Nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng IgG trong sữa và các sản phẩm sữa bằng HPLC

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ ĐÌNH CẢNH

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG IMMUNOGLOBULIN G TRONG SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ ĐÌNH CẢNH MÃ SINH VIÊN: 1301033

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG IMMUNOGLOBULIN G TRONG SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Trần Cao Sơn 2. TS. Đặng Thị Ngọc Lan Nơi thực hiên: 1. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất 2. Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2018

LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Trần Cao Sơn và TS. Đặng Thị Ngọc Lan, là những người tận tình dìu dắt trong quá trình nghiên cứu khoa học, cũng như trực tiếp chỉ bảo, hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, các anh chị trong khoa Độc học và dị nguyên thuộc Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, đặc biệt TS. Trần Cao Sơn và chị Nguyễn Thị Minh Hòa, đã giải đáp thắc mắc, nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc tại Viện.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trong Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, đặc biệt là TS. Đặng Thị Ngọc Lan đã giúp đỡ, quan tâm, tạo điều kiên thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này.

Tôi cũng gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo và toàn thể các thầy cô tại các bộ môn đã chỉ dạy và giúp đỡ trong suốt thời gian học tập 5 năm tại trường Đại học Dược Hà Nội.

Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, gia đình tôi đã luôn bênh cạnh ủng hộ, động viên để tôi có thể hoàn thành khóa luận của mình một cách tốt nhất.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2018 Sinh viên

Lê Đình Cảnh

i

MỤC LỤC MỤC LỤC .................................................................................................................. ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................. iv DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................... v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ................................................................... vi ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... - 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................. - 2 1.1. Tổng quan về Immunoglobulin G .................................................................. - 2 1.1.1. Giới thiệu về tính chất và chức năng Immunoglobulin G........................... - 2 1.1.2. Cấu trúc của immunoglobulin G ................................................................. - 3 1.1.4. Nguồn cung cấp IgG từ sữa và thành phẩm từ sữa ..................................... - 4 1.2. Các phương pháp định lượng IgG .................................................................. - 5 1.2.1. Kỹ thuật phân tích dựa vào tương tác miễn dịch ........................................ - 5 1.2.2. Kỹ thuật định lượng dựa vào phương pháp tách ......................................... - 7 1.3. Tổng quan về sắc ký ái lực trong sắc ký lỏng hiệu năng cao. ........................ - 9 1.3.1. Khái niệm .................................................................................................... - 9 1.3.2. Nguyên tắc................................................................................................... - 9 1.3.3. Pha tĩnh sắc ký ái lực trong sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................ - 10 1.3.4. Pha động trong sắc ký ái lực trên sắc ký lỏng hiệu năng cao . ................. - 13 1.3.5. Một số nghiên cứu về định lượng immunoglobulin G .............................. - 13 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ................. - 15 2.1. Đối tượng...................................................................................................... - 15 2.2. Nguyên vật liệu và thiết bị ........................................................................... - 15 2.2.1. Thiết bị ...................................................................................................... - 15 2.2.2. Dụng cụ ..................................................................................................... - 15 2.2.3. Hóa chất, chất chuẩn ................................................................................. - 15 2.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... - 16 2.3.1. Nghiên cứu phương pháp xác định IgG trong sữa và sản phẩm sữa ........ - 16 2.3.2. Thẩm định phương pháp xác định IgG bằng sắc ký lỏng ......................... - 16 2.3.3. Sơ bộ đánh giá hàm lượng IgG trong sữa và thành phẩm từ sữa trên thị trường Việt Nam.................................................................................................. - 16 ii

2.4. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. - 16 2.4.1. Pha dung dịch chuẩn ................................................................................. - 17 2.4.2. Pha các dung dịch đệm .............................................................................. - 17 2.4.3. Quy trình xử lý mẫu .................................................................................. - 18 2.4.4. Phương pháp phân tích bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao .................. - 18 2.4.5. Thẩm định phương pháp [2]...................................................................... - 19 2.4.6. Phương pháp xử lý kết quả........................................................................ - 20 2.4.7. Phương pháp lấy mẫu ................................................................................ - 20 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................... - 21 3.1. Nghiên cứu phương pháp xác định IgG trong sữa và các sản phẩm sữa ..... - 21 3.1.1. Khảo sát các điều kiện xác định IgG bằng thiết bị HPLC. ....................... - 21 3.1.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu. ................................................................... - 25 3.2. Thẩm định phương pháp xác định IgG bằng sắc ký lỏng ............................ - 28 3.2.1. Độ đặc hiệu................................................................................................ - 28 3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)........................ - 29 3.2.3. Khoảng tuyến tính. .................................................................................... - 31 3.2.4. Độ lặp lại và độ thu hồi ............................................................................. - 32 3.2.5. Độ lặp lại khác ngày .................................................................................. - 33 3.3. Sơ bộ đánh giá hàm lượng IgG trong sữa và thành phẩm từ sữa trên thị trường Việt Nam ............................................................................................................. - 34 3.4. Bàn luận ........................................................................................................ - 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. - 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... - 39 PHỤ LỤC ............................................................................................................ - 42 -

iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt AOAC

Giải nghĩa Association of Official Analytical Communities (Hiệp hội các cộng đồng phân tích chính thức)

IgG

Immunoglobulin G

Igs

Immunoglobulin

Fab

Fragment antigen binding (Phần nhận biết kháng nguyên)

Fc

Fragment crystalizable (Phần dễ kết tinh)

HPLC RID ELISA

High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) Radial imminodifusion (Miễn dịch khuếch tán) Enzyme Linked Immunosorbent Assay- (Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme)

SEC

Size-exclusion chromatography (Sắc ký rây phân tử)

SPR

Surface plasmon resonance (Cổng hưởng plasmon bề mặt)

AC

Affinity chromatography (Sắc ký ái lực) Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis

SDS-PAGE (Điện di polyacrylamide với SDS) LOD

Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ

Limit of Qualification (Giới hạn định lượng)

DAD

Diode-array detectors ( Detector mảng diod)

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1.Chức năng của các thứ lớp dưới của IgG .............................................. - 2 Bảng 1.2. Hàm lượng của các phân lớp dưới của IgG .......................................... - 4 Bảng 1.3. Khả năng liên kết của protein với kháng thể. ..................................... - 12 Bảng 1.4: Một số nghiên cứu về định lượng IgG ............................................... - 13 Bảng 2.1. Khối lượng cân chất chuẩn gốc IgG (10mg/g) ................................... - 17 Bảng 3.1. Khảo sát khối lượng cân mẫu ............................................................. - 27 Bảng 3.2: Tỉ lệ S/N ở nồng độ LOD 0,01 mg/g .................................................. - 30 Bảng 3.3. Độ chệch của các nồng độ chuẩn........................................................ - 31 Bảng 3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi....................................................................... - 33 Bảng 3.5. Độ lặp lại khác ngày ........................................................................... - 34 Bảng 3.6. Kết quả định lượng mẫu thực ............................................................. - 35 -

v

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Cấu tạo của IgG .................................................................................... - 3 Hình 1.2. Phương pháp plasmon bề mặt ............................................................... - 7 Hình 1.3. Quá trình trong sắc ký ái lực .............................................................. - 10 Hình 1.4. Protein G được gắn trên Sepharose. .................................................... - 11 Hình 3.1. Khảo sát pH dung dịch nạp ................................................................. - 22 Hình 3.2. Thể tích nạp ......................................................................................... - 23 Hình 3.3. Khảo sát pH rửa .................................................................................. - 24 Hình 3.4. Sắc ký đồ rửa lại khi khảo sát pH =3 .................................................. - 24 Hình 3.5. Khảo sát thể tích rửa............................................................................ - 25 Hình 3.6. Sắc ký đồ thể hiện tính đặc hiệu ......................................................... - 28 Hình 3.7. Phổ hấp thụ IgG trong nghiên cứu ...................................................... - 29 Hình 3.8. Phổ hấp thụ IgG ................................................................................. - 29 Hình 3.9. Phổ hấp thụ ở nồng độ 0,5mg/g .......................................................... - 29 Hình 3.10. Phổ hấp thụ ở nồng độ 1mg/g ........................................................... - 29 Hình 3.11. Sắc ký đồ của nồng độ LOD 0,01 mg/g ............................................ - 30 Hình 3.12. Đồ thị khảo sát sự tuyến tính............................................................. - 32 -

vi

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong cuộc sống hiện đại ngày nay, sữa và sản phẩm sữa đang ngày càng trở nên thiết yếu vì giúp nâng cao và bảo vệ sức khỏe. Các sản phẩm này gồm các yếu tố tăng trưởng, immunoglobulin, lactoperoxidase, lactoferrin, cytokine, nucleotid, vitamin, … [21-28].

