Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và định lượng một số paraben trong mỹ phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

NGUYỄN THỊ VIỆT ÁI

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH

PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ PARABEN TRONG MỸ PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ VIỆT ÁI

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ PARABEN TRONG MỸ PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210

Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Thị Hường Hoa GS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu

HÀ NỘI - 2018

`

LỜI CẢM ƠN Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tập thể thầy hướng dẫn, TS. Lê Thị Hường Hoa vàGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu - những người thầy đã không quản ngại khó khăn, dành nhiều thời gian quý báu và giúp đỡ tận tình cho tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Khoa kiểm nghiệm Mỹ phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành việc học và làm đề tài.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Tôi xin chân thành cảm ơn trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa phân

tích đã cho tôi một môi trường học tập nghiêm túc, giúp tôi bồi đắp kiến thức và hoàn thiện bản thân.

Không thể nói hết sự cảm kích của tôi đối với đồng nghiệp và gia đình đã

luôn yêu thương, động viên, nhường nhịn để tôi đi đến chặng cuối của chương trình học Thạc sĩ.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 03 năm 2018 Học viên

Nguyễn Thị Việt Ái

MỤC LỤC Lời cảm ơn Danh mu ̣c các kí hiêu, ̣ các từ viế t tắ t Danh mu ̣c các bảng Danh mu ̣c các hin ̀ h CHƯƠNG 1 ..................................................................................................................... 3

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

TỔNG QUAN .................................................................................................................. 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ PARABEN ................................................................................. 3 1.1.1. Đặc điểm chung...................................................................................................... 3 1.1.2. Tác dụng kháng khuẩn của paraben và viê ̣c sử du ̣ng paraben trong thực tiễn sản xuất ............................................................................................................................. 5 1.1.3. Sự hiện diện của paraben trong môi trường ........................................................... 7 1.1.4. Tác động của paraben đối với cơ thể con người .................................................... 8 1.1.5. Một số phương pháp phân tích paraben trong mỹ phẩm ..................................... 12 1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC .......................................................... 25 1.2.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao .......................................................... 25 1.2.2. Cấu tạo máy HPLC .............................................................................................. 25 1.2.3. Detector và bộ phận ghi tín hiệu .......................................................................... 26 1.2.4. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc kí......................................................... 26 1.2.5. Ứng dụng HPLC .................................................................................................. 27 CHƯƠNG 2 ................................................................................................................... 31 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................... 31 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................................ 31 2.2.THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT ..................................................................................... 31 2.2.1. Thiết bị và dụngcụ ................................................................................................ 31 2.2.2. Dung môi và hóa chất .......................................................................................... 31 2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ................................................................................... 32 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................................... 32 2.5. XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ............................................... 35

CHƯƠNG 3 ................................................................................................................... 36 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .................................................................................. 36 3.1. XỬ LÝ MẪU .......................................................................................................... 36 3.1.1. Điều kiện xử lý mẫu ............................................................................................. 36 3.1.2. Cách chuẩn bị mẫu ............................................................................................... 36 3.2. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ......................... 37 3.2.1. Điều kiện sắc kí .................................................................................................... 37 3.2.2. Thẩm định quy trình ............................................................................................. 40

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

3.3. ÁP DỤNG KIỂM TRA MẪU TRÊN THỊ TRƯỜNG ........................................... 67 CHƯƠNG 4 ................................................................................................................... 72 BÀN LUẬN ................................................................................................................... 72 4.1. VỀ CÁC PARABEN NGHIÊN CỨU .................................................................... 72 4.2. VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................... 72 4.2.1. Về phương pháp xử lý mẫu .................................................................................. 74 4.2.2. Về xây dựng quy trình phân tích .......................................................................... 75 4.2.3. Về thẩm định phương pháp .................................................................................. 75 4.3. VỀ KIỂM TRA CÁC MẪU MỸ PHẨM................................................................ 76 KẾT LUẬN .................................................................................................................... 77 KIẾN NGHỊ ................................................................................................................... 77 Tài liêụ tham khảo Phu ̣ lu ̣c

Phu ̣ lu ̣c 1: Các mẫu mỹ phẩm được sử dụng để xác định sự có mặt của 5 paraben cấm Phụ lục 2: Các phương pháp phân tích xác định paraben trong mỹ phẩm Phu ̣ lu ̣c 3: Thường quy ki ̃ thuâ ̣t - Đinh ̣ tin ̣ lươ ̣ng 5 chất bảo quản ́ h và đinh isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben trong sữa rửa mă ̣t và nước súc miê ̣ng bằ ng HPLC-DAD Phụ lục 4: Một số sắc kí đồ phân tích 5 paraben IPP, PheP, BzP, IBP, PeP

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt

Tên tiếng Việt (tiếng Anh)

ACN

Acetonitril

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Association of Official Analytical Chemists)

BzP cs EP HL

Butylparaben

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

BP

Benzylparaben cộng sự

Ethylparaben Hàm lượng

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography)

IBP

Isobutylparaben

IPP

Isopropylparaben

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)

MeOH

Methanol

MP

Methylparaben

PeP

Pentylparaben

PheP

Phenylparaben

PP

Propylparaben

ppm

Phần triệu (parts per million)

r

Hệ số tương quan (Relative coefficient)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

UV-VIS

Tử ngoại- khả kiến (Ultraviolet-visible)

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1. Một số tính chất vật lý, hóa học 5 paraben bị cấm dùng trong mỹ phẩm. 4 Bảng 2. 1. Các mẫu nền được sử dụng để xác định phương pháp phân tích. ...........31 Bảng 3. 1. Độ thích hợp của hệ thống sắc kí của IPP, PheP và BzP ........................40

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Bảng 3. 2. Độ thích hợp của hệ thống sắc kí của IBP và PeP ...................................41 Bảng 3. 3. Thời gian lưu của IPP, PheP, BzP trên các loại mẫu thử khác nhau. ......46 Bảng 3. 4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của IPP, PheP, BzP. .......................46 Bảng 3. 5. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của IBP và PeP. ..............................47 Bảng 3. 6. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với IPP trên nền sữa rửa mặt. ............................................................................................................................49 Bảng 3. 7. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với PheP trên nền sữa rửa mặt. ............................................................................................................................50 Bảng 3. 8. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với BzP trên nền sữa rửa mặt. ............................................................................................................................50 Bảng 3. 9. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với IBP trên nền sữa rửa mặt. ............................................................................................................................51 Bảng 3. 10. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với PeP trên nền sữa rửa mặt. ............................................................................................................................52 Bảng 3. 11. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với IPP trên nền nước súc miệng...................................................................................................................53 Bảng 3. 12. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với PheP trên nền nước súc miệng...................................................................................................................53 Bảng 3. 13. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với BzP trên nền nước súc miệng...................................................................................................................54 Bảng 3. 14. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với IBP trên nền nước súc miệng...................................................................................................................54

Bảng 3. 15. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với PeP trên nền nước súc miệng...................................................................................................................55 Bảng 3. 16. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với IPP, PheP, BzP trên nền sữa rửa mặt. .................................................................................................56 Bảng 3. 17. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với IBP và PeP trên nền sữa rửa mặt. ........................................................................................................57 Bảng 3. 18. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với IPP, PheP, BzP trên nền nước súc miệng. ..........................................................................................58

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Bảng 3. 19. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với IBP và PeP trên nền nước súc miệng. ..................................................................................................59 Bảng 3. 20. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với IPP, PheP, BzP trên nền sữa rửa mặt. ...............................................................................60 Bảng 3. 21. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với IBP và PeP trên nền sữa rửa mặt. .....................................................................................61 Bảng 3. 22. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với IPP, PheP, BzP trên nền nước súc miệng. ........................................................................62 Bảng 3. 23. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với IBP và PeP trên nền nước súc miệng. ..............................................................................63 Bảng 3. 24. LOD và LOQ của IPP, PheP, BzP, IBP và PeP ....................................66 Bảng 3. 25. Kết quả phân tích các paraben cấm. ......................................................71

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. 1. Cấu trúc chung của paraben .......................................................................3 Hình 1. 2. Phương pháp phân tích chính thức do liên minh châu Âu ban hành để định tính và định lượng paraben trong mỹ phẩm. .....................................................14 Hình 1. 3. Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC. .............................................................25 Hình 1. 4. Cấu tạo detector mảng diod (DAD). ........................................................30

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 3. 1. Sắc kí đồ phân tích hỗn hơ ̣p chuẩ n 5 paraben bi ̣cấ m (trái) và hỗn hơ ̣p chuẩ n 9 paraben (phải) với pha động ACN - nước (40 : 60). .................................38 Hình 3. 2. Sắc kí đồ phân tích hỗn hơ ̣p chuẩ n IPP, PheP, BzP (a), hỗn hơ ̣p chuẩ n IBP và PeP (b) và hỗn hơ ̣p 9 paraben (c) trên cột Luna với pha động ACN - nước (35 : 65). ....................................................................................................................39 Hình 3. 3. Sắc kí đồ phân tích hỗn hơ ̣p chuẩ n 9 paraben trên cột Luna với pha động ACN - nước (45 : 55). .............................................................................................40 Hình 3. 4. Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với 3 paraben IPP, PheP, BzP trên nền mẫu sữa rửa mặt so với mẫu chuẩn. ..........................................................................42 Hình 3. 5. Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với 3 paraben nghiên cứu trên nền mẫu nước súc miệng so với mẫu chuẩn. ...........................................................................43 Hình 3. 6. Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với 2 paraben IBP và PeP trên nền mẫu sữa rửa mặt so với mẫu chuẩn. ..................................................................................44 Hình 3. 7. Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với 2 paraben IBP và PeP trên nền mẫu nước súc miệng so với mẫu chuẩn. ...........................................................................45 Hình 3. 8. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của .......47 Hình 3. 9. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ ..............48 Hình 3. 10. Sắc kí đồ xác định LOD của PheP và BzP. ...........................................64 Hình 3. 11. Sắc kí đồ thể hiện LOD của IPP. ...........................................................65 Hình 3. 12. Sắc kí đồ thể hiện LOD của IBP, PeP ....................................................66 Hình 3. 13. So sánh phổ UV-VIS của các píc trên mẫu thử 48L02 và 48L01.........68 Hình 3. 14. Sắc kí đồ phát hiện các paraben trong 48L07 ........................................69

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

ĐẶT VẤN ĐỀ Sự kỳ vọng về thời hạn sử dụng lâu dài và các sản phẩm tiêu dùng không chứa vi sinh vật đòi hỏi phải sử dụng chất bảo quản. Lý tưởng nhất là chất bảo quản hoạt động ở nồng độ thấp mà có tác dụng với nhiều loại vi sinh vật khác nhau và không ảnh hưởng đến các thành phần khác trong sản phẩm, đồng thời không gây độc cho người và có giá rẻ cho các nhà sản xuất. Paraben đã được sử dụng gần 100 năm làm chất bảo quản, chủ yếu là trong các sản phẩm chăm sóc cá nhân, dược

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

phẩm và thực phẩm. Chúng đã từng được coi là một trong những chất bảo quản an toàn nhất và được dung nạp tốt nhất. Việc sản xuất và sử dụng rộng rãi paraben trong thời gian dài trên toàn cầu đã dẫn đến sự xuất hiện của chúng ở nhiều nơi trong môi trường. Paraben đã được phát hiện trong nước mặt, đất và trầm tích, sinh vật, cũng như trong không khí và bụi trong nhà. Tuy nhiên, nguồn phơi nhiễm chính với paraben của con người là các sản phẩm chăm sóc cá nhân và dược phẩm. Phơi nhiễm paraben liên tục ngay cả ở nồng độ thấp có thể dẫn đến sự tồn tại lâu dài và tích tụ. Tác động và sự an toàn của paraben đã được các báo cáo khoa học đề cập đến khả năng tiềm tàng gây rối loạn nội tiết và mối liên hệ có thể có với ung thư vú.

Những phát hiện này cũng chỉ ra tác động tiềm ẩn có hại đối với việc dùng các mỹ phẩm có chứa paraben trên da người, đặc biệt khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời.

Khi con người có thể liên tục tiếp xúc với nhiều paraben khác nhau và nhiều chất gây rố i loa ̣n nội tiết khác thì mặc dù ở các nồng độ dưới mức tác dụng quan sát được, hỗn hợp các chất này có thể gây tác dụng bất lợi tiềm tàng không thể bỏ qua.

Các nước châu Âu và ASEAN đã đưa ra những quy định nhằm quản lý việc

sử dụng paraben. Trong số chin ́ paraben đươ ̣c sử du ̣ng trong thực tế thì methylparaben, ethylparaben, propylparaben và butylparaben đươ ̣c phép sử du ̣ng trong mỹ phẩ m ở những giới ha ̣n nhấ t đinh. ̣ Năm chấ t còn la ̣i là isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben do thiế u dữ liê ̣u về giới ha ̣n và tính an toàn, không đánh giá đươ ̣c nguy cơ đố i với con người nên bi ̣ đưa vào danh mu ̣c các chấ t bi cấ ̣ m sử du ̣ng trong mỹ phẩ m.

1

Công văn số 6577/QLD-MP của Cục quản lý dược (Bộ Y tế) ban hành ngày 13 tháng 4 năm 2015 về việc quyết định ngừng lưu hành các sản phẩm mỹ phẩm chứa các paraben sử du ̣ng không đúng quy đinh ̣ là một trong nhiều động thái của các nước ASEAN trong tiến trình xây dựng cộng đồng chung, nhằm bảo vệ sức khỏe của người dân trong khu vực. Do đó, một phương pháp phân tích sử dụng thiết bị vốn phổ biến ở nhiều phòng thí nghiệm là sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector mảng diod cần được phát triển để xác định các paraben này trong các sản phẩm mỹ phẩm.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Trên cơ sở đó, nghiên cứu này được tiến hành nhằm xây dựng các quy trình

phát hiện và định lượng những paraben bị cấm trong mỹ phẩm với các mục tiêu: 1. Xây dựng được quy trình phân tích các paraben isopropylparaben,

isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben trong mỹ phẩm dạng sữa rửa mặt và nước súc miệng.

2. Áp dụng phương pháp xây dựng để kiểm tra một số mẫu mỹ phẩm trên thị

trường.

2

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ PARABEN 1.1.1. Đặc điểm chung Paraben được biết đến là tên gọi chung của nhóm chất bảo quản hóa học được sử dụng trong nhiều loại mỹ phẩm, dược phẩm và một số sản phẩm thực phẩm. Paraben được tạo ra từ phản ứng ester hóa acid p-hydroxybenzoic. Cấu trúc

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

hóa học chung của một paraben là para –hydroxybenzoat trong đó R có thể là một nhóm alkyl hay aryl. Trong số đó methylparaben và propylparaben được sử dụng phổ biến nhất và chúng thường được dùng kết hợp với nhau trong các sản phẩm .

Hình 1. 1. Cấu trúc chung của paraben

Ở điều kiện bình thường các paraben là những tinh thể không màu hoặc tinh

thể màu trắng, không có mùi, vị. Paraben tan trong các dung môi như methanol, ethanol, ete, glycerin, propylen glycol và tan ít hoặc gần như không tan trong nước.

Paraben tan tốt hơn trong nước nóng. Mặc dù ít tan trong nước nhưng độ tan trong nước của paraben là vừa đủ để cho phép tạo được nồng độ có tác dụng. Khi tăng chiều dài chuỗi alkyl, độ tan trong nước giảm. Paraben hút ẩm và có hệ số phân bố dầu / nước cao. Bảng 1.1 tóm tắt một số tính chất vật lý và hóa học của paraben.

Trong thương mại, paraben được sản xuất bằng ester hóa acid phydroxybenzoic với một alcol thích hợp với sự có mặt của một chất xúc tác (ví dụ acid sulfuric đậm đặc hoặc acid p-toluenesulfonic). Trong môi trường acid thì paraben ổn định. Trong dung dịch kiềm, paraben được thủy phân thành acid phydroxybenzoic và alcol tương ứng. Nói chung, với sự gia tăng chiều dài chuỗi alkyl, tính kháng của dung dịch paraben đối với sự thủy phân tăng lên.

3

Methylparaben được báo cáo là bị thủy phân cho acid p-hydroxybenzoic trong nước, với thời gian bán hủy (t1/2) vài chục giờ đối với sự phân hủy sinh học, đến vài chục ngày đối với sự thủy phân phi sinh học [11]. Paraben đã được mô tả là dễ phân huỷ sinh học trong điều kiện hiếu khí, với khả năng phân huỷ sinh học khoảng 90% nhu cầu oxy lý thuyết (đối với methylparaben, ethylparaben và propylparaben) [11]. Tuy nhiên, González-Mariño và cộng sự (2011) lại cho rằng việc phân hủy sinh học bùn hoạt tính được thực hiện dễ hơn là các quá trình phi sinh học hoặc hấp phụ [18]. Các paraben đã nghiên cứu (methylparaben,

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

ethylparaben, propylparaben, butylparaben, isobutylparaben) gần như hoàn toàn phân hủy sinh học (99%) trong vòng dưới 5 ngày, với thời gian bán hủy không quá 3 ngày. Độ bền của các hợp chất tăng nhẹ với chiều dài của chuỗi alkyl và mức độ clo hóa. Thời gian bán hủy của dẫn chất halogen hóa của methylparaben lên đến 10 ngày [18].

Bảng 1. 1. Một số tính chất vật lý, hóa học 5 paraben bị cấm dùng trong mỹ phẩm.

Tên paraben

Alkyl 4-hydroxybenzoat

Isopropyl

Phenyl

Isobutyl

Benzyl

Pentyl

C10H12O3 180,22

C13H10O3 214,22

C11H14O3 194,25

C14H12O3 228,25

C12H16O3 208,25

Nhiệt độ nóng chảy/điểm đông (oC)

-

-

Độ tan trong nước ở 25oC (g/100ml)

-

Hệ số phân tán octanol/nước (log kow)

2,91

Công thức phân tử Khối lượng mol

110-112 0,01

3,2

3,4

3,56

3,8

Chlorin ở nồng độ thấp khi dùng để xử lý nước có thể phản ứng với paraben để tạo ra dẫn xuất clo [6]. Canosa và cộng sự (2006) quan sát thấy rằng ngay cả vài phút tiếp xúc giữa mỹ phẩm có chứa paraben (ví dụ: gel tắm) và nước máy có chlorin sẽ tạo thành các sản phẩm phụ có chứa clo và brom. Tỉ lệ phản ứng tăng theo nhiệt độ. Hiện tượng này là đáng báo động do sự ổn định cao của dẫn xuất diclo và tiềm ẩn tác dụng estrogen chưa được xác định rõ [6]. Hơn nữa, các dẫn xuất

4

clo có độc tính đáng kể đối với các sinh vật thủy sinh so với các hợp chất mẹ tương ứng.

1.1.2. Tác dụng kháng khuẩn của paraben và viêc̣ sử du ̣ng paraben trong thực tiễn sản xuất Các paraben có tác dụng chống lại nhiều loại vi khuẩn, nấm men và nấm mốc nên thường được sử dụng làm chất bảo quản. Cơ chế hoạt động của các paraben hiện vẫn chưa được xác định rõ. Paraben được cho là phá vỡ quá trình vận chuyển chất qua màng hoặc ức chế tổng hợp ADN và ARN hay một số enzym quan

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

trọng. Khả năng ức chế sự tăng trưởng vi khuẩn của paraben tăng lên cùng với sự gia tăng chiều dài của chuỗi alkyl. Tuy nhiên, cùng với sự gia tăng chiều dài của chuỗi alkyl, giá trị của hệ số phân tán octanol-nước tăng lên, dẫn đến giảm độ tan trong nước. Chính vì vậy để vừa đảm bảo hoạt tính kháng khuẩn lại vừa tan tốt, có thể thấy trong thực tế methylparaben kết hợp với propylparaben được sử dụng rộng rãi trong hoạt động bảo quản. Hoạt tính kháng khuẩn của paraben mạnh nhất với vi khuẩn Gram (+) và kém nhất đối với Pseudomonas [14].

Paraben có tính ổn định hóa học cao trong một khoảng biến thiên nhiệt độ

rộng và dải pH từ 3 đến 8 [14]. Do có tính trơ về mặt hóa học, nó ít khi phản ứng với các thành phần trong sản phẩm. Paraben không có mùi hay vị, không gây ra sự thay đổi trong tính đồng nhất và màu sắc của sản phẩm. Sự kết hợp của các tính chất này làm cho việc tìm kiếm chất bảo quản thay thế thỏa đáng cho paraben sẽ là tương đối khó khăn. Các loại mỹ phẩm không chứa paraben thường có giá thành đắt và thời hạn sử dụng ngắn. Một số chất bảo quản thông dụng khác bao gồm formaldehyd (dung dịch trong nước còn gọi là fooc-môn), quaternium-15, imidazolidinyl urê, diazolidinyl urê và dimethyloldimethyl hydantoin [54]. Nhưng các chất bảo quản này thường gây phản ứng dị ứng và một số gây ra những ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ, như formaldehyd và mối liên hệ nhân quả với ung thư [54]. Việc sử dụng các chất bảo quản tự nhiên đã được ủng hộ, bao gồm chiết xuất từ hạt nho (GSE) [39]. Thật không may, GSE có thể tương tác với các thuốc do khả năng ức chế CYP3A4, một enzym quan trọng liên quan đến sự chuyển

5

hóa của thuốc [39]. Các chất bảo quản tự nhiên khác bao gồm thymol, cinnamaldehyd, allyl isothiocyanat, acid citric, acid ascorbic và chiết xuất thảo mộc [39]. Các chất bảo quản tự nhiên này ức chế sự phát triển của vi sinh vật trong ống nghiệm, tuy nhiên một vài nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn trong các sản phẩm thực phẩm đã mang lại kết quả không rõ ràng [39]. Vì vậy hiệu quả, an toàn và độc tính của chúng cần được bảo đảm trước khi sử dụng rộng rãi.

Paraben từng được phân loại là hợp chất "thường được coi là an toàn" (GRAS) và được chấp thuận sử dụng trong thực phẩm bởi Cục quản lý thực phẩm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) và Liên minh châu Âu (EU). Paraben được sử dụng lần đầu tiên vào giữa những năm 1920 dưới dạng chất bảo quản trong dược phẩm.

Sau này chúng được sử dụng rộng rãi làm chất bảo quản, phổ biến nhất là trong mỹ phẩm, rồi đến dược phẩm, ngoài ra còn dùng trong các mặt hàng thực phẩm và các sản phẩm công nghiệp. Một nghiên cứu đã xác định paraben có trong 44 % mỹ phẩm được thử nghiệm [64]. Trong các sản phẩm chăm sóc cá nhân được thử nghiệm tại Hoa Kỳ, nồng độ methylparaben lên đến 1,0%, với son môi chứa nồng độ cao nhất từ 0,15% đến 1,0%. Các paraben khác được sử dụng ở nồng độ thấp hơn methylparaben. Methylparaben và propylparaben là những chất paraben được sử dụng phổ biến nhất trong các sản phẩm dược phẩm với nồng độ lên đến 20% [9].

Cả hai chất bảo quản này cũng được sử dụng trong các sản phẩm thực phẩm như mứt, thạch, chất độn và các lớp phủ với nồng độ lên đến 0,1% [39]. Trong mỹ phẩm, paraben được coi là thành phần phổ biến nhất, chỉ sau nước. Ước tính khác cho thấy butylparaben có trong 13% mỹ phẩm và các sản phẩm chăm sóc cá nhân trong khi với propylparaben và methylparaben con số này là 48% [40]. Thời kì chuyển giao thiên niên kỉ, khi đã có một số nghiên cứu đươ ̣c công bố cho thấy hoạt tính estrogen của paraben và khả năng có thể gây ung thư thì các nhà sản xuất đã thay đổi thành phần của các sản phẩm mỹ phẩm của họ bằng cách thay paraben bằng các hệ bảo quản khác và đưa ra các công thức được gọi là "không paraben".

Mă ̣t khác, theo báo cáo của Ủy ban đánh giá thành phầ n mỹ phẩ m [8] trên cơ sở dữ liệu của FDA, số lượng các công thức mỹ phẩm trong đó có sử du ̣ng paraben năm 2006 cao hơn 1,7 lần so với năm 1981. Cụ thể, việc sử dụng năm 1981 là 13.200 6

[32], trong khi năm 2006 nó đã lên đến 22.000 [8]. Tuy nhiên, hàm lượng paraben trong mỹ phẩm dường như giảm. Theo báo cáo tự nguyện nộp cho FDA năm 1981, nồng độ cho một paraben duy nhất lên đến 25% đối với methylparaben và propylparaben, 5% đối với butylparaben và 1% đối với ethylparaben. Hàm lươ ̣ng các paraben thông thường lên đến 1% [32]. Khoảng 14 năm sau, hàm lươ ̣ng paraben trong 215 sản phẩm thử nghiệm trên thị trường Đan Mạch dao động từ 0,01% đến 0,87% [48].

1.1.3. Sự hiện diện của paraben trong môi trường

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Việc sử dụng rộng rãi paraben trên toàn cầu đã dẫn đến sự xuất hiện của

chúng ở nhiều nơi trong môi trường. Paraben đã được tìm thấy trong các dòng chảy của nhà máy xử lý nước thải [11]. Do đó, các hợp chất này đã được xác định trong các dòng sông và các nguồn nước uống [11]. Paraben đã được phát hiện trong đất từ các cánh đồng nông nghiệp, có thể từ phương pháp tưới tiêu hoặc bón phân [11].

Bụi trong nhà cũng được tìm thấy chứa paraben [65]. Nồng độ paraben phát hiện trong không khí trong nhà lên đến 21 ng/m3 đối với methylparaben, 4,0 ng/m3 đối với ethylparaben và 3,2 ng/m3 đối với butylparaben [65]. Đáng ngạc nhiên là nồng độ paraben trong bụi cao hơn nhiều so với các chất paraben phát hiện trong bùn thải [65]. Mặc dù paraben được sử dụng thương mại có nguồn gốc tổng hợp, một số paraben được sinh ra từ các sinh vật sống, cụ thể là do thực vật và vi khuẩn, một chủng vi khuẩn biển thuộc chi Microbulbifer. Các loại cây như việt quất, cà rốt, ô liu, dâu tây và các loại khác tạo ra paraben (chủ yếu là methylparaben) giúp cho hoạt động kháng khuẩn của chúng [11]. Paraben có ở khắp mọi nơi và có thể nguồn ô nhiễm chính là các nhà máy xử lý nước thải. Mặc dù tỉ lệ loại bỏ paraben trong các công trình xử lý nước thải là cao (trung bình là 96,1-99,9%) [18] nhưng các chất gây ô nhiễm vẫn tồn tại trong nước thải (ở nồng độ lên đến 4000 ng/L) [86] dẫn đến rò rỉ vào môi trường. Tuy nhiên, các giá trị nồng độ quan sát thấy trong môi trường tự nhiên có vẻ như quá thấp để tạo ra các phản ứng phụ. Các nguồn chính mà con người tiếp xúc với paraben là các sản phẩm chăm sóc cá nhân và dược phẩm. Mức độ tiếp xúc được phản ánh qua việc thường xuyên phát hiện các hợp chất paraben trong nước tiểu, kể cả ở phụ nữ mang thai và trẻ em. Methylparaben và 7

propylparaben được phát hiện trong hầu hết các mẫu nước tiểu được phân tích (trong đó methylparaben xấp xỉ 100%, propylparaben trên 80%) [11]. Hơn nữa, các chất bảo quản đã được phát hiện trong huyết thanh, sữa mẹ, mô nhau thai, tinh dịch, đáng lưu ý nhất là phát hiện ở mô vú từ những bệnh nhân ung thư vú [3], [10]. Tuy nhiên, cần phải xem xét liệu nồng độ paraben mà chúng ta tiếp xúc đã đủ cao để gây ra một mối đe dọa đối với sức khoẻ con người hay chưa.

1.1.4. Tác động của paraben đối với cơ thể con người

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1.1.4.1. Dược động học của paraben Paraben có thể xâm nhập vào cơ thể người qua da và qua đường tiêm. Nồng

độ phơi nhiễm paraben trung bình hàng ngày ước tính khoảng 76 mg trong đó 50 mg từ mỹ phẩm và các sản phẩm chăm sóc cá nhân, 25 mg từ các sản phẩm dược phẩm, và 1 mg từ thực phẩm [54]. Vì độ tan trong nước thấp, các paraben dễ dàng xâm nhập qua lớp sừng của da, và sau đó được giữ lại trong các lớp biểu bì. Paraben dùng cho da được chuyển hóa bằng enzym carboxylesterase của tế bào sừng, ở mức độ thấp hơn nhiều so với gan và các chất chuyển hóa liên hợp được bài tiết qua nước tiểu và mật. Paraben đường uống hoặc tiêm tĩnh mạch được chuyển hóa bởi các enzym esterase trong ruột và gan [9].

