NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT FLAVONOID TRONG LÁ SEN VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA

BỘ CÔNG THƯƠNG

FF IC IA L

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

Ơ

N

O

.......................

N

H

BÁO CÁO ĐỒ ÁN

D

ẠY

KÈ

M

Q

U

Y

ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT FLAVONOID TRONG LÁ SEN VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA GVHD: HUỲNH NGUYỄN QUẾ ANH DANH SÁCH NHÓM

STT

Họ và tên

MSSV

1

NGUYỄN THỊ HẠNH

13081601

2

VŨ THỊ LINH

13050641

3

LÊ THỊ THANH TRÚC

13053501

Tp HCM, tháng 10 năm 2016

FF IC IA L

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................................. 1 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI................................................................................................................... 2 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ..................................................................................................... 3 1. Giới thiệu về cây sen ........................................................................................................... 3 2. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................................... 4

O

3. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới............................................................ 7

N

4. Một số sản phẩm từ sen có trên thị trường..........................................................................

Ơ

CHƯƠNG II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 10 1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.................................................................................... 10

H

a. Thời gian nghiên cứu ............................................................................................................. 10

N

b. Địa điểm nghiên cứu .............................................................................................................. 10

Y

2. Nguyên vật liệu và thiết bị-hóa chất ................................................................................ 11

U

a. Nguyên liệu ............................................................................................................................. 11

Q

b. Thiết bị-hóa chất..................................................................................................................... 11 3. Nội dung nghiên cứu .......................................................Error! Bookmark not defined.

M

3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ dung môi cồn trích ly cho hàm lượng flavonoid cao nhất ...................................................................................................................... 13

KÈ

3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ dung môi metanol trích ly cho hàm lượng flavonoid cao nhất ...................................................................................................................... 14

ẠY

3.3. Thí nghiệm 3: Trích ly flavonoid trong lá sen bằng dung môi nước .................... 14

D

3.4. So sánh hàm lượng flavonoid trích ly từ lá sen bằng ba loại dung môi: cồn, metanol, nước.............................................................................................................................. 14 3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát tính chống oxy hóa của flavonoid .................................... .................................................................................................................................... 24 4. Phương pháp tiến hành nghiên cứu.................................................................................. 21 a. Sơ đồ quy trình xử lý nguyên liệu ......................................................................................... 21

b. Sơ đồ quy trình trích ly .......................................................................................................... 22 5. Phương pháp phân tích ...................................................................................................... 22 6. Phương pháp xử lý số liệu................................................................................................. 26

D

ẠY

KÈ

M

Q

U

Y

N

H

Ơ

N

O

FF IC IA L

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 27

FF IC IA L

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ơ

N

O

Trong những năm gần đây, ngoài khuynh hướng nâng cao ý thức phòng và chữa bệnh, người tiêu dùng còn quan tâm đến cách thức ăn uống sinh hoạt. Người ta bắt đầu quan tâm nhiều đến việc sử dụng các thực phẩm có chức năng chữa bệnh từ thức ăn như các loại họ đậu (đậu xanh, đậu nành, gạo lức…) đến thức uống như trà dược thảo, nước mát dân gian, trà xanh… Điều đó cho thấy những loại thực phẩm rất gần gũi với người Việt – thực phẩm truyền thống đang được sử dụng dần dần trở lại. Khoa học hiện đại vẫn khuyến khích sử dụng nguồn thực phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên như các loài thảo mộc, các loại trà xanh, dược thảo. Những thực phẩm này không những là thực phẩm đơn thuần mà còn có tác dụng phòng và chữa bệnh.

D

ẠY

KÈ

M

Q

U

Y

N

H

Sen là một loài cây đã quá quen thuộc với con người Việt Nam. Sen còn là biểu tượng về tinh thần của dân tộc Việt : “Gần bùn mà chẳng hôi tanh mùi bùn”. Không chỉ có vẻ đẹp, hương thơm mà sen còn có nhiều công dụng, tác dụng quý báu. Hải Thượng Lãn Ông đã viết về cây sen như sau: “cây sen mọc dưới bùn đen mà không ô nhiễm mùi bùn, đượm khí thơm trong lành của đất trời; nên củ, lá, hoa, tua, vỏ, quả, ruột đều là thuốc hay”. Nhưng từ trước đến nay, người ta chỉ chú ý đến sử dụng hạt sen (liên nhục) để nấu chè, tâm sen (liên tâm) làm thuốc an thần, tua sen (liên tu) dùng ướp chè, ngó sen (liên ngẫu) làm thực phẩm. Còn lá sen chỉ được dùng để gói thức ăn, ít người nghĩ rằng lá sen có nhiều tác dụng quý để chữa bệnh. Ngày nay, nhờ công nghệ hiện đại, các nhà khoa học đã phát hiện ra một chất đặc biệt của cây sen, chất nuciferine có tác dụng chống viêm, giảm đau, trị béo phì, hạ cholesterol trong máu và hoạt tính chống lại serotonin. Lá sen chứa nhiều nuciferine nhất.Nuciferine chiết ra từ lá sen có công dụng kéo dài giấc ngủ. Ngoài ra, lá sen còn chứa nhiều vitamin C, alkaloid tác dụng an thần mạnh hơn tâm sen.

Về hóa học, lá sen chứa nhiều thành phần như: tanin, flavonoid, các hợp chất polyphenol, alkaloid trong đó có nuciferine, nor-nuciferine, roemerine, anonain, liriodenin, pro-nuciferine, O-nornuciferine, armeparin, N-nor-amepavin, metylcoclaurin, nepherin, dehydro roemerine, dehydro nuciferine, dehydro anonain, Nmetyl lisococlaurin. Trong đó, nuciferine là alkaloid chính.

1

O

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

FF IC IA L

Về dược lý, lá sen được nghiên cứu có tác dụng an thần, chống co thắt cơ trơn, chống thoáng phản vệ, ức chế loạn nhịp tim, từ lâu đã được y học cổ truyền dùng làm thuốc chữa bệnh. Về sau này khi bệnh béo phì trở nên phổ biến, thì lá sen được sử dụng rất hiệu quả để chống lại căn bệnh này. Chính vì những lý do trên, nhóm chúng em đã chọn đề tài “NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT FLAVONOID TRONG LÁ SEN VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA” để làm đề tài đồ án tốt nghiệp.

D

ẠY

KÈ

M

Q

U

Y

N

H

Ơ

N

Tách chiết thu nhận dịch giàu flavonoid từ lá sen và ứng dụng thử hoạt tính chống oxy hóa của nó.

2

FF IC IA L

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1. Giới thiệu về cây sen

N

O

Cây sen thuộc loài Nelumbo nucifera Gaertn.

Ngành Ngọc Lan (magno liophyta).

Lớp Ngọc Lan (magno liopsida).

Phân lớp Sen (Nelumbonidae).

Bộ Sen (Nelumbonales).

Họ Sen (nelumbonaceae).

Chi Nelumbo Adans.

Ngoài ra còn có tên khác như: Liên, Ngậu (Tày).

Tên khoa học: Nelumbo nuciferagaertn.

Tên nước ngoài: sacred lotus, chinese water-lily, Indian lotus, Egypian bean.

Ơ

-

M

Q

U

Y

N

H

Hình 1.1.Lá sen

D

ẠY

KÈ

Mô tả cây sen: sen là một loại cây mọc ở dưới nước, sống dai nhờ thân rễ.

Ngó sen màu trắng, tiết diện gần tròn.Thân rễ phình to thành củ, màu vàng nâu, hình dùi trống, gồm nhiều đoạn, thắt lại ở giữa, trong có nhiều khuyết rộng. Lá hình lọng có 2 thùy sâu đối xứng nhau, mặt trên xanh đậm, nhẵn bóng, mặt dưới xanh nhạt, nhám.. Cuống lá màu xanh, hình trụ, có nhiều gai.Hoa to, màu hồng hay trắng.

Cuống hoa màu xanh, dài khi già chuyển sang màu nâu, có nhiều gai nhọn. Cuống lá và cuống hoa có nhiều khoang rỗng bên trong.Đế hoa rất lồi dạng hình nón ngược, mép lồi lõm, xốp, non màu vàng, già màu xanh.Quả màu xanh, nhẵn, hình bầu dục.

Hạt màu trắng 2 lá mầm dày mập màu trắng , bên trong có tâm sen màu xanh. Tâm sen gồm rễ mầm, thân mầm, chồi mầm và 2 lá đầu tiên.

3

FF IC IA L

Loại đất có đặc điểm tự nhiên rất thích hợp cho cây sen phát triển chính là đất phèn, bởi vậy vùng trồng sen số lượng lớn phải kể đến các tỉnh thuộc đồng bằng sông Cửu Long như: Đồng Tháp, Long An, Tây Ninh, An Giang,.. Ở miền trung nổi bật nhất sen được trồng ở Huế và trở thành đặc trưng của mảnh đất này, ngoài ra Quảng Nam cũng có những vùng nhỏ lẻ của các hộ gia đình.

Tại miền Bắc, sen được trồng trong các ao hồ nhỏ với quy mô ít hơn, được phân bố ở các vùng như: Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Hòa Bình,…

Trên thế giới Sen được trồng tại một số nước như: Nhật Bản, Ấn Độ, Trung Quốc, Ai Cập, Đài Loan, Hàn Quốc,…

O

2. Đối tượng nghiên cứu Lá sen lấy ở đại lộ Võ Văn Kiệt quận 6.

Các hợp chất hóa học có trong lá sen:

Ơ

N

Năm 1970, D. Cunitomo ( J. Pharm. Soc. Jap., 1970, 90, 9,1165) đã tách được từ lá sen các chất anonain, pronuxiferin, N-nornuxiferin, liriodenin, D. N. metylcoclaurin, roemerin, nuxiferin và O.nornuxiferin.

N

H

Theo cuốn sách những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của giáo sư tiến sĩ Đỗ Tất Lợi thì trong lá sen có nhiều alkaloid, trong đó nuciferine là alkaloid chính.

Công thức phân tử của nuciferine: C19H21 NO2

Y

Trọng lượng phân tử: 295,2

D

ẠY

KÈ

M

Q

U

Công thức cấu tạo của nuciferine.

Hàm lượng alkaloid toàn phần của lá sen chiếm từ 0.28-0.8% tùy theo điều kiện khí hậu, thổ dưỡng. Có khoảng 15 alkaloid đã được xác định.Các alkaloid trong lá sen có cấu trúc isoquinolin bao gồm các phân nhóm aporphin, proaporphin, benzylisoquinolin và bisbenzylisoquinolin.Các alkaloid có cấu trúc aporphin chiếm phần lớn về tỉ lệ cũng như số lượng trong alkaloid toàn phần của lá sen.

4

Hàm lượng flavoniod toàn phần của lá sen từ 3.814% tùy theo điều kiện khí hậu, thổ dưỡng. Có khoảng 16 flavonoid đã được xác định trong lá sen. Flavonoid trong lá sen thuộc các nhóm flavonol, flavon, catechin, leucoanthocyanidin, trong đó hàm lượng cao nhất được tìm thấy là quercetin 3-O-β-D-glucuronid.

Ơ

N

O

-

Tính chất lí – hóa: Nuciferin là chất kết tinh, tinh thể hình khối, màu vàng nhạt, không mùi, không vị, tan tốt trong CHCl3, MeOH, EtOH nóng, hầu như không tan trong nước, nhiệt độ nóng chảy 164– 165oC, Phổ UV (đo trong MeOH) cho λmax tại bước sóng 210 nm, 228 nm, 270nm.

Tác dụng dược lí: Nuciferin chiết từ lá Sen có tác dụng giải thắt co cơ trơn, ức chế thần kinh trung ương, chống viêm yếu, giảm đau, chống ho, kháng serotonin vàcó hoạt tính phong bế thụ thể adrenergic. Nuciferin ít độc, liều LD50 là 330 mg/kg thể trọng chuột. Nuciferin có tác dụng tăng cường quá trình ức chế các tế bào thần kinh vùng vỏ não cảm giác – vận động và thể dưới thân não trên thỏ thí nghiệm, có tác dụng an thần và kéo dài giấc ngủ của pentobarbital trên chuột thí nghiệm.

Bảng 2.1. Bảng thành phần dinh dưỡng của lá sen:

FF IC IA L

-

H

Thành phần

Y

Glucid

N

Nước

57.9% 0.8% 9.5%

U

Protein

Hàm lượng

0.5%

Tro

1.8%

Cellulose

29.5%

D

ẠY

KÈ

M

Q

Lipid

Bảng 2.2. Bảng so sánh hàm lượng flavonoid và alkaloid trong lá sen với cây mã đề và cây lược vàng:

5

U

Y

N

H

Ơ

N

O

FF IC IA L

Qua bảng trên đây cho ta thấy hàm lượng flavonoid và alkaloid của lá sen, cây lược vàng và cây mã đề là tương đương nhau, thậm chí, hàm lượng flavonoid của lá sen còn cao hơn so với hai cây còn lại.

Alkaloid Flavonoid Lá sen 0.28-0.8 % [1] 3.81%[1] Lá lược vàng 0.49%[2] 2.5%[2] Lá mã đề 0.69- 3.09%[3] Đã có nhiều bài báo khoa học chứng minh tác dụng của flavonoid cũng như cơ chế chống oxy hóa của chúng. Hợp chất flavonoid có công dụng trong lĩnh vực sinh học cũng như y học. Flavonoid là một nhóm các hợp chất được gọi là “những người thợ sửa chữa sinh hóa của thiên nhiên” nhờ vào khả năng sửa chữa các phản ứng cơ thể chống lại các hợp chất khác trong các dị ứng nguyên, virus và các chất sinh ung.

Nhờ vậy chúng có đặc tính kháng viêm, kháng dị ứng, chống virus và ung thư. Hơn nữa, flavonoid là một chất chống oxy hóa mạnh giúp cơ thể chống lại các tổn thương do sự oxy hóa và các gốc tự do một cách hữu hiệu. Nhờ vậy flavonoid còn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do các bệnh lý tim mạch như thiếu máu cơ tim, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch,… nhờ khả năng chống sự ôxy hóa không hoàn toàn cholesterol (cũng giống như các chất chống ôxy hóa khác như vitamin C, E,…). Ngược lại, nếu lượng flavonoid cung cấp hàng ngày giảm đi, nguy cơ các bệnh lý này tăng lên rõ rệt.Khả năng chống ôxy hóa của flavonoid còn mạnh hơn các chất khác như vitamin C, E, selenium và kẽm. Mỗi một loại flavonoid đều mang lại những lợi ích riêng, nhưng chúng thường hoạt động hỗ trợ nhau và tác dụng thường chồng chéo lên nhau

KÈ

M

Q

Các yếu tố ảnh hưởng đến các hợp chất có lợi trong lá sen: Dung môi có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình chiết xuất dược liệu. Để chiết xuất đạt hiệu suất cao và ít tạp chất phải lựa chọn được dung môi có độ phân cực phù hợp và có tính chọn lọc cao với chất cần chiết. Trong chiết xuất các chất flavonoid sử dụng dung môi hữu cơ thì pH, nhiệt độ, nồng độ dung môi là yếu tố quyết định đến hiệu suất chiết.