Trong đó, immunoglobulin (Igs) mà chiếm đa số là imunoglobulin G có nguồn chủ yếu từ sữa của loài động vật nhai lại [16] có vai trò giúp cơ thể tăng sức đề kháng. Việc sử dụng các sản phẩm sữa có hàm lượng IgG cao đang là xu hướng của người tiêu dùng. Hiện nay, Việt Nam vẫn chưa có tiêu chuẩn về hàm lượng IgG trong sữa và sản phẩm sữa vì vậy các cơ quan kiểm tra đang tiến tới xây dựng tiêu chuẩn chung. Vấn đề đặt ra là phương pháp định lượng IgG phù hợp để xây dựng các tiêu chuẩn.

Các phương pháp định lượng IgG đã phát triển từ rất lâu, nhưng để phù hợp với hàm lượng IgG ở trong sữa đang là vấn đề khó khăn do IgG là một kháng thể nên cần phải sử dụng phương pháp đặc hiệu. Chúng dễ bị biến tính do điều kiện nhiệt độ, bảo quản và quá trình sản xuất, cùng với đó là bất cập về mặt kinh tế, thời gian, hay quy mô tiến hành. Việc sử dụng phương pháp sắc ký để định lượng IgG trong sữa và sản phẩm sữa có tiềm năng giải quyết được các khó khăn trên.

Xuất phát từ các nhu cầu trên chúng tôi đã xây dựng đề tài: “Nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng IgG trong sữa và các sản phẩm sữa bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với 2 mục tiêu sau: 1. Xây dựng phương pháp và thẩm định phương pháp định lượng IgG trong sữa và các sản phẩm sữa.

2. Áp dụng phương pháp định lượng hàm lượng một số mẫu sữa trên thị trường

-1-

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Immunoglobulin G 1.1.1. Giới thiệu về tính chất và chức năng Immunoglobulin G Immunoglobulin G (IgG) là một trong số những kháng thể của cơ thể người và động vật.

IgG chiếm khoảng 80% tổng lượng kháng thể. IgG chủ yếu xuất hiện trong huyết thanh, chiếm 75% của tất cả các Igs trong huyết thanh. IgG có chủ yếu trong các khoang ngoài mạch máu, là lớp duy nhất của Igs có khả năng đi qua nhau thai, do đó việc miễn dịch được đảm bảo truyền từ mẹ sang con.

Chức năng quan trọng nhất của IgG là giúp cơ thể miễn dịch, thông qua quá trình hoạt hóa bổ thể. Chức năng khác của IgG là khả năng gắn các tế bào như các đại thực bào, các bạch cầu đơn nhân, các bạch cầu đa nhân trung tính một số tế bào lympho có các thụ thể Fc cho vùng Fc của IgG, giúp tế bào có thể tiếp nhận các kháng nguyên tốt hơn. Chức năng của các phân lớp dưới của IgG được thể hiện ở Bảng 1.1.

Bảng 1.1.Chức năng của các thứ lớp dưới của IgG

Các Khả phân Tỷ Khả năng năng qua TT lớp lệ hoạt hóa nhau dưới % bổ thể thai IgG

Khả năng gắn thụ thể Fc trên các tế bào thực bào

Thời gian bán hủy [12]

1

IgG1

66

Có

Cao thứ nhì

Ái lực cao

21 ngày

2

IgG2

23

Không

Cao thứ ba

Ái lực rất thấp

21 ngày

3

IgG3

7

Có

Cao nhất

Ái lực cao

7 ngày

4

IgG4

4

Có

Không

Ái lực trung bình

21 ngày

-2-

1.1.2. Cấu trúc của immunoglobulin G IgG gồm 4 chuỗi polypeptit. Hai chuỗi nhẹ kí hiệu là L và hai chuỗi nặng kí hiệu là H, gắn với nhau bởi cầu disulfua (S-S). Tất cả các IgG là monomer (globulin miễn dịch 7S) Chuỗi nhẹ: Trật tự axit amin của hai chuỗi nhẹ giống nhau và được chia làm hai vùng.

Vùng có trật tự axit amin thay đổi gọi là vùng biến đổi (kí hiệu VL), nằm phía đầu amin (-NH2) của phân tử. Vùng có trật tự không thay đổi gọi là vùng cố định (ký hiệu CL) nằm phía đầu carboxyl (-COOH). Trật tự axit amin vùng cố định của chuỗi nhẹ luôn giống nhau ở tất cả các lớp kháng thể, hoặc theo trật tự lamda hoặc theo trật tự kappa. Ngược lại, trật tự ở vùng biến đổi luôn khác nhau, kể cả ở các kháng thể do cùng một tế bào sinh ra.

Hình 1.1. Cấu tạo của IgG [9] Chuỗi nặng: IgG được cấu thành bởi chuỗi nặng gamma. Mỗi chuỗi nặng có 4 vùng axit amin: một vùng biến đổi và ba vùng cố định. Vùng biến đổi (kí hiệu là VH) nằm phía đầu amin đối xứng với vùng biến đổi của chuỗi nhẹ tạo thành vị trí kết hợp kháng nguyên (paratop). Vùng cố định nằm phía đầu carboxyl, chia làm 3 vùng nhỏ có kí hiệu CH1, CH2 và CH3. Giữa vùng CH1 và CH2 là vùng khớp nối có tác dụng như bản lề làm cho phân tử có hình chữ Y và có thể điều chỉnh cho hai paratop gắn với epitop của kháng nguyên. Hai cánh tay của chữ Y còn gọi là đoạn gắn kháng nguyên Fab (F: fragment, ab: antigen binding), là phần nhận biết kháng nguyên [13]. Dưới tác dụng của papain, phân tử kháng

-3-

thể bị phân giải tại vùng bản lề thành 3 mảnh: hai mảnh nhỏ chứa toàn bộ chuỗi nhẹ và một nửa chuỗi nặng có đầu amin. Một mảnh chính là Fab, mảnh còn lại của chuỗi nặng phía đầu carboxyl có thể kết tinh được gọi là mảnh Fc (Fragment crystalizable). Mảnh này có thể liên kết với đại thực bào, tế bào B và bổ thể. Các phân lớp dưới IgG khác nhau về số lượng liên kết disulfid và chiều dài của vùng bản lề. [24]

1.1.4. Nguồn cung cấp IgG từ sữa và thành phẩm từ sữa IgG có thể được đưa vào cơ thể qua tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch, hoặc bổ sung qua đường ăn uống bằng việc sử dụng các loại thực phẩm chức năng, sữa non và sữa công thức. Trong sữa và sữa non của bò, immunoglobulin G (IgG; phân lớp dưới IgG1 và IgG2) là thành phần miễn dịch chính, mặc dù mức IgA thấp và IgM cũng có mặt [7, 8].

Bảng 1.2. Hàm lượng của các phân lớp dưới của IgG Loài

Bò

Người

Kháng thể

Nồng độ (mg/ml) Huyết thanh

Sữa non

Sữa

IgG

25,0

32–212

0,72

IgG1

14,0

20–200

0,60

IgG2

11,0

12,0

0,12

IgA

0,4

3,5

0,13

IgM

3,1

8,7

0,04

IgG

12,1

0,4

0,04

IgA

2,5

17,4

1,00

IgM

0,9

1,6

0,10

Ở động vật nhai lại như bò, IgG1 cấu thành khoảng 80% tổng hàm lượng Igs trong sữa, trong khi Igs chủ yếu trong sữa ở hầu hết các loài có vú không nhai lại khác (bao gồm cả con người) là IgA. IgA và IgM cũng được tổng hợp bởi các tế bào biểu mô hoặc tế bào biểu mô tuyến vú [18].