Sản phẩm chính của quá trình thủy phân paraben là acid hydroxybenzoic

(pHBA). Các thử nghiệm trong phòng thí nghiệm trên chuột cho thấy trên 50% liều paraben không bị hấp thu sau khi dùng qua da [11]. Paraben uống hoặc tiêm dưới da chủ yếu được bài tiết qua nước tiểu, chủ yếu trong 24 giờ đầu. Tuy nhiên, 2% liều được áp dụng đã được giữ lại trong các mô, trong khi chưa tới 4% được thải trừ với phân [11]. Paraben và sản phẩm thủy phân của chúng được bài tiết qua nước tiểu dưới dạng tự do hoặc dạng liên hợp glycin, glucuronid và sulfat. Hiệu quả và mô hình thủy phân paraben trong cơ thể thay đổi đáng kể tùy thuộc vào độ dài chuỗi xoắn và mô [11]. Mặc dù da người chứa các chất đồng phân carboxylesterase, chúng có khả năng chuyển hóa paraben thành pHBA, nhưng mức độ thủy phân liên kế t ester có thể không đủ để thủy phân hoàn toàn paraben được sử dụng trong cơ thể. Thật thú vị, các nghiên cứu in vitro cho thấy paraben chịu sự thủy phân chậm

8

hơn nhiều trong da người so với gan người, gan chuột và da chuột [33]. Sau khi tiêm dưới da, một phần của methylparaben không bị thủy phân và do đó một lượng hợp chất chưa được chuyển hóa có thể vẫn còn có sẵn trong cơ thể [45]. Ngoài ra, tổn thương da có thể dẫn đến tăng tỉ lệ hấp thụ methylparaben. Pažoureková và các cộng sự (2013) ước tính rằng sau khi dùng nhũ tương có chứa paraben trên da bị tổn thương thì lươ ̣ng methylparaben không bị thủy phân tić h lũy trong cơ thể có thể lên tới 923 μg/kg/ngày [45]. Hơn nữa, phơi nhiễm paraben liên tục có thể dẫn đến sự tồn tại lâu dài và tích tụ [23].

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1.1.4.2. Mẫn cảm paraben

Ở những người có làn da bình thường, paraben hầu như không gây kích ứng.

Tuy nhiên, paraben có thể gây kích ứng da, viêm da và gây bệnh rosacea ở những người dị ứng paraben (chiếm một tỉ lệ nhỏ trong dân số) . Tỉ lệ báo cáo nhạy cảm đối với paraben dao động từ 0,5% đến 3,5% [39]. Tỉ lệ nhạy cảm này là thấp nhất trong số các chất bảo quản [54]. Ngoài ra, có các báo cáo về phản ứng dị ứng quá mẫn tức thời với paraben dẫn đến nổi mày đay, trong một trường hợp dẫn đến co thắt phế quản. Tuy nhiên, các phản ứng dị ứng tức thời là rất hiếm.

1.1.4.3. Paraben và hiện tượng lão hóa da

Đáng chú ý là methylparaben vốn được coi là chất ít có khả năng gây ra phản

ứng bất lợi đã được phát hiện thấy có ảnh hưởng không tốt đối với tế bào sừng của da người trong điều kiện kết hợp với tiếp xúc ánh sáng (UVB) [21]. Sự sản sinh các gốc tự do ôxy hóa (ROS) và nitric oxyd (NO) do UVB, cũng như hoạt hóa các nhân tố phiên mã nha ̣y cảm ôxy hóa (NFκB và AP-1) trong tế bào sừng đã được tăng lên đáng kể bởi methylparaben. Hơn nữa, sự gia tăng đáng kể peroxid hóa lipid của tế bào sừng HaCaT đã xảy ra sau khi kết hợp UVB và tiếp xúc methylparaben. Sự thay đổi của các yếu tố này có thể góp phần làm tăng sự chết tế bào [21]. Những phát hiện này chỉ ra tác động tiềm ẩn có hại đối với việc dùng các mỹ phẩm có chứa paraben trên da người, đặc biệt khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời.

9

1.1.4.4. Paraben tiềm ẩn khả năng gây rối loạn nội tiết và ung thư vú Các nghiên cứu trên người và động vật đã không chứng minh được rằng paraben có bất kỳ mức độ độc tính cấp tính nào theo các đường dùng khác nhau. Vì vậy, nhiều nghiên cứu kiểm tra độc tính paraben đã tập trung vào các tác động lâu dài của tiếp xúc mạn tính.

Hoạt tính estrogen của paraben lần đầu tiên được xác định vào năm 1998 và đã được xác nhận in vitro và in vivo [9], [49]. Paraben gắn với các thụ thể estrogen của con người, mặc dù có sự tương đồng kém hơn từ 10.000 đến 1.000.000 lần so

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

với estradiol [49]. Butylparaben và propylparaben có hoạt tính estrogen cao hơn methylparaben hoặc ethylparaben, nhưng butylparaben và propylparaben được phát hiện có nồng độ thấp hơn methylparaben ở người từ 10 đến 1000 lần [17]. Các tác dụng estrogen ở cơ thể đã được chứng minh bằng thử nghiệm tăng trưởng tử cung (uterine growth) ở chuột cống và chuột nhắt [9], [56]. Tuy nhiên, hiệu ứng này không ngăn được sự hình thành trứng thụ tinh, được coi là biện pháp nhạy nhất về độc tính của estrogen [56].

Mặc dù nhiều báo cáo đã xác nhận rằng paraben chịu sự thủy phân trong sinh

vật [11], chúng được tìm thấy là hoàn toàn ổn định trong các tế bào ung thư vú MCF7 đồng nhất. Sự ổn định của paraben có thể dẫn đến sự tích tụ của chúng trong mô khối u vú. Tuy nhiên, Barr và cộng sự (2012) đã không tìm thấy bất kỳ mối tương quan đáng kể giữa mức paraben trong mô vú và tuổi của bệnh nhân [3].

Paraben đã được tìm thấy trong các mẫu mô của khối u vú ở người. Giá trị trung bình của nồng độ tổng paraben trong mô khối u của vú tương ứng là 20,6 ± 4,2 ng/g (n = 20) và 9.794 ng/g (n = 9) đối với các mẫu từ Anh và Ấn Độ [10], [55]. Nồng độ phát hiện cao nhất trong khối u là 26.469 ng/g đối với butylparaben [55]. Darbre và cộng sự (2004) cho rằng sự hiện diện của paraben trong mô khối u vú có thể liên quan đến sự sinh ung thư [10]. Một số nhà khoa học cũng đã tranh luận về sự hiện diện của paraben trong mô ung thư vú và tác động có hại của paraben [17]. Dữ liệu về ung thư vú của paraben cho thấy không có hoặc có nồng độ thấp paraben ở một nhóm nhỏ các bệnh nhân và không có sự so sánh với các kiểm soát thông thường

10

[3], [10]. Cũng không thể nhận dạng được nguồn paraben ở 7/40 bệnh nhân được xác định có nhiễm paraben nhưng lại chưa bao giờ sử dụng mỹ phẩm. Cũng không có mối tương quan giữa nồng độ paraben và tuổi bệnh nhân (37-91 tuổi), thời gian cho bú sữa (0-23 tháng), vị trí khối u hoặc bản chất thụ thể estrogen khối u [3]. Do đó, không có mối liên hệ rõ ràng, rất khó để đưa ra mối quan hệ nhân quả giữa paraben và sự phát triển của ung thư vú.

Một hướng nghiên cứu khác là ảnh hưởng của paraben đối với hệ thống sinh sản nam giới, nhưng các phát hiện cũng mâu thuẫn [26]. Một nghiên cứu in vitro

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

cho thấy tinh trùng người không thể sống được khi tiếp xúc với paraben ở nồng độ 1 mg/mL [57]. Các nghiên cứu in vivo ở chuột cống lại cho thấy không có tác dụng gây độc tinh trùng ở nồng độ paraben 1% [43]. Các kết quả trái ngược nhau cũng được báo cáo ở chuột nhắt, một nghiên cứu cho thấy số lượng và hoạt động tinh trùng giảm xuống, còn một nghiên cứu khác cho thấy không có tác dụng phụ về sinh sản [26]. Ở những người đàn ông có vấn đề về khả năng sinh sản bao gồm số lượng tinh trùng thấp và khả năng di chuyển của tinh trùng giảm được khảo sát phơi nhiễm paraben bằng đo nồng độ paraben trong nước tiểu [11]. Không tìm thấy sự tương quan giữa lượng tinh trùng hoặc tính di động với nồng độ paraben.

Nồng độ paraben ở liều thấp khoảng 10 mg/kg/ngày gây stress ôxy hóa thông

qua peroxid hóa lipid [11], làm thay đổi trọng lượng tử cung chuột cái [11] và thay đổi việc sản sinh tinh trùng hàng ngày ở chuột đực [43]. Hơn nữa, việc tiếp xúc của chuột mẹ với isobutylparaben liều thấp có thể ảnh hưởng không tốt đến sự phát triển của con đực ở tuổi trưởng thành liên quan đến trạng thái lo âu và hành vi ở chuột [11].

Một vài nghiên cứu liên quan đến quần thể con người đã tìm ra mối liên hệ yếu giữa nồng độ paraben trong nước tiểu và gen chỉ thị stress oxy hóa, suy giảm ADN tinh trùng hay các hoóc môn tuyến giáp trong huyết thanh [11]. Mặc dù sự tương quan có thể là ngẫu nhiên, nhưng dường như không hợp lý để loại trừ giả thiết rằng paraben, thậm chí ở nồng độ thấp, ảnh hưởng đến sự cân bằng nội môi của cơ thể. Hơn nữa, paraben ở nồng độ phát hiện trong mô vú của con người đã

11

được tìm thấy gây ra sự gia tăng các tế bào trong ống nghiệm, đặc biệt khi đấ y là hỗn hợp các paraben [7]. Khi con người có thể liên tục tiếp xúc với một số paraben khác nhau, tác động bất lợi tiềm tàng của chất bảo quản là đáng nghi ngại. Rối loạn nội tiết ở môi trường thường là một ảnh hưởng của việc tiếp xúc không phải chỉvới một hợp chất đơn lẻ, mà thường là với một số chất ở nồng độ thấp. Mặc dù ở các nồng độ dưới mức tác dụng quan sát được (được gọi là nồng độ không quan sát được tác dụng - NOEC), một hỗn hợp các chất gây gián đoạn nội tiết (EDCs) có thể gây phản ứng estrogen [4]. Darbre (2009) đã kiểm tra tác động của paraben đối với

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

sự gia tăng tế bào ung thư vú MCF 7. Kết quả cho thấy paraben hỗn hợp ở nồng độ NOEC có thể tạo phản ứng estrogen bằng cách gia tăng sự tăng trưởng tế bào trong các tế bào ung thư vú MCF 7. Hơn nữa, phản ứng estrogen của hỗn hợp paraben có thể được tăng cường tại thời điểm nồng độ estradiol có mặt ở mức thấp. Trong cơ thể, điều này có thể xảy ra trong chu kỳ kinh nguyệt, trước tuổi dậy thì hoặc sau khi mãn kinh. Kim và cộng sự (2012) cho biết ảnh hưởng của sự kết hợp bisphenol A (BPA) và isobutylparaben (IBP). Kết quả cho thấy rằng BPA và IBP có thể có thêm một tiềm năng tăng estrogen thông qua con đường thụ thể trung gian estrogen [27].

Các hiệu ứng bổ sung và hiệp đồng có thể có của paraben và EDCs khác sẽ là vô cùng quan trọng, bởi vì con người thường là tiếp xúc với một hỗn hợp các chất chứ không phải là một hợp chất duy nhất.

Do đó, không thể bỏ qua vai trò có thể có của paraben trong quá trình gây

ung thư. Cần phải nghiên cứu thêm, bao gồm các nghiên cứu về cỡ mẫu lớn liên quan đến con người để đánh giá những tác động bất lợi của paraben. Ngoài ra, cần phải kiểm tra ảnh hưởng của paraben trên các mô nhạy cảm steroid khác, đặc biệt ở những người có vấ n đề về hệ miễn dịch và hệ thần kinh trung ương.

1.1.5. Một số phương pháp phân tích paraben trong mỹ phẩm Một số phương pháp phân tích để xác định paraben có thể được tìm thấy trong cuốn sách do Salvador và Chisvert biên soạn từ năm 1980 đến năm 2006 [2].

Wang và Liu tổng hợp và đánh giá cách xử lý mẫu và phương pháp phân tích dụng cụ được sử dụng trong việc xác định các chất bảo quản khác nhau trong mỹ phẩm

12

[44]. Trong những năm qua, các đánh giá khác nhau liên quan đến chủ đề này đã được công bố. Nhìn chung, sự phức tạp của các nền mẫu mỹ phẩm và các trạng thái thể chất khác biệt của chúng đã dẫn đến sự phát triển của rất nhiều các phương pháp phân tích khác nhau. Chiết pha rắn (SPE) rồi sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector UV (HPLC-UV) hoặc sắc kí khí với detector quang phổ khối (GC-MS) thường được sử dụng rộng rãi để xác định paraben trong mỹ phẩm.

Phương pháp chính thức để xác định paraben trong mỹ phẩm thì chỉ có phương pháp do EU thiết lập (Hình 1.2). Quy trình này phải qua nhiều khâu cho cả

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

định tính và định lượng paraben. Mặc dù vậy, trong quy trình định tính thì acid 4hydroxybenzoic, methylparaben, ethylparaben và benzylparaben là không tách biệt.

Ngoài ra sự đồng tan của nhiều chất bảo quản khác và phụ gia mỹ phẩm là có thể ảnh hưởng đến việc định lượng. Như vậy cần phải cải tiến phương pháp xử lý mẫu sao cho đơn giản, giảm thời gian xử lý, và để thu được các thông số phân tích tốt hơn. Mục tiêu chính là nhằm đơn giản hóa việc chuẩn bị mẫu khi không gă ̣p vấ n đề về nề n mẫu.

13

MẪU MỸ PHẨM (1g)

ĐỊNH TÍNH

ĐỊNH LƯỢNG

Acid hóa bằng 4 giọt HCl

Thêm 1 ml H2SO4 2M và 50 ml EtOH/H2O (10:1)

Chiết (40 ml Aceton, 60°C)

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Thêm 10 ml chuẩn nội

Điều chỉnh pH đến 3

Lắc (1 phút)

Lắc 1 phút

Làm lạnh

Đun nóng 60°C (5 phút)

Thêm 60 ml nước vào 20 ml dịch chiết mẫu

Làm nguội

Điều chỉnh pH đến 10

Thêm 1g CaCl2. 2H2O, lắc

Để trong tủ lạnh 1 giờ

Lọc

Chiết bằng 75 ml diethyl ether, lắc 1 phút

Lọc

Điều chỉnh pH của lớp nước tới 2 (HCl)Chiết bằng diethyl ether trong 10phút, lắc 1 phút

HPLC-UV

Cột Nucleosil C18 hoặc tương đương TLC

14

Hình 1. 2. Phương pháp phân tích chính thức do liên minh châu Âu ban hành để định tính và định lượng paraben trong mỹ phẩm.

1.1.6. Các phương pháp xử lý mẫu Một số lượng lớn các phương pháp dựa trên sự pha loañ g đơn giản và đồng nhất của dung môi pha loãng với mẫu thử đã được công bố. Tuy nhiên, nhiễu nền có thể xảy ra do không có sự loại bỏ nền mẫu trong các quy trình này. Pha loãng mẫu được thực hiện với dung môi, chẳng hạn như methanol [51], [62], ethanol [5], npropanol [25], ethyl acetate [30], hoặc thậm chí là nước [46]. Đồng nhất mẫu pha loãng thường được thực hiện bằng lắc xoáy, khuấy trộn hoặc siêu âm [5].

Trong hầu hết các trường hợp, pha loãng mẫu và đồng nhất hóa được thêm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

các bước tách bổ sung, ly tâm hoặc lọc, để loại bỏ một tỉ lệ lớn nền mẫu [62], [51].

Các quá trình khác, như đun nóng, có thể là cần thiết khi mẫu có chứa một lượng lớn các thành phần tan trong chất béo [25], [12]. Nói chung, thời gian chuẩn bị mẫu từ 3-75 phút. Các kỹ thuật phân tách như sắc kí lỏng (LC) [62], [25], [12], điện di mao quản (CE) [51], [46], [5] hoặc ít gặp hơn - sắc kí khí (GC) [30] là cần thiết để giúp tránh các nhiễu còn lại. Kỹ thuật điện hóa hầu như không được sử dụng cho mục đích này.

Một số vấn đề có thể gặp phải như ảnh hưởng nền mẫu với propylparaben

hoặc methylparaben [62], sự tuyến tính kém trong việc dựng đường chuẩn đối với methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben [51]. Phương pháp thêm chuẩn là cần thiết để dựng đường chuẩn trong nhiều trường hợp [5]. Ngoài ra, trực tiếp tiêm mẫu có thể làm giảm tuổi thọ của cột sắc kí. Ví dụ, Sottoffatori và cô ̣ng sự [12] đã báo cáo sự xuống cấp của cột trong sắc kí lỏng sau 100 lần tiêm. Do đó, cần sử dụng các phương pháp thích hợp để chiết xuất paraben trước khi tách sắc kí để loại trừ nhiễu nền. Một loạt các phương pháp chiết xuất đã được công bố trong những năm gần đây:chiế t pha rắ n (SPE), chiết xuất pha rắn với sợi (SPME), vi chiế t pha lỏng (LPME), chiết xuất siêu tới hạn (SFE) và chiết lỏng cao áp (PLE)… để cải thiện việc tách các nhiễu nền. Số lượng các ứng dụng của các phương pháp này đang ngày càng gia tăng. Tuy nhiên, một số vấn đề còn tồn tại, cụ thể là: (1) SFE có thể được sử dụng để xác định paraben trong mỹ phẩm mà không cần tiền xử lý mẫu, nhưng điều chỉnh độ phân cực và áp lực vận hành cao là cần thiết;

15

(2) Không thể được loại bỏ hoàn toàn việc tiền xử lý mẫu khi SPE và SPME, đặc biệt trong pha loãng mẫu là cần thiết, tuy nhiên lại làm giảm độ nhạy; (3) Mặc dù các chất hấp thụ liên kết hóa học silica như C18 hoặc C8 được dùng phổ biến trong xác định paraben, nhưng vấn đề chọn lọc sử dụng các pha cần được quan tâm; (4) Các mẫu mỹ phẩm có thể gây tắc nghẽn các cột SPE và rút ngắn tuổi thọ sợi trong SPME. Các cách tiền xử lý mẫu đơn giản như chiết lỏng lỏng - LLE thông thường

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

hiếm khi được sử dụng để xác định paraben trong mỹ phẩm, do mô ̣t số vấ n đề phát sinh [41], đặc biệt là sự hình thành nhũ tương ổn định. Garcia Jimenez và cô ̣ng sự [24] đã trộn mẫu với 1 mL HCl (1: 1) và 10 mL NaCl bão hòa, 50 mL dietyl ether được sử dụng làm pha hữu cơ để chiết paraben từ keo bọt và gel làm sạch. Sau ba lầ n chiế t liên tiế p, dịch chiết đã được xử lý qua các bước sau đây: (1) Làm sạch với NaCl bão hòa và dung dịch NaHCO3; (2) Làm khô bằng Na2SO4; (3) Lọc; (4) Bốc hơi đến khô; (5) Hòa tan với acetonitrile (ACN). Một cột sắc ký nguyên khối trong ống phân tić h dòng chảy (FI) phân tách MP, EP, PP và BP trong các dich ̣ chiết này.

Khả năng tự động hóa được coi là một ưu điể m, nhưng khả năng tách các paraben khác nhau đã bi ̣hạn chế bởi chiều dài cột.

1.1.6.1. Chiết pha rắn – kĩ thuật mới để chiết paraben từ mỹ phẩm Như đã đề cập ở trên, việc sử dụng chiế t lỏng lỏng đặt ra các vấn đề thực tế

khi phân tích các mẫu mỹ phẩm, đặc biệt là sự hình thành nhũ tương, các bước bổ sung và tốn nhiều dung môi hữu cơ [41]. Chiế t pha rắ n cải thiện các vấn đề này, do đó rất nhiều ứng dụng của chiế t pha rắ n để xác định paraben đã được công bố.

Một số bước tiền xử lý mẫu là bắt buộc trước SPE, vì các mẫu mỹ phẩm có thể làm tắc cột. Bao gồm các cách pha loãng, đồng nhất và ly tâm/lọc. Ví dụ, Han et al. [15] đã phân tích các loại kem, gel hoặc lotion có dầu, sau khi khuấy chúng với ethanol, lọc, rửa với hỗn hợp đệm natri tetraborat và ACN, pha loãng với nước và đuổi khí. Sau đó, việc chiết xuất paraben được thực hiện bằng cách sử dụng cột C8

16

trên một hệ thống sắc ký điện động micell SPE phân tích dòng phun (FIA-SPEMEKC). Mặc dù vậy, nó không ngăn cản sự hình thành các bong bóng trong quá trình rửa giải với loại mẫu này.

Vì các quy trình SPE phụ thuộc rất nhiều vào tính chất của chất hấp thụ, nên việc lựa chọn chấ t hấ p thu ̣ rất quan trọng đối với việc xác định paraben. Các phân tử paraben có pKa gần 8, viê ̣c điều chỉnh pH mẫu cho phép sử dụng các pha không phân cực và phân cực để xác định chúng. Các chất hấp thụ liên kết hoá học có chứa

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

silica, chẳng hạn như C18 hoặc C8 (pha đảo để chiết xuất chất không phân cực đến các hợp chất trung bình), là phổ biến nhất trong xác định paraben. Tuy nhiên, một số vấn đề chọn lọc liên quan đến việc sử dụng các pha này đã được nhấn mạnh [20], vì vậy có thể cần các quy trình bổ sung, như làm khô và pha loãng, lọc và siêu âm sau khi SPE để cải thiện việc tách sắc ký khi sử dụng HPLC.

Để tăng tính chọn lọc, các chất hấp thụ mới đã được đề xuất, như là các ống

nano cacbon (CNTs), graphene và các hạt từ được chức hóa. Các loại CNT đa vách (MWCNTs), với bề mặt có tính kị nước cao, tạo thuận lợi cho việc hấp thụ paraben theo cách chọn lọc, có thể tái tạo được khi sử dụng một pH thích hợp để tránh ion hóa paraben (trong trường hợp này là pH3). Các mẫu mỹ phẩm đã được pha loãng với nước để giảm thiểu sự chồng chéo lên nhau các tín hiệu sắc ký của MP, EP và các thành phần nền nhất định. Bước clean-up giữa các mẫu cho phép tái sử dụng cùng một cột lên đến 200 lần. Gần đây, một quy trình chiế t pha rắ n dựa trên graphene đã được phát triển cho phân tích MP, EP, PP và BP trong các mẫu mỹ phẩm, xác định bởi điê ̣n di mao quản. Độ thu hồi từ 62,6 đến 100,4% [42].

Các hạt nano từ tính bề mặt được chức hóa (NPs) cũng được sử dụng để chiết xuất ba paraben trong mẫu anion (pH> 8) từ kem và các mẫu kem đánh răng [13]. Các NPs Fe3O4 tổng hợp đã được phủ polyaniline pha tạp sunfat bằng phương pháp trùng hợp anilin với sự hiện diện của NPs và môi trường sulfuric. Các NPs điện tích dương có thể giữ lại paraben bằng tương tác tĩnh điện, nhưng phải cần đến tiền xử lý mẫu trước đó (siêu âm với methanol, pha loãng nước, ly tâm, lọc và pha loãng nước). Những NPs này có thể được sử dụng cho bốn lần chiết xuất liên tiếp 17

và tái tạo bởi ACN. Nhìn chung, quy trình SPE này được đặc trưng bởi thời gian chiết ngắn và không cần bước ly tâm hoặc lọc.

1.1.6.2. Phân tán pha rắn - Matrix solid-phase dispersion (MSPD) MSPD được sử dụng thành công cho các mẫu nhớt, rắn hoặc bán rắn, vì vậy nó rất phù hợp với các mẫu mỹ phẩm. Trong các quy trình MSPD, mẫu được phân tán lên chất hấp thụ rắn và sau đó được đưa vào một cột để phân tách. Phương thức SPE này đã được đề xuất để xác định paraben trong nhiều loại mỹ phẩm, chẳng hạn

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

như các sản phẩm lưu lại trên da và sản phẩm rửa trôi (ví dụ kem dưỡng thể, kem dưỡng ẩm, kem chống rạn da, kem bôi tay, make-up, kem chống nắng, thuốc khử mùi, dầu gội đầu, xà phòng nước và xà phòng rửa tay) [28]. Mẫu mỹ phẩm trộn với chất làm khô (Na2SO4) và một chất phân tán (Florisil, alumina trung tính, C18, silica gel hoặc cát) vào một cối thủy tinh. Tính chất của chất phân tán có tầm quan trọng đặc biệt đối với việc chiết xuất paraben. Hỗn hợp đã được chuyển vào một cột với Florisil, và hexane / axeton (1: 1) để lấy một dịch chiết 5 mL. Tạo dẫn xuất với anhydrit axetic và GC-MS được sử dụng để xác định. Đây là một quy trình nhanh gọn và chi phí thấ p có thể được thực hiện dễ dàng trong các phòng thí nghiệm thông thường.

1.1.6.3. Vi chiết xuất pha rắn ở dạng phân tán - Dispersive micro-solid-phase extraction (D-SPE)

Trong khi sử dụng cột có thể hạn chế áp dụng SPE cho mỹ phẩm thì các chế

độ SPE thay thế có thể tạo điều kiện cho việc phân tích loại mẫu này. D-SPE là một lựa chọn thú vị, vì nó chỉ đòi hỏi một lượng nhỏ chất hấp thụ rắn để khai thác. Nói chung, các vấn đề liên quan đến sự tắc nghẽn cột và sự chậm trễ của các quy trình vận hành được loại bỏ. Kỹ thuật này đã được sử dụng để xác định paraben trong dung dịch nước súc miệng và kem rửa tay, sử dụng các NPs từ tính chức hóa aminopropyl bằng GC với detector ion hoá ngọn lửa (GC-FID) [33]. Chỉ có 5 mg NPs được sử dụng cùng với 10 mL dung dịch mẫu. Mặc dù vậy, tiền xử lý mẫu là cần thiết. Mẫu nước súc miệng được pha loãng hai lần với nước và kem tay đã được

18

pha loãng 5000 lần, siêu âm trong 30 phút và ly tâm trước khi chiết. Các NPs từ tính được thu lại một cách dễ dàng ở đáy của ống hình nón bằng cách sử dụng từ trường bên ngoài. Độ thu hồi từ 87 đế n 100%.

1.1.6.4. Chiết xuất pha rắn với sợi - Solid-phase microextraction with fibers (SPME) SPME được phát triển như một giải pháp thay thế nhỏ gọn cho SPE, do chỉ sử dụng một lượng nhỏ chất hấp thụ. Cấu hình phổ biến nhất của SPME bao gồm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

các sợi silica nung chảy phủ polymer phù hợp như chất hấp thụ. Có thể sử dụng hai chế độ SPME với sợi (SPME trực tiếp và SPME không gian hơi). Do tính chất không bay hơi của paraben nên trong phần lớn các trường hợp thường sử dụng SPME trực tiếp, tuy nhiên SPME không gian hơi cũng đã được áp dụng cho xác định paraben trong mỹ phẩm. Việc xử lý làm giàu mẫu trước là cần thiết cho việc áp dụng SPME trực tiếp vào mỹ phẩm. Mặc dù SPME không gian hơi có thể thuận lợi do không tiếp xúc với mẫu nhưng các paraben phải được dẫn xuấ t hóa khi sử dụng chế độ này.

Như trong SPE, độ phân cực của paraben xác định loại lớp phủ được sử

dụng. Các sợi silica thương mại phủ polyacrylate (PA) thường được sử dụng để chiết xuất các hợp chất này ở dạng ion hóa. Đặc biệt, Tsai và cô ̣ng sự [59] đánh giá các sợi thương mại khác nhau được phủ PA polydimethylsiloxane (PDMS), polydimetylsiloxan / divinylbenzen (PDMS / DVB), carboxen / polydimetyl-siloxan (CAR / PDMS) và Carbowax / divinylbenzene (CW / DVB). Việc xử lý mẫu trước là cần thiết. Do đó, ethanol được sử dụng để pha loãng và cải thiện sự phân tán của mẫu (0,1g mẫu trong 2 mL ethanol) và cần phải pha loãng với nước. PA cho hiệu quả khai thác lớn nhất đối với paraben trong mỹ phẩm.

Các chất hấp thụ mới cũng đã được đề xuất để đạt được tính chọn lọc, độ lặp lại và hiệu suất chiết cao hơn. C iuvašovaitea và cô ̣ng sự [61] đã sử dụng một lớp polyaniline-polypyrrole lắng đọng bằng điện hóa cho việc chiết xuất MP, EP và PP trong các loại nước dưỡng trên mặt đã được pha loãng 10 lần trước khi phân tích.

19

Sự chọn lọc của lớp phủ là chìa khóa trong công việc này, ưu tiên là các hydrocarbon thơm trong sự có mặt alcol mạch ngắn và ceton. Lớp phủ này có hiệu quả để xác định paraben trong mỹ phẩm có chứa ethanol bằng GC-FID. Phương pháp thêm chuẩn là cần thiết để lập đường chuẩn.

Fei và cô ̣ng sự [16] đã sử dụng quá trình trùng hợp gây ra bởi tia cực tím của diacrylate poly (ethylene glycol) để có được các sợi thích hợp nhằ m xác định paraben không anion trong mỹ phẩm. Tính ổn định và khả năng tái lặp tốt, diện tích

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

bề mặt có nhiều nếp và hiệu suất chiết cao. Để tiề n xử lý mẫu, các loại mỹ phẩm khác nhau, chẳng hạn như kem chống nắng, kem/ nước thoa tay đã được pha loãng với dung dịch NaCl ở pH 5 (tỷ lệ pha loãng 1:25) và siêu âm trong 10 phút. Ở đây có thể sử dụng phương pháp tiền xử lý đơn giản nhờ đặc tính không tắc nghẽn của các sợi này.