Vai trò của lá sen trong dân gian: Chữa mất nước: Người bị tiêu chảy vừa khỏi, cơ thể đang bị thiếu nước. Chỉ cần lấy lá sen non (loại lá còn cuộn lại chưa mở càng tốt) rửa sạch, thái nhỏ, ép lấy nước uống làm nhiều lần trong ngày. Hoặc thái nhỏ, trộn với các loại rau ghém, ăn sống hằng ngày.

Chữa máu hôi không ra hết sau khi sinh: Lá sen sao thơm 20-30 g, tán nhỏ, uống với nước, hoặc sắc với 200 ml nước còn 50 ml uống một lần trong ngày.

Chữa rối loạn mỡ máu: Lá sen khô 1 lá, sắc nước uống trong ngày.

D

ẠY

-

-

6

-

H

Ơ

N

-

FF IC IA L

-

Chữa mất ngủ: Lá sen loại bánh tẻ 30 g rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô sắc (hoặc hãm nước sôi) để uống, có tác dụng còn lớn hơn tim sen.

Chữa sốt xuất huyết: Lá sen 40 g, ngó sen hoặc cỏ nhọ nồi 40 g, rau má 30 g, hạt mã đề 20 g, sắc uống ngày một thang. Nếu xuất huyết nhiều, có thể tăng liều của lá và ngó sen lên 50-60 g.

Chữa băng huyết, chảy máu cam, tiêu chảy ra máu: Lá sen 40 g để sống, rau má 12 g sao vàng, thái nhỏ, sắc với 400 ml nước còn 100 ml, uống làm hai lần trong ngày.

Chữa ho ra máu, nôn ra máu: Lá sen, ngó sen, sinh địa (mỗi vị 30 g), trắc bá, ngải cứu (mỗi vị 20 g). Tất cả thái nhỏ, phơi khô, sắc uống trong ngày.

Chữa đau mắt: Lá sen, hoa hòe (mỗi vị 10 g), cúc hoa vàng 4 g, sắc uống còn chữa cao huyết áp. Đắp nhọt: Dùng ngoài, núm cuống lá sen nấu nước đặt để rửa, rồi lấy lá sen rửa sạch, giã nát với cơm nếp, đắp làm tan mụn nhọt.

Phòng chống béo phì: Lá sen tươi 1 lá, gạo tẻ 100g, đem nấu cháo dùng với đường trắng, cũng có thể gia thêm đậu xanh để tăng sức thanh nhiệt giải độc. Nếu không có lá sen tươi, có thể dùng lá sen khô, nhưng trước khi dùng phải ngâm cho mềm hoặc mỗi ngày uống trà lá sen.

O

-

N

3. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

KÈ

M

Q

U

Y

Hoàng Thị Tuyết Nhung (2012) đã chiết xuất và tinh chế nuciferin từ lá sen để làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm dược. Nuciferin là alkaloid chính có trong lá sen, có tác dụng giải thắt co cơ trơn, ức chế thần kinh trung ương, chống viêm yếu, giảm đau, chống ho, kháng serotonin và có hoạt tính phong bế thụ thể adrenergic. Chiết nuciferin bằng phương pháp chiết nóng với dung môi là ethanol.

Sau khi phân lập bằng phương pháp sắc ký cột với hệ dung môi là nhexan:aceton:NH4OH (3:1:0,1), thì thu được nuciferin với độ tinh khiết khá cao khoảng 96,2%. Bằng phương pháp kết tinh lại trong ethanol ở nhiệt độ thấp thu được nuciferin với độ tinh khiết lên đến 98-99%.[9]

D

ẠY

Trong nghiên cứu của Phạm Hữu Điền (2010)về thành phần hóa học của cây sen (Nenumbo nucifera) trồng ở Hà Nội. Tinh dầu hoa sen được thu hồi bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, sản phẩm có chứa trên 30 cấu tử, chủ yếu là pentadecan (36,49%), a-terpineol (11,88%)… Từ dịch chiết ethanol của lá sen, đã chiết tách và xác định cấu trúc của 4 hợp chất của dodexylamine, β-sitosterol, hexadecanamide và nuciferin. Nuciferin, một alcaloid chính trong lá sen, có biểu hiện họat tính kháng được năm chủng vi khuẩn.[10] Hoạt tính chống oxy hóa của hạt sen chiết bằng ethanol, đã được Sujay Rai và các cộng sự nghiên cứu (2006). Trên mô hình in vitro, hàm lượng phenolic tổng 7

FF IC IA L

số trong hạt sen là 7,6±0,04% (w/w). Giá trị IC50 thấp trên cả hai phương pháp DPPH (6,12±0.41g/mL) và oxit nitric (84,86±3,56 g/mL) và thấp hơn rutin chuẩn là 18,95±0,49 μg/mL, 152,17±5,01 μg/mL cho thấy hoạt tính loại gốc tự do mạnh.

In vivo, thử độc tính cấp tính ở chuột Swiss Albino, cho thấy không có dấu hiệu ngộ độc trong 24 giờ, khi cho chuột uống dịch chiết với liều lên đến 1000 mg/kg.[11]

H

Ơ

N

O

Nghiên cứu của Sasikumar Dhanarasu và cộng sự (2013)cho thấy: Dịch chiết từ nhị hoa sen trong methanol chứa kaempferol có tác dụng ức chế và làm giảm thụ thể IgE (immunoglubulin E)-một tác nhân gây dị ứng. Alkaloid và flavonoid của hạt sen chiết trong ethanol 95% có hoạt tính kháng virus HSV-1. Dịch chiết từ thân rễ có khả năng chống lại vi khuẩn Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis, và Pseudomonus aeruginosa. Khả năng chống nấm có thể so sánh với griseofulvin chống lại năm chủng nấm khác nhau. Ở một thí nghiệm khác cho thấy thân sen được chiết bằng ethanol có tính hạ sốt. Thực hiện trên chuột với thân nhiệt bình thường và chuột bị gây sốt. Kết quả là dịch chiết thân sen ở liều cho uống 200 mg/kg làm giảm thân nhiệt bình thường 3 giờ sau khi uống; còn liều 400 mg/kg thì giảm thân nhiệt tới 6 giờ sau khi uống.[12]

KÈ

M

Q

U

Y

N

Bo Huang và các cộng sự (2010) đã nghiên cứu khả năng bảo vệ gan và hoạt tính chống oxy hóa từ lá sen đƣợc chiết bằng ethanol. Thí nghiệm về hoạt tính bảo vệ gan ở chuột từ dịch chiết lá sen ở các liều 100 mg/kg, 300 mg/kg, 500 mg/kg và so sánh với silymarin 100 mg/kg, một chất điều trị chuẩn. Trong đó liều 100mg/kg chiết xuất từ lá được xem là tương đương với silymarin chuẩn ở liều100mg/kg. Bằng phương pháp HPLC-DAD-ESI/MS đã phát hiện ra sáu chất chống oxy hóa mạnh là glycoside của catechin và năm dẫn xuất glycoside của flavonoid: hyperin, isoquercitrin, astragalin, miricitrin–3–O–glucozid, quercetin–3–O–rhamnoside.

Góp phần chứng minh cho hoạt tính chống oxy hóa mạnh của chiết xuất lá sen.[13]

D

ẠY

“Antioxidant activity of methanol extract of the lotus leaf (nelumbo nucifera Gertn)”, The American Journal of Chinese Medicine, Vol 31, No. 5, 687 -698, 2003 Thirunavukkarasu Santhoshkumar, 10/2010, Springer-Verlag, “Synthesis of silver nanoparticles using Nelumbo nucifera leaf extract and its larvicidal activity against malaria and filariasis vectors”.

3. Một số sản phẩm từ sen có trên thị trường

-

Tinh lá sen tươi Firi: làm giảm huyết áp, mỡ máu, gan nhiễm mỡ.

-

Sen vông R – Viên nén bao đường: sản phẩm của công ty dược phẩm 8

Dopharma (cao khô lá sen và cao khô lá vông là thành phần chính), có tác dụng an thần gây ngủ, giảm đau nhẹ.

Hạt sen sấy bơ thành phần gồm có hạt sen và bơ là sản phẩm của Công ty Đầu Tư Thương Mại Du Lịch Đồng Tháp Mười.

FF IC IA L

-

4. Tổng quan về gốc tự do và chất chống oxy hóa 4.1. Gốc tự do ➢ Định nghĩa:

Ơ

N

O

Gốc tự do là những mảnh phân tử (CH3, OH...), phân tử (NO, NO2, CO2 ...), nguyên tử tự do (Cl, Br...) hay ion (O2...) trung tính hay mang điện tích, có lớp ngoài cùng chứa một điện tử không ghép cặp (điện tử độc thân). Chúng có thể mang điện tích dương, âm hoặc không mang điện và cả 3 loại này đều giữ vai trò quan trọng trong hệ thống sinh học. Vì vậy gốc tự do thường không ổn định cả về năng lượng cũng như điện học.

Q

U

Y

N

H

Gốc tự do luôn có khuynh hướng đạt tới sự ổn định và có thời gian tồn tại rất ngắn, hoạt động rất mạnh. Gốc tự do có thời gian tồn tại càng ngắn, càng có độc tính lớn. Người ta thấy rằng mức độ hoạt động của gốc tự do tương quan nghịch với thời gian tồn tại của chúng. Gốc tự do có thời gian tồn tại < 10 -6 giây là gốc tự do không bền và có độc tính cao, gốc tự do tồn tại > 10 -6 giây là gốc tự do bền, ít độc tính hơn và đây chính là tác nhân trung hoà gốc tự do không bền. Trong cơ thể có những gốc chứa oxy rất không bền, đó là các gốc O2 (gốc superoxid), OH (gốc hydroxyl), Alkoxyl (LO), Peroxyl (LOO•).

KÈ

M

Gốc tự do khi đạt tới trạng thái ổn định, nó có thể thể hiện là gốc oxy hoá khử. Ví dụ hoạt động của gốc anion superoxid (O2).

O2• +

Cu 2+

O2•

Fe 2+

+

Cu 2+ 2 H+

Fe3+

+ O2 +

H2O2

D

ẠY

Hoặc anion superoxid tự oxy hoá theo phản ứng dị ly: O2•

+ O2 •

2 H+

H2O2

+

O2

Gốc tự do hoạt động dễ dàng tấn công vào các phân tử tạo ra các phân tử mới, gốc mới và gây ra phản ứng dây chuyền: R•

+

R1 H

R•1

+

RH

R•1

+

R2 - R3

R•3

+

R1 - R2

9

Các gốc mới sinh nếu không được trung hoà theo phản ứng “gốc- gốc” để tạo phân tử không gốc thì sẽ tiếp tục chuỗi phản ứng như trên. Các gốc tự do luôn được hình thành từ nhiều con đường khác nhau, gốc này mất đi, các gốc khác lại được sinh ra.

FF IC IA L

➢ Phân loại:

Có thể phân loại gốc tự do theo nhiều cách khác nhau như nguồn gốc phát sinh, bản chất gốc tự do…Theo nguồn gốc phát sinh, gốc tự do được xếp thành hai loại như sau: Gốc tự do nội sinh: Có trong cơ thể do những quá trình chuyển hóa tự nhiên như hô hấp tế bào, diệt khuẩn trong quá trình thực bào, tổn thương các tế bào…

-

Gốc tự do ngoại sinh: Được hình thành do các yếu tố ngoại lai như ô nhiễm môi trường, uống rượu, hút thuốc lá… ➢ Ảnh hưởng của gốc tự do: Tác hại:

Ơ

-

N

O

-

Lợi ích:

U

-

Y

N

H

Gốc tự do nội sinh với một tỷ lệ nhất định thoát ra khỏi quá trình hữu ích cùng với gốc tự do lạ do tác động của môi trường, luôn tấn công quyết liệt và liên tục vào mọi cấu trúc của tế bào. Do có khả năng phản ứng mạnh nên các gốc tự do có thể thực hiện các phản ứng hóa học, phá hủy hệ thống tế bào dẫn đến khả năng sinh bệnh ung thư, nhồi máu cơ tim và lão hóa.

KÈ

M

Q

Tuy nhiên, không phải lúc nào gốc tự do cũng gây hại. Gốc tự do nội sinh là cần thiết cho quá trình phân huỷ và tổng hợp các chất trong chu trình chuyển hoá của cơ thể. Phản ứng oxy hoá cơ chất để cung cấp năng lượng cho sự sống hoặc các dây truyền trao đổi electron giữa các hệ thống, thường thông qua phản ứng gốc tự do. Khi cần gốc tự do cũng là vũ khí tiêu diệt các vật thể lạ xâm nhập.

4.2. Chất chống oxy hóa

D

ẠY

Trong điều kiện bình thường, các gốc tự do luôn luôn sản sinh trong cơ thể.

Do gốc tự do có khả năng phản ứng rất mạnh, nên nếu tăng quá mức cho phép sẽ gây ra những tổn thương tế bào làm phát sinh nhiều bệnh bệnh lý phức tạp. Chính vì thế mà trong cơ thể chúng ta hình thành hệ thống chất chống oxy hoá (antioxidant) có vai trò khử các chất oxy hoá và gốc tự do gây độc hại đến tế bào. ➢ Định nghĩa:

10

Chất chống oxy hoá là chất có khả năng phân huỷ được các peroxide, oxy đơn bội, gốc tự do khác, dập tắt gốc tự do, hoặc ngăn chặn quá trình oxy hoá sinh học do một cơ chế gián tiếp nào khác. Có thể có sẵn trong cơ thể hoặc được cung cấp bởi các thực phẩm hàng ngày.

FF IC IA L

➢ Phân loại:

Chất chống oxy hoá đuợc chia thành 2 loại: Các chất chống oxy hoá có bản chất enzyme và các chất chống oxy hoá không có bản chất enzyme.

-

Hệ thống chất chống oxy hoá có bản chất enzyme:

O

Trong cơ thể sống, phản ứng trong các dây truyền chuyển hoá thường sinh ra gốc tự do nhưng thường xuyên đƣợc thu dọn nhờ enzyme có sẵn trong tế bào trong đó có hồng cầu. Một số loại enzyme: Superoxide dismutase (SOD), Catalase, Glutathion reductase (GR), Gluthion peroxidase (GPx)...

