NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÂN TAY SẮC KÝ CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI DÂY THÌA CANH (Gymnema R.Br)

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VIỆT CƯỜNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÂN TAY SẮC KÝ LỚP MỎNG CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI DÂY THÌA CANH (Gymnema R.Br)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2020

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VIỆT CƯỜNG Mã sinh viên: 1501069

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÂN TAY SẮC KÝ LỚP MỎNG CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI DÂY THÌA CANH (Gymnema R.Br) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS. Phạm Thị Linh Giang Nơi thực hiện: Bộ môn Thực vật Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2020

Lời cảm ơn Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Phạm Thị Linh Giang, người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Cô vừa là người thầy, vừa là người chị đi trước đã luôn động viên và cho tôi những lời khuyên chân thành trong công tác nghiên cứu khoa học lẫn trong cuộc sống, giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nhất có thể.

Bên cạnh đó, trong quá trình thực hiện khóa luận tôi còn nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo của nhiều thầy cô, anh chị em khác. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn tới: PGS.TS Trần Văn Ơn, người thầy đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi thu mẫu tại xã Yên Ninh, huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên và cho tôi những lời khuyên quý báu trong nghiên cứu; các thầy cô giảng viên tại Bộ môn Thực vật: TS. Hoàng Quỳnh Hoa, TS. Phạm Hà Thanh Tùng, ThS. Nghiêm Đức Trọng, ThS. Lê Thiên Kim cùng các chị kỹ thuật viên đã luôn giúp đỡ, chỉ bảo nhiệt tình cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này.

Các em sinh viên nghiên cứu khoa học: Vương Thị Ngân Hà (A8K73), Nguyễn Thị Ngọc Ánh (A3K72), Đinh Thùy Dương (A1K72) cùng các bạn thực hiện khóa luận tốt nghiệp tại Bộ môn Thực vật, những người đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong thời gian nghiên cứu.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô và bạn bè tại Trường Đại học Dược Hà Nội, những người tôi luôn học hỏi trong suốt 5 năm vừa qua.

Cuối cùng, tôi gửi lời tri ân đến gia đình tôi– nơi là chỗ dựa và nguồn động lực mỗi khi tôi khó khăn.

Hà Nội, ngày 22 tháng 6 năm 2020

Nguyễn Việt Cường

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .........................................................................................2 1.1. Chi Gymnema R. Br. .............................................................................................2 1.1.1. Vị trí phân loại thực vật chi Gymnema R.Br. .................................................2 1.1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố và các loài trong chi trên thế giới ......................2 1.1.3. Tác dụng sinh học của một số loài thuộc thuộc chi Gymnema R.Br. .............3 1.2. Chi Gymnema R.Br. ở Việt Nam ..........................................................................3 1.2.1. Loài Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult ..........................................4 1.2.2. Loài Gymnema latifolium Wall. Ex Wight .....................................................6 1.2.3. Loài Gymnema inodorum (Lour.) Decne .......................................................8 1.2.4. Loài Gymnema yunnanense Tsiang ................................................................9 1.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao .....................................................10 1.3.1. Sắc ký lớp mỏng ...........................................................................................10 1.3.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao ....................................................................10 1.4. Vân tay sắc ký thực vật .......................................................................................11 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................14 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ......................................................................................14 2.1.1. Mẫu nghiên cứu ............................................................................................14 2.1.2. Trang thiết bị nghiên cứu ..............................................................................15 2.2. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................16 2.2.1. Khảo sát một số thông số của quy trình phân tích vân tay sắc ký các mẫu nghiên cứu...............................................................................................................16

2.2.2. Xây dựng vân tay hóa học của một số loài thuộc chi Gymnema R.Br. ........16 2.2.3. Xây dựng cây phân loại dựa trên thành phần hoá học (sắc ký đồ) của các mẫu nghiên cứu...............................................................................................................16 2.2.4. Ứng dụng phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh thu được trên thị trường ................................................................................................................17 2.3. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................17 2.3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích ................................................................................17 2.3.2. Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký ............................................................19 2.3.3. Tiến hành phân tích vân tay sắc ký các dịch chiết một số loài trong chi Gymnema R.Br. theo quy trình đề xuất ..................................................................20 2.4. Phương pháp xử lý kết quả .................................................................................20 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ..............................................................22 3.1. Kết quả khảo sát một số thông số của quy trình phân tích vân tay sắc ký các mẫu nghiên cứu ..................................................................................................................22 3.1.1. Với dịch chiết toàn phần ...............................................................................22 3.1.2. Với dịch chiết sau thủy phân ........................................................................22 3.2. Kết quả xây dựng vân tay hóa học một số loài thuộc chi Gymnema R.Br. ........23 3.2.1. Với dịch chiết toàn phần ...............................................................................23 3.2.2. Với dịch chiết sau thủy phân ........................................................................27 3.3. Kết quả xây dựng cây phân loại dựa trên kết quả sắc ký lớp mỏng của các mẫu Gymnema nghiên cứu .................................................................................................31 3.4. Kết quả phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh thu được trên thị trường ....................................................................................................................................34 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ...........................................................................................37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .........................................................................................40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

H2SO4

Acid sulfuric

HCl

Acid hydroclorid

HPTLC

High performance thin-layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

ITS

Internal Transcribed Spacer

KOH

Kali hydoxid

MeOH

Methanol

G. inodorum

Gymnema inodorum (Lour.) Decne.

G. latifolium

Gymnema latifolium Wall. ex Wight

G. reticulatum

Gymnema reticulatum (Moon) Alst.

G. sylvestre

Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult

G. yunnanense

Gymnema yunnanense Tsiang

GYM

Chất chuẩn gymnemagenin

Rf

Ratio frequency - Hệ số di chuyển

SKĐ

Sắc ký đồ

STT

Số thứ tự

TLC

Thin-layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng

TT

Thuốc thử

UPGMA

Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages

VIS

Visible – Ánh sáng thường

UV

Ultra violet – Ánh sáng tử ngoại

UV 366-TT VIS-TT

Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 366nm sau khi phun thuốc thử Quan sát dưới ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Một số tác dụng sinh học đã công bố của các loài thuộc chi Gymnema R.Br. ..................................................................................................................................3 Bảng 1.2. Khóa phân loại các loài của chi Gymnema ở Việt Nam [2] ............................4 Bảng 1.3. Tổng hợp sự khác biệt về cấu trúc khung chất chính của các loài trong chi Gymnema R.Br........................................................................................................13 Bảng 2.1. Danh mục và ký hiệu các mẫu trong nghiên cứu (i và ii)…………………….14 Bảng 3.1. Sự xuất hiện các vết trên sắc ký đồ dịch chiết toàn phần mẫu nghiên cứu nhóm 1 khi quan sát ở bản mỏng sau phun thuốc thử………………………………..26 Bảng 3.2. Tổng hợp Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân các mẫu thuộc loài G. sylvestre quan sát ở VIS-TT hoặc UV 366-TT .........................28 Bảng 3.3. Tổng hợp Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân các mẫu thuộc loài G. latifolium quan sát ở VIS-TT hoặc UV 366-TT .......................29 Bảng 3.4. Tổng hợp Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân các mẫu thuộc loài G. yunnanense và G. inodorum quan sát ở VIS-TT hoặc UV 366-TT ................................................................................................................................31 Bảng 3.5. Bảng hệ số tương đồng cặp đôi giữa các mẫu nghiên cứu, sử dụng chỉ số Nei&Li ....................................................................................................................33

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Khung cấu trúc phần aglycon của các acid gymnemic phân lập được từ Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult [52] .....................................................5 Hình 1.2. Khung cấu trúc phần aglycon của các acid dạng C-4 gem-dimethylat olean phân lập được từ Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult nguồn gốc Việt Nam [37] ............................................................................................................................6 Hình 1.3. Khung cấu trúc phần aglycon của các 3β-hydroxy oleaan triterpenoid phân lập được từ Gymnema latifolium Wall. Ex Wight [38] ..................................................7 Hình 1.4. Khung cấu trúc của một số chất phân lập được từ loài Gymnema inodorum (Lour.) Decne [44]. ...................................................................................................8 Hình 1.5. Khung cấu trúc chung của các aglycon C21 phân lập được từ Gymnema yunnanense Tsiang [28], [62]. ..................................................................................9 Hình 2.1. Quy trình chiết - thủy phân các mẫu nghiên cứu………………………….…18 Hình 3.1. Sắc ký đồ khai triển dịch chiết toàn phần của các mẫu Gymnema nhóm 1………………………………………………………………………………..24 Hình 3.2. Kết quả chồng phổ sắc ký dịch chiết toàn phần tại VIS-TT các mẫu thuộc nhóm 1 ....................................................................................................................25 Hình 3.3. Sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân của các mẫu Gymnema nhóm 1 ............30 Hình 3.4. Cây phân loại dựa trên phân tích UPGMA hệ số tương đồng giữa sắc ký đồ của các mẫu .............................................................................................................33 Hình 3.5. Kết quả chồng phổ sắc ký đồ các mẫu GX2, GX3 và sắc ký đồ GS1 ...........34 Hình 3.6. Kết quả chồng phổ sắc ký đồ mẫu GX4 và sắc ký đồ GI ..............................35 Hình 3.7. Kết quả chồng phổ sắc ký đồ mẫu GX1 và sắc ký đồ GS1, GL1 .................36

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong nền y học cổ truyền Ấn Độ Ayurveda, Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult) đã được sử dụng từ hơn 2000 năm nay để điều trị đái tháo đường [56], [61]. Dựa trên kinh nghiệm này, hàng loạt các nghiên cứu đã được tiến hành để chứng minh cơ chế tác dụng hạ đường huyết của cây và xác định các acid gymnemic là nhóm hoạt chất chính liên quan đến tác dụng này [49], [53]. Dựa trên nguyên lý là các loài cùng bậc taxon thực vật thường có các thành phần hóa học tương tự nhau do đó có xu hướng có tác dụng sinh học giống nhau [3], một số nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh được tác dụng hạ đường huyết tương tự trên các loài cùng chi như: Gymnema montanum Hook.f., Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema yunnanense Tsiang,…[18], [40], [46], [47], [58].

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết mới được thực hiện trên chủ yếu 2 loài là Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult và Gymnema latifolium Wall. Ex Wight [12], [16]. Bên cạnh một số sản phẩm thực phẩm chức năng như Diabetna (Nam Dược), DK-betics (DK-Pharma),…còn rất nhiều trà thảo dược – dược liệu khô của dây thìa canh được bán rộng rãi cùng một số sản phẩm có tên gọi “Dây thìa canh” được sử dụng nhưng không thuộc hai loài đã nghiên cứu.

Vì vậy, việc nghiên cứu sự đa dạng vân tay sắc ký TLC của một số loài thuộc chi Dây thìa canh giúp bước đầu phân biệt nhanh về hóa học, làm cơ sở cho việc kiểm nghiệm và sử dụng đúng các loài trong chi Gymnema R.Br.; đề tài “Nghiên cứu xây dựng vân tay sắc ký lớp mỏng của một số loài thuộc chi dây thìa canh - Gymnema R.Br” được thực hiện với các mục tiêu sau: -

Xây dựng dấu vân tay sắc ký của một số loài thuộc chi Gymnema R.Br. bằng

phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao từ đó xây dựng cây phân loại dựa trên thành phần hóa học (sắc ký đồ) của các mẫu nghiên cứu.

-

Ứng dụng kết quả nghiên cứu phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh

thu được trên thị trường.

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Chi Gymnema R. Br. 1.1.1. Vị trí phân loại thực vật chi Gymnema R.Br. Theo hệ thống phân loại của Armen Takhtajan trong “Flowering Plants” (2009), chi Gymnema R.Br. được sắp xếp theo thứ tự phân loại như sau: Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Hoa môi (Lamiidae) Bộ: Long đởm (Gentianales) Họ: Trúc đào (Apocynaceae) Phân họ: Thiên lý (Asclepiadoideae) Chi: Gymnema R.Br [20].

1.1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố và các loài trong chi trên thế giới Các loài thuộc chi Gymnema R.Br. là cây leo, không có rễ phụ trên thân. Lá mọc đối, không nạc. Cụm hoa xim, dạng tán hoặc chùm. Hoa nhỏ. Thùy đài nhỏ, hình trứng, đầu tù, gốc đài có tuyến, ít khi không có tuyến. Tràng hình bánh xe, thùy tràng không gập trong nụ, tiền khai vặn phải. Tràng phụ đơn, vảy tràng phụ dính ở tràng, thường có các hàng lông xếp dọc theo tràng. Chỉ nhị dính nhau, bao phấn 2 ô, có phần phụ ở đỉnh, hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh, cơ quan truyền phấn có gót đính và 2 chuôi, khối phấn hướng lên, chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn. Đầu nhụy phình lên hình trứng, đỉnh bầu không thót lại thành dạng vòi nhụy. Cột nhị - nhụy hình ống nhọn đầu [21], [23].

Phân bố của chi Gymnema R.Br. khá rộng, ở vùng Tây châu Phi đến Australia, châu Á [7]. Trong thực vật chí Trung Quốc, Tsiang và cộng sự đã mô tả và xây

dựng

khóa

phân

loại

chi

Gymnema

R.Br

[21].

Năm

2011,

Jingyun Fang và cộng sự đã công bố bản đồ phân bố của 7 các loài Gymnema R.Br. tại Trung Quốc [29]. Các tài liệu thực vật, Thái Lan ghi nhận có 3 loài, Ấn Độ có 2 loài, Indonesia 2 loài và Lào [27], Đài Loan có 1 loài [32].

Theo dự án “The plant list” thực hiện bởi Royal Botanic Gardens, Kew và Missouri Botanical Garden khởi động từ năm 2010 đã xác định được 120 loài thuộc chi Gymnema R.Br. thu thập từ các cơ sở dữ liệu khác nhau trên thế giới trong đó có 52 tên khoa học được chấp nhận (43,3%), 50 tên được xác định là tên đồng nghĩa (41,67 %), và 18 tên 2

chưa xác định được chính xác thông tin (15,0 %) [64]. Danh sách 52 loài thuộc chi Gymnema R.Br. đã được chấp nhận theo “The plant list” [64] được trình bày trong phụ lục 2.

1.1.3. Tác dụng sinh học của một số loài thuộc thuộc chi Gymnema R.Br. Nhiều loài thuộc chi Gymnema R.Br. đã được nghiên cứu về hoạt tính sinh học bao gồm tác dụng của dịch chiết toàn phần, của cao phân đoạn và của các hoạt chất được phân lập từ cây. Tác dụng sinh học nổi bật của các loài thuộc chi Gymnema R.Br. gồm hạ đường huyết, chống béo phì, chống oxy hóa và bảo vệ gan. Các thống kê và tài liệu đi kèm thể hiện trong bảng 1.1.

Bảng 1.1. Một số tác dụng sinh học đã công bố của các loài thuộc chi Gymnema R.Br. Loài

Tác dụng sinh học Hạ đường huyết Hạ lipid máu và chống

Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult

béo phì Bảo vệ gan Khả năng gây độc tế bào khối u

Gymnema latifolium Wall. Ex Wight Gymnema

inodorum

Tài liệu tham khảo [19], [43], [51], [14] [19] [55] [22], [55], [59], [39]

Hoạt tính kháng khuẩn

[55]

Hạ đường huyết

[10], [14]

(Lour.) Hạ đường huyết

[14]

Decne

Bảo vệ gan

[54]

Gymnema yunnanense Tsiang

Hạ đường huyết

[14]

1.2. Chi Gymnema R.Br. ở Việt Nam Theo các tác giả Phạm Hoàng Hộ (2000) [7], Võ Văn Chi (2004) [4], Trần Thế Bách (2007) [2], chi Gymnema R.Br. phân bố ở Việt Nam có 6 loài là Gymnema albiflorum Cost., Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall. Ex Wight, Gymnema yunnanense Tsiang, Gymnema reticulatum (Moon) Alst. và Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult. Để xác định các loài này, TS. Trần Thế Bách (2007) đã xây dựng khóa phân loại cho chi Gymnema R.Br. ở Việt Nam (bảng 1.2) sử dụng các 3

đặc điểm phân loại chính của quả và hạt, bao gồm: kích thước quả, kích thước mào lông và độ dài hạt [2].

Bảng 1.2. Khóa phân loại các loài của chi Gymnema ở Việt Nam [2] 1A. Quả dài hơn 12 cm…………………………………………………1.G. inodorum 1.B. Quả ngắn hơn 10 cm 2.A. Mào lông ngắn hơn 2,6 cm……………………………….……..2.G. yunnanense 2.B. Mào lông dài hơn hay bằng 3 cm 3.A. Chiều dài hạt ngắn hơn 0,9 cm…………………..…..…………....3.G. sylvestre 3.B. Chiều dài hạt lớn hơn 1 cm 4.A. Chiều dài quả ngắn hơn 6 cm; mào lông ngắn hơn 3,5 mm………...4.G. latifolium 4.B. Chiều dài quả dài hơn 6 cm; mào lông dài hơn 3,5 mm………......5.G. reticulatum Các đặc điểm thực vật của 4 loài Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult, Gymnema latifolium Wall. Ex Wight, Gymnema inodorum (Lour.) Decne và Gymnema yunnanense Tsiang cũng đã được mô tả chi tiết trong nghiên cứu của tác giả Phạm Hà Thanh Tùng năm 2012 [15].

1.2.1. Loài Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult 1.2.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố Thân leo tới 8m, có lỗ vỏ rải rác, toàn thân có nhựa mủ trắng. Thân non có lông sau nhẵn, thân bánh tẻ ở gần gốc có vân dạng cánh. Cuống lá 3-12 mm; phiến lá hơi dày có trứng, bầu dục hoặc trứng ngược, kích thước 3-8.5 × 1.5-5.5 cm, có lông tơ hướng trục trừ những đường khía dọc ở gân giữa, chuyển từ có lông mịn đến nhẵn ở gân chính.

Gân bên 4-5 cặp, uốn cong về phía mép lá. Cụm hoa xim ở nách lá thường ngắn hơn rất nhiều so với lá, có nhiều lông. Trục cụm hoa 2-5mm, cuống hoa rụng để lại những vết sẹo xoắn ốc xếp sát nhau. Đài 5, rời, hình trứng, có lông tơ. Tràng 5 hàn liền hình chuông, màu trắng, vàng kem hoặc đỏ. Thùy tràng hình trứng, nhẵn, thường có vành màu trắng ở mép thùy tràng. Tràng phụ 5, dài nhô ra ngoài đính ở họng tràng ở gốc có 2 dãy lông màu nâu. Đầu nhụy hình nón trắng nhô ra ngoài. Bầu 2 lá noãn rời, hình trứng, dài 1 x 0,3 mm [15].

Quả 2 đại thường bị rụng chỉ còn 1, có dạng hình mác rộng, 5-9 × 2 cm, nhẵn, 4

đáy tròn, đầu nhọn . Hạt hình trứng, mép dạng màng, 8 × 4 mm; mào lông màu trắng mượt, dài khoảng 3.5 cm [15].

Tên thường gọi: Dây thìa canh, dây muôi, lõa ti rừng. Cây thường mọc hoang dại ở bờ bụi, hang rào nhiều tỉnh như Hải Dương, Hưng Yên, Bắc Giang, Quảng Bình, Quảng Trị,…[4], [15].

1.2.1.2. Thành phần hóa học Các nghiên cứu sâu về thành phần hoá học của chi Gymnema R.Br chủ yếu được tập trung vào loài Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult với các nhóm chất triterpen saponin thuộc 2 nhóm olean và dammaran. Saponin khung olean có các acid gymnemic và các gymnemasaponin [60], [63], trong khi đó các saponin khung dammarane là các gymnemasid [25]. Trong lá Dây thìa canh lá nhỏ còn có resine, albumin, chlorophyll, carbonhydrat, acid tartric, acid formic, acid butyric, anthraquinon, alkaloid inositol, acid hữu cơ (5,5%), paraben, calci oxalat (7,3%), lignin (4,8%) và cellulose (22%) [48], [49], [50].

Thành phần có tác dụng hạ đường huyết được xác định là các acid gymnemic, là tên chung của các acid hữu cơ thuộc nhóm saponin triterpenoid [24], [33], [34], [49].

Các acid gymnemic là các dẫn chất thế acyl (Tiglolyl, Methyltutylrol,…) của acid deacylgymnemic tương ứng là dẫn xuất thế 3-O-beta-glucoronid của gymnemagenin [42]. Cấu trúc chung phần aglycon của gymnemagenin và 17 loại acid gymnemic được minh họa trong hình 1.1 và phụ lục 6.

R

R

6

5

R

4

1

R O OR

2

Hình 1.1. Khung cấu trúc phần aglycon của các acid gymnemic phân lập được từ Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult [52] Tuy nhiên, trong một nghiên cứu mới công bố vào năm 2018 của Phạm Hà Thanh Tùng và cộng sự cho thấy loài G. sylvestre thu tại hai khu vực địa lý khác nhau là Ấn 5

Độ và Việt Nam có sự khác biệt về thành phần hóa học chính [37]. Thành phần hóa học trong Dây thìa canh lá nhỏ Việt Nam gồm các acid dạng C-4 gem-dimethylat olean bao gồm myrtillogen, chichipegenin, sitakisogenin, maniladiol, gymnemagenol, và 3b, 16b, 28-trihydroxyolean-12-en-29,22b-olid (hình 1.2). Kết quả này tương tự với một số nghiên cứu về Dây thìa canh lá nhỏ tại Trung Quốc và khác biệt với các công bố đã có về cây Dây thìa canh lá nhỏ có nguồn gốc Ấn Độ [37].