-4-

1.2. Các phương pháp định lượng IgG Có nhiều phương pháp để xác định nồng độ của IgG phù hợp với từng khoảng nồng độ và nền mẫu khác nhau. Nồng độ IgG có thể được xác định một cách đơn giản bằng đo quang [3]. Các phép đo như vậy thường được áp dụng đối với nồng độ chuẩn tinh khiết tuân theo định luật Lamber - Beer. Hai nhóm phương pháp cơ bản để phân tích IgG dựa trên tách hoặc miễn dịch.

1.2.1. Kỹ thuật phân tích dựa vào tương tác miễn dịch Các kỹ thuật này dựa trên sự tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể (hoặc protein gắn kết). Các nhóm phương pháp này có ưu điểm lã dễ phát hiện sự thay đổi cấu trúc của protein (bao gồm cả IgG) và có thể phát hiện các sản phẩm làm giả.

1.2.1.1. Miễn dịch khuếch tán (Radial imminodifusion, RID) Miễn dịch khuếch tán là kỹ thuật được Mancini sử dụng và mô tả đầu tiên [26]. Kỹ thuật này sử dụng một kháng huyết thanh được hòa tan vào thạch đun lỏng, và hỗn hợp thạchkháng huyết thanh được đổ rải đều lên một phiến kính đặt trên mặt phẳng ngang. Sau khi thạch đông, người ta đục các lỗ tròn trên thạch và cho huyết thanh cần đo hoặc huyết thanh chứng vào. Kháng nguyên, mà trong trường hợp này là immunoglobulin G, sẽ khuếch tán theo hướng ly tâm từ các lỗ ra vùng thạch có chứa kháng huyết thanh xung quanh. Bởi vì nồng độ kháng thể (kháng huyết thanh trong thạch) cố định nên khi kháng nguyên trong lỗ khuếch tán thì nồng độ giảm dần cho đến khi có tỉ lệ thích hợp với nồng độ kháng thể trong thạch thì một vòng tủa sẽ hình thành. Đối với mỗi mẻ người ta làm ba lỗ chứa kháng nguyên với nồng độ biết trước để vẽ thành đường chuẩn [5].

Giới hạn định lượng của RID là khoảng từ 50 mg/ml – 150 mg/ml [9]. Do đó phương pháp này không phù hợp để định lượng IgG có hàm lượng thấp trong sữa.

1.2.1.2. Phản ứng miễn dịch Elisa Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản -5-

ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản. ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh.

Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu, thực hiện qua hai bước: -

Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

-

Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy

nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm. Phương pháp định lượng IgG bằng phương pháp Elisa có thể định lượng 1ng/ml [14]. Tuy nhiên khoảng tuyến tính của phương pháp này khá nhỏ khi phân tích mẫu thực cần pha loãng rất nhiều lần, dẫn đến việc tốn thời gian, hoá chất và sai số do pha loãng. Mặc dù các bộ kit định lượng trên thị trường đã thương mại hóa nhưng giá thành vẫn còn rất cao, tốn kém chi phí vì chỉ được dùng được một lần.

1.2.1.3. Phương pháp cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) (surface plasmon resonance).

Cộng hưởng Plasmon bề mặt (SPR) là quá trình phát hiện bằng quang học xảy ra khi ánh sáng đi vào lăng kính được phủ lớp kim loại (vàng) mỏng. Dưới điều kiện cố định (bước sóng, phân cực, góc tới), các điện tử tự do tại bề mặt hấp thụ photon ánh sáng và chuyển đổi chúng sang sóng plasmon bề mặt. Sự suy giảm phản xạ của ánh sáng sẽ được nhìn thấy dưới điều kiện của SPR. Trong phương pháp định lượng IgG thì gắn trên bề mặt kim loại là các phối tử (kháng nguyên cố định), khi mẫu thực di chuyển qua thì IgG liên kết với kháng nguyên làm thay đổi chỉ số phản xạ. Độ thay đổi này tỉ lệ với số lượng liên kết (hay nồng độ IgG). Quá trình được theo dõi trong một khoảng thời gian, để số lượng IgG trong mẫu liên kết toàn bộ với kháng nguyên trên bề mặt. Các mẫu tiếp theo được chảy qua khi trên bề mặt khi các IgG liên kết với kháng nguyên đã được loại bỏ và IgG được rửa giải ra ngoài. Quá trình thực

-6-

hiện với các mẫu có nồng độ IgG chuẩn từ đó nội suy cho các mẫu cần phần tích với nồng độ IgG chưa xác định.

Xét nghiệm miễn dịch dựa trên SPR có ưu điểm cho việc phân tích các protein sữa nhỏ.

Một xét nghiệm miễn dịch sinh học tự động sử dụng SPR quang học đã được sử dụng để định lượng IgG. Khoảng định lượng của phương pháp này từ 0,08-25 µg/ml. [29]

Hình 1.2. Phương pháp plasmon bề mặt

1.2.2. Kỹ thuật định lượng dựa vào phương pháp tách Cả hai phương pháp sắc ký lỏng và kỹ thuật điện di đều phù hợp để xác định và định lượng IgG trong nền mẫu phức tạp bao gồm sữa bò và sữa non. Thông thường, casein được loại bỏ trước khi phân tích tách, do casein chiếm phần lớn protein trong sữa.

1.2.2.1. Điện di gel Điện di là kỹ thuật dùng để phân tách và đôi khi tinh chế các chất đặc biệt là các protein và các acid nucleotide trên cơ sở kích thước, khối lượng, điện tích và hình dạng của chúng.

-7-

Các phân tử protein và acid nucleic có thể được chạy điện di trên một khuôn đỡ như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamid gel. Trong đó gel của agarose và polyacrylamid được sử dụng phổ biến nhất. Thông thường, gel là một khuôn đúc dạng phiến mỏng có các giếng để nạp mẫu. Gel được ngâm trong đệm điện di cung cấp các ion để dẫn truyền dòng điện và một vài loại đệm để duy trì pH ở một giá trị không đổi trong một khoảng tương đối. Khả năng di chuyển của các phân tử protein và acid nucleic trong điện trường là khác nhau tùy thuộc vào độ ion, cường độ điện trường, kích thước và hình dạng. Sau khi tách hoàn thành, các dải protein có thể được phát hiện bằng cách xử lý gel với một chất phát hiện vết Coomassie Blue, liên kết đặc biệt với protein, mỗi dải đại diện cho một protein. Định lượng được thực hiện bằng cách sử dụng thiết bị đo độ hấp thụ và nội suy từ đường chuẩn được xây dựng trên các protein chuẩn [18]. Nền gel sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) thường được sử dụng trong định lượng IgG. Khi đó IgG được cắt thành các chuỗi nhẹ và nặng, xuất hiện dưới dạng các dải riêng biệt. Do đó SDS-PAGE không thể phân biệt IgG ở giai đoạn ban đầu là trạng thái tự nhiên hay bị biến tính. Khoảng định lượng của phương pháp này 0,2 mg/ml – 3,5 mg/ml. [19]. Kỹ thuật này không hay được dùng để định lượng IgG.

1.2.2.2. Sắc ký rây phân tử (SEC) Sắc ký rây phân tử là phương pháp chia tách các phân tử trong dung dịch dựa trên kích thước của chúng. Trong trường hợp pha động là một dung môi hữu cơ, kỹ thuật được gọi là sắc ký thấm qua gel, còn trường hợp pha động là nước thì kỹ thuật được gọi là sắc ký lọc trên gel. Mẫu được đưa vào cột chứa đầy gel hoặc một loại vật liệu xốp, và được pha động dẫn chạy qua cột.

