Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng đồng thời polydatin, resveratrol và emodin trong cốt khí

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

ĐỒNG VĂN THÀNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI POLYDATIN, RESVERATROL VÀ EMODIN TRONG CỐT KHÍ CỦ (REYNOUTRIA JAPONICA HOUTT) ẰNG SẮC K LỎNG HI U NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐỒNG VĂN THÀNH

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI POLYDATIN, RESVERATROL VÀ EMODIN TRONG CỐT KHÍ CỦ (REYNOUTRIA JAPONICA HOUTT) ẰNG SẮC K LỎNG HI U NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210

Nơi thực hiện đề tài: Viện Dƣợc liệu Thời gian thực hiện: từ 08/2017 đến 04/2018

HÀ NỘI 2018

LỜI CẢM ƠN

Bản luận văn này đƣợc thực hiện và hoàn thành tại Viện Dƣợc Liệu với sự hƣớng dẫn của TS. Lê Đình Chi và PGS.TS. Phƣơng Thiện Thƣơng Em xin chân thành cảm ơn TS. Lê Đình Chi đã định hƣớng nghiên cứu và góp ý giúp em hoàn thành luận văn này.

Em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Phƣơng Thiện Thƣơng đã hƣớng

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

dẫn và giúp đỡ em hoàn thành luận văn này.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Dƣợc Liệu và các cán

bộ Khoa Hóa phân t ch và tiêu chu n đã tạo điều kiện giúp em hoàn thành luận văn này.

Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn

bên em, chia sẻ khó khăn, động viên và giúp đỡ em trong thời gian em thực hiện luận văn

Do thời gian thực hiện luận văn có hạn nên không tránh những thiếu

sót. Em rất mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 03 tháng 04 năm 2018 Học viên

Đồng Văn Thành

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ................................................................. ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Chƣơng 1: Tổng quan............................................................................................ 3 1.1. Tổng quan về Cốt kh củ (Reynoutria japonica Houtt.) ............................ 3 1.1.1. Tên khoa học ....................................................................................... 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố ............................................................. 3 1.1.3. Bộ phận dùng....................................................................................... 4 1.1.4. Thành phần hóa học ............................................................................ 4 1.1.5. Tác dụng theo Y học cổ truyền ........................................................... 7 1.1.6. Tác dụng dƣợc lý ................................................................................. 8 1.2. Tổng quan về polydatin, resveratrol, emodin ............................................ 8 1.2.1. T nh chất vật lý và hóa học ................................................................. 8 1.2.2. Tác dụng dƣợc lý ............................................................................... 10 1.3. Phƣơng pháp xác định POL, RES và EM ................................................ 15 1.3.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc ............................................................... 15 1.3.2. Các nghiên cứu trong nƣớc ............................................................... 16 1.3.3. Tiêu chu n về dƣợc liệu Cốt kh củ trong một số Dƣợc điển ........... 17 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 20

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................... 20 2.2. Chất chu n, hóa chất và thiết bị ............................................................... 20 2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 21 2.3.1. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời POL, RES, EM b ng HPLC ........................................................................................................... 21

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

2.3.2. Th m định phƣơng pháp ................................................................... 22 2.3.3. Áp dụng phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu Cốt kh củ .... 22 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 22 2.4.1. Chu n bị dung dịch chu n ................................................................. 22 2.4.2. Khảo sát điều kiện sắc ký .................................................................. 23 2.4.3. Quy trình xử lý mẫu .......................................................................... 23 2.4.3. Đánh giá phƣơng pháp phân t ch ...................................................... 24 2.4.4. Áp dụng trên một số mẫu dƣợc liệu Cốt kh củ ................................ 27 2.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ................................................................. 28 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU/THỰC NGHIỆM .................................. 29 3.1. Nghiên cứu tối ƣu hóa điều kiện sắc ký ................................................... 29 3.1.1. Khảo sát bƣớc sóng hấp thụ cực đại của chất nghiên cứu ................ 29 3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký .................................................................. 30 3.1.2.1 Lựa chọn pha tĩnh ............................................................................ 30 3.1.2.2. Khảo sát thành phần pha động ....................................................... 30 3.1.2.3. Khảo sát thể t ch tiêm mẫu ............................................................. 35

3.2. Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu .............................................................. 36 3.2.1. Khảo sát phƣơng pháp chiết mẫu ...................................................... 36 3.2.2. Khảo sát dung môi chiết .................................................................... 37 3.2.3. Khảo sát nhiệt độ chiết ...................................................................... 38 3.2.4. Khảo sát thời gian chiết ..................................................................... 39

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

3.2.5. Khảo sát số lần chiết .......................................................................... 40 3.3. Th m định phƣơng pháp định lƣợng b ng HPLC.................................... 43 3.3.1. Độ chọn lọc của phƣơng pháp ........................................................... 43 3.3.2. Độ th ch hợp hệ thống ....................................................................... 43 3.3.3. Đƣờng chu n và khoảng tuyến t nh .................................................. 45 3.3.4. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lƣợng LOQ) ................ 46 3.3.5. Độ lặp lại ........................................................................................... 48 3.3.6. Độ đúng ............................................................................................. 49 3.4. Áp dụng phƣơng pháp định lƣợng POL, RES và EM trên các mẫu Cốt kh củ ..................................................................................................................... 50 Chƣơng 4. BÀN LUẬN ...................................................................................... 52 Kết luận và đề xuất .............................................................................................. 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 1

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học

EM

Emodin

POL

Polydatin

RES

Resveratrol

Tiếng Việt

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Ký hiệu

DMSO

Dimethyl sulfoxide

Dimethyl sulfoxid

High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng

chromatography

cao

High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng

chromatography photodiode array

cao gh p nối detector

detetion

mảng iod

LC-

Liquid chromatography tandem

Sắc ký lỏng gh p khối

MS/MS

mass spectrometry

phổ 2 lần

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lƣợng

R(%)

Recovery

Hiệu suất thu hồi

RSD(%)

Relative standard deviation

Độ lệch chu n tƣơng đối

SD

Standard Deviation

Độ lệch chu n

HPLC

HPLCPDA

DANH MỤC CÁC ẢNG Bảng 1.1

Một số nghiên cứu ngoài nƣớc về định lƣợng POL, RES, EM trong Cốt kh củ

Tr. 15

Khảo sát pha động ACN – nƣớc

Tr. 31

Bảng 3.2

Khảo sát pha động MeOH – nƣớc

Tr. 33

Bảng 3.3

Các thông số sắc ký ứng với chƣơng trình gradient 4

Tr. 35

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Bảng 3.1

Bảng 3.4 Bảng 3.5

Kết quả đánh giá độ th ch hợp hệ thống của phƣơng pháp

Tr. 44

Quan hệ tuyến t nh giữa nồng độ và diện t ch p c của POL, RES và EM

Tr. 45

Bảng 3.6

Kết quả xác định LOD và LOQ của phƣơng pháp

Tr. 48

Bảng 3.7

Kết quả đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp

Tr. 49

Bảng 3.8

Kết quả th m định độ đúng của phƣơng pháp

Tr. 50

Bảng 3.9

Kết quả hàm lƣợng POL, RES và EM trên các mẫu Cốt kh củ

Tr. 51

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1

Hình 1.2

Hình ảnh dƣợc liệu Cốt kh củ

Tr.4

Công thức một số anthraquinon và naphthoquinon trong Tr.5

Hình 1.3

Công thức cấu tạo một số stilben trong rễ Cốt kh củ

Tr.7

Hình 1.4

Công thức cấu tạo của polydatin

Tr.8

Hình 1.5

Công thức cấu tạo của resveratrol

Tr.9

Hình 1.6

Công thức cấu tạo của emodin

Tr.9

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

rễ Cốt kh củ

Hình 2.1

Hình ảnh dƣợc liệu Cốt kh củ lƣu trữ tại Viện Dƣợc liệu

Tr.20

Hình 3.1

Phổ hấp thụ UV-VIS của POL, RES và EM

Tr.29

Hình 3.2

Chƣơng trình gradient 1

Tr.32

Hình 3.3

Chƣơng trình gradient 2

Tr.32

Hình 3.4

Chƣơng trình gradient 3

Tr.34

Hình 3.5

Chƣơng trình gradient 4

Tr.34

Hình 3.6

Kết quả khảo sát phƣơng pháp chiết mẫu

Tr.36

Hình 3.7

Kết quả khảo sát dung môi chiết

Tr.37

Hình 3.8

Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết

Tr.38

Hình 3.9

Kết quả khảo sát thời gian chiết

Tr.39

Hình 3.10

Kết quả khảo sát số lần chiết

Tr.40

Hình 3.11

Sắc ký đồ đánh giá t nh chọn lọc của phƣơng pháp

Tr.43

Sắc ký đồ khảo sát t nh phù hợp hệ thống của phƣơng pháp

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 3.12

Tr.44

Hình 3.13

Đƣờng chu n của POL, RES và EM

Tr.46

Hình 3.14

Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ

Tr.47

1

ĐẶT VẤN ĐỀ Cốt kh củ là một vị thuốc cổ truyền đƣợc sử dụng phổ biến tại các nƣớc châu Á nhƣ Trung Quốc, Việt Nam, Nhật Bản…[1], [4] Theo y học cổ truyền cốt kh củ có công dụng để chữa tê thấp, tổn thƣơng đau đớn do bị ngã, bị thƣơng, là một vị thuốc thu liễm cầm máu [1], [4]. Kết quả nghên cứu hiện đại cho thấy tác dụng dƣợc lý của cốt kh củ c ng nhƣ các hoạt chất có trong cốt kh củ rất phong

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

phú, một số tác dụng đầy tiềm năng đã đƣợc chứng minh nhƣ tác dụng kháng khu n [32], [51], [52]; tác dụng chống viêm [21], [33]; tác dụng chống oxi hóa [25]; tác dụng hạ lipid [49]; tác dụng kháng u, chống ung thƣ [66] và tiềm năng điều trị đái tháo đƣờng [64]…

Hiện nay, nhu cầu sử dụng các vị thuốc cổ truyền trong nhân dân ngày càng lớn. Nguồn nguyên liệu cốt kh củ một phần đƣợc trồng tại Việt Nam, phần lớn đƣợc nhập từ Trung Quốc với chất lƣợng chƣa đƣợc kiểm soát. Do đó xuất hiện tình trạng dƣợc liệu cốt kh củ lƣu thông trên thị trƣờng thƣờng bị giả mạo hoặc không đạt yêu cầu về chất lƣợng, thực trạng này đã đặt ra một yêu cầu cấp thiết trong việc kiểm soát chất lƣợng dƣợc liệu. Tuy nhiên, trong chuyên luận Cốt kh củ DĐVN V , chƣa có quy định về ch tiêu định lƣợng hoạt chất ch nh, hiện nay mới ch có ch tiêu định t nh b ng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng, so sánh với dƣợc liệu đối chiếu. Ch tiêu định lƣợng chất chiết đƣợc b ng phƣơng pháp cân với độ ch nh xác không cao. Vì vậy, chuyên luận cốt kh củ DĐVN V chƣa đánh giá ch nh xác đƣợc chất lƣợng dƣợc liệu cốt kh củ ở Việt Nam. Emodin, resveratrol, polydatin là những hoạt chất ch nh của Cốt kh củ, đã đƣợc chứng minh về tác dụng dƣợc lý. Mặt khác, trong Dƣợc điển Trung Quốc và Dƣợc điển Hồng kông đã đƣa các ch tiêu định lƣợng các hoạt chất này nh m đảm bảo chất lƣợng dƣợc liệu Cốt kh củ nhƣng chƣa thực hiện định lƣợng đồng thời chúng

2

[10], [13]. Xuất phát từ thực tiễn đó, nhóm nghiên cứu đề xuất đề tài “Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời polydatin, resveratrol và emodin trong Cốt khí củ (Reynoutria japonica Houtt)

ằng sắc ký lỏng hiệu

năng cao” với mục tiêu: 1. Xây dựng và th m định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời polydatin, resveratrol và emodin trong dƣợc liệu Cốt kh củ b ng phƣơng pháp HPLC.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

2. Áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng đƣợc trên các mẫu dƣợc liệu Cốt kh củ thu mua trên địa bàn Hà Nội.

3

Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Cốt khí củ (Reynoutria japonica Houtt.)

1.1.1. Tên khoa học Cốt kh củ có tên khoa học là Reynoutria japonica Houtt., thuộc họ Rau răm Polygonaceae và có tên khoa học đồng nghĩa khác là Reynoutria Mak.,

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc, Reynoutria elata Nak. Ở Việt Nam, Cốt kh củ còn đƣợc gọi là điền thất, hổ trƣợng căn, phù linh, nam hoàng cầm, co hớ hƣờn Thái , mèng kẻng (Tày , hồng lìu Dao [1], [4].

1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân ố

Cốt kh củ là loại cây nhỏ, sống lâu năm. Rễ phình thành củ cứng, mọc bò nghiêng dƣới đất, vỏ ngoài màu nâu đen, ruột màu vàng. Thân hình trụ, nhẵn, mọc thẳng đứng, cao 0,5-1 m, thƣờng có những đốm màu t a hồng. Lá mọc so le, cuống ngắn, hình trứng, đầu tù, hơi nhọn, m p nguyên, dài 5-12 cm, rộng 3,5-8 cm, mặt trên màu lục sẫm, có khi nâu đen; bẹ chìa ngắn. Cụm hoa ngắn hơn lá, mọc thành chùm ở kẽ lá; hoa nhỏ màu trắng, hoa đực và hoa cái riêng; bao hoa có 5 phiến; hoa đực có 8 nhị; hoa cái có bầu 3 góc. Quả 3 cạnh màu nâu đỏ, mùa hoa quả vào tháng 10-11 [1], [4].

Cốt kh củ có nguồn gốc ở vùng Đông Á, sau lan xuống khắp các vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới, bao gồm Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Việt Nam, Lào và một vài nơi khác. Ở Việt Nam, cây mọc hoang dại ở vùng núi cao, từ 1000 -1600 m và đƣợc trồng rải rác trong nhân dân ở vùng trung du và đồng b ng Bắc Bộ [1], [4].