Chỉ có một ứng dụng của SPME không gian hơi đã được công bố để xác định

paraben. Yang và cộng sự [60] kết hợp chiế t xuất siêu tới hạn, dẫn xuất hóa tại chỗ và SPME không gian hơi đối với GC-MS để xác định paraben và các chất chống oxy hoá polyphenolic trong mỹ phẩm. Silylate hóa với N, O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamid và sản phẩm sau đó được hấp phụ trên sợi PA.

1.1.6.5. Chiế t xuấ t hấ p thu ̣ trên thanh khuấ y - Stir-bar sorptive extraction (SBSE)

Trong SBSE, sơ ̣i hấ p thu ̣ được thay thế bằng một thanh khuấy được phủ vật

liệu hấp thu ̣. SBSE cho phép một lớp phủ lớn hơn nhiều so với SPME, vì vậy việc chiết tách chất phân tích được tăng cường. Quy triǹ h SBSE rất đơn giản. Mặc dù có những lợi thế như vâ ̣y nhưng chỉ có Melo và cô ̣ng sự [31] đã dùng SBSE để xác định MP, EP, PP và BP trong mỹ phẩm bằ ng LC-UV. Một thanh khuấy thương mại có phủ sẵn PDMS được đưa vào lọ được đun nóng ở 40°C với 50 mg mẫu trước đó pha loãng với 100 mL đệm phosphate (pH 5, paraben không ion hóa). Giải hấ p thu ̣ với 1 ml pha động (methanol / nước) trong 20 phút. Hơn 100 dich ̣ chiết xuất với thanh khuấy đã được xác nhận.

20

Như trong SPE và SPME, cầ n thiế t phải pha loãng mẫu đáng kể để tránh các hiệu ứng nề n gây ra bởi việc chiết tách các thành phần không phân cực và phân cực thấp từ mỹ phẩm. SBSE có giới hạn phát hiện (LOD) tương tự như thu được trong SPE hoặc SPME trong xác đinh ̣ paraben. Ngoài ra, do chỉ các thanh PDMS có khả năng thương mại hóa nên đã hạn chế viê ̣c sử dụng kỹ thuật này.

1.1.6.6. Kỹ thuật dựa trên vi chiế t pha lỏng - Liquid-phase microextractionbased techniques (LPME)

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sự thu go ̣n quá trình chiết dung môi cổ điển đã thúc đẩ y phát triển các

phương pháp khác nhau nhằm giảm thiểu việc sử dụng các dung môi độc hại và tích hợp lấy mẫu, chiết tách, tạo tiền chất và thậm chí ta ̣o dẫn xuất. Mặc dù sử dụng ha ̣n chế LPME cho các nề n mẫu phức tạp, một số cách tiếp cận của nó đã được sử dụng để xác định paraben trong các mẫu mỹ phẩm, chẳng hạn như vi chiế t đơn gio ̣t (single-drop microextraction - SDME), vi chiế t pha lỏng sơ ̣i rỗng (hollow-fiber liquid-phase microextraction - HF-LPME) và vi chiế t lỏng – lỏng phân tán (dispersive liquid-liquid microextraction - DLLME). Gầ n đây hơn là các ki ̃ thuâ ̣t vi chiế t gio ̣t hữu cơ đông đă ̣c (solidified floating organic-drop microextraction SFODME) hoặc vi chiế t nhũ tương có hỗ trơ ̣ siêu âm (ultrasound-assisted emulsification microextraction - USAEME), dựa trên nguyên tắc SDME và DLLME, cũng được đề xuất để xác định paraben trong mỹ phẩm.

SDME theo sau dẫn xuất hóa trong ống tiêm đã được báo cáo bởi Saraji và

Mirmahdieh [36] để xác định MP, EP, BP, PP và iso-propyl-paraben trong một số mỹ phẩm nề n nước (nước súc miệng, tẩy trang và gel tóc) bằ ng GC -MS. Với sự tiếp xúc trực tiếp của giọt (3 µL hexyl axetat) với mẫu, cần pha loãng đáng kể mẫu (lên đến 1200 lần). Khi độ nhạy được so sánh với các phương pháp khác (SPE-GCMS, SPME-GC-MS, SPME-IMS, HPLC-UV hoặc SFE-LC-MS) thì LOD đa ̣t đươ ̣c là thấp. Tuy nhiên, dựng đường chuẩ n theo phương pháp thêm chuẩn là rất cần thiết, do việc làm sạch mẫu bi ̣hạn chế. SDME không gian hơi phù hợp hơn cho các mẫu bẩn, chẳng hạn như mỹ phẩm, nhưng tính không bay hơi của paraben đã giới hạn khả năng ứng dụng của nó nên chưa được áp dụng.

21

SFODME đã được sử dụng để phân tích kem chống nắng, gel sau cạo râu và các loại kem bằng HPLC-UV [34]. Trong trường hợp này, 30 µL dung môi siêu phân tử có điểm nóng chảy là 10°C, các túi của axit decanoic và tetra-butyl amoni hydroxit, được đặt trên mẫu đã pha loañ g (5 mg mẫu trong 150 mL của một dung dịch nước chứa methanol và HCl). Sau khi khuấy, lọ mẫu được làm lạnh để làm rắn chất chiết xuất, dễ dàng tách ra bằng cách ly tâm. Sau đó, nó đã tan chảy trước khi đo. LOD tương tự hoặc thậm chí tốt hơn so với các phương pháp chiết xuất khác.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Tuy nhiên, các vấn đề liên quan đến sự mất ổn định gio ̣t đã được báo cáo.

Ngược lại với SDME, HF-LPME cho phép ổn định dung môi. Msagati et al.

[58] đề xuất xác định paraben trong các sản phẩm chăm sóc da, gel sửa chữa tóc và dung dịch xà phòng làm sạch bằng HPLC-UV sau HF-LPME. Trong trường hợp này, dung môi hữu cơ (di-n-hexyl ether) được cố định trong các lỗ rỗng của một sợi rỗng, bên trong có một dung dịch tiế p nhận (pH 11,8). Chiế t xuấ t trong 30 phút với 0,5 g mẫu pha loãng với 50 ml nước và chuẩ n từng paraben thêm vào trong phương pháp thêm chuẩ n. Việc sử dụng thể tić h dich ̣ chiết cao hơn so với SDME (lên đến 30 µL) và độ nhạy cao hơn là đáng chú ý.

DLLME sử dụng một mũi tiêm dung dịch chiết và dung môi phân tán vào

một mẫu nước để tạo thành một dung dịch vẩ n đu ̣c cho phép chuyể n khố i nhanh giữa các pha. Các quy triǹ h khác nhau dựa trên DLLME đã được phát triển để xác định paraben trong mỹ phẩm. Farajzadeh và cô ̣ng sự [37] đã sử dụng 20 µL octanol làm dung môi và 0,5 mL aceton làm chất phân tán để xác định paraben trong dung dịch súc miệng bằng GC-FID mà không cần ta ̣o dẫn xuất. Như trong các chế độ LPME khác, pha loãng mẫu là cần thiết (ví dụ: pha loãng 1: 100 với nước khử ion).

Một ống mao quản được sử dụng để lấy mẫu pha hữu cơ sau 10 phút ly tâm.

DLLME với dẫn xuất hóa đồng thời đã được sử dụng để xác định định lượng MP, EP, PP và BP trong các mẫu khác nhau, bao gồm mỹ phẩm bằ ng GC-FID. Isobutyl chloroformate được sử dụng làm thuốc thử ta ̣o dẫn xuất, ethanol làm chất phân tán và chloroform làm dung môi chiết xuất [47]. Một tiền xử lý đầy đủ cho các

22

mẫu mỹ phẩm là cần thiết, cụ thể là, chiế t xuấ t ethanol, lắ c xoáy siêu âm, ly tâm, dich ̣ lo ̣c phiá trên đem lọc pha loãng với ethanol.

Như đã đề cập, UAEME là một cách tiếp cận với DLLME sử dụng năng lượng siêu âm để thúc đẩy nhũ tương hóa. Yamini và cô ̣ng sự [63] đã sử dụng UAEME để xác định MP, EP và PP với 40 µL octanol bằng HPLC-UV. Dung môi được tiêm từ từ vào một lọ ly tâm chứa mẫu nước, sau đó được đặt bên trong bồn nước siêu âm và nhũ tương hình thành được ly tâm để tách pha hữu cơ. Nói chung,

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

DLLME cung cấp các quy trình nhanh hơn, nhạy hơn so với SDME và HF-LPME trực tiếp để xác định paraben. Tuy nhiên, pha loãng mẫu đáng kể và / hoặc làm sạch mẫu là cần thiết trong mọi trường hợp.

1.1.6.7. Chiết xuất siêu tới hạn - Chiết xuất siêu tới hạn (SPE) SFE đã được sử dụng để xác định paraben trong mỹ phẩm mà không cần

tiền xử lý mẫu [38], [52], [53]. Khi kỹ thuật này được xem xét để chiế t xuất paraben, nên tính tới độ phân cực paraben vì nó có thể ảnh hưởng đến việc chiết xuất với cacbon điôxit tinh khiết. Scalia và cô ̣ng sự [52] đã sử dụng SFE với CO2 siêu tới hạn trước khi xác định MP, EP, PP và BP bằng phương pháp HPLC. Các mẫu mỹ phẩm đã được cân trực tiếp trên một mảnh giấy lọc và sau đó chèn vào cell chiết xuất. Thời gian chiết xuất 7 phút và nhiệt độ 60 ° C đủ để thu hồi lượng paraben. Tuy nhiên, cần phải có áp lực vận hành cao (khoảng 27.500 kPa).

Bên cạnh áp lực gia tăng, bổ sung một số chất nền (ví dụ, methanol,

ethanol, ACN hoặc axit axetic) có thể làm tăng tính hòa tan của CO2, vì vậy nó phù hợp hơn cho paraben. Như vậy, Wang và cộng sự [53] đã sử dụng CO2 siêu tới hạn với 0.05% ACN để chiết MP, EP, PP và BP trước khi tách bằng điện di mao quản vùng. Với một lượng nhỏ ACN việc chiết xuất paraben thư c̣ hiê ̣n ở áp suất thấp (12,100 kPa).

Lee và cộng sự [38] đã sử dụng một hỗn hợp của mẫu mỹ phẩm và cát biển (nền trơ) để làm đầy lớp vỏ chiết. Bằng cách này, bề mặt mẫu tăng lên, cho phép chiết xuất paraben được thực hiện trong 5 phút ở chế độ tĩnh và 20 phút ở chế độ 23

động ở 14.000 kPa và 65 °C. LC-MS được sử dụng để xác định bốn paraben. SFE cũng đã được sử dụng trực tuyến với headspace SPME và GC-MS [60]. Các mẫu mỹ phẩm được chiết xuất với CO2 siêu tới hạn ở mức 13.840 kPa và 55°C trong thời gian chiết tĩnh 10 phút, sau đó là 15 phút chiết động.

1.1.6.8. Chiết lỏng cao áp - Pressurized liquid extraction (PLE) PLE sử dụng dung môi lỏng ở nhiệt độ và áp suất cao, do đó tăng khả năng

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

chiết xuất các chất phân tích. Sánchez-Prado và cô ̣ng sự [29] đã kế t hơ ̣p PLE với GC-MS bởi để chiế t xuất các chất bảo quản khác nhau (bao gồm paraben) trong kem, kem dưỡng da và các sản phẩm chăm sóc tóc. Viê ̣c chiết xuất được thực hiện trong 15 phút ở 120 °C và 1500 psi với hỗn hợp hexane và axeton (1: 1). Việc tách đồng thời một số thành phần không liên quan từ nền mỹ phẩm đã được giảm thiểu với một giai đoạn bổ sung. Lipid được hấp thụ bởi chất hấp thụ phân tán (Na2SO4 và Florisil). Có thể ta ̣o dẫn xuất acetyl hóa bằng cách thêm thuốc thử ta ̣o dẫn xuất vào tế bào PLE. Không có ảnh hưởng nền được quan sát thấy trong những điều kiện này.

Mặc dù sự phát triển của các chiến lược nhằm đơn giản hóa và đẩy nhanh

việc chuẩn bị mẫu cần được theo đuổi, điều này không phải lúc nào cũng khả thi do tính chất phức tạp của nền mẫu mỹ phẩm. Xu hướng tương lai trong lĩnh vực này sẽ tập trung vào việc phát triển các quy trình khai thác mới cho phép làm sạch các mẫu mỹ phẩm, do đó tránh nhiễu mà không mất độ nhạy. Các vật liệu nano có thể đóng góp vào việc đạt được các mục tiêu này, vì chúng có thể được sử dụng trong chiết xuất pha rắn (SPE), vi chiết và cả lọc. Các máy nano đã cho thấy khả năng trích xuất nhiều loại hợp chất vì bề mặt của chúng được phủ các phân tử chức năng, polyme hoặc các hạt nâng cao tính chọn lọc và hiệu quả làm giàu mẫu.

24

1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC 1.2.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào các yếu tố

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

đó. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được ghi lại nhờ máy ghi và bộ phận xử lý số liệu thành sắ c kí đồ với các thông tin về pic của chất phân tích.

Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc

ký khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [2].

1.2.2. Cấu tạo máy HPLC

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Bình chứa pha

động, bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký ở áp suất cao, hệ tiêm mẫu để đưa mẫu vào pha động, cột sắc ký, detector, hệ thu nhận và xử lý dữ liệu.

.

Hệ thống cấp dung môi

Hệ thu nhận xử lý dữ liệu (máy ghi, máy tính)

Bơm

Bộ phận tiêm mẫu

Detector

Cột sắc ký

Thải Hình 1. 3. Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC.

25

1.2.3. Detector và bộ phận ghi tín hiệu Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp. Tuỳ thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp.

- Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS).

- Detector huỳnh quang: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang.

- Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: Các cation,

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

anion, các hợp chất có tính dẫn điện…

- Detector khối phổ: thường được dùng để nhận biết và xác định các hợp chất

khi chúng rất khó tách bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ, chẳng hạn như các chất có khối lượng phân tử lớn, các hợp chất không bền nhiệt và các hợp chất phân cực.

Bộ phận ghi tín hiệu gồm có máy ghi, máy phân tích, máy tính.

1.2.4. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc kí 1.2.4.1. Thời gian lưu

Khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi píc đến detector được gọi

là thời gian lưu tR. Đối với những chất không lưu giữ thì tốc độ di chuyển của nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử pha động. Thời gian tM của chất không lưu gọi là thời gian chết.

1.2.4.2. Đô ̣ phân giải

Độ phân giải của cột đánh giá khả năng tách hai chất trong hỗn hợp trên cột sắc ký: Rs = trong đó:

=

RS : độ phân giải (tR)1, (tR)2: thời gian lưu chất 1, 2 W1, W2 : lần lượt là độ rộng pic 1, 2 ở các đáy pic

26

W1/2 1, W1/2 2 : lần lượt là độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic RS ≥ 1,5 thì 2 pic coi như tách được hoàn toàn.

1.2.4.5. Tính đối xứng của píc sắc kí - Hệ số bất đối: AF =

b a

b: nửa chiều rộng phía sau píc. a: nửa chiều rộng phía trước píc a+b 2a

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

- Hệ số kéo đuôi: As =

1.2.4.6. Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết

Cột sắc kí được coi là có N lớp mỏng, ở mỗi lớp, sự phân bố chất tan vào hai

pha được coi là đạt đến trạng thái cân bằng. Những lớp mỏng này được gọi là đĩa lý thuyết.

Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện

sắc kí nhất định. Cột có số đĩa lý thuyết lớn sẽ có hiệu lực cao, khi đó độ doãng píc nhỏ.

1.2.5. Ứng dụng HPLC

Sắc kí nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính: định tính, định

lượng và điều chế.

1.2.5.1. Định tính

Người ta có thể dùng HPLC để định tính bằng một số cách sau [2]: - So sánh thời gian lưu của các chất phân tích trong dung dịch thử với thời gian lưu của chất chuẩn chạy cùng điều kiện sắcký.

- So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã thêm chuẩn đối chiếu.

- So sánh phổ UV-Vis (chồng phổ) giữa phổ mẫu thử với phổ chất đối chiếu bằng DAD thông qua hệ sốMatch.

27

- Có thể kết nối HPLC – phổ IR hoặc HPLC – MS định tính dựa vào nhóm chức (IR) hoặc số khối (MS).

1.2.5.2. Phân tích định lượng Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc [2]: nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.

Có 4 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký:

➢ Phương pháp chuẩn ngoại

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

➢ Phương pháp chuẩn nội

➢ Phuơng pháp thêm chuẩn

➢ Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Trong luận văn này phương pháp chuẩn ngoại được chọn sử dụng. Đây là

phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành trong cùng điều kiện. So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử.

Có thể sử dụng chuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm.

❖ Chuẩn hóa 1 điểm

Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử. Tính nồng độ

của mẫu thử theo công thức:

CX =CS ( trong đó:

)

CX: nồng độ chấtthử CS: nồng độ chất chuẩn SX: diện tích (chiều cao) của pic mẫu thử SS: diện tích (chiều cao) của pic mẫu chuẩn

❖ Chuẩn hóa nhiều điểm

28

Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu được là diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn. Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) pic với nồng độ của chất chuẩn (C). Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định. Có thể tính theo 2 cách: - Áp dữ kiện diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy ra được nồng độ của nó.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

- Xây dựng đường hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) pic với nồng độ chất cần xác định.

S=axC+b

S: Diện tích pic

a: Độ dốc của đường chuẩn

b: Giao điểm của đường chuẩn với trục tung C: Nồng độ của chất thử

Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ chất thử: C = (S-b)/a

Chú ý: Độ lớn của diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu thử phải nằm trong

khoảng nồng độ tuyến tính của đường chuẩn.

1.2.6. Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector) Detector mảng diod (DAD) là một loại detector hấp thụ UV – Vis, được dùng

phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV – Vis (trong khoảng 190 – 800 nm) của các chất phân tích. Một chùm sáng có phổ rộng đi qua mẫu, sau đó được tách ra thành các bước sóng đơn. Detector có mảng diod để nhận bức xạ đã tán sắc từ một cách tử. Mỗi diod nhạy với một bước sóng nhất định, do đó detector DAD cho phép đo nhiều bước sóng khác nhau cùng một lúc. Thông thường, chỉ có một hoặc hai bước sóng được theo dõi trong quá trình chạy sắc ký. Phổ DAD của các pic có thể cung cấp thông tin về độ tinh khiết của pic.

29

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 1. 4. Cấu tạo detector mảng diod (DAD).

Quang phổ và sắc ký đồ có thể được biểu thị trên màn hình nhờ phần mềm

của hệ thống xử lý tín hiệu bằng máy tính. Có thể gọi DAD là detector sóng quét bên cạnh detector đo ở bước sóng cố định hoặc thay đổi. Mặt khác, hệ thống này có thể cho đồ thị 3D: độ hấp thụ, bước sóng và thời gian.

Ứng dụng: Đầu dò DAD giúp lựa chọn bước sóng phù hợp cho phân tích, có

khả năng vẽ phổ UV – Vis của pic chuẩn và pic thử rồi chồng hai phổ với nhau để thấy sự giống nhau về dạng phổ thông qua hệ số Match.

Khi hệ số match xấp xỉ 1 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hoàn toàn. Hệ

số match trên 0,90 thì chỉ ra hai phổ tương tự. Hệ số match càng gần 1 thì sự tương tự của hai phổ càng cao. Hệ số match dưới 0,90 chỉ ra hai phổ khác nhau.

30

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 5 paraben trong danh mục các chất không được dùng trong mỹ phẩm bao gồm: Isopropylparaben (IPP), Phenylparaben (PheP), Benzylparaben (BzP), Isibutylparaben (IBP), Pentylparaben (PeP).

Bảng 2. 1. Các mẫu nền được sử dụng để xác định phương pháp phân tích.

1

2

Nơi sản xuất

Tên mẫu

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

STT

Thành phần

Dầu rửa mặt, tẩy trang

Kracie home products,

Không có chất bảo

dạng bọt 2 trong 1 Naive

Ltd., Nhật Bản

quản nhóm paraben

Nước súc miệng Colgate Plax peppermint fresh

Thái Lan

Không có chất bảo quản nhóm paraben

Thông tin về các mẫu mỹ phẩm trên thị trường dùng để xác định sự có mặt

của 5 paraben bị cấm xem chi tiết trong Phụ lục1.

2.2.THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 2.2.1. Thiết bị và dụngcụ

Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2017 đến tháng 2/2018 tại Khoa Kiểm

nghiệm Mỹ phẩm - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương với các thiết bị được định kỳ hiệu chuẩn đạt yêu cầu ISO/IEC 17025.

- Máy sắc kí lỏng Shimadzu LC - 2030C 3D (L21455502327) gồm module

điều khiển, bơm gradient 4 kênh, bộ tiêm mẫu tự động, detector UV - UV 2600, buồng điều nhiệt, tích hợp đuổi khí.

- Cân phân tích chính xác tới 0,1 mg.

- Máy lắc siêu âm.

- Dụng cụ thủy tinh: Bình định mức, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh.

2.2.2. Dung môi và hóa chất - Chất chuẩn IPP (Canada) số lô: 2-PLL-65-3, HL: 98%.

- Chất chuẩn PheP (Nhật) số lô: PEJFB-LM, HL: 99,0%.

31

- Chất chuẩn BzP (Canada) số lô:4-JTN-11-1, HL: 98%.

- Chất chuẩn IBP(Canada) số lô:3-SCC-165-1, HL: 98%.

- Chất chuẩn PeP (Canada) số lô:10-RCD-146-5, HL: 97%.

- Methanol HPLC (Merck).

- Acetonitril HPLC (Merck).

- Nước tinh khiết (DĐVN IV).

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU • Xây dựng phương pháp phát hiện 5 paraben cấm: IPP, PheP, BzP, IBP, PeP có mặt trái phép trong mỹ phẩm với ba quy trình: - Quy trình xử lý mẫu;

- Quy trình phân tích, phát hiện 3 paraben cấm IPP, PheP, BzP bằng HPLC; - Quy trình phân tích, phát hiện 2 paraben cấm IBP, PeP bằng HPLC. • Đánh giá phương pháp đã xây dựng: - Tính đặc hiệu;

- Độ chính xác của phương pháp (gồm độ đúng và độ lặp lại); - Khoảng tuyến tính;

- Giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện.

• Áp dụng phương pháp đã xây dựng để phát hiện 5 paraben cấm: IPP,

PheP, BzP, IBP và PeP trong một số chế phẩm mỹ phẩm đang lưu hành trên thị trường.

2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Sử dụng là 2 mẫu đại diện cho các nhóm sản phẩm: sữa rửa mặt và nước súc miệng để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích với HPLC. Tiến hành thực nghiệm để tìm ra điều kiện sắc kí thích hợp, sau đó xử lý các kết quả thu được bằng thuật toán thống kê.

❖ Xây dựng quy trình xử lý mẫu: Chọn dung môi và phương pháp chiết sao cho chiết được hoàn toàn chất phân tích từ nền mẫu, loại bỏ tối đa ảnh hưởng của nền mẫu, chất phân tích bên

32

trong môi trường pha mẫu (dựa vào 3 yếu tố: tính tan của chất phân tích, đặc điểm nền mẫu, phương pháp phân tích).

❖ Lựa chọn điều kiện sắc kí phù hợp: Tiến hành khảo sát chọn cột sắc kí, nhiệt độ cột, pha động, tốc độ dòng, bước sóng phân tích với detector PDA, thể tích tiêm mẫu. Định tính bằng so sánh thời gian lưu, độ tinh khiết píc và chồng phổ UV-VIS, so sánh hệ số tương đương của píc nghi ngờ thu được từ mẫu thử với píc thu được từ mẫu chuẩn. Định lượng bằng

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

cách so sánh diện tích hoặc chiều cao píc thu được từ mẫu thử với mẫu chuẩn.

Cách tiến hành:Tiêm riêng biệt dung dịch thử, dung dịch chuẩn vào hệ thống

sắc kí lỏng sử dụng các điều kiện ở trên. Tiến hành sắc kí khoảng 40-60 phút. Ghi lại sắc kí đồ.

Cách đánh giá kết quả:

- Dựa vào thời gian lưu: thời gian lưu của píc thu được từ dung dịch thử

phải giống với thời gian lưu của píc thu được từ dung dịch chuẩn.

- So sánh phổ UV-VIS của píc thu được từ dung dịch thử có thời gian lưu

tương ứng với píc thu được từ dung dịch chuẩn và hệ số chồng phổ của các píc này phải đạt từ 0,99 trở lên.

❖ Độ đặc hiệu:

Tiến hành sắc kí các loại mẫu: mẫu nền (mẫu mỹ phẩm không có chất cần

phân tích); mẫu chuẩn; mẫu tự tạo (mẫu mỹ phẩm không có chất cần phân tích đã được cho thêm chất chuẩn cần phân tích và được chuẩn bị theo quy trình) và mẫu thử được chuẩn bị theo quy trình.

Yêu cầu: Trên sắc kí đồ của mẫu thử/mẫu tự tạo: píc của chất cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi các píc khác (nếu có trong nền mẫu), píc của chất cần phân tích có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với píc của chất chuẩn thu được từ mẫu chuẩn. Sắc kí đồ của mẫu trắng, dung dịch mẫu nền không xuất hiện píc ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn.

Nếu có đáp ứng píc phải không quá 1,0% so với đáp ứng píc của mẫu chuẩn. Píc của chất cần phân tích trong sắc kí đồ dung dịch thử phải tinh khiết. Hệ số chồng

33

phổ UV-VIS của píc hoạt chất cần phân tích thu được trong sắc kí đồ của dung dịch thử/tự tạo với píc tương ứng trong sắc kí đồ dung dịch chuẩn phải đạt từ 0,99 trở lên.

❖ Khoảng nồng độ tuyến tính: Tiến hành sắc kí các dung dịch chuẩn (5 dung dịch). Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng píc thu được trên các sắc kí đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu. Yêu

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

cầu: Hệ số tương quan (r) phải ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995). Trường hợp r < 0,997 phải có sự giải thích phù hợp.

❖ Độ đúng:

Xác định trên các mẫu tự tạo. Chuẩn bị 03 loại mẫu tự tạo bằng cách thêm

chính xác một lượng chất chuẩn chất cần phân tích vào các nền mẫu không có chất cần phân tích. Với phép thử định lượng, lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ. Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập. Tính kết quả thu hồi theo dung dịch chuẩn hoặc phương trình hồi quy tuyến tính. Tính lượng thu hồi theo công thức:

Lượng chất phân tích tìm lại

Tỉ lệ thu hồi (%) =

Lượng chất chuẩn thêm vào

x100

Tham khảo hướng dẫn của ICH, ASEAN và AOAC, yêu cầu với phép thử

định lượng: Tỉ lệ thu hồi 95,0-105,0% và RSD của tỉ lệ thu hồi không quá 2,0% ở mỗi mức nồng độ.

❖ Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): Có thể tiến hành theo cách pha loãng hoặc dựa vào đường tuyến tính và độ lệch chuẩn của đáp ứng. Giá trị LOD = (3,3 x δ)/a, trong đó: δ: Độ lệch chuẩn đáp ứng của mẫu nền (placebo), a: Hệ số góc của đường hồi quy tuyến tính (y = ax +b) giữa nồng độ và đáp ứng píc của chất cần phân tích. LOQ = 3,3 x LOD (kl/tt).

34

2.5. XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM Các kết quả thực nghiệm được tính toán và xử lý thống kê trên Microsoft Excel 2003với các hàm thống kê thông dụng như: - Hàm tính trung bình cộng AVARAGE.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

- Hàm tính độ lệch chuẩn STDEV.

35

CHƯƠNG 3

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. XỬ LÝ MẪU 3.1.1. Điều kiện xử lý mẫu Qua tổng quan tài liệu cho thấy methanol là dung môi được sử dụng nhiều nhất trong việc chiết xuất paraben từ các nền mẫu [19]. W. Gao, C. Legido-Quigley

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

cũng đã đưa ra kết quả nghiên cứu khi so sánh hiệu quả chiết xuất 4 paraben (methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben) bằng các tỉ lệ methanol: nước khác nhau (60:40, 70:30, 80:20) trong báo cáo vào năm 2011 khi phân tích chất bảo quản trong kem mỹ phẩm bằng phương pháp HPLC [62]. Kết quả cho thấy với sự gia tăng hàm lượng methanol, chiều cao píc của các thành phần không thay đổi. Methanol cũng là dung môi phổ biến, dễ kiếm, vì vậy methanol đã được lựa chọn làm dung môi chiết mẫu.

3.1.2. Cách chuẩn bị mẫu 3.1.2.1. Chuẩn bị mẫu thử

Cân chính xác khoảng 0,5 g chế phẩm, phân tán mẫu trong khoảng 25 ml

methanol, cho vào bình định mức 50 ml, lắc siêu âm 10 phút sau đó pha loañ g tới đinh ̣ mức bằ ng cùng dung môi. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

3.1.2.2. Chuẩn bị mẫu chuẩn

- Cân chính xác khoảng 20,0 mg từng chất chuẩn isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben vào các bình định mức 100,0 ml , thêm 30 ml methanol, lắc cho tan. Thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 2,0 ml từng dung dịch trên cùng vào mô ̣t biǹ h đinh ̣ mức 50,0 ml, pha loãng bằng methanol. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

- Dung dịch chuẩn đánh giá (QC): cân chính xác khoảng 0,5 g chế phẩm vào bình định mức 50 ml, thêm một lượng mẫu chuẩn sao cho đạt nồng độ 100-120%

36

của quy trình phân tích và xử lý giống như mẫu thử (Dùng trong quy trình thường quy để kiểm tra mẫu).

