T4-3 (71-150) 3 vết trong đó vết saponin ở giữa to hơn và đậm có màu tím, 2 vết tạp ở trên vả dưới màu nâu nhạt do có gắn đường.

Phân đoạn T4-4 (151-226) vết bị kéo do chất đang giải ly ra khỏi cột nhiều nhưng hệ phân cực thấp không tách vết rõ được, thấy được 4 vết chính và nhiều tạp mờ. Cần tăng hệ giải ly cột và hệ chạy SKLM. Phân đoạn T4-5 (227-353) tăng hệ giải ly cột từ CHCl3:MeOH:H2O (85:15:10) thành CHCl3:MeOH:H2O (75:25:10) vết tách rõ thấy được 2 vết chính, vết dưới là vết saponin to và đậm màu, vết trên bị kéo vệt do kém phân cực. Xuất hiện kết tinh ở phân đoạn này, rửa sạch kết tinh bằng methanol lạnh, hòa tan kết tinh trong dung môi Chloroform và gửi đi đo phổ.

Phân đoạn T4-6 (354-394) 1 vết saponin to rõ, màu tím đậm, và tạp kéo dài nên chọn phân đoạn này để tiếp tục giải ly loại tạp để tách được hợp chất saponin tinh sạch.

Phân đoạn T4-7 (395-474) 1 vết mờ bị kéo dài, chất gần hết nên tiến hành rửa cột bằng methanol 100% cho sạch và xả cột.

Phân đoạn T4-8: Rửa cột

Chọn rửa giải tiếp Hình 4.6: Bản SKLM tất cả các phân đoạn cột T4

32

Chú thích: các phân đoạn hứng từ cột T4 là T4-1(1-8), T4-2(9-70), T4-3(91-150), T44(151-226),T4-5(227-353), T4-6(354-394), T4-7(395-474).

Phân đoạn T4-5 sau khi tinh sạch ta được 1 phân tử đường

-D-Fructo pyranose

Phân đoạn T4-6 sau khi chế hóa ta thu được Ginsenoside Rb1

Hình 4.7: T4-6 chấm so với các chất chuẩn

Hình 4.8: Cấu trúc ginsenoside Rb1

33

4.2.3 Tổng kết toàn bộ kết quả Sắc ký cột chân không thu được 5 phân đoạn trong đó phân đoạn T2 và T4 được đem đi rửa giải để tách hợp chất tinh sạch.

Sắc kí cột T2 thu được 3 phân đoạn, trong đó phân đoạn T2-3 có triển vọng tách được hợp chất tinh sạch.

Sắc kí cột T2-3 thu được 7 phân đoạn, tách được hợp chất saponin MR2 với khối lượng là 60 mg.

Sắc kí cột T4 thu được 8 phân đoạn, phân đoạn T4-5 (227-353) có kết tinh được đo phồ NMR, kết quả xác định được cấu trúc và định danh được một phân tử đường là

-D-Fructo pyranose. Phân đoạn T4-6 (354-394) tách ra được 1 hợp chất tinh khiết là Ginsenoside Rb1 với khối lượng là 18 mg.

4.3 THẢO LUẬN Lượng cao tổng ban đầu khá ít mà số lượng các saponin trong cao chiết lại nhiều nên khối lượng của mỗi chất sẽ ít. Qua mỗi cột sắc kí lại xảy ra hao hụt nên lượng chất mất đi khá đáng kể .Vì vậy cần lấy lượng cao chiết tổng nhiều hơn để khối lượng mỗi chất tách được nhiều hơn, dễ dàng cho việc xác định cấu trúc hơn.

Ngoài ra, có thể áp dụng các phương pháp tách chất khác như: dùng silicagel pha đảo, dùng phương pháp chế hóa silicagel,… Càng mở rộng phương thức thì kết quả thu được sẽ phong phú hơn.

34

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN Từ cao chiết methanol của sâm Ngọc Linh, thông qua các kĩ thuật sắc kí cột nhanh, sắc kí cột thường , sử dụng các hệ dung môi chạy sắc ký thích hợp và được kiểm tra độ tinh sạch bằng sắc ký bản mỏng , ta tiến hành phân lập được 2 Saponin là (majonoside R2) MR2 (60mg) và ginsenoside Rb1(18mg).

Hai Saponin này rất có ý nghĩa trong công tác kiểm nghiệm và đánh giá chất lượng của sâm Việt Nam. 5.2 KIẾN NGHỊ Kiến nghị tiếp tục tách và phân lập saponin từ các phân đoạn còn lại trong sắc kí cột nhanh.