Cốt kh củ ƣa sáng, ƣa m, nhƣng ráo nƣớc úng ngập dễ làm thối củ thƣờng mọc thành khóm trong các thung l ng, nơi gần nguồn nƣớc. Cây rụng lá

4

vào mùa đông, ra hoa quả nhiều hàng năm, có khả năng mọc chồi từ thân rễ. Cây sinh trƣởng mạnh từ mùa xuân đến mùa thu, bắt đầu cho thu hoạch củ từ tháng 9 trở đi, nên thu hoạch vào những ngày nắng ráo trong mùa đông, khi phần thân lá bắt đầu h o hoặc c ng có thể thu hoạch vào đầu mùa xuân, trƣớc khi cây tái sinh [1], [4].

1.1.3. Bộ phận dùng

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Thân rễ - (Rhizoma Renoutriae japanicae, gọi tên là Hổ Trƣợng hoặc Radix Polygoni cuspidati) là rễ phơi hay sấy khô của cây cốt kh củ, rễ cốt kh củ thu hái quanh năm, tốt nhất vào thu đông, rửa sạch đất cát, cắt bỏ rễ con, thái thành miếng nhỏ dày chừng 1-2 cm, phơi hoặc sấy khô. Dƣợc liệu có mặt ngoài nâu xám, sần sùi, nhăn nheo theo chiều dọc, có các mấu đốt và gióng, mặt cắt ngang màu vàng b n, lõi gần nhƣ rỗng, phần không rỗng có màu nâu sẫm. Chất nhẹ, hơi cứng, mùi không rõ, vị hơi đắng ƣ

Hình 1.1: Hình ảnh dƣợc liệu Cốt kh củ 1.1.4. Thành phần hóa học Từ đầu những năm 1950, đã có rất nhiều hợp chất hóa học đƣợc phân lập từ loài Cốt kh củ Reynoutria japonica Houtt.) tại Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn

5

Quốc và nhiều nƣớc khác trên thế giới. Hầu hết các nghiên cứu tập trung xác định thành phần hóa học từ rễ Cốt kh củ, bộ phận đƣợc sử dụng ch nh trong các bài thuốc y học cổ truyền. Trong thành phần hóa học nổi bật của rễ Cốt kh củ, hai nhóm chất ch nh chiếm hàm lƣợng lớn là các quinon chủ yếu là anthraquinon) và các stilben. Đây là các thành phần hóa học quyết định cho nhiều hoạt t nh của Cốt kh củ nhƣ kháng khu n, kháng u, kháng ung thƣ, chống

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

oxy hóa, phòng ngừa bệnh tim mạch… Ngoài ra còn có nhiều nhóm hợp chất khác nhƣ flavonoid, coumarin, lignan…với nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý, bổ trợ với hai nhóm hợp chất ch nh làm cho Cốt kh củ có hoạt t nh sinh dƣợc học cao.

1.1.4.1. Nhóm chất quinon

Kể từ những nghiên cứu đầu tiên về Cốt kh củ vào những năm 1950, các quinon và các dẫn xuất của nó đã đƣợc phân lập và xác định cấu trúc hóa học.

Trong rễ Cốt kh củ, các quinon bao gồm các nhóm anthraquinon chiếm hàm lƣợng lớn và naphthoquinon [30], [34], [45], [47], [54], [66]. Các anthraquinon có cấu trúc khung emodin nhƣ: emodin, physcion, fallacinol, questin, anthraglycoside A–B, chrysophanol, citreorosein, questinol, rhein, anthraquinones polyganin A – B. Ba naphthoquinon là 2-methoxy-6-acetyl-7methyljuglone, cuspidatumin A và 7-acetyl-2-methoxy-6-methyl-8-hydroxyl-4naphthoquinone c ng đã đƣợc phân lập từ rễ Cốt kh củ.

H3COC

O OCH2CH3

O

Emodin

Physcion

Cuspidatumin A

6

Hình 1.2. Công thức một số anthraquinon và naphthoquinon trong rễ Cốt kh củ 1.1.4.2. Nhóm chất stilben Stilben là là một nhóm chất có chung một cấu trúc mạch cacbon là C6-C2C6. Stilben thuộc nhóm các hợp chất phenylpropanoids. Một số stilbenoid đã đƣợc tìm thấy trong thực vật và khẳng định về hoạt t nh đặc trƣng của chúng nhƣ p ceatannolin có trong rễ của cây vân sam Na Uy. Hay pinosylvin là một độc tố

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

nấm bảo vệ gỗ khỏi bị nhiễm nấm, đƣợc tìm thấy trong cây họ thông.

Pterostilben có trong hạnh nhân, cây thông và quả mọng [11].

Trong rễ cây Cốt kh củ, nhiều nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới đã nghiên cứu và xác định sự có mặt của nhóm stilben. Trong đó hai stilben ch nh là resveratrol và dẫn xuất của nó là polydatin đã đƣợc phân lập và xác định cấu trúc vào năm 1963 [47]. Đến năm 2004, hai stilben khác là resveratrol 4-O-D- 2′galloyl)- glucopyranoside và resveratrol 4-O-D- 6′ galloyl -glucopyranoside đã đƣợc xác định từ dịch chiết methanol 70 % của rễ Cốt kh củ [23]. Ngoài ra, thêm 10 stilbenoid sulfat đƣợc xác định từ dịch chiết aceton bao gồm Na, K trans-resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside-6″-sulfat; Na, K trans-resveratrol-3O-β-D-glucopyranoside-4″-sulfat;

Na,

K

trans-resveratrol-3-O-β-D-

glucopyranoside-2″-sulfat; Na, K trans -resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside4′-sulfat; Na, K trans -resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside-5-sulfat; Na, K cisresveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside-6″-sulfat, Na, K cis-resveratrol-3-O-β-Dglucopyranoside-4″-sulfat, Na, K cis-resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside-3″sulfat; Na, K cis-resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside-2″-sulfat, Na, K cisresveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside-5-sulfat [58].

7

Polydatin

Resveratrol

Hình 1.3: Công thức cấu tạo một số stilben trong rễ Cốt kh củ

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1.1.4.3. Các nhóm chất khác

Trong rễ Cốt kh củ có chứa các flavonoid thuộc nhóm flavonol nhƣ: quercetin, dẫn xuất của quercetin và dạng glycosid, catechin và dạng glycosid của nó [27], [37], [58].

Ngoài ra trong rễ Cốt kh củ còn chứa các hợp chất thuộc nhóm coumarin nhƣ 7-hydroxy-4-methoxy-5-methylcoumarin…, [65] các lignan nhƣ natri (-)lyoniresinol-2a-sulfat và natri (+)-isolaricireinol-2a-sulfat [59]và các hợp chất khác nhƣ acid gallic, tryptophan, β-sitosterol……

1.1.5. Tác dụng theo Y học cổ truyền

Theo y học cổ truyền, rễ cốt kh củ có vị đắng, t nh ấm. Quy kinh can, tâm bào với công năng hoạt huyết thông kinh, ch thống, trừ phong thấp, thanh thấp nhiệt, tiêu viêm, sát khu n. Ở Việt Nam rễ cốt kh củ thƣờng đƣợc dùng để chữa tê thấp, tổn thƣơng đau đớn do bị ngã, bị thƣơng, là một vị thuốc thu liễm cầm máu.

Trong bộ Bản thảo cƣơng mục của Lý Thời Trân Trung Quốc - thế kỷ 16 , vị thuốc này có tác dụng lợi tiểu, thông kinh, giảm đau, giảm độc, dùng cho những ngƣời bị kinh nguyệt bế tắc, kinh nguyệt khó khăn đau đớn, đẻ xong huyết ứ, bụng trƣớng, tiểu tiện khó khăn [1].

8

Trong y học cổ truyền Trung Quốc cốt kh củ đƣợc gọi là Zhang Hu, đƣợc sử dụng để điều trị các tổn thƣơng viêm, viêm gan, các khối u, tiêu chảy, hạ sốt, giảm đau, lợi tiểu, tiêu đờm và đƣợc liệt kê ch nh thức trong Dƣợc điển Trung Hoa (1995) [9]. Sử dụng trong các phƣơng pháp điều trị đau khớp, viêm phế quản mãn t nh, vàng da, vô kinh và huyết áp cao [15].

1.1.6. Tác dụng dƣợc lý

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sự phong phú về thành phần hoá học và các nhóm chất có hoạt t nh sinh học cao làm cho cốt kh củ có nhiều tác dụng sinh học quý giá. Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng sinh học của cốt kh củ với các định hƣớng sinh học khác nhau nhƣ: tác dụng kháng khu n [32], [51], [52]; tác dụng chống viêm [21], [33]; tác dụng chống oxi hóa [25]; tác dụng hạ lipid [49]; tác dụng kháng u, chống ung thƣ [66] và tiềm năng điều trị đái tháo đƣờng [64].

1.2. Tổng quan về polydatin, resveratrol, emodin 1.2.1. Tính chất vật lý và hóa học 1.2.1.1. Polydatin (POL)

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của polydatin - Tên đầy đủ: 2-[3-hydroxy-5-[(E)-2-(4-hydroxyphenyl)ethenyl]phenoxy]-6(hydorxymethyl)oxane-3,4,5-triol.

- Công thức phân tử: C20H22O8 - Khối lƣợng phân tử: 390,384 g/mol.

9

- Ở điều kiện nhiệt độ phòng, POL có dạng tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 236 C, tan tốt trong DMSO và nƣớc, methanol.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1.2.1.2. Resveratrol (RES)

Hình 1.5: Công thức cấu tạo của resveratrol

- Tên đầy đủ: 5-[(1E)-2-(4-Hydroxyphenyl)ethenyl]-1,3-benzenediol - Công thức phân tử: C14H12O3

- Khối lƣợng phân tử: 228,24 g/mol

- Ở điều kiện nhiệt độ phòng, RES có dạng tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 236 C, tan tốt trong DMSO và nƣớc, methanol.

1.2.1.3. Emodin (EM)

Hình 1.7: Công thức cấu tạo của emodin - Tên đầy đủ: 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracene-9,10-dione - Công thức phân tử: C15H10O5 - Khối lƣợng phân tử: 270,24 g/ mol - Ở điều kiện nhiệt độ phòng, EM tồn tại ở trạng thái bột kết tinh hoặc tinh thể hình kim màu vàng cam. Nhiệt độ nóng chảy khoảng 256-257 oC. EM tan tốt

10

trong dung môi hữu cơ nhƣ ether, ether dầu hỏa, cloroform, methanol… , không tan trong nƣớc.

1.2.2. Tác dụng dƣợc lý 1.2.2.1. Tác dụng dược lý của POL a. Tác dụng tr n t bào c tim Trong một nghiên cứu tiến hành trên chuột, Zhao SK và cộng sự đã chứng

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

minh đƣợc tác dụng bảo vệ cơ tim của POL trên chuột nhắt trƣởng thành với tổn thƣơng cơ tim đƣợc gây ra bởi adriamicin adr . Những con chuột dùng POL + adr tế bào cơ tim gần nhƣ giữ cấu trúc bình thƣờng, trong khi con chuột ch dùng adr có hoại tử từng phần [69].

Polydatin c ng đƣợc Zhao SK và cộng sự chứng minh có tác dụng gây tăng Ca huyết và tăng cƣờng co bóp cơ tim [28]. Với liều POL 20 mg/kg có tác dụng giảm đáng kể creatine phosphokinase và lactate dehydrogenase từ cơ tim bị hƣ hỏng do k ch hoạt protein kinase C-ATP nhạy cảm phụ thuộc kênh K [43], [44].

b. Tác dụng b o v gan

Năm 1999, Huang và cộng sự thử nghiệm và chứng minh đƣợc POL ở nồng độ 10-7 mol/l -10-4 mol/l có tác dụng bảo vệ tế bào gan đƣợc nuôi cấy của chuột chống lại thƣơng tổn do CCl4 gây ra [26]. Năm 2012 Zhang và cộng sự tiến hành th nghiệm: gây tổn thƣơng gan chuột b ng cách tiêm trong lồng ngực chuột CCl4 và dùng POL trong 5 ngày liên tiếp cho kết quả POL làm giảm đáng kể sự tăng các yếu tố gây hoại tử gan AST, ALT, MDA, IL-1β, đồng thời tăng hàm lƣợng của GSH và GST [65].

Thử nghiệm trên chuột, POL có tác dụng giảm nồng độ TC, TG huyết tƣơng và lipid gan b ng cơ chế giảm yếu tố hoại tử khối u gan TNF-

và biểu

11

hiện gen SREBP-1c, tác dụng này cho thấy POL có khả năng làm giảm gan nhiễm mỡ ở chuột [67]. c. Tác dụng ch ng o y hóa POL có đặc t nh chống oxy hóa đáng kể do cấu trúc phân tử chứa hệ nối đôi liên hợp, nó liên quan chặt chẽ tới các tác dụng dƣợc lý nhƣ bảo vệ chống lại thƣơng t ch, cải thiện học tập và tr nhớ, giảm lipid và k o dài tuổi thọ… POL

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

kháng lại quá trình oxy hóa enzyme hơn resveratrol do sự thay đổi cấu trúc phân tử [16].

d. Tác dụng ch ng vi m

Nhiều nghiên cứu báo cáo r ng POL điều ch nh sự sản sinh các cytokin viêm và các phân tử kết d nh tế bào trong các thử nghiệm invitro và invivo. POL làm giảm sản xuất IL-17 trong các tế bào đơn nhân máu ngoại vi hoạt t nh của con ngƣời thông qua sự điều ch nh làm giảm biểu hiện mRNA IL-17 trong tế bào [38].