R

3

R

4

R H

R

5

2

OH R1

H

Hình 1.2. Khung cấu trúc phần aglycon của các acid dạng C-4 gem-dimethylat olenan phân lập được từ Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult nguồn gốc Việt Nam [37] 1.2.2. Loài Gymnema latifolium Wall. Ex Wight 1.2.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố Thân leo tới 6m. Thân có lỗ vỏ, các nhánh có nhiều lông tơ. Cuống lá 1,5 - 4 cm, có lông tơ dày đặc; phiến lá 8-13 × 5-8 cm, lông dày đặc, càng xa trục càng dày đặc, gốc tròn, ngọn nhọn, gân bên 6-7 cặp. Cụm hoa xim dạng đầu thành từng đôi ở mấu, có lông dày. Một cụm mang rất nhiều hoa, mùi thơm. Cuống cụm hoa 1-1,5 cm, cuống hoa 3-8 mm. Đài hình trứng, phủ lông măng. Tràng hoa vàng, hình chuông, nhẵn ở mặt ngoài. Ống hoa có 5 cặp gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng, khoảng 1,2 × 1,2 mm, phủ lông dày đặc hướng trục, ngắn hơn so với ống tràng. Khối nhị nhụy dạng hình trụ, phần phụ nhị dạng màng ngắn hơn so với đầu núm nhụy. Khối phấn hình thuôn. Đầu núm nhụy hình nón, đỉnh phân đôi [15].

Quả đại hình mác nhọn, 4,5-5,5 × 1,5-2 cm. Hạt hình trứng thuôn, dài khoảng 1,1 cm × 5 mm, mép dạng màng; mào lông dài 3 cm [15].

Tên thường gọi: Dây thìa canh lá to, lõa ti lá rộng. Loài Gymnema latifolium Wall. Ex Wight được phân bố ở đảo Andaman và Nicobar, Bangladesh, Trung Quốc 6

(Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam), Ấn Độ (Arunachal Pradesh, Assam, Kerala, Maharashtra, Tamil Nadu), Myanmar, Thailand [57], Việt Nam (Gia Lai, Tây Ninh, Tuyên Quang, Hoà Bình, Thái Nguyên) [15].

1.2.2.2. Thành phần hóa học Tại Việt Nam, bằng các phản ứng hóa học định tính xác định được trong lá cây G. latifolium có mặt của các nhóm chất chính như: saponin, flavonoid, coumarin, tanin, chất béo, đường khử, acid amin và acid hữu cơ. Trong đó, saponin và flavonoid là 2 nhóm chất chính của dược liệu [5], [11]. Hàm lượng saponin trung bình trong dược liệu là: 5,60% ± 0,11 [11].

Dịch chiết G. latifolium sau khi thuỷ phân bằng acid và kiềm cho thấy có pic tương ứng với pic của chất chuẩn gymnemagenin trên sắc ký đồ sau khi triển khai bằng kỹ thuật HPTLC [15]. Điều này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Trần Thị Oanh năm 2014 với 2 acid gymnemic đã phân lập được là acid gymnemic I và acid gymnemic IV (2 chất có cùng khung cấu tạo như khung hình 1.1) [11].

Bên cạnh đó, các nhóm hợp chất khác đã được chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc trong Dây thìa canh lá to bao gồm 3 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat là: stigmasterol, lupeol acetat và 3β-acetoxy – 22,23,24,25,26,27 – hexanordammaran – 20 – one [10]. Gần đây nhất, năm 2020, Phạm Hà Thanh Tùng và cộng sự đã phân lập được các 3β-hydroxy olean triterpenoid với khung aglycon là gynemagenin và longispinogenin [38] (chi tiết trong phụ lục 6).

R

4

H R R R R1

2 5

6

H R3

Hình 1.3. Khung cấu trúc phần aglycon của các 3β-hydroxy olean triterpenoid phân lập được từ Gymnema latifolium Wall. Ex Wight [38]

7

1.2.3. Loài Gymnema inodorum (Lour.) Decne 1.2.3.1. Đặc điểm thực vật và phân bố Dây leo tới 10m. Thân nhẵn, các nhánh non có màu nâu nhạt, có lỗ vỏ, phủ lông măng. Cuống lá 2-6 cm; bề mặt lá nhẵn, hình trứng thuôn hoặc hình trứng rộng, 4-13 × 2-9 cm, nhẵn hoặc phủ lông măng ở dọc gân lá. Gốc lá tròn hoặc hình tim nông, ngọn lá nhọn hoặc nhọn kéo dài, 4-6 cặp gân bên. Cụm hoa xim dạng chùm xếp giống như đầu, xếp xoắn ốc, tới 4 cm; Cuống cụm hoa 1-2 cm. Cuống hoa 1-1.5 cm. Đài thuôn, 23 × 1.4 mm, ngắn hơn ống tràng, có lông măng hoặc lông mịn. Tràng hoa màu vàng, 67 mm, có lông mịn dày đặc phía ngoài. Ống tràng dạng hình trụ, nhẵn trừ các dãy lông dọc theo phần kẽ ống tràng, xen kẽ với các thùy tràng; Thùy tràng hình chữ nhật, 3-4 × 1.6-1.8 mm, chóp nhọn, nhẵn trừ mép có lông tơ. Khối phấn hình chữ nhật. Đầu núm nhụy có hình mái vòm, thò lên trên ống tràng [15].

Quả hai đại, hình mác, dài 16x3 cm, vỏ quả dày và hơi có sợi. Vỏ quả nhẵn. Hạt khoảng 1.5x1 cm; mào lông khoảng 4 cm [15].

Tên thường gọi: Lõa ti không mùi, Lõa ti nhuộm, Rau mỏ, Dây thìa canh lá to.

Phân bố ở Nam Bộ, Nha Trang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Hòa Bình, Vĩnh Phúc,...mọc rộng khắp trên đất rừng, cạnh suối và lùm bụi [15].

1.2.3.2. Thành phần hóa học Năm 2001, từ lá của G. inodorum, tác giả Kazumasa Shimizu đã phân lập được 4 hợp chất thuộc nhóm olean triterpenoid với một nhóm thế methyl anthranilat đặc trưng gồm GiA-1, GiA-2, GiA-5 và GiA-7 [44]. Công thức khung chung của các chất này minh họa trong hình 1.4 và phụ lục 6.

CH 2R

4

R

2

R3

HOOC

OH

O HO

O CH 2R OR

6

OR

1

5

Hình 1.4. Khung cấu trúc của một số chất phân lập được từ loài Gymnema inodorum (Lour.) Decne [44].

8

1.2.4. Loài Gymnema yunnanense Tsiang 1.2.4.1. Đặc điểm thực vật và phân bố Thân bụi leo, cao tới 8m. Thân bánh tẻ phình lên thành các rãnh sâu, thân non có nhiều lỗ vỏ, bề mặt phủ lông dày đặc màu vàng sét. Toàn thân có nhựa mủ vàng. Lá đối, cuống lá 0,8-1,5 cm. Phiến lá hình trứng, bầu dục hoặc trứng ngược, kích thước lá 6-13 × 2,5-6 cm, 5-6 cặp gân lông chim. Toàn bộ bề mặt phiến lá và gân lá có phủ lông sét nâu. Mép lá nguyên, gốc lá tù hoặc tròn, ngọn lá nhọn. Cụm hoa xim mọc đối xứng nách lá, mỗi cụm 12-20 hoa. Cuống 3- 4mm. Lá đài 5,2x2 mm rời, hình trứng, có lông dày đặc. Tràng hàn liền màu vàng, mép thùy tràng có vành màu vàng kem nhạt. Ống thùy hình trứng, 4x4mm, có phần phụ ở họng tràng mang lông dày màu vàng nâu. Phần phụ của nhị rộng, thò cao lên trên ống tràng nhưng vẫn thấp hơn đầu núm nhụy. Khối phấn hình khối chữ nhật, thẳng đứng, Đầu núm nhụy hình cầu, thò ra ngoài. Bộ nhụy gồm 2 lá noãn rời nhau. Hạt hình trứng thuôn dài 1,3-1,5 cm x 6 mm, mép dạng màng, mào lông dài 2,5 cm [15].

Tên thường gọi: Lõa ti Nam Vân hay Dây thìa canh Vân Nam. Phân bố ở Kiên Giang, Kom Tum, Gia Lai và Đắc Lắc [2], [4], [7].

1.2.3.2. Thành phần hóa học Theo các tài liệu tham khảo, từ dịch chiết sau thủy phân của Dây thìa canh Vân Nam đã xác định được các saponin có 4 khung aglycon C21 steroidal là penupogenin, 20- O-cinnamoylsarcostin, sarcostin và metaplexigenin. Bên cạnh đó, một loại aglycon mới được phát hiện gymnemarsgenin [28].

Năm 1991, từ dịch chiết toàn phần của lá Gymnema yunnanense Tsiang, Zhang và cộng sự đã phân lập được hai glycosid C21 mới có tên là gymnemarosid A và B [62].

Các khung này (hình 1.5 và phụ lục 6) có cấu trúc khác biệt so với các loài Dây thìa canh khác (hình 1.3).

OR 1

OR 2 OH

OR OH R3O

Hình 1.5. Khung cấu trúc chung của các aglycon C21 phân lập được từ Gymnema yunnanense Tsiang [28], [62].

9

1.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao 1.3.1. Sắc ký lớp mỏng Quá trình tách hỗn hợp các chất bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) xảy ra khi cho pha động chuyển qua pha tĩnh. Trong TLC pha tĩnh được rải thành lớp mỏng trên giá đỡ phẳng. Dưới tác động của lực mao quản, pha động thấm theo lớp mỏng đi qua điểm xuất phát – nơi mẫu được đưa lên bản mỏng. Trong quá trình di chuyển của pha động qua pha tĩnh, nhờ quá trình hấp phụ và giải hấp phụ được lặp lại nhiều lần và hệ số phân bố khác nhau mà những chất khác nhau sẽ di chuyển theo hướng của pha động với tốc độ khác nhau. Kết quả mỗi chất phân tích sẽ được tách riêng ra ở các vị trí khác nhau trên bản mỏng [13].

1.3.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC là dạng nâng cao và tự động hóa của TLC và cho phép phun mẫu lên bản mỏng chính xác hơn và đánh giá định lượng các vết được tách. Sự cải tiến về kỹ thuật này làm tăng hiệu lực tách và giảm thời gian phân tích. Sự khác nhau giữa TLC và HPTLC ở chỗ kích thước và mức độ đồng đều hạt của chất hấp phụ. TLC thường có phạm vi kích thước hạt từ 10-15µm, trung bình khoảng 20µm nhưng với HPTLC phạm vi kích thước hạt nhỏ hơn và kích thước hạt trung bình khoảng 5µm. Phương pháp đưa mẫu lên bản mỏng cũng được cải tiến với thiết kế dụng cụ phun mẫu chính xác làm giảm đường kính vết phun ban đầu. Những cải tiến này làm giảm đáng kể thời gian và tăng hiệu lực tách của peak [1], [31].

HPTLC là một kỹ thuật đơn giản, trực quan và thực dụng, có khả năng mang lại kết quả đáng tin cậy và có thể tái tạo, dựa trên phương pháp được tiêu chuẩn hóa và sử dụng SST cho chất lượng tấm. Những cải tiến được giới thiệu trong Dược điển, đặc biệt là trong Dược điển Châu Âu và Dược điển Mỹ, cùng với thiết bị và phần mềm cho phép ghi lại hình ảnh điện tử chuẩn hóa của sắc ký đồ (dấu vân tay) và sự biến đổi của chúng thành cấu hình đỉnh (PPI), mở ra cánh cửa để lấy thông tin định lượng từ phân tích được thực hiện để nhận dạng. Dựa vào đó, khái niệm về dấu vân tay HPTLC toàn diện đã được giới thiệu. Nó cho phép đơn giản hóa các quy trình kiểm soát chất lượng đối với thuốc/ chế phẩm/ sản phẩm thảo dược, bởi vì từ một phân tích HPTLC duy nhất, có thể thu được thông tin về nhận dạng, độ tinh khiết và đặc tính [41].

10

1.4. Vân tay sắc ký thực vật Khái niệm dấu vân tay hóa học được đề cập trong phụ lục 12.23 Dược điển Việt Nam V như sau: dấu vân tay hóa học là các thông tin hóa học của dược liệu được biểu thị dưới dạng sắc ký đồ, các phổ và các đồ thị… được ghi bằng các kỹ thuật phân tích (kỹ thuật sắc ký) hay còn được gọi là sắc ký đồ dấu vân tay [8].

Nói cách khác sắc ký đồ dấu vân tay là một hồ sơ sắc ký bao gồm tất cả các vết sắc ký của các thành phần đặc trưng từ dược liệu hoặc thuốc từ dược liệu được nghiên cứu. Hồ sơ sắc ký sẽ cung cấp thông tin như tính toàn vẹn, độ đậm nhạt, sự giống hay khác nhau của các chất đặc trưng cho loài. Do đó, với dấu vân tay sắc ký thu được có khả năng xác thực cũng như xác định các loài dược liệu một cách hiệu quả ngay cả khi số lượng và/hoặc nồng độ các thành phần đặc trưng hóa học là không giống nhau giữa các mẫu khác nhau [30].

Như vậy, dấu vân tay có khả năng cung cấp thông tin cho ba cấp độ kiểm soát chất lượng phân tích. Những mức độ kiểm soát chất lượng là: -

Xác định thực vật (xác thực loài, tuổi và nguồn gốc);

-

Định lượng hoạt chất;

-

Phát hiện tạp chất, chất gây ô nhiễm hoặc chất pha trộn [17].

Theo hướng dẫn của WHO về việc lựa chọn các chất đánh dấu của dược liệu để

kiểm soát chất lượng thuốc thảo dược [35], tiêu chí lựa chọn các chất tham chiếu và kiểm soát chất lượng thuốc thảo dược nên tính đến các thành phần khác nhau có thể có mức độ ảnh hưởng khác nhau đến chất lượng, an toàn và hiệu quả cuối cùng. Do đó, thứ tự lựa chọn các chất để xác định và định lượng phải tuân theo các quy tắc được trình bày dưới đây: -

Nếu các thành phần có tác dụng đã biết và đã được xác định, chúng nên được sử dụng làm vết đánh dấu.

-

Nếu không phải là trường hợp 1 nhưng thành phần được công nhận tác dụng dược lý nên được sử dụng làm vết đánh dấu.

-

Nếu các trường hợp trên không được áp dụng, danh tính của nguyên liệu thảo dược, chế phẩm và thuốc có thể được xây dựng bằng cách phân tích (các) chất đánh dấu là các thành phần đặc trưng khác.

-

Ngoài ra cũng có thể dùng dược liệu chuẩn để đối chiếu.

Tổ chức Y tế Thế giới WHO cũng đã đưa ra định nghĩa về chất đặc trưng như 11

sau: “Một thành phần chất tự nhiên có trong một bộ phận của cây có thể được dùng để đảm bảo cho sự nhận biết hoặc đảm bảo chất lượng chế phẩm của cây thuốc đó, không nhất thiết là hoạt chất” [35].

Các phương pháp sắc ký xác định dấu vân tay đang được sử dụng là TLC, HPTLC, HPLC, GC, hoặc sắc ký kết hợp đo phổ LC-MS, GC-MS, HPLC-DAD…[30].

Phương pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao có nhiều ưu điểm so với các phương pháp khác là: -

Có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu, tiết kiệm chi phí, dung môi và thời gian

-

Có thể vừa định tính vừa định lượng

-

Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được phun trên cùng một bản mỏng sắc ký, khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm nên có thể so sánh trực tiếp đối chứng nhau, hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần phân tích.

-

Chuẩn bị mẫu đơn giản, không cần xử lý dung môi trước (lọc hay siêu âm).

****** Như vậy, theo các tài liệu ghi nhận được, có 04 loài thuộc chi Gymnema R.Br. là G. sylvestre, G. latifolium, G. inodorum và G. yunnanense ở Việt Nam hiện đang được nghiên cứu đều có tác dụng hạ đường huyết ở các mức độ khác nhau. Bên cạnh những đặc điểm tương đối khác biệt về hình thái, các aglycon trong khung cấu trúc saponin của thành phần hóa học bốn loài Dây thìa canh này cũng có sự khác biệt nhất định (bảng 1.3). Chính sự khác biệt về cấu trúc sẽ dẫn đến sự khác biệt về các vết sắc ký trên sắc ký đồ của từng loài Dây thìa canh.

Mặt khác, trên thị trường, khi các chế phẩm đã sử dụng dạng dược liệu khô cắt nhỏ hoặc dạng cao chiết từ Dây thìa canh nên rất khó có thể nhận biết được sự có mặt của loài Dây thìa canh nào trong chế phẩm nhờ cảm quan. Do đó, nghiên cứu dự kiến sử dụng các vết sắc ký điển hình là cơ sở quan trọng để có thể bước đầu phân biệt được các loài trong chi dựa trên bằng chứng hóa học đơn giản.

12

Bảng 1.3. Tổng hợp sự khác biệt về cấu trúc khung chất chính của các loài trong chi Gymnema R.Br. R

R

R

3

6

R

5

4

R

R

4

H

R

5

2

OH 1

R1

R O OR

H

2

Khung saponin chính trong loài G.

Khung saponin chính trong loài G.

sylvestre nguồn gốc Ấn Độ

sylvestre nguồn gốc Việt Nam

R

OR 1

4

H R R R R1

OR 2 OH

2

OR

5

6

OH R3O

H R3

Khung saponin chính trong loài G.

Khung saponin chính trong loài G.

yunnanense

latifolium CH 2R

4

R

2

R3

HOOC

OH

O HO

O CH 2R OR

6

OR

1

5

Khung saponin chính trong loài G. inodorum

13

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 2.1.1. Mẫu nghiên cứu - Mẫu nghiên cứu xây dựng vân tay sắc ký theo loài (nhóm 1): Các mẫu thuộc chi Gymnema R.Br. thu hái ở Hòa Bình, Quảng Bình, Nam Định và vùng trồng Dây thìa canh ở Phú Lương, Thái Nguyên; được thu hái trong thời gian gần nhau vào tháng 5 và đầu tháng 6 năm 2020. Các mẫu nghiên cứu đều được giám định tên khoa học và lưu mẫu tại phòng tiêu bản của Trường Đại học Dược Hà Nội (phụ lục 1).

Tên loài, địa điểm, thời điểm thu mẫu, dạng mẫu lúc thu và ký hiệu trong nghiên cứu của từng mẫu được thể hiện trong bảng 2.1-i.

- Mẫu nghiên cứu để so sánh sắc ký đồ và xác định loài (nhóm 2): Là các mẫu thu mua trên thị trường, thông tin mẫu thể hiện trong bảng 2.1-ii.

Bảng 2.1. Danh mục và ký hiệu các mẫu trong nghiên cứu (i và ii) i) Mẫu xây dựng vân tay sắc ký STT

Loài

Tên thường

Thời gian, địa điểm

Dạng mẫu

Ký

gọi

thu mẫu

lúc thu

hiệu

Lá tươi

GS1a

Dược liệu

GS3

16/5/2020, Yên Ninh, Phú Lương, Thái

1

Nguyên Dây thìa canh lá nhỏ

2 3

G. sylvestre

T6/2020, Hải Hậu, Nam Định T6/2020, Quảng Bình T6/2020, Quảng Bình

4 Dây thìa canh

5

nhập nội

6

và lá

GS4 GS5

16/5/2020, Yên Ninh, Phú Lương, Thái

Lá tươi

GS2

Nguyên

Thái Nguyên

GL1a

7

G. latifolium

Giống gốc

16/5/2020, Yên Ninh,

8

(Dây thìa

Thái Lan

Phú Lương, Thái

9

canh lá to)

Cuống ngắn

Nguyên

10

khô lẫn cành

Cuống dài

GL2a Lá tươi

GL3a GL4a GL5a

14

STT

11

12

Loài

Tên thường

Thời gian, địa điểm

Dạng mẫu

Ký

gọi

thu mẫu

lúc thu

hiệu

Lá tươi

GYa

Lá tươi

GIa

G.