Khoảng kích thước lỗ của vật liệu nhồi trong cột sẽ xác định khoảng kích thước phân tử được chia tách qua quá trình sắc ký. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để có thể đi vào trong tất cả khoảng không gian của lỗ xốp và được rửa giải trong tổng thể tích thấm. Các phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ xốp lớn nhất chỉ di chuyển được dọc theo cột qua các khoảng trống giữa các hạt vật liệu nhồi mà không bị giữ lại, được rửa giải trong thể tích loại trừ (thể tích trống). Sự chia tách theo kích thước phân tử xảy ra giữa thể tích trống và tổng thể tích thấm. Sau đó chất phân tích được định lượng bằng phương pháp đo quang.

-8-

SEC đã thành công trong việc tách whey protein với IgG và định lượng trên cột Sepharose [6]. Tuy nhiên, các vấn đề trong việc xác định IgG của SEC cũng đã được ghi nhận, đặc biệt trong trường hợp có casein, một protein chính trong sữa làm ảnh hưởng tới khả năng chia tách. Phương pháp này cũng có khả năng xác định được nguồn gốc của IgG.

1.2.2.3. Sắc ký ái lực (Affinity chromatography AC) Phương pháp này kết hợp giữa sự tách và tương tác của IgG với protein G hoặc A. Các loại protein này là protein mà bề mặt tế bào có liên kết đặc biệt (tuy nhiên không phải cơ chế miễn dịch) với IgG thông qua phần Fc (không bị biến tính bởi nhiệt) của phân tử IgG. Trong quá trình rửa giải với đệm trung tính, các protein khác trong sữa sẽ đi qua cột, sau đó IgG sẽ được rửa ra với đệm có pH thấp. Phương pháp này phát hiện các protein bằng việc đo độ hấp thụ tại bước sóng ≈ 280 nm, pic protein xuất hiện tại thời gian rửa giải pH thấp sẽ chỉ là pic của một mình IgG. Tuy nhiên, cần loại bỏ casein do casein có khả năng gây cản trở quá trình rửa giải IgG. Phương pháp có khoảng tuyến tính từ 1-100 mg/g [3], phù hợp với việc phân tích sữa, sản phẩm từ sữa và sữa non.

1.3. Tổng quan về sắc ký ái lực trong sắc ký lỏng hiệu năng cao.

1.3.1. Khái niệm Sắc ký lỏng hiệu năng hiệu năng cao (High Perform Liquid Chromatography HPLC) là kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rủa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Sắc ký ái lực là một kiểu sắc ký của HPLC. [1]

1.3.2. Nguyên tắc Các hợp chất sinh học, như enzyme và cơ chất hoặc kháng nguyên và kháng thể, sở hữu những đặc trưng nhận biết giữa chúng một cách chọn lọc để tạo thành các hợp chất phức.

Sắc ký ái lực là một phương pháp phân tách và tinh chế các chất vận dụng tính ái lực sinh học của chúng. Tương tác giữa chúng thường có thể đảo ngược. Một phân tử được cố định

-9-

(pha tĩnh) có ái lực với chất phân tích, sau đó chất phân tích được rửa giải nhờ gradient pha động [20].

Quy trình trong sắc ký ái lực gồm 4 bước sau: (1) Cân bằng cột Nhồi cột bằng pha tĩnh gồm phần chất mang đã cố định sẵn một phối tử phù hợp với mục tiêu phân tách trên bề mặt. Cột được cần bằng nhờ dung môi chạy mẫu.

(2) Thêm mẫu và hấp phụ với hợp chất mục tiêu (Hình a) Mẫu được đưa vào cột và thành phần mục tiêu hấp phụ lên trên pha tĩnh.

(3) Rửa cột (Hình b) Việc rửa cột nhằm loại bỏ những thành phần không hấp phụ lên pha tĩnh.

(4) Xả cột (Hình c) Dung môi được đưa vào để rửa giải thành phần mục tiêu đang hấp phụ trên pha tĩnh ra khỏi cột nhằm thu hồi chúng. Quy trình bắt đầu lại từ bước (1). [27]

Hình 1.3. Quá trình trong sắc ký ái lực [27]

1.3.3. Pha tĩnh sắc ký ái lực trong sắc ký lỏng hiệu năng cao 1.3.3.1. Các chất hỗ trợ ái lực (Các chất mang pha tĩnh) Loại chất mang được sử dụng phổ biến gồm agarose hay những hạt gel tổng hợp đại phân tử (cấu tạo từ polyme) có tính ưa nước (ví dụ như polyvinyl alcohol polyacrylate, …).

Theo nguyên tắc, chất mang được chọn không có phản ứng gì (bất hoạt) với mẫu và bền về mặt vật lý lẫn hóa học dưới những điều kiện sắc ký được thiết lập. Cũng cần phải lưu ý rằng

- 10 -

nếu các hạt gel có cấu trúc xốp, sự phân tán lỗ xốp và diện tích bề mặt riêng của chúng sẽ ảnh hưởng đến lượng phối tử đang được cố định và lượng phối tử hữu hiệu (có hoạt động) trên bề mặt vật liệu nhồi. [25] Trong cột ái lực protein G thì chất mang là hạt Agrose liên kết chéo (Sepharose). Phương pháp cố định Protein G lên bề mặt chất mang cũng rất quan trọng. Độ dài cánh tay nối rất quan trọng trong việc các phối tử bắt và liên kết với chất phân tích. Trong cột Protein G thì để tăng khả năng gắn với IgG đã sử dụng phương pháp kích hoạt N-hydroxysuccinimide, trên Sepharose là 12 phân tử 6-aminohexanoic acid. Phương pháp khớp nối này mang lại hiệu năng cao cho cột.

Qua trình gắn với protein G

Hình 1.4. Protein G được gắn trên Sepharose.[15]

1.3.3.2. Các phối tử Protein G, một protein bề mặt tế bào từ Streptococci nhóm G, là một thụ thể Fc kiểu III. ProteinG liên kết qua cơ chế không phải miễn dịch. Protein G gắn kết đặc biệt với vùng Fc của IgG, nhưng nó liên kết mạnh hơn với một số IgG đa dòng (Bảng 1.3) và với IgG3 của người.

Trong thí nghiệm này protein G được sản xuất từ E. Coli. GE Healthcare đưa ra một tái tổ hợp, dạng protein G đó có vùng gắn kết tự nhiên với albumin đã được bị xóa di truyền, do đó tránh các phản ứng không mong muốn với albumin. Protein tái tổ hợp G chứa hai vùng rằng buộc Fc. Protein G Sepharose là một sự lựa chọn tốt hơn cho việc thu thập các kháng thể chung vì nó gắn kết một phạm vi rộng hơn của IgG từ các loài sinh vật và liên - 11 -

kết nhiều lớp IgG. Thông thường protein G có liên kết mạnh hơn protein A và thể hiện gắn ít nhất với albumin, kết quả là chế phẩm sạch hơn và năng suất cao hơn. Sức kết dính protein G với IgG phụ thuộc vào các nguồn và phân lớp của globulin miễn dịch. Khả năng liên kết năng động phụ thuộc vào độ bền liên kết và trên một số các yếu tố khác, chẳng hạn như tốc độ dòng chảy trong quá trình áp dụng mẫu. Nhiều kháng thể cũng tương tác ái lực thấp với protein G thông qua vị trí Fab. Protein G hầu như không có liên kết với IgM, IgA hoặc IgE ở người, mặc dù một số chúng liên kết yếu với protein A. Các phối tử protein G trong quá trình sử dụng luôn luôn có khả năng bị tách ra khỏi chất nền, đặc biệt trong điều kiện rửa giải khắc nghiệt. Sự gắn bó nhiều điểm của protein G với Sepharose cho kết quả mức rò rỉ rất thấp trong một loạt các điều kiện rửa.

Bảng 1.3. Khả năng liên kết của protein với kháng thể. [27] Phân lớp kháng thể

Liên kết với protein A

Liên kết với protein G

IgA

Không xác định

–

IgD

–

–

IgG1

++++

++++

IgG2

++++

++++

IgG3

–

++++

IgG4

++++

++++

Bò

Kháng thể

++

++++

Chó

Kháng thể

++

+

IgG1

+

++++

IgG2a

++++

++++

IgG2b

+++

+++

IgG3

++

+++

Loài

Người

Chuột

Các sản phẩm sữa chủ yếu có nguồn gốc từ sữa bò, vì vậy trong nghiên cứu này sử dụng protein G là phù hợp.