POL giảm hoạt động và biểu hiện NF-kB p65, ngăn chặn sự sản sinh của TNF-a, IL-6 và IL-1b ở mRNA và protein, làm giảm hoạt động của MPO và giảm bớt các tổn thƣơng viêm đại tràng ở chuột bị viêm đại tràng [60]. e. Các tác dụng khác

POL đã đƣợc chứng minh có nhiều tác dụng khác nhƣ tác dụng bảo vệ hệ thần kinh [28], [39], tác dụng chống sốc [50], tác dụng chống khối u [36]…

1.2.2.2. Tác dụng dược lý của RES a. Tác dụng ch ng ung thư RES liều 2,5 và 10 mg/ kg, tiêm màng bụng trên chuột trong 5 ngày làm giảm đáng kể thể t ch 42% và khối lƣợng 44 % , ngăn cản sự phát triển và di căn của khối u do ức chế tổng hợp DNA của tế bào khối u, c ng nhƣ ngăn

12

cản sự hình thành vi mạch do khối u gây ra trên chuột có tế bào u phổi Lewis có nguy cơ di căn cao [35]. Trong một th nghiệm khác trên chuột có u thần kinh đệm trong não, RES liều 40 mg/kg/ngày, tiêm màng bụng trong khoảng 150 ngày làm giảm sự phát triển của tế bào khối u, tăng thời gian và tỷ lệ sống sót của chuột thử nghiệm [53]. Cơ chế này có liên quan đến tác dụng gây độc tế bào, tăng sự chết rụng và ức chế sự hình thành mạch máu của tế bào khối u.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

RES c ng có tác dụng gây độc tế bào đối với tế bào MCF-7 và các tế bào MCF7 kháng adriamycin với giá trị IC50 lần lƣợt là 58,4 và 56,7 μg / mL [17]. RES c ng có tác dụng chống ung thƣ buồng trứng Guo và cộng sự, 2010 , ung thƣ bạch huyết [62], khối u không điển hình / rhabdoid không điển hình [31], ung thƣ gan [24], khối u ác t nh ở mắt và khối u thần kinh ở ngƣời [55]…. b. Tác dụng kháng virus

Trong các th nghiệm nuôi cấy tế bào, RES đã ngăn chặn quá trình tái tạo virus cúm, đạt hiệu quả lớn nhất 3 giờ sau khi phơi nhiễm cúm. RES đạt hiệu quả nhỏ hơn nhƣng vẫn đáng kể khi điều trị đƣợc tiến hành bắt đầu 6 giờ sau khi nhiễm, tuy nhiên tại thời điểm 9 giờ sau khi bị nhiễm, RES không có tác dụng [48].

c. Tác dụng kháng nấm

RES có tác dụng kháng nấm mạnh, chống lại các loại nấm gây bệnh ở ngƣời trong khoảng nồng độ 10-20 µg/ml. Sự tiêu diệt các tế bào nấm C.albicans bởi RES đã đƣợc xác định b ng phƣơng pháp qu t k nh hiển vi điện tử. Các kết quả này đƣa ra giả thuyết r ng RES có thể đƣợc sử dụng nhƣ là chất điều trị nấm ở ngƣời [57]. d. Tác dụng kháng vi m

13

Nghiên cứu ch ra r ng cả RES và quercetin đã ức chế quá trình sao ch p phụ thuộc NF-kappaB-, AP-1- và CREB đến một mức lớn hơn glucocorticosteroid, dexamathasone [8].

Abeer H. Harb và cộng sự đã thử nghiệm hiệu quả chống viêm của RES trên chuột và nhận thấy: quá trình giảm viêm phụ thuộc liều; sự ức chế này có ý nghĩa thống kê sau 3h và 1h với liều 13,40 mg/kg tƣơng ứng. Hiệu quả chống

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

viêm của RES đƣợc tìm thấy một cách độc lập ở tuyến thƣợng thận nhƣng có thể liên quan tới việc ức chế các nhân tố gây viêm và gốc tự do. Một vài ý kiến cho r ng hiệu quả chống viêm của RES là do ức chế hoạt t nh cyclooygenase, làm giảm tạo prostagladin E2 (PGE2 ; đồng thời ức chế con đƣờng phát sinh NO, làm giảm quá trình tổng hợp NO trên các đại thực bào và các tế bào nuôi cấy có hoạt t nh [22]. e. Các tác dụng khác

RES đã đƣợc chứng minh có tác dụng giảm sự oxy hóa và tăng trƣởng trong các tế bào biểu mô sắc tố võng mạc ngƣời, chống lại các rối loạn tim mạch do oxy hóa, ….[7], [18].

1.2.2.3. Tác dụng dược lý của EM a. Tác dụng ch ng ung thư

Jia và cộng sự lần đầu tiên chứng minh r ng EM có khả năng ức chế sự di căn của tế bào ung thƣ vú b ng cách ức chế sự hồi phục của các đại thực bào M2 trong phổi [29]. Trong một nghiên cứu khác, điều trị kết hợp của EM (10, 20, 40 và 80 μM và curcumin 10 μM đã ức chế sự gia tăng và xâm lấn các tế bào ung thƣ vú b ng cách tăng sự hiện diện của miR-34a [20].

14

Way và cộng sự đã chứng minh r ng EM ức chế đáng kể sự di chuyển và xâm lấn của tế bào TWIST1 b ng cách ức chế các con đƣờng tổng hợp βcatenin và Akt [56]. b. Tác dụng ch ng vi m Nhiều nghiên cứu ch ra r ng EM có tác dụng chống viêm trên chuột bị viêm hoại tử b ng cách tăng sản sinh tế bào mCD14 và ức chế TNF- , IL-6 và

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

IL-1β trong huyết thanh [46], [63].

Yếu tố nhân-κB tham gia vào việc sao ch p các gen viêm da khác nhau liên quan đến sự tiến triển của bệnh. Tác dụng kháng viêm của EM có liên quan đến sự ức chế yếu tố phiên mã viêm nƣớu NF-κB. Gao và cộng sự Làm sáng tỏ các thành phần hoạt t nh kháng viêm của thuốc bôi sẹo trị liệu Jiashitang, bao gồm saffiomin, emodin, salvianolic acid, tanshinone và các dẫn chất saponin triterpenoid. Trong số các hoạt chất này, emodin đƣợc dự đoán sẽ gây tác dụng ức chế NF-κB thông qua các con đƣờng tổng hợp MAPK, PI3K / AKT và NIK-IKK [19].

c. Tác dụng kháng khuẩn

EM có tác dụng kháng khu n đáng kể trên các vi khu n Gram dƣơng đƣợc thử nghiệm, đặc biệt là Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus. Giá trị nồng độ kháng sinh ức chế vi khu n tối thiểu MIC của emodin là 28,9 và 14,4 μM [12]. Tuy nhiên, EM không có tác dụng trên hai vi khu n Gram âm (Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli ở nồng độ cao nhất 1851,9 μM đã đƣợc thử nghiệm. Các nghiên cứu tƣơng tự cho thấy, EM đã đƣợc báo cáo có hoạt t nh kháng khu n phổ rộng, đặc biệt đối với M. tuberculosis (MIC = 0,9 μM và vi khu n Gram dƣơng MIC <14,8 μM [14]. d. Các tác dụng khác

15

Ngoài ra, EM còn đƣợc báo có tác dụng giảm đau, kháng virus, ức chế miễn dịch, tác dụng bảo vệ thần kinh, chống tiểu đƣờng, bảo vệ tế bào gan….[40], [41], [42], [61].

1.3. Phƣơng pháp xác định POL, RES và EM 1.3.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc ảng 1.1: Một số nghiên cứu ngoài nƣớc về định lƣợng POL, RES, EM trong

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Cốt kh củ

Kỹ

TLTK

thuật

sử dụng

Đối tƣợng phân tích

Điều kiện phân tích

- Dung môi chiết: methanol - Phƣơng pháp chiết: Siêu âm

[6]

HPLCDAD

- POL, RES,

- Điều kiện sắc ký

EM trong 5

+ Pha tĩnh: C18 4,6 × 250 mm; 5 µm )

loài

+ Pha động: Kênh A: acetonitril; Kênh

Polygonum

B: nƣớc. Chế độ gradient + Bƣớc sóng phát hiện: 320 nm với POL, RES và 280 nm với EM

- POL, RES, anthraglycosd [68]

HPLC

B,

EM

và

physcion trong rễ Cốt kh củ

- Dung môi chiết: methanol - Phƣơng pháp chiết: Siêu âm - Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: Agilent Zorbax SB-C18 (4,6 × 250 mm; 5 µm ) + Pha động: Kênh A: acetonitril; Kênh B: acid fomic 0,1%. Chế độ gradient

16

+ Bƣớc sóng phát hiện: 306 nm - Dung môi chiết: ethanol 95 % - Phƣơng pháp chiết: Siêu âm - Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: HPTLC Silica gel 60

HPTLC

+ Pha động: Petroleum–butyl acetat –

POL trong rễ

methanol – acetic acid tỷ lệ 4: 1: 0,7:

Cốt kh củ

0,02 hệ dung môi I và petroleum –

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

[70]

- EM, RES và

butyl acetat – methanol – acetic acid tỷ lệ 4: 2: 2: 0,1 hệ dung môi II + Bƣớc sóng phát hiện: 285 nm với EM, 293 nm với RES và POL.

1.3.2. Các nghiên cứu trong nƣớc

Trong chuyên luận cốt kh củ DĐVN V , chƣa có quy định về ch tiêu định lƣợng hoạt chất ch nh, hiện nay mới ch có ch tiêu định t nh b ng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng, so sánh với dƣợc liệu đối chiếu. Ch tiêu định lƣợng chất chiết đƣợc b ng phƣơng pháp cân với độ ch nh xác không cao. Vì vậy, chuyên luận cốt kh củ DĐVN V chƣa đánh giá ch nh xác đƣợc chất lƣợng dƣợc liệu cốt kh củ ở Việt Nam. Hiện nay, trong nƣớc đã có một số tác giả đề xuất các quy trình định lƣợng riêng lẻ từng chất POL, RES và EM. Năm 2007, Nguyễn Đình Tuấn đã xây dựng quy trình định lƣợng RES b ng phƣơng pháp LC-MS/MS. Tác giả đã sử dụng dung môi chiết là methanol 95 %, cô cắn và lắc loại tạp với ether dầu hỏa, tiếp tục cô lấy cắn và hòa cắn

17

trong methanol thu đƣợc dung dịch thử. Phƣơng pháp đƣợc xây dựng với độ thu hồi từ 98,1 – 100 % và có khoảng tuyến t nh từ 200 đến 1000 ng/ml [5].

Năm 2010, Nguyễn Thị Thúy H ng đã xây dựng phƣơng pháp định lƣợng RES trong Cốt kh củ, rƣợu vang nho và trong thực phầm chức năng viên Thiên Bảo Vang Không Độ b ng HPLC-DAD và LC-MS/MS. Dung môi methanol đƣợc sử dụng làm dung môi chiết. Với kỹ thuật HPLC-DAD, tác giả đã sử dụng

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

pha tĩnh là cột C18 250 mm x 4 mm; 5 µm , pha động là nƣớc-trifluoroacetic (215:1) : methanol tỷ lệ 50:50, v/v và 60:40, v/v , tốc độ dòng 1ml/ phút, bƣớc sóng phát hiện là 305 nm. Với kỹ thuật LC-MS/MS tác giả sử dụng pha tĩnh là cột C18 250 mm x 4 mm; 5 µm , pha động là methanol : acid acetic 0,5 % tỷ lệ 60:40, v/v , tốc độ dòng 0,5 ml/ phút. Cả 2 kỹ thuật đều có độ nhạy cao, có t nh đặc hiệu, thời gian phân t ch ngắn, phân t ch đúng và ch nh xác đối tƣợng nghiên cứu [4].

Năm 2017, Lê Ngọc Duy đã xây dựng phƣơng pháp định lƣợng POL trong Cốt kh củ b ng phƣơng pháp HPLC-UV/VIS. Tác giả đã sử dụng dung môi methanol : nƣớc 60:40, v/v làm dung môi chiết. Pha tĩnh đƣợc sử dụng là cột Ascentis C18 250mm×4,6mm; 5µm , pha động 2 thành phần nƣớc A và acetonitril B theo chƣơng trình gradient: từ 0-10 phút: 20-50% B; từ 10-20 phút: 50%B; từ 20-25 phút: 50-20% B; từ 25-30 phút: 20% B. Tốc độ dòng 0,5 ml/phút. Bƣớc sóng phát hiện là 306 nm. Phƣơng pháp đã xây dựng cho độ thu hồi từ 97,8% đến 104,4%, giới hạn phát hiện của POL trong cốt kh củ là 0,02 µg/ml, giới hạn định lƣợng là 0,04 µg/ml [2].

1.3.3. Tiêu chuẩn về dƣợc liệu Cốt khí củ trong một số Dƣợc điển Hiện nay, đã có nhiều quốc gia đƣa chuyên luận dƣợc liệu Cốt kh củ vào quy định trong Dƣợc điển nhƣ Trung Quốc, Hồng Kông, Việt Nam…

18

Trong Dƣợc điển Trung Quốc 2015 [10], quy định hàm lƣợng POL trong dƣợc liệu Cốt kh củ không đƣợc thấp hơn 0,15 % với quy trình sử ethanol làm dung môi chiết. Pha tĩnh sử dụng là cột C18, pha động là ACNnƣớc 23:77, v/v chạy đẳng dòng. Bƣớc sóng phát hiện là 306 nm.

Dƣợc điển Trung Quốc 2015) [10] c ng quy định hàm lƣợng EM trong dƣợc liệu Cốt kh củ không đƣợc thấp hơn 0,6 %. Quy trình định lƣợng EM sử

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

dụng phƣơng pháp chiết hồi lƣu cách thủy với clorofom + H2SO4 2,5 M làm dung môi chiết. Pha tĩnh sử dụng là cột C18, pha động: methanol : H3PO4 0,1 % 80:20 chạy theo chế độ đẳng dòng. Bƣớc sóng phát hiện là 254 nm.

Trong Dƣợc điển Hồng Kông [13] thì quy định tổng hàm lƣợng POL và RES không đƣợc thấp hơn 1,1 %. Quy trình sử dụng phƣơng pháp siêu âm với dung môi là ethanol. Pha động: Kênh A: acetonitril; Kênh B: nƣớc. Chế độ gradient. Bƣớc sóng phát hiện là 306 nm.

Hiện nay, nhu cầu sử dụng dƣợc liệu c ng nhƣ các sản ph m từ dƣợc liệu đang tăng cao. Cốt kh củ là một trong những dƣợc liệu đƣợc sử dụng phổ biến trong các bài thuốc chủ trị đau do tê thấp, kinh nghiệt bế tắc…Để đảm bảo chất lƣợng dƣợc liệu Cốt kh củ, cần có hệ thống các tiêu chu n nh m đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu một cách toàn diện nhất. Tuy nhiên, trong Dƣợc điển Việt Nam V mới có yêu cầu về ch tiêu hàm lƣợng chất chiết đƣợc và chƣa có quy định về hàm lƣợng của các hoạt chất trong dƣợc liệu Cốt kh củ.