Dây thìa canh

yunnanense

Vân Nam

G. inodorum

16/5/2020, Yên Ninh, Phú Lương, Thái Nguyên T6/2020, Kim Bôi, Hòa Bình

ii) Mẫu nghiên cứu để so sánh sắc ký đồ và xác định loài Thời gian, địa điểm thu mẫu

STT

13 14 15

16

Dạng mẫu lúc thu mua

T6/2020, sản phẩm Trà dây thìa canh đặc

T5/2020, sản phẩm từ công ty Dược liệu Indochina Herb, Hà Nội

trong nghiên cứu GX1

biệt của công ty DK natura, Thái Nguyên T6/2020, chợ thuốc Lãn Ông, Hà Nội

Ký hiệu

Dược liệu khô gồm cành và lá

T6/2020, mua tại chợ ở Kim Bôi, Hòa Bình

GX2 GX3

GX4

2.1.2. Trang thiết bị nghiên cứu 2.1.2.1. Hóa chất, dung môi - Hóa chất, dung môi và thuốc thử được sử dụng đều đạt tiêu chuẩn phân tích theo Dược điển Việt Nam V: KOH, toluen, aceton, methanol, ethanol 96%, ethylacetat, acid formic, HCl đặc, H2SO4 đặc, nước cất, thuốc thử hiện màu vanillin-acid sulfuric (pha theo phụ lục 2.1.1 Dược điển Việt Nam V tập 2: Trộn đồng lượng dung dịch vanilin 1% trong ethanol 96% và dung dịch acid sulfuric 5% trong ethanol 96%; pha trước khi dùng [8]),…

- Chất chuẩn: Gymnemagenin (thông số mẫu: lot PRF9072601, cas 22467-07-8, độ tinh khiết 99,4%), cân 5.32mg hòa tan trong vừa đủ 5.0ml MeOH, lắc đều, bảo quản trong ngắn mát tủ lạnh. Nồng độ dung dịch chuẩn 1.064 mg/ml (pha sẵn do Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương cung cấp).

- Bản mỏng chạy TLC Silica Gel GF254 (Merck).

15

2.1.2.2. Dụng cụ và thiết bị dùng trong thí nghiệm -

Các dụng cụ thí nghiệm thường quy (bình nón nút mài, giấy lọc, cốc có mỏ, bình gạn, ống đong, ống ly tâm, pipet…) và các dụng cụ khác (mao quản, bình khai triển sắc ký…)

-

Máy cất quay chân không Büchi B-490 và R-220 (Thụy Sỹ)

-

Cân kỹ thuật Sartorius, độ chính xác 0,01 g (Đức)

-

Cân phân tích Shimadzu, độ chính xác 0,0001g (Nhật Bản)

-

Tủ sấy Memmert (Đức)

-

Bể siêu âm Ultrasonic LC60H (Đức)

-

Máy li tâm lạnh Centrifuge (Trung Quốc)

-

Hệ thống HPTLC CAMAG gồm: bàn tiêm mẫu tự động LIMONAT V, bình khai triển bản mỏng tự động ADC2, buồng chụp sắc ký TLC Visualizer, máy nhúng thuốc thử, máy vi tính với phần mềm điều khiển winCATS và phần mềm phân tích VideoSan (Thụy Sỹ).

2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Khảo sát một số thông số của quy trình phân tích vân tay sắc ký các mẫu nghiên cứu - Khảo sát điều kiện chạy sắc ký cho dịch chiết toàn phần và dịch chiết phân đoạn ethyl acetat sau thủy phân gồm: hệ dung môi pha động, thể tích tiêm mẫu nhằm lựa chọn được điều kiện ra được sắc ký đồ tách biệt rõ nét nhất khi hiện màu bằng UV 254nm, UV 366nm và thuốc thử vanilin-acid sulfuric.

- Xây dựng quy trình tối ưu từ các yếu tố đã nghiên cứu cho phân tích HPTLC bằng hệ thống CAMAG. 2.2.2. Xây dựng vân tay hóa học của một số loài thuộc chi Gymnema R.Br. Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng và phân tích sắc ký đồ dịch chiết trước và sau thủy phân của các mẫu nghiên cứu từ đó xây dựng vân tay sắc ký điển hình của mỗi loài.

2.2.3. Xây dựng cây phân loại dựa trên thành phần hoá học (sắc ký đồ) của các mẫu nghiên cứu.

Tiến hành phân tích sự đa dạng về thành phần hóa học giữa các loài trong chi Gymnema dựa trên các thông tin vân tay sắc ký thu được từ đó xây dựng cây phân loại đến loài theo sự xuất hiện các vết trên sắc ký đồ ở các mẫu nghiên cứu.

16

2.2.4. Ứng dụng phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh thu được trên thị trường Tiến hành sắc ký và so sánh sắc ký đồ của các mẫu Dây thìa canh trên thị trường với sắc ký đồ của các mẫu nghiên cứu để có kết luận ban đầu về sự xuất hiện của các loài Gymnema trong các mẫu Dây thìa canh thu được trên thị trường.

2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích Các mẫu nghiên cứu được chiết đồng thời bằng 2 phương pháp để thu được dịch chiết toàn phần và dịch chiết sau khi thủy phân. Trong đó, mẫu GS1a được lựa chọn làm mẫu khảo sát quy trình phân tích.

2.3.1.1. Chuẩn bị dược liệu - Với các mẫu thu được lá tươi: Mẫu được rửa sạch, sấy khô ở 55oC đến hàm ẩm dưới 12%. Với các mẫu dược liệu khô: Chọn lấy phần lá làm nguyên liệu nghiên cứu.

- Các mẫu sau đó được xay đến bột thô và rây qua rây 0,71mm bảo quản trong túi nilon kín.

2.3.1.2. Chuẩn bị dịch chiết toàn phần Cân chính xác khoảng 2g bột dược liệu vào bình nón nút mài 250ml. Tiến hành chiết siêu âm 3 lần, mỗi lần với 50ml ethanol 70% trong 30 phút. Lọc, gộp dịch, cô đến cắn. Cắn này hòa tan trong 10ml methanol rồi đi ly tâm lấy dịch làm mẫu chấm sắc ký.

2.3.1.3. Chuẩn bị dịch chiết sau thủy phân Dược liệu được thủy phân các liên kết glycosid trong môi trường acid rồi làm lạnh để tủa xuống aglycon dạng muối; kiềm hóa tủa này thu được aglycon dạng base.

Chiết đồng lượng lỏng-lỏng bằng ethyl acetat (lắc trong bình gạn) dịch nước chứa aglycon base này thu được phân đoạn các aglycon tan trong ethyl acetat, lấy tất cả các chất trong phân đoạn này làm dịch phun sắc ký. Quy trình chi tiết thể hiện trong hình 2.1.

17

Hình 2.1. Quy trình chiết - thủy phân các mẫu nghiên cứu 18

2.3.2. Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký - Bản mỏng: TLC silicagel 60 F254 (Merck) được hoạt hóa ở 105oC trong vòng 30 phút, sau đó lấy ra để nguội để triển khai sắc ký.

- Kích thước bản mỏng: 10x10 cm hoặc 10x20 cm - Đưa mẫu lên bản mỏng bằng máy tiêm mẫu Linomat V. Vị trí tiêm mẫu cách mép dưới bản mỏng là 8,0 mm, khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng là 15,0 mm. Độ rộng của vết là 8 mm.

- Khảo sát thể tích tiêm mẫu: tiêm những thể tích khác nhau (dịch chiết toàn phần khảo sát các thể tích tiêm: 0,5µl; 1µl; 1,5µl, 2µl; dịch chiết sau thủy phân khảo sát ở các thể tích: 6µl; 8µl; 10µl, 12µl của cùng dịch chiết mẫu GS1a trên cùng một bản mỏng silicagel G60F254, khai triển với hệ dung môi được lựa chọn ở dưới. Lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp cho vết đủ rõ, gọn.

- Hệ dung môi khai triển: Tiến hành khảo sát một mẫu dịch chiết GS1a với lần lượt các hệ dung môi sau: Hệ 1: Cloroform: methanol: nước (15:5:1) Hệ 2: n-butanol: acid acetic: nước (4:1:5, lớp trên) Hệ 3: Ethyl acetat: acid acetic: nước (8:2:1) Hệ 4: Ethyl acetat: methanol: nước (100:17:13) Hệ 5: Cloroform: methanol: acid formic (10:1,1:0,02) Hệ 6: Ehtyl acetat: methanol: acid formic (5:4:0,02) Hệ 7: Toluen: ethyl acetat: acid formic (5:4:1) Hệ 8: n-hexan: ethyl acetat: acid formic (5:4:1) - Điều kiện chạy sắc ký lớp mỏng + Điều kiện môi trường: nhiệt độ: 28oC, độ ẩm: 70%. + Thể tích dung môi bão hòa: 25 ml; thể tích dung môi khai triển: 10,0 ml. + Thời gian bão hòa dung môi: 15 phút. + Thời gian sấy bản mỏng: 5 phút + Quãng đường di chuyển của dung môi pha động: 80,0 mm.

- Bản mỏng được hiện màu bằng cách: + Soi dưới đèn UV bước sóng 254 nm và 366 nm. + Hiện màu bằng dung dịch valinin-acid sulfuric (TT) (chuẩn bị như mục

2.1.2.1). Bản mỏng sau đó được sấy ở 105oC trong 10 phút và quan sát 19

dư᝛i ånh sång thư�ng và dư᝛i UV 366nm.

D᝹a trên kết quả quan såt đưᝣc, ch�n pha đ᝙ng cho cåc vết sắc ký tåch nhau, g�n, ít bᝋ kÊo đuôi và có Rf cᝧa cåc chẼt nẹm trong khoảng tᝑi ưu tᝍ 0,10 - 0,90 cho cåc nghiên cᝊu tiếp theo.

2.3.3. Tiáşżn hĂ nh phân tĂ­ch vân tay sắc kĂ˝ cĂĄc dáť‹ch chiáşżt máť™t sáť‘ loĂ i trong chi Gymnema R.Br. theo quy trĂŹnh Ä‘áť xuẼt - ChuẊn báť‹ cĂĄc mẍu nghiĂŞn cᝊu theo m᝼c 2.3.1 áť&#x; trĂŞn.

- Triáťƒn khai sắc kĂ˝ cĂĄc mẍu theo Ä‘iáť u kiᝇn áť&#x; m᝼c 2.3.2 váť›i tháťƒ tĂ­ch phun táť‘i Ć°u vĂ máť™t hᝇ dung mĂ´i khai triáťƒn đưᝣc cháť?n cĂł hiᝇu láťąc tĂĄch táť‘t nhẼt.

- Ch᝼p ảnh bản m�ng, xåc đᝋnh cåc vết chính trên sắc ký đᝓ, tính giå trᝋ Rf và mà u sắc cᝧa tᝍng vết tưƥng ᝊng thu đưᝣc.

- XĂĄc Ä‘áť‹nh váşżt đạc trĆ°ng cᝧa chi vĂ loĂ i: + Váşżt đạc trĆ°ng cᝧa chi: Váşżt sắc kĂ˝ xuẼt hiᝇn áť&#x; tẼt cả cĂĄc mẍu nghiĂŞn cᝊu

thuáť™c chi Gymnema R.Br. khi tiáşżn hĂ nh phân tĂ­ch trĂŞn cĂšng Ä‘iáť u kiᝇn triáťƒn khai sắc kĂ˝. + Váşżt đạc trĆ°ng cᝧa loĂ i: Váşżt sắc kĂ˝ chᝉ xuẼt hiᝇn áť&#x; 1 loĂ i nghiĂŞn cᝊu mĂ

khĂ´ng xuẼt hiᝇn áť&#x; cĂĄc loĂ i khĂĄc khi tiáşżn hĂ nh cĂšng Ä‘iáť u kiᝇn sắc kĂ˝.

2.4. PhĆ°ĆĄng phĂĄp xáť­ lĂ˝ káşżt quả Ä?áťƒ xây dáťąng vân tay sắc kĂ˝: Tiáşżn hĂ nh phân tĂ­ch sáť‘ lưᝣng, mĂ u sắc, Rf cᝧa cĂĄc váşżt trĂŞn sắc kĂ˝ Ä‘áť“ tĆ°ĆĄng ᝊng cᝧa cĂĄc mẍu trong cĂšng máť™t loĂ i. vĂ giᝯa cĂĄc loĂ i váť›i nhau Ä‘áťƒ tĂŹm ra nhᝯng váşżt sắc kĂ˝ đạc trĆ°ng cho chi/loĂ i/giáť‘ng. Ä?áťƒ xây dáťąng cây phân loấi dáťąa trĂŞn hĂŹnh ảnh sắc kĂ˝ Ä‘áť“: Tiáşżn hĂ nh tháť‘ng kĂŞ đạc Ä‘iáťƒm thĂ nh phần hĂła háť?c cᝧa cĂĄc mẍu qua cĂĄc káşżt quả sắc kĂ˝ Ä‘áť“ thu đưᝣc. Sáťą cĂł mạt cᝧa cĂĄc “váşżtâ€? trĂŞn sắc kĂ˝ Ä‘áť“ đưᝣc mĂŁ hĂła nháť‹ biáşżn, trong Ä‘Ăł “1â€? lĂ cĂł váşżt vĂ â€œ0â€? lĂ khĂ´ng cĂł váşżt. Mạt khĂĄc, nhᝯng váşżt cĂł cĂšng Rf nhĆ°ng cĂł mĂ u sắc khĂĄc nhau thĂŹ đưᝣc coi lĂ 2 váşżt khĂĄc nhau khi khai biáşżn. Hᝇ sáť‘ Ä‘áť“ng dấng Sij cᝧa cĂĄc mẍu đưᝣc tĂ­nh theo cĂ´ng thᝊc cᝧa Nei&Li:

Sij = Trong Ä‘Ăł:

2 Nij đ?‘ đ?‘–+đ?‘ đ?‘—

Sij là hᝇ sᝑ đᝓng dấng Nij là sᝑ vết chung cᝧa 2 loà i i và j Ni là sᝑ vết cᝧa loà i i Nj là sᝑ vết cᝧa loà i j 20

Trên cơ sở bảng hệ số đồng dạng vết trên sắc ký đồ của các mẫu nghiên cứu xây dựng vân tay sắc ký, sử dụng phương pháp phân tích cụm (Cluster Analysis) để xây dựng cây phân loại đặc điểm thành phần hóa học theo phương pháp khoảng cách liên kết trung bình UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages) bằng phần mềm NTSYSpc 2.1.

(Nguyên tắc: Cluster Analysis là phương pháp sử dụng phương thức liên kết hoàn chỉnh để phân cụm theo phân cấp mặc định. Phương pháp phân cụm này xác định khoảng cách cụm giữa hai cụm là khoảng cách tối đa giữa các thành phần riêng lẻ của chúng.

Trong quá trình kết tụ phân cấp, mỗi quan sát bắt đầu như một nhóm riêng biệt. Hai cụm gần nhất được hợp nhất thành một cụm mới. Quá trình được lặp lại cho đến khi toàn bộ tập dữ liệu được kết tụ thành một cụm duy nhất. Đầu ra mang lại một cây phân loại cho thấy mối quan hệ giữa các quan sát và giữa các cụm mà chúng được hợp nhất liên tiếp.

Cây phân loại về thành phần hoá học được xây dựng để xác định quan hệ gần gũi giữa các mẫu nghiên cứu trong chi Gymnema R.Br. ở khu vực nghiên cứu). Để so sánh và bước đầu nhận dạng các mẫu Dây thìa canh trên thị trường: Tiến hành so sánh số lượng, màu sắc, Rf của các vết sắc ký trên sắc ký đồ tương ứng và tiến hành chồng phổ với các mẫu nghiên cứu để so sánh sự tương đồng.

21

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 3.1. Kết quả khảo sát một số thông số của quy trình phân tích vân tay sắc ký các mẫu nghiên cứu Đối tượng khảo sát: Mẫu Dây thìa canh lá nhỏ có ký hiệu GS1a.

3.1.1. Với dịch chiết toàn phần Sau khi khảo sát các hệ dung môi pha động (mục 2.3.2), pha động ổn định và có hiệu lực tách tốt nhất đối với dịch chiết toàn phần của mẫu GS1a là hệ dung môi số 4 gồm ethyl acetat: methanol: nước tỷ lệ 100:17:13. Hệ dung môi này cho sắc ký đồ của mẫu khảo sát GS1a có nhiều vết sắc ký ở các bước sóng UV 254 nm và UV 366 nm.

Sau khi phun thuốc thử vanilin- acid sulfuric có nhiều vết mới xuất hiện và quan sát được dưới ánh sáng trắng, các vết sắc ký gọn và tách nhau khá rõ.

Khảo sát thể tích tiêm mẫu theo quy trình chuẩn bị dịch chiết nhận thấy ở thể tích tiêm 1,5µl sắc ký đồ rõ nét, tách gọn, ít kéo đuôi nhất.

Từ kết quả trên, quy trình định tính bằng sắc ký lớp mỏng cho dịch chiết toàn phần được lựa chọn với thể tích tiêm mẫu tiêm mẫu là 1,5µl và hệ dung môi pha động là ethyl acetat: methanol: nước tỷ lệ 100:17:13, sắc ký đồ được quan sát ở các điều kiện: bước sóng 254nm, 366nm trước khi phun thuốc thử, ánh sáng thường và bước sóng 366nm sau phun thuốc thử (hình ảnh sắc ký đồ khảo sát thể tích phun trong phụ lục 3).

3.1.2. Với dịch chiết sau thủy phân Sau khi khảo sát các hệ dung môi pha động (mục 2.3.2), pha động ổn định và có hiệu lực tách tốt nhất đối với dịch chiết sau thủy phân của mẫu GS1a là hệ dung môi số 7 gồm toluen: ethyl acetat: acid formic với tỷ lệ 5:4:1. Sau khi tiến hành phun thuốc thử vanilin-acid sulfuric và hiện màu, hệ dung môi này cho sắc ký đồ gồm nhiều vết gọn và rõ nét nhất.

Mặt khác khi tiêm mẫu dịch chiết ở thể tích tiêm mẫu 10µl các vết xuất hiện rõ ràng, tách nhau ít chồng lấn và kéo đuôi, trên 10µl vết sắc ký đậm, phun thuốc thử hiện màu bị kéo đuôi khó quan sát, tiêm dưới 10µl vết mờ hoặc mất vết.

Như vậy, hệ dung môi pha động toluen: ethyl acetat: acid formic tỷ lệ 5:4:1 và thể tích tiêm mẫu 10µl là hệ dung môi và thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất cho quá trình phân tích vân tay sắc ký dịch chiết mẫu nghiên cứu GS1a sau thủy phân. Nhóm nghiên cứu chọn các điều kiện này cho quá trình phân tích trên các mẫu còn lại (hình ảnh sắc ký đồ khảo sát thể tích phun trong phụ lục 3).

22

3.2. Kết quả xây dựng vân tay hóa học một số loài thuộc chi Gymnema R.Br. 3.2.1. Với dịch chiết toàn phần Sau khi triển khai sắc ký dịch chiết toàn phần các mẫu thuộc 4 loài Gymnema khác nhau với hệ dung môi và thể tích tiêm mẫu đã lựa chọn thu được sắc ký đồ của các mẫu nghiên cứu ở các điều kiện quan sát khác nhau như hình 3.1 – trang 24. Trong các hình ảnh sắc ký đồ thu được, sắc ký đồ ở ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử cho nhiều vết sắc ký nhất, các vết gọn và khá rõ nên đề tài sử dụng hình ảnh sắc ký đồ này để phân tích sự đa dạng về thành phần hóa học giữa các loài trong chi.

Tiến hành phân tích sự xuất hiện/không xuất hiện các vết sắc ký trên sắc ký đồ của các mẫu nhóm 1 quan sát bằng VIS-TT bằng cách mã hóa nhị phân 1/0 (bảng 3.1 – trang 26) nhận thấy sắc ký đồ của các mẫu/loài nghiên cứu khá giống nhau, chỉ có mẫu loài G. inodorum có điểm khác biệt nhiều, cụ thể: -

Có 6 vết xuất hiện sau khi phun thuốc thử ở tất cả các mẫu nghiên cứu, Rf lần lượt là: 0,22-màu nâu dưới ánh sáng thường và xám đậm dưới UV 366nm (trừ mẫu GIa có màu xanh nhạt ); 0,39-màu xanh lá dưới UV 366nm; 0,55; 0,60 (xám nhạt); 0,78 (xám nhạt) và 0,89 (màu xám đậm dưới ánh sáng thường, phát huỳnh quang đỏ dưới đèn UV 366nm). Tại các vết có Rf=0,39; 0,55 và 0,61; trước phun thuốc ở cả bước sóng 254nm và 366nm đều không xuất hiện (trừ mẫu GS2 có vết 0,39 phát huỳnh quang sáng dưới UV 366nm). Như vậy, vết sắc ký có Rf=0,39; 0,55 và 0,60 tương đối đặc trưng cho chi Gymnema R.Br. Các vết này được bôi màu đỏ trong bảng 3.1 – trang 26.

-

Các mẫu Dây thìa canh lá nhỏ loài G. sylvestre (GSx trừ GS2) xuất hiện nhiều vết chung, ngoài các vết chung của chi còn có thêm tại Rf : 0,11; 0,29 (trừ mẫu GS3); 0,33 (trừ mẫu GS4); 0,49; 0,65; 0,70 và 0,78 (trừ mẫu GS4); trong đó vết 0,70-xám nhạt trên sắc ký đồ VIS-TT chỉ xuất hiện ở loài này.