Hệ thống chất chống oxy hoá không có bản chất enzyme:

N

-

Ơ

Polyphenol [15][16]

KÈ

M

Q

U

Y

N

H

Hợp chất phenolic là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của thực vật. Đến nay đã có hơn 8000 hợp chất polyphenol đã được xác định cấu trúc. Các phân lớp chính của polyphenol gồm có: acid phenolic, flavonoid và tannin. Đặc điểm cấu trúc chung của nhóm này là phân tử có một vòng thơm (vòng benzene) gắn trực tiếp với một hay nhiều nhóm hydroxyl (-OH). Về mặt y học, việc sử dụng thực phẩm giàu các hợp chất phenol như trà, rượu vang đỏ được chứng minh là có lợi cho sức khỏe. Tác dụng tốt này có được là do khả năng chống oxy hóa của các hợp chất phenol. Một số nghiên cứu cho thấy polyphenol có tác dụng chống ung thư và chống gây đột biến. Do chúng can thiệp vào một số các bước dẫn đến sự phát triển của khối u ác tính, bất hoạt các chất gây ung thư, ức chế sự biểu hiện gen đột biến và hoạt động của các enzyme tham gia vào sự kích hoạt procarcinogens (chất gây hại cho ADN), và kích hoạt hệ thống enzyme chuyển hóa chất lạ xenobiotic tham gia giải độc.

Flavonoid

D

ẠY

Flavonoid là một hợp chất rất phổ biến trong thực vật, có bản chất hoá học là những polyphenol, các flavonoid có hoạt tính sinh học được gọi là bioflavonoid có khả năng chống oxy hoá cao.Các hợp chất flavonoid là tập hợp những chất có khung cơ bản theo kiểu C6-C3-C6, trong đó có ít nhất một vòng benzen. Những lớp hợp chất flavonoid như là: flavan, flavonol, flavanonol, isoflavon, catechin, flavan3,4 diol…Trong tự nhiên thường tồn tại dưới dạng glycoside, trong đó có một hay nhiều nhóm hydroxyl phenolic gắn với phần đường qua liên kết glycosidic.

11

D

ẠY

KÈ

M

Q

U

Y

N

H

Ơ

N

O

FF IC IA L

Flavonoid có khả năng kìm hãm các hóa trình oxy hóa dây chuyền sinh ra từ gốc tự do hoạt động. Hoạt tính này phụ thuộc vào sự sắp xếp của các nhóm chức trong phân tử (cấu hình phân tử) và và số lượng nhóm hydroxyl. Sự có mặt của nhóm hydroxyl phenolic làm cho chúng có khả năng tương tác với protein. Nếu nhóm hydroxyl gắn trên vòng B thì hoạt tính loại gốc tự do mạnh nhất so với khi nhóm hydroxyl gắn trên vòng A hay vòng C. Thêm vào đó, hoạt tính chống oxy hóa được tăng lên khi trùng hợp các monome flavonoid thành dạng polyme. Ví dụ : proanthocyanidins (tannin ngưng tụ), các polyme của catechins là những chất chống oxy hóa tuyệt vời, bởi có chứa một lượng lớn nhóm hydroxyl trong phân tử. Ngoài ra, khả năng chống oxy hóa của proanthocyanidins còn phụ thuộc vào chiều dài của chuỗi oligomer và loại gốc tự do mà chúng phản ứng. Flavonoid loại gốc tự do theo nhiều cách khác nhau như: loại trực tiếp gốc tự do hoạt động, kích thích các enzyme chống oxy hóa, tạo phức với kim loại, làm giảm bớt các α-tocopheryl, ức chế enzyme oxidase, giảm tress oxy hóa gây ra bởi oxit nitric, làm tăng acid uric hay làm tăng hoạt tính cho chất chống oxy hóa kém hoạt động hơn…Chính những tác dụng này là một trong những cơ sở hóa sinh để định hướng cho việc sử dụng các flavonoid để chữa bệnh.

12

Hình 2. Những vị trí có hoạt tính chống oxy hóa của flavonoid Một số lợi ích của flavonoid: [5] Hoạt tính sinh học của flavonoid: Có tác dụng với khối u và một số dạng ung thư như enpatin (3,5,3'-trihydroxy-6,7,4'-trimetoxyflavon), enpatoretin (3,3'-dihydroxy -5,6,7,4'-tetrametoxyflavon); Nâng cao tính bền của thành mạch máu như rutin; Có tác dụng estrogen như glycosid quecxetin và kaempferol- 3-3-ramnogalacto-7ramnorid. Ngoài các tác dụng trên, flavonoid còn có các tác dụng khác như: chống dị ứng, chống co giật, giãn phế quản, giãn mạch, lợi mật, giảm đau và có tác dụng diệt nấm... Một số dẫn chất của flavonoid có tác dụng thông tiểu như quercetin (có trong lá diếp cá), kháng khuẩn như acvicularin. Đặc biệt, flavonoid còn có hoạt tính vitamin P, làm bền những mao mạch và giảm tính giòn của thành mạch.

Các kết quả nghiên cứu khoa học đã kết luận rằng: tác dụng sinh học của flavonoid là do khả năng chống oxy hoá của chúng quy định. Do khả năng ức chế quá trình oxy hoá nênchúng có hiệu ứng chống u lành tính và u ác tính. Các flavonoid còn được ứng dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm trùng như chống viêm loét dạ dày, viêm mật cấp tính và mãn tính, viêm gan, thận, thương hàn, lị...

Khả năng loại gốc tự do:

H

-

Ơ

N

O

FF IC IA L

-

Q

U

Y

N

Flavonoid có khả năng chống oxy hóa rất mạnh, chúng triệt tiêu các gốc tự do sinh ra trong quá trình bệnh lý của cơ thể và tạo nên những gốc tự do của chúng bền vững hơn và không tham gia vào dây chuyền phản ứng gốc. Nhờ thế oxy hóa khử thấp nên flavonoid (Fl-OH) có thể khử các gốc tự do như peroxyl, alkoxyl và hydroxyl bằng cách nhường nguyên tử hydro.

Fl-OH + R Fl-O +RH (Với R là gốc tự do)

D

ẠY

KÈ

M

Gốc flavonoid tự do (Fl-O) sau đó lại kết hợp với một gốc tự do khác để tạo thành hợp chất bền.

Hình 3. Flavonoid trung hòa gốc tự do Vitamin C

13

Vitamin C có khả năng vô hoạt các gốc tự do rất tốt do nó có thể chuyển cho các gốc tự do hai nguyên tử hydro của nó và khi đó nó trở thành dehydroascorbic acid.

O

FF IC IA L

Ngoài khả năng vô hoạt trực tiếp gốc tự do, vitamin C còn có khả năng tăng tác dụng chống oxy hóa của các chất khác trong cơ thể như vitamin E, carotenoid và flavonoid. Khi có sự tiếp xúc giữa vitamin E và gốc tự do peroxide của acid béo, vitamin E chuyển điện tử của nó cho gốc tự do nhưng đồng thời nó trở thành gốc tự do tocopheryl (vitamin E ở dạng oxy hóa). Vitamin C tiến hành khử gốc tocopheryl thành vitamin E nguyên dạng, sẵn sàng vô hoạt các gốc tự do peroxide mới. Các carotenoid khi vô hoạt các gốc tự do cũng được hoàn nguyên với cơ chế tương tự bởi vitamin C. Điều này góp phần hạn chế sự tự kích thích oxy hóa (pro-oxydante) của các gốc vitamin E và flavonoid.

5.Tổng quan về các phương pháp

N

5.1. Phương pháp trích ly

D

ẠY

KÈ

M

Q

U

Y

N

H

Ơ

Trong phạm vi bài nghiên cứu này, chúng chúng tôi chọn phương pháp trích ly flavonoid bằng kĩ thuật trích ly dùng dung môi lỏng, cụ thể là kĩ thuật trích ly pha lỏng – rắn (solid – liquid extraction) vì những ưu điểm và sự thuận tiện mà nó mang lại. Trích ly bằng dung môi lỏng là phương pháp truyền thống và được sử dụng phổ biến nhất hiện nay để trích ly flavonoid từ các mẫu nguyên liệu thực vật, với các đặc điểm dễ dàng sử dụng, hiệu quả và đối tượng mẫu áp dụng rộng rãi. Lượng chất trích ly được phụ thuộc vào từng loại dung môi phân cực khác nhau, thời gian và nhiệt độ trích ly, tỉ lệ nguyên liệu mẫu so với lượng dung môi cũng như thành phần hóa học và đặc tính vật lý của mẫu. Và hiển nhiên độ tan của hợp chất phenolic bị chi phối bởi bản chất hóa học của mẫu thực vật cũng như sự phân cực của loại dung môi sử dụng. Ngoài ra, số lượng và chất lượng sau khi thu hồi của các hợp chất flavonoid trích ly được cũng bị ảnh hưởng bởi thời gian và nhiệt độ trích ly. Sự tăng nhiệt độ có thể thúc đẩy quá trình hòa tan hay làm tăng vận tốc hòa tan các chất trích ly vào dung môi, tăng động lực truyền khối cả quá trình; bên cạnh đó, độ nhớt và sức căng bề mặt của dung môi cũng sẽ giảm ở nhiệt độ cao hơn, cải thiện khả năng trích ly. Tuy nhiên, hợp chất flavonoid có thể dễ dàng bị phân hủy và bị oxy hóa.

Thời gian trích ly lâu và nhiệt độ cao làm tăng khả năng oxy hóa flavonoid.

Một số loại dung môi như methanol, ethanol, acetone, ethyl acetate và hỗn hợp phối trộn các loại dung môi này và thường có sự kết hợp ở các tỉ lệ khác nhau với nước, đã được dùng để trích ly hợp chất flavonoid từ nguyên liệu thực vật. Việc

14

lựa chọn chính xác loại dung môi cũng như chế độ trích ly phù hợp quyết định đến số lượng và chất lượng flavonoid trích ly được.

5.2. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa

FF IC IA L

Vai trò chống oxy hóa của hợp chất flavonoid thể hiện qua khả năng cho electron hoặc nguyên tử hydro đến các gốc tự do hiện diện trong mẫu, điều này sẽ làm ngừng chuỗi phản ứng không mong muốn diễn ra trong quá trình oxy hóa (Tsao và Deng, 2004).

Y

N

H

Ơ

N

O

Gốc tự do được hình thành khi oxy bị chuyển hóa thành dạng cấu trúc hóa học đặc biệt với một electron đơn lẻ hoặc đôi khi là một vài electron ở lớp vỏ ngoài của phân tử. Với cấu trúc như vậy nên các gốc tự do có độ hoạt động cao và có thể phản ứng với protein, lipid, carbohydrate và DNA. Các gốc tự do này sẽ tấn công vào các phân tử ổn định ở gần nó nhất và lấy các electron của chúng. Khi phân tử bị tấn công công mất electron thì nó sẽ trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục bắt đầu chuỗi phản ứng tương tự. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa của một chất thường dựa trên phản ứng trực tiếp của phân tử chất đó với gốc tự do hoặc trong phản ứng với các kim loại chuyển tiếp (RiceEvan và cộng sự, 1996; Antolovich và cộng sự, 2002; Re và cộng sự, 1999, Record và cộng sự, 2001). Việc xác định hoạt tính chống oxy hóa là một cách để xác định giá trị về mặt sinh học và dinh dưỡng của thực phẩm.

D

ẠY

KÈ

M

Q

U

Có rất nhiều phương pháp để xác định hoạt tính chống oxy hóa, bao gồm phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH (Nagaraja, 2008), ABTS (Leong, Shui, 2002; Miller, Rice-Evans, 1997; Kriengsak và cộng sự, 2006), hydroxy peroxide (Tatjana Kadifkova Panovska, 2005) khả năng khử sắt (Huda và cộng sự, 2009), sử dụng hệ β-carotene – acid linoleic (Moure và cộng sự, 2000)… Trong đó, phương pháp sử dụng sử dụng gốc tự do DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) là phương pháp có thể thực hiện việc kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa một cách nhanh chóng, đơn giản và chính xác. Đây là phương pháp có thể sử dụng được cho cả mẫu ở dạng rắn và lỏng, và được dùng để xác định năng lực chống oxy hóa cho tổng thể mẫu thử chứ không dùng để xác định khả năng chống oxy hóa riêng của một thành phần nào (Koleva và cộng sự, 2001).

Phương pháp DPPH dựa trên khả năng làm giảm các gốc tự do DPPH (2,2diphenyl-1-picrylhydrazyl). DPPH là một gốc tự do ổn định ở nhiệt độ phòng, tạo thành dung dịch có màu tím trong các loại dung môi rượu như methanol, ethanol,… khi các gốc tự do này phản ứng với chất chống oxy hóa, số lượng gốc tự do sẽ bị 15

FF IC IA L

giảm và chúng sẽ chuyển sang màu vàng. Độ giảm hàm lượng gốc tự do được xác định bằng cách đo quang phổ hấp thụ với bước sóng hấp thu cực đại đặc trưng cho màu tím của gốc tự do DPPH. Thông thường, độ hấp thụ sử dụng trong phương pháp này được xác định ở bước sóng từ 515 – 520nm (Bandoniene và cộng sự, 2002; Pavlov và cộng sự, 2002). Khi dung dịch DPPH được trộn với các cơ chất có khả năng nhường nguyên tử hydro (chất chống oxy hóa), DPPH thu nhận nguyên tử hydro này và chuyển thành dạng chất bị khử. Cơ chế được mô tả theo phản ứng minh họa sau: Z● + AH

ZH + A●

Trong đó, Z● đại diện cho gốc tự do DPPH, AH đại diện cho các phân tử

A-A

H

A● + A●

Ơ

N

O

có khả năng cho nguyên tử hydro, ZH là dạng bị khử và A● là gốc tự do mới được hình thành. Điều đó có nghĩa là số lượng gốc DPPH sẽ giảm (bị mất màu tím) và bị thay thế bằng dạng bị khử (có màu vàng). Các gốc tự do A● này tiếp tục liên kết với nhau, ngăn chặn chuỗi phản ứng oxy hóa.