Nhận xét: Qua các kết quả nghiên cứu trƣớc đây có thể thấy, hầu hết các tác giải đề sử dụng các dung môi chiết có độ phân cực cao nhƣ methanol, ethanol, ethanol/ nƣớc. Pha tĩnh đƣợc sử dụng là cột sắc ký C18 250mm×4,6mm; 5µm với hệ pha động ACN: nƣớc, methanol : nƣớc hay methanol : acid. Bƣớc sóng phát hiện là 320, 305, 306 hay 293 nm đối với POL và RES và 254, 280,

19

285 nm đối với EM. Phƣơng pháp chiết chủ yếu là chiết hồi lƣu cách thủy và siêu âm. Đã có nhiều nghiên cứu nƣớc ngoài định lƣợng đồng thời 3 hoạt chất này trong dƣợc liệu Cốt kh củ, tuy nhiên ở trong nƣớc mới ch dừng lại định lƣợng 1 hoạt chất là POL hoặc RES. Qua các nghiên cứu dƣợc lý cho thấy, POL, RES và EM là những chất ch nh tạo nên hoạt t nh cho dƣợc liệu Cốt kh củ, vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

định lƣợng đồng thời polydatin, resveratrol và emodin trong cốt khí củ (Reynoutria japonica Houtt) ằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” để góp phần kiểm soát chất lƣợng dƣợc Cốt kh củ.

20

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu là mẫu dƣợc liệu Cốt kh củ Rhizoma Renoutriae japanicae) đã đƣợc xác định tên khoa học và lƣu trữ tại Khoa Hóa phân t ch – tiêu chu n, Viện Dƣợc liệu từ tháng 12/2017. Ngoài ra, chúng tôi còn tiến hành thu thập

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

các mẫu dƣợc liệu Cốt kh củ tại một số chợ trên thị trƣờng Hà Nội để tiến hành áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng đánh giá hàm lƣợng hợp chất trong chúng.

Hình 2.1. Hình ảnh dƣợc liệu Cốt kh củ lƣu trữ tại Viện Dƣợc liệu

2.2. Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị 2.2.1. Chất chuẩn

- Chất chu n POL do hãng Dalian Meilunbio Co. Ltd. Manufcture cung cấp, độ tinh khiết đạt 98 % (ID: MB5448-S).

- Chất chu n RES do hãng DSM Nutritional Product. Ltd cung cấp, độ tinh khiết đạt 99 % (ID: 5011108004).

- Chất chu n EM do hãng Staherb Natural Ingredients cung cấp, độ tinh khiết đạt 98 % ID: STA-17090603)

21

2.2.2. Hóa chất - Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao MeOH, ACN của hãng Merck.

- Các dung môi, hoá chất dùng để xử lý mẫu EtOH, MeOH mua của Trung Quốc và đạt tiêu chu n tinh khiết phân t ch P.A. - Nƣớc cất sử dụng là nƣớc cất hai lần đã đƣợc deion hoá.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

2.2.3. Thi t bị

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu bao gồm: Bơm LC-20AD, detector SPD-20A UV/Vis, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20A, bộ phận ổn nhiệt CTO-20A Shimadzu.

- Cột Zorbax Eclipse XDB-C18 (250 x 4,6mm, 5µm .

- Bếp cách thủy Memmert, WB – 14 LO).

- Cân phân t ch (Precisa XT 220A), độ ch nh xác 0,0001 g.

- Cân phân t ch Precisa XT 220A), độ ch nh xác 0,00001 g.

- Cân kỹ thuật điện tử Ohaus) độ ch nh xác 0,01 g - Tủ sấy Memmert, ULM 500 .

- Cân xác định độ m Sartorius, MA – 45).

- Máy ly tâm Hettich Zentrifugen, Universal – 320).

- Máy quang phổ UV-VIS (Shimadzu UV – 1800).

- Các dụng cụ thông thƣờng ở phòng th nghiệm.

2.3. Nội dung nghiên cứu

2.3.1. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời POL, RES, EM ằng HPLC - T i ưu hóa điều ki n sắc ký + Khảo sát bƣớc sóng phát hiện

22

+ Khảo sát thành phần pha động + Khảo sát thể t ch tiêm mẫu - T i ưu hóa quy tr nh

lý m u

+ Khảo sát phƣơng pháp chiết: chiết siêu âm/hồi lƣu cách thủy. + Khảo sát dung môi chiết : ethanol, methanol, ethanol/nƣớc. + Khảo sát nhiệt độ chiết mẫu

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

+ Khảo sát thời gian chiết mẫu + Khảo sát số lần chiết mẫu 2.3.2. Thẩm định phƣơng pháp

- T nh chọn lọc, đặc hiệu của phƣơng pháp.

- Giới hạn phát hiện LOD , giới hạn định lƣợng LOQ .

- Khoảng tuyến t nh và đƣờng chu n.

- T nh th ch hợp hệ thống.

- Độ lặp lại.

- Độ đúng.

2.3.3. Áp dụng phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu Cốt khí củ Áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng để xác định hàm lƣợng POL, RES, EM trong một số mẫu cốt kh củ trên thị trƣờng Hà Nội.

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.4.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn - Dung dịch chuẩn g c POL 1 mg/ml: Cân ch nh xác 5 mg chu n POL, hòa tan ch nh xác trong 5 ml methanol.

- Dung dịch chuẩn g c RES 1 mg/ml: Chu n bị tƣơng tự nhƣ dung dịch chu n gốc POL.

23

- Dung dịch chuẩn g c EM 1 mg/ml: Chu n bị tƣơng tự nhƣ dung dịch chu n gốc POL. - Dung dịch chuẩn đ n: Tiến hành pha loãng từng dung dịch chu n gốc đến nồng độ khoảng 25 µg/ml.

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Từ dung dịch chu n gốc, tiến hành pha loãng thành dãy dung dịch chu n hỗn hợp nồng độ từ 500-0,02 µg/ml.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Các dung dịch chu n gốc đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 4 oC, sử dụng ổn định trong 02 tháng.

2.4.2. Khảo sát điều kiện sắc ký

- Khảo sát bƣớc sóng phát hiện: qu t phổ UV dung dịch chu n POL, RES, EM hòa tan trong MeOH để xác định cực đại hấp thụ λmax). Lựa chọn bƣớc sóng tại vị tr cực đại hấp thụ làm bƣớc sóng phát hiện.

- Khảo sát chƣơng trình pha động: Tiến hành khảo sát chƣơng tr nh rửa giải gradient với pha động gồm acetonitril hoặc methanol kênh B phối hợp với H2O kênh A theo các t lệ khác nhau.

- Khảo sát thể t ch tiêm mẫu: Tiến hành khảo sát thể t ch tiêm mẫu 5 µl, 10 µl và 20 µl để thu đƣợc cƣờng độ t n hiệu chất phân t ch lớn nhất (Sp c) c ng nhƣ hình dạng cân đối (As).

Các kết quả thu đƣợc với từng khảo sát đƣợc đánh giá, so sánh về thời gian lƣu tR , độ phân giải RS , và hệ số đối xứng (AS). RS ≥ 1,5; AS n m trong khoảng 0,8 – 1,5 tối ƣu xấp x b ng 1 ; tR của các chất phân t ch không quá dài nhƣng phải đảm bảo tách xa nhau.

2.4.3. Quy trình xử lý mẫu - Kh o sát hai phư ng pháp chi t: Phƣơng pháp siêu âm và phƣơng pháp đun hồi lƣu cách thủy.

24

- Kh o sát điều ki n chi t: + Dung môi chiết: khảo sát các dung môi chiết là hỗn hợp nƣớc – ethanol, nƣớc – methanol với các tỷ lệ khác nhau để lựa chọn đƣợc dung môi chiết phù hợp nhất. Trên cùng một nền mẫu tiến hành chiết theo quy trình chiết trên với các loại dung môi tỷ lệ khác nhau, mỗi loại tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

+ Thời gian chiết: khảo sát thời gian chiết 10 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút và 90 phút.

+ Khảo sát nhiệt độ chiết: khảo sát nhiệt độ 60, 70, 80 oC. Mỗi mức nhiệt độ tiến hành trên 3 lần cân mẫu độc lập, lấy kết quả trung bình để đánh giá. + Khảo sát số lần chiết: cùng một nền mẫu chiết lặp lại 1, 2, 3 lần, so sánh kết quả giữa các mẫu.

Lựa chọn các thông số tối ƣu dựa trên việc đánh giá hàm lƣợng POL, RES và EM t nh trên khối lƣợng mẫu khô kiệt.

2.4.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích

Sau khi khảo sát quá trình xử l mẫu và các điều kiện sắc ký, tiến hành th m định phƣơng pháp định lƣợng POL, RES và EM trong Cốt kh củ b ng HPLC theo hƣớng dẫn của AOAC.

2.4.3.1. Độ th ch hợp h th ng

T nh th ch hợp hệ thống là ph p thử nh m đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân t ch bởi các yếu tố nhƣ máy móc, thiết bị.

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chu n đã chu n bị ở trên. Ghi lại các giá trị thời gian lƣu, diện t ch p c. T nh tƣơng th ch hệ thống đƣợc biểu thị qua độ lệch chu n tƣơng đối RSD của các đáp ứng phân t ch. Yêu cầu các giá trị thời gian lƣu, diện t ch p c có RSD ≤ 2%.

25

2.4.3.2. Độ chọn lọc của phư ng pháp: - T nh chọn lọc của phư ng pháp: là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân t ch khi có mặt các thành phần khác nhƣ tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, t nh chọn lọc thể hiện trên sắc ký đồ thu đƣợc từ mẫu chu n các mẫu phân t ch và mẫu thêm chu n, p c của chất cần phân t ch tách hoàn toàn với các p c tạp.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Tiến hành chạy sắc ký dung dịch chu n hỗn hợp, dung dịch thử Cốt kh củ với chƣơng trình đã lựa chọn. Ghi lại các thông số thời gian lƣu và diện t ch p c.

Thời gian lƣu p c POL, RES và EM dung dịch chu n hỗn hợp, dung dịch thử Cốt kh củ phải tƣơng đƣơng nhau. P c trong mẫu thử phải tách hoàn toàn với các p c khác trong nền mẫu.

2.4.3.3. Giới hạn phát hi n (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) - Giới hạn phát hi n (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân t ch mà hệ thống phân t ch còn cho t n hiệu phân t ch khác có ý nghĩa với t n hiệu mẫu trắng hay t n hiệu nền nhƣng chƣa thể định lƣợng đƣợc.

LOD đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó t n hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đƣờng nền, thông thƣờng lấy S/N=3.

- Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lƣợng b ng phƣơng pháp khảo sát và cho kết quả có độ ch nh xác mong muốn.

LOQ đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó t n hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu đƣờng nền, thông thƣờng lấy S/N=10.

Trong đó:

S: Chiều cao t n hiệu của chất phân t ch.

N: Nhiễu đƣờng nền.

26

Tiến hành pha loãng dung dịch thử đã xác định nồng độ đến nồng độ thấp nhất còn xác định đƣợc b ng sắc ký. Xác định tỷ lệ S/N. 2.4.3.4. Kho ng tuy n t nh - Khoảng tuyến t nh của một phƣơng pháp phân t ch: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến t nh giữa t n hiệu đo đƣợc và nồng độ chất phân t ch.

Tiến hành sắc k các dung dịch chu n có nồng độ thay đổi và khảo sát sự

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

phụ thuộc của t n hiệu đo đƣợc và nồng độ. Vẽ đồ thị thuộc giữa t n hiệu và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến t nh. Việc xác định khoảng tuyến t nh thƣờng đƣợc khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lƣợng điểm thấp nhất và kết thúc là giới hạn tuyến t nh điểm cao nhất .

- Đƣờng chu n: là đƣờng biểu diễn sự phụ thuộc tuyến t nh giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ các chất phân t ch.

Đánh giá đƣờng chu n dựa vào giá trị R2 và độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đƣờng chu n Δ . Yêu cầu: 0,99 ≤ R2 ≤ 1.

2.3.4.5. Độ lặp lại

- Độ lặp lại: là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các ph p đo lặp lại và đƣợc biểu diễn b ng độ lệch chu n SD hay độ lệch chu n tƣơng đối RSD (%).

- Tiến hành định lƣợng 6 lần riêng biệt trên một mẫu dƣợc liệu và t nh toán độ lệch chu n tƣơng đối, theo AOAC yêu cầu RSD ≤ 3,7% đối với chất phân t ch có hàm lƣợng trong mẫu ≥ 0,1%. ( ) ∑ √

⃐ (

̅)

27

Trong đó:

xi : Nồng độ t nh đƣợc của lần thử nghiệm thứ i. ̅ : Nồng độ trung bình t nh đƣợc của N lần thử nghiệm.

N: Số lần thử nghiệm.

2.3.4.6. Độ đ ng Độ đ ng của phư ng pháp: là khái niệm ch mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị đƣợc chấp nhận

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

là đúng.

Độ thu hồi (đánh giá độ đ ng): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu đƣợc so với giá trị lý thuyết.

Thêm vào mẫu cốt kh củ đã đƣợc xác định hàm lƣợng hoạt chất một lƣợng ch nh xác chất chu n ở 2 mức 80% và 100% so với hàm lƣợng POL, RES và EM có trong mẫu khảo sát. Độ thu hồi đƣợc t nh theo công thức ( )

R: độ thu hồi (%).

: Nồng độ chất phân t ch trong mẫu thử thêm chu n µg/mL .

Cn: nồng độ chất phân t ch trong mẫu thử µg/mL . : Nồng độ chu n thêm lý thuyết mg/mL .

Độ thu hồi chấp nhận cho trƣờng hợp chất phân t ch có hàm lƣợng trong khoảng 0,1 – 1 % là: 95 – 105 %.

2.4.4. Áp dụng trên một số mẫu dƣợc liệu Cốt khí củ Áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng để xác định hàm lƣợng POL, RES, EM trong một số mẫu cốt kh củ trên thị trƣờng Hà nội.

28

2.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu - Một số đặc trƣng thống kê: Các đặc trƣng thống kê đƣợc t nh dựa vào dựa vào các hàm số trong Microsoft Excel.

Giá trị trung bình X : Hàm AVERAGE Độ lệch chu n SD : Hàm STDEV %

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Độ lệch chu n tƣơng đối (RSD) - Tƣơng quan hồi quy tuyến t nh:

Phƣơng trình hồi quy tuyến t nh thể hiện quan hệ giữa diện t ch p c sắc ký và nồng độ chất phân t ch: Y = aC +b

Hệ số góc a: Hàm SLOPE

Hệ số chắn b: Hàm INTERCEPT

Hệ số tƣơng quan r: Hàm CORREL

29

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU/THỰC NGHI M 3.1. Nghiên cứu tối ƣu hóa điều kiện sắc ký 3.1.1. Khảo sát ƣớc sóng hấp thụ cực đại của chất nghiên cứu Để xác định bƣớc sóng hấp thụ cực đại của POL, RES và EM, chúng tôi tiến hành qu t phổ UV-VIS của từng dung dịch chu n đơn trên máy quang phổ

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

UV-VIS. Hình 3.1 biểu phổ UV-VIS của từng chất.