3.2. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 3.2.1. Điều kiện sắc kí Qua tham khảo tài liê ̣u đươ ̣c biế t các paraben có thể đươ ̣c phân tić h trên HPLC pha đảo cô ̣t C18, pha đô ̣ng Acetonitril : Nước. Chúng tôi đã tiế n hành thử nghiê ̣m và lựa cho ̣n đươ ̣c điề u kiê ̣n tố i ưu như sau:

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

- Cột Luna C18, (250 x 4,6 mm), 5 µm có sử dụng tiền cột thép không gỉ (3 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C18 (5 µm); - Nhiệt độ cột: 40oC;

- Pha động: Acetonitril - nước (40:60); - Tốc độ dòng: 1,0 ml/ phút;

- Bước sóng phát hiện: 254 nm; - Thể tích tiêm: 10 µl.

Mă ̣c dù trong đề tài này chỉ tiế n hành phân tích năm paraben cấ m IPP, IBP,

PheP, BzP và PeP. Tuy nhiên cũng phải quan tâm đế n thực tế trong chế phẩ m có thể sử du ̣ng các chấ t bảo quản thuô ̣c nhóm paraben mà không bi ̣cấ m. Đă ̣c biê ̣t là PP có thời gian lưu rấ t gầ n với PP, BP có thời gian lưu rấ t gầ n với IBP và BzP…Nế u điề u kiê ̣n sắ c kí chỉ tâ ̣p trung vào tố i ưu năm paraben bi ̣ cấ m mà không quan tâm đế n bố n paraben trong nhóm có giới ha ̣n sử du ̣ng thì có thể xảy ra viê ̣c IPP có thời gian lưu trùng với PP, IBP có thời gian lưu trùng với BP. Thâ ̣m chí ba pic IBP, BP và BzP trùng làm mô ̣t. Mă ̣t khác các chấ t trong nhóm paraben có hình dáng phổ rấ t giố ng nhau, với các điể m cực đa ̣i và cực tiể u gầ n như nhau thì khi đó chồ ng phổ cũng sẽ cho hê ̣ số tương đồ ng rấ t cao. Viê ̣c kế t luâ ̣n nhầ m lẫn giữa paraben có giới ha ̣n và paraben cấ m sẽ kéo theo nhiề u vấ n đề hê ̣ lu ̣y. Vì vâ ̣y khi thực hiê ̣n đề tài này, trong quá trình khảo sát điề u kiê ̣n sắ c ki,́ tác giả đã luôn quan tâm cả chuẩ n hỗn hơ ̣p 5 paraben và chuẩ n hỗn hơ ̣p 9 paraben.

37

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 3. 1. Sắc kí đồ phân tích hỗn hợp chuẩn 5 paraben bi ̣ cấ m (trái) và hỗn hợp chuẩn 9 paraben (phải) với pha động ACN - nước (40 : 60).

Với điều kiện phân tích như trên thì 45 phút cả 5 píc được rửa giải, các píc

IPP, PheP, IBP, BzP, PeP đều cân đối (hệ số kéo đuôi xấp xỉ 1,1) và các paraben tách tốt (độ phân giải xấp xỉ 3,0). Cùng điều kiện như vậy mà thay đổi tỉ lệ pha động acetonitril - nước (35 : 65) thì các píc cân đối hơn (hệ số kéo đuôi xấp xỉ 1,0) nhưng thời gian phân tích lại kéo dài hơn đáng kể (BzP ra ở 45 phút và 75 phút mới xuất hiện píc PeP) như ở hình 3.3. Còn ở tỉ lê ̣ pha động acetonitril - nước (45 : 55) thì chỉ 28 phút là rửa giải hế t cả 5 chấ t, nhưng BzP và BP – mô ̣t paraben có giới ha ̣n sử du ̣ng trong số 9 paraben - trùng làm mô ̣t, cùng ra ở thời gian lưu 17 phút. Như vâ ̣y tỉ lê ̣ pha động acetonitril - nước (40 : 60) là tỉ lê ̣ tố i ưu đươ ̣c lựa cho ̣n.

Các paraben có bước sóng hấ p thu ̣ cực đa ̣i gầ n giố ng nhau 254, 255, 256, 257 nm. Phenylparben có cực đa ̣i hấ p thu ̣ là 261 nm. Chúng tôi lựa cho ̣n detector diod mảng (DAD) với bước sóng 254 nm để phát hiê ̣n các paraben. DAD cho phép quét phổ UV-VIS trong mô ̣t khoảng bước sóng, như vâ ̣y có thể quan sát hiǹ h da ̣ng phổ của chấ t nghi ngờ so với chuẩ n. Nế u thời gian lưu của thử và chuẩ n gầ n nhau, trong trường hơ ̣p đó người phân tić h có thể chồ ng phổ để củng cố cho kế t luâ ̣n của mình.

38

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

a)

b)

c)

Hình 3. 2. Sắc kí đồ phân tích hỗn hợp chuẩn IPP, PheP, BzP (a), hỗn hợp chuẩn IBP và PeP (b) và hỗn hợp 9 paraben (c) trên cột Luna với pha động ACN - nước (35 : 65).

39

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 3. 3. Sắc kí đồ phân tích hỗn hợp chuẩn 9 paraben trên cột Luna với pha động ACN - nước (45 : 55).

Đánh giá phương pháp định lượng các nhóm paraben nghiên cứu trên điều

kiện sắc kí đã chọn bao gồm các nội dung: độ thích hợp của hệ thống sắc kí, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng.

3.2.2. Thẩm định quy trình

3.2.2.1. Đánh giá độ thích hợp hệ thống

Tiêm 6 lần dung dịch đối chiếu hỗn hợp có nồng độ từng paraben khoảng 8

µg/ml vào hệ thống sắc kí, ghi lại sắc kí đồ, kết quả thu được như ở bảng 3.1.

Bảng 3. 1. Độ thích hợp của hệ thống sắc kí của IPP, PheP và BzP TT

Thời gian lưu (phút)

Diện tích píc (mAU.s)

IPP

PheP

BzP

IPP

PheP

BzP

1

13,870

21,156

26,252

499897

447480

409679

2

13,870

21,150

26,250

499215

445136

409923

3

13,873

21,167

26,267

498638

444797

409357

4

13,874

21,172

26,281

501902

448175

411805

5

13,879

21,171

26,278

503341

449656

412951

40

6

13,870

21,149

13,8722

21,1610

0,03

Số đĩa lý thuyết Hệ số đối xứng

Trung bình RSD %

499924

446507

409856

26,2610

500486,2

446958,5

410595,2

0,05

0,06

0,36

0,42

0,35

12670

13014

13656

1,16

1,12

1,10

-

11,80

6,22

Độ phân giải

26,241

Bảng 3. 2. Độ thích hợp của hệ thống sắc kí của IBP và PeP STT

Thời gian lưu (phút) PeP

IBP

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

IBP

Diện tích píc (mAU.s)

1 2 3 4 5 6 Trung bình RSD %

23,795 23,641 23,638 23,673 23,636 23,627 23,6683

43,647 43,323 43,327 43,378 43,317 43,310 43,3837

0,27

0,30

Số đĩa lý thuyết

14178

14181

Hệ số đối xứng Độ phân giải

1,07 -

1,06 17,51

385092 387541 384997 385518 386248 385468 385810,7 0,25

PeP 361498 363715 361505 362442 362858 361772 362298,3 0,24

Vậy hệ thống đạt yêu cầu về độ thích hợp hệ thống: Độ lặp lại tốt với RSD

của thời gian lưu nhỏ hơn 1,0% và diện tích píc nhỏ hơn 2,0%; số đĩa lý thuyết trên 2500, hệ số bất đối nhỏ hơn 2,0 và độ phân giải trên 1,5. Do vậy đáp ứng yêu cầu phân tích cho cả 5 paraben IPP, PheP, BzP, IBP và PeP. 3.2.2.2. Độ đặc hiệu Tiến hành sắc kí theo điều kiện đã chọn các mẫu sau đây và kết quả được thể hiện ở hình 3.1 (mẫu sữa rửa mặt), hình 3.2 (mẫu nước súc miệng).

- Dung dịch mẫu placebo: Cân chính xác khoảng 0,5 g chế phẩm, phân tán mẫu trong khoảng 25 ml methanol, cho vào bình định mức 50 ml, lắc siêu âm 10 phút sau đó pha loañ g tới đinh ̣ mức bằ ng cùng dung môi. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

41

- Dung dịch mẫu tự tạo hoặc mẫu thử, dung dịch chuẩn được xử lý theo mục 3.1.2.1 và 3.1.2.2.

c)

b)

d)

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

a)

Hình 3. 4. Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với 3 paraben IPP, PheP, BzP trên nền mẫu sữa rửa mặt so với mẫu chuẩn. a) Dung môi

b) Placebo mẫu sữa rửa mặt

c) Chuẩn hỗn hợp IPP, PheP, BzP

d) Mẫu tự tạo nền sữa rửa mặt

42

c)

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

a)

b)

d)

Hình 3. 5. Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với 3 paraben nghiên cứu trên nền mẫu nước súc miệng so với mẫu chuẩn.

a) Dung môi

b) Placebo mẫu nước súc miệng

c) Chuẩn hỗn hợp IPP, PheP, BzP

d) Mẫu tự tạo nền nước súc miệng

43

a)

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

c)

b)

d)

Hình 3. 6. Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với 2 paraben IBP và PeP trên nền mẫu sữa rửa mặt so với mẫu chuẩn. a) Dung môi

b) Placebo sữa rửa mặt

c) Mẫu tự tạo nền sữa rửa mặt

d) Dung dịch chuẩn hỗn hợp IBP và PeP

44

a)

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

c)

b)

d)

Hình 3. 7. Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với 2 paraben IBP và PeP trên nền mẫu nước súc miệng so với mẫu chuẩn. a) Dung môi

b) Placebo mẫu nước súc miệng

c) Chuẩn hỗn hợp IBP, PeP

d) Mẫu tự tạo nền nước súc miệng

Kết quả thu được như ở hình 3.6 và 3.7 cho thấy: Trên sắc kí đồ mẫu placebo

không xuất hiện píc ở thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu bất kỳ chất nào trong số 5 paraben IPP, PheP, BzP, IBP và PeP. Trên sắc kí đồ của dung dịch mẫu tự tạo cho các píc chiń h có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của 5 píc thu được từ sắc kí đồ của dung dịch hỗn hợp chuẩn.

Thứ tự rửa giải và thời gian lưu của các chất trong các mẫu khác nhau thể hiện trên bảng 3.2.

45

Bảng 3. 3. Thời gian lưu của IPP, PheP, BzP trên các loại mẫu thử khác nhau.

Thời gian lưu (phút)

Mẫu thử Mẫu sữa rửa mặt

IPP 13,55

PheP 20,52

IBP 23,24

BzP 25,42

PeP 42,45

Mẫu nước súc miệng Mẫu chuẩn

13,51 13,51

20,44 20,45

23,44 23,67

25,27 25,57

42,82 43,38

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

3.2.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính

Với các lượng cân chuẩn là 19,82 mg IPP; 19,85 mg PheP và 19,97 mg BzP

chuẩn bị các dung dịch chuẩn như ở mục 3.1.2.2.

Bảng 3. 4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của IPP, PheP, BzP.

STT

IPP

1 2 3 4 5 6 7 8

S C (µg/ml) píc(mAu.s) 1,982 101082 3,964 204304 5,946 302429 9,910 500486 15,856 809500 19,820 1032011 29,730 1551625 39,640 2093010

PheP

C (µg/ml) 1,985 3,970 5,955 9,925 15,880 19,850 29,775 39,700

46

BzP S S C (µg/ml) píc(mAu.s) píc(mAu.s) 89402 1,997 81070 181344 3,994 165783 269202 5,991 247316 446959 9,985 410595 724190 15,976 666392 923160 19,970 849330 1387297 29,955 1277920 1886779 39,940 1738009

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 3. 8. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của IPP, PheP, BzP

Bảng 3. 5. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của IBP và PeP.

STT

IBP C (µg/ml)

PeP S píc(mAu.s)

C (µg/ml)

S píc(mAu.s)

1

2,020

93328

2,140

81950

2

4,040

189667

4,280

174173

3

8,080

386019

8,560

362554

4

12,120

573392

12,840

541891

5

16,160

769358

17,120

729976

6

20,200

960011

21,400

912595

7

32,320

1533885

34,240

1462059

8

40,400

1971842

42,800

1879917

47

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 3. 9. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của IBP và PeP

Kết quả khảo sát cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích trong khoảng nồng độ khảo sát.

3.2.2.4. Đánh giá độ đúng Thêm chính xác một lượng chất chuẩn paraben vào nền mẫu placebo, xử lý theo qui trình phân tích. Tiến hành ở 3 mức nồng độ khác nhau: 4, 8, 12 µg/ml, mỗi nồng độ thực hiện 3 lần. Dựa vào diện tích píc của chất tương ứng trong dung dịch chuẩn hỗn hợp để tính ra lượng chất chuẩn tìm thấy.

48

❖ Kết quả khảo sát độ đúng của 5 paraben trên nền sữa rửa mặt Thực hiện khảo sát độ đúng trên nền sản phẩ m rửa mặt, tẩy trang dạng bọt 2 trong 1 Naive với IPP, PheP, BzP, IBP và BzP thu được kết quả như ở các bảng 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 và 3.10.

Bảng 3. 6. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với IPP trên nền sữa rửa mặt.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Lượng cân mẫu giả dược (g)

Lượng chuẩn IPP thêm (mg)

S píc IPP (mAu.s)

Lượng IPP tìm lại (mg)

4

0,5106

0,2000

202271

0,2000

100,0

4 4 8

0,5199 0,5106 0,5061

0,2000 0,2000 0,4000

198724 201864 412522

0,1965 0,1996 0,4078

98,2 99,8 102,0

8 8 12

0,5108 0,5175 0,5018

0,4000 0,4000 0,5946

407814 406409 628217

0,4032 0,4018 0,6026

100,8 101,06 0,78 100,4 101,4

12 12

0,5025 0,5165

0,5946 0,5946

628159 623510

0,6026 0,5981

101,3 100,6

Nồng độ (µg/ml)

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

S T T

49

% thu hồi

Trung bình

RSD (%)

99,33

0,97

101,1

0,43

Bảng 3. 7. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với PheP trên nền sữa rửa mặt.

S T T

Nồng độ (µg/ml)

Lượng cân mẫu giả dược (g)

Lượng chuẩn PheP thêm (mg)

Diện tích píc PheP (mAu.s)

Lượng PheP tìm lại (mg)

% thu hồi

RSD (%)

98,84

0,93

0,77

4 4

0,5106 0,5199

0,203 0,203

182404 179118

0,2023 0,1986

3 4

4 8

0,5106 0,5061

0,203 0,406

181353 373946

0,2011 99,1 0,4146 102,1

8

0,5108

0,406

369665

0,4099 101,0 101,25

8

0,5175

0,406

368577

0,4087 100,7

12 12 12

0,5018 0,5025 0,5165

0,5955 0,5955 0,5955

562138 563078 557962

0,6045 101,5 0,6055 101,7 101,31 0,6000 100,8

6 7 8 9

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1 2

5

99,6 97,8

Trung bình

0,49

Bảng 3. 8. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với BzP trên nền sữa rửa mặt.

S T T

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Lượng cân mẫu giả dược (g)

Lượng chuẩn BzP thêm (mg)

Diện tích píc BzP (mAu.s)

Lượng BzP tìm lại (mg)

4 4

0,5106 0,5199

0,2010 0,2010

168313 165258

0,2044 0,2007

101,7 99,9

4 8 8 8 12 12 12

0,5106 0,5061 0,5108 0,5175 0,5018 0,5025 0,5165

0,2010 0,402 0,402 0,402 0,5991 0,5991 0,5991

167901 347625 342539 342195 519177 518283 511905

0,2039 0,4222 0,4160 0,4156 0,6112 0,6102 0,6027

101,5 105,0 103,5 103,4 102,0 101,9 100,6

Nồng độ (µg/ml)

50

% thu hồi

Trung bình

RSD (%)

101,00

0,99

103,97

0,88

101,49

0,77

Thực hiện khảo sát độ đúng trên nền rửa mặt, tẩy trang dạng bọt 2 trong 1 Naive với IBP và PeP thu được kết quả như ở các bảng 3.18, 3.19.

Bảng 3. 9. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với IBP trên nền sữa rửa mặt.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Nồng độ (µg/ml)

Lượng cân mẫu giả dược (g)

Lượng chuẩn IBP thêm (mg)

S píc IBP (mAu.s)

Lượng IBP tìm lại (mg)

% thu hồi

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

S T T

Trung bình

RSD (%)

4

0,5112

0,2030

189481

0,2054

101,2

4

0,5025

0,2030

187205

0,2030

100,0 100,57 0,61

4

0,5113

0,2030

188236

0,2041

100,5

8

0,5066

0,4060

390755

0,4164

102,6

8

0,5050

0,4060

378745

0,4036

8

0,5043

0,4060

382359

0,4074

100,4

12

0,5113

0,6090

580943

0,6299

103,4

12

0,5057

0,6090

577895

0,6266

102,9 103,02 0,35

12

0,5217

0,6090

577118

0,6257

102,7

51

99,4 100,77 1,60

Bảng 3. 10. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với PeP trên nền sữa rửa mặt.

S Nồng T độ T (µg/ml)

Lượng cân mẫu giả dược (g)

Lượng chuẩn PeP thêm (mg)

4

0,5112

0,2100

2

4

0,5025

0,2100

3

4

0,5113

0,2100

4

8

0,5066

0,4200

5

8

0,5050

0,4200

6

8

0,5043

0,4200

7

12

0,5113

0,6300

8

12

0,5057

0,6300

9

12

0,5217

0,6300

Lượng PeP tìm lại (mg)

171415

0,2088

99,4

170074

0,2072

98,7

171824

0,2093

99,7

361883

0,4295

102,3

353689

0,4198

100,0

355376

0,4218

100,4

542976

0,6614

105,0

538589

0,6561

104,1

538464

0,6559

104,1

% thu hồi

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1

Diện tích píc PeP (mAu.s)

Trung bình

RSD (%)

99,25

0,54

100,88

1,21

104,41

0,48

Kết quả cho thấy phương pháp có độ đúng tốt với nền mẫu sữa rửa mặt (Tỉ lệ

thu hồi cao, từ 98,84 đến 103,97 %).

❖ Kết quả khảo sát độ đúng của 5 paraben trên nền nước súc miệng.

Thực hiện khảo sát độ đúng trên nền nước súc miệng Colgate Plax

peppermint fresh(48L10)với IPP, PheP, BzP, IBP và PeP thu được kết quả như ở các bảng 3.11, 3.12 và 3.13.

52

Bảng 3. 11. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với IPP trên nền nước súc miệng.

S T T

Mức nồng độ (µg/ml)

Lượng cân mẫu giả dược (g)

Lượng chuẩn IPP thêm (mg)

Diện tích píc IPP (mAu.s)

Lượng IPP tìm lại (mg)

% thu hồi

4

0,5079

0,2000

200590

0,1984

99,2

2

4

0,5064

0,2000

204747

0,2025

101,3

3

4

0,5184

0,2000

202120

0,1999

100,0

4

8

0,5102

0,4000

410101

0,4057

101,4

5

8

0,5044

0,4000

408944

0,4046

101,1

8

0,5266

0,4000

409020

0,4046

101,2

12

0,5064

0,5946

617008

0,5919

99,5

12

0,5148

0,5946

629134

0,6035

101,5

12

0,5213

0,5946

628188

0,6026

101,4

6 7 8 9

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1

Trung bình

RSD (%)

100,16

1,04

101,24

0,16

100,80

1,08

Bảng 3. 12. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với PheP trên nền nước súc miệng.

S T T

1

Mức nồng độ (ppm)

Lượng cân mẫu giả dược (g)

Lượng chuẩn PheP thêm (mg)

Diện tích píc PheP (mAu.s)

Lượng PheP tìm lại (mg)

% thu hồi

4

0,5079

0,2030

181637

0,2016

99,3

4

0,5064

0,2030

184942

0,2053

101,1

4

0,5184

0,2030

182633

0,2027

99,9

8

0,5102

0,4060

372679

0,4137

101,9

8

0,5044

0,4060

370551

0,4113

101,3

8

0,5266

0,4060

370337

0,4111

101,3

7

12

0,5064

0,5955

553650

0,5953

100,0

8

12

0,5148

0,5955

563483

0,6059

101,8

9

12

0,5213

0,5955

564158

0,6066

101,9

2 3 4 5 6

53

Trung bình

RSD (%)

100,11

0,93

101,49

0,35

101,20

1,05

Bảng 3. 13. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với BzP trên nền nước súc miệng.

S T T

Mức nồng độ (µg/ml)

Lượng cân mẫu giả dược (g)

Lượng chuẩn BzP thêm (mg)

Diện tích píc BzP (mAu.s)

Lượng BzP tìm lại (mg)

% thu hồi

TB

RSD (%)

4 4

0,5079 0,5064

0,2010 0,2010

167995 171133

0,2044 0,2082

101,7 103,6 102,55 0,94

3 4

4 8

0,5184 0,5102

0,2010 0,4020

169056 345257

0,2057 0,4201

102,3 104,5

5 6 7 8 9

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1 2

8

0,5044

0,4020

344061

0,4187

104,1 104,26 0,20

8

0,5266

0,4020

344037

0,4186

104,1

12 12 12

0,5064 0,5148 0,5213

0,5991 0,5991 0,5991

508521 518296 518286

0,5987 0,6102 0,6102

99,9 101,9 101,21 1,10 101,9

Bảng 3. 14. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với IBP trên nền nước súc miệng.

Mức

Lượng cân

Lượng

Diện tích

Lượng

%

T

nồng độ

mẫu giả

chuẩn IBP

píc IBP

IBP tìm

thu

T

(µg/ml)

dược (g)

thêm (mg)

(mAu.s)

lại (mg)

hồi

S

1 2 3 4

Trung

RSD

bình

(%)

4 4 4 8

0,5097 0,5166 0,5200 0,5094

0,2030 0,2030 0,2030 0,4060

189897 186406 190182 380148

0,2059 0,2021 0,2062 0,4097

101,4 99,6 100,85 101,6 100,9

0,5029 0,5135

0,4060 0,4060

0,5043

0,6090

379171 373755 565788

0,4087 0,4028 0,6134

100,7 100,27 99,2 100,7

0,91

7

8 8 12

8

12

0,5137

0,6090

573075

0,6213

102,0 101,12

0,78

9

12

0,5151

0,6090

565138

0,6127

100,6

5 6

54

1,11

Bảng 3. 15. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với PeP trên nền nước súc miệng.

S T T

Mức nồng độ (ppm)

Lượng cân mẫu giả dược (g)

Lượng chuẩn PeP thêm (mg)

1

4

0,5097

2

4

3

4

5 6 7 8 9

Lượng PheP tìm lại (mg)

% thu hồi

0,2100

171088

0,2084

99,2

0,5166

0,2100

168958

0,2058

98,0

0,5200

0,2100

171279

0,2086

99,3

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

4

Diện tích píc PeP (mAu.s)

Trung bình

RSD (%)

98,86

0,76

1,67

8

0,5094

0,4200

352101

0,4224

100,6

8

0,5029

0,4200

354754

0,4256

101,3 101,92

8

0,5135

0,4200

363510

0,4361

103,8

12

0,5043

0,6300

527899

0,6430

102,1

12

0,5137

0,6300

535124

0,6518

103,5 102,47

12

0,5151

0,6300

526872

0,6418

101,9

0,85

Kết quả cho thấy phương pháp có độ đúng tốt với nền nước súc miệng (Tỉ lệ

thu hồi cao, từ 98,86 đến 104,26 %).

3.2.2.5. Độ lặp lại

Độ lặp lại được tiến hành thử nghiệm trên 6 mẫu tự tạo. Cân 0,5 g mẫu nền

rồi tiến hành theo quy trình xử lý mẫu tự tạo như trong mục “Độ đặc hiệu”. Kết quả thể hiện ở bảng 3.16, bảng 3.17, bảng 3.18 và bảng 3.19.

55

Bảng 3. 16. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với IPP, PheP, BzP trên nền sữa rửa mặt.

Lượng cân mẫu giả dược (g)

1 2

0,5061 0,5108

3 4

0,5175 0,5053

Lượng chuẩn thêm (mg)

S píc (mAu.s)

Lượng hoạt chất tìm lại (mg)

0,4000 0,4000

412522 407814

0,4078 0,4032

102,0 100,8

0,4000 0,4000

406409 413435

0,4018 0,4087

100,4 101,46 0,72 102,2

% thu hồi

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

IPP

S T T

PheP

BzP

Trung bình

RSD (%)

5

0,5423

0,4000

409936

0,4052

101,3

6

0,5038

0,4000

413186

0,4085

102,1

1 2 3

0,5061 0,5108 0,5175

0,4060 0,4060 0,4060

373946 369665 368577

0,4146 0,4099 0,4087

102,1 101,0 100,7

4 5

0,5053 0,5423

0,4060 0,4060

373954 371539

0,4147 0,4120

102,1 101,5

6 1 2 3 4 5 6

0,5038 0,5061 0,5108 0,5175 0,5053 0,5423 0,5038

0,4060 0,4020 0,4020 0,4020 0,4020 0,4020 0,4020

375208 347625 342539 342195 346784 343820 347309

0,4160 0,4222 0,4160 0,4156 0,4212 0,4176 0,4218

102,5 105,0 103,5 103,4 104,25 0,72 104,8 103,9 104,9

56

101,64 0,71

Bảng 3. 17. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với IBP và PeP trên nền sữa rửa mặt.

Lượng cân mẫu giả dược (g)

1

0,5066

2 3

Lượng chuẩn thêm (mg)

S píc (mAu.s)

Lượng hoạt chất tìm lại (mg)

0,4060

390755

0,4164

102,6

0,5050

0,4060

378745

0,4036

99,4

0,5043

0,4060

382359

0,4074

100,4

% thu hồi

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

IBP

S T T

PeP

Trung bình

RSD (%)

100,24 1,87

4 5 6

0,5030 0,5174 0,5019

0,4060 0,4060 0,4060

378402 372012 389328

0,4032 0,3964 0,4149

99,3 97,6 102,2

1 2 3 4

0,5066 0,5050 0,5043 0,5030

0,4200 0,4200 0,4200 0,4200

361883 353689 355376 349976

0,4295 0,4198 0,4218 0,4154

102,3 100,0 100,4 100,25 1,75 98,9

5

0,5174

0,4200

346158

0,4109

97,8

6

0,5019

0,4200

361318

0,4288

102,1

57

Bảng 3. 18. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với IPP, PheP, BzP trên nền nước súc miệng.

PheP

BzP

Lượng cân mẫu giả dược (g)

Lượng chuẩn IPP thêm (mg)

S píc IPP (mAu.s)

Lượng IPP tìm lại (mg)

% thu hồi

1

0,5102

0,4000

410101

0,4057

101,4

2

0,5044

0,4000

408944

0,4046

101,1

3

0,5266

0,4000

409020

0,4046

101,2

4 5 6

0,515 0,5058 0,5071

0,4000 0,4000 0,4000

407327 406686 401444

0,4030 0,4023 0,3971

100,7 100,6 99,3

1 2 3 4

0,5102 0,5044 0,5266 0,515

0,4060 0,4060 0,4060 0,4060

372679 370551 370337 369360

0,4137 0,4113 0,4111 0,4100

101,9 101,3 101,3 101,0

5

0,5058

0,4060

368310

0,4088

100,7

6 1

0,5071 0,5102

0,4060 0,4020

364167 345257

0,4042 0,4201

99,6 104,5

2 3 4 5 6

0,5044 0,5266 0,515 0,5058 0,5071

0,4020 0,4020 0,4020 0,4020 0,4020

344061 344037 343061 341431 337335

0,4187 0,4186 0,4174 0,4155 0,4105

104,1 104,1 103,8 103,4 102,1

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

IPP

S T T

58

TB

RSD (%)

100,72

0,76

100,95

0,78

103,68

0,83

Bảng 3. 19. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với IBP và PeP trên nền nước súc miệng.

Lượng cân mẫu giả dược (g)

Lượng chuẩn thêm (mg)

1

0,5073

0,4060

377708

0,4071

100,3

2

0,5250

0,4060

381734

0,4114

101,3

3

0,5155

0,4060

393516

0,4241

104,5

4 5 6

0,5094 0,5029 0,5135

0,4060 0,4060 0,4060

380148 379171 373755

0,4097 0,4087 0,4028

100,9 100,7 99,2

1 2 3 4

0,5073 0,5250 0,5155 0,5094

0,4200 0,4200 0,4200 0,4200

352101 354754 363510 353181

0,4224 0,4256 0,4361 0,4237

100,6 101,3 103,8 100,99 1,66 100,9

5

0,5029

0,4200

352205

0,4226

100,6

6

0,5135

0,4200

345354

0,4144

98,7

S píc (mAu.s)

Lượng tìm lại (mg)

% thu hồi

Trung bình

RSD (%)

101,15 1,76

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

IBP

S T T

PeP

Kết quả độ lặp lại đối với mẫu tự tạo trên 2 nền mẫu sữa rửa mặt và nước súc

miệng cho giá tri ̣RSD lớn nhấ t là 1,87%, phương pháp có độ lặp lại tốt.