-

Các mẫu trong loài Dây thìa canh lá to (GLx) cùng mẫu Dây thìa canh nhập nội (GS2) có sắc ký đồ rất giống nhau sau khi phun thuốc thử, đều có các vết (trừ vết chung của chi) tại Rf: 0,13; 0,17; 0,30; 0,34; 0,43; 0,49; 0,63. Sự khác biệt rõ nhất giữa mẫu GS2 so với các mẫu trong loài Dây thìa canh lá to thể hiện rõ trên sắc ký đồ trước phun thuốc thử ở UV 366nm: vết Rf=0,39 ở mẫu Dây thìa canh nhập nội và vết 0,55 ở các mẫu Dây thìa canh lá to phát huỳnh quang sáng (đánh dấu màu xanh trên bảng 3.1 – trang 26).

23

Hình 3.1. Sắc ký đồ khai triển dịch chiết toàn phần của các mẫu Gymnema nhóm 1 Chú thích:

a) Quan sát dưới UV 254nm trước khi phun thuốc thử; b) Quan sát dưới UV 366nm trước khi phun thuốc thử c) Quan sát dưới ánh sáng trắng sau phun thuốc thử; d) Quan sát dưới UV 366nm sau phun thuốc thử.

24

-

Mẫu loài G. inodorum quan sát trên sắc ký đồ mẫu GIa ở ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử nhận thấy mẫu này có sắc ký đồ khác biệt nhất: xuất hiện 2 vết sắc ký ở Rf=0,08 có màu tím đậm, phát huỳnh quang nâu và Rf=0,22 có màu xanh nhạt và phát huỳnh quang xanh khi quan sát dưới UV 366-TT sau phun thuốc thử; các vết tại Rf=0,22; 0,38 và 0,70 phát huỳnh quang sáng chỉ xuất hiện ở mẫu này trên bản trước phun thuốc thử soi dưới UV 366nm (đánh dấu màu xanh trên bảng 3.1 – trang 26).

-

Mẫu GYa (loài G. yunnanense) có sắc ký đồ nhiều tương đồng các mẫu khác trong chi Gymnena R.Br., chỉ quan sát thấy điểm khác biệt khi soi UV 366nm trước phun thuốc thử tại Rf=0,28 có xuất hiện vết cho huỳnh quang sáng không xuất hiện trên các mẫu khác (đánh dấu màu xanh trên bảng 3.1 – trang 26).

Tiến hành chồng phổ sắc ký đồ của các dịch chiết mẫu Gymnema nhóm 1 sau khi

phun thuốc thử và quan sát dưới ánh sáng thường nhận thấy phổ từ Rf 0,35 trở lên giữa các loài tương đồng nhau nhiều (hình 3.2).

Hình 3.2. Kết quả chồng phổ sắc ký dịch chiết toàn phần tại VIS-TT các mẫu thuộc nhóm 1 Dữ liệu sắc ký đồ trước thủy phân chưa thể hiện được rõ sự khác biệt giữa các mẫu/loài Gymnema nghiên cứu. Sắc ký đồ có khá nhiều vết và các vết chưa tách hẳn nhau nên quá trình phân tích kết quả khó khăn. Đề tài đã tiến hành thủy phân các dịch chiết theo mục 2.3.1.3 để tạo dịch chiết chọn lọc hơn và bộc lộ được các khung saponin cấu trúc chính của từng loài, từ đó có những phân tích rõ ràng và chính xác hơn.

25

Bảng 3.1. Sự xuất hiện các vết trên sắc ký đồ dịch chiết toàn phần mẫu nghiên cứu nhóm 1 khi quan sát ở bản mỏng sau phun thuốc thử Rfx100

GS1a GS2 GS3 GS4 GS5 GL1a GL2a GL3a GL4a GL5a GYa GIa

2

1

1

1

0

1

1

1

1

1

1

1

1

6-8

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

1

11

1

0

1

1

1

0

0

0

0

0

1

1

13

0

1

0

0

0

1

1

1

1

1

1

0

17

0

1

0

0

0

1

1

1

1

1

0

0

22

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

28

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

29

1

0

0

1

1

0

0

0

0

0

1

1

30

0

1

0

0

0

1

1

1

1

1

0

0

32-33

1

1

1

0

1

1

1

1

1

1

1

1

38-39

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

42

0

1

0

0

0

1

1

1

1

0

1

0

48-49

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1 1

1 1

1

1

1 1

1

54-55

1 1

1

1

60-61

1

1

1

1

0

1

1

1

1

1

1

1

62-63

0

1

0

0

0

1

1

1

1

1

1

1

65

1

0

1

1

1

0

0

0

0

0

0

0

70

1

0

1

1

1

0

0

0

0

0

0

0

77-79

1

1

1

0

1

1

1

1

1

1

1

1

81-82

0

1

0

0

0

1

1

1

1

1

1

0

86-88

0

0

0

1

0

0

0

0

0

0

1

1

89-90 1 1 Chú thích:

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

Các vết tương đồng xuất hiện ở tất cả các loài thuộc mẫu nghiên cứu Các vết xuất hiện ở mẫu nghiên cứu cùng loài Các vết đặc biệt – vết có cùng Rf nhưng khác về màu sắc quan sát được (1-Có xuất hiện vết tại Rf tương ứng, 0-không xuất hiện; Số liệu sắc ký đồ trình bày trong phụ lục 4) 26

3.2.2. Với dịch chiết sau thủy phân Triển khai sắc ký dịch chiết sau thủy phân các mẫu thuộc nhóm 1 (mục 2.1.1) với hệ dung môi và thể tích tiêm mẫu ở mục 3.1.2 thu được sắc ký đồ của các mẫu nghiên cứu. Hình ảnh sắc ký đồ sau thủy phân cho các vết với số lượng vừa phải, tách nhau khá rõ và gọn dễ quan sát hơn. Hình ảnh sắc ký đồ với các điều kiện quan sát bao gồm UV ở bước sóng 366nm và sánh sáng thường sau khi phun thuốc thử được sử dụng để phân tích các kết quả cụ thể (hình 3.3 – trang 30).

Qua quan sát sắc ký đồ dưới ảnh sáng thường sau khi phun thuốc thử của các mẫu nghiên cứu nhận thấy như sau: Mẫu Dây thìa canh Vân Nam G. yunnanense có sắc ký đồ khác biệt rõ rệt so với các mẫu còn lại, mẫu Dây thìa canh nhập nội (GS2) có sắc ký đồ tương tự các mẫu Dây thìa canh lá to và mẫu Dây thìa canh lá nhỏ có sắc ký đồ có nhiều điểm tương đồng với mẫu Dây thìa canh G. idonorum.

3.2.2.1. Sắc ký đồ của các mẫu Dây thìa canh G. sylvestre Khi quan sát sắc ký đồ của các các mẫu Dây thìa canh G.sylvestre nhận thấy các mẫu chia thành 02 nhóm với sự khác biệt rõ rệt trên sắc ký đồ. Các mẫu nhóm 1 là các mẫu Dây thìa canh lá nhỏ có sắc ký đồ tương tự nhau với 12 vết trên sắc ký đồ (bảng 3.2) thì chỉ có 2 vết có sự khác nhau: cụ thể tại vết ở Rf=0,89 không quan sát thấy trên trên SKĐ mẫu GS4; vết 0,15 chỉ quan sát được ở mẫu GS3; vết ở Rf=0,83 mẫu GS3, GS4 phát huỳnh quang khác màu (màu xanh nhạt so với màu nâu của mẫu GS1a và GS4). Các vết còn lại đều xuất hiện với Rf và màu sắc như nhau ở tất cả các mẫu thuộc loài Dây thìa canh lá nhỏ (kết quả tổng hợp thành bảng 3.2).

Nhóm 2 là mẫu Dây thìa canh nhập nội có sắc ký đồ khác biệt các mẫu Dây thìa canh lá nhỏ nhưng lại có nhiều điểm tương tự với sắc ký đồ của các mẫu Dây thìa canh lá to.

27

Bảng 3.2. Tổng hợp Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân các mẫu thuộc loài G. sylvestre quan sát ở VIS-TT hoặc UV 366-TT STT vết 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Rf GS1a GS3 GS4 GS5 0,04 Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt 0,11 Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt 0,15 0,22 Xám/vàng nâu Xám/vàng nâu Xám/vàng nâu Xám/vàng nâu Xám/xanh lá Xám/xanh lá Xám/xanh lá 0,28 Xám/xanh lá 0,32 Xám đậm/nâu Xám đậm/nâu Xám đậm/nâu Xám đậm/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu 0,42 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu 0,49 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu 0,51 0,57 Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt 0,71 Xám/vàng đậm Xám/vàng đậm Xám/vàng đậm Xám/vàng đậm 0,79 Xám/xanh lá Xám/xanh lá Xám/xanh lá Xám/xanh lá Xám/xanh lá Xám/xanh lá 0,83 Xám/nâu Xám/nâu 0,89 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu

(Chú thích: Bỏ trống là không có vết; màu sắc trước dấu sổ chéo là màu quan sát được ở VIS-TT, sau sổ chéo là UV 366-TT) 3.2.2.2. Phân tích sắc ký đồ của các mẫu Dây thìa canh lá to Sắc ký đồ dây thìa canh lá to và Dây thìa canh nhập nội có nhiều vết tương đồng: cùng chung 6 vết: 0,22-màu nâu đậm; 0,31; 0,42; 0,47; 0,53 và 0,89 (cùng màu xám).

Về điểm hác biệt: quan sát thấy trên các mẫu Dây thìa canh lá to tổng cộng 14 vết, có 8 vết chung (gồm 6 vết chung với Dây thìa canh nhập nội và 2 vết tại Rf=0,05; 0,11).

Trong các mẫu thuộc loài G. latifolium cũng nhận thấy sự khác biệt: mẫu GL3a xuất hiện thêm vết màu xám ở Rf=0,62; GL2a, GL3a thêm một vết ở 0,37 (màu xám); GL1a không có vết tại 0,71 và 0,78. Đặc biệt vết ở Rf=0,22; 0,42 tuy xuất hiện cả ở các mẫu thuộc loài khác nhưng khi soi dưới UV 366nm lại phát huỳnh quang xám khác biệt. Ba vết Rf 0,22-nâu đậm; 0,42-xám và 0,53-xám có thể coi là vết đặc trưng cho loài G. latifolium. Với mẫu Dây thìa canh nhập nội: quan sát thấy có 14 vết tất cả trên sắc ký đồ VIS-TT, màu sắc và Rf chi tiết các vết tổng hợp trong bảng 3.3.

28

Bảng 3.3. Tổng hợp Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân các mẫu thuộc loài G. latifolium quan sát ở VIS-TT hoặc UV 366-TT STT vết 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Rf GS2 0,03 Xám/nâu 0,05 0,08 Xám/nâu 0,11 0,12 Xám/nâu Tím đen/ 0,22 nâu đậm 0,31 Xám/nâu 0,37 Xám/nâu 0,42 Xám/nâu 0,47 Xám/nâu 0,53 Xám/nâu 0,57 Xám/nâu 0,62 Xám/nâu 0,71 Xám/nâu 0,78 Xám/nâu 0,89 Xám/nâu

GL1a Xám/nâu Xám/nâu

Xám/nâu

GL3a Xám/nâu Xám/nâu

GL4a Xám/nâu Xám/nâu

GL5a Xám/nâu Xám/nâu

Xám/nâu

Xám/nâu

Xám/nâu

Xám/nâu

Xám/nâu

Tím đen/ nâu đậm Xám/nâu

Tím đen/ nâu đậm Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu

Tím đen/ nâu đậm Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu

Tím đen/ nâu đậm Xám/nâu

Tím đen/ nâu đậm Xám/nâu

Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu

Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu

Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu

Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu

Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu

Xám/nâu

GL2a

Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu

(Chú thích: Bỏ trống là không có vết; màu sắc trước dấu sổ chéo là màu quan sát được ở VIS-TT, sau sổ chéo là UV 366-TT) 3.2.2.3. Phân tích sắc ký đồ mẫu Dây thìa canh Vân Nam Quan sát sắc ký đồ mẫu Dây thìa canh Vân Nam có tất cả 12 vết với Rf và màu sắc được trình bày ở bảng 3.4, trong đó các vết tại Rf=0,10; 0,21; 0,59 và 0,63 đặc trưng trên sắc ký đồ các mẫu loài G. yunnanense: vết 0,10-xám; 0,21-xám đậm; 0,59-xám đậm chỉ xuất hiện trên trên mẫu GYa; vết 0,63 phát huỳnh quang xanh khi soi dưới UV 366nm khác biệt so với các mẫu khác trong chi. Xác định 4 vết này là 4 vết đặc trưng cho loài G. yunnanense (bảng 3.4 – trang 31).

3.2.2.4. Phân tích sắc ký đồ mẫu Dây thìa canh G. idonorum Quan sát trên sắc ký đồ mẫu Dây thìa canh G. inodorum có tất cả 12 vết với Rf và màu sắc được trình bày ở bảng 3.4, trong đó có 3 vết đặc trưng tại Rf=0,22 và 0,71.

Vết 0,22 tuy cùng Rf các mẫu GLx và GSx nhưng soi UV 366nm lại phát huỳnh quang vàng nâu khác biệt. Vết 0,71 cũng phát huỳnh quang vàng nâu và rất đậm chỉ xuất hiện ở mẫu này. Như vậy, sơ bộ có thể coi 2 vết này là 2 vết đặc trưng cho loài G. inodorum (bảng 3.4 – trang 31).

29

Hình 3.3. Sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân của các mẫu Gymnema nhóm 1 Chú thích:

a) Quan sát dưới ánh sáng trắng sau phun thuốc thử b) Quan sát dưới UV 366nm sau phun thuốc thử

30

Bảng 3.4. Tổng hợp Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân các mẫu thuộc loài G. yunnanense và G. inodorum quan sát ở VIS-TT hoặc UV 366-TT STT vết 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Rf 0,03 0,05 0,08 0,11 0,15 0,17 0,22 0,27 0,29 0,32 0,35 0,47 0,50 0,53 0,57 0,60 0,63 0,71 0,81 0,89

GYa

GIa Xám/vàng nâu

Xám/xám Xám/xám Xám/xám

Xám/nâu

Xám/nâu Xám/xám

Xám/nâu Xám/nâu Xám/vàng nâu Xám/nâu

Xám/xanh lá Xám/nâu Xám/hồng Xám/xám Xám/nâu Xám/xám Xám/xám Xám/xám Xám/xám Xám/xanh lá Xám/xám

Xám/nâu Xám/nâu Tím đậm/nâu vàng Xám/nâu Xám/nâu

(Chú thích: Bỏ trống là không có vết; màu sắc trước dấu sổ chéo là màu quan sát được ở VIS-TT, sau sổ chéo là UV 366-TT) 3.3. Kết quả xây dựng cây phân loại dựa trên kết quả sắc ký lớp mỏng của các mẫu Gymnema nghiên cứu Theo vân tay sắc ký thu được từ mục 3.2. Nhận thấy kết sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân khi quan sát ở ánh sáng trắng và so sánh màu ở UV 366nm có sự khác nhau nhiều hơn kết quả quan sát ở dịch chiết toàn phần, do đó nhóm nghiên cứu chọn sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân để xây dựng cây phân loại các mẫu.

Tổng hợp kết quả các bảng 3.2, 3.3 và 3.4 thành bảng mã hóa nhị phân mở rộng: thêm một biến phụ (bên cạnh biến chính trùng Rf) là màu sắc khi quan sát dưới UV 366nm (trùng Rf và màu giống nhau = 1; trùng Rf khác màu nhau = 0). Bảng nhị nhân mở rộng (trong phụ lục 4) được dùng làm dữ liệu tính toán hệ số Nei&Li và vẽ cây phân 31

loại.

Kết quả thu được hệ số tương đồng giữa các mẫu có giá trị từ 0,41 đến 1,00 (bảng 3.5). Về cây phân loại, các mẫu cơ bản được chia thành 4 nhóm (hình 3.4), cụ thể là: -

Nhóm 1 gồm các mẫu Dây thìa canh lá nhỏ (G. sylvestre): GS1a, GS3, GS4, GS5 có hệ số tương đồng với nhau lên đến 0,92. Nhóm này lại gồm 2 nhánh nhỏ có hệ số tương đồng cao hơn là GS4, GS3 (0,95) và đặc biệt hai mẫu GS1a và GS5 giống nhau 100% hình ảnh sắc ký đồ quan sát được.

-

Nhóm 2 là mẫu G. inodorum (GIa). Cây phân loại cho thấy mẫu GIa và nhóm 1 có chung một gốc lớn, tức là tương đồng nhau hơn các nhánh còn lại; trên bảng hệ số Nei&Li thấy sắc ký đồ GIa có hệ số tương đồng với các mẫu nhóm 1 từ 0,61 đến 0,64.

-

Nhóm 3 gồm các mẫu Dây thìa canh lá to (GLx) và mẫu Dây thìa canh nhập nội (GS2) có độ tương đồng nhau trong nhóm từ 0,79 trở lên. Nhóm này lại tách ra thành 2 nhóm là GS2 và các mẫu GLx. Các mẫu GLx phân ra nhỏ hơn thành 3 nhóm (GL2a cùng GL4a; GL3a cùng GL5a; và GL1a) tuy nhiên có hệ số tương đồng cao >90%.

-

Nhóm 4 là mẫu GYa loài G. yunnanense khác biệt nhất trong các mẫu nghiên cứu: hệ số tương đồng với các mẫu khác chỉ từ 0,41 đến 0,62 và là nhóm ngoài cùng của cây phân loại (bảng 3.5 và hình 3.4).

32

Hình 3.4. Cây phân loại dựa trên phân tích UPGMA hệ số tương đồng giữa sắc ký đồ của các mẫu

Bảng 3.5. Bảng hệ số tương đồng cặp đôi giữa các mẫu nghiên cứu, sử dụng chỉ số Nei&Li GS1a

GS2

GS1a

1,00

GS2

0,56 1,00

GL1a

GL2a

GL3a

GL4a

GL5a

GYa

GIa

GS3

GS4

GS5

GL1a

0,51 0,79 1,00

GL2a

0,56 0,85 0,90

1,00

GL3a

0,51 0,85 0,95

0,95

1,00

GL4a

0,54 0,85 0,92

0,97

0,97

1,00

GL5a

0,54 0,87 0,92

0,97

0,97

0,95

1,00

GYa

0,49 0,82 0,46

0,46

0,46

0,44

0,48 1,00

GIa

0,62 0,51 0,59

0,53

0,54

0,51

0,56 0,46 1,00

GS3

0,92 0,59 0,49

0,49

0,44

0,86

0,46 0,41 0,64 1,00

GS4

0,92 0,49 0,49

0,49

0,44

0,46

0,46 0,41 0,64 0,95 1,00

GS5

1,00 0,56 0,51

0,56

0,51

0,54

0,54 0,49 0,61 0,92 0,92 1,00

33

3.4. Kết quả phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh thu được trên thị trường Sắc ký đồ của các mẫu Dây thìa canh trên thị trường (mẫu nhóm 2) được khai triển trên cùng bản mỏng với các mẫu Gymnema nhóm 1. Sau khi chồng phổ các mẫu này với nhau thấy các mẫu GX2, GX3 có sắc ký đồ nhiều điểm tương đồng với sắc ký đồ của GS1; mẫu GX4 nhiều điểm tương đồng với GI. Riêng sắc ký đồ mẫu GX1 có đặc điểm của các mẫu Dây thìa canh lá nhỏ (G. sylvestre) và Dây thìa canh lá to (G. latifolium). Các kết quả trên quan sát thấy ở cả sắc ký đồ dịch chiết toàn phần và dịch chiết sau thủy phân.

Hình ảnh chồng phổ được phân ra làm 3 nhóm như hình 3.5, hình 3.6 và hình 3.7 (hình ảnh bản mỏng và số liệu sắc ký ở phụ lục 5).

Hình 3.5. Kết quả chồng phổ sắc ký đồ các mẫu GX2, GX3 và sắc ký đồ GS1 Chú thích:

a) Dịch chiết toàn phần; 34

b) Dịch chiết sau thủy phân.

Các mẫu có phổ tương đồng phổ GS1: 2 mẫu GX2, GX3 có các pic tương ứng vị trí các pic trên sắc ký đồ GS1: - Trên phổ dịch chiết toàn phần trùng các vết đặc trưng chi: Rf=0,22-màu nâu, 0,39-màu xanh lá, 0,55; 0,60-xám nhạt, 0,78-xám nhạt và 0,89-màu xám đậm; đặc biệt có vết đặc trưng của mẫu Dây thìa canh lá nhỏ-vết Rf=0,7-màu xám nhạt khi quan sát ở VIS-TT. - Trên phổ dịch chiết sau thủy phân trùng Rf và màu sắc các vết: 0,22-tím đậm, 0,57-xám; 0,79-xám và phát huỳnh quang vàng nâu khi soi dưới UV 366nm là các vết có màu đặc biệt trên sắc ký đồ Dây thìa canh lá nhỏ.

Kết hợp với kết quả chồng phổ sơ bộ kết luận các mẫu GX2, GX3 có dược liệu loài G. sylvestre và có thành phần tương đồng gymnemagenin trong dược liệu (hình 3.5).

Hình 3.6. Kết quả chồng phổ sắc ký đồ mẫu GX4 và sắc ký đồ GI Chú thích:

a) Dịch chiết toàn phần; 35

b) Dịch chiết sau thủy phân.