A. Phổ UV-VIS của POL

Phổ UV-VIS của RES

C. Phổ UV-VIS của EM Hình 3.1. Phổ hấp thụ UV-VIS của POL, RES và EM Nhƣ vậy, phổ UV-VIS của POL và RES giống nhau, cùng có cực đại hấp thụ ở bƣớc sóng 306 nm. Điều này đƣợc giải th ch bới cấu trúc hóa học của chúng rất giống nhau, ch khác 1 gốc đƣờng glucose. Đối với EM, phổ UV-VIS cho thấy đ nh hấp thụ cực đại tại 221, 254, 289 và 437 nm. Qua tham khảo các

30

nghiên cứu trƣớc đây [2], [4], [10], trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn bƣớc sóng 306 nm để định lƣợng POL và RES, bƣớc sóng 254 nm để định lƣợng EM. 3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký 3.1.2.1 Lựa chọn pha tĩnh Qua các nghiên cứu trƣớc đây [2], [4], [5], [6], [10], [13] [68], [70], các

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

tác giả chủ yếu lựa chọn cột pha đảo RP-HPLC để tiến hành định lƣợng các hoạt chất trong dƣợc liệu Cốt kh củ. Trong điều kiện phòng th nghiện chúng tôi lựa chọn cột Zorbax Eclipse XDB-C18 (250 x 4,6mm, 5µm để định lƣợng POL, RES và EM trong dƣợc liệu Cốt kh củ.

3.1.2.2. Khảo sát thành phần pha động

Thành phần pha động ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả tách chất. Pha động có thể ảnh hƣởng tới những vấn đề sau trong ph p sắc ký: Độ chọn lọc của hệ pha, thời gian lƣu của chất phân t ch, hiệu lực cột tách, độ phân giải của chất phân t ch..

Để tiến hành khảo sát pha động chúng tôi tiến hành chu n bị dung dịch chu n đơn mỗi chất có nồng độ khoảng 25 µg/ml, dung dịch chu n hỗn hợp có nồng độ mỗi chất khoảng 25 µg/ml và dung dịch mẫu thử. Dung dịch mẫu thử đƣợc chu n bị với quy trình dự kiến nhƣ sau:

Cân ch nh xác 100 mg bột dƣợc liệu Cốt khi củ đã xay nhỏ vào bình cầu dung t ch 250 ml. Thêm ch nh xác 25 ml ethanol. Cân xác định khối lƣợng bình. Đun hồi lƣu trong 2 giờ. Để nguội. Cân lại bình, bổ sung khối lƣợng đã mất b ng ethanol. Lọc dịch thử qua màng lọc cellulose acetat 0,45 µm thu đƣợc dung dịch thử.

Các điều kiện sắc ký đƣợc giữ cố định nhƣ sau:

31

+ Pha tĩnh: Zorbax Eclipse XDB-C18 (250 x 4,6mm, 5µm + Bƣớc sóng phát hiện: 306 nm đối với POL và RES, 254 nm đối với EM + Thể t ch tiêm mẫu: 10 µl + Nhiệt độ cột: 25 oC + Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút Sau đó tiến hành sắc ký từng dung dịch chu n đơn, dung dịch chu n hỗn

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

hợp và dung dịch thử theo các chƣơng trình sắc ký khảo sát sau đây.

Với h pha động là ACN - nước

Với hệ pha động ACN – nƣớc, thời gian lƣu của từng chất đƣợc xác định b ng cách tiêm lần lƣợt từng chu n đơn vào hệ thống HPLC. Thứ tự rửa giải từng chất là: POL  RES  EM. Sau đó tiêm lần lƣợt dung dịch chu n hỗn hợp và dung dịch thử để xác định khả năng tách của các chất khỏi nhau c ng nhƣ khỏi tạp chất khác trong nền mẫu. Các chƣơng trình gradient đƣợc biểu diễn nhƣ bảng 3.1.

ảng 3.1. Khảo sát pha động ACN – nƣớc

Gradient 1

Thời gian phút

%ACN

Gradient 2

Thời gian phút

%ACN

0,01

20

0,01

15

10

70

25

40

20

70

30

90

25

95

45

90

30

20

50

15

40

20

55

15

32

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:

Hình 3.2. Chƣơng trình gradient 1

Hình 3.3. Chƣơng trình gradient 2 Nhận xét: Với chƣơng trình gradient 1, POL, RES không tách đƣợc ra khỏi nền mẫu, còn p c của emodin không cân xứng, bị k o đuôi. Với chƣơng trình gradient 2, chúng tôi đã tiến hành giảm thành phần dung môi hữu cơ, giảm

33

khả năng rửa giải của dung môi nh m mục đ ch tách đƣợc POL, RES và EM khỏi nền mẫu. Tuy nhiên, khi quan sát dƣới bƣớc sóng 254 nm, đƣờng nền không ổn định tại v tr p c EM, điều này làm ảnh hƣởng đến độ ch nh xác khi định lƣợng EM. Vì vậy chúng tôi lựa chọn hệ dung môi khác để tiến hành khảo sát Với h pha động là methanol : nước

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Với hệ pha động methanol – nƣớc, thời gian lƣu của từng chất đƣợc xác định b ng cách tiêm lần lƣợt từng chu n đơn vào hệ thống HPLC. Thứ tự rửa giải từng chất là: POL  RES  EM. Sau đó tiêm lần lƣợt dung dịch chu n hỗn hợp và dung dịch thử để xác định khả năng tách của các chất khỏi nhau c ng nhƣ khỏi tạp chất khác trong nền mẫu. Các chƣơng trình gradient đƣợc biểu diễn nhƣ bảng 3.2.

ảng 3.2. Khảo sát pha động MeOH – nƣớc

Gradient 3

Thời gian phút

%MeOH

Gradient 4

Thời gian phút

%MeOH

0,01

15

0,01

25

25

40

25

75

28

90

45

90

40

90

50

25

45

15

55

25

50

15

Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

34

Hình 3.4. Chƣơng trình gradient 3

Hình 3.5. Chƣơng trình gradient 4 Nhận xét: Với chƣơng trình gradient 3, p c POL đã tách đƣợc khỏi các p c tạp khác, tuy nhiên p c của RES vẫn chƣa tách đƣợc. Chúng tôi tiến hành khảo sát chƣơng trình gradient 4 b ng cách tăng tỷ lệ MeOH, đồng thời giảm tốc độ tăng của độ phân cực của hệ. Kết quả thu đƣợc, p c POL, RES và EM đã tách hoàn

35

toàn khỏi nền mẫu. Đồng thời hệ số đối xứng (As) xấp x b ng 1. Vì vậy chúng tôi lựa chọn chƣơng trình gradient 4 để tiến hành các khảo sát tiếp theo. ảng 3.3. Các thông số sắc ký ứng với chƣơng trình gradient 4 POL

RES

EM

Hệ số đối xứng (As)

1,098

1,291

0,985

Độ phân giải (Rs)

2,525

2,521

4,375

tr (phút)

14,191

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Thông số

18,593

38,542

3.1.2.3. Khảo sát thể tích tiêm mẫu

Sau khi lựa chọn đƣợc hệ pha động th ch hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát thể t ch tiêm mẫu. Thể t ch tiêm mẫu ảnh hƣởng đến cƣờng độ t n hiệu chất phân t ch, độ phân giải c ng nhƣ đối xứng của p c. Chúng tôi tiến hành tiêm hỗn hợp chu n theo chƣơng trình đã khảo sát lần lƣợt với 5 µl, 10 µl và 20 µl. Kết quả cho thấy ở cả 3 mức thể t ch đều cho khả năng tách tốt giữa các p c Rs > 1,5 , p c có độ đối xứng cao xấp x b ng 1 . T n hiệu chất phân t ch tăng theo tỷ lệ thể t ch tiêm mẫu. Tuy nhiên khi tiêm mẫu ở mức 20 µl có khả năng gây nhiễm b n cột cao, vì vậy chúng tôi lựa chọn thể t ch tiêm mẫu là 10 µl để tiến hành các khảo sát tiếp theo.

Nhƣ vậy, chúng tôi đã khảo sát đƣợc chƣơng trình xử lý mẫu tối ƣu nhƣ sau: + Pha tĩnh: Zorbax Eclipse XDB-C18 (250 x 4,6mm, 5µm . + Pha động: Kênh A: nƣớc, kênh B: methanol. Chạy theo chƣơng trình gradient. + Bƣớc sóng phát hiện: 306 nm đối với POL và RES, 254 nm đối với EM + Thể t ch tiêm mẫu: 10 µl + Nhiệt độ cột: 25 oC. Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.

36

3.2. Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu 3.2.1. Khảo sát phƣơng pháp chiết mẫu Từ các tài liệu tham khảo về định lƣợng POL, RES và EM trong Cốt kh củ, chúng tôi nhận thấy r ng có hai phƣơng pháp chiết thƣờng đƣợc sử dụng đó là chiết siêu âm và chiết hồi lƣu cách thủy. Với mục tiêu lựa chọn đƣợc phƣơng phát chiết cho hiệu suất tối ƣu, chúng tôi tiến hành khảo sát hai phƣơng pháp

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

chiết này.

Đ i với phư ng pháp si u âm: Cân ch nh xác 100 mg bột dƣợc liệu Cốt kh củ vào ống ly tâm 50 ml. Thêm ch nh xác 25 ml ethanol. Cân xác định khối lƣợng ống. Tiến hành siêu âm trong 30 phút. Để nguội. Cân và bổ sung khối lƣợng đã mất b ng ethanol. Lọc sơ bộ qua giấy lọc thô. Lọc qua màng cellulose acetat 0,45µm thu đƣợc dung dịch thử.

Đ i với phư ng pháp đun hồi lưu cách thủy: Chu n bị tƣơng tự nhƣ mục 3.1.3.

Mỗi phƣơng pháp chiết đƣợc tiến hành lặp lại 3 lần. Tiến hành phân t ch b ng HPLC theo điều kiện đã khảo sát và xác định hàm lƣợng trung bình của POL, RES và EM. Kết quả thu đƣợc nhƣ hình 3.6.

Hàm lƣợng (%)

Siêu âm

Cách thủy 0.558

0.423 0.295

0.423 0.324 0.155

POL

RES

EM

Hình 3.6. Kết quả khảo sát phƣơng pháp chiết mẫu

37

Nhận xét: Giữa hai phƣơng pháp chiết là siêu âm và hồi lƣu cách thủy chúng tôi nhận thấy phƣơng pháp đun hồi lƣu cách thủy cho hiệu suất chiết POL, RES và EM cao hơn so với phƣơng pháp siêu âm. Do đó, phƣơng pháp đun hồi lƣu cách thủy đƣợc lựa chọn để tiến hành tối ƣu hóa các điều kiện tiếp theo.

3.2.2. Khảo sát dung môi chiết Sau khi lựa chọn đƣợc phƣơng pháp chiết mẫu, chúng tôi tiến hành khảo

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

sát dung môi chiết nh m thu đƣợc hiệu suất chiết lớn nhất. Do POL, RES và EM tan tốt trong các dung môi có độ phân cực nhƣ methanol, ethanol, ethanol/nƣớc nên chúng tôi dùng các dung môi này làm dung môi chiết. Nh m lựa chọn đƣợc dung môi có hiệu suất chiết cao nhất, chúng tôi tiến hành khảo sát các dung môi: methanol, ethanol, ethanol/ nƣớc với các tỷ lệ 80%, 60% và 40 %. Quy trình xử lý mẫu tƣơng tự nhƣ mục 3.2.1. Mẫu Cốt kh củ đƣợc chiết 3 lần độc lập với mỗi dung môi chiết. Hiệu quả chiết của từng dung môi đƣợc đánh giá thông qua hàm lƣợng trung bình POL, RES và EM trong mẫu.

Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:

Hàm lƣợng (%) POL

RES

EM

0.557

0.415

0.464

0.431

0.431

0.447

0.439

0.446

0.319

0.323

0.309

0.307

0.399 0.375 0.294

Methanol

Ethanol

Ethanol 80%

Ethanol 60%

Ethanol 40%

Hình 3.7. Kết quả khảo sát dung môi chiết

38

Nhận xét: Kết quả thu đƣợc cho thấy, hàm lƣợng POL khi chiết mẫu b ng dung môi ethanol, ethanol 80%, ethanol 60% khác nhau không đáng kể và lớn hơn so với khi chiết b ng methanol và ethanol 40%. Hàm lƣợng RES đạt giá trị lớn nhất khi chiết với dung môi ethanol và giảm dần khi chiết với methanol, ethanol 80%, ethanol 60% và ethanol 40%. Hàm lƣợng EM đạt giá trị lớn nhất khi chiết b ng dung môi ethanol và nhỏ nhất khi chiết b ng dung môi ethanol

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

40%. Vì vậy, để đạt hiệu quả chiết POL, RES và EM cao nhất, chúng tôi lựa chọn ethanol làm dung môi chiết mẫu.

3.2.3. Khảo sát nhiệt độ chiết

Đối với phƣơng pháp chiết hồi lƣu thì nhiệt độ chiết là yếu tố đóng vai trò quan trọng đến hiệu suất chiết. Nhiệt độ cần đƣợc lựa chọn phù hợp để có hiệu suất chiết tốt nhƣng không làm ảnh hƣởng tới độ bền trong dung dịch của POL, RES và EM. Ch nh vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ chiết hồi lƣu trong khoảng từ 60 – 80 oC. Quy trình xử lý mẫu tƣơng tự nhƣ mục 3.2.1. Các khảo sát đƣợc thực hiện với dung môi chiết là ethanol. Mỗi khảo sát đƣợc làm lặp lại 3 lần độc lập ở mỗi điều kiện nhiệt độ và xác định hàm lƣợng trung bình POL, RES và EM trong mẫu. Kết quả đƣợc tập hợp trong hình 3.8.