- 12 -

1.3.4. Pha động trong sắc ký ái lực trên sắc ký lỏng hiệu năng cao .

Việc lựa chọn pha động trong sắc ký ái lực phụ thuộc vào khoảng pH cần sử dụng.

Protein G liên kết với IgG trong một khoảng pH rộng, cho nên việc lựa chọn dung môi phù hợp không khó. Khoảng pH = 6 - 9 là điều kiện để protein gắn với IgG. Để phá vỡ liên kết này chỉ cần pH của pha động giảm xuống khoảng pH từ 2,5 đến gần bằng 3, phụ thuộc vào mẫu phân tích.

1.3.5. Một số nghiên cứu về định lượng immunoglobulin G Bảng 1.4. Một số nghiên cứu về định lượng IgG

Nền mẫu

Phương pháp định lượng

Nồng độ IgG trong sữa %(kl/kl) 0.03–1.3

Sữa lạc đà

RID

Sữa non của bò

Elisa

Sữa và sữa non của bò

SPR

Sữa bò

SDS-PAGE

Sữa non lạc đà

SEC

Sữa non của bò và sữa bột

AC

0.08

0.05–12

Tài liệu tham khảo

[10]

[11]

[17] [4]

Lên tới 1,7

8.5

[22]

[9]

Từ những thống kê trên đã cho thấy sự quan tâm của các nhà nghiên cứu với việc xác định hàm lượng IgG sữa và các sản phẩm sữa. Có những phương pháp đã được sử dụng

- 13 -

rộng rãi như Elisa hay tới những phương pháp đang được triển khai nghiên cứu như SPR, SEC..., nhưng vẫn còn những bất cập mắc phải Từ những ưu điểm đã được chỉ ra trong tổng quan về sắc ký ái lực và cột Protein G, nên nghiên cứu đã lựa chọn làm phương pháp định lượng IgG trong sữa và sản phẩm sữa.

- 14 -

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 2.1. Đối tượng Đối tượng nghiên cứu của phương pháp này là IgG có trong sữa và sản phẩm sữa, cụ thể chính là IgG của bò. Đối tượng mẫu được lựa chọn để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và ứng dụng phương pháp bao gồm sữa và các thành phẩm từ sữa.

2.2. Nguyên vật liệu và thiết bị 2.2.1. Thiết bị -

Hệ thống sắc ký HPLC Aliance 2965 của hãng Waters.

-

Máy ly tâm Mikro, Hittech.

-

Máy lắc ngang H260, IKA.

-

Cân phân tích có độ chính xác 0,1 mg XS105, Mettler Toledo.

-

Máy đo pH Mettler Toledo.

2.2.2. Dụng cụ -

Micropipet có thể tích điều chỉnh được 20µL-200µL, 100µL-1000µL.

-

Ống ly tâm loại 50mL, 15ml.

-

Vial 1,8mL.

-

Cốc 20ml.

2.2.3. Hóa chất, chất chuẩn -

Chuẩn IgG (Sigma Cat. No. I5506, Sigma – Aldrich) (độ tính khiết 95%).

-

Na2HPO4 (Merck). (hàm lượng ≥ 99%)

-

NaCl (Merck). (hàm lượng ≥ 99,5%)

-

Glycine (Merck). (hàm lượng ≥ 99,7%)

-

NaOH (Merck). (hàm lượng ≥ 97,0%)

-

HCl (Merck). (hàm lượng 37 - 38%)

- 15 -

2.3. Nội dung nghiên cứu 2.3.1. Nghiên cứu phương pháp xác định IgG trong sữa và sản phẩm sữa 2.3.1.1. Khảo sát các điều kiện xác định IgG bằng máy HPLC Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: -

pH của dung dịch đệm để gắn IgG lên cột.

-

pH dung dịch đệm rửa giải.

-

Thể tích dung dịch đệm nạp.

-

Thể tích dung dịch đệm rửa giải.

2.3.1.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu Dựa trên phương pháp tủa các protein và chất béo: -

Khảo sát các điều kiện ly tâm.

- Tỉ lệ pha loãng của mẫu.

2.3.2. Thẩm định phương pháp xác định IgG bằng sắc ký lỏng Đánh giá các thông số cơ bản của phương pháp gồm có: -

Tính chọn lọc, độ đặc hiệu.

-

Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ.

-

Khoảng làm việc.

-

Độ chụm (độ lặp lại).

-

Độ đúng (độ thu hồi).

-

Độ lặp lại khác ngày.

2.3.3. Sơ bộ đánh giá hàm lượng IgG trong sữa và thành phẩm từ sữa trên thị trường Việt Nam Ứng dụng phương pháp để phân tích và đánh giá hàm lượng IgG trong các sản phẩm sữa khác nhau.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

- 16 -

2.4.1. Pha dung dịch chuẩn 2.4.1.1. Dung dịch chuẩn gốc IgG (10mg/g) Cân chính xác 105,26 mg IgG gốc vào cốc 20ml, thêm dung môi NaCl 0,15M vào vừa đủ 10,00 g lắc đều để hòa tan ở điều kiện 30°C trong 30 phút.

2.4.1.2. Dung dịch chuẩn làm việc.

Tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn trên nền mẫu trắng có nồng độ từ 0,01 – 5 mg/g vào lọ mẫu để tiến hành dựng đường chuẩn. Thể tích các dung dịch cần sử dụng để pha dãy chuẩn được thể hiện trong bảng 2.1.

Cân IgG chuẩn gốc vào cốc 20 ml với khối lượng lần lượt như bảng sau thêm dung dịch mẫu trắng đã được tách chiết vừa đủ 4,000 g, trộn đều sau đó lọc qua màng 0,45 µm, bỏ dịch lọc đầu.

Bảng 2.1. Khối lượng cân chất chuẩn gốc IgG (10mg/g) Nồng độ IgG chuẩn

Khối lượng IgG chuẩn gốc

(mg/g)

(g)

0,01

0,004

3,996

0,03

0,012

3,988

0,05

0,020

3,980

0,1

0,040

3,960

0,5

0,200

3,800

1

0,400

3,600

3

1,200

2,800

5

2,000

2,000

Khối lượng dịch mẫu trắng (g)

2.4.2. Pha các dung dịch đệm Các dung dịch đệm được tham khảo để phù hợp với cột và phương pháp ái lực [3]

2.4.2.1 Dung dich đệm tủa cassein (CH3COONa, pH=2,95)

- 17 -

Hòa tan 11,43 mL acid acetic băng vào xấp xỉ 900 ml nước. Điều chỉnh pH của dung dịch bằng 0,2M CH3COONa (hòa tan 27,22 g CH3COONa.3H2O vào 1L nước) thêm nước vừa đủ 1L.

2.4.2.2. Dung dịch đệm nạp Đệm Na2HPO4: Hòa tan 8,90 g Na2HPO4 và 17,53g NaCl vào 900ml nước, điều chỉnh pH bằng NaOH 4M và HCl 6M. Sau đó lọc qua màng lọc 0,45µm.

2.4.2.3. Dung dịch đệm rửa giải Hòa tan 3,75 g glycine vào 900 ml điều chỉnh pH bằng HCl 6M, thêm nước vừa đủ 1L. Sau đó lọc qua màng 0,45 µm.

2.4.3. Quy trình xử lý mẫu Chuẩn bị mẫu sơ bộ: Mỗi mẫu lấy được đồng nhất, trộn đều trước khi cân hoặc hút Tạo mẫu trắng: Sử dụng sữa đậu nành làm mẫu trắng. Phân tích lặp lại 10 lần, xác định mẫu trắng không cho tín hiệu thời gian lưu của chất phân tích.

Quy trình chuẩn bị mẫu: -

Cân chính xác khoảng 2 g bột hoặc sữa dạng lỏng vào ống ly tâm 50mL.

-

Thêm dung dịch NaCl 0,15M cho đủ 10 g.

-

Lắc trên máy lắc ngang khoảng 60 phút cho tan hết.