D

ẠY

KÈ

M

Q

U

Y

N

Nhận xét: cứ hai phân tử AH sẽ phản ứng với hai gốc tự do DPPH để hình thành 1 phân tử A-A mới, vậy tỉ lệ phản ứng giữa DPPH với cơ chất dạng AH là 1:1. Cơ chất AH đại diện cho các hợp chất chống oxy hóa mà trong phân tử có khả năng nhường 1 nguyên tử hydro. Nếu trong phân tử của chất chống oxy hóa có hai nhóm –OH (ví dụ: acid ascorbic), tức chúng có khả năng cho hai nguyên tử hydro thì tỉ lệ này sẽ thay đổi tương ứng là 2:1 (Phillip, 2004). Cơ chế được mô tả qua hai phương trình sau:

Và tương tự để áp dụng cho các hợp chất polyphenol có nhiều nhóm hydroxyl.

16

FF IC IA L

Hình 1.13. Gốc tự do DPPH trước và sau khi nhận nguyên tử hydro

ẠY

KÈ

M

Q

U

Y

N

H

Ơ

N

O

Với các cơ chế đã nêu, để xác định hoạt tính chống oxy hóa, người ta xây dựng đường chuẩn trên cơ sở cho DPPH phản ứng với chất cần xác định hoạt tính và ghi nhận lại độ giảm hàm lượng gốc tự do DPPH ứng với độ giảm giá trị hấp thụ của mẫu đo quang. Một trong những tham số được đưa ra để giải thích kết quả từ phương pháp DPPH nói riêng và nhiều phương pháp xác định hoạt tính khác nói chung là giá trị EC50 – “efficient concentration” (cách gọi khác là IC50). Giá trị này được định nghĩa là nồng độ của cơ chất (chất chống oxy hóa) có thể làm giảm 50% lượng DPPH (hay 50% độ màu) (Brand-Williams và cộng sự, 1995; Bondet và cộng sự, 1997).

D

CHƯƠNG II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

a.

Thời gian nghiên cứu: Đề tài được nghiên cứu trong vòng 6 tháng.

Thời gian tiến hành làm đồ án được chia làm 2 giai đoạn: 17

Giai đoạn 1: Thời gian tiến hành thí nghiệm trích ly hợp chất flavonoid trong lá sen.

- Giai đoạn 2: Thời gian tiến hành thí nghiệm khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của flavonoid trích ly được. ➢ Giai đoạn 1: thời gian tiến hành thí nghiệm trích ly hợp chất flavonoid trong lá sen được tiến hành từ ngày 1/11/2016 đến ngày 20/11/2016. Cụ thể như sau: - Thí nghiệm 1, 2, 3 tiến hành cùng lúc và mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần tiến hành từ ngày 1/11/2016 đến ngày 20/ 11/2016. ➢ Giai đoạn 2: Thời gian tiến hành thí nghiệm khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của flavonoid trích ly được - Thí nghiệm cho phương pháp 1 cũng được lặp lại 3 lần tiến hành từ ngày 20/11/2016 đến ngày 27/11/2016.

- Thí nghiệm cho phương pháp 2 lặp lại 3 lần tiến hành từ ngày 28/11/2016 đến ngày 5/12/2016.

- Thí nghiệm cho phương pháp 3 lặp lại 3 lần tiến hành từ ngày 6/12/2016 đến ngày 13/12/2017.

Thời gian còn lại sẽ làm lại những thí nghiệm làm sai hoặc thay đổi phương pháp làm để có kết quả tốt nhất và tiến hành viết báo cáo. Hoàn chỉnh đồ án vào ngày 30 tháng 3 năm 2017.

N

H

Ơ

N

O

FF IC IA L

-

Q

Nguyên liệu Lá sen được lấy ở hồ trên đường đại lộ Võ Văn Kiệt, quận 6.

KÈ

a.

Nguyên vật liệu và thiết bị, dụng cụ-hóa chất

M

2.

U

Y

b. Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện nghiên cứu tại phòng thí nghiệm F7.7, Viện Công nghệ Sinh học-Thực phẩm của trường Đại học Công nghiệp TP.HCM.

D

ẠY

Các mẫu được chuẩn bị theo chế độ sấy đã khảo sát, được nghiền theo kích thước 500µm, đóng gói và hút chân không bảo quản để thực hiện cho các khảo sát tiếp theo.

18

FF IC IA L O N Ơ H N Y

U

Hình 2.1. Hồ sen ở Võ Văn Kiệt

Q

b.

Thiết bị, dụng cụ-hóa chất Thiết bị:

M

➢ Máy đo ẩm hồng ngoại:

KÈ

- Thang đo: 0 – 100 % RH, khối lượng mẫu đo: 0,5 – 120 g - Nhiệt độ sấy: 30 – 180 oC

ẠY

- Thời gian cài đặt: 1 – 240 phút - Nguồn điện hoạt động: AC 220V 50/60 Hz

D

- Công suất sấy: 900 W.

➢ Máy so màu UV-Vis: - Giới hạn bước sóng: 200 nm – 800 nm - Độ chính xác buớc sóng: ± 2 nm 19

- Chức năng: A; T; C, điện tử hiện số - Khoảng truyền quang: 0 - 100 % T - Nguồn điện: 220 V AC / 50 Hz.

- Không gian màu: Lab, XYZ, Yxy, LCh, ....

- Dãy quang phổ: 400 - 700 nm.

- Nguồn sáng: A, C, D50, D65, F2, F6, F7, F8, F11, F12.

- Công thức sai lệch màu: d*ab, d94, d00.

- Đầu đo: MAV 8/11 mm, SAV 3/6 mm.

N

- Sai số giữa 2 chế độ MAV /SAV: d*ab < 0,2.

O

- Góc chụp: 2 và 10 0.

FF IC IA L

➢ Máy Đo Màu Minolta:

Ơ

- Sai số lần đo: d*ab < 0,02.

- Nguồn điện sử dụng: adapter hoặc pin AA.

H

➢ Máy sấy khay: Điện áp: 220V, 50Hz.

-

Công suất tiêu thụ: 1,5 kW.

-

Nhiệt độ: 0 – 300 0C.

-

Năng suất: 3 - 8kg/ lần.

Q

U

Y

N

-

➢ Máy xay mẫu.

KÈ

M

➢ Máy cô quay. ➢ Tủ nung. ➢ Tủ sấy không khí nóng.

D

ẠY

Dụng cụ:

➢ ➢ ➢ ➢ ➢ ➢ ➢

➢ ➢ ➢ ➢ ➢

Cân kỹ thuật.

Bộ chiết soxhlet.

Bình hút ẩm.

Tốc kế.

Erlen nút nhám.

Pipet 1ml, 5ml, 10ml.

Microburet.

Micro pipet. Ống đong 100ml, 250ml.

Becher 100ml, 250ml, 500ml.

Bình định mức 100ml, 250ml.

Bóp cao su, đũa thủy tinh, ống nhỏ giọt. ➢ Nhiệt kế 0-100 oC. 20

➢ Chén nung.

➢ Ống nghiệm.

Hóa chất: - Cồn.

- Metanol.

- Nước cất.

- Quercetin - AlCl3 - NaOH 3. Phương pháp xử lý kết quả.

NaNO2 DPPH Vitamin C ABTS K2S2 O8

FF IC IA L

-

D

ẠY

KÈ

M

Q

U

Y

N

H

Ơ

N

O

Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên từ 2 đến 3 lần lặp lại. Kết quả được tính toán bằng phần mềm Excel và phần mềm R. Kết quả phân tích ANOVA với độ tin cậy 95% và được trình bày dưới dạng Mean ± SD.

CHƯƠNG 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

21

Mỗi thí nghiệm có độ lặp lại là 3 lần để đảm bảo độ chính xác của thí nghiệm.

3.1.

Thí nghiệm 1: Khảo sát nhiệt độ sấy nguyên liệu cho hàm lượng flavonoid là cao nhất

FF IC IA L

➢ Mục đích:

Khảo sát sự thay đổi của hàm lượng flavonoid theo từng nhiệt độ sấy nguyên liệu, chọn nhiệt độ sấy thích hợp cho hàm lượng flavonoid là cao nhất. ➢ Thông số cố định:

Khối lượng nguyên liệu đem sấy: 360g/mẻ.

-

Hàm ẩm của nguyên liệu sau khi sấy: 12%.

-

Số khay đựng mẫu mỗi lần sấy: 3 khay.

-

Khối lượng trên mỗi khay: 120g/khay.

-

15 phút đổi thứ tự vị trí các khay 1 lần.

H

Ơ

N

O

-

N

➢ Thông số thay đổi: các mốc nhiệt độ sấy nguyên liệu lần lượt là 40 oC, 50o C, 60 oC, 70 oC, 80 oC.

Q

U

Y

Sau khi hoàn tất quá trình sấy, tiến hành trích ly xác định hàm lượng flavonoid trong mẫu ở các nhiệt độ khảo sát để chọn nhiệt độ sấy phù hợp theo các thông số cố định sau:

M

-

ẠY

KÈ

-

D

3.2.

Khối lượng nguyên liệu của từng nhiệt độ sấy: 5g.

Tỉ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:30 (w/v)

-

Loại dung môi trích ly: methanol

-

Thời gian trích: 1 giờ.

Hàm mục tiêu: Hàm lượng flavonoid tổng.

Thí nghiệm 2: Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu:dung môi cho hàm lượng flavonoid cao nhất ➢ Mục đích:

22

Khảo sát sự thay đổi của hàm lượng flavonoid theo từng tỉ lệ nguyên liệu:dung môi, chọn ra tỉ lệ nguyên liệu:dung môi thích hợp cho hàm lượng flavonoid là cao nhất.

-

Khối lượng nguyên liệu: 5g.

-

Loại dung môi: methanol 70 o

-

Thời gian trích ly: 1 giờ.

FF IC IA L

➢ Thông số cố định:

➢ Thông số thay đổi:

Tỉ lệ nguyên liệu : dung môi: 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60 (w/v).

O

Hàm mục tiêu: Hàm lượng flavonoid tổng.

N

3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng trích ly flavonoid từ lá sen bằng dung môi nước

Q

U

Y

N

H

Ơ

➢ Mục đích: - Khảo sát hàm lượng flavonoid theo dung môi trích ly là nước. ➢ Thông số cố định: - Khối lượng nguyên liệu: 5g.

- Loại dung môi: nước.

- Tỉ lệ nguyên liệu:dung môi: kết quả phù hợp từ thí nghiệm khảo sát tỉ lệ nguyên liệu:dung môi.

- Thời gian trích ly: 1 giờ.

Hàm mục tiêu: Hàm lượng flavonoid tổng.

D

ẠY

KÈ

M

3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát nồng độ dung môi cồn trích ly cho hàm lượng flavonoid là cao nhất ➢ Mục đích: - Khảo sát sự thay đổi hàm lượng flavonoid theo nồng độ dung môi cồn trích ly.

- Xác định nồng độ dung môi cồn trích ly thích hợp cho hàm lượng flavonoid là cao nhất. ➢ Thông số cố định: - Khối lượng nguyên liệu: 5g.

- Loại dung môi: cồn.

- Tỉ lệ nguyên liệu:dung môi: kết quả phù hợp từ thí nghiệm khảo sát tỉ lệ nguyên liệu:dung môi.

- Thời gian trích ly: 1 giờ. ➢ Thông số thay đổi: 23

- Nồng độ dung môi: 40 o, 50 o, 60 o, 70 o , 80 o .

Hàm mục tiêu: Hàm lượng flavonoid tổng.

N

H

Ơ

N

O

FF IC IA L

- [4] 3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát nồng độ dung môi metanol trích ly cho hàm lượng flavonoid là cao nhất ➢ Mục đích: - Khảo sát sự thay đổi hàm lượng flavonoid theo nồng độ dung môi methanol trích ly.

- Xác định nồng độ dung môi trích ly thích hợp cho hàm lượng flavonoid là cao nhất. ➢ Thông số cố định: Khối lượng nguyên liệu: 5g.

Loại dung môi: methanol.

Tỉ lệ nguyên liệu:dung môi: kết quả phù hợp từ thí nghiệm khảo sát tỉ lệ nguyên liệu:dung môi.

Thời gian trích ly: 1 giờ. ➢ Thông số thay đổi: Nồng độ dung môi: 40 o, 50 o, 60 o, 70 o , 80 o .

Hàm mục tiêu: Hàm lượng flavonoid tổng.

Tìm hiểu khả năng chống oxi hóa của hợp chất flanovoid.

Xác định được mức độ chống oxi hóa của hợp chất flavonoid.

Q

-

U

Y

3.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của flavonoid trích ly được Thí nghiệm được lặp lại 3 lần nhằm đảm bảo độ chính xác cao. ➢ Mục đích:

D

ẠY

KÈ

M

a. Phương pháp DPPH [13] ➢ Nguyên tắc.

Hoạt tính chống oxi hóa của flanovoid được thể hiện thông qua khả năng trung hòa các gốc tự do DPPH (1,1–diphenyl–2–picrylhydrazyl ). DPPH là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng hấp thu cực đại là 517nm. Khi có mặt chất chống oxi hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H), có màu vàng. Các chất có khả năng chống oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt.

24

FF IC IA L

Cơ chế phản ứng của gốc tự do DPPH và chất chống oxy hóa :

M

-

Q

U

Y

N

H

Ơ

N

O

Hình 2. Phản ứng giữa DPPH và chất chống oxy hóa • Các tính chất của gốc tự do DPPH. - Là gốc tự do bền do có hiệu ứng liên hợp trong phân tử.

- Độ hấp thụ cực đại tại 517 nm do gốc tự do trên Nitơ và cho màu tím trong Methanol [4].

- Có công thức cấu tạo như sau :

D

ẠY

KÈ

DPPH ˉ + AH ↔ DPPH-H + A˙

25

FF IC IA L O N Ơ

N

H

Hình 2.6: Đồ thị biểu diễn độ hấp thu tại các bước sóng của phân tử DPPH ở dạng gốc tự do (tím) và dạng bị trung hòa (vàng).

Y

Nguồn: Cowie J. M. G., Arrighi, Valeria, 2008 ➢

U

Q

M

Lấy 1.8ml dịch trích định mức lên 100ml bằng nước cất .

▪ Pha thuốc thử : Cân 0.0059 g DPPH cho vào bình định mức 100 ml có bọc giấy bạc.

Thêm cồn 96 0 vào, lắc mạnh cho tan hết, sau đó thêm cồn 96 0 vào cho đủ 100 ml, được DPPH nồng độ 0.02mM Để ổn định trong tối 30 phút, ta được dung dịch A. Đem dung dịch A đi đo ở bước sóng 517nm, ta được Ac chuẩn.

▪ Pha dung dịch chuẩn: Cân 0.1g vitamin C vào bình định mức 100ml.

Thêm nước cất vào, lắc mạnh cho tan hết, sau đó thêm nước cất vào cho đủ 100 ml. Nồng độ vitamin C lúc này là 100ppm(mg/l) Pha loãng dung dịch chuẩn thành các nồng độ 20,25,30,35,40(ppm).