Hàm lƣợng (%) POL

RES

0.562 0.434 0.325

0.542 0.439 0.326

0.541 0.4 0.297

60

EM

70

80

Hình 3.8. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết

39

Nhận xét: Kết quả cho thấy khi nhiệt độ tăng từ 60-80 oC thì hàm lƣợng của POL, RES và EM tăng dần và đạt giá trị lớn nhất tại 80 oC. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ chiết là 80 oC. 3.2.4. Khảo sát thời gian chiết Trong quy trình xử lý mẫu, thời gian chiết có vai trò quan trọng liên quan

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

đến hiệu suất chiết c ng nhƣ thời gian chu n bị mẫu. Để xác định đƣợc thời gian chiết tối ƣu, chúng tôi tiến hành khảo sát chiết trong 10 phút, 20 phút, 30 phút, 60 phút và 90 phút với dung môi chiết là ethanol và thực hiện chiết hồi lƣu ở 80oC. Quy trình tƣơng tự mục 3.2.1. Tại mỗi thời gian, tiến hành chiết lặp lại trên 3 lƣợng cân mẫu độc lập và xác định hàm lƣợng trung bình của POL, RES và EM trong mẫu. Kết quả thu đƣợc nhƣ hình 3.9.

Hàm lƣợng (%) RES

0.429

RES

0.545

0.536

0.533

0.419

RES

0.497

0.496

0.433

0.431

0.434

0.303

0.312

0.32

0.324

0.324

10 phút

20 phút

30 phút

60 phút

90 phút

Hình 3.9. Kết quả khảo sát thời gian chiết Nhận xét: Khi thời gian chiết tăng từ 10-30 phút thì hàm lƣợng POL, RES và EM đều tăng lên dù không nhiều. Khi thời gian chiết k o dài hơn 30 phút, hàm lƣợng POL và RES xác định đƣợc không thay đổi, trong khi hàm lƣợng EM

40

lại giảm. Hàm lƣợng EM giảm khi tăng thời gian chiết có thể do phân hủy vì tăng thời gian tiếp xúc nhiệt. Vì vậy, thời gian chiết đƣợc chọn ở 30 phút để tiếp tục các khảo sát tiếp theo.

3.2.5. Khảo sát số lần chiết Ngoài nhiệt độ và thời gian chiết, số lần chiết c ng quyết định đến hiệu suất chiết. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát các quy trình chiết

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1 lần với 25 ml ethanol, chiết 2 lần, mỗi lần với 12 ml ethanol và chiết 3 lần, mỗi lần với 8 ml ethanol. Mỗi quy trình chiết đƣợc tiến hành lặp lại trên 3 lƣợng cân độc lập rồi xác định hàm lƣợng trung bình của POL, RES và EM trong mẫu. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.10.

Hàm lƣợng (%) EM

3 lần

RES

POL

0.542

0.324

0.429

2 lần

0.545

0.325

0.431

1 lần

0.551

0.325

0.435

Hình 3.10. Kết quả khảo sát số lần chiết Nhận xét: Khi tiến hành chiết 1 lần, 2 lần và 3 lần với tổng thể t ch chiết không thay đổi thì hàm lƣợng POL, RES và EM thay đổi không đáng kể. Để tiết kiệm thời gian xử lý mẫu, chúng tôi tiến hành lựa chọn quy trình chiết 1 lần với 25 ml ethanol.

41

3.2.5. Phƣơng pháp định lƣợng đồng thời POL, RES và EM ằng HPLC Sau quá trình khảo sát điều kiện phân t ch b ng HPLC và điều kiện xử lý mẫu Cốt kh củ, phƣơng pháp định lƣợng đồng thời POL, RES và EM b ng HPLC đƣợc thiết lập với các điều kiện sau: - Điều ki n sắc ký: + Pha tĩnh: Cột Zorbax Eclipse XDB-C18 (250 x 4,6mm, 5µm .

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

+ Pha động: Kênh A: nƣớc, kênh B: methanol. Chạy theo chƣơng trình gradient.

+ Bƣớc sóng phát hiện: 306 nm đối với POL và RES, 254 nm đối với EM + Thể t ch tiêm mẫu: 10 µl + Nhiệt độ cột: 25 oC

+ Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút

+ Chƣơng trình gradient nhƣ sau:

- Quy tr nh

Thời gian phút

%MeOH

0,01

25

25

75

45

90

50

25

55

25

lý m u:

+ Dung dịch chuẩn g c POL 1 mg/ml: Cân ch nh xác 5 mg chu n POL, hòa tan ch nh xác trong 5 ml methanol. +Dung dịch chuẩn g c RES 1 mg/ml: Chu n bị tƣơng tự nhƣ dung dịch chu n gốc POL.

42

+ Dung dịch chuẩn g c EM 1 mg/ml: Chu n bị tƣơng tự nhƣ dung dịch chu n gốc POL. + Dung dịch chuẩn đ n: Tiến hành pha loãng từng dung dịch chu n gốc đến nồng độ khoảng 25 µg/ml. + Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Từ dung dịch chu n gốc, tiến hành pha loãng thành dãy dung dịch chu n hỗn hợp nồng độ từ 500-0,02 µg/ml.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

+ Dung dịch th :

Cân ch nh xác khoảng 100 mg bột dƣợc liệu Cốt khi củ đã xay nhỏ vào bình cầu dung t ch 250 ml. Thêm ch nh xác 25 ml ethanol. Cân xác định khối lƣợng bình. Đun hồi lƣu trong 30 phút, ở 80 oC. Để nguội. Cân lại bình, bổ sung khối lƣợng đã mất b ng ethanol. Lọc sơ bộ qua giấy lọc thô, dịch lọc đƣợc lọc qua màng lọc cellulose acetat 0,45 µm thu đƣợc dung dịch thử tiêm sắc ký.

43

3.3. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC 3.3.1. Độ chọn lọc của phƣơng pháp Tiến hành phân t ch dung dịch chu n hỗn hợp, dung dịch mẫu thử Cốt kh củ với các điều kiện sắc ký và xử lý mẫu nhƣ mục 3.2.5. Kết quả thu đƣợc cho

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

thấy:

Hình 3.11. Sắc ký đồ đánh giá t nh chọn lọc của phƣơng pháp

Nhận xét: POL, RES và EM đƣợc tách hoàn toàn khỏi nhau trên sắc ký đồ dung dịch chu n hỗn hợp và dung dịch mẫu Cốt kh củ. Thời gian lƣu của p c POL, RES và EM trên sắc ký đồ mẫu Cốt kh củ tƣơng tự nhƣ thời gian lƣu của các p c chu n tƣơng ứng trên sắc ký đồ dung dịch chu n hỗn hợp. Bên cạnh đó, trên sắc ký đồ mẫu thử, p c của POL, RES và EM đƣợc tách hoàn toàn khỏi các p c khác. Nhƣ vậy, phƣơng pháp đủ đặc hiệu để định lƣợng đồng thời POL, RES và EM trong Cốt kh củ.

3.3.2. Độ thích hợp hệ thống Để xác định độ th ch hợp hệ thống của phƣơng pháp, chúng tôi tiến hành sắc ký 6 lần hỗn hợp dung dịch chu n POL, RES và EM có nồng độ lần lƣợt là

44

25 µg/ml, 28 µg/ml và 26 µg/ml với điều kiện đã khảo sát. Tiến hành ghi lại thời gian lƣu và diện t ch p c tƣơng ứng. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: ảng 3.4. Kết quả đánh giá độ th ch hợp hệ thống của phƣơng pháp POL

1

tR (phút)

Spíc (mAU.s)

tR (phút)

EM Spíc

(mAU.s)

tR (phút)

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

TT

RES

Spíc (mAU.s)

14,126

1399837

18,515

2839697

38,525

1199684

14,159

1401624

18,545

2839614

38,534

1201737

14,178

1403820

18,565

2840314

38,540

1205563

14,197

1402407

18,584

2841833

38,540

1204561

14,205

1401381

18,585

2838929

38,539

1204283

14,181

1387181

18,569

2816979

38,501

1192940

ình

14,174

1399375

18,560

2836227

38,529

1201461

RSD(%)

0,20

0,43

0,14

0,33

0,04

0,39

2 3 4 5 6

Trung

Hình 3.12. Sắc ký đồ khảo sát t nh phù hợp hệ thống của phƣơng pháp

45

Nhận xét: Kết quả cho thấy độ lệch chu n tƣơng đối của diện t ch p c và thời gian lƣu của POL, RES và EM đều nhỏ hơn 2 %, cho thấy các điều kiện sắc

ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC sử dụng là phù hợp và đảm bảo độ ổn định của ph p phân t ch định lƣợng POL, RES và EM. 3.3.3. Đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính Để xây dựng khoảng tuyến t nh và đƣờng chu n. Chúng tôi tiến hành

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

chu n bị 1 dãy hỗn hợp dung dịch chu n chứa POL, RES và EM với khoảng nồng độ của POL từ 5 – 150 µg/ml, RES từ 1,12 – 112 µg/ml và EM từ 5,2 – 104 µg/ml. Tiến hành sắc ký với điều kiện đã khảo sát. Ghi lại t n hiệu p c và tiến hành xây dựng mối tƣơng quan giữa nồng độ và diện t ch p c. Kết quả khảo sát sự tƣơng quan giữa diện t ch p c và nồng độ POL, RES và EM đƣợc trình bày trong bảng 3.5

ảng 3.5. Quan hệ tuyến t nh giữa nồng độ và diện t ch p c của các chất POL

TT 1 2 3 4 5 6 7

Nồng độ (µg/ml)

S píc (mAU.s)

150 7942894 100 5520446 75 4157522 50 2719745 25 1337181 10 557486 5 276435 Y = 53486x + 44977 R2 = 0,9990

RES

Nồng độ (µg/ml)

S píc (mAU.s)

112 11545397 84 8628599 56 5704538 28 2816919 11,2 1167353 5,6 578334 1,12 119087 Y = 102924x -14699 R2 = 0,9999

EM

Nồng độ (µg/ml)

S píc (mAU.s)

104 78 52 26 10,4 5,2

4787683 3580914 2346811 1142940 478016 238255

Y = 46106x - 22033 R2 = 0,9998

Nhận xét: Đƣờng chu n đƣợc đánh giá thông qua hệ số tƣơng quan R. Kết quả đánh giá đƣờng chu n đƣợc trình bày trong bảng 3.6 cho thấy R2 của POL,

46

RES và EM đều lớn hơn 0,99 cho thấy đƣờng chu n đƣợc xây dựng có độ tuyến t nh cao đảm bảo để thực hiện ph p phân t ch định lƣợng POL, RES và EM.

Đƣờng chuẩn của RES

Đƣờng chuẩn của POL

14000000 12000000 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0

y = 102924x - 14699 R² = 0.9999

D ẠY da K yk ÈDiện tích píc (mAU.s) em M Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F Diện tích píc (mAU.s) s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Diện tích píc (mAU.s)

10000000 y = 53,486 x + 44,976 8000000 R² = 0.9990 6000000 4000000 2000000 0

0

50

100

150

0

200

Nồng độ (µg/ml)

50

100

150

Nồng độ (µg/ml)

Đƣờng chuẩn của EM

6000000

y = 46106x - 22033 R² = 0.9998

5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0

0

20

40

60

80

100

120

Nồng độ (µg/ml)

Hình 3.13. Đƣờng chu n của POL, RES và EM 3.3.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) Phân t ch mẫu thử đã đƣợc xác định nồng độ POL, RES và EM, sau đó pha loãng dần đến khi trên sắc k đồ của dung dịch thử, tại thời gian lƣu của POL, RES và EM, xác định đƣợc tỷ lệ S/N = 3 - 4 và S/N = 10. Từ đó tìm đƣợc LOD và LOQ. Mỗi mẫu làm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

47

Hình 0.14. Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ

Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:

48

Bảng 3.6. Kết quả xác định LOD và LOQ của phƣơng pháp

POL

RES

EM

LOD (µg/ml)

0,05

0,02

1,0

LOQ (µg/ml)

0,099

0,066

3,3

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

3.3.5. Độ lặp lại Để xác định độ lặp lại của phƣơng pháp, chúng tôi tiến hành phân t ch độc lập 6 lần một mẫu dƣợc liệu Cốt kh củ với quy trình nhƣ mục 3.2.5. Tiến hành sắc ký và ghi lại diện t ch p c của POL, RES và EM trong mẫu thử. Hàm lƣợng POL, RES và EM trong mẫu thử đƣợc t nh toán theo công thức sau: X(%) =

C x 25 x P x 100 x 100% 1000 x 100 x m x (100-B)

Trong đó:

X % : Hàm lƣợng của POL, RES và EM tƣơng ứng

C: Nồng độ POL, RES và EM t nh từ phƣơng trình đƣờng chu n (µg/ml) P: Độ tinh khiết của chất chu n % m: Khối lƣợng mẫu thử mg B: Độ m của mẫu thử %

49

ảng 3.7. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp Khối TT

Độ ẩm lƣợng (g)

POL

RES

EM

POL

RES

EM

1

0,1125 954976 1329974 988732

0,43

0,32

0,54

2

0,1089 944623 1312992 978314

0,44

0,33

0,56

3

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

(%)

Hàm lƣợng (%)

S píc (mAU.s)

0,1142 943251 1328867 957712

0,42

0,32

0,52

0,1099 954237 1339174 978992

0,44

0,33

0,55

0,1105 956866 1311266 966712

0,44

0,32

0,54

0,1142 953286 1312224 973332

0,42

0,31

0,53

TB

0,43

0,32

0,54

SD

0,019

0,017

0,01

RSD(%)

2,2

2,2

2,6

4 5 6

10,07

Nhận xét: Hàm lƣợng trung bình của POL, RES và EM trong mẫu Cốt kh củ lần lƣợt là 0,43 %, 0,32% và 0,54% với độ lệch chu n tƣơng đối RSD % là 2,2 %, 2,2% và 2,6 % < 3,7 % Theo AOAC, với hàm lƣợng hoạt chất > 0,1% thì độ lặp lại đạt yêu cầu khi RSD% < 3,7 % ) cho thấy phƣơng pháp xây dựng có độ lặp lại cao.

3.3.6. Độ đúng Mẫu thêm chu n: Cân ch nh xác khoảng 100 mg bột dƣợc liệu vào bình cầu dung t ch 250 ml. Tiến hành thêm chu n ở 2 mức khoảng 80% và 100% so với hàm lƣợng của POL, RES và EM trong mẫu Cốt kh củ pha dung dịch chu n POL, RES, EM nồng độ 0,1 mg/mL, sau đó thêm lƣợng thể t ch tƣơng ứng vào bột dƣợc liệu, sấy khô . Tiến hành xử lý mẫu nhƣ mục 3.2.5.