Mẫu GX4 có phổ gần như trùng phổ GI, có các pic đặc trưng của GI (Rf=0,08màu tím đậm; 0,22-phát huỳnh quang xanh dưới UV 366nm trên sắc ký đồ dịch chiết toàn phần; và Rf=0,22; 0,71 phát huỳnh quang vàng nâu dưới UV 366nm trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân). Sơ bộ kết luận mẫu GX4 có chứa dược liệu loài G.inodorum (hình 3.6).

Hình 3.7. Kết quả chồng phổ sắc ký đồ mẫu GX1 và sắc ký đồ GS1, GL1 Chú thích:

a) Dịch chiết toàn phần;

b) Dịch chiết sau thủy phân.

Mẫu GX1 sắc ký đồ ngoài xuất hiện các pic đặc trưng trên mẫu loài Dây thìa canh lá nhỏ còn có cả các đặc điểm nhận dạng của mẫu thuộc loài Dây thìa canh lá toGLx: có vết sắc ký ở Rf=0,55 - phát huỳnh quang sáng trên sắc ký đồ quan sát dưới UV 366nm ở bản trước phun thuốc thử dịch chiết toàn phần (hình ảnh SKĐ trong phụ lục 5). Sơ bộ kết luận mẫu GX1 chứa dược liệu chi Gymnema của 2 loài G. sylvestre và G. latifolium (hình 3.7).

36

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 4.1. Về kết quả khảo sát quy trình định tính bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Để có thể xây dựng vân tay sắc ký của các mẫu nghiên cứu bằng sắc ký lớp mỏng việc lựa chọn dung môi và thể tích phun sắc ký sẽ ảnh hưởng nhiều đến kết quả phân tích. Để đảm bảm độ chính xác và độ lặp lại thì việc sàng lọc điều kiện để xây dựng quy trình định tính là cần thiết để có được kết quả tối ưu.

Hệ dung môi pha động là một trong những yếu tố quan trọng nhất tác động đến kết quả sắc ký đồ, để có thể tách được nhiều vết và các vết gọn, tác rõ nhau, cần thiết phải lựa chọn dung môi có độ phân cực phù hợp. So với dịch chiết toàn phần, các thành phần hóa học trong dịch chiết sau thủy phân có độ phân cực kém hơn do đã bị cắt các nhóm đường, do đó, hệ dung môi pha động cho dịch chiết sau thủy phân là toluen: ethylacetat: acid formic (5:4:1) có độ phân cực kém hơn so với hệ dung môi phù hợp tác các chất trong dịch chiết toàn phần là ethylacetat: methanol: nước (100:17:13). Mặt khác, để các vết trong sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân có độ phân giải cao hơn và ít kéo đuôi hơn, việc sử dụng dung môi toluen và acid formic là cần thiết.

Bên cạnh đó, việc khảo sát lượng mẫu đưa lên bản mỏng (thể tích tiêm mẫu) sẽ ảnh hưởng đến số lượng vết hiển thị và độ đậm nhạt của các vết trên sắc ký đồ. Kết quả cho thấy ở thể tích tiêm mẫu chỉ 1,5µl dịch chiết toàn phần đã cho sắc ký đồ tách rõ nhất; tuy nhiên với dịch chiết sau thủy phân cần tiêm ở 10µl sắc ký đồ mới tối ưu. Tiêm mẫu thể tích lớn hơn làm kéo dài thời gian tiêm mẫu và làm các vết sắc ký bị kéo đuôi và khó tách ra khỏi nhau.

Như vậy, nghiên cứu đã bước đầu sàng lọc được 2 yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích TLC là thể tích tiêm mẫu và dung môi pha động để xây dựng được một quy trình phân tích tối ưu cho ra các sắc ký đồ phù hợp của các mẫu nghiên cứu.

4.2. Về kết quả cao xây dựng vân tay hóa học một số mẫu thu được trong chi Gymnema R.Br. Qua quá trình phân tích sắc ký đồ dịch chiết trước và sau thủy phân của các mẫu nghiên cứu nhận thấy trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân, các vết sắc ký xuất hiện rõ ràng và gọn hơn, ít vết sắc ký hơn, màu sắc cũng khác biệt so với các vết trên sắc ký đồ của dịch chiết toàn phần. Điều này cho thấy quá trình thủy phân và chiết bằng dung môi ethylacetat đã thay đổi các chất có trong dịch chiết toàn phần về cả số lượng lẫn cấu trúc.

37

Ở sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân, trừ mẫu G. yunnanense, các mẫu đều có vết trùng Rf với chất chuẩn gymnemagenin, nhưng chỉ có các mẫu Dây thìa canh lá to và mẫu Dây thìa canh nhập nội là có cùng màu sắc với vết chuẩn gymnemagenin khi soi dưới UV 366nm (màu nâu). Kết hợp các kết quả trên có thể sơ bộ kết luận, gymnemagenin chỉ có trong dịch chiết sau thủy phân của loài Dây thìa canh lá to G. latifolium và loài Dây thìa canh nhập nội; trên các loài còn lại, hoạt chất trên vết trùng hệ số di chuyển với gymnemagenin có thể là chất có khung cấu trúc tương đồng. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trên thế giới từ đó có thể thấy Dây thìa canh nhập nội có nguồn gốc gần với Dây thìa canh ở Ấn độ và khác biệt với các mẫu Dây thìa canh lá nhỏ tại Việt Nam. Vết đặc trưng chi và vết đặc trưng loài: Từ kết quả sắc ký đồ xác định được vết đặc trưng chi và vết đặc trưng loài được liệt kê trong mục 3.2.2. Bên cạnh các vết đặc trưng cho chi và cho loài, các giống Dây thìa canh khác nhau cũng có những điểm phẩn biệt trên sắc ký đồ. Việc cách ly xã hội trong quá trình dịch bệnh làm ảnh hưởng đến quá trình thu mẫu, đề tài mới chỉ thu được sự đa dạng dưới loài của các mẫu Dây thìa canh lá nhỏ (5 mẫu) và Dây thìa canh lá to (5 mẫu), số lượng mẫu thu được của loài G. inodorum và các loài còn lại còn hạn chế (do mẫu Vân Nam và mẫu nhập nội chỉ có duy nhất một giống). Tuy nhiên kết quả sắc ký đồ của các giống trong một loài lại có nhiều nét tương đồng và có sự khác biệt chủ yếu xảy ra trên sắc ký đồ của các loài khác nhau.

Do đó, tuy số lượng mẫu của đề tài còn hạn chế nhưng những kết quả bước đầu về sắc ký đồ vẫn cung cấp một cơ sở dữ liệu có ý nghĩa nhất định khi so sánh về vân tay sắc ký lớp mỏng giữa các loài Dây thìa canh với nhau.

4.3. Về kết quả xây dựng cây phân loại hóa học các mẫu nghiên cứu Qua phân tích hình ành sắc ký đồ kết hợp với mã hóa và phân tích dữ liệu bằng phần mềm NTSYSpc 2.1, đề tài đã xây dựng được cây phân loại dựa trên hệ số tương đồng cho thấy hình ảnh trực quan thể hiện mối quan hệ giữa các loài trong cùng bậc taxon thực vật thường có các thành phần hóa học tương tự nhau do đó có xu hướng có tác dụng sinh học giống nhau.

Kết quả cây phân loại chia các mẫu ra làm 4 nhóm: nhóm 1 là mẫu thuộc loài G. sylvestre, nhóm 2 mẫu thuộc loài G. inodorum, nhóm 3 mẫu thuộc loài G. yunnanense, nhóm 4 các mẫu thuộc loài G. latifolium và mẫu Dây thìa canh nhập nội-GS2. Điều đặc biệt là trong các mẫu thuộc loài G. sylvestre, mẫu Dây thìa canh nhập nội-GS2 có sắc 38

ký đồ khác hẳn so với các mẫu còn lại và tương tự với các mẫu Dây thìa canh lá to. Khi so sánh với nghiên cứu năm 2018 của Phạm Hà Thanh Tùng và cộng sự [37], kết quả của đề tài có sự tương đồng nhất định khi chỉ ra sự khác biệt của hai giống này. Theo đó, giống Dây thìa canh nhập nội có nguồn gốc từ Ấn Độ có nhiều điểm khác biệt về cả hình thái thực vật và thành phần hóa học với giống Dây thìa canh lá nhỏ sinh trưởng ở Việt Nam, thành phần hóa học của nó tương tự với thành phần hóa học của loài Dây thìa canh lá to với hàm lượng lớn các chất có khung aglycon là gymnemagenin [37].

Mặt khác, cũng tại nghiên cứu này, tác giả đã xây dựng cây phân loại về da dạng di truyền đoạn trình tự ITS của một số mẫu thuộc chi Gymnema R.Br. Kết quả cho thấy giống Dây thìa canh nhập nội và Dây thìa canh lá nhỏ nằm ở hai nhóm khác nhau. Giả thiết cho sự khác nhau này có thể là do hai giống sinh trưởng khác biệt về mặt địa lý, thổ nhưỡng và khí hậu trong thời gian dài nên đã tích lũy và tiến hóa theo những hướng khác nhau [37].

Như vậy kết quả sự khác biệt về hóa học trên sắc ký đồ mà nhóm nghiên cứu quan sát được khẳng định lại chứ không hề mẫu thuẫn các nghiên cứu trước đó. Tuy nhiên, với hệ số tương đồng giữa các loài khoảng 46% (hình 3.5), có cơ sở hoạt chất có tác dụng sinh học của loài này cũng có ở loài kia. Điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu đã chứng minh G. latifolium, G. yunnanense, G. inodorum cũng có tác dụng hạ đường huyết giống như G. sylvestre.

4.4. Về kết quả ứng dụng vân tay sắc ký phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh thu được trên thị trường Áp dụng các kết quả vân tay xây dựng được từ các mẫu nghiên cứu đã sơ bộ nhận biết được một số mẫu dược liệu thị trường là dược liệu các loài thuộc chi Gymnema, cụ thể chứa các loài G. sylvestre (mẫu GX2, GX3), G. inodorum (GX4) và mẫu GX1 chứa dược liệu thuộc 2 loài G. sylvestre, G. latifolium. Như vậy, dựa trên các tiêu chí tương đồng về Rf, màu sắc vết và chồng phổ sắc ký đồ ban đầu có thể sơ bộ nhận biết nhanh sự có mặt hay không có mặt của Dây thìa canh cũng như dự đoán được loài nào có trong các mẫu sản phẩm từ Dây thìa canh thu được trên thị trường. Tuy nhiên, để có những kết luận chính xác hơn, nên tiến hành xây dựng dữ liệu dấu vân tay hóa học trên số lượng lớn các mẫu thuộc các loài khác nhau, tập hợp kết quả và lưu trữ thành ngân hàng dữ liệu, từ đó, hoàn toàn có thể sử dụng lượng dữ liệu này để nhận dạng một mẫu bằng phương pháp so sánh sắc ký đồ khai triển bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao.

39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN 1. Đã khảo sát được 02 thông số quy trình phân tích sắc ký HPTLC để cho kết quả tối ưu là hệ dung môi pha động và thể tích phun mẫu trên bản mỏng, kết quả hệ ethy acetat: methanol: nước tỷ lệ 100:17:13, phun mẫu ở thể tích 1,5µl tối ưu với dịch chiết toàn phần; hệ pha động toluen: ethyl acetat: acid formic tỷ lệ 5:4:1, phun mẫu ở thể tích 10µl tối ưu với dịch chiết sau thủy phân.

2. Đã xây dựng được vân tay sắc ký một số loài chi Gymnema R.Br từ các mẫu thu được, vân tay gồm sự xuất hiện, màu sắc, Rf của tất cả các vết có trên sắc ký đồ. Kết quả cho thấy dịch chiết sau thủy phân có vân tay rõ ràng hơn dịch chiết toàn phần, sự khác nhau giữa các loài rõ ràng hơn giữa các giống cùng loài, trừ hai mẫu Dây thìa canh lá nhỏ và Dây thìa canh nhập nội cho kết quả khác nhau nhiều tuy trong cùng loài G. sylvestre.

3. Đã xây dựng được cây phân loại hóa học dựa trên kết quả mã hóa sắc ký đồ các mẫu cho kết quả các mẫu tương đồng nhau trên 46% chia làm 4 nhóm. Kết quả phù hợp với kết quả vân tay sắc ký cũng như các các nghiên cứu đã được công bố.

4. Đã ứng dụng vân tay sắc ký xây dựng được sơ bộ nhận biết được 04 mẫu dược liệu Dây thìa canh trên thị trường có chứa thành phần thuộc chi Gymnema R.Br. ĐỀ XUẤT Tiếp tục thu thập thêm các mẫu thuộc các loài khác nhau trong chi Gymnema R.Br. để có thể tập hợp và lưu trữ kết quả thành ngân hàng dữ liệu dấu vân tay hóa học, từ đó tiến tới sử dụng bộ dữ liệu vân tay hóa học trong nhận dạng các mẫu phức tạp hơn như các mẫu bán thành phẩm (dược liệu nhiều thành phần, cao dược liệu, bài thuốc đông y,…)

40

TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2006), Hóa phân tích, Tập II, Trường đại học Dược Hà Nội, tr. 125-146, 173-210.

2. Trần Thế Bách (2007), Nghiên cứu phân loại Họ Thiên Lý ở Việt Nam, Luận án Tiến sỹ Sinh học, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật.

3. Lê Đình Bích (2007 ), Thực vật Dược, Nhà Xuất bản Y học, trang 302-306 4. Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng (Tập 2), NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.

5. Phạm Văn Hải (2010), Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Dây thìa canh lá to ở Hòa Bình, Khóa luận tốt nghiệp, Thư viện trường Đại học Dược Hà Nội.

6. Nguyễn Thị Thu Hiền (2014), Nghiên cứu đặc điểm hình thái, di truyền và bán định lượng Gymnemagenin của loài dây thìa canh lá to (Gymnema Latifolium Wall. Ex Wight) ở Việt Nam, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội.

7. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam (Tập 2), NXB Trẻ, trang 671-703 8. Hội đồng Dược điển Việt Nam (2017), Dược điển Việt Nam V, tập 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. PL88, PL290.

9. Đoàn Thị Thanh Hương (2016), Nghiên cứu tinh chế saponin từ dây thìa canh lá to bằng nhựa macroporous D101, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ, Thư viện trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.

10. Đoàn Thị Ái Nghĩa (2014), Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng hạ đường huyết của Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight), Luận văn Thạc sỹ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội.

11. Trần Thị Oanh (2014), Nghiên cứu sản xuất chế phẩm hỗ trợ điều trị tiểu đường từ cây dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. Ex Wight), Báo cáo kết quả khoa học công nghệ, Hà Nội.

12. Trần Văn Ơn (2011), Sàng lọc các dược liệu có tác dụng điều trị đái tháo đường ở Việt Nam và nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính, hạ đường huyết của một số dược liệu điển hình, Đề tài khoa học và phát triển công nghệ cấp Bộ.

13. Thái Nguyễn Hùng Thu (2010), Sắc ký lớp mỏng, Tài liệu dùng sau đại học, Thư viện trường Đại học Dược Hà Nội.

14. Đinh Thị Thu Thủy (2014), Đánh giá tác dụng hạ glucose máu của dịch chiết lá các loài trong chi Gymnema R.Br ở Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Thư viện trường Đại học Dược Hà Nội.

15. Phạm Hà Thanh Tùng (2012), Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi Gymnema R.Br. ở Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội.

16. Đỗ Anh Vũ (2007), Nghiên cứu đặc điểm thực vật và tác dụng hạ đường huyết của cây Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.), Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ, Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH 17. Agatonovic-Kustrin

Snezana,

Morton

David

W

(2019),

Thin-Layer

Chromatography: Fingerprint Analysis of Plant Materials, Encyclopedia of Analytical Science (3rd edition), ScienceDirect, pp. 43-49.

18. Ananthan R., Latha M., Ramkumar K. M., Pari L., Baskar C. and Narmatha Bai V. (2004), "Modulatory effects of Gymnema montanum leaf extracton alloxan-induced oxidative stress in Wistar rats," Nutrition, 20, 280-285.

19. Ankit Saneja, Chetan Sharma, K.R. Aneja, Pahwa Rakesh (2010), "Gymnema Sylvestre (Gurmar): A Review", Der Pharmacia Lettre, 2 (1) pp. 275-284 20. Armen Takhtajan (2009), Flowering Plants (2nd edition), Springer Science & Business Media.

21. Bingtao Li M. G. G. W. D. S. and Tsiang Ying L. P.-t. (1995), Asclepiadaceae R. Brown. In Wu, Z. Y. & P. H. Raven, eds. 1995. Flora of China. Vol. 16 (Gentianaceae through Boraginaceae). Science Press, Beijing, and Missouri Botanical Garden Press, St. Louis. 479 pp.

22. Chakraborty D1 Ghosh S, Bishayee K, Mukherjee a, Sikdar S, Khuda- Bukhsh Ar. (2013), "Antihyperglycemic drug Gymnema sylvestre also shows anticancer potentials in human melanoma A375 cells via reactive oxygen species generation and mitochondria-dependent caspase pathway.", Integr Cancer Ther. , 12(5), pp.

433-441.

23. Doyle J.J. D. J. L. (1990), Isolation of Plant DNA from fresh tissue, Focus, 12, 13 15.

24. Gurav e. a. S. (2007), “Pharmacognosy, phytochemistry, pharmacology and clinical applications of Gymnema sylvestre R Br.”, Pharmacognosy Reviews, 338-343.

25. Hostettmann M. (1995), Saponins - Chemistry and pharmacology of natural products, Cambridge University Press 26. Inoue K., Yamada H., Imoto T. and Akasaka K. (1998), "High pressure NMR study of a small protein, gurmarin," Journal of biomolecular NMR, 12, 535-541.

27. Inthakoun L. and Delang C. O. (2008), Lao Flora - A checklist of plants found in Lao PDR with scientific and vernacular names, Lulu Press.

28. Jijun, C., Shengxiang, Q., Zhuangxin, Z., & Jun, Z. (1989), "THE CHEMICAL CONSTITUENTS

OF

GYMNEMA

YUNNANENSE", Acta

Botanica

Yunnanica, 2.

29. Jingyun Fang Z. W., Zhiyao Tang (2011), Atlas of woody plants in China (Distribution and Climate), Higher education Press, Springer.

30. Joshi Devi Datt (2012), Herbal drugs and fingerprints: Evidence based herbal drugs, Springer Science & Business Media, pp. 19-27.

31. Leslie S. Ettre (2008), Milestones in the evolution of chromatography, ChromSource, Inc, Portland, pp.129-136.

32. Lu F. Y., Kao, M. T., Huang, S. F. & Wang, J. C. (1998), Flora of Taiwan Asclepiadaceae (2nd edition), Editorial Committee of the Flora of Taiwan, Taipei.

33. Murakami N., Murakami T., Kadoya M., Matsuda H., J. and Yoshikawa M. (1996), "New hypoglycemic constituents in "gymnemic acid" from Gymnema sylvestre," Chemical & pharmaceutical bulletin, 44, 469-471.

34. Nakamura Y., Tsumura Y., Tonogai Y. and Shibata T. (1999), "Fecal steroid excretion is increased in rats by oral administration of gymnemic acids contained in Gymnema sylvestre leaves," The Journal of nutrition, 129, 1214-1222.

35. Organization World Health (1993), Research guidelines for evaluating the safety and efficacy of herbal medicines, Manila: WHO Regional Office for the Western Pacific, pp.

36. Palanisamy Rajaguru Kunga Mohan Ramkumar, Muniappan Latha, Rajendran Ananthan, (2007), "Ethanol extract of Gymnema montanum leaves reduces glycoprotein components in experimental diabetes" Nutrition Research 27, 97-103.

37. Pham, H. T. T., Hoang, M. C., Ha, T. K. Q., Dang, L. H., Tran, V. O., Nguyen, T. B. T., ... & Oh, W. K. (2018), "Discrimination of different geographic varieties of Gymnema sylvestre, an anti-sweet plant used for the treatment of type 2 diabetes", Phytochemistry, 150, 12-22.

38. Pham, H. T. T., Ryu, B., Cho, H. M., Lee, B. W., Yang, W. Y., Park, E. J., ... & Oh, W. K. (2020), "Oleanane hemiacetal glycosides from Gymnema latifolium and their inhibitory effects on protein tyrosine phosphatase 1B", Phytochemistry, 170, 112181.

39. Ramkumar K, Manjula C, Elango B, Krishnamurthi K, Saravana Devi S, Rajaguru P. (2013), "In vitro cytotoxicity of Gymnema montanum in human leukaemia HL60 cells; induction of apoptosis by mitochondrial membrane potential collapse", Cell Prolif, 46(3), pp. 263-271.

40. Ramkumar K. M., Vanitha P., Uma C., Suganya N., Bhakkiyalakshmi E. and Sujatha J. (2011), "Antidiabetic activity of alcoholic stem extract of Gymnema montanum in streptozotocin- induced diabetic rats," Food and chemical toxicology : an international journal published for the British Industrial Biological Research Association, 49, 3390-3394.