KÈ

-

Bố trí thí nghiệm.

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đạt độ chính xác cao.

▪ Pha mẫu:

ẠY

-

D

-

-

26

-

đ?&#x2018;&#x2030;Ä&#x2018;đ?&#x2018;&#x153; 1000

Ă&#x2014;

đ?&#x2018;&#x2030;Ä&#x2018;đ?&#x2018;&#x161; đ?&#x2018;&#x2030;â&#x201E;&#x17D;Ăşđ?&#x2018;Ą

Ă&#x2014;

1000

174.6

Ă&#x2014;

100

đ?&#x2018;&#x161; Ă&#x2014;(100â&#x2C6;&#x2019;đ?&#x2018;&#x160;)

O

TEAC (Âľmol VitC/g CK)= đ??śđ?&#x2018;Ľ Ă&#x2014;

FF IC IA L

-

â&#x2013;Ş Ä?o dung dáť&#x2039;ch chuẊn VitC Cho 3 ml dung dáť&#x2039;ch A vĂ o 0.3 ml dung dáť&#x2039;ch chuẊn áť&#x; tᝍng Ä&#x2018;áť&#x2122; pha loĂŁng, thĂŞm vĂ o 7ml cáť&#x201C;n 96 o Ä?áť&#x192; áť&#x2022;n Ä&#x2018;áť&#x2039;nh trong bĂłng táť&#x2018;i 20 phĂşt. Ä?o Ä&#x2018;áť&#x2122; hẼp th᝼ quang (OD) áť&#x; bĆ°áť&#x203A;c sĂłng 517nm. â&#x2013;Ş Ä?o mẍu Cho 3 ml dung dich A vĂ o 0.3ml mẍu dáť&#x2039;ch trĂ­ch, thĂŞm vĂ o 7ml cáť&#x201C;n 96 o Ä?áť&#x192; tẼt cả vĂ o trong bĂłng táť&#x2018;i, 20 phĂşt. Ä?o Ä&#x2018;áť&#x2122; hẼp th᝼ quang (OD) áť&#x; bĆ°áť&#x203A;c sĂłng 517 nm. â&#x2013;Ş TĂ­nh káşżt quả cᝧa tháť­ nghiáť&#x2021;m cháť&#x2018;ng oxy hĂła

Cx : náť&#x201C;ng Ä&#x2018;áť&#x2122; TFC trong áť&#x2018;ng (ppm) VÄ&#x2018;o: tháť&#x192; tĂ­ch áť&#x2018;ng Ä&#x2018;o (ml) VÄ&#x2018;m: tháť&#x192; tĂ­ch Ä&#x2018;áť&#x2039;nh mᝊc (ml) VhĂşt: tháť&#x192; tĂ­ch dáť&#x2039;ch Ä&#x2018;áť&#x2039;nh mᝊc hĂşt vĂ o áť&#x2018;ng nghiáť&#x2021;m (ml) 1000: háť&#x2021; sáť&#x2018; qui Ä&#x2018;áť&#x2022;i W: Ä&#x2018;áť&#x2122; Ẋm mẍu (%) m: kháť&#x2018;i lưᝣng mẍu ban Ä&#x2018;ầu (g) 176.4: kháť&#x2018;i lưᝣng mol cᝧa VitC (g/ mol) Khả nÄ&#x192;ng ᝊc cháşż gáť&#x2018;c táťą do Ä&#x2018;ưᝣc Ä&#x2018;ĂĄnh giĂĄ báşąng phĆ°ĆĄng phĂĄp gáť&#x2018;c táťą do báť n DPPH. Káşżt quả Ä&#x2018;o OD Ä&#x2018;áť&#x2018;i váť&#x203A;i vitamin C Vitamin C Ä&#x2018;ưᝣc Ä&#x2018;o 3 lần vĂ lẼy giĂĄ tráť&#x2039; trung bĂŹnh.

Bảng 3.3: Náť&#x201C;ng Ä&#x2018;áť&#x2122; vĂ káşżt quả Ä&#x2018;o OD cᝧa vitamin C Náť&#x201C;ngÄ&#x2018;áť&#x2122; vitamin C (ppm) A (OD Ä&#x2018;o áť&#x; 517 nm) 20 25 30 35 40

D

áş Y

KĂ&#x2C6;

M

Q

U

Y

N

H

Ć

N

Trong Ä&#x2018;Ăł:

(2)

Káşżt quả Ä&#x2018;o OD Ä&#x2018;áť&#x2018;i váť&#x203A;i dáť&#x2039;ch trĂ­ch lĂĄ Sen Dáť&#x2039;ch trĂ­ch mẍu Sen Ä&#x2018;ưᝣc Ä&#x2018;o 3 lần vĂ lẼy giĂĄ tráť&#x2039; trung bĂŹnh.

27

FF IC IA L

Bảng 3.4: Nồng độ và kết quả đo OD của dịch trích lá Sen Lần A (OD đo ở 517 nm) 1 2 3 Phương pháp TEAC

3.6. ➢

Nguyên tắc:

Ơ

Y

N

H

-

N

O

Cation ABTS+[2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)(ABTS)] là một gốc tự do bền. Đây là một chất phát quang màu xanh, được đặc trưng ở độ hấp thu 734 nm. Khi cho chất chống oxi hóa vào dung dịch chứa ABTS+, các chất chống oxi hóa sẽ khử ion này thành ABTS. Đo độ giảm độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 734nm để xác định hoạt tính của chất chống oxi hóa trong sự so sánh với chất chuẩn Trolox[6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid] Công thức cấu tạo của ABTS:

➢ -

M

Q

U

• Công thức hóa học: C 18 H 18 N 4 O 6 S 4 Trong phản ứng này, màu xanh ABTS cation triệt để được chuyển đổi trở lại hình thức trung tính không màu của nó.

D

ẠY

KÈ

Bố trí thí nghiệm:[10] ABTS (CTPT: C18 H24 N6O6S4 , KLPT: 548.68 g) được pha trong nước cất đến nồng độ 7mM (dung dịch A): cân 250 mg pha thành 65,1 ml.

- K2S2O8, pha trong nước cất đến 2,45 mM (dung dịch B): cân 0,82g pha thành 1 lít.

- Gốc tự do cation ABTS+ được tạo ra bằng phản ứng giữa dung dịch A và dung dịch B theo tỉ lệ 1:1 về thể tích, phản ứng diễn ra trong bóng tối từ 12 - 16 giờ ở nhiệt độ phòng (dung dịch stock).

- Pha loãng dung dịch stock bằng nước cất để đạt độ hấp thu 0,7 ± 0,02A ở 734 nm (dung dịch C). Dung dịch C được chuẩn bị mới cho từng phép thử.

• Pha dung dịch chuẩn: - Cân 0.1g vitamin C vào bình định mức 100ml.

28

Thêm nước cất vào, lắc mạnh cho tan hết, sau đó thêm nước cất vào cho đủ 100 ml. Nồng độ vitamin C lúc này là 100ppm(mg/l) - Pha loãng dung dịch chuẩn thành các nồng độ 50,60,70,80,90(ppm).

• Đo dung dịch chuẩn VitC: - Cho 3 ml dung dịch C vào 0.3 ml dung dịch chuẩn ở từng độ pha loãng, thêm vào 7ml cồn 96 o - Lắc ống nghiệm nhẹ, đều.

- Đo độ hấp thụ quang (OD) ở bước sóng 734nm.

• Đo mẫu: - Cho 3 ml dung dich C vào 0.04ml mẫu dịch trích, thêm vào 7ml cồn 96 o - Lắc ống nghiệm nhẹ, đều.

- Đo độ hấp thụ quang (OD) ở bước sóng 734 nm. ➢ Tính kết quả:[7] mg TEAC/g= Quy trình tiến hành nghiên cứu

Ơ

3.7.

N

O

FF IC IA L

-

N

H

a. Sơ đồ quy trình xử lý nguyên liệu

Y

Lá sen tươi

Rửa sạch Để ráo

Sấy khô đến độ ẩm 10%

D

ẠY

KÈ

M

Q

U

Lựa chọn

Xay (500µm)

Bảo quản 29

Khảo sát nhiệt độ sấy: 40, 50, 60, 70, 80 oC

D

ẠY

KÈ

M

Q

U

Y

N

H

Ơ

N

O

FF IC IA L

Thuyết minh quy trình + Lá sen tươi: Lá sen được hái trực tiếp ở hồ sen trên đại lộ Võ Văn Kiệt-Q.6. Khi hái chọn những lá có màu đạt chuẩn. + Lựa chọn: Lá sen khi hái phải được lựa chọn, chỉ chọn những lá tươi, nguyên, không bị dập nát, không bị hư, đều màu. Chọn lá đều màu nhằm cố định ngày tuổi của lá sen. + Rửa sạch: Lá sen sau khi hái về được mang đi rửa sạch bằng nước thường sau đó tráng lại bằng nước cất để loại bỏ bùn đất và các tạp chất bám trên lá sen cũng như những loại vi sinh vật có trên nguyên liệu. + Để ráo: để nguyên liệu ra sàng và để ráo, nhằm mục đích loại bỏ bớt nước trên bề mặt nguyên liệu tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sấy. + Sấy khô đến độ ẩm 10%: làm giảm hàm lượng ẩm có trong lá sen nhằm đảm bảo điều kiện thuận lợi cho sự bảo quản nguyên liệu trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài, hạn chế sự phát triển của nấm mốc, cũng như giúp cho quá trình trích ly và khảo sát đạt hiệu suất cao hơn. + Xay mẫu thành bột mịn: Lá sen sau khi sấy khô được đem đi xay mịn bằng máy xay sinh tố để chuẩn bị cho quá trình trích ly, giúp quá trình trích ly diễn ra một cách thuận lợi hơn. Kích thước của hạt bột là 0.5mm( được kiểm tra qua dụng cụ rây bột) + Bảo quản: Nguyên liệu sau khi xay được bảo quản trong túi PE đã được hút chân không và ghép mí chặt chẽ. Nguyên liệu được bảo quản trong túi PE nhằm mục đích tránh bị ẩm trong quá trình bảo quản.

30

b. Sơ đồ quy trình trích ly Mẫu đã xử lý

FF IC IA L

Dung môi trích ly: nước, cồn, methanol ở nồng độ 40 o,50 o,60 o,70 o,80o.

Trích ly

Dung môi

Tỉ lệ nguyên liệu:dung môi=1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60

Lọc Cô quay

H

Ơ

Dịch trích

N

O

Hàm lượng polyphenol

N

Thử hoạt tính chống oxy hóa

Phương pháp DPPH Phương pháp TEAC

KÈ

M

Q

U

Y

Thuyết minh quy trình + Chuẩn bị mẫu và lắp hệ thống soxhlet: Lá sen khô đã được xay mịn ở dạng bột và bảo quản trong túi PE. Cân 5g mẫu đã nghiền nhỏ, gói vào giấy lọc và cho vào tháp trích ly của máy Soxhlet.

Lắp bình cầu đã sấy khô vào máy. Qua cổ ống sinh hàn rót dung môi vào bình cầu. Lượng dung môi rót vào khoảng 2/3 thể tích bình cầu. Cho nước chảy liên tục vào ống làm lạnh.

D

ẠY

+ Trích ly: Cho mẫu nguyên liệu đã được gói lại bằng giấy lọc vào ống chứa nguyên liệu của bộ shoxlet, thoa vaselin vào những khớp nối của của bộ shoxlet , lắp thiết bị vào, cho dung môi vào thiết bị, dùng bông không thấm bịt kín đầu thiết bị lại, bật công tắc và tiến hành trích ly. Đun từ từ dung môi trong bình, dung môi sôi, bay hơi gặp lạnh, ngưng tụ ở tháp trích ly, trong thời gian này, dung môi sẽ trích ly flavonoid, đến khi dung môi trong tháp trích ly vượt quá đầu ống xiphông sẽ tràn về bình cầu kéo theo là dịch trích .Trong quá trình trích ly cần phải kiểm tra xem nguồn nước lạnh có chảy liên tục hay không.

31

O

3.8.

Phương pháp phân tích a. Xác định độ ẩm: ➢ Phương pháp sấy đến khối lượng không đổi:

FF IC IA L

+ Dịch sau khi trích ly được đem đi lọc để loại bỏ các tạp chất, những cặn của bã lọc bị rơi rớt, ngoài ra còn lọc được vaselin ngấm vào dịch trong quá trình trích ly. + Dịch trích: Dịch trích sau khi thu nhận được cho vào bekcher và bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh, nhiệt độ khoảng 100C để tránh mẫu bị oxi hóa cũng như bị các tác nhân bên ngoài gây hư hỏng mẫu trong quá trình bảo quản. + Thử hoạt tính: Dùng dịch trích flavonoid sau khi có được đem đi thử hoạt tính chống oxy hóa của nó bằng những phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa như DPPH, TEAC…

U

- Tính kết quả:

Y

N

H

Ơ

N

Nguyên tắc: Dùng sức nóng làm bay hết hơi nước có trong nguyên liệu. Cân trọng lượng trước và sau khi sấy đến khối lượng không đổi. Từ đó tính ra phần trăm nước có trong nguyên liệu.

- Tiến hành:Tiến hành cân cốc sấy, đem sấy khô ở nhiệ độ 100 – 150 0C đến khối lượng không đổi. Để nguội trong bình hút ẩm. Cân chính xác mẫu, mỗi mẫu có khối lượng 5g cho vào cốc sấy trên. Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở 50 -700C trong vòng 2 giờ.Sau đó nâng nhiệt độ lên 100 – 150 0 C, sấy khô liên tục trong 3 giờ.Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, đem cân ghi kết quả lần 1. Cho lại tủ sấy 100 – 150 0C trong 30 phút, lặp lại như trên đến khối lượng không đổi.

Q

Độ ẩm theo % (X) tính bằng công thức:

M

(G1 – G2) * 100X = G1 – G

KÈ

Trong đó:

+ X: độ ẩm của thực phẩm (%). + G: khối lượng cốc sấy (g).

ẠY

+ G1: khối lượng cốc sấy và mẫu thử trước khi sấy (g).

D

+ G2: khối lượng cốc sấy và mẫu thử sau khi sấy (g).

3.9.

Định tính flavonoid: [5] Trích ly mẫu bằng bộ chiết soxlet với dung môi thu được dịch trích.

-

Phản ứng với AlCl3 10%: Cho màu vàng ánh.

32

-

Phản ứng với NaNOH 1M: Cho màu đỏ.

-

Phản ứng với chì: Tạo tủa trắng đục.