50

Mẫu không thêm chu n: Cân ch nh xác khoảng 100 mg bột dƣợc liệu và Tiến hành xử lý mẫu nhƣ mục 3.2.1.

Tiến hành định lƣợng mẫu thêm chu n và mẫu không thêm chu n b ng HPLC, mỗi mức thêm chu n đƣợc làm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình.

Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: ảng 3.8. Kết quả th m định độ đúng của phƣơng pháp

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Lƣợng chuẩn thêm vào (mg)

TT

Nồng độ (µg/ml)

Độ thu hồi (%)

POL

RES

EM

POL

RES

EM

POL

RES

EM

0,4

0,3

0,4

33,5

25,1

38,2

97,7

99,0

98,1

0,4

0,3

0,4

33,9

24,9

38,5

100,2

97,3

100,0

0,4

0,3

0,4

34,5

25,4

38,8

104,0

101,5 101,9

0,5

0,4

0,5

37,8

29,5

42,9

99,7

101,7 102,0

0,5

0,4

0,5

37,4

29,2

43,1

97,7

99,8

103,0

0,5

0,4

0,5

38,5

28,8

42,3

103,2

97,3

99,0

1 2 3 4 5 6

Độ thu hồi trung bình của phƣơng pháp định lƣợng POL trong rễ cốt kh củ b ng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC từ 97,7% đến 104,0%, củ RES từ 97,3% đến 101,7% và của EM từ 98,1% đến 103,0 %. Vậy phƣơng pháp đã xây dựng có độ đúng cao Đạt yêu cầu độ thu hồi của AOAC ứng với hàm lƣợng hoạt chất trên 0,1 % là 95 – 105%) 3.4. Áp dụng phƣơng pháp định lƣợng POL, RES và EM trên các mẫu Cốt khí củ Áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng, tiến hành đánh giá hàm lƣợng POL, RES và EM trong các mẫu dƣợc liệu Cốt kh củ thu mua tại thị trƣờng Hà Nội.

51

Mỗi mẫu đƣợc tiến hành lặp lại 3 lần độc lập. Tiến hành xử lý mẫu nhƣ mục 3.2.1. Kết quả nhƣ sau: ảng 3.9. Kết quả hàm lƣợng POL, RES và EM trên các mẫu Cốt kh củ Kí hiệu mẫu

Hàm lƣợng (%)

Độ ẩm

Hàm lƣợng POL và

POL

RES

EM

M1

10,34

0,27 ± 0,02

0,48 ± 0,02

0,67 ± 0,04

0,75 ± 0,04

M2

11,25

0,30± 0,03

0,49± 0,03

0,82± 0,05

0,79 ± 0,06

M3

10,98

0,27± 0,01

0,46± 0,02

0,65± 0,03

0,73 ± 0,03

M4

12,64

0,31± 0,05

0,56± 0,04

0,66± 0,01

0,87 ± 0,09

M5

11,92

0,35± 0,03

0,51± 0,02

0,61± 0,04

0,86 ± 0,05

M6

11,23

0,28± 0,02

0,52± 0,01

0,58± 0,03

0,80 ± 0,03

M7

9,90

0,26± 0,02

0,52± 0,02

0,90± 0,02

0,78 ± 0,04

M8

11,25

0,29± 0,03

0,51± 0,02

0,65± 0,01

0,80 ± 0,05

M9

13,50

0,47± 0,01

0,23± 0,03

0,47± 0,04

0,70 ± 0,04

M10

10,98

0,55± 0,04

0,20± 0,02

0,49± 0,02

0,77 ± 0,06

M11

10,56

0,48± 0,03

0,34± 0,01

0,47± 0,02

0,82 ± 0,04

M12

11,99

0,45± 0,02

0,17± 0,01

0,84± 0,03

0,62 ± 0,03

M13

11,94

0,23± 0,02

0,41± 0,01

0,58± 0,01

0,64 ± 0,03

M14

11,67

0,82± 0,01

0,06± 0,04

0,27± 0,01

0,88 ± 0,05

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

(%)

RES (%)

Nhận xét: Hàm lƣợng POL trong các mẫu Cốt kh củ thu mua trên thị trƣờng Hà Nội dao động từ 0,22 – 0,82 %, hàm lƣợng RES dao động từ 0,06 – 0,56 % còn đối emodin là từ 0,27 – 0,90 %.

52

Chƣơng 4. àn luận 4.1. Về quy trình xử lý mẫu POL, RES và EM là 03 thành phần ch nh trong dƣợc liệu Cốt kh củ, đã đƣợc nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng dƣợc lý. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành định lƣợng đồng thời 3 thành phần trên trong dƣợc liệu Cốt kh củ mà trƣớc đó ở Việt Nam chƣa có tác giả nào tiến hành.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Phƣơng pháp chiết mẫu là chiết hồi lƣu cách thủy, đây là phƣơng pháp chiết mẫu phổ biến trong phân t ch hoạt chất trong dƣợc liệu với ƣu điểm chiết kiệt đƣợc hàm lƣợng hoạt chất, trang thiết bị đơn giản.

Dung môi chiết mẫu đƣợc lựa chọn là ethanol có giá thành rẻ và t gây độc đối với kiểm nghiệm viên.

Chúng tôi đã tiến hành lựa chọn đƣợc nhiệt độ, thời gian c ng nhƣ số lần chiết mẫu phù hợp nh m đạt đƣợc hiệu suất chiết cao nhất.

So với Dƣợc điển Trung Quốc [10], chúng tôi đã xây dựng đƣợc quy trình định lƣợng đồng thời 3 thành phần này trong khi DĐTQ cần phải xử lý b ng 2 quy trình khác nhau gây lãng ph thời gian và chi ph phân t ch. Trong đó quy trình thứ nhất đánh giá hàm lƣợng POL và quy trình thứ 2 đánh giá hàm lƣợng EM.

Với Dƣợc điển Hồng Kông [13], quy trình chúng tôi xây dựng đã rút ngắn đƣợc thời gian xử lý mẫu từ 60 phút xuống còn 30 phút và đánh giá đƣợc hàm lƣợng 3 chất so với 2 chất đánh dấu trong Dƣợc điển Hồng Kông. Đối với một số nghiên cứu nƣớc ngoài nhƣ nghiên cứu định lƣợng đồng thời POL, RES và EM b ng phƣơng pháp HPTLC [70], thể t ch dung môi chiết đã giảm đáng kể. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả cần dùng đến 100 ml ethanol 95 % b ng phƣơng pháp siêu âm để chiết kiệt đƣợc hàm lƣợng 3 chất

53

còn trong quy trình chúng tôi xây dựng ch cần chiết với 25 ml ethanol với phƣơng pháp đun hổi lƣu cách thủy.

Quy trình xử lý mẫu đã xây dựng tƣơng đối đơn giản không cần trải qua nhiều công đoạn phức tạp gây thất thoát mẫu c ng nhƣ thời gian xử lý mẫu ngắn 30 phút , phù hợp trong công tác đảm bảo chất lƣợng dƣợc liệu.

4.2. Về xây dựng chƣơng trình sắc ký và thẩm định phƣơng pháp

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng tách và phát hiện chất phân t ch trong HPLC nhƣ loại cột sử dụng, chƣơng trình dung môi và detector.

Loại cột đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này là cột Zorbax Eclipse XDBC18 (250 x 4,6mm, 5µm . Đây là loại pha tĩnh đƣợc sử dụng phổ biến trong các phòng kiểm nghiệm dƣợc liệu.

Bƣớc sóng phát hiện, POL, RES và EM có khả năng hấp thụ ánh sáng UV-VIS tại các bƣớc sóng đặc trƣng. Chúng tôi đã lựa chọn các bƣớc sóng tại cực đại hấp thụ để tiến hành định lƣợng POL, RES và EM.

Chƣơng trình dung môi đƣợc xây dựng thông qua tham khảo các tài liệu trƣớc đây và điều ch nh thành phần pha động để phù hợp với mẫu nghiên cứu, đảm bảo khả năng tách giữa POL, RES. EM ra khỏi nền mẫu, c ng nhƣ p c thu đƣợc có t nh đối xứng nhất. So sánh với các nghiên cứu trong nƣớc nhƣ nghiên cứu [2], chƣơng trình sắc ký xây dựng đã đảm bảo khả năng tách giữa POL khỏi nền mẫu. Với điều kiện săc ký đã khảo sát, không những cho khả năng tách tốt POL, RES, EM mà còn giữa các p c khác nên hoàn toàn có thể đƣợc lựa chọn làm chƣơng trình sắc ký vân tay đối với dƣợc liệu Cốt kh củ đảm bảo rút ngắn thời gian giữa định t nh và định lƣợng hoạt chất trong dƣợc liệu Cốt kh củ, c ng nhƣ có thể sử dụng điều kiện sắc ký này để tiến hành định lƣợng đồng thời các anthraquinon và stilben khác trong dƣợc liệu Cốt kh củ.

54

Phƣơng pháp đã đƣợc tiến hành th m định theo những tiêu ch của AOAC, và đã đáp ứng đƣợc các tiêu ch nhƣ độ chọn lọc, độ phù hợp hệ thông, giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng, khoảng tuyến t nh và đƣờng chu n, độ lặp lại và độ thu hồi.

4.3. Về kết quả định lƣợng POL, RES và EM trên các mẫu dƣợc liệu Cốt khí củ thu mua tại thị trƣờng Hà Nội

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Kết quả cho thấy sự dao động của hàm lƣợng POL, RES và EM là rất lớn.

POL có hàm lƣợng dao động từ 0,23 – 0,82 %, hàm lƣợng RES dao động từ 0,06 – 0,56 % còn đối emodin là từ 0,27 – 0,90 %. Hầu hết các Cốt kh củ khảo sát đều đạt quy định về hàm lƣợng POL và RES trong Dƣợc điển Trung Quốc (POL không đƣợc dƣới 0,15 % và EM không dƣới 0,6 %). Tuy nhiên lại không có mẫu đạt quy định về tổng hàm lƣợng POL và RES theo quy định của Dƣợc điển Hồng Kông tổng hàm lƣợng POL và RES không đƣợc dƣới 1,1 % . Điều này có thể do sự khác biệt về hàm lƣợng hoạt chất trong dƣợc liệu Cốt kh củ trồng tại Việt Nam. Để có thể đánh giá một cách khách quan hơn cần định lƣợng POL, RES và EM trong nhiều mẫu Cốt kh củ hơn nữa.

55

Kết luận và đề xuất A. Kết luận Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi rút ra kết luận sau: 1. Đã tối ƣu hóa đƣợc điều kiện sắc ký POL, RES và EM b ng phƣơng pháp HPLC. Các điều kiện sắc ký bao gồm: + Pha tĩnh: Cột Zorbax Eclipse XDB-C18 (250 x 4,6mm, 5µm .

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

+ Pha động: MeOH – nƣớc. Chạy theo chƣơng trình gradient

+ Bƣớc sóng phát hiện: 306 nm đối với POL và RES, 254 nm đối với EM + Chọn đƣợc hệ dung môi phù hợp cho hiệu quả tách tốt nhất 03 chất + Thể t ch tiêm mẫu: 10 µl + Nhiệt độ cột: 25 oC

+ Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút

2. Đã xây dựng đƣợc quy trình định lƣợng 03 chất b ng HPLC với hiệu suất chiết cho hàm lƣợng 03 chất cao nhất.

3. Đã th m định đƣợc phƣơng pháp theo các tiêu ch của AOAC về: độ th ch hợp hệ thống các giá trị RSD đề nhỏ hơn 2% ; độ lặp lại RSD nhỏ hơn 3,7 % ; độ thu hồi đều n m trong khoảng 95 – 105%); đƣờng chu n và khoảng tuyến t nh các giá trị R2 đều lớn hơn 0,99 ; giới hạn phát hiện của POL, RES và EM lần lƣợt là 0,05, 0,02 và 1,0 µg/ml, giới hạn định lƣợng của POL, RES và EM lần lƣợt là 0,099, 0,066 và 3,3 µg/ml.

4. Áp dụng phƣơng pháp trên 14 mẫu Cốt kh củ trên thị trƣờng cho thấy POL có hàm lƣợng dao động từ 0,229 – 0,816%, hàm lƣợng RES dao động từ 0,057 – 0,561 % còn đối EM là từ 0,267 – 0,903 %.

56

. Đề xuất - Tiếp tục nghiên cứu đánh giá hàm lƣợng POL, RES và EM tại các vùng trồng dƣợc liệu của Việt Nam. - Xem x t việc đƣa tiêu ch định lƣợng các chất đánh dấu POL, RES và

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

EM vào Dƣợc điển Việt Nam để đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu Cốt kh củ.

TÀI LI U THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Đỗ Huy B ch 2006 , Cây thu c và động vật làm thu c ở Vi t Nam, Tập 1, tr.529-530, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội 2. Lê Ngọc Duy 2017 , ây d ng phư ng pháp định lượng polydatin trong r cây C t kh củ b ng sắc ký l ng hi u năng cao, Khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội

3. Nguyễn Thị Thúy H ng 2010 , Nghi n cứu ây d ng phư ng pháp định lượng Resveratrol trong c t kh củ, trong rượu vang nho và trong một s th c phẩm chức năng, Luận văn thạc sỹ, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội 4. Đỗ Tất Lợi 2004 , "Những cây thu c và vị thu c Vi t Nam", tr. 506-507, 1175-1176, NXB Y học, Hà Nội.

5. Nguyễn Đình Tuấn 2007 , " ng dụng LC-MS định lượng resveratrol trong c t kh củ", Tạp ch dược học, Số 379, tr. 13-16.

Tài liệu tiếng anh

6. Avula B., Joshi V. C., Wang Y.H., et al. (2007), "Simultaneous identification and quantification of anthraquinones, polydatin, and resveratrol in Polygonum multiflorum, various Polygonum species, and dietary supplements by liquid chromatography and microscop c study of Polygonum species", Journal of AOAC International, 90(6), pp. 1532-1538.

7. Baur J. A., Sinclair D. A. (2006), "Therapeutic potential of resveratrol: the in vivo evidence", Nature reviews Drug discovery, 5(6), p. 493.

8. Boocock D. J., Patel K. R., Faust G. E., et al. (2007), "Quantitation of transresveratrol and detection of its metabolites in human plasma and urine by high

performance liquid chromatography", Journal of Chromatography B, 848(2), pp.