41. Salvador CaĂąigueral and et al (2019), High performance thin-layer chromatography (HPTLC) in the quality control of herbal products, Research Signpost Trivandrum Kerala, India.

42. Saneja A. (2010), "Gymnema sylvestre (Gurma): A review," Der Pharmacia Lettre, 2, 275-284.

43. Sathya S, Kokilavani R, Gurusamy K. (2008), "Hypoglycemic effect of Gymnema sylvestre (retz.,) R.Br leaf in normal and alloxan induced diabetic rats.", Anc Sci Life., 28(2), pp. 12-14.

44. Shaik Sayeed, Chand Pasha, Md. Sadath Ali, Md. Ziaullah Khan, (2009), "Antisalmonella Activity of Selected Medicinal Plants", Turk J Biol 33, 59- 64.38.

45. Shigemura N., Nakao K., Yasuo T., Murata Y., Yasumatsu K., Nakashima A., et al.

(2008), "Gurmarin sensitivity of sweet taste responses is associated with coexpression patterns of T1r2, T1r3, and gustducin," Biochemical and biophysical research communications, 367, 356-363.

46. Shimizu K., Ozeki M., Iino A., Nakajyo S., Urakawa N. and Atsuchi M. (2001), "Structure-activity relationships of triterpenoid derivatives extracted from Gymnema inodorum leaves on glucose absorption," Japanese journal of pharmacology, 86, 223-229.

47. Shimizu K., Ozeki M., Tanaka K., Itoh K., Nakajyo S., Urakawa N., et al. (1997), "Suppression of glucose absorption by extracts from the leaves of Gymnema

inodorum," The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science, 59, 753-757.

48. Sinsheimer J. E. and McIlhenny H. M. (1967), "Constituents from Gymnema sylvestre leaves. II. Nitrogenous compounds," Journal of pharmaceutical sciences, 56, 732-736.

49. Sinsheimer J. E. and Rao G. S. (1970), "Constituents from Gymnema sylvestre leaves. VI. Acylated genins of the gymnemic acids--isolated and preliminary characterization," Journal of pharmaceutical sciences, 59, 629-632.

50. Sinsheimer J. E., Rao G. S. and McIlhenny H. M. (1970), "Constuents from Gymnema sylvestre leaves. V. Isolation and preliminary characterization of the gymnemic acids," Journal of pharmaceutical sciences, 59, 622-628.

51. Snigur G, Samokhina Mp, Pisarev Vb, Spasov Aa, Bulanov Ae. (2008), "Structural alterations in pancreatic islets in streptozotocin-induced diabetic rats treated with of bioactive additive on the basis of Gymnema sylvestre", Morfologiia. , 133(1), pp.

60-64.

52. Suttisri R., Lee I. S. and Kinghorn A. D. (1995), "Plant-derived triterpenoid sweetness inhibitors," Journal of ethnopharmacology, 47, 9-26.

53. Suzuki K., Ishihara S., Uchida M. and Komoda Y. (1993), "Quantitative analysis of deacylgymnemic acid by high-performance liquid chromatography" Yakugaku zasshi : Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 113, 316-320.

54. Tian J, Ma Qg, Yang Jb, Wang Ag, Ji Tf, Wang Yg, Su Y (2013), "Hepatoprotective phenolic glycosides from Gymnema tingens.", Planta Med., 79(9), pp. 761-767.

55. Tiwari P, Mishra Bn, Sangwan Ns. (2014), "Phytochemical and pharmacological properties of Gymnema sylvestre: an important medicinal plant.", Biomed Res Int. 56. Ulbricht C., Abrams T. R., Basch E., Davies-Heerema T., Foppa I., Hammerness P., et al. (2011), "An evidence-based systematic review of gymnema (Gymnema sylvestre R. Br.) by the Natural Standard Research Collaboration," Journal of dietary supplements, 8, 311-330.

57. Ulrich Meve Jonathan Alejandro Grecebio (2013), "Taxonomy of the Asian Gymnema latifolium (Apocynaceae, Asclepiadoideae, Marsdenieae), including lectotypification of the synonymous G. khandalense", Willdenowia, 43, pp. 81-86.

58. Xie J. T., Wang A., Mehendale S., Wu J., Aung H. H., Dey L., et al. (2003), "Antidiabetic effects of Gymnema yunnanense extract," Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society, 47, 323-329.

59. Yasukawa K, Okuda S, Nobushi Y. (2014), "Inhibitory Effects of Gymnema (Gymnema sylvestre) Leaves on Tumour Promotion in Two-Stage Mouse Skin Carcinogenesis.", Evid Based Complement Alternat Med. 60. Ye W. C., Zhang Q. W., Liu X., Che C. T. and Zhao S. X. (2000), "Oleanane saponins from Gymnema sylvestre," Phytochemistry, 53, 893-899.

61. Yeh G. Y., Eisenberg D. M., Kaptchuk T. J. and Phillips R. S. (2003), "Systematic review of herbs and dietary supplements for glycemic control in diabetes," Diabetes care, 26, 1277-1294.

62. Zhang, Z., Chen, J., & Zhou, J. (1991), “Gymnemaroside A and B from Gymnema yunnanense”, Acta Botanica Yunnanica, 13, 76-80.

63. Zhu X. M., Xie P., Di Y. T., Peng S. L., Ding L. S. and Wang M. K. (2008), "Two new triterpenoid saponins from Gymnema sylvestre," Journal of integrative plant biology, 50, 589-592.

TÀI LIỆU TRÊN INTERNET 64. The-Plant-List.

(2010).

Version

1.

Published

http://www.theplantlist.org/ (truy cập ngày 31/5/2020)

on

the

Internet;

PHỤ LỤC DANH SÁCH PHỤ LỤC Phụ lục 1

Phụ lục 2

Phiếu giám định tên khoa học và giấy chứng nhận mã số tiêu bản Danh sách 52 loài thuộc chi Gymnema R.Br. đã được chấp nhận theo “The Plant List”

Phụ lục 3

Hình ảnh sắc ký đồ khảo sát một số quy trình sắc ký

Phụ lục 4

Số liệu sắc ký đồ của nghiên cứu xây dựng vân tay sắc ký

Phụ lục 5

Phụ lục 6

Hình ảnh và số liệu sắc ký đồ nghiên cứu phân tích một số mẫu Dây thìa canh trên thị trường Chi tiết nhóm thế các khung saponin phân lập được từ các loài trong chi Gymnema R.Br.

PHỤ LỤC 1. PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC VÀ GIẤY CHỨNG NHẬN MÃ SỐ TIÊU BẢN

PHỤ LỤC 2. DANH SÁCH 52 LOÀI THUỘC CHI Gymnema R.Br. ĐÃ ĐƯỢC CHẤP NHẬN THEO “THE PLANT LIST”

Tên chính thức

STT

Tên chính thức

STT

1

Gymnema acuminatum Wall.

27

Gymnema longiretinaculatum

2

Gymnema albidum Decne.

3

Gymnema albiflorum Costantin

4

Gymnema brevifolium Benth.

5

Gymnema calycinum Schltr.

29

Gymnema macrothyrsa Warb.

6

Gymnema chalmersii Schltr.

30

Gymnema maingayi Hook.f.

7

Gymnema cumingii Schltr.

31

Gymnema mariae Schltr.

8

Gymnema cuspidatum (Thunb.)

32

Gymnema micradenium Benth.

Kuntze

33

Gymnema molle Wall. ex Wight.

9

Gymnema decaisneanum Wight

34

Gymnema montanum Hook.f.

10

Gymnema dissitiflorum Ridl.

35

Gymnema montanum var.

11

Gymnema dunnii (Maiden &

Tsiang.

28

Gymnema lushaiense M.A.Rahman & Wilcock.

beddomei Hook.f.

Betche) P.I.Forst.

36

Gymnema muelleri Benth.

12

Gymnema elegans Wight & Arn.

37

Gymnema pachyglossum Schltr.

13

Gymnema erianthum Decne.

38

Gymnema piperii Schltr.

14

Gymnema foetidum Tsiang.

39

Gymnema pleiadenium F.Muell.

15

Gymnema glabrum Wight.

40

Gymnema recurvifolium Blume.

16

Gymnema griffithii Craib.

41

Gymnema rotundatum Thwaites.

17

Gymnema hainanense Tsiang.

42

Gymnema rufescens Decne.

18

Gymnema hirtum Ridl.

43

Gymnema schlechterianum Warb.

19

Gymnema inodorum (Lour.)

44

Gymnema spirei Costantin.

Decne.

45

Gymnema suborbiculare K.Schum.

20

Gymnema javanicum Koord.

46

Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex

21

Gymnema khandalense Santapau.

22

Gymnema kollimalayanum

Sm. 47

A.Ramach. & M.B.Viswan.

Gymnema syringaefolium (Decne.)

Costantin.

23

Gymnema lacei Craib.

48

Gymnema thorelii Costantin.

24

Gymnema lactiferum (L.) R.Br. ex

49

Gymnema tricholepis Schltr.

Schult.

50

Gymnema trinerve R.Br.

Gymnema latifolium Wall. ex

51

Gymnema uncarioides Schltr.

Wight.

52

Gymnema yunnanense Tsiang

25

26

Gymnema littorale Blume.

PHỤ LỤC 3. HÌNH ẢNH SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT MỘT SỐ THÔNG SỐ QUY TRÌNH SẮC KÝ

Hình PL3.1. Sắc ký đồ khảo sát thể tích phun với hệ dung môi 4 mục 2.3.2 trên dịch chiết toàn phần mẫu GS1a

Hình PL3.2. Sắc ký đồ khảo sát thể tích phun với hệ dung môi 7 mục 2.3.2 trên dịch chiết sau thủy phân mẫu GS1a

PHỤ LỤC 4. SỐ LIỆU SẮC KÝ ĐỒ CỦA NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÂN TAY SẮC KÝ

Bảng PL4.1. Bảng mã hóa theo Rf và màu sắc vết sắc ký trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân của các mẫu sử dụng để xây dựng cây phân loại GS1a 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1

GS2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1

GL1a 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

GL2a 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1

GL3a 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1

GL4a 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1

GL5a 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1

GY 1 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 1

GI 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1

GS3 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1

GS4 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0

GS5 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1

Bảng PL4.2. Số liệu sắc ký đồ các mẫu nghiên cứu xây dựng vân tay sắc ký dịch chiết toàn phần quan sát ở ánh sáng trắng Track 1 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Track 2 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Track 3 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

GS1a Rf : start 0.0142 0.0895 0.179 0.2798 0.3026 0.3565 0.4744 0.5298 0.5838 0.6236 0.7472 0.7898 0.8864 GS2 Rf : start 0.017 0.0966 0.1477 0.196 0.2784 0.3153 0.3594 0.4403 0.4815 0.5199 0.5724 0.6349 0.7386 0.8097 0.8778 GL1a Rf : start 0.0085 0.0881 0.1506 0.1989 0.2784 0.3196 0.3537 0.4205 0.4858 0.5199 0.5795 0.6207 0.7429 0.7841 0.8281

Height : start 483.665 418.8809 688.3906 17.71191 0 716.8105 94.05859 796.4609 1044.014 1095.088 1031.523 1894.96 5025.951

Rf : max 0.0241 0.1136 0.2216 0.2884 0.3295 0.3892 0.4929 0.5483 0.6065 0.6534 0.7798 0.8594 0.9034

Height : max 903.499 1120.146 4126.681 185.5703 951.2393 4271.1 492.7485 1461.15 1597.248 1920.561 1872.358 5884.507 5412.46

Rf : end 0.0384 0.1349 0.2699 0.3011 0.3466 0.429 0.5114 0.5724 0.6179 0.6733 0.7812 0.8807 0.9631

Height : end 276.832 322.125 318.877 9.689453 614.3901 753.4526 369.438 1003.564 1201.031 1347.765 1851.54 5032.56 296.4048

Height : start 0 593.2578 1791.226 1846.473 628.0322 196.0645 259.7314 125.5552 251.7778 215.4448 526.2217 884.7769 567.772 2327.581 4475.238

Rf : max 0.0355 0.1307 0.1705 0.2287 0.294 0.331 0.3864 0.4545 0.4972 0.5469 0.6065 0.6378 0.7713 0.8622 0.9034

Height : max 2375.667 3120.57 3664.656 4301.591 1224.828 759.5264 4750.409 272.333 495.3325 1049.223 2503.556 921.6665 1533.524 4828.067 5687.609

Rf : end 0.0597 0.1477 0.1932 0.2741 0.3125 0.3423 0.4148 0.4631 0.5114 0.5625 0.6293 0.6619 0.7869 0.8693 0.9588

Height : end 43.33398 1791.226 1734.753 606.7852 242.6777 538.0752 17.94678 114.3335 296.1113 504.1113 899.3329 89.88867 1423.029 4550.115 735.5811

Height : start 444.9843 335.8555 1715.901 1823.968 95.72461 666.8008 959.5533 365.5273 229.2686 229.3413 461.2178 715.4575 758.6753 1662.396 3203.5

Rf : max 0.0241 0.1307 0.1761 0.2216 0.2983 0.3352 0.3864 0.4318 0.5 0.5398 0.6023 0.6335 0.7741 0.8196 0.8864

Height : max 1283.675 2682.796 2636.467 3397.469 1026.163 1137.979 4163.108 456.4438 306.2715 1050.078 1230.489 746.3608 1653.555 3162.018 5356.519

Rf : end 0.0497 0.1477 0.1932 0.2699 0.3111 0.348 0.4162 0.456 0.5057 0.5625 0.6179 0.6506 0.7798 0.8224 0.9531

Height : end 235.292 1717.506 1641.509 259.5361 388.2783 1041.428 308.9331 151.4775 210.6714 358.0146 688.9243 210.8965 1609.321 3112.067 524.0195

Area

Area [%]

10616.9 28705.1 175337.9 1709.838 20565.03 126709.1 9542.791 37158.53 33354.88 56316.95 37211.59 281077.3 176192.3

1.067564 2.88639 17.63079 0.17193 2.06788 12.741 0.959558 3.73641 3.353941 5.662851 3.741745 28.26323 17.7167

Area

Area [%]

37122.68 72286.53 89505.32 165439.6 19733.52 11285.67 84278.4 2825.942 8127.161 21356.67 62634.78 10591.33 39892.27 155583.3 224585.6

3.692885 7.19091 8.903798 16.45758 1.963048 1.122674 8.383835 0.281119 0.808473 2.124516 6.230774 1.053603 3.968397 15.47709 22.3413

Area

Area [%]

24788.66 68612.56 66131.66 118770.8 14729.03 19675.61 100218.7 7901.222 3284.916 20029.5 24404.92 12117.73 34354.62 67114.24 318163.1

2.753386 7.621101 7.345536 13.1924 1.636019 2.185458 11.13174 0.877624 0.36487 2.224765 2.710763 1.34597 3.81592 7.454677 35.33978

Track 4 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Track 5 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Track 6 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

GL2a Rf : start 0.0099 0.071 0.1207 0.1477 0.1932 0.2756 0.3224 0.358 0.4233 0.4844 0.5156 0.5724 0.6264 0.7372 0.7898 0.8764 GL3a Rf : start 0.0085 0.0597 0.0724 0.098 0.1534 0.1918 0.2798 0.3139 0.3622 0.4219 0.4801 0.5142 0.5696 0.6193 0.7372 0.7784 0.8324 GL4a Rf : start 0.0128 0.0639 0.0852 0.1548 0.1946 0.2827 0.3196 0.3622 0.419 0.4787 0.5114 0.5639 0.6207

Height : start 0 126.999 1393.625 800.249 666.916 0 467.4951 748.4551 300.6064 139.9727 322.9424 361.8564 1075.926 589.9087 2080.056 5742.349

Rf : max 0.0284 0.0994 0.1293 0.1705 0.2287 0.3011 0.3381 0.3892 0.4375 0.4929 0.5426 0.6023 0.6307 0.7756 0.8665 0.8935

Height : max 2460.09 3000.5 1602.209 2710.251 3652.125 1239.451 1096.104 4396.005 385.8574 318.8438 1084.478 1263.237 1224.694 2009.161 5764.223 5936.092

Rf : end 0.0554 0.1207 0.1477 0.1932 0.2741 0.3139 0.3537 0.4162 0.4545 0.5043 0.5597 0.6193 0.6562 0.7798 0.8679 0.9602

Height : end 20.12109 1393.625 800.249 666.916 33.79199 397.0107 779.7119 313.8145 164.1582 167.5601 442.2178 935.6441 56.97265 2003.595 5759.48 499.1318

Height : start 0 49.93945 0 21.30566 1483.08 1454.539 0 264.0605 1222.479 303.5854 136.9292 183.2979 450.7715 915.0176 689.2607 1983.365 3736.983

Rf : max 0.027 0.0653 0.0852 0.1392 0.169 0.2301 0.3011 0.3551 0.3892 0.4375 0.4929 0.5398 0.5994 0.6335 0.7727 0.8182 0.8864

Height : max 1946.833 108.4853 283.8193 1816.65 2171.119 2927.331 732.8711 1145.301 4761.027 566.7788 270.1924 1231.491 1890.053 1013.754 1886.58 3855.522 5656.268

Rf : end 0.0526 0.0696 0.0937 0.1491 0.1875 0.2784 0.3111 0.3551 0.4162 0.456 0.5057 0.5611 0.6151 0.6577 0.7727 0.8239 0.9545

Height : end 76.16699 49.05957 28.80957 1432.584 1275.043 25.05664 294.3887 1145.301 303.5752 187.312 116.7886 404.9297 983.5962 29.61328 1886.58 3773.64 578.3472

Height : start 337.1768 45.2373 270.2539 1509.028 1656.375 0 821.8979 1146.034 383.7744 130.8604 214.9473 401.8423 844.0528

Rf : max 0.0312 0.0682 0.1278 0.1733 0.2259 0.3068 0.3423 0.392 0.4233 0.4915 0.5369 0.5966 0.6321

Height : max 2548.274 104.7627 3061.578 2544.213 4053.123 1167.356 1842.527 4722.965 613.6221 332.8076 1227.842 1845.263 1003.229

Rf : end 0.0554 0.071 0.1506 0.1889 0.2699 0.3153 0.3565 0.4176 0.4545 0.5043 0.5568 0.6165 0.6491

Height : end 38.60742 0 1495.063 1675.086 298.1035 918.7173 1211.795 357.7148 278.9453 166.4209 449.6489 749.4038 265.1577

Area

Area [%]

38787.61 64229.25 24585.48 58061.33 119813.9 19160.98 20254.11 95631.49 6297.246 3447.059 23525.98 29282.45 16319.1 42797.56 217972.6 232957

3.828519 6.339728 2.426702 5.730926 11.82619 1.891279 1.999176 9.439277 0.621568 0.340241 2.322124 2.890315 1.610772 4.22432 21.51491 22.99394

Area

Area [%]

34765.25 566.8325 2395.741 36974.68 42419.81 110340.7 9421.943 25116.73 100850.7 9856.604 3543.13 25583.75 40737.73 17379.7 33684.02 94055.07 343849.5

3.732012 0.060849 0.25718 3.969192 4.553721 11.84495 1.011435 2.696254 10.82621 1.058096 0.380351 2.746388 4.373151 1.865692 3.615942 10.09671 36.91187

Area

Area [%]

46721.27 367.4282 85290.93 50281.55 144104.3 15786.24 38460.49 102262.8 11455.99 4460.36 24955.21 41698.05 15505.28

4.118168 0.032386 7.517826 4.431983 12.70183 1.391452 3.390036 9.013781 1.009769 0.393151 2.199635 3.675405 1.366687

14 15 16 Track 7 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Track 8 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Track 9 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8

0.7358 0.7884 0.8295 GL5a Rf : start 0.0114 0.0724 0.1207 0.1634 0.1847 0.206 0.2784 0.3125 0.3523 0.5057 0.5682 0.6264 0.723 0.7784 0.8338 0.8722 Gya Rf : start 0.0071 0.0426 0.0682 0.0937 0.1264 0.1705 0.2756 0.3011 0.3452 0.4091 0.4716 0.5057 0.5682 0.6165 0.6634 0.723 0.7812 0.8153 0.8892 GIa Rf : start 0.0085 0.0483 0.0625 0.1065 0.1861 0.2557 0.3097 0.3494

569.7822 2080.567 3774.688

0.7699 0.8239 0.8963

2069.778 3720.855 6500.721

0.7812 0.8253 0.9687

2010.777 3693.479 336.9189

Height : start 208.9805 0 1966.229 2026.98 1921.354 2228.396 26.01563 743.5308 1072.076 199.5361 430.9233 890.2232 403.6714 1997.742 4175.479 5437.348

Rf : max 0.027 0.1136 0.1477 0.1705 0.196 0.2216 0.2983 0.3352 0.3864 0.5341 0.5952 0.6278 0.7713 0.831 0.8651 0.8977

Height : max 1817.039 1920.548 2766.748 2162.66 2237.644 3129.295 1056.455 1279.318 5302.925 1287.895 1686.03 969.8076 2108.853 4146.056 5485.125 6349.149

Rf : end 0.0554 0.1165 0.1591 0.179 0.2017 0.267 0.3097 0.348 0.4119 0.5554 0.6207 0.6619 0.7756 0.831 0.8693 0.9687