-

Phản ứng với Fe3+: Tạo màu xanh đen.

FF IC IA L

3.10. Định lượng flavonoid: Dựng đường chuẩn quercetin:

O

Ống

0

Quercetin chuẩn

0

0.5

(ml)

4

1

1.5

2

N 6.7

D

ẠY

KÈ

7.2

5.7

5.2

0.5

0.3

Q

NaNO2 5%(ml)

M

3

2

U

NaOH 1M(ml)

Y

AlCl3 trong EtOH

Nước cất(ml)

2

H

100ppm(ml)

96 0

1

N

-

Nguyên tắc: Hàm lượng flavonoid tổng số được xác định thông qua phản ứng tạo màu với ion Al3+ cho phức có màu vàng. Đo độ hấp thụ của phức thu được ở bước sóng 415 nm. Dựa vào đường chuẩn quecertin tính ra hàm lượng flavonoid tổng số có trong mẫu phân tích và được tính bằng số milligam quercetin/g vật chất khô.

Tiến hành:

Ơ

-

33

6.2

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1. Độ ẩm nguyên liệu.

FF IC IA L

Quá trình sấy là quá trình tách ẩm từ các vật cần sấy, điều kiện cần thiết để sấy khô là phải cấp nhiệt làm bay hơi ẩm trong vật sấy, hoặc dùng không khí thổi qua mang hơi

nước ra ngoài không gian sấy.Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng máy sấy ẩm hồng

N

O

ngoại để xác định độ ẩm của nguyên liệu.

Chúng tôi tiến hành làm nhỏ mẫu lá sen sau khi đã được làm sạch, cân khoảng 2g nguyên liệu cho vào thiết bị sấy ẩm hồng ngoại, sau khi có kết quả ghi lại và được thực hiện lặp lại 3 lần để cho kết quả chính xác nhất. Tiến hành xử lý số liệu được kết quả trung bình và độ lệch chuẩn trên đến khối lượng không đổi.Việc xác định độ ẩm của mẫu lá sen nhằm mục đích quy đổi kết quả về vật chất khô. Vì thế cần phải xác định chính xác yếu tố này.

Độ ẩm(%)

75.56

Mẫu 2

H

Mẫu 1

N

Mẫu

Ơ

Kết quả xác định độ ẩm của nguyên liệu được thể hiện qua bảng sau:

75.72

Mẫu 3 75.89

Y

Như vậy độ ẩm trung bình của nguyên liệu là: 75.72 0.16

U

Hiện nay vẫn chưa có một tài liệu nghiên cứu cụ thể nào nói về độ ẩm của lá sen; tuy

Q

nhiên, độ ẩm kiểm tra được của mẫu là 75.72% kết quả này cũng tương đối phù hợp với

M

đối tượng mẫu lá thực vật, là những mẫu có độ ẩm tương đối cao. So sánh với đa số các mẫu thực vật thường dùng làm nguyên liệu trích ly polyphenol thì độ ẩm ban đầu của

KÈ

bộ phận lá của chúng cũng dao động khá lớn trong phạm vi từ 76 – 93%, ví dụ độ ẩm của mẫu lá Allium cepa L. là 91.5%, lá Lactuca sativa L. là 93.3%, lá Persicaria minor

ẠY

là 76.8% (Shaida và cộng sự, 2011). Từ kết quả xác định độ ẩm của nguyên liệu lá đã

D

nêu trên, chúng tôi nhận thấy độ ẩm nguyên liệu là khá cao.

Vì vậy, để duy trì tính ổn định của flavonoid trong nguyên liệu và tạo thuận lợi cho quá trình vận chuyển, bảo quản và tăng hiệu quả trích ly thì chúng tôi đã thực hiện quá trình sấy nguyên liệu trước khi sử dụng cho quá trình khảo sát.

34

4.2. Kết quả khảo sát quá trình trích ly flavonoid từ lá sen 4.2.1 Kết quả đường chuẩn quercetin

FF IC IA L

Đường chuẩn quercetin là đường chuẩn nhằm xác định hàm lượng flavonoid tổng số( TFC). Hàm lượng tổng flavonoid được xác định thông qua phương pháp tạo màu với AlCl3 trong môi trường kiềm-trắc quang. Được tiến hành hút quercetin vào 5 ống

nghiệm với thể tích lần lượt là 0, 0.5, 1, 1.5, 2 mL, sau đó, thêm vào 0,3 mL dung dịch NaNO2 5%. Sau 5 phút thêm tiếp 0,3 mL dung dịch AlCl3 10%, sau 5 phút cho vào 2 mL dung dịch NaOH 1M và sau 20 phút định mức đến thể tích 10 mL bằng nước cất.

O

Độ hấp thụ của dung dịch phản ứng được đo ở bước sóng 415 nm. Quercetin được sử dụng làm chất chuẩn tham khảo và kết quả được quy tương đương theo số milligam

Ơ

N

quercetin /1 gam mẫu nguyên liệu(16).

5

10

15

20

25

0

0.065

0.122

0.185

0.244

0.327

Q

U

Y

Độ hấp thu A

0

N

Nồng độ quercetin (ppm)

H

Bảng 1. Kết quả đo độ hấp thu của dịch chuẩn quercetin

D

ẠY

KÈ

M

Phương trình đường chuẩn quercetin: y=0.012x-0.002, với hệ số R2 =0.996

35

Am

FF IC IA L

y = 0.012x - 0.002 R² = 0.9968

O

C (ppm)

HĂŹnh1. Ä?Ć°áť?ng chuẊn quercetin xĂĄc Ä&#x2018;áť&#x2039;nh hĂ m lưᝣng TFC.

N

Tᝍ Ä&#x2018;áť&#x201C; tháť&#x2039; biáť&#x192;u diáť&#x2026;n sáťą tĆ°ĆĄng quan giᝯa náť&#x201C;ng Ä&#x2018;áť&#x2122; quercetin chuẊn vĂ Ä&#x2018;áť&#x2122; hẼp thu, cho thẼy

Ć

khoảng náť&#x201C;ng Ä&#x2018;áť&#x2122; tᝍ 0 Ä&#x2018;áşżn 25ppm cĂł sáťą tuyáşżn tĂ­nh giᝯa náť&#x201C;ng Ä&#x2018;áť&#x2122; vĂ Ä&#x2018;áť&#x2122; hẼp thu. Do Ä&#x2018;Ăł, cĂł tháť&#x192;

H

dĂšng phĆ°ĆĄng trĂŹnh: y=0.012x-0.002 Ä&#x2018;áť&#x192; xĂĄc Ä&#x2018;áť&#x2039;nh hĂ m lưᝣng TFC trong mẍu phân tĂ­ch.

N

HĂ m lưᝣng flavonoid Ä&#x2018;ưᝣc tĂ­nh báşąng cĂ´ng thᝊc dĆ°áť&#x203A;i Ä&#x2018;ây:

đ??śđ?&#x2018;Ľ â&#x2C6;&#x2014;đ??žâ&#x2C6;&#x2014;đ?&#x2018;&#x2030;đ?&#x2018;Ąâ&#x201E;&#x17D;đ?&#x2018;˘

Y U

F%=

đ?&#x2018;&#x161;đ?&#x2018;&#x161;ẍđ?&#x2018;˘

Q

Váť&#x203A;i: F% lĂ hĂ m lưᝣng flavonoid cĂł trong mẍu lĂĄ sen.

M

Cx lĂ náť&#x201C;ng Ä&#x2018;áť&#x2122; flavonoid cĂł trong dung dáť&#x2039;ch.

KĂ&#x2C6;

K lĂ háť&#x2021; sáť&#x2018; pha loĂŁng.

Vthu lĂ tháť&#x192; tĂ­ch dáť&#x2039;ch trĂ­ch thu Ä&#x2018;ưᝣc.

D

áş Y

mmẍu lĂ kháť&#x2018;i lưᝣng mẍu Ä&#x2018;em Ä&#x2018;i trĂ­ch ly

36

(1)

4.2.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ sấy nguyên liệu cho hàm lượng flavonoid cao nhất Bảng 4.2.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ sấy nguyên liệu cho hàm lượng flavonoid cao nhất

Am

40

50

60

0.136±0.002

0.149±0.002

92.13±1.39

99.9±2.4

FF IC IA L

Nhiệt độ sấy (oC) 70

80

0.147±0.004

0.175±0.002

0.144±0.003

99.234±3.05

117.66±1.68

97.46±2.035

Hàm lượng flavonoid

N

O

(mg/g)

Ơ

Qua kết quả xử lý được ở bảng , chúng tôi nhận thấy rằng: hàm lượng flavonoid của mẫu lá

H

sen tăng ở nhiệt độ sấy từ 40-70 oC, cao nhất là chế độ sấy 70 oC với hàm lượng là

N

117.66±1.68mg/g , nhưng khi tiếp tục tăng nhiệt độ sấy lên mức 80 oC thì hàm lượng flavonoid giảm theo độ tăng nhiệt độ, từ 117.66±1.68mg/g giảm còn 97.46±2.035mg/g . Kết quả số liệu

Y

khi được chạy ANOVA cho thấy mức nhiệt độ 70oC là cho hàm lượng cao nhất và có ý nghĩa

Q

U

thống kê.

120

M

hàm lượng flavonoid

140

100

D

ẠY

KÈ

80 60 40 20 0

40

50

60

70

80

nhiệt độ

Hình 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm lượng flavonoid

37

Quá trình sấy nguyên liệu nhằm đảm bảo điều kiện thuận lợi cho sự bảo quản nguyên liệu trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài. Nguyên liệu lá tươi sau khi thu hái được tiến hành sấy ở các mốc chế độ khác nhau. Các khoảng nhiệt độ sấy được lựa chọn để đảm bảo sự hao hụt

FF IC IA L

các hợp chất flavonoid là thấp nhất. Trong bài nghiên cứu này, chúng tôi chọn các khoảng nhiệt độ sấy nguyên liệu từ mức 40-80oC dựa trên nghiên cứu của Sriyana và cộng sự (2011), khi nghiên cứu hàm lượng polyphenol trên nguyên liệu lá Orthosiphon staminiues Benth.

Trên cơ sở lý thuyết, độ ẩm nguyên liệu được quyết định bởi nước tự do và nước liên kết.

Nguyên liệu có lượng nước liên kết càng nhiều thì thời gian sấy để đạt độ ẩm nhất định càng

O

dài và ngược lại. Sự thay đổi về hàm lượng flavonoid của nguyên liệu được giải thích là do

động lực của quá trình trích ly flavonoid khác nhau. Nguyên liệu tươi có hàm ẩm cao, do đó

N

sự chênh lệch về nồng độ (gradient nồng độ) không lớn bằng mẫu nguyên liệu đã tách ẩm.

Ơ

Hơn nữa, quá trình sấy góp phần cải thiện hiệu quả trích ly các hợp chất flavonoid do tính

H

thấm của thành tế bào và màng tế bào sẽ được gia tăng và tính chọn lọc qua màng sẽ bị giảm khi thành tế bào bị biến tính bởi nhiệt trong quá trình sấy (José, 2003). Điều này cũng phù

N

hợp với nghiên cứu của các tác giả Li và cộng sự (2006) trên một số đối tượng nguyên liệu

Y

vỏ trái cây thuộc họ citrus, nhóm tác giả này đã kết luận khi độ ẩm của nguyên liệu càng thấp

U

thì hiệu quả trích ly flavonoid càng cao. Bên cạnh đó, không thể không nhắc đến vai trò phân

Q

hủy các hợp chất flavonoid của loại enzyme polyphenol oxidase có mặt trong mẫu nguyên liệu tươi mà chúng tôi đang khảo sát. Sự hiện diện của enzyme này và sự xay nghiền nguyên

M

liệu tươi trước khi trích ly đã tạo điều kiện cho hoạt động oxy hóa một phần các flavonoid.

KÈ

Các mẫu đã trải qua quá trình sấy vừa tăng động lực trích ly đồng thời cũng ức chế được sự hoạt động của enzyme polyphenol oxidase trước khi nghiền nhỏ nguyên liệu. Việc gia nhiệt

ẠY

ở nhiệt độ càng cao thì sự phân hủy và oxy hóa các hợp chất flavonoid càng nhiều, tuy rằng việc tăng nhiệt độ có thể rút ngắn thời gian sấy nhưng độ giảm thời gian này lại không tương

D

xứng với độ giảm hàm lượng và hoạt tính chất trích ly. Điều này cũng được đề cập đến trong nghiên cứu của Nasir và cộng sự (2008) khi các tác giả này nghiên cứu quá trình sấy lá olive.

Họ nhận thấy, nếu nhiệt độ sấy lớn hơn 70 oC thì hàm lượng và hoạt tính của oleurpein và một số phenolic khác bắt đầu giảm mạnh làm cho quá trình oxy hóa flavonoid diễn ra mạnh mẽ 38

dẫn đến giảm hàm lượng lẫn hoạt tính flavonoid có trong nguyên liệu lá trước khi thực hiện quá trình trích ly.

Nguyên liệu sau khi sấy ở từng chế độ đến độ ẩm đạt yêu cầu sẽ tiếp tục được xay nghiền và

FF IC IA L

ray qua màng ray có kích thước 0.5mm, thu nhận bột khô có kích thước lọt lỗ sàng dao động từ 250 – 500µm. Kích thước này được chúng tôi lựa chọn dựa theo nghiên cứu của các tác giả: Qu và cộng sự (2010), Kossah và cộng sự (2010), Dianlov và cộng sự (2011). Qu và

cộng sự (2010) đã thực hiện đề tài nghiên cứu mô hình tách chiết các hợp chất chống oxy hóa trên quả lựu với kích thước nguyên liệu cho quá trình khảo sát thay đổi 0.2, 0.5 đến 3.5 mm

O

với thời gian trích ly là 2 đến 90 phút.

Kết quả cho thấy kích thước hạt càng nhỏ thì thời gian trích ly càng ngắn và ngược lại. Tóm

N

lại, mặc dù điều kiện trích ly của mỗi tác giả là khác nhau nhưng việc lựa chọn kích thước

Ơ

nguyên liệu trong nghiên cứu của các tác giả này đều tuân theo một nguyên tắc cơ bản là:

H

kích thước hạt càng nhỏ thì quá trình trích ly các chất ra khỏi nguyên liệu càng ngắn do diện

Y

gian và nâng cao hiệu quả trích ly.