182-187.

9. China Pharmacopoeia Committee (1995), "Pharmacopoeia of the People’s Republic of China", China Chemical Industry Press, BeiJing, pp. 167.

10. China Pharmacopoeia Committee (2015), Pharmacopoeia of the People's Republic of China, Volume I, pp.362-363.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

11. Chong J., Poutaraud A., Hugueney P. (2009), "Metabolism and roles of stilbenes in plants", Plant Science, 177(3), pp. 143-155.

12. Chukwujekwu J., Coombes P., Mulholland D., et al. (2006), "Emodin, an antibacterial anthraquinone from the roots of Cassia occidentalis", South African Journal of Botany, 72(2), pp. 295-297.

13. Department of Health (2009), Hong Kong Chinese Materia Medica Standards, Volume 4, pp. 244-245

14. Dey D., Ray R., Hazra B. (2014), "Antitubercular and Antibacterial Activity of Quinonoid Natural Products Against Multi‐ Drug Resistant Clinical Isolates", Phytotherapy research, 28(7), pp. 1014-1021.

15. Editor Committee of Jiangsu New Medical College (2001), "Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine", Shanghai, Shanghai Science and Technology Press, pp. 1329.

16. Fabris S., Momo F., Ravagnan G., et al. (2008), "Antioxidant properties of resveratrol and p ceid on lipid peroxidation in micelles and monolamellar liposomes", Biophysical chemistry, 135(1), pp. 76-83.

17. Feng L., Zhang L., Yan T., et al. (2006), "Studies on active substance of anticancer effect in Polygonum cuspidatum", Journal of Chinese medicinal materials, 29(7), pp. 689-691.

18. Fr mont L., Belguendouz L., Delpal S. 1999 , "Antioxidant activity of resveratrol and alcohol-free wine polyphenols related to LDL oxidation and polyunsaturated fatty acids", Life sciences, 64(26), pp. 2511-2521.

19. Gao J., Wang F., Wang W., et al. (2014), "Emodin Suppresses Hyperglycemia-Induced Proliferation and Fibronectin Expression in Mesangial".

20. Guo J., Li W., Shi H., et al. (2013), "Synergistic effects of curcumin with

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

emodin against the proliferation and invasion of breast cancer cells through upregulation of miR-34a", Molecular and cellular biochemistry, 382(1-2), pp.

103-111.

21. Han J.H., Koh W., Lee H.J., et al. (2012), "Analgesic and anti-inflammatory effects of ethyl acetate fraction of Polygonum cuspidatum in experimental animals", Immunopharmacology and immunotoxicology, 34(2), pp. 191-195.

22. Harba A. H., Abu Zargab M., Abdallaa S. (2009), "Effects of TransResveratrol, Isolated from Smilax Aspera, on Smooth Muscle, Blood Pressure, and Inflammation in Rats and".

23. Hegde V. R., Pu H., Patel M., et al. (2004), "Two new bacterial DNA primase inhibitors from the plant Polygonum cuspidatum", Bioorganic & medicinal chemistry letters, 14(9), pp. 2275-2277.

24. Hsu C.M., Hsu Y.A., Tsai Y., et al. (2010), "Emodin inhibits the growth of hepatoma cells: finding the common anti-cancer pathway using Huh7, Hep3B, and HepG2 cells", Biochemical and biophysical research communications, 392(4), pp. 473-478.

25. Hsu C.Y., Chan Y.P., Chang J. (2007), "Antioxidant activity of extract from Polygonum cuspidatum", Biological research, 40(1), pp. 13-21.

26. Huang Z.S., Wang Z.W., Liu M.P., et al. (1999), "Protective effects of polydatin against CCl4-induced injury to primarily cultured rat hepatocytes", World journal of gastroenterology, 5(1), p. 41.

27. Jayatilake G. S., Jayasuriya H., Lee E.S., et al. (1993), "Kinase inhibitors from Polygonum cuspidatum", Journal of Natural Products, 56(10), pp. 18051810.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

28. Ji H., Zhang X., Du Y., et al. (2012), "Polydatin modulates inflammation by decreasing NF-κB activation and oxidative stress by increasing Gli1, Ptch1, SOD1 expression and ameliorates blood–brain barrier permeability for its neuroprotective effect in pMCAO rat brain", Brain research bulletin, 87(1), pp.

50-59.

29. Jia X., Yu F., Wang J., et al. (2014), "Emodin suppresses pulmonary metastasis of breast cancer accompanied with decreased macrophage recruitment and M2 polarization in the lungs", Breast cancer research and treatment, 148(2), pp. 291-302.

30. Jin X.M., Jin G.Z. (2007), "Chemical constituents in root and rhizome of Polygonum cuspidatum", Chinese Traditional and Herbal Drugs, 38(10), p.

1446.

31. Kao C.L., Huang P.I., Tsai P.H., et al. (2009), "Resveratrol-induced apoptosis and increased radiosensitivity in CD133-positive cells derived from atyp cal teratoid/rhabdoid tumor", International Journal of Radiation Oncology Biology Physics, 74(1), pp. 219-228.

32. Kim J. R., Oh D.R., Cha M. H., et al. (2008), "Protective effect of Polygoni cuspidati radix and emodin on Vibrio vulnificus cytotoxicity and infection", The Journal of Microbiology, 46(6), pp. 737-743.

33. Kim K.W., Ha K.T., Park C.S., et al. (2007), "Polygonum cuspidatum, compared with baicalin and berberine, inhibits inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 gene expressions in RAW 264.7 macrophages", Vascular pharmacology, 47(2), pp. 99-107.

34. Kimura Y., Kozawa M., Baba K., et al. (1983), "New constitutents of roots of Polygonum cuspidatum", Planta medica, 48(07), pp. 164-168.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

35. Kimura Y., Okuda H. (2001), "Resveratrol isolated from Polygonum cuspidatum root prevents tumor growth and metastasis to lung and tumorinduced neovascularization in Lewis lung carcinoma-bearing mice", The Journal of nutrition, 131(6), pp. 1844-1849.

36. Kimura Y., Okuda H. (2000), "Effects of Naturally Occurring Stilbene Glucosides from Medicinal Plants and Wine, on Tumour Growth and Lung Metastasis in Lewis Lung Carcinoma‐ Bearing Mice", Journal of Pharmacy and Pharmacology, 52(10), pp. 1287-1295.

37. Kuznetsova Z. (1979), "Study of phenolic compounds from Japanese knotweed (Polygonum cuspidatum)", Vestsi Akad Navuk Belarus SSR Ser Biyal Navuk, 5, pp. 29-32.

38. Lanzilli G., Cottarelli A., Nicotera G., et al. (2012), "Anti-inflammatory effect of resveratrol and polydatin by in vitro IL-17 modulation", Inflammation, 35(1), pp. 240-248.

39. Li R.P., Wang Z.Z., Sun M.X., et al. (2012), "Polydatin protects learning and memory impairments in a rat model of vascular dementia", Phytomedicine, 19(8), pp. 677-681.

40. Liu Y., Chen X., Qiu M., et al. (2014), "Emodin ameliorates ethanol-induced fatty liver injury in mice", Pharmacology, 94(1-2), pp. 71-77.

41. Liu Y.X., Shen N.Y., Liu C., et al., editors, Immunosuppressive effects of emodin: an in vivo and in vitro study, Transplantation proceedings, 2009, Elsevier, pp. 1837-1839.

42. Lu Y., Yang J. H., Li X., et al. (2011), "Emodin, a naturally occurring anthraquinone derivative, suppresses IgE-mediated anaphylactic reaction and mast cell activation", Biochemical pharmacology, 82(11), pp. 1700-1708.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

43. Miao Q., Shi X.P., Ye M.X., et al. (2012), "Polydatin attenuates hypoxic pulmonary hypertension and reverses remodeling through protein kinase C mechanisms", International journal of molecular sciences, 13(6), pp. 7776-7787.

44. Miao Q., Wang S., Miao S., et al. (2011), "Cardioprotective effect of polydatin against ischemia/reperfusion injury: Roles of protein kinase C and mito K ATP activation", Phytomedicine, 19(1), pp. 8-12.

45. Murakami T., Ikeda K., Takido M. (1968), "Uber die Strukturen der Anthraglykoside aus den Rhizomen von Polygonum cuspidatum SIEB. et Zucc", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 16(11), pp. 2299-2300.

46. Ni Q., Sun K., Chen G., et al. (2014), "In vitro effects of emodin on peritoneal macrophages that express membrane-bound CD14 protein in a rat model of severe acute pancreatitis/systemic inflammatory response syndrome", Molecular medicine reports, 9(1), pp. 355-359.

47. Nonomura S., Kanagawa H., Makimoto A. (1963), "Chemical constituents of polygonaceous plants. I. studies on the components of kojokon (Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)", Yakugaku Zasshi: Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 83, pp. 988-990.

48. Palamara A. T., Nencioni L., Aquilano K., et al. (2005), "Inhibition of influenza A virus replication by resveratrol", Journal of Infectious Diseases, 191(10), pp. 1719-1729.

49. Park C.-S., Lee Y.C., Kim J.-D., et al. (2004), "Inhibitory effects of Polygonum cuspidatum water extract (PCWE) and its component rasveratrol on acyl-coenzyme A–cholesterol acyltransferase activity for cholesteryl ester

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

synthesis in HepG2 cells", Vascular pharmacology, 40(6), pp. 279-284.

50. Sheng C., Yu Y.H., Zhao K.S., et al. (2011), "Hypotensive resuscitation combined with polydatin improve microcirculation and survival in a rabbit model of uncontrolled hemorrhagic shock in pregnancy", Journal of Surgical Research, 168(1), pp. 103-110.

51. Song J.H., Kim S.K., Chang K.W., et al. (2006), "In vitro inhibitory effects of Polygonum cuspidatum on bacterial viability and virulence factors of Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus", Archives of Oral Biology, 51(12), pp. 1131-1140.

52. Song J.H., Yang T.C., Chang K.W., et al. (2007), "In vitro effects of a fraction separated from Polygonum cuspidatum root on the viability, in suspension and biofilms, and biofilm formation of mutans streptococci", Journal of ethnopharmacology, 112(3), pp. 419-425.

53. Tseng S.H., Lin S.M., Chen J.C., et al. (2004), "Resveratrol suppresses the angiogenesis and tumor growth of gliomas in rats", Clinical Cancer Research, 10(6), pp. 2190-2202.

54. Tsukida K., Yoneshige M. (1954), "Studies on the constituents of polygonaceous plants. 3. constituents of kojokon (Polygonum cuspidatum Sieb et

Zucc)", yakugaku zasshi : Journal of the Pharmaceutical society of Japan, 74(4), pp. 379-382.

55. Van Ginkel P. R., Darjatmoko S. R., Sareen D., et al. (2008), "Resveratrol inhibits uveal melanoma tumor growth via early mitochondrial dysfunction", Investigative ophthalmology & visual science, 49(4), pp. 1299-1306.

56. Way T.D., Huang J.T., Chou C.H., et al. (2014), "Emodin represses

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

TWIST1-induced epithelial–mesenchymal transitions in head and neck squamous cell carcinoma cells by inhibiting the β-catenin and Akt pathways", European journal of cancer, 50(2), pp. 366-378.

57. Weber K., Schulz B., Ruhnke M. (2011), "Resveratrol and its antifungal activity against Candida species", Mycoses, 54(1), pp. 30-33.

58. Xiao K., Xuan L., Xu Y., et al. (2000), "Stilbene Glycoside Sulfates from Polygonum cuspidatum", Journal of natural products, 63(10), pp. 1373-1376.

59. Xiao K., Xuan L., Xu Y., et al. (2002), "Constituents from Polygonum cuspidatum", Chemical and pharmaceutical bulletin, 50(5), pp. 605-608.

60. Xie X., Peng J., Huang K., et al. (2012), "Polydatin ameliorates experimental diabetes-induced fibronectin through inhibiting the activation of NF-κB signaling pathway in rat glomerular mesangial cells", Molecular and cellular endocrinology, 362(1), pp. 183-193.

61. Xue J., Ding W., Liu Y. (2010), "Anti-diabetic effects of emodin involved in the activation of PPARγ on high-fat diet-fed and low dose of streptozotocininduced diabetic mice", Fitoterapia, 81(3), pp. 173-177.

62. Yan Y., Gao Y.Y., Liu B.Q., et al. (2010), "Resveratrol-induced cytotoxicity in human Burkitt's lymphoma cells is coupled to the unfolded protein response", BMC cancer, 10(1), p. 445.

63. Yao W. Y., Zhou Y. F., Qian A. H., et al. (2015), "Emodin has a protective effect in cases of severe acute pancreatitis via inhibition of nuclear factor‑ κB activation resulting in antioxidation", Molecular medicine reports, 11(2), pp.

1416-1420.

64. Yun J.M., Chien A., Jialal I., et al. (2012), "Resveratrol up-regulates SIRT1 and inhibits cellular oxidative stress in the diabetic milieu: mechanistic insights",

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

The Journal of nutritional biochemistry, 23(7), pp. 699-705.

65. Zhang H., Yu C.H., Jiang Y.P., et al. (2012), "Protective effects of polydatin from Polygonum cuspidatum against carbon tetrachloride-induced liver injury in mice", PLoS One, 7(9), p. e46574.

66. Zhang H., Zhang Q.W., Wang L., et al. (2012), "Two new anthraquinone malonylglucosides from Polygonum cuspidatum", Natural product research, 26(14), pp. 1323-1327.

67. Zhang J., Tan Y., Yao F., et al. (2012), "Polydatin alleviates non-alcoholic fatty liver disease in rats by inhibiting the expression of TNF- and SREBP-1c", Molecular medicine reports, 6(4), pp. 815-820.

68. Zhang W., Jia Y., Huang Q., et al. (2007), "Simultaneous determination of five major compounds in Polygonum cuspidatum by HPLC", Chromatographia, 66(9-10), pp. 685-689.

69. Zhao J., Li H.Y., Wang Z.Y., et al. (2010), "Effect of polydatin on ultrastructure of cardiac myocytes in rats with adriamycin-induced myocardial damage [J]", Acta Academiae Medicinae CPAF, 8, p. 015.

70. Zhao R.Z., Liu S., Zhou L.L. (2005), "Rapid quantitative HPTLC analysis, on one plate, of emodin, resveratrol, and polydatin in the Chinese herb Polygonum cuspidatum", Chromatographia, 61(5), pp. 311-314.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

PHỤ LỤC

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T