3.2.2.6. Độ chính xác trung gian

Độ chính xác trung gian được tiến hành thử nghiệm trên 6 mẫu tự tạo được

chuẩn bị giống phần độ lặp lại nhưng thực hiện khác ngày và khác kiểm nghiệm viên. Kết quả thể hiện ở bảng 3.12 và bảng 3.13 cho thấy phương pháp có độ chính xác tương đối cao trên cả nền mẫu sữa rửa mặt và nước súc miệng.

59

Bảng 3. 20. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với IPP, PheP, BzP trên nền sữa rửa mặt.

Lượng

Lượng

cân

chuẩn

S píc

hoạt chất

%

mẫu giả

thêm

(mAu.s)

tìm lại

thu hồi

T

dược (g)

(mg)

1

0,5016

0,4060

418281

0,4173

102,8

2

0,5108

0,4060

416775

0,4158

102,4

3

0,5004

0,4060

418091

0,4172

102,8

4

0,5044

0,4060

415903

0,4150

102,2

5

0,5009

0,4060

418355

0,4174

102,8

6

0,5105

0,4060

417589

0,4167

102,6

Trung bình (n=6)

102,72

RSD % (n=6)

0,13

S

IPP

PheP

BzP

(mg)

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

T

Lượng

1

0,5016

0,4020

368716

0,4125

102,6

2

0,5108

0,4020

367900

0,4116

102,4

3

0,5004

0,4020

369072

0,4129

102,7

4

0,5044

0,4020

367058

0,4107

102,2

5

0,5009

0,4020

369418

0,4133

102,8

6

0,5105

0,4020

368892

0,4127

102,7

Trung bình (n=6)

102,74

RSD % (n=6)

0,10

1

0,5016

0,4100

348968

0,4207

102,6

2

0,5108

0,4100

346998

0,4183

102,0

3

0,5004

0,4100

349479

0,4213

102,8

4

0,5044

0,4100

347092

0,4185

102,1

5

0,5009

0,4100

349654

0,4215

102,8

6

0,5105

0,4100

348723

0,4204

102,5

Trung bình (n=6)

102,68

RSD % (n=6)

0,19

60

Trung

RSD

bình

(n=12)

(n=12)

(%)

102,09

0,87

102,19

0,76

103,47

1,07

Bảng 3. 21. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với IBP và PeP trên nền sữa rửa mặt.

Lượng Lượng Lượng % cân chuẩn S píc hoạt STT mẫu giả thêm (mAu.s) chất tìm thu hồi dược (g) (mg) lại (mg)

1 2

0,5050 0,5206

0,4040 385497 0,4040 383489

0,4045 0,4024

100,1 99,6

3 4

0,5092 0,5159

0,4040 382120 0,4040 383537

0,4009 0,4024

99,2 99,6 100,03 101,6

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

IBP

Trung bình (n=12)

5

0,5033

0,4040 391209

0,4105

6

0,5089

0,4040 380250

0,3990

RSD (n=12) (%)

0,30

98,8

Trung bình (n=6) 99,82

PeP

1 2 3

0,5050 0,5206 0,5092

RSD % (n=6) 0,4300 355373 0,4299 0,4300 353312 0,4274 0,4300 353075 0,4272

4 5 6

0,5159 0,5033 0,5089

0,4300 354630 0,4300 361885 0,4300 351244

0,4290 0,4378 0,4249

Trung bình (n=6) RSD % (n=6)

61

0,98 100,0 99,4 99,3

99,8 100,06 101,8 98,8 99,86 1,04

0,28

Bảng 3. 22. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với IPP, PheP, BzP trên nền nước súc miệng.

S T T

PheP

BzP

Lượng

Lượng

cân mẫu

chuẩn

S píc

hoạt chất

giả dược

thêm

(mAu.s)

tìm lại

(g)

(mg)

Trung

RSD

%

bình

(n=12)

thu hồi

(n=12)

(%)

101,10

0,53

101,27

0,45

102,65

1,43

(mg)

1

0,5163

0,4060

412067

0,4111

101,3

2

0,504

0,4060

414297

0,4134

101,8

3

0,5308

0,4060

410236

0,4093

100,8

4

0,5118

0,4060

412651

0,4117

101,4

5

0,5048

0,4060

415717

0,4148

102,2

6

0,5004

0,4060

412608

0,4117

101,4

Trung bình (n=6)

101,48

RSD % (n=6)

0,46

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

IPP

Lượng

1

0,5163

0,4020

364530

0,4078

101,5

2

0,504

0,4020

366675

0,4102

102,1

3

0,5308

0,4020

361958

0,4050

100,7

4

0,5118

0,4020

365019

0,4084

101,6

5

0,5048

0,4020

367328

0,4110

102,2

6

0,5004

0,4020

364606

0,4079

101,5

Trung bình (n=6)

101,59

RSD % (n=6)

0,52

1

0,5163

0,4100

344477

0,4153

101,3

2

0,504

0,4100

346984

0,4183

102,0

3

0,5308

0,4100

342975

0,4135

100,9

4

0,5118

0,4100

345829

0,4169

101,7

5

0,5048

0,4100

347116

0,4185

102,1

6

0,5004

0,4100

345843

0,4170

101,7

Trung bình (n=6)

101,61

RSD % (n=6)

0,46

62

Bảng 3. 23. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với IBP và PeP trên nền nước súc miệng.

STT

Lượng Lượng Lượng % cân mẫu chuẩn S píc hoạt giả dược thêm (mAu.s) chất tìm thu hồi (g) (mg) lại (mg)

0,5021 0,4040 389269

0,4084

101,1

2

0,5360 0,4040 387333

0,4064

100,6

3

0,5121 0,4040 381105

0,3999

99,0

4

0,5232 0,4040 383669

0,4026

99,6

5

0,5017 0,4040 380182

0,3989

98,7

6

0,5041 0,4040 378985

0,3976

98,4

Trung bình (n=6)

99,58

RSD % (n=6)

1,08

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1

IBP

PeP

1

0,5021 0,4300 360486

0,4361

101,4

2

0,5360 0,4300 358056

0,4332

100,7

3

0,5121 0,4300 350784

0,4244

98,7

4

0,5232 0,4300 354041

0,4283

99,6

5

0,5017 0,4300 351605

0,4254

98,9

6

0,5041 0,4300 349461

0,4228

98,3

Trung bình (n=6)

99,62

RSD % (n=6)

1,23

Trung bình (n=12)

RSD (n=12) (%)

100,37

1,11

100,31

0,97

Kế t quả phân tích giữa 2 kiể m nghiê ̣m viên cho giá tri ̣ RSD lớn nhấ t là

1,43%, phương pháp có đô ̣ chu ̣m đa ̣t yêu cầ u.

3.2.2.7. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) Pha loãng dần dung dịch thử và dung dịch chuẩn đến nồng độ thấp nhất mà tín hiệu của máy vẫn đáp ứng được (gấp 3 lần so với nhiễu đường nền) để xác định giới hạn phát hiện. Các sắc kí đồ thu được như ở hình 3.8 và 3.9. Giới hạn phát hiện xác định được như ở bảng 3.14.

63

0.20

0.15

Benzyl PB/26.976

IsoPropyl PB/14.112

/5.416

/1.780 /2.062 /2.575 /2.931

Phenyl PB/21.689

Datafile Name:LOD 200 + 48L03.lcd mAU 254nm,4nm

Hỗn hợp chuẩn trong nền mẫu sữa rửa mặt

0.10 /3.685

(trong đó PheP 0,05

0.05

ppm; BzP 0,05 ppm)

0.00 0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

min

Datafile Name:LOD 200.lcd

0.20 0.15

hợp (trong đó PheP 0,05 ppm; BzP 0,05 ppm)

/13.755

0.10

Dung dịch chuẩn hỗn

Benzyl PB/26.876

0.25

Phenyl PB/21.606

0.30

IsoPropyl PB/14.091

/2.587 /2.939

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU 0.35 254nm,4nm

0.05 0.00 0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

min

Datafile Name:LOD 200 + 48L10.lcd

0.10 0.05 0.00

Benzyl PB/27.453

0.15

Phenyl PB/22.048

/1.510 /2.302 /2.552 /2.911

IsoPropyl PB/14.325

mAU 254nm,4nm 0.20

Hỗn hợp chuẩn trong nền mẫu nước súc

miệng (trong đó PheP

-0.05 -0.10 0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

min

Hình 3. 10. Sắc kí đồ xác định LOD của PheP và BzP.

64

0,05 ppm; BzP 0,05 ppm)

0.15

Hỗn hợp chuẩn trong

Benzyl PB/26.856

0.20

Phenyl PB/21.589

/5.415

/1.793 /2.041 /2.297 /2.563 /2.760 /2.941

IsoPropyl PB/14.085

Datafile Name:LOD 400 + 48L03.lcd mAU 254nm,4nm 0.25

(trong đó IPP 0,025

/3.552 /3.620

0.10

nền mẫu sữa rửa mặt

0.05

ppm)

0.00 0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

min

0.075 0.050 0.025 0.000 0.0

/2.574 /2.946

Phenyl PB/21.565

0.100

/2.143 /2.358 /3.667

0.125

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

0.150

IsoPropyl PB/14.050

mAU 0.175 254nm,4nm

Benzyl PB/26.797

Datafile Name:LOD 400.lcd

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

Dung dịch chuẩn hỗn hợp (trong đó IPP 0,025 ppm)

min

Datafile Name:LOD 400 + 48L10.lcd

0.00 -0.05 0.0

5.0

10.0

15.0

Benzyl PB/27.029

0.05

Phenyl PB/21.685

0.10

IsoPropyl PB/14.144

0.15

/7.151

0.20

/1.512 /2.294 /2.547 /2.902

mAU 254nm,4nm

20.0

25.0

30.0

Hình 3. 11. Sắc kí đồ thể hiện LOD của IPP.

65

min

Hỗn hợp chuẩn trong nền nước súc miệng (trong đó IPP 0,025 ppm)

Datafile Name:LOD 0.03 ppm + 48L10.lcd

Datafile Name:LOD 0.03 ppm + 48L03.lcd

0.075 0.075

0.050

/7.073

/2.312

0.100

0.100

/4.767

0.125

IsoButyl PB/23.700

/1.902 /2.573 /2.891 /3.089 /4.028

0.150

/3.508

0.125

mAU 254nm,4nm

PeP/43.281

0.150

IBP/23.639

/2.196 /2.274 /2.581 /3.238

mAU 254nm,4nm

0.025

0.050

0.000

0.025 5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

min

a)

0.0

5.0

10.0

15.0

30.0

35.0

40.0

35.0

40.0

IBP/23.276

/2.915

/0.927

PeP/42.7 49

IBP/23.312

0.15

0.10

0.00

45.0

min

c)

45.0

min

d)

mAU 0.20 254nm,4nm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

0.05

/2.92 1

0.10

25.0

Datafile Name:LOD 2PB 0.04ppm.lcd

Datafile Name:LOD 2PB 0.03ppm.lcd mAU 254nm,4nm

20.0

PeP/42.558

0.0

0.05

-0.05

0.0

0.00

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

min

b)

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

Hình 3. 12. Sắc kí đồ thể hiện LOD của IBP, PeP

a) Hỗn hợp chuẩn trong nền mẫu sữa rửa mặt (trong đó IBP 0,03 ppm) b) Dung dịch chuẩn hỗn hợp (trong đó IBP 0,03 ppm)

c) Hỗn hợp chuẩn trong nền mẫu nước súc miệng (trong đó IBP 0,03 ppm) d) Dung dịch chuẩn hỗn hợp (trong đó PeP 0,04 ppm)

Bảng 3. 24. LOD và LOQ của IPP, PheP, BzP, IBP và PeP

STT

Tên chất phân tích

LOD (µg/ml)

LOQ (µg/ml)

1

IPP

0,025

0,09

2

PheP

0,05

0,20

3

BzP

0,05

0,20

4

IBP

0,03

0,10

5

PeP

0,04

0,15

66

3.3. ÁP DỤNG KIỂM TRA MẪU TRÊN THỊ TRƯỜNG Xem xét mỹ phẩm là một đối tượng có nền mẫu phức tạp và không phải thành phần nào cũng được công bố trên nhãn sản phẩm. Vì vậy khi phân tích thực tế sẽ thường xuyên bắt gặp trong mẫu những píc có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của chuẩn chất cần phân tích. Tuy nhiên nếu quan sát phổ UV thì sẽ loại thô được những chất không thuộc nhóm chất đang phân tích. Dưới đây là một số trường hợp cần được xem xét trong số 10 mẫu mỹ phẩm thử nghiệm được mua từ thị

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

trường. Tất cả đều là các sản phẩm mỹ phẩm mới, còn hạn sử dụng và lớp bề mặt đã được loại bỏ trước khi cân (trừ nước súc miệng).

Trong mẫu 48L01 và 48L02 tại vị trí 25,0 phút có píc, đây là vị trí của BzP

trong chuẩn hỗn hợp, nhưng píc này có phổ UV hoàn toàn khác so với phổ của nhóm paraben. Chính vì vậy kết quả chồng phổ cho hệ số tương đồng thấp (0,76; 0,77).

67

a)

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

a)

b)

c)

Hình 3. 13. So sánh phổ UV-VIS của các píc trên mẫu thử 48L02 và 48L01. a) Sắc kí đồ và phổ UV của píc BzP trong chuẩn hỗn hợp IPP, PheP, BzP. b) Sắc kí đồ và phổ UV của píc tại tR = 25,0 phút trong mẫu 48L01. c) Sắc kí đồ và phổ UV của píc tại tR = 25,0 phút trong mẫu 48L02.

Trường hợp phức tạp hơn, trong mẫu xuất hiện píc có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất phân tích và có phổ UV hoàn toàn giống với nhóm chất phân tích. Lúc này chồng phổ UV sẽ cho hệ số tương đồng xấp xỉ 1. Người phân tích cần sử dụng cách thêm chuẩn vào nền mẫu trước khi kết luận.

68

b)

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

a)

c)

d)

e)

Hình 3. 14. Sắc kí đồ phát hiện các paraben trong 48L07

a)Dung dịch chuẩn hỗn hợp IPP, PheP, BzP b) Mẫu 48L07 có thêm chuẩn IPP

c) Mẫu 48L07

d) Mẫu 48L07 có thêm chuẩn PP

e) Dung dịch chuẩn hỗn hợp IPP + PP

Ví dụ trong 10 mẫu được kiểm tra trong đề tài này, mẫu 48L07 có píc gần với IPP (tR thử = 14,5 phút; tR chuẩn IPP = 13,6 phút). Tiến hành chồng phổ thử và chuẩn cho hệ số tương đồng Similarity = 0,9999. Tuy nhiên giá trị này cũng chưa

69

đủ để khẳng định píc có trong thử là IPP. Mặt khác quan sát chuẩn hỗn hợp 9 paraben trong cùng điều kiện phân tích thấy píc IPP và PP gần nhau (IPP = 13,8 phút; PP = 14,7 phút; Rs = 1,9).

Trong thực tế có trường hợp khi cho chuẩn vào nền mẫu thì thời gian lưu của píc chuẩn bị trôi đi so với dung dịch mẫu chuẩn trong dung môi. Vì vậy cần thiết phải tiến hành phân tích mẫu thêm chuẩn IPP và mẫu thêm chuẩn PP. Kết quả như hình 3.15, trên sắc kí đồ của mẫu thêm chuẩn IPP xuất hiện 2 píc ngay cạnh nhau

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

trong đó 1 píc là IPP và píc còn lại có vị trí giống PP trong chuẩn hỗn hợp (IPP = 13,5 phút; píc 2 = 14,3 phút). Mặt khác trên sắc kí đồ của mẫu thử thêm chuẩn PP chỉ xuất hiện duy nhất 1 píc (PP = 14,3 phút). Chồng phổ thử và chuẩn hỗn hợp 9 paraben tại vị trí PP cho hệ số tương đồng Similarity = 0,9999.

Như vậy rất có thể píc xuất hiện trong mẫu 48L07 là PP. Để khẳng định chắc

chắn thì cần chạy lại bằng quy trình phát hiện PP trong mỹ phẩm.

Phân tích chất cấm trong mỹ phẩm thật sự không đơn giản. Việc khẳng định

chất cấm cần có sự so sánh giữa các phương pháp. Phương pháp HPLC với detector DAD có vai trò sàng lọc hiệu quả, đơn giản và nhanh chóng. Nhưng cần thiết phải có kết quả đối chứng bằng phương pháp khác đối với những mẫu phát hiện chất cấm (như phân tích khối phổ). Bởi kết quả này liên quan đến pháp lý và có thể phát sinh rất nhiều vấn đề hệ lụy khi kết luận không chính xác.

Áp dụng quy trình để kiểm tra trên 10 mẫu mỹ phẩm, kết quả thu được như ở

bảng 3.27.

70

Bảng 3. 25. Kết quả phân tích các paraben cấm.

Mã số

Tên mẫu

Số ĐKKN

Kết quả

Nước rửa tay bảo vệ khỏi vi khuẩn

48L01

-

2 3 4

Nước rửa tay bảo vệ khỏi vi khuẩn Lifeboy Dầu rửa mặt, tẩy trang dạng bọt 2 trong 1 Naive Sữa rửa mặt lá đào Naive

48L02 48L03 48L04

-

5

Sữa rửa mặt trắng da Nivea

48L05

-

6

Sữa rửa mặt Pond's pure white

48L06

-

7 8

Sũa rửa mặt Benew snail Nước súc miệng Listerine total care

48L07 48L08

-

9

Nước súc miệng Listerine natural green tea

48L09

-

10

Nước súc miệng colgate plax peppermint fresh

48L10

-

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1

71

CHƯƠNG 4

BÀN LUẬN 4.1. VỀ CÁC PARABEN NGHIÊN CỨU Paraben là ester của acid p-hydroxybenzoic và theo Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), chúng là chất bảo quản được sử dụng rộng rãi nhất trong các sản phẩm mỹ phẩm. Trong thực tiễn công nghiệp thường người ta sử dụng hỗn hợp các paraben và trong một số trường hợp kết hợp với các loại chất bảo

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

quản khác để bảo vệ chống lại một loạt các vi sinh vật. Trong vài năm gần đây diễn ra cuộc tranh luận về sự an toàn và nguy cơ ung thư tiềm tàng từ việc sử dụng các sản phẩm chứa paraben. Thêm vào đó, chất paraben trong các sản phẩm chăm sóc cá nhân như dung dịch súc miệng có phản ứng với clo tự do thường chứa trong nước máy tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ clo hóa của chúng sau vài phút. Cần có những nghiên cứu sâu hơn để đánh giá những nguy cơ tiềm ẩn về sức khoẻ và hoạt động phá hoại nội tiết có thể có của sản phẩm paraben halogen hóa.

Do vậy cần có các phương pháp phân tích mới cho việc kiểm soát chất lượng đối với mỹ phẩm và các công thức chứa paraben. Việc phân tích các chất phụ gia này trong mỹ phẩm rất quan trọng không chỉ cho mục đích đảm bảo chất lượng mà còn vì bảo vệ lợi ích người tiêu dùng

4.2. VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để phân tích các paraben có các phương pháp phổ biến như: phương pháp

sắc kí lỏng (sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép nối detector UV-VIS; sắc kí lỏng khối phổ LC-MS/MS; sắc kí lỏng siêu hiệu năng kết hợp đầu dò khối phổ UPLCMS/MS, phương pháp sắc kí khí khối phổ GC-MS, phương pháp điện di mao quản (CE).

Phương pháp điện di mao quản có ưu điểm là tiết kiệm, lượng hóa chất sử dụng rất ít, có thể phân tích được nhiều nhóm chất khác nhau với tốc độ và hiệu suất cao. Tuy nhiên, tính ổn định không cao, thiết bị không phổ biến cho các phòng thí nghiệm. Phương pháp sắc kí khí khối phổ GC-MS là phương pháp có độ nhạy và độ tin cậy cao, tuy nhiên cũng có nhược điểm là sự khiếm khuyết của việc xác định

72

trực tiếp một số chất do tính bất ổn, phân cực và sự không ổn định nhiệt của chúng.

Phương pháp HPLC với độ lặp lại tốt là một kỹ thuật lý tưởng để phân tích tồn dư của các thành phần này. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector UVVIS có một nhược điểm là có thể có sự chồng chéo các píc khi phân tích paraben trong nền mẫu phức tạp. Những hạn chế này có thể được khắc phục khi kết hợp sắc kí lỏng với đầu dò khối phổ. Tuy nhiên kỹ thuật này giá thành cao hơn đáng kể và thiết bị vẫn chưa có ở nhiều phòng thí nghiệm. Dựa vào tham khảo tài liệu, kết hợp với điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn phương pháp HPLC-

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

UV/VIS để phân tích paraben. Đây là thiết bị khá phổ biến ở các phòng phân tích, kiểm nghiệm.

Phần lớn các phương pháp LC xác định paraben được báo cáo là sử dụng các

cột dựa trên hạt thông thường. Các cột như vậy nói chung có hai hạn chế chính. Sự chuyển khối chậm giữa các pha động và pha tĩnh và gia tăng áp suất ở tốc độ cao.

Các vật liệu đơn khối mới được thương mại hóa gần đây có thể là một sự lựa chọn thú vị và thuận lợi mang lại các đặc tính thuận lợi cho việc tách nhanh chóng và hiệu quả cao, như giảm áp suất trên cột, động học chuyển khối nhanh và khả năng liên kết cao. Chính vì những đặc tính đó mà các nguyên liệu đồng nhất đã được đưa vào danh sách đóng gói L1 của Dược điển Mỹ. Như vậy có thêm một sự lựa chọn nữa để các nhà phân tích cân nhắc khi phân tích paraben.

Một gợi ý mới cho phân tích paraben trong các sản phẩm mỹ phẩm đấy là

phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang (FD) lần đầu tiên được công bố vào năm 2016 trong nghiên cứu của AgnieszkaZgoła-Grześ kowiak và cộng sự [64]. FD đưa ra cả độ chọn lọc và độ nhạy cao hơn nhiều so với UV. Do đó, một quy trình chuẩn bị mẫu đơn giản với độ pha loãng mẫu 1000 lần đã được phát triển thành công trong nghiên cứu này. Thời gian chuẩn bị không mất hơn 2 phút cho mỗi mẫu. Hơn nữa, tiêm mẫu pha loãng nhiều làm tăng tuổi thọ cột HPLC bởi vì nó ít bị tắc bởi các thành phần nền mẫu hấp phụ cao.

73

4.2.1. Về phương pháp xử lý mẫu Nhìn chung, sự phức tạp của các nền mẫu mỹ phẩm và các trạng thái thể chất khác biệt của chúng đã dẫn đến sự phát triển của rất nhiều các phương pháp phân tích khác nhau. Trong hầu hết các quy trình trình bày trong phụ lục 2, việc bổ sung dung môi và lắc siêu âm đã được sử dụng. Trong khoảng một nửa các nghiên cứu là việc làm giàu mẫu và làm sạch được thực hiện bằng cách sử dụng chiết xuất pha rắn, vi chiết đơn giọt, vi chiết pha rắn, chiết xuất hấp phụ trên thanh khuấy và các kỹ thuật khác. Các phương pháp chuẩn bị phức tạp đã được sử dụng ngay cả đối với

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

các nền mẫu tương đối đơn giản như gel tẩy trang, dung dịch nước súc miệng và gel tóc [35]. Trong bối cảnh này, với việc lựa chọn sự đơn giản của phương pháp phát triển chúng tôi mong muốn rằng sẽ ít khả năng dẫn đến sai sót hơn.

Cũng đễ dàng nhận thấy một số lượng lớn các phương pháp dựa trên sự pha

loãng đơn giản và sự đồng nhất của dung môi pha loãng và mẫu thử đã được công bố [62], [30], [51], ... Trong đó methanol là dung môi được sử dụng nhiều nhất trong việc chiết xuất paraben từ các nền mẫu. Methanol cũng là dung môi phổ biến, dễ kiếm, vì vậy trong nghiên cứu này cũng đã lựa chọn dung môi chiết mẫu là methanol.

Mặt khác, các paraben là chất bảo quản, nồng độ sử dụng rất nhỏ và không

xác định được trước, vì vậy quy trình xử lý mẫu trong đề tài chúng tôi đưa ra có tính chất thăm dò tạm thời. Lượng dung môi chiết sử dụng có thể thay đổi tùy thuộc vào mẫu thử sau khi đã xác định sơ bộ trước nồng độ của paraben có trong mẫu để đưa nồng độ phân tích vào trong khoảng nồng độ đã khảo sát.

Các ảnh hưởng nền mẫu quan trọng nhất đã được báo cáo đối với propylparaben hoặc methylparaben [62]. Sự tuyến tính kém đã được quan sát thấy trong việc dựng đường chuẩn đối với methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben [51]. Như vậy có thể thấy vấn đề bị ảnh hưởng bởi nền mẫu mới chỉ được báo cáo ở nhóm paraben có giới hạn về nồ ng đô ̣ sử du ̣ng (MP, EP, PP, BP).

Mặc dù trên hai nền mẫu trong đề tài cho thấy sự thu hồi có thể chấp nhận được (ngay cả khi không có tinh chế chiết pha rắn), nhưng thiết nghĩ những dịch

74

chiết này nên được tinh chế thêm để bảo vệ cột sắc kí khỏi sự lắng đọng dầu, nhằm kéo dài tuổi thọ của cột. Có thể nghĩ đến kỹ thuật chiết xuất pha rắn (SPE) và chiết xuất pha rắn với sợi (SPME), tuy nhiên tiền xử lý mẫu không thể được loại bỏ hoàn toàn cho hai kĩ thuật này mà như thế lại giảm độ nhạy. Các vật liệu nano có thể là một hướng khai thác trong tương lai cho phép làm sạch nền mẫu mỹ phẩm, vừa tránh nhiễu mà không giảm độ nhạy. Các máy nano đã cho thấy khả năng trích xuất nhiều loại hợp chất vì bề mặt của chúng được phủ các phân tử chức năng, polyme hoặc các hạt nâng cao tính chọn lọc và hiệu quả làm giàu mẫu.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

4.2.2. Về xây dựng quy trình phân tích

Xây dựng quy trình phân tích trong mỹ phẩm rất phức tạp, không thể chỉ tiến

hành dựa trên mẫu chuẩn mà quy trình bị ảnh hưởng rất nhiều bởi nền mẫu. Vì vậy xây dựng được quy trình bước đầu nhưng khi tiến hành vào mẫu thử đã phải có những thay đổi để phù hợp với từng nền mẫu khác nhau. Trong nền mẫu có nhiều chất chưa xác định được trước (có những chất được ghi trên nhãn và những chất không được công bố ) gây khó khăn trong quá trình xây dựng quy trình phân tích.

Thậm chí trong cùng một dạng nền mẫu (son, phấn, kem bôi da...), quy trình phân tích cũng có thể phải thay đổi theo từng nhà sản xuất khác nhau. Qua khảo sát, chúng tôi đã xây dựng chương trình sắc kí để định tính định lượng 5 paraben (IPP, PheP, IBP, BzP, PeP) trong 2 nền mẫu sữa rửa mặt và nước súc miệng.

4.2.3. Về thẩm định phương pháp

Xây dựng quy trình phân tích trong mỹ phẩm bị ảnh hưởng rất nhiều bởi nền

mẫu. Vì vâ ̣y trong quá triǹ h áp du ̣ng quy trin ̀ h kiể m tra mẫu sẽ có khi gă ̣p những mẫu cá biê ̣t không thể áp du ̣ng nguyên xi quy trình như đề tài đưa ra mà cầ n có những điề u chỉnh hơ ̣p lý. Khi đó cầ n thiế t phải thẩ m đinh ̣ la ̣i trên nề n mẫu đó.

Do các paraben bị cấm là chất bảo quản không được phép sử dụng, không biết chính xác hàm lượng nên để thẩm định phương pháp chúng tôi chủ yếu thực hiện trên mẫu tự tạo ở hàm lượng nhỏ. Nồng độ khảo sát paraben cũng rất nhỏ, lượng chuẩn thêm vào chỉ đến cỡ microgram, với lượng nhỏ như vậy chúng thôi không thể cân cho từng mẫu được nên lượng hoạt chất thêm vào bằng cách thêm

75

các thể tích đã tính toán của dung dịch chuẩn paraben. Mặc dù được tiến hành ở nồng độ rất thấp nhưng kết quả thu được đã cho thấy phương pháp đã đáp ứng được yêu cầu định tính, định lượng đồng thời paraben trong nền mẫu sữa rửa mặt và nước súc miệng (Theo khuyến cáo của các nhà phân tích hóa học AOAC). Cụ thể: - Độ thích hợp hệ thống: Độ lặp lại tốt với RSD của thời gian lưu nhỏ hơn 1,0 % và diện tích píc nhỏ hơn 2,0 %, số đĩa lý thuyết trên 2500, hệ số bất đối nhỏ hơn 2,0 và độ phân giải lớn hơn 1,5.