-

Tủa casein: Đối với mỗi mẫu thêm dung dịch đệm tủa vừa đủ 20 g trộn đều.

-

Ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 7 phút.

- Hút dịch sau đó lọc qua màng 0,45 µm cho dịch lọc vào vial, bỏ các giọt dịch đầu.

2.4.4. Phương pháp phân tích bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng thiết bị HPLC/DAD để định lượng IgG. Điều kiện dung dịch đệm nạp: Lựa chọn pH tối ưu, thể tích dung dịch qua cột. Điều kiện dung dịch đệm rửa: Lựa chọn pH tối ưu, thể tích dung dịch qua cột.

- 18 -

2.4.5. Thẩm định phương pháp [2] 2.4.5.1. Tính chọn lọc Tính chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua so sánh sắc ký đồ của các chất phân tích trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn. Mẫu trắng không được lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn.

Phương pháp sử dụng detector DAD (mảng diod) nên tính chọn lọc trong sắc ký lỏng thông qua xác định độ tinh khiết của pic, hay so sánh phổ của pic với thư viện có sẵn.

2.4.5.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) LOD, LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu đường (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio).

LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3).

LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10).

2.4.5.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn Để xác định khoảng tuyến tính chúng tôi thực hiện đo các dung dịch chuẩn trên nền mẫu trắng có nồng độ thay đổi từ 0,03 đến 5mg/g. Sau đó vẽ đường phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính Sau khi xác định được khoảng tuyến tính của các chất, chúng tôi đã xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực (pha trên nền mẫu trắng), nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích. Vẽ đường chuẩn phụ thuộc giữa diện tích pic của chất chuẩn với nồng độ chất chuẩn (trục hoành x).

2.4.5.4. Độ lặp lại và độ thu hồi Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, chúng tôi tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau là 0,05; 1 và 3 mg/g (n = 6) và tính toán kết quả theo các công thức sau: - Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn tương đối RSD (%):

- 19 -

đ?‘…đ?‘†đ??ˇ% =

� × 100 �̅

ďƒĽ (x N

S =

i =1

i

− x

)

2

N −1

Trong Ä‘Ăł: xi :

Náť“ng Ä‘áť™ tĂ­nh đưᝣc cᝧa lần tháť­ nghiᝇm thᝊ “iâ€?.

x:

Nᝓng đ᝙ trung bÏnh tính đưᝣc cᝧa N lần th᝭ nghiᝇm.

S:

Ä?áť™ lᝇch chuẊn.

N:

Sᝑ lần th᝭ nghiᝇm.

C R(%) = C .100

- Ä?áť™ thu háť“i

c

Trong Ä‘Ăł: R:

Ä?áť™ thu háť“i (%).

C:

Nᝓng đ᝙ chẼt phân tích trong mẍu trắng thêm chuẊn.

Cc :

Nᝓng đ᝙ chuẊn thêm (lý thuyết).

2.4.6. Phưƥng phåp x᝭ lý kết quả Kết quả phân tích trên thiết bᝋ đưᝣc x᝭ lý bẹng phần mᝠm Empower 3 cᝧa Water. Kết quả thẊm đᝋnh phưƥng phåp đưᝣc x᝭ lý bẹng phần mᝠm Microsoft Excel.

2.4.7. Phưƥng phåp lẼy mẍu -

LẼy mẍu theo phưƥng phåp lẼy mẍu ngẍu nhiên.

-

T᝕ng sᝑ mẍu nghiên cᝊu: 17 mẍu sᝯa và sản phẊm sᝯa

- Mẍu: LĂ cĂĄc mẍu sᝯa đưᝣc gáť­i váť kiáťƒm nghiᝇm tấi Viᝇn Kiáťƒm nghiᝇm An toĂ n Vᝇ sinh Tháťąc phẊm Quáť‘c gia.

- 20 -

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Nghiên cứu phương pháp xác định IgG trong sữa và các sản phẩm sữa ➢ Điều kiện thiết bị HPLC -

Cột: Hitrap Protein G 1ml

-

Nhiệt độ cột: 30 0C

-

Bước sóng phát hiện: 277,4 nm

-

Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút

3.1.1. Khảo sát các điều kiện xác định IgG bằng thiết bị HPLC. Pha động được khảo sát với các yếu tố: pH của dung dịch đệm để gắn IgG lên cột, pH dung dịch đệm rửa giải, thể tích dung dịch đệm nạp, thể tích dung dịch đệm rửa giải. Để thuận lợi cho qua trình khảo sát, ban đầu nồng độ IgG chuẩn được lựa chọn để khảo sát là 1 mg/g. Vì qua các để tài nghiên cứu về định lượng IgG bằng sắc ký ái lực [18,24] có khoảng làm việc từ 1 mg/g tới 100 mg/g.

Việc lựa chọn nồng độ dung dịch đệm cũng rất quan trọng đối với quá trình rửa giải của sắc ký lỏng hiệu năng cao. Nếu nồng độ đệm thấp quá có thể làm giảm khả năng đệm, dẫn tới pH của dung dịch bị thay đổi khi tiêm mẫu, ngược lại nếu nồng độ quá cao dẫn tới tăng áp suất trên cột phân tích, làm giảm tuổi thọ của cột. Do cột Hitrap Protein G với áp suất tối đa cho phép là 3 bar, cho nên cả dung dịch đệm nạp và rửa đều được sử dụng với mức nồng độ 50mM. Nồng độ này đã được tham khảo bởi nhà sản xuất cột sắc ký. Đặc biệt, trong pha dung dịch đệm nạp có sử dụng thêm muối NaCl có nồng độ 0,3M để tránh tương tác giữa các protein, việc ảnh hưởng cạnh trạnh của các protein lên quá trình liên kết của IgG với Protein G (do hình thành các protein có thể kết tụ).

3.1.1.1. Khảo sát pH của dung dịch đệm nạp. Đầu tiên mẫu được thêm vào cột và IgG trong mẫu sẽ được liên kết với phối tử (protein G) rồi được lưu giữ trên cột. Việc lựa chọn pH của dung dịch đệm nạp thích hợp sẽ tạo điều kiện liên kết bền vững giữa IgG và phối tử. Theo tài liệu liên quan, pH thích hợp của quá trình này có pH = 6 – 9, nên khoảng pH được lựa chọn khảo sát từ 6 đến 9. Để tạo được

- 21 -

dung dịch đệm có độ pH ổn định trong khoảng pH trên nên dung dịch đệm Na2HPO4 được lựa chọn.

Diện tích pic (µV.sec)

15000000.00 14570176.65 14230931.62 14000000.00 13727466.78

13696736.09

13000000.00 pH 6

pH 7

pH 8

pH 9

pH

Hình 3.1. Khảo sát pH dung dịch nạp Nhận xét: Qua kết quả trên ở pH = 7 có diện tích pic lớn nhất. Nhưng qua kết quả thì khi thay đổi pH diện tích pic có thay đổi nhưng không quá lớn, như vậy có thể thấy rằng liên kết giữa IgG với phối tử trong cột là khá bền trong khoảng pH 6 - 9. pH 7 đã được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo.

3.1.1.2.Khảo sát thể tích của dung dịch đệm nạp. Đệm nạp vừa tạo điều kiện giúp IgG liên kết với protein G và khi dung dịch chảy qua cột giúp loại bỏ các tạp chất có trong mẫu. Do để ổn định áp suất của cột, tạo điều kiện ổn định khi phân tích thì tốc dộ dòng là không đổi. Tốc độ dòng đã được khảo sát từ 0,3 mL/phút đến 1,0 mL/phút, do áp suất tối đa của cột là ≤ 3 bar thì tốc độ dòng tối ưu được chọn là 0,5 ml/phút.

Vì vậy quá trình thay đổi thể tích nạp cũng chính là thay đổi thời gian nạp của dung môi.

Cho nên khảo sát được xây dựng bằng cách thay đổi gradient, kéo dài thời gian dung dịch nạp qua cột. Thể tích nạp mẫu khảo sát là từ 2 đến 5 lần thể tích cột.