Kiến nghị kết hợp các phương pháp khác như: dùng sắc ký cột pha đảo, phương pháp chế hóa,…trong việc phân lập và tinh sạch saponin tiếp theo nhất là những phân đoạn về sau chất đã gần tinh sạch.

Tiến hành thử hoạt tính sinh học của các saponin tách được.

35

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Bộ môn Dược Liệu (2007), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Trường Đại Học Y Dược TPHCM. 2. Đái Duy Ban (2008), Các hợp chất thiên nhiên nhiên có hoạt tính sinh học phòng chống một số bệnh cho người và vật nuôi, NXB Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ.

3. Đào Kim Long và Nguyễn Châu Giang (1991), Sơ lược quá trình phát hiện cây sâm Đốt Trúc ở vùng núi Ngọc Linh (Kon Tum), trong: Liên chi hội Dược Học và Sở Y Tế Quảng Nam – Đà Nẵng, trang 138 – 146.

4. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học.

5. Hà Thị Dung Grushvitzky I.V (1985), Một loài sâm mới thuộc chi sâm (Panax L.), họ nhân sâm (Araliaceae) ở Việt Nam, tạp chí Sinh học, tập 7(3), 45-48.

6. Liên chi Hội Dược Học – Sở Y Tế QN-ĐN (1991), Tập tài liệu viết về lịch sử ngành Dược Khu 5 và tỉnh Quảng Nam – Đả Nẵng.

7. Ngô Văn Thu (1990), Hóa học saponin, Trường Đại học Y Dược TPHCM. 8. Nguyễn Bá Hoạt (1999), Những dẫn liệu về hình thái cây sâm mới phát hiện ở Việt Nam, thông báo Dược Liệu, số 1, 5-9.

9. Nguyễn Kim Phi Phụng (2005). Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ. NXB Đại Học Quốc Gia TPHCM. 10. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại Học Quốc Gia TPHCM. 11. Nguyễn Tập (2006), Danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam, Tạp chí Dược liệu; số 3 (11); trang 97 – 105.

12. Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự (2001), Nghiên cứu ứng dụng tác dụng antistress và tác dụng tăng lực của Sâm Việt Nam và Đinh lăng, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Bộ Y Tế ( Mã số đề tài KHYD-0225R ).

13. Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự (1993), Tóm tắt kết qủa nghiên cứu từ năm (19781992), Trung tâm Sâm Việt Nam- Bộ Y Tế.

14. Nguyễn Thới Nhâm và Phan Văn Đệ (1980), Tóm tắt kết quả nghiên cứu đặc tính sinh học cây sâm K5 hoang dại trong 2 năm (1979-1980), TL.06/TV-89-ĐVSK5, 1-21.

36

15. Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm và một số cây thuốc thuộc họ Nhân Sâm, NXB Khoa học và Kĩ thuật. Hà Nội.

16. Nguyễn Tiến Bân - chủ biên (1996), Sách Đỏ Việt Nam, Tập II- Phần thực vật, NXB Khoa Học và Kĩ thuật Hà Nội; trang 207 – 208.

17. Phạm Hoàng Hộ (1972), Cây cỏ miền Nam Việt Nam, Bộ Giáo Dục Sài gòn. Q. I, tr.

989, fig. 2492 18. Phan Văn Đệ, Grushvitzky I.V., Skvortsova N.T.(1983), Đặc tính hình thái – giải phẫu lá của Panax vietnamensis (Araliaceae). Leningrad, Tạp chí Thực Vật học, tập 70(4), 512-522.

19. Phan Văn Đệ, Grushvitzky I.V., Skvortsova N.T., 1983, Những hoa tự bất thường của Panax vietnamensis (Araliaceae), Leningrad, Tạp chí Thực Vật học, tập 72(8), 10791082.

Tài liệu tiếng Anh 20. Antan I.S., Slepyan L.I., Minina S.A.; Shikov A.N., Legosteva A B, Vasil'eva A.L.,(1995), Development of the method of quantitative spectrophotometric determination of the main active agents in preparations of the ginseng selective strain.

Pharmaceutical Chemistry Journal, Vol. 26, No. 6, 436-439 21. Dan Zhou, Hong Jin, Huan-Bing Lin, Xue-Mei Yang , Yu-Fang Cheng, Feng-Jun Deng, Jiang-Ping Xu (2010), Antidepressant effect of the extracts from Fructus Akebiae. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 488–495.