N

tích bề mặt tiếp xúc của nguyên liệu với dung môi tăng lên, nhờ đó ta có thể rút ngắn thời

U

Theo Zhenbin Wang et al, 2011 Zhongli Pan, Haile Ma and Griffiths G. Atungulu, (The Open Food Science Journal, 2011, 5, 17-25) thì kích thước hạt nhỏ làm giảm khoảng cách

Q

khuếch tán của chất trích vào trong dung môi và tăng gradient nồng độ; từ đó giúp cho khoảng cách tiếp cận giữa dung môi và chất tan ngắn hơn, dẫn tới thời gian trích ly ngắn và

M

cho hiệu quả cao. Nhưng kích thước xay nghiền nhỏ hơn nữa (<250µm) có thể không gia

KÈ

tăng hiệu suất trích ly một cách có ý nghĩa mà lại giảm hiệu suất trích ly. Bởi lẽ, nguyên liệu có kích thước quá nhỏ thì tỷ trọng của nó sẽ nhỏ hơn tỷ trọng của dung môi trích ly và làm nguyên liệu nổi lên trên bề mặt và dính trên thiết bị trích ly khi khuấy từ và gây thất

ẠY

thoát mẫu. Hơn nữa, nguyên liệu quá nhỏ sẽ làm bít lỗ giấy lọc, gây khó khăn cho quá trình lọc và ảnh hưởng đến việc chuyển toàn bộ polyphenol đã trích ly được vào dịch chiết.

D

Quá trình sấy góp phần cải thiện hiệu quả trích ly các hợp chất polyphenol do tính thấm của thành tế bào và màng tế bào sẽ được gia tăng và tính chọn lọc qua màng sẽ bị giảm khi thành tế bào bị biến tính bởi nhiệt trong quá trình sấy (José, 2003).

39

Tóm lại, từ các kết quả thu được qua khảo sát này và qua các phân tích đã nêu trên, chúng tôi xác định chế độ sấy ở nhiệt độ 700C là phù hợp.

4.2.3. Kết quả khảo sát tỉ lệ nguyên liệu:dung môi để cho hàm lượng flavonoid cao nhất.

ly flanovoid.

Tỉ lệ nguyên

1:20

liệu:dung môi

1:40

flavonoid(%)

91.464±1.39

0.157±0.003

142.76±2.52 120.99±3.35 114.33±1.39 106.116±1.77

H

160

N

140 120

Y

100

U

80

40 20

Q

60

M

hàm lượng flavonoid mg/g

0.17±0.002

N

Hàm lượng

0.18±0.005

1:60

O

0.135±0.002 0.185±0.004

1:50

Ơ

Am

1:30

FF IC IA L

Bảng 4.2.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi đến quá trình trích

KÈ

0

1:20

1:30

1:40

1:50

2:00

tỉ lệ nguyên liệu:dung môi

ẠY

Hình 3. Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu:dung môi đến hàm lượng flavonoid

Theo tác giả Hamdam (2008) thì tỉ lệ nguyên liệu : dung môi có ảnh hưởng đáng kể đến hằng

D

số cân bằng và đặc trưng cho mối quan hệ giữa hàm lượng chất trích ly được với dung môi sử dụng vì nó gia tăng theo cấp số mũ và sau đó ổn định dần để đạt hiệu quả trích ly cực đại.

Vì thế, ở khảo sát này, chúng ta cần chọn tỉ lệ nguyên liệu:dung môi trích ly sao cho lượng dung môi sử dụng để đạt hiệu quả trích ly cao mà vẫn đạt được những lợi ích về kinh tế cho

40

thí nghiệm. Trong khảo sát này tiến hành thay đổi tỉ lệ nguyên liệu:dung môi với các tỉ lệ: 1:20 (w/v), 1:30 (w/v), 1:40 (w/v), 1:50 (w/v) và 1:60(w/v).

Qua bảng có thể nhận thấy, khi tăng lượng dung môi sử dụng từ tỉ lệ 1:20 lên đến tỉ lệ 1:30

FF IC IA L

thì hàm lượng flavonoid trích ly được cũng tăng theo. Tuy nhiên, khi chúng tôi tiếp tục tăng lượng dung môi sử dụng ở tỉ lệ 1:40, 1:50 và 1:60 thì hàm lượng của flavonoid trích ly giảm so với mốc tỉ lệ 1:30 trước đó.

Khi flavonoid được trích ly với một tỉ lệ dung môi lớn thì khả năng lôi kéo của các cấu tử này

là rất cao. Tuy nhiên, việc tăng tỉ lệ dung môi bổ sung có thể không phải là một giải pháp hữu

ích để cải thiện hiệu suất trích ly flavonoid bởi lẽ các hoạt chất này sẽ không tiếp tục tăng khi

quá trình trích ly đạt trạng thái cân bằng (Herodež và cộng sự, 2003). Hơn thế nữa, việc tăng

O

(lượng dung môi từ tỉ lệ 1:30 lên 1:40, 1:50 và 1:60) có thể cung cấp nhiều hơn lượng oxy

N

hòa tan lớn gây ra quá trình oxy hóa flavonoid làm giảm đi phần nào hàm lượng flavonoid (Kossah, 2010). Chính vì thế mà khi tăng tỉ lệ dung môi lên 1:40, 1:50 và 1:60 cho kết quả

Ơ

hàm lượng flavonoid thấp hơn. Ngược lại, lượng dung môi ít (tại các tỉ lệ 1:20) dẫn tới trạng

H

thái cân bằng được thiết lập trong khi các hợp chất cần trích vẫn còn trong nguyên liệu và

N

không đủ lượng dung môi để chuyển hoàn toàn các flavonoid đã được trích ly đi qua lớp bã bột nguyên liệu và lớp giấy lọc dẫn đến làm thất thoát lượng flavonoid đã được trích ly ra.

Y

Frank và cộng sự, (1999) phát biểu rằng: độ hòa tan của một chất rắn chịu ảnh hưởng bởi sự

U

thay đổi hệ số hoạt động với các điều kiện nhiệt độ và thành phần dung dịch khác nhau. Sự

Q

tương tác giữa các hợp chất với dung môi có thể làm thay đổi hệ số hoạt động và vì vậy cũng thay đổi độ hòa tan của các hợp chất trong dung môi. Nhìn chung, tác dụng chính của khảo

M

sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi là thay đổi độ hòa tan và hằng số cân bằng, từ đó làm tăng hàm lượng flavonoid trích ly (Cacace và Mazza, 2003). Với những cơ sở phân tích ở trên

KÈ

cùng với kết quả ở bảng, chúng tôi có thể khẳng định hàm lượng flavonoid trích ly gia tăng khi ta tăng tỉ lệ dung môi nhưng sự tăng này có thể không theo tỉ lệ thuận.

ẠY

Từ đó chúng tôi kết luận tỉ lệ nguyên liệu:dung môi để hàm lượng flavonoid cao nhất là 1:30.

D

4.2.4. Kết quả các khảo sát hàm lượng flavonoid tổng số(TFC) trong dung môi nước Kết quả của thí nghiệm này là kết quả sau khi trích ly flavonoid trong lá sen bằng dung môi nước và đem dịch trích ly được đo hàm lượng flavonoid có trong mẫu. Thí nghiệm được tiến hành như sau: Cân 5g mẫu đã nghiền nhỏ, cho vào ống giấy xốp hay gói bằng giấy lọc cho vào tháp trích ly của máy Soxhlet. Sau đó cho dung môi là nước cất vào với tỷ lệ mẫu: nước 41

FF IC IA L

lĂ 1:30, tiáşżn hĂ nh trĂ­ch ly mẍu nguyĂŞn liáť&#x2021;u trong háť&#x2021; tháť&#x2018;ng soxhlet trong 30 phĂşt vĂ thu Ä&#x2018;ưᝣc 120ml dáť&#x2039;ch trĂ­ch. ThĂ­ nghiáť&#x2021;m lạp lấi 3 lần Ä&#x2018;áť&#x192; Ä&#x2018;ảm bảo Ä&#x2018;áť&#x2122; chĂ­nh xĂĄc cᝧa káşżt quả thĂ­ nghiáť&#x2021;m.

Sau Ä&#x2018;Ăł dáť&#x2039;ch trĂ­ch Ä&#x2018;ưᝣc láť?c qua giẼy láť?c Ä&#x2018;áť&#x192; loấi báť? nhᝯng tấp chẼt nhĆ° cạn cᝧa bĂŁ nguyĂŞn liáť&#x2021;u báť&#x2039; rĆĄi ráť&#x203A;t trong quĂĄ trĂŹnh tháťąc hiáť&#x2021;n vĂ sau cĂšng lĂ Ä&#x2018;em Ä&#x2018;i Ä&#x2018;o hĂ m lưᝣng flavonoid báşąng phĆ°ĆĄng phĂĄp Ä&#x2018;o quang, Ä&#x2018;ưᝣc tiáşżn hĂ nh Ä&#x2018;o áť&#x; bĆ°áť&#x203A;c sĂłng 415nm, ta Ä&#x2018;ưᝣc Ä&#x2018;áť&#x2122; hẼp thu vĂ hĂ m lưᝣng cᝧa flavonoid trong nguyĂŞn liáť&#x2021;u áť&#x; bảng dĆ°áť&#x203A;i Ä&#x2018;ây: Bảng 4.2.4. Káşżt quả hĂ m lưᝣng flavonoid trong lĂĄ sen Ä&#x2018;ưᝣc trĂ­ch ly báşąng dumg mĂ´i nĆ°áť&#x203A;c.

Am

F(mg/1g VCK)

Mẍu 1

0.236

9.917

Mẍu 2

0.234

9.819

Mẍu 3

0.233

9.778

đ??šĚ&#x2026;ď&#x201A;ą SD

9.838ď&#x201A;ą 0.071

N

O

Mẍu

Q

U

Y

N

H

Ć

Tᝍ káşżt quả cᝧa bảng sau cho thẼy hĂ m lưᝣng flavonoid cᝧa mẍu nguyĂŞn liáť&#x2021;u lĂ 9.838mg/1g VCK. Ta tĂ­nh Ä&#x2018;ưᝣc phần trÄ&#x192;m flavonoid ( %F) lĂ 0.984%, theo máť&#x2122;t bĂ i tấp chĂ­ sinh háť?c cᝧa trĆ°áť?ng Ä?ấi Háť?c NĂ´ng Nghiáť&#x2021;p HĂ Náť&#x2122;i vĂ o nÄ&#x192;m 2003 thĂŹ lưᝣng flavonoid cĂł trong cây diáşżp cĂĄ Ä&#x2018;ưᝣc trĂ­ch ly báşąng dung mĂ´i nĆ°áť&#x203A;c lĂ 0.83%(17), ta cĂł tháť&#x192; thẼy hĂ m lưᝣng flavonoid Ä&#x2018;ưᝣc trĂ­ch ly trong dung mĂ´i nĆ°áť&#x203A;c cᝧa lĂĄ sen cao hĆĄn so váť&#x203A;i lĂĄ diáşżp cĂĄ( máť&#x2122;t loấi tháťąc váş­t Ä&#x2018;ĂŁ Ä&#x2018;ưᝣc tiáşżn hĂ nh thĂ­ nghiáť&#x2021;m trĂ­ch ly vĂ tháť­ hoất tĂ­nh cháť&#x2018;ng oxy hĂła cho káşżt quả táť&#x2018;t). Qua Ä&#x2018;Ăł ta cĂł tháť&#x192; káşżt luáş­n ráşąng, hĂ m lưᝣng flavonoid Ä&#x2018;ưᝣc trĂ­ch ly trong dung mĂ´i nĆ°áť&#x203A;c cĂł trong mẍu lĂĄ sen lĂ khĂĄ cao, mang Ă˝ nghÄŠa tháťąc tiáť&#x2026;n 4.2.5. Káşżt quả khảo sĂĄt hĂ m lưᝣng flavonoid trong dung mĂ´i cáť&#x201C;n

D

áş Y

KĂ&#x2C6;

M

Ä?áť&#x192; xĂĄc Ä&#x2018;áť&#x2039;nh hĂ m lưᝣng flavonoid cĂł trong mẍu khi trĂ­ch ly dung mĂ´i cáť&#x201C;n ta cĹŠng tiáşżn hĂ nh tĆ°ĆĄng táťą nhĆ° trĂ­ch ly trong dung mĂ´i nĆ°áť&#x203A;c. Tuy nhiĂŞn tháť?i gian trĂ­ch ly vĂ tháť&#x192; tĂ­ch dáť&#x2039;ch thu Ä&#x2018;ưᝣc trong thĂ­ nghiáť&#x2021;m nĂ y cĂł sáťą khĂĄc biáť&#x2021;t, c᝼ tháť&#x192; tháť?i gian trĂ­ch ly 1 giáť? 15 phĂşt vĂ tháť&#x192; tĂ­ch dáť&#x2039;ch thu lĂ 120ml. Trong thĂ­ nghiáť&#x2021;m trĂ­ch ly báşąng dung mĂ´i cáť&#x201C;n ta tiáşżn hĂ nh trĂ­ch ly váť&#x203A;i 5 náť&#x201C;ng Ä&#x2018;áť&#x2122; cáť&#x201C;n lần lưᝣt lĂ 40 0, 50 0, 60 0, 70 0, 80 0 . áť&#x17E; máť&#x2014;i náť&#x201C;ng Ä&#x2018;áť&#x2122; cáť&#x201C;n ta cĹŠng tiáşżn hĂ nh trĂ­ch ly vĂ lạp lấi 3 lần Ä&#x2018;áť&#x192; cho káşżt quả chĂ­nh xĂĄc nhẼt.

DĆ°áť&#x203A;i Ä&#x2018;ây lĂ bảng káşżt quả hĂ m lưᝣng flavonoid trong nguyĂŞn liáť&#x2021;u trĂ­ch ly báşąng dung mĂ´i cáť&#x201C;n áť&#x; 5 mᝊc náť&#x201C;ng Ä&#x2018;áť&#x2122;: Bảng 4.2.5. Káşżt quả hĂ m lưᝣng flavonoid trong lĂĄ sen Ä&#x2018;ưᝣc trĂ­ch ly báşąng cáť&#x201C;n áť&#x; cĂĄc náť&#x201C;ng Ä&#x2018;áť&#x2122; khĂĄc nhau.