- 22 -

Diện tích pic (µV.sec)

14881629.32

14776319.95

14629713.13

Hình 3.2. Thể tích nạp

14605979.62

Thể tích nạp

Nhận xét: Qua kết quả trên thể tích tối ưu là 3ml. Phương pháp ổn định khi thay đổi thể tích nạp vì diện tích pic thay đổi không quá lớn khi thay đổi thời gian nạp mẫu. Nhưng qua quan sát hình dạng pic và đảm bảo mẫu được rửa sạch tạp thì nên chọn thể tích nạp là 3ml. Khi tăng thể tích nạp mẫu lên 4 và 5 mL, thì diện tích pic ổn định nhưng dẫn đến tăng thời gian phân tích và tốn nhiều dung môi.

3.1.1.3. Khảo sát pH của dung dịch rửa.

Khi quá trình nạp IgG lên cột đã tối ưu thì vấn đề quan tâm tiếp theo là việc rửa giải. Do liên kết giữa IgG và protein G bị phá vỡ khi giảm pH xuống thấp, cột Hitrap có thể sử dụng trong khoảng pH là từ 2,5 đến 9, nên để tối ưu, pH của dung dịch rửa đã được khảo sát từ 2,5 đến 4. Để có được sự ổn định của dung dịch đệm rửa, dụng đệm được sử dụng là acid amin glycine. Bản chất glycine chính là acid amin, có pKa= 2,37, thường được dùng đệm pH từ 2,2 -3,6.

- 23 -

Diện tích pic (µV.sec)

16000000

14580772.37

14000000

12985025.38

12000000 pH 2.5

pH 3

pH 4

pH

Hình 3.3. Khảo sát pH rửa Nhận xét: Kết quả chỉ thấy rõ tại pH =2,5 cho diện tích pic lớn nhất, đồng thời khi pH cao quá 3 thì liên kết giữa IgG và protein G không bị phá vỡ hoàn toàn Khi khảo sát pH ở 3; diện tích pic nhỏ hơn. Ngay sau mỗi lần phân tích ở pH cao (3 và 4), tiến hành rửa cột bằng việc tiêm dung môi không chứa chất phân tích và sử dụng pH rửa giải thấp là 2,5 thì ghi nhận có pic xuất hiện ở khoảng thời gian lưu của IgG. Nên có thể kết luận rằng dung môi rửa giải có pH lớn hơn hoặc bằng 3 thì không thể rửa giải hết được IgG. Vì vậy pH của dung dịch rửa giải được sửa dụng là 2,5 để tiếp tục các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 3.4. Sắc ký đồ rửa lại khi khảo sát pH =3

- 24 -

3.1.1.4. Khảo sát thể tích rửa giải Dù đã có pH =2,5 để phá hủy liên kết nhưng cần phải khảo sát thể tích tối ưu để rửa giải IgG trong quá trình phân tích

Diện tích pic (µV.sec)

13200000

13086194.91

13100000

13000000

12900000

13065858.12

12967885.39 12898874.84

12800000 5ml

6ml

7ml

8ml

Hình 3.5. Khảo sát thể tích rửa

Thể tích rửa

Nhận xét: Dù diện tích pic thay đổi không đáng kể, nhưng V = 7ml cho diện tích lớn nhất. Để tích kiệm thời gian thì thể tích rửa giải được giảm xuống, nhưng do tốc độ dòng là 0,5 ml/phút, và để đưa cột về pH thấp thì lại cần có thời gian thích hợp nên V = 7 ml là điều kiện tối ưu nhất.

3.1.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu.

3.1.2.1. Quy trình xử lý mẫu dự kiến.

Cân chính xác khoảng 2 g bột sữa cho vào ống ly tâm 50ml

Thêm dung dich NaCl 0,15M vừa đủ 10 g

- 25 -

Lắc ngang cho đến khi tan hoàn toàn (khoảng 60 phút)

Thêm dung dich tủa CH3COONa có pH= 2,95 vừa đủ 20 g

Ly tâm 6000 vòng/phút, 7 phút

Lọc dịch qua màng 0,45 µm, (bỏ dịch lọc đầu) vào vial 1,8 ml.

Qua tham khảo các nghiên cứu trước đây, việc loại bỏ casein, một protein chính trong sữa, là cần thiết do hàm lượng casein lớn có thể gây tắc cột, bẩn cột và cản trở sự hình thành liên kết giữa IgG và protein G trong cột. Casein có điểm đẳng điện là 4,6, nên khi đưa mẫu về pH đó thì casein và một số protein khác sẽ bị kết tủa và dễ dàng loại bỏ bằng việc ly tâm, trong khi IgG không bị kết tủa ở pH này. Sữa bột cũng chứa nhiều chất béo, và cách làm sạch mẫu một cách đơn giản là ly tâm ở nhiệt độ thấp, chất béo trong sữa sẽ bị kết tủa và nổi lên trên bề mặt dung dịch. Như vậy để loại bỏ casein, chất béo và các chất lơ lửng không tan trong mẫu sữa, thì pH của dung dịch mẫu cẩn được chỉnh tới khoảng 4,6 và ly tâm lạnh.

Vì sữa có pH trung tính nên lựa dung dịch tủa cần có pH thấp vì vậy đã sử dụng dung dịch CH3COONa có pH =2,95. Sau đó lọc lại bằng màng lọc 0,45 µm.

Khảo sát khối lượng cân mẫu.

Từ quy trình sơ bộ ban đầu, thì tỉ lệ pha loãng dịch chiết so với mẫu thực khá là quan trọng, giúp thay đổi được khoảng giá trị định lượng trên mẫu thực. Để khảo sát khối lượng cân, mẫu được lựa chọn có hàm lượng sữa non cao (để đảm bảo khối lượng cân phù hợp với toàn bộ mẫu thực), và cân với khối lượng tăng dần.

- 26 -

Bảng 3.1. Khảo sát khối lượng cân mẫu Khối lượng cân chính xác khoảng

pH của dịch khi

Tỉ lệ pha loãng

tủa casein

(g)

Hàm lượng IgG khi định lượng. (mg/g)

2

10.00

4,31

276,0

3

6,67

4,45

272,3

3,5

5,71

4,52

270,9

4

5,00

4,58

272,8

4,5

4,44

4,67

276,5

5

4,00

4,71

265,8

Nhận xét: Từ kết quả ta thấy không có sự sai khác hàm lượng khi khối lượng cân thay đổi . Nhưng có sự giảm đáng kể khi khối lượng cân m = 5 g, do pH của dung dịch khi cân lượng mẫu lớn cao hơn so với mức pH kết tủa của casein (pH từ 4,2 - 4,6) [23]. Vì vậy để đảm bảo cho quá trình định lượng, những mẫu sau nên cân với khối lượng khoảng 4 g (tỉ lệ pha loãng 5 lần).

Kết luận: Từ các khảo sát trên quy trình tối ưu của điều kiện xử lý mẫu Cân chính xác khoảng 4 g bột sữa cho vào ống ly tâm 50 ml

Thêm dung dịch NaCl 0,15M vừa đủ 10g

Lắc ngang cho đến khi tan hoàn toàn (khoảng 60 phút)

Thêm dung dịch tủa CH3COONa pH =2,95 vừa đủ 20 g

- 27 -

Ly tâm 6000 vòng/phút, 7 phút nhiệt độ 00C

Lọc dịch qua màng 0,45 µm, (bỏ dịch lọc đầu) vào vial 1,8 ml.

3.2. Thẩm định phương pháp xác định IgG bằng sắc ký lỏng Trên cơ sở phương pháp đã xây dựng ở trên, tiến hành thẩm định phương pháp với các thông số cơ bản sau: a. Độ đặc hiệu. b. Khoảng tuyến tính. c. LOD, LOQ. d. Độ lặp lại.

e. Độ thu hồi. f. Độ lặp lại khác ngày.

3.2.1. Độ đặc hiệu.