Height : end 29.17676 1841.287 1988.038 1947.21 2161.788 52.11719 646.1816 1140.386 528.061 387.9956 848.8843 60.08984 2001.319 4146.056 5389.926 395.709

Height : start 0 245.7881 36.99805 106.9775 896.7842 400.5811 137.6826 60.1084 144.6016 297.168 140.1465 399.4414 445.6489 1054.233 574.0547 791.7373 2511.992 4034.953 5384.925

Rf : max 0.0199 0.0526 0.0767 0.1108 0.1335 0.2202 0.2841 0.3196 0.3778 0.419 0.4872 0.5369 0.5966 0.6165 0.6989 0.7756 0.8139 0.8594 0.9034

Height : max 1432.577 1150.089 590.9912 1687.296 934.6113 4699.708 567.0469 709.5088 3167.722 629.8701 405.8652 1045.545 1718.228 1054.233 1173.778 2545.943 4051.525 6471.583 5897.548

Rf : end 0.0426 0.0639 0.0895 0.125 0.1534 0.2699 0.3011 0.3381 0.4034 0.4318 0.4986 0.5625 0.6136 0.6548 0.7187 0.777 0.8153 0.8864 0.9773

Height : end 245.7881 140.5283 186.8135 886.2851 50.92871 9.834961 60.1084 223.5762 315.1475 200.917 403.2969 524.5991 1030.042 503.4809 776.1177 2475.038 4034.953 5376.734 144.1865

Height : start 0 61.27051 602.625 1314.323 154.542 0 1075.488 824.7422

Rf : max 0.0227 0.0568 0.0795 0.1136 0.2045 0.2898 0.3239 0.3778

Height : max 973.2822 1185.084 5140.917 1689.5 1804.786 2575.361 1963.722 5024.209

Rf : end 0.0426 0.0625 0.1023 0.1349 0.2514 0.3068 0.3437 0.4148

Height : end 359.0771 602.625 1259.75 1.364258 31.14893 969.0416 829.8481 87.01611

50374.11 78308.59 424483.2

4.440141 6.90238 37.41536

Area

Area [%]

32925.11 27495.96 64133.61 22834.04 25908.86 91234.7 15457.5 27996.63 122329.7 25950.47 40411.1 10918.65 50525.66 117256.6 124841.6 270551.7

3.074894 2.567863 5.989475 2.132484 2.419643 8.520461 1.443585 2.614622 11.42444 2.42353 3.774016 1.019699 4.71862 10.95066 11.65903 25.26698

Area

Area [%]

18262.68 10804.71 6067.248 24540.71 11371.93 198349.4 6348.953 12122.9 57453.86 7077.178 6288.046 30317.83 39004.73 20296.14 34135.03 68360.58 78030.66 271357.7 197171.4

1.664236 0.984608 0.552894 2.236338 1.036298 18.07512 0.578565 1.104732 5.235636 0.644927 0.573015 2.762793 3.55441 1.84954 3.110645 6.22954 7.110751 24.72819 17.96777

Area

Area [%]

16702.92 7901.646 87648.27 20895.05 44636.9 48737.59 36547.87 107135.6

1.785106 0.84448 9.367313 2.233135 4.77052 5.208777 3.906014 11.45

9 10 11 12 13 14 15 Track 10 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Track 11 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Track 12 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

0.4645 0.5071 0.5696 0.6278 0.7315 0.7912 0.8864

0 372.9604 871.546 1536.903 581.2603 2046.472 4090.371

0.4858 0.5369 0.5994 0.6278 0.7869 0.8636 0.9077

514.8135 1139.898 2400.485 1536.903 1957.575 5046.37 4852.517

0.5014 0.5611 0.6207 0.6591 0.7869 0.8793 0.9574

351.5425 888.4209 1664.965 325.0288 1957.575 4247.433 517.4155

Height : start 0 0 0 204.3672 42.40625 681.7251 193.4326 323.5679 332.624 357.8447 362.3535 1305.234 3302.481

Rf : max 0.0114 0.054 0.1094 0.2159 0.3295 0.3835 0.483 0.5369 0.6023 0.6591 0.7713 0.8608 0.9006

Height : max 2046.238 650.333 882.4776 4950.761 955.855 3750.551 838.458 1111.34 679.8975 818.9496 1377.299 3762.296 4165.999

Rf : end 0.0355 0.0739 0.1392 0.2741 0.3423 0.4233 0.5014 0.5639 0.6335 0.6889 0.7841 0.8764 0.9489

Height : end 222.4521 95.33301 243.9297 81.08838 679.4063 162.7817 310.2246 423.6133 344.7588 331.3926 1303.395 3280.56 806.875

Height : start 140.8789 254.4814 0 171.9258 354.7744 914.1036 966.4824 1261.193 1097.113 1189.152 3842.318

Rf : max 0.0298 0.054 0.125 0.2301 0.4048 0.4915 0.5384 0.5895 0.6676 0.8551 0.8864

Height : max 497.7266 851.9258 1204.419 4279.125 2580.492 1231.117 1962.061 1377.03 1841.271 4289.715 3914.678

Rf : end 0.0369 0.0852 0.1548 0.277 0.446 0.5099 0.5739 0.6165 0.7259 0.8793 0.9744

Height : end 117.3027 221.8887 204.8477 13.24512 903.625 969.0039 1347.05 1068.968 1024.505 3859.08 305.7534

Height : start 0 437.3057 0.248047 988.791 123.877 0 134.5693 668.8525 315.9878 374.1621 355.4819 506.955 414.8423

Rf : max 0.027 0.0511 0.1151 0.1392 0.2273 0.304 0.3381 0.392 0.4901 0.5398 0.6619 0.7017 0.7713

Height : max 2034.291 464.6992 1227.901 1339.617 4556.779 937.7393 976.0372 3139.788 928.7271 1001.188 749.8677 732.1025 1788.351

Rf : end 0.0412 0.0597 0.125 0.1534 0.2741 0.3168 0.3523 0.429 0.5114 0.5724 0.6733 0.7216 0.7812

Height : end 482.082 150.707 1138.001 94.23633 5.816406 265.9355 683.5508 292.0547 374.1621 405.8354 634.0771 453.2222 1711.242

8383.396 32530.73 64559.19 15216.24 56146.63 230739.8 157900.2

0.895966 3.476686 6.899693 1.626219 6.00061 24.66006 16.87541

Area

Area [%]

29124.99 7545.327 18974 229056.9 15118.5 106826.8 17480.02 24852.12 19438.7 20336.34 31823.8 160329.6 137232

3.559906 0.922255 2.319165 27.9973 1.847913 13.05729 2.136558 3.037639 2.375965 2.485682 3.889778 19.59686 16.77368

Area

Area [%]

4954.545 13997.18 29390.23 142192.5 119566.4 42045.37 63177.74 32000.11 102099.4 262483.7 134353.4

0.523592 1.479209 3.105934 15.02678 12.63568 4.443318 6.676569 3.381743 10.78978 27.73905 14.19835

Area

Area [%]

26530.26 4246.4 17322.86 16030.07 177835.2 13978.33 16042.06 89150.9 20979.4 28328.94 27088.42 15433.62 45148.34

2.976827 0.476467 1.943711 1.798653 19.954 1.568438 1.799998 10.00317 2.353993 3.178648 3.039455 1.731729 5.065867

GS3 Rf : start 0 0.0398 0.0852 0.1534 0.3097 0.348 0.4545 0.5128 0.5753 0.6349 0.7386 0.7926 0.8807 GS4 Rf : start 0.0128 0.0455 0.0937 0.1875 0.321 0.4517 0.5156 0.5795 0.6222 0.7415 0.8821 GS5 Rf : start 0.0085 0.044 0.0923 0.1278 0.1605 0.2798 0.3196 0.3551 0.4659 0.5114 0.6051 0.6847 0.7259

14 15 16

0.7841 0.8338 0.8764

1705.546 3357.341 4116.546

0.831 0.8551 0.9034

3268.371 4429.11 4849.587

0.831 0.8722 0.9687

3268.371 4130.926 234.8804

87792.31 110622.3 194696.7

9.850734 12.41237 21.84594

Bảng PL4.3. Số liệu sắc ký đồ các mẫu nghiên cứu xây dựng vân tay sắc ký dịch chiết sau thủy phân quan sát ở ánh sáng trắng Track 1 Peak 1 Track 2 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Track 3 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Track 4 Peak 1 2 3 4

GS1a Rf : start 0.1838 Rf : start 0 0.0235 0.0853 0.1074 0.1324 0.1559 0.1897 0.2632 0.2926 0.3985 0.45 0.5044 0.5441 0.6279 0.6824 0.775 0.8162 0.8574 GS2 Rf : start 0.0206 0.0559 0.0897 0.1574 0.225 0.2618 0.3559 0.4441 0.4985 0.5515 0.725 0.8368 GL1a Rf : start 0 0.0191 0.0353 0.0809

Height : start 707.3701

Rf : max 0.2324

Height : max 5109.148

Rf : end 0.2676

Height : end 451.5557

Height : start 927.2598 866.2959 661.0752 950.8154 727.333 800.3711 905.2227 1208.148 1710.298 905.9268 1025.667 3345.446 1215.927 1205.148 1242.444 1236.705 1635.778 1218.927

Rf : max 0.0103 0.0441 0.0971 0.1147 0.1412 0.1721 0.2294 0.2794 0.3176 0.4191 0.4912 0.5118 0.5676 0.6412 0.7176 0.7912 0.8324 0.8868

Height : max 2008.223 4772.148 1419.852 1181.075 1019.777 1018.593 2116.408 1784.223 4088.593 1861.963 3912.778 3683.297 2983.26 1457.481 3442.481 1633.52 2106.408 2618.148

Rf : end 0.0235 0.0809 0.1044 0.1279 0.1529 0.1838 0.2588 0.2897 0.3441 0.4441 0.5044 0.5426 0.625 0.6735 0.7706 0.8147 0.8544 0.9426

Height : end 866.2959 716.2969 1007.89 874.334 868.8535 869.2227 1280.482 1691.038 1038.26 1031.371 3345.446 1220.89 1225.37 1315.703 1160.741 1542.52 1203.815 162.4453

Height : start 28.14746 4974.888 5441.813 5894.889 9718.592 4874.222 3585.629 3096.555 3169.185 3040.999 2176.332 2024.555

Rf : max 0.0382 0.0765 0.1235 0.2206 0.2382 0.3044 0.4029 0.4706 0.5235 0.5676 0.7838 0.8853

Height : max 6776.591 5580.555 5992.888 9756.925 10479.63 7465.629 6509.369 5107.296 4379.593 4065.962 3226.222 3748.443

Rf : end 0.0515 0.0838 0.1515 0.2221 0.2603 0.3515 0.4441 0.4941 0.55 0.6147 0.8309 0.9588

Height : end 4912.813 5397.962 5727.258 9723.518 4941.221 3523.999 3096.555 2981.221 2970.184 2271.629 1974.925 1707.37

Height : start 2167.185 640.2217 3511.852 1795.926

Rf : max 0.0059 0.0294 0.0529 0.1118

Height : max 2850.148 4701.815 5702.852 3157.889

Rf : end 0.0162 0.0353 0.0765 0.1412

Height : end 578.8145 3511.852 1793.74 1374

Area

Area [%]

127727.8

100

Area

Area [%]

23091.56 70134.13 14163.23 14494.84 12982.51 17905.06 70723.4 27936.49 97813.52 42652.14 93568.2 65473.44 110525.6 41424.89 115364.8 40161.7 44913.85 82327.63

2.342759 7.115471 1.436933 1.470577 1.317143 1.816561 7.175255 2.834301 9.923688 4.327281 9.492978 6.64262 11.21339 4.20277 11.70435 4.074613 4.556743 8.352565

Area

Area [%]

97317.31 100588 243938.2 325104 209504.6 339615.5 272049.5 138593.5 128634.6 135573.6 181805.7 199220

4.102849 4.240738 10.28431 13.70622 8.83261 14.31802 11.46947 5.843032 5.423172 5.715714 7.664837 8.399016

Area

Area [%]

23665.11 37781.15 100017.6 97899.95

2.694509 4.301761 11.388 11.14688

5 6 7 8 9 10 11 Track 5 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Track 6 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Track 7 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.15 0.2515 0.3647 0.4441 0.5029 0.5559 0.8132 GL2a Rf : start 0 0.025 0.0794 0.1 0.1412 0.2603 0.3588 0.3838 0.4471 0.5044 0.6485 0.7574 0.8221 GL3a Rf : start 0 0.0206 0.0353 0.0794 0.1074 0.1368 0.2765 0.3485 0.3868 0.4559 0.5059 0.5529 0.6044 0.675 0.7485 0.8426 GL4a Rf : start 0 0.0162 0.0368 0.05 0.0765 0.1397 0.2676 0.3618 0.4485 0.5029

1262.63 1144.555 856.5186 910 971.2217 1321.111 392.8516

0.2235 0.3088 0.4176 0.4824 0.5294 0.5676 0.8824

6539.297 2666.963 1983.555 1239.926 2133.926 1716.185 2281.593

0.25 0.3588 0.4412 0.4985 0.5529 0.6397 0.95

1104.814 723.1475 827.6671 888.7042 1138.26 470.5928 193.6289

Height : start 3622.222 4254.146 2841.109 3635.999 2522.962 1790.221 998.8887 999.7402 754.5547 641.2217 429.2949 526.9248 805.2207

Rf : max 0.0147 0.0529 0.0956 0.1132 0.2265 0.3029 0.3676 0.4088 0.4765 0.5353 0.7118 0.7868 0.8824

Height : max 5078.518 6858.999 3770.518 4368.851 8577.629 3595.111 1243.665 2839.146 1825.666 1551.888 942.4063 1163.407 3043.962

Rf : end 0.0191 0.0794 0.1 0.1353 0.2588 0.3588 0.3824 0.4441 0.5 0.5647 0.7544 0.8162 0.9735

Height : end 4247.592 2841.109 3635.999 2542.406 1744.962 998.8887 1042.146 748.1475 590.332 636.7402 458.2207 785.7021 368.1846

Height : start 3472.519 3978.964 5022.11 3756.815 5360.407 3384.963 2822.666 1691.555 1892.814 1639.815 1717.297 1719.815 1023.407 732.8154 945.9629 1137.332

Rf : max 0.0118 0.0279 0.0529 0.0971 0.1088 0.2353 0.3059 0.3676 0.4265 0.4765 0.5309 0.5706 0.6191 0.7118 0.7765 0.8853

Height : max 4413.704 5291.147 8242.926 5902.89 5409.148 9261.592 6460.296 2038.37 4115.223 2778.333 4499.371 2242.37 1186.555 1387.334 1439.667 2919.296

Rf : end 0.0176 0.0353 0.0794 0.1044 0.1324 0.2721 0.3456 0.3824 0.4529 0.5 0.5529 0.6044 0.6691 0.7485 0.8412 0.9603

Height : end 3933.556 5022.11 3756.815 5435.001 3363.407 2905.592 1707.037 1787.963 1803.333 1619.889 1719.815 1023.407 712.8516 945.9629 1138.63 289.2959

Height : start 2750.48 2879.223 5381.26 5396.741 3591.554 3326.852 2370.813 1514.963 1411.592 1483.519

Rf : max 0.0074 0.0294 0.0441 0.0544 0.0971 0.2294 0.3074 0.4132 0.4765 0.5294

Height : max 3589.184 6699.963 6187.666 5654.889 5947.741 9577.815 4326.926 3438.667 2414.74 2919

Rf : end 0.0132 0.0338 0.05 0.0765 0.1382 0.2662 0.3574 0.4471 0.5015 0.5529

Height : end 3067.777 5719.26 5396.741 3591.554 3262.704 2368.852 1466.555 1379.74 1438.814 1426.853

212794.7 106457.7 68917.52 37920.61 50668.84 51605.26 90543.39

24.22879 12.12127 7.846948 4.31764 5.769153 5.875773 10.30927

Area

Area [%]

57440.23 171907.8 47512.43 86169.03 373646 137924.6 16860.16 73365.85 42735.23 45388.72 44633.34 36077.09 123306.1

4.569749 13.6764 3.779927 6.855315 29.72601 10.97281 1.341337 5.836738 3.399869 3.610972 3.550877 2.870171 9.809811

Area

Area [%]

48406.86 49328.02 170186.4 87478.54 75393.5 498565.7 206023.7 42486.61 131828.5 64923.34 102955.8 63313.13 42719.28 45845.86 67961.44 114959.5

2.670905 2.721732 9.390233 4.826732 4.159925 27.50895 11.3676 2.344249 7.27379 3.582222 5.68071 3.493377 2.357087 2.529599 3.749853 6.343024

Area

Area [%]

29995.83 65223.72 52272.48 80092.34 188530.1 466157.8 174749.4 138753.5 66235.49 76070.63

1.822714 3.963357 3.176368 4.866857 11.45614 28.32635 10.61875 8.431437 4.024838 4.622476

11 12 13 14 Track 8 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Track 9 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Track 10 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

0.5574 0.675 0.7426 0.8368 GL5a Rf : start 0 0.0206 0.0368 0.0794 0.1059 0.1382 0.2662 0.3676 0.4574 0.5 0.5529 0.6956 0.7765 0.8338 GYa Rf : start 0 0.025 0.0426 0.0676 0.0882 0.1294 0.1912 0.2397 0.3235 0.3809 0.4794 0.5235 0.5662 0.6147 0.7588 0.8515

1500 859.1484 1216.258 717.7783

0.575 0.7324 0.7868 0.8912

2278.37 1530.037 1852.963 2824.037

0.625 0.7412 0.8353 0.9574

1052.11 1225.926 731.8516 200.9258

Height : start 1428.963 2301.555 3843.74 2318.52 2622.036 1982.704 1566.519 859.999 1055.777 799.1104 1048.963 262.7031 785.5176 642.1484

Rf : max 0.0118 0.0324 0.0559 0.0971 0.1162 0.2265 0.3088 0.4265 0.4662 0.5294 0.5618 0.7397 0.7824 0.8853

Height : max 2648.814 4320.369 5963.629 3142.334 2819.408 8096.223 3911.667 3101.11 1207.223 2231.592 1439.556 763.4072 894.9257 2809.666

Rf : end 0.0206 0.0368 0.0779 0.1059 0.1338 0.2603 0.3647 0.4529 0.4956 0.5529 0.5794 0.7735 0.8294 0.9632

Height : end 2301.555 3843.74 2410 2622.036 2115.186 1596.629 897.6299 1042.519 915.4453 1048.963 599.2217 685.7412 614.6289 304.5176

Height : start 1528.741 2079.036 7047.889 2477.296 2058.666 1725.333 2204.556 1286.222 1306.186 822.037 2668.26 1233.889 1335.111 2271.556 1276.667 1493.926

Rf : max 0.0088 0.0397 0.0471 0.0765 0.1059 0.1647 0.2103 0.2897 0.3471 0.4647 0.4794 0.5412 0.5971 0.6338 0.8118 0.8941

Height : max 2729.075 6852.853 7516.926 2995.371 3429.778 5385.037 4103.667 3154.519 4020.63 2869.889 2668.26 1392.444 2859.593 4156.667 1904.223 3077.37

Rf : end 0.0191 0.0397 0.0676 0.0882 0.1294 0.1853 0.2353 0.3191 0.3765 0.4765 0.5206 0.5618 0.6118 0.7103 0.85 0.9721

Height : end 2032.927 6852.853 2477.296 2058.666 1725.333 2099.89 1178.852 1428.407 856.7042 2615.481 1203.148 1081.853 2239.63 821.9638 1513.667 310.2227

Height : start 2112.631 3951.889 586.4824 883.7422 757.9629 792.8516 607.2607 525.9629 351.1855 1350.075 2521.63

Rf : max 0.0147 0.0353 0.0941 0.15 0.1794 0.2235 0.2765 0.3162 0.5029 0.5735 0.6

Height : max 4017.482 9449.814 1202.334 2466.926 1027 4223.074 1088.927 728 3286.778 2536.038 4529.927

Rf : end 0.0176 0.075 0.1265 0.1706 0.1912 0.2559 0.3 0.3441 0.5324 0.575 0.6397

Height : end 3964.705 625.5938 868.8145 757.9629 648.5186 528.4082 551.5928 308.0381 1342.37 2521.63 2604.445

70284.82 50578.49 81670.41 105053.3

4.270898 3.073431 4.962749 6.383626

Area

Area [%]

32382.74 40507.16 112567.5 49934.16 48042.28 330123.4 143017.7 104935 28166.72 55117.23 18192.35 29721.66 22221.43 96029.1

2.914847 3.646146 10.13247 4.494692 4.324399 29.71519 12.87336 9.445447 2.535353 4.961233 1.637536 2.675317 2.000204 8.643806

Area

Area [%]

30228.68 46005.24 83678.38 36729.46 70547.96 128886.7 87157.63 111158.1 86782.99 96763.69 54841.86 32923.02 63977.41 125903.9 98284.69 121519.8

2.370153 3.607152 6.561006 2.879862 5.531484 10.10567 6.833805 8.715622 6.80443 7.586991 4.300009 2.581409 5.016304 9.871799 7.706249 9.528055

Area

Area [%]