- Độ đặc hiệu: Trên sắc kí đồ của mẫu tự tạo: píc của chất cần phân tích tách

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

hoàn toàn khỏi các píc khác. Sắc kí đồ của mẫu trắng, dung dịch mẫu placebo: không xuất hiện píc ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. Hệ số chồng phổ UV-VIS tại đỉnh píc chất cần phân tích thu được trong sắc kí đồ của dung dịch mẫu tự tạo với píc tương ứng trong sắc kí đồ dung dịch chuẩn đạt trên 0,99.

- Độ tuyến tính: Hệ số tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của các

paraben đều có r ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995).

- Độ đúng: Tỉ lệ thu hồi của tất cả các mẫu đều nằm trong khoảng 95,0 –

105,0%.

- Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng: Vì nền mẫu phức tạp chúng tôi

xác định LOD, LOQ theo phương pháp pha loãng. Kết quả LOD với các paraben nghiên cứu đều nhỏ hơn 0,1 µg/ml và LOQ đều nhỏ hơn 0,4 µg/ml.

4.3. VỀ KIỂM TRA CÁC MẪU MỸ PHẨM

Đề tài đã tiến hành kiểm tra 10 mẫu mỹ phẩm bằng phương pháp HPLC đã xây dựng. Kết quả không phát hiện mẫu nào có chứa paraben bị cấm. Do số lượng mẫu làm được quá ít nên kết quả này chưa có ý nghĩa phản ánh tình hình sử dụng paraben trong thực tế. Chúng tôi sẽ tiếp tục thu thập mẫu và thực hiện công việc này trong thời gian sắp tới. Việc kiểm tra và phát hiện các chất bị cấm này là rất cần thiết cho cả nhà quản lý và các doanh nghiệp. Đây cũng là phương pháp để giúp các doanh nghiệp có thể dùng để kiểm tra nguyên liệu bán thành phẩ m đầu vào để lựa cho ̣n các nguyên liê ̣u không chứa các paraben bi ̣cấ m sử du ̣ng.

76

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua triển khai nghiên cứu, chúng tôi có một số kết luận sau: 1. Đã xây dựng được phương pháp cho phép phân tích các paraben cấm IPP, PheP, BzP, IBP và PeP bằng HPLC. 2. Kết quả thẩm định trên 2 nền mẫu là sữa rửa mặt và nước súc miệng cho thấy phương pháp có độ lặp lại cao, độ đúng tốt, khoảng tuyến tính khá rộng và có

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

giới hạn phát hiện với cả 5 paraben bị cấm là IPP, PheP, BzP, IBP và PeP đều dưới 0,05 µg/ml.

3. Áp dụng phương pháp xây dựng được để phân tích 10 mẫu mỹ phẩm trên

thị trường và không phát hiện mẫu nào chứa các paraben bi ̣cấm trên.

KIẾN NGHỊ

1. Thẩm định các quy trình xây dựng được trên các nền mẫu mỹ phẩm khác.

2. Cần triển khai rộng hơn việc kiểm tra sự có mặt paraben bị cấm trong các

sản phẩm mỹ phẩm trên thị trường để có kết luận chính xác về việc lạm dụng chất này trong mỹ phẩm và có biện pháp quản lý chất lượng mỹ phẩm phù hợp.

77

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1.

Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2006), Hóa phân tích II, NXB Y học, tr.168-200.

Tài liệu tiếng Anh

2.

A. Salvador, A. Chisvert (2007), Analysis of Cosmetic Products, Elsevier,

3.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Netherlands, 2007.

Barr L, Metaxas G, Harbach CA, et al (2012), “Measurement of paraben concentrations in human breast tissue at serial locations across the breast from axilla to sternum”, J Appl Toxicol, 32(3), 219- 232.

4.

Brian JV, Harris CA, Scholze M, Backhaus T, Booy P, Lamoree M, et al (2005), “Accurate predictionof the response of freshwater fish to a mixture of estrogenic chemicals”, EnvironHealth Perspect, 113, 721–728.

5.

C. Cruces-Blanco, A. Segura-Carretero, L. Galvez-Mata, A. FernandezGutierrez

(2001),

“Simultaneous

determination,

by capillary zone

electrophoresis, of multiple components of different industrial products”, Chromatographia, 53, 414–418.

6.

Canosa P, Rodríguez I, Rubí E, Negreira N, Cela R. (2006),“Formation of halogenated by-products ofparabens in chlorinated water”, Anal Chim Acta, 575, 106–113.

7.

Charles AK, Darbre PD (2013), “Combinations of parabens at concentrations measured in humanbreast tissue can increase proliferation of MCF-7 human breast cancer cells”, J ApplToxicol, 33, 390– 398.

8.

CIR Cosmetic Ingredient Review Expert Panel (2008), “Final amended report on the safety assessment of methylparaben, ethylparaben, propylparaben, isopropylparaben, butylparaben, isobutylparaben, and

benzylparaben as used in cosmetic products”, Int J Toxicol, 27(Suppl. 4):1– 82.

9.

Cosmetic Ingredient Review Expert Panel (2008), “Final amended report on the safety assessment of Methylparaben, Ethylparaben, Propylparaben, Isopropylparaben, Butylparaben, Isobutylparaben, and Benzylparaben as used in cosmetic products”, Int J Toxicol, 27(Suppl 4), 1- 82.

10.

Darbre PD, Aljarrah A, Miller WR, et al (2004), “Concentrations of

11.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

parabens in human breast tumours”, J Appl Toxicol, 24(1), 5-13.

Dorota Błędzka, Jolanta Gromadzińska, WojciechWąsowicz (2014), “Parabens. From environmental studies to human health”, Environment International, 67,27–42.

12.

E. Sottofattori, M. Anzaldi, A. Balbi, G. Tonello (1998), “Simultaneous HPLC determination of multiple components in a commercial cosmetic cream”, J. Pharm. Biomed. Anal., 18: 213–217.

13.

E. Tahmasebi, Y. Yamini, A. Mehdinia, F. Rouhi (2012), Polyanilinecoated Fe3O4 nanoparticles: an anion exchange magnetic sorbent for solid-phase extraction, J. Sep. Sci., 35(17), 2256–2265.

14.

Ethylparaben P. (1984), "Final report on the safety assessment of methylparaben, ethyl paraben, propyl paraben, and butylparaben", Journal of the American College of Toxicology, 3(5), 147-209.

15.

F. Han, Y.Z. He, C.Z. Yu (2008), On-line pretreatment and determination of parabens in cosmetic products by combination of flow injection analysis, solid-phase extraction and micellar electrokinetic chromatography, Talanta, 74(5), 1371–1377.

16.

Fei T, Li H, Ding M, Ito M, Lin JM (2011), “Determination of parabens in cosmetic products by solid-phase microextraction of poly(ethylene glycol) diacrylate thin film on fibers and ultra high-speed liquid chromatography

with diode array detector”, J Sep Sci., 34,1599-1606.

17.

Golden R, Gandy J, Vollmer G (2005), A review of the endocrine activity of parabens and implicationsfor potential risks to human health, Crit Rev Toxicol, 35, 435–458.

18.

González-Mariño I, Quintana JB, Rodríguez I, Cela R (2011), “Evaluation of the occurrence andbiodegradation of parabens and halogenated byproducts in wastewater by accuratemass liquid chromatography quadrupole

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

time-of-flight mass spectrometry (LC–QTOF-MS)”, Water Res, 45, 6770– 6780.

19.

Guo, Y., Wang, L., Kannan, K. (2014),“Phthalates and parabens in personal care products from China: concentrations and human exposure”, Arch.

Environ. Contam. Toxicol., 66, 113–119.

20.

H.Y. Shen, H.L. Jiang, H.L. Mao, G. Pan, L. Zhou, Y.F. Cao. (2007), “Simultaneous determination of seven phthalates and four parabens in cosmetic products using HPLC-DAD and GC-MS methods”,J. Sep. Sci., 30 (1), 48-54.

21.

Handa O, Kokura S, Adachi S, Takagi T, Naito Y, Tanigawa T, et al.

(2006),

“Methylparaben

potentiatesUV-induced

damage

of

skin

keratinocytes”, Toxicology, 227,62–72.

22.

Harville HM, Voorman R, Prusakiewicz JJ (2007), “Comparison of paraben stability in human andrat skin”, Drug Metab Lett, 1, 17–21.

23.

Ishiwatari S, Suzuki T, Hitomi T, Yoshino T, Matsukuma S, Tsuji T, et al (2007), “Effects of methylparaben on skin keratinocytes”, J Appl Toxicol, 27, 1– 9.

24.

J.F. García-Jiménez, M.C. Valencia, L.F. Capitán-Vallvey (2007), Simultaneous determination of antioxidants, preservatives and sweetener additives in food and cosmetics by flow injection analysis coupled to a

monolithic column, Anal. Chim. Acta, 594(2), 226–233.

25.

J.F. Noguera-Orti, R.M. Villanueva-Camanas, G. Ramis-Ramos (1999), “Determination of parabens in cosmetics without previous extraction by micellar liquid chromatography”, J. Chromatogr. Sci., 37, 84–87.

26.

Kang KS, Che JH, Ryu DY, et al (2002), “Decreased sperm number and motile activity on the F1 offspring maternally exposed to butyl phydroxybenzoic acid (butyl paraben)”, J Vet Med Sci, 64(3), 227- 235.

Kim S, Jung EM, An BS, Hwang I (2012), “Additional effects of bisphenol

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

27.

A and paraben on the inductionof calbindin-D (9K) and progesterone receptor via an estrogen receptor pathwayin rat pituitary”, J Physiol Pharmacol, 63, 445–55.

28.

L. Sánchez-Prado, G. Álvarez-Rivera, J.P. Lamas, M. Lores, C. García-Jares, M. Llompart (2011), Analysis of multi-class preservatives in leave-on and rinse-off cosmetics by matrix solid-phase dispersion, Anal. Bioanal. Chem., 401(10), 3293–3304.

29.

L. Sánchez-Prado, J.P. Lamas, M. Lores, C. García-Jares, M. Llompart (2010), Simultaneous in-cell derivatization pressurized liquid extraction for the determination of multiclass preservatives in leave-on cosmetics, Anal. Chem., 82(22) 9384–9392.

30.

L. Sanchez-Prado, M. Llompart, J.P. Lamas, C. Garcia-Jares, M. Lores (2011), “Multicomponent analytical methodology to control phthalates, synthetic musks, fragrance allergens and preservatives in perfumes”, Talanta, 85, 370–379.

31.

L.P. Melo, M.E.C. Queiroz (2010), Simultaneous analysis of parabens in cosmetic

products

by

stir

bar

sorptive

chromatography, J. Sep. Sci., 33(12), 1849–1855.

extraction

and

liquid

32.

Liebert NA (1984), “Final report on the safety assessment of methylparaben ethylparaben, propylparaben and butylparaben”, J Am Coll Toxicol, 3:147–209.

33.

M. Abbasghorbani, A. Attaran, M. Payehghadr (2013), Solvent-assisted dispersive micro-SPE by using aminopropyl-functionalized magnetite nanoparticle followed by GC-PID for quantification of parabens in aqueous matrices, J. Sep. Sci., 36(2), 311–319.

34.

M. Moradi, Y. Yamini (2012), Application of vesicular coacervate

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

phase for microextraction based on solidification of floating drop, J. Chromatogr. A, 1229, 30–37.

35.

M. Saraji, S. Mirmahdieh (2009), “Single-drop microextraction followed by in-syringe derivatization and GC-MS detection for the determination of parabens in water and cosmetic products”, J. Sep. Sci., 32, 988–995.

36.

M. Saraji, S. Mirmahdieh (2009), Single-drop microextraction followed by in-syringe derivatization and GC-MS detection for the determination of parabens in water and cosmetic products, J. Sep. Sci., 32(7), 988–995.

37.

M.A. Farajzadeh, D. Djozan, R.F. Bakhtiyari (2010), Use of a capillary tube for collecting an extraction solvent lighter than water after dispersive liquid–liquid microextraction and its application in the determination of parabens in different samples by gas chromatographyflame ionization detection, Talanta, 81(4-5), 1360–1367.

38.

M.R. Lee, C.Y. Lin, Z.G. Li, T.F. Tsai (2006), Simultaneous analysis of antioxidants and preservatives in cosmetics by supercritical fluid extraction combined with liquid chromatography–mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 1120, 244–251.

39.

Mark G. Kirchhof, Gillian C. de Gannes (2013), “The Health Controversies of Parabens”, Skin Therapy Lett., 18(2), 5-7.

40.

Masten SA (2005), “Butylparaben review of toxicological literature butylparaben (CAS no. 94-26-8)”, Rev Toxicol Lit, 1–64.

41.

N. Cabaleiro, I. de La Calle, C. Bendicho, I. Lavilla (2013), Current trends in liquid– liquid and solid–liquid extraction for cosmetic analysis: a review, Anal. Methods, 5(2), 323–340.

42.

N. Ye, P. Shi, J. Li, Q. Wang (2013), Application of graphene as solid phase extraction absorbent det parabens in cosmetic products by capillary

43.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

electrophoresis, Anal. Lett., 46, 1991–2000.

Oishi S (2002), “Effects of butyl paraben on the male reproductive system in mice”, Arch Toxicol, 76(7), 423- 9.

44.

P. Wang, Y. Liu (2007), “Cosmetic preservatives and analysis methods used in China”, J.Environ. Health, 24, 557–559.

45.

Pažoureková S, Hojerová J, Klimová Z, Lucová M (2013), “Dermal absorption and hydrolysis of methylparaben in different vehicles through intact and damaged skin: using a pig-earmodel in vitro”, Food Chem Toxicol, 59, 754-765.

46.

R. Bodor, M. Zuborova, E. Olvecka, V. Madajova, M. Masar, D. Kaniansk, B. Stanislawski (2001), “Isotachophoresis and isotachophoresis-zone electrophoresis of food additives on a chip with column-coupling separation channels”, J. Sep. Sci., 24, 802–809.

47.

R. Jain, M.K. Mudiam, A. Chauhan, R. Ch, R.C. Murthy, H.A. Khan (2013), Simultaneous derivatization and preconcentration of parabens in food and other matrices by isobutyl chloroformate and dispersive liquid-liquid microextraction followed by gas chromatographic analysis, Food Chem., 141(1), 436–443.

48.

Rastogi SC, Schouten A, de Kruijf N, Weijland JW (1995), “Contents of methyl-, ethyl-, propyl-, butyl- and benzylparaben in cosmetic products”,

Contact Dermatitis, 32: 28–30.

49.

Routledge EJ, Parker J, Odum J, Ashby J, Sumpter JP (1998), “Some alkyl hydroxy benzoate preservatives (parabens) are estrogenic”, Toxicol Appl Pharmacol, 153, 12–9.

50.

Rudel RA, Camann DE, Spengler JD, Korn LR, Brody JG (2003), “Phthalates, alkylphenols, pesticides,polybrominated diphenyl ethers and other endocrine-disrupting compounds inindoor air and dust”, Environ Sci

51.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Technol, 37, 4543–4553.

S. He, Y. Zhao, Z. Zhu, H. Liu, M. Li, Y. Shao, Q. Zhuang (2006), “Comparative study for the analysis of parabens by micellar electrokinetic capillary chromatography with and without large-volume sample stacking technique”, Talanta, 69, 166–171.

52.

S. Scalia, D.E. Games (1992), Determination of parabens in cosmetic products by supercritical fluid extraction and high-performance liquid chromatography, The Analyst, 117(5), 839–841.

53.

S.P. Wang, C.L. Chang (1998), Determination of parabens in cosmetic products

by

supercritical

fluid

extraction

and

capillary

zone

electrophoresis, Anal. Chim. Acta, 377, 85–93.

54.

Sasseville D (2004), Hypersensitivity to preservatives, Dermatol Ther, 17(3), 251-263.

55.

Shanmugam G., Ramaswamy B. R., Radhakrishnan V., et al. (2010), "GC– MS method for the determination of paraben preservatives in the human breast cancerous tissue", Microchemical Journal, 96(2), 391-396.

56.

Shaw J, deCatanzaro D (2009), “Estrogenicity of parabens revisited: impact of parabens on early pregnancy and an uterotrophic assay in mice”, Reprod Toxicol, 28(1), 26- 31.

57.

Song BL, Li HY, Peng DR (1989), “In vitro spermicidal activity of parabens against human spermatozoa”, Contraception, 39(3), 331- 5.

58.

T.A.M. Msagati, T. Barri, N. Larsson, J.Å. Jönsson (2008), Analysis and quantification of parabens in cosmetic products by utilizing hollow fibresupported

liquid

membrane

and

high

performance

liquid

chromatography with ultraviolet detection, Int. J. Cosmet. Sci., 30(4), 297–307.

T.F. Tsai, M.R. Lee (208), “Determination of antioxidants and

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

59.

preservatives in cosmetics by SPME combined with GC–MS”, Chromatographia, 67, 425–431.

60.

T.J. Yang, F.J. Tsai, C.Y. Chen, T.C.C. Yang, M.R. Lee (2010), Determination of additives in cosmetics by supercritical fluid extraction on-line headspace solid-phase microextraction combined with gas chromatography–mass spectrometry, Anal. Chim. Acta, 668 (2), 188– 194.

61.

V. Cˇiuvašovaité, E. Adomavicˇi~uté, V. Vicˇkacˇkaité (2007), Solid-phase microextraction of parabens by polyaniline–polypyrrole coating, Chemija, 18(3), 11–15.

62.

W. Gao, C. Legido-Quigley (2011), “Fast and sensitive high performance liquid chromatography analysis of cosmetic creams for hydroquinone, phenol and six preservatives”, J. Chromatogr. A, 4307–4311.

63.

Y. Yamini, A. Saleh, M. Rezaee, L. Ranjbar, M. Moradi (2012), Ultrasound assisted emulsification microextraction of various preservatives from cosmetics, beverages and water samples, J. Liq. Chromatogr. Relat.

Technol., 35(18), 2623–2642.

64.

Yazar K, Johnsson S, Lind ML, et al (2011), “Preservatives and fragrances in selected consumer-available cosmetics and detergents”, Contact

Dermatitis, 64(5), 265-272.

Yu Y, Huang Q, Wang Z, Zhang K, Tang C, Cui J, et al (2011), “Occurrence and behavior of pharmaceuticals, steroid hormones, and endocrine-disrupting personal care products in wastewater and the recipient river water of the Pearl River Delta, South China”, J Environ Monit,13, 871–878.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

65.

PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các mẫu mỹ phẩm được sử dụng để xác định sự có mặt của 5 paraben cấm Số ĐKKN

Nhà sản xuất

Nước rửa tay bảo vệ khỏi vi khuẩn

Procter & Gamble (P&G), China

Nước rửa tay bảo vệ khỏi vi khuẩn Lifeboy

Công ty TNHH quốc tế Unilever VN

Mô tả

Thông tin chung

Lô: 70861864AD NSX: 27/3/2017 HD: 24 tháng

48L02

Lô: 36 NSX: Không có HD: 26/04/2020

Lô: 7HN7 NSX: 31/3/2017 HD: 3 năm SCB: 100404/14/CBMP QLD Lô: 7HPC NSX: 03/04/2017 HD: 3 năm SCB: 24735/16/CBMP QLD

48L03

Dầu rửa mặt, tẩy trang dạng bọt 2 trong 1 Naive

Kracie home Products, Ltd, Japan

48L04

Sữa rửa mặt lá đào Naive

Kracie home Products, Ltd, Japan

48L05

Sữa rửa mặt trắng da Nivea

Thái Lan, Phân phối: Công ty TNHH DKSH Việt Nam

Sữa rửa mặt Pond's pure white

PT Unilever Indonesia Tbk, JI, Lô: 312 Jatabeka. Phân NSX: 15/10/2017 phối : Công ty HSD: 15/09/2020 TNHH quốc tế Unilever VN

Sữa rửa mặt Benew snail

Hàn Quốc Phân Phối: CTY TNHH quốc tế Thiên Anh

48L06

48L07

Lô: 73513877 NSX:02/09/2017 HSD: 30 tháng

Công thức

Chế phẩm màu trắng dạng lỏng, sệt, có mùi thơm.

Không có paraben

Chế phẩm màu trắng dạng lỏng, sệt, có mùi thơm

Không có paraben

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

48L01

Tên sản phẩm

Dung dịch không Không có màu, có mùi thơm. paraben

Kem màu trắng có Không có mùi thơm. thông tin

Kem màu trắng có Methyl mùi thơm. paraben

Kem màu ghi xám, Không có có mùi thơm. paraben

Lô: QF131 NSX: Không có Kem màu trắng có HSD: 21/07/2020 mùi thơm.

SCB: 4/8/15/CBMP - QLD

Methyl paraben, Propyl paraben

Số ĐKKN

Tên sản phẩm

Nhà sản xuất

48L09

Thái Lan, Phân Nước súc miệng phối: Công ty Listerine natural TNHH Johnson green tea and Johnson VN

Lô: P145L NSX: 25/05/2017 HSD: 05/2020 SCB: 67046/12/CBMPQLD Lô: M282L NSX: 08/10/2016 HSD: 10/2019 SCB: 77498/13/CBMPQLD

48L10

Nước súc miệng colgate plax peppermint fresh

Thái Lan Phân phối: Cty TNHH colgate Pamonive VN

Lô: 7188TH1123 NSX: không có HSD: 07/2019

Công thức

Dung dịch trong suốt, màu tím, có mùi bạc hà.

Không có paraben

Dung dịch trong suốt, màu vàng chanh, có mùi bạc hà.

Không có paraben

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

48L08

Thái Lan, Phân Nước súc miệng phối: Công ty Listerine total TNHH Johnson care and Johnson VN

Mô tả

Thông tin chung

Dung dịch trong suốt, màu xanh nước biển, có mùi bạc hà.

Không có paraben

Phụ lục 2: Các phương pháp phân tích xác định paraben trong mỹ phẩm

Stt

Nền mẫu Các paraben 1. Phân tích trực tiếp

1

MP, EP, PP, BP

Một que thủy tinh Dip-IT đã được nhúng vào mẫu, nhẹ nhàng lau bằng vải không có xơ và đặt trực tiếp vào nguồn ion DART.

DART-MS (Phân tích trực tiếp - Sắc kí khối phổ)

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Dầu rám nắng, kem rám nắng, sữa, lotion, kem che khuyết điểm 2. Đồng nhất hóa MP, EP, Kem, lotion, dầu gội, dầu PP, BP xả tóc, xà phòng nước

Kĩ thuật phát hiện

Nhận xét về chuẩn bị mẫu

2

MP, EP, PP, BP

3

MP, EP, PP, BP

4

MP, EP, PP, BP, IBP

5

MP, EP, PP, BP

6

MP, EP, PP, BP, BzP

7

Sữa tắm, lotion, kem dưỡng em bé, kem dưỡng móng, gel, dầu gội, dầu xả tóc, khử mùi Kem, lotion

Lotion, kem và các loại mỹ phẩm khác Kem, lotion

Nước hoa

8

MP, EP, Mỹ phẩm PP, BP

9

MP, EP, PP, BP,

Lotion dưỡng mặt và dưỡng thể

LOD

Bán định lượng

0,5 g mẫu và 2 mL methanol. Lắc xoáy (2 phút). Lắc siêu âm (5 phút) và ly tâm (10 phút). 500 μL của dịch trong trên mặt được pha loãng đến 5 mL với dung dịch natri lauryl sulfat. Lọc.

0,1 g mẫu với 3 mL methanol. Lắc xoáy (3 phút). Lắc siêu âm (20 phút).

Ly tâm (10 phút). Lọc.

HPLC-UV-vis

0.04– 0.1 µM

GC-MS/MS

0.05– 0.5 µg /g1

0.2 g mẫu với 60% (v / v) methanol.

Lắc siêu âm (30 phút). Ly tâm và lọc.

HPLC-UV-vis

0,3 g mẫu với 800 µl methanol. Lắc xoáy (1 phút) và ly tâm (10 phút). Dịch trong được làm khô và hòa tan lại trong 200 µl nước.

Thêm 5 mL methanol / nước vào 0,2 g mẫu và lắc siêu âm (30 phút). Ly tâm (10 phút) và lọc.

Các tỉ lệ pha loãng khác nhau với ethyl acetate (1:10, 1: 100 hoặc 1: 1000).

CE-UV (Điện di mao quản với detector UV) HPLC-UV

0.015– 0.2 µg /mL 0.005– 2 µg /mL

0,5 g mẫu với 10 mL ethanol. Lắc siêu âm (10 phút). Pha loãng với 0,2 M đệm muối phosphat (pH 6,5) đến 500 mL. Pha loãng mẫu với methanol. Lắc xoáy (3 phút) và để yên (3 phút). Lắc xoáy (3 phút) và ly tâm (10 phút). Dịch

SWV (Kĩ thuật vôn-ampe sóng vuông)

GC-MS

UHPLC-UV

0.2 µg /mL 1.6 106 –5 106 % (w/v) 0.2–0.4 µM

Không có thông

10

11

12

13

14

15

16

Các paraben IPP, IBP MP, EP, PP, BP

Nền mẫu

Kĩ thuật phát hiện

Nhận xét về chuẩn bị mẫu trong được pha loãng và lọc.

LOD tin

Sữa rửa mặt tạo bọt

Mẫu trộn với 5 ml methanol. Lắc siêu âm (10 phút) và lọc. Dung dịch được pha loãng đến 10 ml.

Lotion dưỡng thể, gel tắm, dầu thơm bôi tóc, kem

2 g mẫu với 5 mL methanol. Lắc siêu âm (10 phút). Lắc xoáy (1 phút) và pha loãng với methanol. Lọc.

MP, EP, PP, BP

Lotion

0.2 g mẫu với 10 mL methanol. Lắc siêu âm (30 phút) và ly tâm (20 phút).

Dịch trong đem lọc.

UPLC-UV

MP, EP, PP, BP

Mỹ phẩm

MEKC (Sắc kí điện động micell)

0.3 µM

MP, EP, PP, BP

Mỹ phẩm

CE-UV

0.06 – 0.15 µg/mL

MP, EP, PP, BP

Nước vệ sinh, sữa rửa mặt, gel tắm

0,5 g mỹ phẩm và methanol. Lắc siêu âm (20-30 phút). Ly tâm và chuyển lớp chất hữu cơ. Lặp đi lặp lại 3 lần. Trộn tất cả dịch trong và pha loãng với methanol. Lọc lại.

Các mẫu được phân tán trong ACN. Lotion dạng dầu (0,1 g) được phân tán với 0,9 ACN, Lắc siêu âm (30 phút).

Ly tâm (10 phút).

1 g mẫu với 5 ml methanol. Lắc siêu âm (10 phút), pha loãng và lọc. Pha loãng với nước.

HPLC-CL (HPLC detector huỳnh quang)

MP, EP, PP, BP

Hai bọt cạo râu và một thuốc khử mùi Dầu gội đầu

Mẫu trong 20 ml nước. Khuấy và pha loãng với pha động. Lọc. Thuốc khử mùi (1 mL) được lắc siêu âm (15 phút), pha loãng và lọc.

0,5-1 g mẫu với 1 mL H2SO4 2M , 40ml EtOH-H2O và 10 mL chuẩn nội.

Lắc (1 phút). Gia nhiệt (5 phút, 60 ° C). Làm mát và lưu trữ tủ lạnh (1 giờ).

Lọc.

1 g mẫu với 6 mL ethanol. Lắc siêu âm (10 phút). Ly tâm.

HPLC-UV

1.9 103 –5.3 10-3 µg/ mL 0.014– 0.053 µg/ mL Not given

MP, EP, PP, BP

LP-LC-CD (sắc kí lỏng áp suất thấp với detector phát quang hóa học) UPLC-UV

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Stt

17

MP, EP, PP, BP, BzP

18

MP, EP, PP, BP

Lotion

HPLC-UV

MEKC-UV

9.2 x 10-3– 4.8 x 10-2 µM 2.25 10-3– 4.82 10-3 µg/mL 0.05 – 0.95 µg/mL

0.04– 0.77 µg/ mL 0.13– 1.49 µg/

Các paraben

Nền mẫu

Nhận xét về chuẩn bị mẫu

19

MP, EP, PP, BP, BzP

Kem bôi tay, phấn nền

Thêm 25 µL chuẩn nội . Bổ sung 1 mL ACN và Lắc siêu âm (1 giờ, 30°C).

Lọc và pha loãng với nước.

20

MP, EP, PP, BP

Lotion bôi da

Pha loãng mẫu với nước. Bổ sung bistris propan và điều chỉnh pH đến 9.

21

MP, EP, PP, BP

Nước hoa hồng

Mẫu được hòa tan trong ethanol và pha loãng với nước cất.

MP, EP, PP, BP

Gội đầu dạng bọt

MP, EP, PP, BP, IBP, BzP MP, EP, PP, BP

Kem bôi da

Thêm 10 mL ether-acid acetic (1%) vào mẫu. Lắc siêu âm (5 phút), khuấy (2 phút). Lặp đi lặp lại. Bay hơi. Đối với CZE, chất chiết xuất hoà tan trong methanol: đệm borat và lọc. Đối với HPLC, chất chiết xuất hòa tan trong methanol, pha loãng với pha động và lọc.

Phương pháp định lượng chính thức của châu Âu.

MP, EP, PP

Mỹ phẩm

26

MP, PP

Mỹ phẩm

27

MP, EP, PP, BP

Kem

22

23

24

25

Kĩ thuật phát hiện CEC-UV (Sắc kí điện di mao quản với detector UV) ITP-ZE (Điện di mao quản vùng đẳng dòng) CZE-UV (Điện di mao quản vùng detector UV) HPLC-UV /CZEUV

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Stt

Bọt tắm, sữa tắm, kem nền, kem tay, dầu gội đầu

0.2 mẫu với 25 g n-propanol . Lắc. Đun nóng. Pha loãng 5,0 ml dung dịch đến 50 ml với 0,1 M SDS hoặc npropanol. Nếu mẫu chứa nhiều tá dược tan trong dầu, một nhũ tương được tạo thành bằng pha loãng với 0,1 M SDS. Sau đó, pha loãng với n-propanol.