22. Grushvitzky I. V., Skvortsova N. T., Hà Thi Dung (1990), The genus Panax (Araliaceae) in the flora of Vietnam. Bot. Jour. 75(6): 884 – 888 23. Hiai S., Oura H., Nakajima T. (1976), Color reaction of some sapogenins and saponins with vanillin and sulfuric acid. Planta Med. 29(2), 116-122.

24. Kazuo Yamasaki (1999), Bioactive saponins in Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis.

25. Konoshima T., Takasaki M., Ichiishi E., Murakami T., Tokudo H., Nishino H., Duc N.M., Kasai R., Yamashaki K. (1997), Cancer chemopreventive activity of Majonoside-R2 from Vietnamese ginseng Panax vietnamensis. Cancer Lett, 147(1-2), 11-16.

37

26. Liang Z.M., Long M.S., Min S.S., Hua X.Z., Na L.A. (2001), Two New Triterpenoid Saponins from Aralia subcapitata. Natural Product Research. Volume 4.0 Issue 3.

157-161.

27. Nguyễn Minh Đức và Nguyễn Thới Nhâm (1998), Chemical composition and pharmacological activities of Vietnamese ginseng, Advances in Ginseng Research, The Korean Society of Ginseng, 127-137.

28. Nham, K. Yamasaki and O. Tanaka, New on biogenesis of dammarane triterpenoids. saponins from Vietnamese ginseng: Highlights Srivastava S.K., Jaina D.C., (1989), Triterpenoid saponins from plants of Araliaceae. Phytochemistry. Volume 28, Issue 2, 644-64 29. Thomas Barclay, Milena Ginic-Markovic, Martin R. Johnston, Peter Cooper , Nikolai Petrovsky (2012), Observation of the keto tautomer of D-fructose in D2O using 1H NMR spectroscopy. Carbohydrate 136–141 30. Trần Lê Quan (2002), Biologically active saponin constituents from vietnamese ginseng plants, Ph. D Thesis, Falcuty of Pharmacology, Toyama Medical and Pharmaceutical University.

31. Xuemei Yang, Guoliang Li, Lingyun Chen, Cong Zhang, Xinxiang Wan, Jiangping Xu (2010), Quantitative determination of hederagenin in rat plasma and cerebrospinal fluidby ultra fast liquid chromatography–tandem mass spectrometry method (1973– 1979), Journal of Chromatography B. 32. Yamasaki, Plenum Press, New York and London Yu S., Cai Y.M., Yiao L., Yang L., Sheng C.M. (2008), Facile synthesis of oleanolic acid monoglycosides and diglycosides. Molecules. 13, 1472-1486

38

PHỤ LỤC • Cách pha thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH Dùng ống đong 100 ml: - Cho vào ống đong khoảng 70 ml EtOH. - Cho thêm 7 ml H2SO4.

- Đong thêm EtOH đến mức 100 ml.

• Cách pha hệ dung môi CHCl3:MeOH - Đong lượng vừa đủ của mỗi chất theo đúng tỷ lệ (ví dụ: 85:25, 65:35) - Cho hệ dung môi vừa pha vào erlen, lắc đều cho các chất tác dụng với nhau, hoặc dùng máy siêu âm đánh đều dung môi này trong 15 phút.

- Dùng toàn bộ hệ dung môi đó.

• Cách pha hệ dung môi CHCl3:MeOH:H2O - Đong lượng vừa đủ của mỗi chất theo đúng tỷ lệ.(ví dụ: 65:35:10, 70:30:10) - Chú ý pha lần lượt CHCl3, sau đó cho MeOH vào và cuối cùng là H2O. Không làm thay đổi vị trí các chất khi pha.

- Cho hệ dung môi vừa pha vào bình lắng, lắc đều cho các chất trộn đều với nhau.

- Để yên bình lắng đến khi toàn bộ dung môi trong suốt (có phân thành 2 lớp), lấy lớp bên dưới và bỏ lớp ở trên.

• Kết quả đo phổ NMR của mẫu kết tinh phân đoạn T2-3-5 trong sắc kí cột T2-3 [10,20,29]

39

40

41

42

Cấu trúc đường đã xác định được dựa vào phổ NMR là đường pyranose.

Hình cấu trúc hóa học của đường

43

-D-Fructo pyranose

-D-Fructo