38502.34 145069.9 29655.22 44114.23 12480.32 92422.13 23274.07 15489.93 135749.3 51309.49 141923.9

3.246848 12.23354 2.500783 3.72009 1.052448 7.793827 1.96267 1.306244 11.44755 4.326857 11.96824

GIa Rf : start 0 0.0206 0.0779 0.1294 0.1706 0.1956 0.2574 0.3029 0.35 0.5353 0.575

12 13 14 Track 11 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Track 12 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Track 13 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.6412 0.775 0.8426

2617.52 812.1113 814.4814

0.7118 0.8118 0.8868

6410 1501.148 2830.853

0.7735 0.8382 0.9691

789.3701 720.5557 141.4814

Height : start 982.4824 188.5566 1814.297 1824.482 1746.926 1735.148 2476.333 2978.594 1822.26 1972.815 4167.371 2276.074 1945.742 1925.741 1755.667 2091.853

Rf : max 0.0029 0.0412 0.0941 0.1176 0.1529 0.2294 0.2706 0.3029 0.4029 0.4735 0.4971 0.5632 0.6412 0.7088 0.8265 0.8897

Height : max 1202.186 5394.26 2274.779 1932.852 2260.26 3262.557 3397.777 4720.741 2364.223 4713.223 4358.037 4925.186 2852.075 4088.926 2808.853 3066.704

Rf : end 0.0132 0.0735 0.1029 0.125 0.1941 0.2515 0.2809 0.3382 0.4279 0.4853 0.5191 0.6088 0.6691 0.7632 0.8515 0.9691

Height : end 185.0742 1862.519 1817.037 1714.334 1583.26 2525.593 3068.444 1832.112 1878.963 4148.927 2200.814 1953.89 1979.297 1804.815 2095.778 764.3711

Height : start 1195.778 360.8525 4622.407 2016.741 1786.518 2557.297 3296.334 1716.111 2088.223 4888.26 2139.407 1768.556 1179.482 1524.111 1021.111

Rf : max 0.0044 0.0294 0.0397 0.0926 0.2324 0.2735 0.3088 0.4044 0.4779 0.5 0.5676 0.7088 0.8015 0.8294 0.8912

Height : max 1491.853 4723.741 5453.556 3604.63 4067.63 3889.334 5610.963 2346.074 4888.26 6402.408 4026.333 3973 1313.63 2215.963 1247.481

Rf : end 0.0162 0.0324 0.0706 0.1103 0.2529 0.2838 0.3632 0.4353 0.4779 0.5294 0.6118 0.7662 0.8015 0.8588 0.9338

Height : end 5.852539 4622.407 2063.778 2078.222 2557.297 3383.186 1771.778 2088.223 4888.26 2139.407 1800.37 1169.927 1313.63 951.8887 336.1855

Height : start 1560 562.2227 1058.557 494.5566 1118.186 1052.852 893.5546 1442.63 1898.074 909.2598

Rf : max 0.0015 0.0368 0.0529 0.0912 0.1118 0.1426 0.2382 0.2824 0.3088 0.4059

Height : max 1565.777 3534.185 1194.408 1817.297 1478.408 1413.223 2729.963 1929.668 3882.334 2709.074

Rf : end 0.0147 0.05 0.0735 0.1029 0.1279 0.175 0.2574 0.2824 0.3353 0.4412

Height : end 562.2227 1058.557 494.5566 1118.186 1006.297 954.7051 1446.297 1929.668 1172.187 1389.593

294000.7 49634.09 112211.9

24.79266 4.185573 9.462671

Area

Area [%]

6337.261 109489.4 37453.56 23857.23 83809.89 97623.78 58218.28 127755 72005.04 123929.8 77562.39 194980.2 91957.93 154066.6 129263.3 143312.1

0.413761 7.14859 2.445353 1.557645 5.47197 6.373883 3.801087 8.341161 4.701228 8.091407 5.064069 12.73031 6.003958 10.05905 8.439636 9.356888

Area

Area [%]

10491.16 28429.63 88837.08 68190.93 120971.9 71270.46 178527.6 90990.5 95031.95 160939.5 163329.1 137338.9 24922.15 63380.74 42378.06

0.779994 2.113681 6.604841 5.069846 8.993996 5.298802 13.27314 6.764943 7.065416 11.9655 12.14316 10.21084 1.852907 4.712219 3.150716

Area

Area [%]

12528.63 49104.77 14485.6 25352.96 20627.95 35582.46 90809.6 26331.6 96327.23 91512.11

1.028178 4.029843 1.188779 2.080622 1.692858 2.920118 7.452401 2.160935 7.905212 7.510053

GS3 Rf : start 0 0.0191 0.075 0.1059 0.1279 0.1971 0.2529 0.2824 0.3779 0.4309 0.4868 0.5235 0.6118 0.6721 0.7676 0.8544 GS4 Rf : start 0 0.0191 0.0324 0.0735 0.1956 0.2529 0.2853 0.3691 0.4353 0.4779 0.5294 0.6721 0.7706 0.8059 0.8618 GS5 Rf : start 0 0.0147 0.05 0.0735 0.1029 0.1309 0.1809 0.2603 0.2838 0.3603

11 12 13 14 15 16 17

0.4471 0.4985 0.5324 0.6206 0.6765 0.7706 0.8603

1379.26 4121.778 1629.112 1611.593 1891.037 1785.593 1309.89

0.4794 0.5059 0.5647 0.6441 0.7118 0.8324 0.8882

5289.815 4343.482 3492.927 2404.853 3903.037 2323.927 2553.778

0.4956 0.5294 0.6191 0.6735 0.7691 0.8574 0.9574

4184.89 1552.261 1605.334 1885.778 1792.557 1307.26 50.77832

119271 66930.36 149249.4 70124.09 154856.1 114183.8 81250.4

9.788124 5.492722 12.24833 5.754819 12.70846 9.37063 6.667913

PHỤ LỤC 5. HÌNH ẢNH VÀ SỐ LIỆU SẮC KÝ ĐỒ NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ MẪU DÂY THÌA CANH TRÊN THỊ TRƯỜNG

Hình PL5.1. Sắc ký đồ dịch chiết toàn phần các mẫu Dây thìa canh thị trường khai triển trên cùng bản mỏng với các mẫu Dây thìa canh nhóm 1

a) Quan sát dưới VIS-TT; b) Quan sát dưới UV 366-TT; c) Quan sát dưới UV 366

Hình PL5.2. Sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân các mẫu Dây thìa canh thị trường khai triển trên cùng bản mỏng với các mẫu Dây thìa canh nhóm 1

a) Quan sát dưới ánh sáng trắng;

b) Quan sát dưới UV 366nm

Bảng PL5.1. Số liệu sắc ký đồ dịch chiết toàn phần các mẫu Dây thìa canh thị trường Track 13 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Track 14 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Track 15 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

GX1 Rf : start 0.0128 0.0966 0.1293 0.1534 0.1903 0.2827 0.3224 0.3594 0.473 0.517 0.5668 0.6392 0.7287 0.7841 0.8267

Height : start 0 16.9502 1019.876 821.8496 1485.75 0 390.4102 814.3398 209.6113 141.5781 507.1768 369.6299 186.6377 1260.532 2622.759

Rf : max 0.0384 0.1222 0.1378 0.1761 0.2301 0.3068 0.3381 0.392 0.4886 0.5398 0.6023 0.6605 0.767 0.8224 0.8949

Height : max 2331.052 1106.805 1242.493 2187.608 3993.743 1289.928 1083.561 4015.715 602.4277 924.7666 2130.366 585.0752 1401.642 2540.204 5043.99

Rf : end 0.0625 0.1264 0.1506 0.1875 0.2699 0.3196 0.3537 0.4233 0.5043 0.5639 0.6321 0.6818 0.7798 0.8224 0.9687

Height : end 33.58105 1062.115 942.7539 1568.988 288.4053 409.9277 829.043 329.6797 310.9102 516.0283 419.5908 181.1885 1298.31 2540.204 267.1816

Height : start 0 70.1543 32.36523 177.124 88.33301 81.05957 245.0889 591.2402 232.1738 95.98975 289.4395 517.769 1318.646 2700.825 3212.338

Rf : max 0.0284 0.054 0.0795 0.1207 0.2273 0.3068 0.3437 0.3935 0.4886 0.5412 0.6676 0.7656 0.8239 0.8523 0.8977

Height : max 2417.911 212.3252 207.1787 1553.994 4651.333 319.3936 630.9976 2452.631 550.1128 843.0493 518.1958 1334.979 2690.522 3312.885 4219.398

Rf : end 0.0469 0.0625 0.0838 0.1548 0.2798 0.3139 0.3494 0.4304 0.5028 0.5682 0.6889 0.777 0.8239 0.8679 0.9673

Height : end 70.1543 34.12988 112.0791 156.5313 6 230.1504 612.604 287.9028 202.627 409.5933 286.8008 1260.858 2690.522 3210.551 301.8184

Height : start 0 50.85742 87.33301 55.3169 327.1787 481.7236 242.3418 691.4521 566.4473 453.0547

Rf : max 0.0327 0.125 0.2301 0.304 0.3437 0.3864 0.4915 0.5384 0.6562 0.7628

Height : max 3760.271 1577.667 4425.333 601.9146 698.0996 1596.607 750.5488 1422.374 848.9337 1596.536

Rf : end 0.0668 0.1605 0.277 0.3168 0.3537 0.4205 0.5114 0.5994 0.7031 0.7912

Height : end 83.51172 107.2139 45.33301 266.2007 532.3955 275.48 601.1411 623.811 461.7583 1504.429

Area

Area [%]

37301.34 14926.52 16981.72 38119.71 145119.3 19505.73 19515.16 89248.83 9811.239 20446.53 53002.5 12650.6 31471.89 51206.59 325883.5

4.21393 1.686248 1.918424 4.306381 16.39412 2.203562 2.204627 10.08243 1.108375 2.309843 5.987689 1.429138 3.555378 5.784806 36.81504

Area

Area [%]

30607.51 1638.897 1417.951 46205.58 169445.5 3904.683 10178.44 83349.43 9264.012 20328.31 17871.22 29063.45 61809.52 89068.3 178312.9

4.067629 0.217804 0.188441 6.140556 22.5187 0.518918 1.352678 11.07684 1.231154 2.70156 2.375021 3.862428 8.214265 11.83686 23.69715

Area

Area [%]

68914.74 40119.85 146903.3 7989.853 12570.32 44624.34 21636.67 62803.33 42155.2 62516.81

8.745853 5.091542 18.64326 1.013979 1.595278 5.6632 2.745873 7.970264 5.349845 7.933903

GX2 Rf : start 0.0099 0.0469 0.0668 0.0866 0.1733 0.2912 0.3196 0.3523 0.4673 0.5156 0.6293 0.7386 0.7812 0.8267 0.8722 GX3 Rf : start 0.0099 0.0881 0.179 0.2855 0.3224 0.3551 0.4574 0.517 0.608 0.7131

11 12 Track 16 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

0.7983 0.8651

1812.07 2925.821

0.8523 0.8949

3095.869 3912.376

0.8608 0.9503

2935.837 783.5029

Height : start 0 0 505.2627 1398.445 85.30762 40.28906 96.66699 1113.667 869.9995 207.1553 714.377 1830.024 1378.876 612.457 498.6157 1707.453 4285.31

Rf : max 0.0256 0.0597 0.0824 0.1222 0.1534 0.2131 0.2955 0.3267 0.3807 0.5014 0.5611 0.598 0.6378 0.6932 0.7642 0.8551 0.8977

Height : max 1277.41 1244.96 5042.213 1702.737 261.9492 1742.265 2427.667 1925.668 4760 731.6968 1796.882 2613.552 1538.453 719.9575 1780.401 5273.795 5009.927

Rf : end 0.044 0.0682 0.108 0.1406 0.1747 0.2543 0.3097 0.3452 0.4077 0.5014 0.5611 0.6278 0.669 0.7216 0.7798 0.8764 0.9588

Height : end 460.9111 505.2627 1282.787 47.33887 29.43555 31.74317 1104 899.0005 234.001 731.6968 1796.882 1245.978 595.9937 502.6021 1692.672 4296.86 396.5605

115482.9 162253

14.65574 20.59126

Area

Area [%]

20122.8 9995.512 87846.88 24144.39 3389.732 42896.43 46521.34 33627.35 101926.4 11669.04 55634.21 79843.71 30310.74 19269.47 48868.29 251817.9 170583.3

1.93774 0.962525 8.459281 2.325002 0.326417 4.130744 4.479807 3.238171 9.815077 1.123679 5.357338 7.68861 2.918796 1.855568 4.705808 24.24899 16.42645

GX4 Rf : start 0.0114 0.0483 0.0682 0.1108 0.1477 0.1875 0.2628 0.3125 0.3494 0.4702 0.5057 0.571 0.6307 0.6747 0.7259 0.7812 0.8778

Bảng PL5.2. Số liệu sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân các mẫu Dây thìa canh thị trường Track 14 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Track 15 Peak 1 2

GX1 Rf : start 0 0.0147 0.0279 0.0441 0.0765 0.1956 0.25 0.2824 0.3853 0.4515 0.5 0.5412 0.5971 0.6279 0.675 0.7809 0.8529

Height : start 1667.813 879.999 2411.964 2901.036 974.7021 1604.333 1225.776 1438.407 735.7773 863.5918 2456.592 1173.777 1285.185 796.4805 633.5176 805.1104 1115.073

Rf : max 0.0029 0.0235 0.0353 0.0471 0.1088 0.2206 0.2735 0.3088 0.4118 0.4809 0.5015 0.5676 0.5985 0.65 0.7088 0.8368 0.8897

Height : max 1821.63 2452.519 3735.479 3204.333 1901.813 4861.556 1660.332 3022.999 1825.962 3875.556 2471.11 2437.519 1288.888 1339.852 1972.999 1442.073 3042.37

Rf : end 0.0118 0.025 0.0441 0.0735 0.1324 0.25 0.2794 0.3441 0.4485 0.5 0.5221 0.5941 0.625 0.6721 0.7765 0.8485 0.9397

Height : end 921.7022 2407.813 2901.036 988.1103 936.3701 1225.776 1520.259 755.4814 898.7031 2456.592 1278.777 1274.888 801.1475 589.333 776.0742 1117.703 31.48047

Height : start 1812.557 855.668

Rf : max 0.0029 0.0206

Height : max 1872 1106.889

Rf : end 0.0132 0.0235

Height : end 945.1113 986.9258

Area

Area [%]

13307.75 12871.46 34347.12 38234.98 55855.18 117085.3 29179.67 82047.89 55859.76 83690.04 29402.12 67976.5 19452.68 28723.07 70615.98 51175.64 106135.9

1.485305 1.436609 3.833551 4.267483 6.234109 13.06812 3.256802 9.15753 6.23462 9.340814 3.281629 7.586994 2.171152 3.20584 7.881592 5.711816 11.84604

Area

Area [%]

13935.24 5021.113

2.561526 0.922963

GX2 Rf : start 0 0.0162

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Track 16 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Track 17 Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0.0235 0.0794 0.1441 0.2074 0.2574 0.2838 0.3882 0.4294 0.5044 0.5471 0.6779 0.7721 0.8588

986.9258 322.5938 240 473.5547 578.5557 1111.333 122.8896 299.7783 1993.444 593.4814 710.9258 406.7412 881.704

0.0309 0.0897 0.1559 0.2294 0.2765 0.3147 0.4 0.4912 0.5147 0.5824 0.7147 0.8309 0.8912

1429.186 718.1113 566.7402 1851.371 1252.074 3265.814 743.4082 2194.556 2252.704 2915.001 2567.704 1571.223 1427.667

0.0529 0.1029 0.175 0.2574 0.2824 0.3456 0.425 0.5015 0.5441 0.6059 0.7662 0.8574 0.9588

499.1484 360.8887 334.6309 578.5557 1159.481 341.7783 316.9629 2043.593 607.2588 760.667 453.4443 891.7031 454.334

Height : start 741.5557 487.666 308 367.5918 438.7773 387.5186 299.9258 340.9619 634.4072 447.5547 733.9258 409.7773 520 687.2949

Rf : max 0.0029 0.0324 0.1191 0.1765 0.3118 0.3412 0.4206 0.4912 0.5118 0.5618 0.6059 0.6544 0.7088 0.8868

Height : max 889.3701 1105.223 701.7402 663.2598 832.333 621.0361 656.8887 699.9258 841.6299 1107.666 862.4815 1025.333 1011.296 1178.11

Rf : end 0.0162 0.0603 0.1279 0.2 0.3324 0.3662 0.4397 0.5029 0.5426 0.5809 0.6294 0.6779 0.7515 0.9647

Height : end 502.4063 375.4805 372.4434 304.8887 304.8516 348.6289 291.4072 639.8145 447.5547 857.7783 529.8887 486.1103 377.333 47.99902

Height : start 2351.814 867.7412 842.2969 821.6299 657.9629 389.2959 1187.149 1154.519 1975.037 1681.815 730.1113 439.4443

Rf : max 0.0294 0.0985 0.1471 0.2221 0.2794 0.4868 0.5118 0.6074 0.6471 0.7118 0.8191 0.8912

Height : max 9920.187 1143.778 2469.89 3933.74 1095.815 1225.186 2946.668 3898 2123.371 5557.89 896.2598 2510.74

Rf : end 0.0559 0.1279 0.1676 0.2588 0.3059 0.4912 0.5529 0.6353 0.675 0.7721 0.8368 0.9544

Height : end 857.7412 834.5557 744.5557 553.2227 479.7412 1198.407 1151.408 1975.037 1626.481 732.8525 512.0381 113.9258

19433.08 8702.003 8404.542 39038.65 17046.84 76914.15 12951.75 48211.48 39501.86 73163.79 73987.37 58246.35 49462.89

3.572119 1.599571 1.544893 7.175945 3.133489 14.13808 2.380744 8.862061 7.26109 13.44871 13.60009 10.70664 9.092092

Area

Area [%]

7900.865 20222.63 9707.252 22250.69 18257.99 9977.844 13404.8 11494.04 17022.6 22114.36 19447.41 21188.63 31041.91 59354.23

2.78803 7.136092 3.425461 7.851747 6.442817 3.520947 4.73024 4.055979 6.006876 7.803638 6.862535 7.476971 10.95396 20.94472

Area

Area [%]

179836.3 41504.05 39663.69 106310.7 23359.27 16948.37 72069.99 119536.3 51292.28 188085.6 31680.86 87929.48

18.76781 4.331383 4.139323 11.09464 2.437785 1.768741 7.521261 12.47487 5.352888 19.62871 3.306231 9.176366

GX3 Rf : start 0 0.0191 0.1015 0.1309 0.2912 0.3338 0.3941 0.4706 0.5044 0.5426 0.5868 0.6338 0.6794 0.8294 GX4 Rf : start 0 0.0574 0.1309 0.1706 0.2632 0.4618 0.4926 0.5574 0.6353 0.6765 0.7765 0.8412

PHỤ LỤC 6. CHI TIẾT NHÓM THẾ CÁC KHUNG SAPONIN PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CÁC LOÀI TRONG CHI Gymnema R.Br.

1) Cấu trúc phần aglycon của các acid gymnemic phân lập được từ Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult [52]

Tig = Tigloyl

Mba = 2-methylbutyroyl

Bz

Cấu trúc phần aglycon trong phân tử acid gymnemic phân lập được từ Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult [52]

Cấu trúc phần đường trong phân tử acid gymnemic phân lập được từ Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult [52]

Vị trí nhóm thế tương ứng các acid gymnemic phân lập được từ Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult [52] Tên

R1

R2

R3

R4

R5

R6

I

GlcA

H

OH

OAc

OH

OTig

II

GlcA

H

OH

OAc

OH

OMba

III

GlcA

H

OH

OH

OH

OMba

IV

GlcA

H

OH

OH

OH

OTig

V

GlcA

H

OH

OH

OTig

OTig

VI

A

H

OH

OH

OH

OTig

VII

GlcA

H

OH

OH

H

OH

VIII

B

H

OH

OH

OH

OMba

IX

B

H

OH

OH

OH

OTig

X

GlcA

H

OH

OAc

OH

OH

XI

GlcA

H

OH

OTig

OH

OTig

XII

A

H

OH

OAc

OH

OTig

XIII

GlcA

H

OH

OMba

OH

OH

XIV

GlcA

H

OH

OTig

OH

OH

XV

GlcA

H

OH

OH

OTig

OMba

XVI

GlcA

H

Tig

OH

OTig

OH

XVII

GlcA

H

OH

OH

OH

OBz

XVIII

GlcA

H

OH

OBz

OH

OH

GA

2) Cấu trúc phần aglycon của các C-4-gem-dimethylat olenan type acid phân lập được từ Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult nguồn gốc Việt Nam [52]

3) Cấu trúc phần aglycon của các 3β-hydroxy oleanan triterpenoid phân lập được từ Gymnema latifolium Wall. Ex Wight [38] [52]

4) Cấu trúc của một số chất phân lập được từ loài Gymnema inodorum (Lour.) Decne [44].

5) Khung cấu trúc chung của các aglycon C21 phân lập được từ Gymnema yunnanense Tsiang [28], [62].