Mẫu với H2SO4 và methanol. Lắc siêu âm (30 phút). Đối với mỹ phẩm có chứa - hòa tan chất béo, đun nóng (60°C) và Lắc siêu âm. Ly tâm (10 phút). Lặp lại quy trình. Dịch chiết được tập hợp và vừa đủ 10 mL với methanol.

Acid hóa mẫu (10% m / v H2SO4).

Thêm 10mL IS. Lắc, đun nóng (60 ° C) và lọc / ly tâm. Đối với sản phẩm hỗn dịch, thêm 10 mL IS và 30 mL ethanol đến 10 g mẫu. Khuấy (10 phút) và lọc.

1 g kem được pha loãng 1:10 với THFđệm phosphat (3: 7 (v / v) (pH 3,5)).

Lắc xoáy và làm nóng nhẹ.

HPLC-UV

Sắc kí lỏng điện động (MLC)

LOD mL 1.25– 2.50 µg/ mL Cỡ µM

0.65– 0.92 µg/ mL 0.05– 0.21 µg/ mL

5–30 µg/ mL 0.03– 0.3 ng

HPLC-UV

Không đưa ra

HPLC-UV

Không đưa ra

HPLC-DAD

Không đưa ra

28

29

30

31

Nền mẫu Các paraben 3. Chiết lỏng - lỏng MP, EP, Bọt vuốt tóc, PP, BP gel làm sạch

MP, EP, PP, BP

Kem đánh răng, keo bọt

MP, EP, PP, BP

Mỹ phẩm

4. Chiết pha rắn MP, EP, Dầu gội đầu PP

MP, EP, PP, BP, IBP

Kem đánh răng

33

MP, EP, PP, BP

34

MP, EP, PP

Dầu gội đầu, kem đánh răng, gel dưỡng da sau cạo râu, kem dưỡng da.

Lotion nền nước và Lotion nền dầu, gel và

32

Kĩ thuật phát hiện

Nhận xét về chuẩn bị mẫu

Bọt vuốt tóc: 1 mL HCl 50% (v / v) và 10 mL NaCl bão hòa được thêm vào 15 g mẫu. Chiết xuất với 50 mL ether diethyl (3 lần,10 phút mỗi lần). Dịch chiết được tập trung và xử lý với NaCl bão hòa và 3 lần với 30 mL 0,02 g / mL NaHCO3. Chiết xuất khô với 10g Na2SO4. Lọc, bốc hơi và tái hòa tan trong 50 mL ACN. Gel làm sạch : 1 g được pha loãng với 5 mL MeOH. Lắc siêu âm (10 phút).

Lọc. Pha loãng.

15 g mẫu với 1 mL HCl 1: 1 và 10 mL dung dịch nước NaCl bão hòa. Trích xuất bằng 50 ml diethyl ether (ba lần).

Dịch chiết làm sạch với NaCl bão hòa và 3 lần với 30 mL NaHCO3 10-2 g/ml. Làm khô bằng 10 g Na2SO4. Lọc.

Bốc hơi và vừa đủ 50 mL với ACN. Điều chỉnh pH và pha loãng.

Chiết xuất vào benzen hoặc chloroform. Dẫn xuất hóa với phosphorochloridat. Làm sạch (Florisil minicolumn).

FIA-HPLCUV

1 g mẫu với 25 mL nước. Lắc siêu âm (5 phút). Sau đó, SPE (C18 sorbent) với 1 mL dung dịch mẫu. Dung dịch rửa giải được pha loãng đến 10 mL với nước. Lọc.

1 g mẫu với 5 mL methanol. Ly tâm (15 phút). 100 µL dịch trên bề mặt được pha loãng (1:20) trong nước. SPE (cột Licrolut RP-18). Rửa giải bằng methanol. Bốc hơi đến khô và hòa tan lại trong 2 mL methanol.

1,2 g mẫu với nước. Thêm 1 mL HCl. Pha loãng đến 100 mL bằng nước.

Lọc. 2 mL mẫu cho qua cột C18. Rửa giải bằng methanol. Bổ sung 5,5 mL nước, 2 giọt 0,2 N NaOH, và 0,5 ml IS vào dung dịch rửa giải.

1 g mẫu với 2,0 ml dung dịch đệm natri tetraborat 50 mM và 2 ml ACN. Pha loãng đến 10 mL với nước. Lắc siêu âm. Chiết xuất bằng C8. Rửa giải

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Stt

LOD

0.012– 0.03 µM

FIA-LC-UV

0.03– 0.85 µg/ mL

GC-FPD

Không đưa ra

HPLC-ED (HPLC đầu dò điện hóa)

0.4 µg/ mL

HPLC-UV

0.1– 0.3 µg/ mL

CE-UV

1.42– 2.86 µg/ mL

MEKC

0.07– 0.1 µg/ mL

Stt

Các paraben

Nền mẫu kem.

MP, EP, PP, BP

Xịt tóc, nước hoa, thuốc khử mùi, kem, lotion

36

MP, EP, PP, BP

Xịt tóc, nước hoa, thuốc khử mùi, kem, lotion…

Kem, lotion và bọt rửa mặt

37

38

LOD

với đệm natri tetraborate 10 mM có chứa 60% (v / v) ethanol. Đối với một số mẫu, đầu tiên khuấy với 5 mL ethanol và lọc.

1 g mẫu với 10 mL methanol. Lắc siêu âm (30 phút). Làm khô dưới N2. C18 (3 mL). Rửa giải với 5 mL methanol.

Làm khô dưới N2. Hòa tan lại trong 1 mL methanol. Lọc.

Các mẫu được pha loãng với methanol và lắc siêu âm. SPE 3ml mẫu sử dụng C18.

HPLC-UV-vis GC-MS

Không đưa ra

GC-MS

1. 104 –5 103 µg/ mL

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

35

Kĩ thuật phát hiện

Nhận xét về chuẩn bị mẫu

MP, EP, PP, BP, IPP, IBP

MP, EP, PP, BP

39

MP, EP, PP, BP

40

MP, EP, PP

Dưỡng ẩm, chống nhăn và kem tay, kem che khuyết điểm, lotion, dầu gội đầu và kem dưỡng làm dịu da sau khi phơi nắng Mỹ phẩm

Kem đánh răng và kem

1 g mẫu với 5 mL THF. Lắc siêu âm (1 phút). Thêm IS, 50 mL dung dịch NaCl bão hòa, và 5 ml 10% H2SO4. Chiết xuất với 50 ml ete diethyl. Làm khô pha hữu cơ. Hơi bay hơi đến khô (40 ° C). Hoà tan trong 10 ml methanol. Ly tâm (5 phút). 2 mL dịch trên bề mặt đem bay hơi. Hòa tan lại trong 10 ml hexanechloroform (75:25). SPE với cột Sep-Pak Florisil (1 mL). Rửa giải bằng 10 ml hexaneethyl acetat (70:30). Bay hơi. Hòa tan lại trong 2 ml methanol bằng siêu âm (1 phút).

1,0 g mẫu đã được pha loãng (giữa 1:20 và 1: 100). Lắc siêu âm (30 phút).

Ly tâm. Điều chỉnh pH đến 3. 1 mL dung dịch được sử dụng cho SPE (cột chứa 20 mg MWCNTs). Rửa giải với 2 mL axeton (1 mL/ phút). Dịch chiết bốc hơi đến khô. Hòa tan lại trong 500 µL pha động.

HPLC-UV

10 ng

C-CAD (Corona charged aerosol detector)

0.5– 2.1 µg/ mL

Chiết pha rắn nền graphene.

CE-UV-vis

0.10– 0.15 µg/ mL 3. 10-3 - 4.103 µg/ mL

5 mg mẫu với 3 mL methanol. Lắc siêu HPLC-UV âm (5 phút) và pha loãng đến 50 ml bằng nước. Ly tâm (15 phút). Lọc lớp dịch phía trên và pha loãng đến 500 mL với nước. Chiết xuất sử dụng 100 mg Fe3O4 hạt nano phủ 100%

41

42

43

44

45

46

Các paraben

Nền mẫu

Kĩ thuật phát hiện

Nhận xét về chuẩn bị mẫu

Polyaniline có khuấy trộn (2 phút). Sự giải hấp thụ với 100 µL 3% (v / v) acid axetic trong ACN. 5. Matrix solid-phase extraction MP, EP, Son môi, 0,5 g mẫu được trộn với Na2SO4 và PP, BP, kem che Florisil (5 phút). Chuyển sang một cột IPP, IBP, khuyết điểm, và rửa giải với hexane / axeton. Bổ gel tay, sữa sung 100 µL acetic anhydrit có chứa BzP dưỡng thể và 2,5% pyridin vào dd rửa giải đến 1 chống nắng, mL. Gia nhiệt (80 ° C, 10 phút). Làm kem khử nguội. mùi.

6. Chiết pha rắn micro phân tán MP, EP, Nước súc Siêu âm 10 mL mẫu với 5 mg hạt nano miệng, kem magnetite chức hóa nhóm amino (2 PP, BP phút). Thêm 15 µl hexyl acetat. Khuấy tay.

(5 phút). Rửa giải với 25 µL ACN bởi siêu âm (2 phút). Thêm vào 10 µL acetic anhydrit và 10 µL pyridin.

Khuấy (5 phút). Bay hơi. Hòa tan lại với 5 µL ACN. 7. Vi chiết pha rắn MP, EP, Kem chống Phân tán mẫu trong 20 g/ L NaCl. nắng, lotions, Siêu âm (10 phút). Sợi phủ polymer PP, BzP PEG-DA ngâm trong 10 mL dung kem. dịch mẫu (20 phút, 65 ° C). Giải hấp thụ trong 1 mL methanol. Siêu âm (3 phút) và lọc.

MP, EP, Lotions, kem 0,1 g mẫu với 2 mL methanol. Lắc.

PP, BP, Vừa đủ đến 100 mL bằng nước. Từ 4 mL vừa đủ thành 100 mL với nước có IPP, IBP 12% NaCl. 30 mL được sử dụng cho SPME sử dụng sợi PA và 30 mL dung dịch mẫu (40 phút, 40 ° C). Giải hấp thụ bằng nhiệt.

MP, EP, Pha loãng mẫu 10 lần với NaCl 0.4 g/ Tonics mL. SPME bằng cách nhúng sợi bọc PP polyaniline-polypyrrole trong dung dịch mẫu (30 phút, 600 rpm). Giải hấp thụ bằng nhiệt (15 phút).

MP, EP, Sữa dưỡng 0,02 g mẫu được chiết xuất bằng CO2 PP, BP, (emulsion), ở 13.840 kPa, 55°C (chiết tĩnh 10 phút, chiết động 15 phút). Tập hợp trong một IPP, IBP lotions và kem dưỡng lọ với 100 µL BSTFA trong 0.1% TMCS. HS-SPME sử dụng sợi PA (15 thể phút, 50 °C).

8. Chiết hấp thụ trên thanh khuấy (SBSE)

GC-MS

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Stt

LOD

1.4 107 –3.9 10-6 % (w/w)

GC-FID

5. 10-5 –3. 104 µg/ mL

UPLC-DAD

0.12– 0.15 µg/ mL

GC-MS

4. 10-4 –8.5 10-2 µg/ mL

GC-FID

0.07– 17 µM

GC-MS

5. 10-4 –8.3 10-3 µg/g

47

48

Các paraben MP, EP, PP, BP

Nền mẫu Kem, chống nắng

9. Vi chiết pha lỏng MP, EP, Rửa mặt, kem cân PP, BP bằng độ ẩm, kem cạo râu, kem dưỡng ẩm, keo vuốt tóc

MP, EP, PP

Kem đánh răng, dầu gội đầu, nước súc miệng

MP, EP, PP

Nước súc miệng

MP, EP, PP, BP, IPP

Gel tẩy trang, dung dịch nước súc miệng và gel dưỡng tóc

52

MP, EP, PP, IBP

53

MP, EP, PP

Gel dưỡng tóc và hồi phục tóc sau khi tắm nắng, kem, xà phòng, thuốc mỡ, lotion, kem chống nắng Kem chống nắng, gel dưỡng da sau

49

50

51

Kĩ thuật phát hiện

Nhận xét về chuẩn bị mẫu

LOD

0,5 g mẫu phân tán với 100 mL đệm phosphate. Đun nóng. SBSE sử dụng thanh khuấy tráng PDMS (40 phút, 1200 vòng / phút). Giải hấp thụ trong methanol / nước (20 phút).

LC-UV-vis

0.03– 0.2 µg/g

1 g mẫu với 5 mL ethanol. Lắc xoáy (3 phút) và siêu âm (5 phút). Ly tâm (5 phút). Dịch trong phía trên được lọc và pha loãng 50 lần bằng ethanol.

DLLME. Để có 200 µL dịch chiết xuất, bổ sung 150 µL pyridin. Một hỗn hợp gồm 50 µL chloroform và 10 µL IBCF (isobutyl chloroformate) được tiêm. Lắc xoáy (30 giây). Ly tâm (3 phút).

0.1 g-0.25 g mẫu phân tán trong nước thành 1000 mL. Điều chỉnh pH đến 6.

DLLME. 10 ml dung dịch trong bình nón được đặt trong bể siêu âm và tiêm 30 µL 1-octanol. Siêu âm (2 phút).

Nhũ tương được chuyển vào một xilanh 10ml để lọc trực tiếp và phân tách pha trước khi phân tích.

DLLME. 1ml mẫu được phân tán trong 100ml nước. 2 g NaCl được thêm vào 10 mL dung dịch mẫu. 0,5 ml acetone và 20 µl octanol được tiêm. Ly tâm (10 phút) 0.05 g mẫu với 5 mL axeton / nước (1: 1). Siêu âm (5 phút). Pha loãng với nước và lọc. SDME (47 °C, 20 phút) sử dụng 3 µL hexyl acetate như chất chiết xuất. Sau khi giọt co lại, 0.4 µL BTMSA được lấy để tạo dẫn xuất trong xi-lanh.

0,5 g mẫu với 50 mL nước. HF-LPME (Vi chiết pha lỏng sợi rỗng) sử dụng DHE trong màng chất lỏng được chống đỡ và 7 µL đệm glycine như acceptor.

Chiết xuất trong 30 phút, 700 vòng / phút.

GC-FID

0.029– 0.102 µg/ mL

5 mg mẫu với methanol 20% (v / v) và 1 mL HCl. Siêu âm (10 phút). Pha loãng với nước đến 150 mL và điều

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Stt

HPLC-UV

5 10-4 –2 104 µg/ mL

GC-FID

5 10-3 –0.015 µg/ mL

GC-MS

1. 10-6 –1.5 10-5 µg/ mL

HPLC-UV

Không đưa ra

HPLC-UV

2 10-4 –5 10-4 µg/

Stt

Các paraben

Nền mẫu cạo râu

55

56

57

58

MP, EP, PP

Mỹ phẩm

chỉnh pH đến 6. SFODME. 30 µL dung môi siêu phân tử vào 24 mL dung dịch mẫu. Khuấy (30 phút, 30 ° C).

Vial được làm lạnh và khuấy (3 phút, 600 rpm). Giọt hóa rắn được sử dụng cho phân tích.

USAEME. 40µL 1-octanol đã được tiêm vào dung dịch mẫu (5% w / v).

Siêu âm. Ly tâm. Pha hữu cơ được lấy để phân tích.

10. Chiết xuất siêu tới hạn MP, EP, Kem, sữa 0,05 g mẫu trộn với 1,3 g cát biển. SFE (CO2 siêu tới hạn, 14.000 kPa, 65oC), PP , BP dưỡng da chiết tĩnh 5 phút và chiết động 20 phút.

Pha loãng trong methanol. Bốc hơi dung môi.

MP, EP, 0,02 g mẫu. SFE với ACN 0,05% Kem CO2 siêu tới hạn có sửa đổi(12100 PP, BP KPa, 40°C). Chiết tĩnh15 phút, chiết động 20 phút. Tập trung lại trong 7-8 mL ACN. Pha loãng thành 10 mL với ACN. Lọc. Pha loãng 0,5 ml dịch chiết đến 10 mL với đệm borat 30 mM. MP, EP, Kem, lotions, 0.2-0.3 g mẫu. SFE với CO2 siêu tới hạn (60°C). Hai bước 7 phút (chiết PP, BP sữa động). Tập trung lại trong 1,2 mL methanol. Pha loãng đến 3 mL với methanol.

11. Chiết lỏng cao áp MP, EP, Kem, lotions, 0,5 g mẫu được trộn với 0,1 ml axetic sản phẩm anhydrit và 2,5% pyridin, 1g Na2SO4 PP, BP, và 1g Florisil. PLE với hexane / làm tóc IPP, IBP, acetone (1500 psi, 120°C, 15 phút).

BzP

BSTFA: N,O bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamid; BTMSA: N,O-bis(trimethylsilyl) acetamid FIA: Flow-injection analysis (Phân tích dòng chảy) TMCS: Trimethylchlorosilan

LOD mL

HPLC-UV

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

54

Kĩ thuật phát hiện

Nhận xét về chuẩn bị mẫu

HPLC-MS

CZE-UV-vis

2.5 104 –6 10-4 µg/ mL 4.7 103 – 0.142 µg/ mL 0.97– 1.33 ng

HPLC-UV-vis

Không đưa ra

GC-MS

5,3.106 – 9,8.

10-6 % (w/w)

Phụ lục 3 Thường quy ki ̃ thuâ ̣t Đinh ̣ tính và đinh ̣ lươ ̣ng 5 chất bảo quản isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben trong sữa rửa mă ̣t và nước súc miêng ̣ bằ ng HPLC-DAD 1. Mục đích:

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Mô tả các bước tiến hành để định tính, định lượng 5 chất bảo quản

isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben trong sữa rửa mă ̣t và nước súc miê ̣ng.

2. Phạm vi áp dụng:

- Thường qui này được áp dụng trong viện kiểm nghiệm Thuốc Trung ương

bởi những cán bộ được đào tạo phù hợp.

- Thường qui này được áp dụng để định tính và định lượng 5 chất bảo quản

trong sữa rửa mă ̣t và nước súc miê ̣ng.

3. Tài liệu tham khảo:

- AOAC (1998), Peer-Verified Methods Program, Manual on policies and procedures, Arlington, Va., USA.

- ASEAN (2003), Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm, Bản dịch của Cục quản lý Dược, 2008.

- Bộ Y tế, (Cục Quản lý dược Việt Nam), (2015), Công văn số 6577/QLD-MP về việc cập nhật qui định về các chất dùng trong mỹ phẩm, ngày 13/4/2015.

4. Trách nhiệm: Tất cả cán bộ của khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm có trách nhiệm thực hiện theo quy trình thường quy này khi kiểm tra 5 chất bảo quản isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben trong sữa rửa mă ̣t và nước súc miê ̣ng.

5. Nội dung 5.1. Nguyên lý của phương pháp

5 paraben được hòa tan và chiết ra bằng methanol. Sau đó được phân tích bằng thiết bị HPLC trang bị DAD đặt tại bước sóng 254 nm.

Sự

có

mặt

của

isopropylparaben,

isobutylparaben,

phenylparaben,

benzylparaben và pentylparaben có thể được khẳng định bằng cách so sánh thời gian lưu và phổ UV-VIS của pic nghi ngờ trên sắc ký đồ mẫu thử với các pic isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben tương ứng trong sắc ký đồ mẫu chuẩn.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

5.2. Thiết bị, thuốc thử và chất chuẩn

5.2.1. Chất chuẩn, dung môi, hóa chất: * Chất chuẩn:

Isopropylparaben,

isobutylparaben,

phenylparaben,

benzylparaben

và

pentylparaben

* Dung môi, hóa chất - Acetonitril HPLC

- Methanol tinh khiết phân tích 5.2.2. Thiết bị và dụng cụ

- Máy sắc ký lỏng có trang bị DAD

- Cân phân tích chính xác tới 0,01 mg - Máy lắc siêu âm

- Dụng cụ thủy tinh: Bình định mức, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh 5.2.3. Đối tượng nghiên cứu - Dầu rửa mặt, tẩy trang dạng bọt 2 trong 1 Naïve do công ty Kracie home products, Ltd., Nhật Bản sản xuất.

- Nước súc miệng Colgate Plax peppermint fresh do Thái Lan sản xuất

5.3. Quy trình thử 5.3.1. Chuẩn bị mẫu thử Cân chính xác khoảng 0,5 g kem vào cốc có mỏ 50 ml, thêm 10 ml methanol, dùng đũa thủy tinh phân tán đều kem trong cốc, chuyển vào bình định mức 50,0 ml. Tráng rửa cốc nhiều lần với 30 ml methanol và chuyển vào bình định mức trên, lắc siêu âm 10 phút. Để nguội, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều.

Lọc qua giấy lọc, lọc qua màng lọc 0,45 µm.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

5.3.2. Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp:

Cân chính xác khoảng 20,0 mg từng chất chuẩn isopropylparaben,

isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben vào các bình định mức 100,0 ml , thêm 30 ml methanol, lắc cho tan. Thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 2,0 ml từng dung dịch trên cùng vào mô ̣t biǹ h đinh ̣ mức 50,0 ml, pha loãng bằng methanol. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

5.3.3. Chuẩn bị mẫu đánh giá:

- Dùng trong thường quy kiểm tra mẫu: chuẩn bị mẫu chuẩn thứ 2 tương tự

chuẩn 1, yêu cầu hệ số tương đồng giữa 2 chuẩn là 0,98 – 1,02.

- Dùng trong trường hợp mẫu không đạt và nền mẫu phức tạp: Cân chính xác

khoảng 0,5 g sữa rửa mă ̣t hoặc nước súc miê ̣ng vào cốc có mỏ hoặc bình định mức theo quy trình, thêm chính xác một lượng chuẩn sao cho nồng độ cuối cùng thu được tương ứng với khoảng 100 – 120 % nồng độ định lượng và tiếp tục xử lý mẫu theo quy trình.

5.3.4. Điều kiện sắc ký: - Cột Luna C18, (250 x 4,6 mm), 5 µm với tiền cột thép không gỉ (3 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C18 (5 µm).

- Pha động: Acetonitril - nước (40:60).

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/min.

- Thể tích tiêm: 10 µl - DAD đặt ở bước sóng 254 nm.

5.3.5. Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt các dung dịch chuẩn, dung dịch thử và dung dịch mẫu QC vào hệ thống sắc ký. Tiến hành sắc ký khoảng 50 phút. Ghi lại các sắc ký đồ.

5.3.6 Yêu cầu tính thích hợp hệ thống:

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp:

- RSD của thời gian lưu không được lớn hơn 1,0 % và RSD của diện tích píc

không được lớn hơn 2,0 %.

- Hệ số phân giải giữa các paraben không được nhỏ hơn 1,5.

- Hệ số bất đối không được lớn hơn 2,0.

- Số đĩa lý thuyết không được nhỏ hơn 2500.

5.3.7. Cách đánh giá kết quả: * Định tính:

- Dựa vào thời gian lưu: so sánh thời gian lưu của píc thu được từ dung dịch

thử và píc thu được từ dung dịch chuẩn.

- So sánh phổ UV-VIS của píc thu được từ dung dịch thử có thời gian lưu

tương ứng với píc thu được từ dung dịch chuẩn và hệ số chồng phổ của các pic này phải không được nhỏ hơn 0,99. * Định lượng: - Từ các giá trị diện tích píc, lượng cân mẫu chuẩn và mẫu thử, độ pha loãng tính ra hàm lượng các chất bảo quản có trong chế phẩm.

- Từ các giá trị diện tích píc, lượng cân mẫu chuẩn và mẫu thử, lượng chuẩn thêm vào mẫu QC và độ pha loãng của các dung dịch tính ra phần trăm thu hồi các chất bảo quản. Yêu cầu phần trăm thu hồi phải từ 95 % đến 105 % (Theo AOAC).

6. Qui định chung Tất cả cán bộ của khoa khi tiến hành kiểm tra 5 paraben isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben trong mỹ phẩm phải thực hiện đúng theo quy trình thường quy này và các biểu mẫu

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

có liên quan.

7. Tài liệu viện dẫn và các biểu mẫu liên quan

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Phụ lục 4

Một số sắc kí đồ phân tích 5 paraben IPP, PheP, BzP, IBP, PeP

Report(Report Editor) 26/03/2018 18:39:13 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : C 1.100_1.lcd : tp.lcm : 10012018.lcb : 1-39 : 10 uL : 10/01/2018 22:36:19 : 15/03/2018 11:01:00

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

C 1.100_1.lcd

0.0

Benzyl PB / 26.328

2.5

Phenyl PB / 21.215

5.0

Isopropyl PB / 13.914

7.5

PDA Multi 1 254nm,4nm

/ 2.496 / 2.886

10.0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

0

5

10

15

20

25

30

35 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 2.496 2.886 Isopropyl PB 13.914 Phenyl PB 21.215 Benzyl PB 26.328

Area 13724 26056 101160 89515 80681

C 1.100_1.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) --1 -0.083 145 1.141 15.265 13090 1.111 11.986 13450 1.094 6.349 14351

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\C 1.100_1.lcd

Report(Report Editor) 26/03/2018 18:41:09 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : C 2.100_1.lcd : tp.lcm : 10012018.lcb : 1-40 : 10 uL : 11/01/2018 00:22:22 : 15/03/2018 13:46:52

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

C 2.100_1.lcd

0

Benzyl PB / 26.295

5

Phenyl PB / 21.185

10

Isopropyl PB / 13.902

15

PDA Multi 1 254nm,4nm

/ 2.496 / 2.879

20

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

0

5

10

15

20

25

30

35 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 2.496 2.879 Isopropyl PB 13.902 Phenyl PB 21.185 Benzyl PB 26.295

Area 13710 28047 203923 181562 165956

C 2.100_1.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) --2 -0.086 135 1.159 14.976 13356 1.118 12.062 13604 1.098 6.344 14143

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\C 2.100_1.lcd

Report(Report Editor) 26/03/2018 18:41:59 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : C 3.100_1.lcd : tp.lcm : 10012018.lcb : 1-41 : 10 uL : 11/01/2018 02:08:25 : 15/03/2018 13:50:03

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

C 3.100_1.lcd

Benzyl PB / 26.199

/ 2.544 / 2.863 / 2.992

10

Phenyl PB / 21.117

20

PDA Multi 1 254nm,4nm

Isopropyl PB / 13.851

30

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

0

0

5

10

15

20

25

30

35 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 2.544 2.863 2.992 Isopropyl PB 13.851 Phenyl PB 21.117 Benzyl PB 26.199

Area 13922 17547 12922 303000 269439 247669

C 3.100_1.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) --13 -0.147 54 -0.081 55 1.162 10.313 12504 1.121 11.741 12949 1.101 6.196 13612

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\C 3.100_1.lcd

Report(Report Editor) 26/03/2018 18:46:30 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : C 5.100_3.lcd : tp.lcm : 10012018.lcb : 1-42 : 10 uL : 11/01/2018 04:29:49 : 18/01/2018 15:42:28

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

<Chromatogram>

C 5.100_3.lcd

/ 2.496 / 2.874

10

Benzyl PB / 26.245

20

Phenyl PB / 21.150

30

PDA Multi 1 254nm,4nm

Isopropyl PB / 13.867

40

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

0

0

5

10

15

20

25

30

35 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 2.496 2.874 Isopropyl PB 13.867 Phenyl PB 21.150 Benzyl PB 26.245

Area 12504 26314 503149 449949 412952

C 5.100_3.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) --4 -0.130 152 1.158 15.446 12815 1.121 11.844 13080 1.099 6.234 13761

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\C 5.100_3.lcd

Report(Report Editor) 26/03/2018 18:47:24 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : C 8.100_1.lcd : tp.lcm : 10012018.lcb : 1-43 : 10 uL : 11/01/2018 08:37:17 : 15/03/2018 14:03:20

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

C 8.100_1.lcd

10 0

Benzyl PB / 26.127

20

Phenyl PB / 21.078

30

Isopropyl PB / 13.839

40

PDA Multi 1 254nm,4nm

/ 2.868

50

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

0

5

10

15

20

25

30

35 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 2.868 Isopropyl PB 13.839 Phenyl PB 21.078 Benzyl PB 26.127

Area 25201 811058 726070 667477

C 8.100_1.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) --182 1.154 16.376 12749 1.121 11.795 13080 1.099 6.203 13773

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\C 8.100_1.lcd

Report(Report Editor) 26/03/2018 18:48:03 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : C 10.100_1.lcd : tp.lcm : 10012018.lcb : 1-44 : 10 uL : 11/01/2018 10:23:21 : 15/03/2018 14:40:21

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

C 10.100_1.lcd

0

Benzyl PB / 25.760

25

Phenyl PB / 20.771

50

Isopropyl PB / 13.650

75

PDA Multi 1 254nm,4nm

/ 2.480 / 2.870

100

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

0

5

10

15

20

25

30

35 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 2.480 2.870 Isopropyl PB 13.650 Phenyl PB 20.771 Benzyl PB 25.760

Area 12361 28346 1025100 918033 844418

C 10.100_1.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) --11 -0.197 148 1.153 15.036 12429 1.122 11.618 12740 1.100 6.130 13349

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\C 10.100_1.lcd

Report(Report Editor) 26/03/2018 18:48:38 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : C 15.100_1.lcd : tp.lcm : 10012018.lcb : 1-45 : 10 uL : 11/01/2018 12:09:26 : 15/03/2018 14:42:55

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

C 15.100_1.lcd

25 0

Benzyl PB / 25.699

Phenyl PB / 20.745

50

Isopropyl PB / 13.648

75

/ 2.528 / 2.877

100

PDA Multi 1 254nm,4nm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

0

5

10

15

20

25

30

35 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 2.528 2.877 Isopropyl PB 13.648 Phenyl PB 20.745 Benzyl PB 25.699

Area 12113 31264 1560129 1398345 1289020

C 15.100_1.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) -----149 1.177 14.961 12134 1.135 11.485 12560 1.113 6.060 13208

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\C 15.100_1.lcd

Report(Report Editor) 26/03/2018 18:49:14 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : C 20.100_1.lcd : tp.lcm : 10012018.lcb : 1-46 : 10 uL : 11/01/2018 13:55:31 : 15/03/2018 14:46:18

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

C 20.100_1.lcd

0

Phenyl PB / 20.558

Isopropyl PB / 13.524

0

Benzyl PB / 25.477

50

PDA Multi 1 254nm,4nm

/ 6.281

100

/ 2.472 / 2.878

150

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

5

10

15

20

25

30

35 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 2.472 2.878 6.281 Isopropyl PB 13.524 Phenyl PB 20.558 Benzyl PB 25.477

Area 10792 25515 23744 2090358 1884605 1735624

C 20.100_1.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) ----0.044 155 1.302 5.778 9823 1.177 19.494 12206 1.139 11.508 12593 1.116 6.070 13172

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\C 20.100_1.lcd

Report(Report Editor)

Analysis Report

09/02/2018 14:44:14 Page 1 / 2

<Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : L03_4ppm.4.lcd : tp 2 PB.lcm : 24012018.lcb : 1-29 : 10 uL : 28/01/2018 05:40:32 : 29/01/2018 09:40:51

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

<Chromatogram>

L03_4ppm.4.lcd

mAU 20

0 0

10

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 2.191 2.279 2.528 2.883 3.220 3.333 5.336 Isobutyl PB 23.633 Pentyl PB 43.220

Pentyl PB / 43.220

5

Isobutyl PB / 23.633

10

/ 2.191 / 2.279 / 2.528 / 2.883 / 3.220 / 5.336 / 3.333

15

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

PDA Multi 1 254nm,4nm

20

Area 42336 14317 8275 14069 43988 13359 1713 189481 171415

30

Tailing Factor

------1.143 1.014 1.036

40

50

60 min

Resolution(USP) Theoretical Plates/meter(USP) -737 0.158 6750 0.050 7 0.069 1643 0.663 14079 0.395 13776 8.235 81438 38.445 103486 18.310 104514

Method <<Header>> <<Oven>> Oven Model Enable Oven Oven Temperature Maximum Temperature

: LC-2040 Oven : Use : 40 C : 90 C

<<LC Time Program>> Time Module 0.01 Controller

Command Stop

Value

D:\Viet Ai\PB\25.01.2018\2PB\L03_4ppm.4.lcd

Report(Report Editor) 09/02/2018 14:44:14 Page 2 / 2

: Low pressure gradient : LC-2040 Pump : 1.0000 mL/min : 0.0 % : 40.0 % : 60.0 % :0 :0 :0 : 300 bar : 0 bar : Auto : Off : None

<<PDA>> Lamp Use Cell Temp.