42

Am

F(mg/1g VCK)

Cồn 40 0

0.1346  0.0015

91.044 1.00

Cồn 50 0

0.155 0.002

104.889 1.55

Cồn 60 0

0.176 0.001

Cồn 70 0

0.186 0.002

Cồn 80 0

0.145 0.0005

FF IC IA L

Nồng độ

108.71 0.65 112.87 1.33

O

89.56 0.311

M

Q

U

Y

N

H

Ơ

N

Từ kết quả bảng hàm lượng flavonoid ở 5 khoảng nồng độ của dung môi cồn ta thấy ở nồng độ cồn 70 0 cho ra hàm lượng flavonoid là cao nhất, cụ thể là 112.87mg/1g VCK và nồng độ cồn 80 0 lại cho kết quả hàm lượng flavonoid là thấp nhất là 89.56mg/1g VCK. Khi tăng nồng độ cồn từ 400 đến 70 0 thì hàm lượng flavonoid trích ly cũng tăng theo. Tuy nhiên, khi chúng tôi tiếp tục tăng nồng độ cồn lên 80 0 thì hàm lượng flavonoid trích ly giảm so với cồn 70 0 . Điều này có thể giải thích là vì khi nồng độ dung môi lớn thì khả năng lôi kéo của các phân tử dung môi cồn rất cao. Tuy nhiên, việc tăng nồng độ dung môi có thể không phải là một giải pháp hữu ích để cải thiện hiệu suất trích ly flavonoid bởi lẽ hợp chất flavonoid sẽ không tiếp tục tăng khi quá trình trích ly đạt trạng thái cân bằng, hay có thể nói rằng việc tăng nồng độ dung môi tới một giá trị thích hợp sẽ làm tăng hàm mục tiêu, tuy nhiên, khi tăng nồng độ vượt quá giá trị tới hạn sẽ không có lợi và điều này làm giảm giá trị của hàm mục tiêu.

KÈ

4.2.6. Kết quả khảo sát hàm lượng flavonoid trong dung môi methanol.

D

ẠY

Ở thí nghiệm này cũng được tiến hành như thí nghiệm trích ly trong dung môi cồn và nước, nhưng thời gian trích ly dài hơn so với trích ly bằng dung môi cồn; cụ thể trích ly bằng dung môi methanol trong thời gian là 1 giờ 15 phútvà lượng thể tích dịch thu được là 120ml. Thí nghiệm cũng được tiến hành với 5 mức nồng độ tương tự như dung môi cồn và cũng được lặp lại 3 lần để đảm bảo độ chính xác cao.

Dưới đây là bảng hàm lượng flavonoid có trong nguyên liệu ở 5 mức nồng độ dung môi methanol: Bảng 4.2.6. Kết quả hàm lượng flavonoid trong lá sen được trích ly bằng methanol ở các nồng độ khác nhau.

43

Am

F(mg/1g VCK)

Methanol 40 0

0.155 0.001

105.036 1.14

Methanol 50 0

0.184 0.002

124.073  1.67

Methanol 60 0

0.165 0.001

Methanol 70 0

0.166 0.001

Methanol 80 0

0.136 0.002

FF IC IA L

Nồng độ methanol

106.551 0.81 102.51 0.69 84.730  1.59

Ơ

N

O

Từ kết quả bảng trên cho thấy hàm lượng flavonoid trong mẫu lá sen khi trích ly bằng dung môi methanol cho kết quả cao nhất ở nồng độ 50 0 cho hàm lượng flavonoid là 124.073mg/1 g VCK, và thấp nhất là ở methanol 80 0 hàm lượng là 84.730mg/1g VCK. Ta cũng có thể thấy hàm lượng flavonoid tăng từ nồng độ methanol 40 0 đến 50 0 và sau đó giảm từ nồng độ 600 đến 80 0 .

Q

U

Y

N

H

Mức độ hòa tan của một chất trong các hệ dung môi khác nhau là khác nhau. Một chất có thể hòa tan rất tốt trong một loại dung môi nguyên chất, nhưng lại có thể hòa tan tốt trong hệ dung môi bậc hai của chính nó. Do đó, việc lựa chọn hệ dung môi tách chiết hợp chất có vai trò quan trọng. như chúng ta đã biết, nước là dung môi rẻ tiền, phổ biến, có khả năng hòa tan không hạn chế trong methanol. Việc sử dụng hệ dung môi methanol-nước mang lại hiệu quả tốt và trong thí nghiệm này thì tỷ lệ methanol:nước =50:50 là cao nhất.

4.2.7. Kết quả khảo sát dung môi cho hàm lượng flavonoid cao nhất

M

Bảng 4.2.7. Kết quả khảo sát dung môi cho hàm lượng flavonoid cao nhất: Nước

Cồn 70 0

Methanol 50 0

F(mg/1g VCK)

9.838 0.071

112.87 1.33

124.073  1.67

D

ẠY

KÈ

Dung môi

44

140

100 80

FF IC IA L

hàm lượng flavonoid

120

60

40 20 0 cồn 70 dung môi

methanol 50

O

nước

Ơ

N

Hình 4.2.7. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng flavonoid của các dung môi có nồng độ khác nhau

N

H

Dựa vào kết quả hình 4.2.7 cho ta thấy được, khi so sánh khả năng trích ly của 3 loại dung môi là nước, cồn và methanol thì ta thấy methanol là dung môi có khả năng trích ly cao nhất hay nói cách khác methanol là dung môi có hiệu suất trích ly cao nhất.

KÈ

M

Q

U

Y

Bằng phương pháp trích ly Soxhlet, trích kiệt được hợp chất flavonoid trong mẫu do mẫu được trích liên tục bằng dung môi tinh khiết. Dung môi trích có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả tách chiết các hợp chất flavonoid trong lá sen. Nhiều nghiên cứu trước đây đã cho thấy methanol là dung môi tốt nhất để tách chiết polyphenol và flavonoid từ lá sen. Kết quả khảo sát cho thấy methanol có hiệu suất trích ly tốt hơn cồn và nước. Điều này có thể được giải thích vì các hợp chất polyphenolic có tính phân cực cao nhờ các nhóm hydroxyl và cetone có tính ái nước nên chúng dễ dàng tan trong dung môi có tính phân cực cao. Dựa vào độ phân cực và liên kết hydro của ethanol là cơ sở giải thích cho khả năng tách chiết của dung môi methanol tốt hơn ethanol.

4.3. Kết quả đường chuẩn DPPH

D

ẠY

Bảng 4.3. Kết quả đo độ hấp thu của dung dịch chuẩn VitC bằng phương pháp DPPH Nồng độ VitC (ppm)

20

25

30

35

40

Độ hấp thu A

0.345

0.287

0.238

0.191

0.125

45

Ơ

N

O

FF IC IA L

Phương trình đường chuẩn: y = -0.0107x+0.5588, với R2 =0.99673

H

Hình 4.3. Đường chuẩn VitC của phương pháp DPPH

N

DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để kiểm tra khả năng loại bỏ gốc tự

Y

do và các nhóm cho hydro, phương pháp này cũng được sử dụng để định lượng các chất

U

oxy hóa trong hệ thống sinh học phức tạp ngày nay. Những electron lẻ có trong gốc tự do

Q

DPPH cho sự hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 517 nm và hợp chất này có màu tím. Khi các electron lẻ này kết hợp với hydro của chất kháng oxy hóa để hình thành dạng DPPH-

M

H, hợp chất sẽ chuyển từ màu tím sang vàng tương ứng với lượng electron kết hợp với

KÈ

DPPH (18). Vì vậy, khả năng làm sạch gốc tự do của một chất càng cao thì sự hấp thu quang phổ được đo ở bước sóng 517 nm của phản ứng DPPH có giá trị càng thấp và

ẠY

ngược lại.

Khả năng kháng oxy hóa của lá sen được khảo sát dựa trên hàm lượng chất kháng

D

oxy hóa. Hàm lượng chất kháng oxy hóa được tính tương đương μg/ml vitamin C dựa vào phương trình đường chuẩn y = -0.0107x+0.5588, với R2=0.99673.

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần lấy kết quả trung bình, phần trăm loại gốc tự do được tính toán theo công thức (2). Công thức (2) quy đổi chất chống oxi có trong mẫu về 46

vitamin C, từ công thức ta được kết quả cho thấy 1g chất khô mẫu có chứa 459.332µM VitC. Như vậy, 1g chất khô mẫu có chứa chất chống oxi hóa tương đương với vitamin C ở nồng độ 30ppm. Từ đó cho thấy khả năng loại gốc tự do của lá sen yếu hơn khoảng 15

FF IC IA L

lần so với mẫu đối chứng dương (vitamin C). Kết quả nghiên cứu này chứng minh cao Hà Thủ Ô có khả năng kháng oxy hóa cao hơn một số thảo dược trong các nghiên cứu

trước đây như nghiên cứu ở cao methanol cây Hà Thủ Ô với khả năng kháng oxy hóa là

D

ẠY

KÈ

M

Q

U

Y

N

H

Ơ

N

O

349 μg/ml ( Đái Thị Xuân Trang và ctv,2015)(19).

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

5.1 .

KẾT LUẬN.

Từ kết quả khảo sát được, đề tài nghiên cứu rút ra kết luận: Đã chọn được nhiệt độ sấy thích hợp cho hàm lượng flavonoid cao nhất là 70 oC.

-

Tỉ lệ nguyên liệu:dung môi phù hợp cho khảo sát này là 1:30.

-

Loại dung môi tốt nhất cho quá trình trích ly đạt hiệu suất cao là methanol 50 o với hàm lượng flavonoid là 124.073 ± 1.67 mg/gVCK.

5.2.

KIẾN NGHỊ

FF IC IA L

-

D

ẠY

KÈ

M

Q

U

-

Tinh sạch flavonoid trích ly được, đồng thời phân tích từng loại polyphenol và hàm lượng trong đó.

Khảo sát khả năng và tìm điều kiện để ứng dụng flavonoid trích ly được trong thực phẩm với mục đích chống oxy hóa, đặc biệt là khả năng chống oxy hóa ở nhiệt độ cao như nhóm các thực phẩm có sử dụng chất béo.

Y

-

N

H

Ơ

N

O

Do thời gian thực hiện đồ án có hạn nên đề tài vẫn còn thiếu sót trong các khảo sát cần thiết khác, quá trình khảo sát chưa thể tiến hành chặt chẽ. Chính vì thế, chúng tôi xin được kiến nghị như sau: - Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố khác như: thời gian, kích thước nguyên liệu đến hiệu suất trích ly flavonoid.

- Tiến hành xác định hiệu suất trích ly flavonoid bằng các phương pháp khác.

48

FF IC IA L

TÀI LIỆU THAM KHẢO

M

Q

U

Y

N

H

Ơ

N

O

1. Hoàng Văn Tuấn, Phạm Hương Sơn, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Đình Luyện, Nguyễn Thanh Hảo. Nghiên cứu tách chiết và xác định một số hoạt tính sinh học của dịch chiết flavonoid từ cây diếp cá (HOUTTUYNIA CORDATA THUNBERG) thu hái tại Hà Nội. Tạp chí sinh học 2013 (183-187) 2. Lan Zhang, Ying Shan, Keji Tang and Ramesh Putheti. Ultrasound -assisted extraction flavonoids from Lotus (Nelumbo nuficera Gaertn) leaf and evaluation of its anti-fatigue activity. International Journal of Physical Sciences Vol. 4 (8), pp. 418422, August, 2009.

3. Dương Thị Phượng Liên, Phan Thị Bích Trâm và Hà Thanh Toàn. Ảnh hưởng quá trình trích ly đến hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa từ đậu nành.Tạp chất Khoa Học Trường đại học Cần Thơ 2014.

4. Bùi Trọng Đạt, Phùng Văn Trung, Phan Nhật Minh, Hoàng Thị Ngọc Dung và Phạm Cao ThanhTùng, 2003. Xây dựng quy trình thử hoạt tính kháng oxy hóa DPPH và sàng lọc một số cao chiết từ cây cỏ Việt Nam. Tuyển Tập Công Trình Nghiên Cứu Khoa Học và Công Nghệ năm 2003; tr.150-155 5. Mohamed, . Kobeasy , Osama, M. Abdel-Fatah , Samiha M. Abd El-Salam and Zahrat El-Ola M. Mohamed. Biochemical studies on Plantago major L. and Cyamopsis tetragonoloba L. International Journal of Biodiversity and Conservation Vol. 3(3), pp.

83-91, March 2011

KÈ

7. Jittawan Kubola, Sirithon Siriamornpun. Phytochemicals and antioxidant activity of different fruit fractions (peel, pulp,aril and seed) of Thai gac (Momordica cochinchinensis Spreng). Food Chemistry 127 (2011) 1138 –1145.

D

ẠY

8. Hoàng Văn Tuấn, Phạm Hương Sơn, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Đình Luyện, Nguyễn Thanh Hảo , (2013),“Nghiên cứu tách chiết và xác định một số hoạt tính sinh học của dịch chiết flavonoid từ cây diếp cá (Houttuynia cordata thunberg) thu hái tại Hà Nội”, Tạp chí sinh học, 35 (3), tr. 183 – 187 9. Robin van den Berga,b,* ; Guido R.M.M. Haenen b; Henk van den Berga; Wim van der Vijgh c; Aalt Bastb. The predictive value of the antioxidant capacity of structurally

49

related Flavonoids using the Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) assay.

Food Chemistry 70 (2000) 391±395.

FF IC IA L

10. Mariken J.T.J. Arts*, Guido R.M.M. Haenen, Hans-Peter Voss, Aalt Bast.

Antioxidant capacity of reaction products limits the applicability of the Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) assay. Food and Chemical Toxicology 42 (2004) 45–49.

11. Zou, Y.P.; Chang, S.K.C.; Gu, Y.; Qian, S.Y. Antioxidant activity and phenolic compositions of Lentil (Lens culinarisvar. Morton) extractand its fractions. J. Agric.

Food Chem. 2011, 59, 2268–2276.

N

O

12. Reşat Apak 1 ,‡, Shela Gorinstein 2, Volker Böhm3, Karen M. Schaich 4 , Mustafa Özyürek 1, and Kubilay Güçlü 1. Methods of measurement and evaluation of natural antioxidant capacity/activity (IUPAC Technical Report)*. Pure Appl. Chem., Vol. 85, No. 5, pp. 957–998, 2013.

Y

N

H

Ơ

13. Ming-Zhi Zhu 1, Wei Wu2, Li-Li Jiao 2, Ping-Fang Yang1 and Ming-Quan Guo 1,* .

Analysis of Flavonoids in Lotus (Nelumbo nucifera) Leaves and Their Antioxidant Activity Using Macroporous Resin Chromatography Coupled with LC-MS/MS and Antioxidant Biochemical Assays. Molecules 2015, 20, 10553-10565; doi:10.3390/molecules200610553.

D

ẠY

KÈ

M

Q

U

14. Dương Thị Phượng Liên 1, Phan Thị Bích Trâm1 và Hà Thanh Toàn 3. Ảnh hưởng quá trình trích ly đến hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa từ đậu nành.

Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. (2014)(1): 8-15.

50

51

D

ẠY M

KÈ Y

U

Q H

N Ơ N

FF IC IA L

O