Cell Temp.

: D2 : Use : 40 C

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<<Pump>> Mode Pump A Flow B Conc.

C Conc.

D Conc.

B Curve C Curve D Curve PressMax PressMin LPGE Mode Compressibility Setting Gradient Start Adjustment

D:\Viet Ai\PB\25.01.2018\2PB\L03_4ppm.4.lcd

Report(Report Editor) 27/03/2018 17:55:03 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : L03_8ppm.3.lcd : tp 2 PB.lcm : 24012018.lcb : 1-34 : 10 uL : 26/01/2018 13:25:03 : 09/02/2018 14:18:16

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

L03_8ppm.3.lcd

Pentyl PB / 42.530

/ 5.309

10

PDA Multi 1 254nm,4nm

Isobutyl PB / 23.295

20

/ 2.171 / 2.315 / 2.640 / 2.914 / 3.230

30

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

0

0

10

20

30

40

50 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 2.171 2.315 2.640 2.914 3.230 5.309 Isobutyl PB 23.295 Pentyl PB 42.530

Area 41551 21315 3530 12088 59788 1711 382359 355376

L03_8ppm.3.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) --321 -0.407 1757 -0.394 55 -0.257 281 -0.581 1067 1.188 7.072 12197 1.057 38.511 15777 1.046 18.485 16135

D:\Viet Ai\PB\25.01.2018\L03_8ppm.3.lcd

Report(Report Editor) 27/03/2018 17:47:49 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : L03_12ppm.1.lcd : tp 2 PB.lcm : 24012018.lcb : 1-38 : 10 uL : 26/01/2018 21:25:22 : 09/02/2018 14:36:40

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

L03_12ppm.1.lcd

0

0

10

20

30

40

Pentyl PB / 42.616

10

Isobutyl PB / 23.364

20

PDA Multi 1 254nm,4nm

/ 1.936 / 2.161 / 2.247 / 2.600 / 2.803 / 5.325 / 3.231 / 3.354

30

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

50 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 1.936 2.161 2.247 2.600 2.803 3.231 3.354 5.325 Isobutyl PB 23.364 Pentyl PB 42.616

Area 32002 15887 14216 15217 22836 34534 7460 1653 580943 542976

L03_12ppm.1.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) --35 -0.224 152 -0.172 914 -0.198 10 -0.093 108 -0.647 2716 -0.519 3534 1.150 9.472 12496 1.028 38.432 15602 1.026 18.108 15301

D:\Viet Ai\PB\25.01.2018\2PB\L03_12ppm.1.lcd

Report(Report Editor) 27/03/2018 18:04:43 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : L10_4ppm.4.lcd : tp 2 PB.lcm : 24012018.lcb : 1-41 : 10 uL : 28/01/2018 08:41:37 : 09/02/2018 15:09:41

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

L10_4ppm.4.lcd PDA Multi 1 254nm,4nm

Isobutyl PB / 23.642

/ 3.416

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

10.0

7.5

2.5

0.0

/ 1.654 / 2.264 / 2.576 / 2.897

5.0

Pentyl PB / 43.285

mAU

0

10

20

30

40

50 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 1.654 2.264 2.576 2.897 3.416 Isobutyl PB 23.642 Pentyl PB 43.285

Area 7062 2165 8144 11679 483733 189897 171088

L10_4ppm.4.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) 0.910 -2552 -3.075 1158 -0.575 158 -0.383 182 0.794 0.868 1642 1.013 37.040 15694 1.036 18.345 15589

D:\Viet Ai\PB\25.01.2018\2PB\L10_4ppm.4.lcd

Report(Report Editor) 27/03/2018 17:50:37 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : L10_8ppm.5.lcd : tp 2 PB.lcm : 24012018.lcb : 1-48 : 10 uL : 27/01/2018 17:20:23 : 09/02/2018 15:18:29

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

L10_8ppm.5.lcd

0

/ 3.569

0

10

20

30

40

Pentyl PB / 43.096

10

Isobutyl PB / 23.570

20

PDA Multi 1 254nm,4nm

/ 1.695 / 2.568 / 2.897

30

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

50 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 1.695 2.568 2.897 3.569 Isobutyl PB 23.570 Pentyl PB 43.096

Area 6638 7017 11424 482377 379171 352205

L10_8ppm.5.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) 0.863 -2067 -1.839 165 -0.439 276 0.714 1.190 1088 1.001 33.634 15532 1.012 18.098 15133

D:\Viet Ai\PB\25.01.2018\2PB\L10_8ppm.5.lcd

Report(Report Editor) 27/03/2018 18:00:55 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : L10_12ppm.1.lcd : tp 2 PB.lcm : 24012018.lcb : 1-50 : 10 uL : 27/01/2018 05:58:30 : 09/02/2018 14:49:09

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

L10_12ppm.1.lcd

0

/ 3.208

0

10

20

30

40

Pentyl PB / 42.781

10

Isobutyl PB / 23.422

20

PDA Multi 1 254nm,4nm

/ 1.593 / 2.576 / 2.900

30

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

50 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 1.593 2.576 2.900 3.208 Isobutyl PB 23.422 Pentyl PB 42.781

Area 6758 6827 10665 475469 565788 527899

L10_12ppm.1.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) 0.854 -2993 -2.323 199 -0.466 309 1.031 0.622 1516 1.031 37.519 15687 1.026 18.192 15369

D:\Viet Ai\PB\25.01.2018\2PB\L10_12ppm.1.lcd

Report(Report Editor) 27/03/2018 18:12:53 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : LOD 200 + 48L03.lcd : tp LOD.lcm : 15012018.lcb : 4-14 : 10 uL : 17/01/2018 12:14:47 : 19/01/2018 09:25:33

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

<Chromatogram>

LOD 200 + 48L03.lcd

0.1 0.0 -0.1

Benzyl PB / 26.976

Phenyl PB / 21.689

IsoPropyl PB / 14.112

/ 5.416

/ 3.685

0.2

PDA Multi 1 254nm,4nm

/ 3.347

0.3

/ 1.780 / 2.575 2.062 / 2.931

0.4

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

0

5

10

15

20

25

30

35 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 1.780 2.062 2.575 2.931 3.347 3.685 5.416 IsoPropyl PB 14.112 Phenyl PB 21.689 Benzyl PB 26.976

LOD 200 + 48L03.lcd

Area 34177 97341 12641 26153 1578 3918 1996 2917 2096 2014

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) --93 -0.574 1133 -0.737 81 -0.302 94 -0.615 8904 -1.203 1236 1.122 5.504 10671 1.004 24.730 13079 -13.077 17009 -6.775 14519

D:\Viet Ai\PB\LOD\16.01.2018\LOD 200 + 48L03.lcd

Report(Report Editor)

Status:Manual Integration 27/03/2018 18:12:02 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : LOD 200 + 48L10.lcd : tp LOD.lcm : 15012018.lcb : 4-15 : 10 uL : 17/01/2018 13:20:11 : 19/01/2018 09:26:23

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

<Chromatogram>

LOD 200 + 48L10.lcd

0.0

-0.1

0

PDA Multi 1 254nm,4nm

5

10

15

20

Benzyl PB / 27.453

Phenyl PB / 22.048

IsoPropyl PB / 14.325

0.1

// 2.302 1.510 / 2.552 / 2.911

0.2

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

25

30

35 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 1.510 2.302 2.552 2.911 IsoPropyl PB 14.325 Phenyl PB 22.048 Benzyl PB 27.453 63.385

LOD 200 + 48L10.lcd

Area 6511 21078 244953 190788 2354 1696 1826 32170

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) 0.881 -2778 -1.816 148 -0.501 1801 -0.687 210 1.098 18.092 15647 1.030 13.893 18207 0.974 7.600 20400 -23.319 12017

D:\Viet Ai\PB\LOD\16.01.2018\LOD 200 + 48L10.lcd

Report(Report Editor)

Status:Manual Integration 27/03/2018 18:13:36 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : LOD 400 + 48L03.lcd : tp LOD.lcm : 15012018.lcb : 4-11 : 10 uL : 17/01/2018 09:28:43 : 23/01/2018 09:51:46

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

<Chromatogram>

LOD 400 + 48L03.lcd

0.0

-0.1

PDA Multi 1 254nm,4nm Benzyl PB / 26.856

Phenyl PB / 21.589

IsoPropyl PB / 14.085

/ 5.415

/ 3.552 / 3.620 / 3.348

0.1

/ 1.793 / 2.041 / 2.297 / 2.563 / 2.760 / 2.941

0.2

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

0

5

10

15

20

25

30

35 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 1.793 2.041 2.297 2.563 2.760 2.941 3.348 3.552 3.620 5.415 IsoPropyl PB 14.085 Phenyl PB 21.589 Benzyl PB 26.856

LOD 400 + 48L03.lcd

Area 34885 75065 16674 12540 5112 20116 1555 2299 2169 1862 2040 1416 1327

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) --9 -0.192 1979 -0.328 45 -0.196 59 -0.057 4 -0.054 119 -0.668 9241 -0.411 277 ---1.153 -11385 1.085 26.096 14903 0.883 14.750 24120 0.995 7.520 16170

D:\Viet Ai\PB\LOD\16.01.2018\LOD 400 + 48L03.lcd

Report(Report Editor)

Status:Manual Integration 27/03/2018 18:15:31 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : LOD 400 + 48L10.lcd : tp LOD.lcm : 15012018.lcb : 4-12 : 10 uL : 17/01/2018 10:34:04 : 23/01/2018 09:53:51

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

<Chromatogram>

LOD 400 + 48L10.lcd

mAU

0.0

-0.1

0

5

10

15

Benzyl PB / 27.029

Phenyl PB / 21.685

IsoPropyl PB / 14.144

// 2.294 1.512 / 2.547 / 2.902

/ 7.151

0.1

PDA Multi 1 254nm,4nm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

0.2

20

25

30

35 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 1.512 2.294 2.547 2.902 7.151 IsoPropyl PB 14.144 Phenyl PB 21.685 Benzyl PB 27.029 62.192 62.279

LOD 400 + 48L10.lcd

Area 6968 23722 237163 211081 1077 1165 1105 800 14929 18248

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) 0.936 -2860 -2.268 253 -0.623 1849 -0.782 299 -7.238 3233 1.007 14.470 14897 1.139 12.750 14538 1.149 6.589 14351 -9.622 1508 -0.015 2623

D:\Viet Ai\PB\LOD\16.01.2018\LOD 400 + 48L10.lcd

Report(Report Editor)

Status:Manual Integration 27/03/2018 18:14:17 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : LOD 400.lcd : tp LOD.lcm : 15012018.lcb : 4-10 : 10 uL : 17/01/2018 08:53:22 : 29/01/2018 14:47:10

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

<Chromatogram>

LOD 400.lcd

0.0

-0.1

PDA Multi 1 254nm,4nm Benzyl PB / 26.797

Phenyl PB / 21.565

IsoPropyl PB / 14.050

/ 3.667

/ 2.143 / 2.358

0.1

/ 2.574 / 2.946

0.2

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

0

5

10

15

20

25

30

35 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 2.143 2.358 2.574 2.946 3.667 IsoPropyl PB 14.050 Phenyl PB 21.565 Benzyl PB 26.797

Area 1008 1674 11543 30224 5366 1427 929 1259

LOD 400.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) 0.990 -1669 -0.131 9 -0.078 18 -0.223 162 -1.124 1689 0.968 25.903 15967 0.995 14.055 19077 1.034 7.602 20308

D:\Viet Ai\PB\LOD\16.01.2018\LOD 400.lcd

Report(Report Editor)

Status:Manual Integration 26/03/2018 19:11:26 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : LOD PL 200.lcd : tp.lcm : 10012018.lcb : 1-26 : 10 uL : 11/01/2018 16:16:55 : 13/01/2018 18:19:50

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

<Chromatogram>

LOD PL 200.lcd

0.00

PDA Multi 1 254nm,4nm

0

5

10

15

20

Benzyl PB / 25.250

Phenyl PB / 20.405

Isopropyl PB / 13.516

0.25

/ 2.488 / 2.873

0.50

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

25

30

35 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 2.488 2.873 Isopropyl PB 13.516 Phenyl PB 20.405 Benzyl PB 25.250

Area 12642 29205 2283 1901 1846

LOD PL 200.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) --1 -0.069 143 1.016 15.102 14425 0.998 12.652 16326 0.906 6.981 18174

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\LOD PL 200.lcd

Report(Report Editor)

Status:Manual Integration 27/03/2018 17:42:36 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : LOD 0.03 ppm + 48L03.lcd : tp LOD.lcm : 18012018.lcb : 4-48 : 10 uL : 22/01/2018 00:42:06 : 24/03/2018 16:08:11

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

LOD 0.03 ppm + 48L03.lcd

0.0

-0.1

0

10

20

30

40

PeP / 43.281

PDA Multi 1 254nm,4nm

IBP / 23.639

0.1

/ 2.196 / 2.274 / 2.581 / 3.238

0.2

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

50 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 2.196 2.274 2.581 3.238 IBP 23.639 PeP 43.281

LOD 0.03 ppm + 48L03.lcd

Area 20869 20240 27634 63543 1307 1277

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) --113 -0.081 68 -0.424 908 -1.751 1009 1.002 39.510 22888 1.411 26.608 41351

D:\Viet Ai\PB\20.01.2018\LOD 0.03 ppm + 48L03.lcd

Report(Report Editor)

Status:Manual Integration 27/03/2018 17:43:24 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : LOD 0.03 ppm + 48L10.lcd : tp LOD.lcm : 18012018.lcb : 4-49 : 10 uL : 22/01/2018 01:32:27 : 24/03/2018 17:57:14

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

LOD 0.03 ppm + 48L10.lcd

0.0

-0.1

0

PDA Multi 1 254nm,4nm

IsoButyl PB / 23.700

/ 7.073

0.1

/ 2.573 1.902 / 2.891 / 2.312 / 3.089 / 3.508 / 4.028 / 4.767

0.2

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

10

20

30

40

50 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 1.902 2.312 2.573 2.891 3.089 3.508 4.028 4.767 7.073 IsoButyl PB 23.700

LOD 0.03 ppm + 48L10.lcd

Area 8501 1207 10957 20383 6737 8170 493866 350 841 1154

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) 1.119 -1203 -0.469 36 -0.068 3 -0.089 143 -0.234 292 -0.405 108 0.712 0.651 4118 1.485 3.224 8449 -6.235 2826 1.157 29.910 26753

D:\Viet Ai\PB\20.01.2018\LOD 0.03 ppm + 48L10.lcd

Report(Report Editor) 27/03/2018 17:41:26 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : LOD 0.03 ppm.lcd : tp LOD.lcm : 18012018.lcb : 4-47 : 10 uL : 21/01/2018 23:51:45 : 23/01/2018 09:16:45

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

<Chromatogram>

LOD 0.03 ppm.lcd

0.0

-0.1

PDA Multi 1 254nm,4nm

IsoButyl PB / 23.667

/ 7.086 / 8.864 / 8.976 / 9.341

/ 3.643 / 4.780

/ 3.318

0.1

/ 2.581 / 2.893 / 3.092

0.2

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

0

10

20

30

40

50 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 2.581 2.893 3.092 3.318 3.643 4.780 7.086 8.864 8.976 9.341 IsoButyl PB 23.667

Area 13289 21236 7084 132 7700 351 580 343 143 214 1061

LOD 0.03 ppm.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) --5 -0.116 138 -0.230 274 1.020 0.560 48718 0.713 1.427 1362 1.153 3.880 9997 1.057 8.409 6290 -4.786 8461 -0.267 6230 -0.604 2464 -21.784 28312

D:\Viet Ai\PB\20.01.2018\LOD 0.03 ppm.lcd

Report(Report Editor)

Status:Manual Integration/Temporary 26/03/2018 19:39:06 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : 48L01.1.lcd : tp.lcm : 11012018.lcb : 1-3 : 10 uL : 13/01/2018 20:00:45 : 24/03/2018 13:48:27

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

48L01.1.lcd

mAU

0.0

Benzyl PB / 25.033

2.5

PDA Multi 1 254nm,4nm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

5.0

0

10

20

30

40

50 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time Benzyl PB 25.033

Area 30192

48L01.1.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) 1.033 -16553

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\Mau\48L01.1.lcd

Report(Report Editor)

Status:Manual Integration/Temporary 26/03/2018 19:36:01 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : 48L02.2.lcd : tp.lcm : 11012018.lcb : 1-6 : 10 uL : 13/01/2018 23:16:48 : 24/03/2018 14:38:56

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

48L02.2.lcd

mAU

0.0

Benzyl PB / 25.027

/ 5.269

/ 4.756

2.5

0

/ 6.405

5.0

/ 2.711 // 2.269 3.058

7.5

PDA Multi 1 254nm,4nm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

10.0

10

20

30

40

50 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 2.269 2.711 3.058 4.756 5.269 6.405 Benzyl PB 25.027

Area 111914 63980 190435 5358 24008 2566 38211

48L02.2.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) --1455 -0.842 178 -0.546 718 1.093 4.661 4891 1.285 2.136 10258 1.215 5.074 11450 1.061 35.638 15440

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\Mau\48L02.2.lcd

Report(Report Editor) 27/03/2018 10:06:37 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : 48L03.1.lcd : tp.lcm : 11012018.lcb : 1-7 : 10 uL : 14/01/2018 00:22:09 : 26/03/2018 19:41:09

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

48L03.1.lcd

mAU

2.5

0.0

/ 3.080 / 2.267 / 3.248

/ 5.266 / 6.406

5.0

/ 1.819

7.5

PDA Multi 1 254nm,4nm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

10.0

0

10

20

30

40

50 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 1.819 2.267 3.080 3.248 5.266 6.406

Area 28346 74232 12547 19290 3199 1494

48L03.1.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) --105 -0.889 936 -1.918 499 -0.396 1900 1.291 8.086 10978 1.364 4.989 10034

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\Mau\48L03.1.lcd

Report(Report Editor) 27/03/2018 10:08:22 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : 48L04.1.lcd : tp.lcm : 11012018.lcb : 1-9 : 10 uL : 14/01/2018 02:32:54 : 24/03/2018 14:44:12

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

48L04.1.lcd

mAU

0.0

0

5

/ 8.156

/ 5.268

2.5

/ 2.526 / 2.888 / 3.084

5.0

/ 1.728 / 1.985

7.5

PDA Multi 1 254nm,4nm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

10.0

10

15

20

25

30

35 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 1.728 1.985 2.526 2.888 3.084 5.268 8.156

Area 36155 26393 44058 12686 9843 1687 3953

48L04.1.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) --92 -0.443 324 -0.834 140 -0.236 27 -0.145 618 1.152 6.315 11625 1.146 12.262 14009

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\Mau\48L04.1.lcd

Report(Report Editor)

Status:Manual Integration 27/03/2018 11:00:02 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : 48L05.1.lcd : tp.lcm : 11012018.lcb : 1-11 : 10 uL : 14/01/2018 04:43:36 : 26/03/2018 18:30:20

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

48L05.1.lcd

mAU

PDA Multi 1 254nm,4nm

50

25

0

/ 5.903

75

/ 1.659 / 2.198 / 2.400 / 2.880 / 3.186

/ 6.278

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

0

10

20

30

40

50 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 1.659 2.198 2.400 2.880 3.186 5.903 6.278

Area 8224 47895 76462 12739 51013 183370 714556

48L05.1.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) --84 -0.791 188 -0.261 111 -0.313 29 -0.250 1860 1.285 10.422 10931 1.292 1.602 10798

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\Mau\48L05.1.lcd

Report(Report Editor) 27/03/2018 10:58:04 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : 48L06.1.lcd : Ace 40.60 T.lcm : 11012018.lcb : 1-13 : 10 uL : 14/01/2018 06:54:19 : 24/03/2018 14:46:56

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

48L06.1.lcd

mAU

5.0

2.5

0.0

/ 1.475 / 1.750 / 2.328 / 2.534 / 2.896 / 6.283 / 2.987 / 3.080

7.5

PDA Multi 1 254nm,4nm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

10.0

0

10

20

30

40

50 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 1.475 1.750 2.328 2.534 2.896 2.987 3.080 6.283

Area 18384 7721 4617 15925 13454 4933 8277 15202

48L06.1.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) --225 -1.017 2260 -1.450 205 -0.342 330 -0.323 47 -0.075 272 -0.048 15 1.278 1.902 11452

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\Mau\48L06.1.lcd

Report(Report Editor) 27/03/2018 11:01:00 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : 48L07.1.lcd : tp.lcm : 11012018.lcb : 1-15 : 10 uL : 14/01/2018 12:37:06 : 27/03/2018 09:21:17

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : trangmp

<Chromatogram>

48L07.1.lcd

mAU

10 0

/ 14.481

/ 3.201 / 5.921 / 6.300

20

/ 2.888

30

/ 1.480 / 1.689 / 2.443 / 1.781 / 1.855

40

PDA Multi 1 254nm,4nm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

50

0

10

20

30

40

50 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 1.480 1.689 1.781 1.855 2.443 2.888 3.201 5.921 6.300 14.481

Area 2961 5615 3792 6766 295379 9049 134021 100359 104241 391195

48L07.1.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) -----100 -0.176 373 -0.310 4443 0.912 3.210 1470 -0.417 38 0.840 0.287 1836 1.290 10.344 10860 1.285 1.616 10857 1.140 22.502 14251

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\Mau\48L07.1.lcd

Report(Report Editor) 27/03/2018 11:01:50 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : 48L07+IPP.lcd : tp.lcm : 11012018.lcb : 1-30 : 10 uL : 14/01/2018 18:03:51 : 22/03/2018 18:48:39

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

48L07+IPP.lcd

20 10 0

IsoPropyl PB / 13.468 / 14.346

30

/ 2.386 / 3.213 / 5.903 / 6.274

40

PDA Multi 1 254nm,4nm

/ 1.680 / 1.752 / 1.824 / 2.126

50

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

0

10

20

30

40

50 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 1.680 1.752 1.824 2.126 2.386 3.213 5.903 6.274 IsoPropyl PB 13.468 14.346

Area 9967 3491 7570 6533 301829 160065 123327 132485 597425 487714

48L07+IPP.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) --84 -0.115 180 -0.223 3546 -1.571 1049 1.212 0.902 923 0.817 2.778 2090 1.271 10.630 11019 1.271 1.601 11037 1.145 20.810 14175 1.130 1.884 14300

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\Mau\48L07+IPP.lcd

Report(Report Editor) 27/03/2018 11:02:30 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : 48L07+PP.lcd : tp.lcm : 11012018.lcb : 1-29 : 10 uL : 14/01/2018 16:58:29 : 26/03/2018 18:14:41

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

48L07+PP.lcd

30 20 10 0

PP / 14.327

/ 2.420

40

PDA Multi 1 254nm,4nm

/ 3.215 / 5.898 / 6.269

50

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

0

10

20

30

40

50 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 2.420 3.215 5.898 6.269 PP 14.327

Area 262771 131646 104256 111153 650034

48L07+PP.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) 1.119 -1131 0.818 2.632 1652 1.284 9.901 10942 1.277 1.594 10930 1.141 22.389 14258

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\Mau\48L07+PP.lcd

Report(Report Editor)

Status:Temporary 27/03/2018 15:01:07 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : 48L08.1.lcd : tp.lcm : 11012018.lcb : 1-18 : 10 uL : 14/01/2018 20:14:35 : 24/03/2018 14:49:01

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

48L08.1.lcd

mAU

0.0

/ 19.749

2.5

/ 5.285 / 6.311

5.0

/ 1.651 / 2.581

7.5

PDA Multi 1 254nm,4nm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

10.0

0

10

20

30

40

50 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 1.651 2.581 5.285 6.311 19.749

Area 23207 96626 1211 9162 23858

48L08.1.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) 0.788 -3565 1.359 3.341 536 1.234 8.327 10779 1.262 4.597 10829 1.089 30.682 15556

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\Mau\48L08.1.lcd

Report(Report Editor)

Status:Manual Integration/Temporary 27/03/2018 15:07:25 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : 48L09.1.lcd : Ace 40.60 T.lcm : 11012018.lcb : 1-20 : 10 uL : 14/01/2018 22:25:16 : 24/03/2018 14:52:16

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

48L09.1.lcd

mAU

0.0

0

20

/ 34.913

/ 25.587

/ 19.599

/ 6.281

/ 8.671

10

/ 22.530

/ 2.704

/ 1.542

/ 2.208 / 3.080

2.5

PDA Multi 1 254nm,4nm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

5.0

30

40

50 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 1.542 2.208 2.704 3.080 6.281 8.671 19.599 22.530 25.587 34.913 59.100

Area 7104 1937 100022 2224 1431 1092 24586 7159 4131 14297 11189

48L09.1.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) 1.035 -2598 -0.148 1 -0.107 635 2.564 1.198 3881 1.166 14.806 11471 1.157 9.121 14348 1.073 23.522 15022 1.097 4.242 14742 0.891 3.912 15546 1.048 9.704 16083 1.030 14.866 12058

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\Mau\48L09.1.lcd

Report(Report Editor) 27/03/2018 15:10:33 Page 1 / 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: : : Placebo.lcd : Ace 40.60 T.lcm : 11012018.lcb : 2-47 : 10 uL : 12/01/2018 23:31:39 : 15/03/2018 15:19:13

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : tammp

<Chromatogram>

Placebo.lcd

mAU

30 20 10 0

/ 3.847

/ 1.733 / 2.282 / 2.528 / 2.875 / 3.080

40

PDA Multi 1 254nm,4nm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

50

0

10

20

30

40

50 min

<Peak Table>

PDA Ch1 254nm Name Ret. Time 1.733 2.282 2.528 2.875 3.080 3.847

Area 6226 1963 13738 17580 6663 489858

Placebo.lcd

Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP) 0.847 -1913 -1.944 503 -0.152 13 -0.189 179 -0.240 212 0.685 1.282 1933

D:\Viet Ai\PB\10.01.2018\Ace 40.60\Cot 25cm\Do dung\Nuoc suc mieng\Placebo.lcd