3.2.1.1. Phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn tại mức nồng độ 0,1 mg/g. Các mẫu được lặp lại n = 6.

Trắng

Chuẩn

Hình 3.6. Sắc ký đồ thể hiện tính đặc hiệu

- 28 -

Thêm chuẩn

Nhận xét: Mẫu trắng đều không cho pic của chất phân tích, mẫu thêm chuẩn và mẫu chuẩn đều cho pic của IgG chênh lệch không quá 2%, thời gian lưu là 11,7 phút. Vậy phương pháp có độ đặc hiệu với IgG.

3.2.1.2. Phổ hấp thụ của IgG

Hình 3.7. Phổ hấp thụ IgG trong nghiên cứu

Hình 3.9. Phổ hấp thụ ở nồng độ 0,5 mg/g

Hình 3.8. Phổ hấp thụ IgG [21]

Hình 3.10. Phổ hấp thụ ở nồng độ 1 mg/g

Nhận xét: IgG luôn có 1 cực đại hấp thụ ổn định trong những nồng độ khác nhau ở bức sóng λ = 277,4 nm. Phổ IgG phù hợp với các phổ IgG trong các nghiên cứu trước đó [21], [25], [30].

3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Tiến hành phân tích mẫu trắng thêm chuẩn với nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu chất phân tích. Phân tích lặp lại 6 lần. Tiến hành xác định tỉ lệ S/N tự động theo phần mềm - 29 -

của máy. Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó có S/N = 3. Giới hạn định lượng là giới hạn mà tại đó S/N = 10 hay LOQ = 3,3LOD.

Bảng 3.2. Tỉ lệ S/N ở nồng độ LOD 0,01mg/g

STT

Tên mẫu

S/N

1

LOD 0,01

4,31

2

LOD 0,01

3,36

3

LOD 0,01

3,3

4

LOD 0,01

3,97

5

LOD 0,01

3,27

6

LOD 0,01

3.32

Hình 3.11. Sắc ký đồ của nồng độ LOD 0,01 mg/g - 30 -

Kết luận: Vậy LOD = 0,01 mg/g. LOQ = 0,03 mg/g.

3.2.3. Khoảng tuyến tính.

Tiến hành thêm chuẩn vào mẫu trắng ở các mức nồng độ 0,03; 0,1; 0,5; 1; 3, 5 mg/g và phân tích trên HPLC/DAD. Xây dựng đường phụ thuộc giữa diện tích pic với nồng độ. Đường chuẩn được lập theo phần mềm của thiết bị.

Bảng 3.3. Độ chệch của các nồng độ chuẩn Nồng độ các STT

điểm chuẩn (mg/g)

Nồng độ tính Diện tích pic

theo đường

Độ chệch

(µV.sec)

chuẩn

(%)

(mg/g)

1

0,030

247779,96

0,0290

-3,257

2

0,030

254745,83

0,0295

-1,546

3

0,100

1075054,32

0,0899

-10,007

4

0,100

1071758,39

0,0897

-10,250

5

0,500

5825408,61

0,4400

-11,982

6

0,500

573406,66

0,4333

-13,328

7

1,000

14159613,68

1,0543

5,432

8

1,000

13488294,47

1,0048

0,484

9

3,000

43119071,64

3,1886

6,287

10

3,000

40980477,51

3,0310

1,033

11

5,000

66981541,44

4,9472

-1,055

12

5,000

66641228,97

4,9221

-1,556

- 31 -

80000000 y = 13,568,601.94x - 146,019.15 R² = 0.9986

Diện tích pic (µV.sec)

60000000

40000000

20000000

0 0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

Hình 3.12. Đồ thị khảo sát sự tuyến tính

4.5

5

5.5

Nồng độ (mg/g)

Kết luận: Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ này tín hiệu của các IgG tỉ lệ tuyến tính với nồng độ với R2 > 0,995 (R2 =0,998) với độ chệch < 15% với tất cả các giá trị.

3.2.4. Độ lặp lại và độ thu hồi Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp được đánh giá bằng cách phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các mức nồng độ khác nhau 0,05; 1; 3 mg/g, phân tích lặp lại 6 lần cho mỗi nồng độ.

Các kết quả tính độ lệch chuẩn tương đối và độ thu hồi được trình bày trong bảng

- 32 -

Bảng 3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi STT

0,05 mg/g

1mg/g

3mg/g

Spic

C (mg/g)

R%

234583

0,053

106,0

215915

0,052

104,0

217838

0,052

104,0

202469

0,051

102,0

225115

0,053

106,0

188369

0,050

100,0

11628716

0,950

95,0

11827677

0,963

96,3

11877158

0,967

96,7

12680779

1,010

101,4

12780974

0,980

98,0

12766307

0,957

95,7

38834180

3,065

102,17

39535600

3,119

103,97

39511088

3,117

103,9

38771354

3,060

102,0

39739980

3,135

104,5

38969373

3,075

102,5

Trung

SD

RSD %

0,051

0,00130

2,3

0,971

0,0215

2,2

3,095

0,0322

1,0

bình

Nhận xét: Các kết quả trên cho thấy các giá trị độ thu hồi nằm trong khoảng từ 94,8 – 106 % và độ lệch chuẩn tương đối từ 1,0 đến 3,7 %. Điều này cho thấy phương pháp có độ chính xác đáp ứng yêu cầu của AOAC. (với độ thu hồi từ 80 – 110% và độ lệch chuẩn tương đối ≤ 7,3%).

3.2.5. Độ lặp lại khác ngày

- 33 -

Thực hiện phân tích cùng một mẫu trắng, thêm chuẩn ở mức 1mg/g vào hai ngày khác nhau. Tính độ lặp lại khác ngày theo phương pháp trung bình bình phương độ lệch chuẩn.

Kết quả tính toán độ lặp lại khác ngày được trình bày trong bảng Bảng 3.5. Độ lặp lại khác ngày Ngày thực hiện

C (mg/g)

STT

Ngày 1

Ngày 2

1

1,016

0,972

2

1,027

1,028

3

1,019

1,013

4

0,980

1,026

5

0,971

1,023

6

0,970

0,996

Trung bình (mg/g)

1,003

SDr

0,0239

RSDr (%)

2,4

Nhận xét: Độ lặp khác ngày RSDr = 2,4% phù hợp với tiêu chuẩn cho phép của AOAC là ≤ 5,6%.

3.3. Sơ bộ đánh giá hàm lượng IgG trong sữa và thành phẩm từ sữa trên thị trường Việt Nam Qua phương pháp định lượng IgG bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao chúng tôi đã đánh giá sơ bộ các mẫu sữa trên thị trường.

Tất cả các mẫu đều là các mẫu sữa bột, có thành phần chủ yếu là sữa bò.

- 34 -

Bảng 3.6. Kết quả định lượng mẫu thực

STT

Tên mã hóa

Thời gian lưu (phút)

Diện tích pick (µV.sec)

Nồng độ trên dịch

Hàm lượng (mg/100g)

(mg/g) 1

1841

11,834

8523709

0,629

315

2

1836

11,838

2453922

0,185

92,5

3

1816

11,828

14359106

1,056

528

4

1818

11,822

1942024

0,147

73,5

5

1807

11,825

2541828

0,191

95,5

6

1856

11,817

4812110

0,357

179

7

1817

11,818

5965975

0,442

221

8

1839

11,824

2778931

0,208

104

9

1843

11,834

2584163

0,194

97,0

10

1813

11,835

496998

0,041

20,5

11

1815

11,849

492138

0,041

20,5

12

929

11,822

6940576

0,513

257

13

930

11,822

7013406

0,518

259

14

1851

11,839

472097

0,040

20,0

15

932

11,826

3228053

0,241

121

16

926

11,827

1521517

0,116

58,0

17

1003

11,832

1367894

0,105

52,5

- 35 -

Nhận xét: Phương pháp định lượng phù hợp với hàm lượng IgG trong các sản phẩm sữa lưu hành trên thị trường. Cho thấy hàm lượng IgG trong sản phẩm có sự khác nhau khá cao, thay đổi từ vài chục tới vài trăm mg/ 100 g. Đây là bước cải tiến trong quá trình kiểm nghiệm các sản phẩm sữa. Khả năng kiểm nghiệm nhanh chóng, quy trình mở rộng để thực hiện đồng thời nhiều mẫu thực, tiết kiệm thời gian cho đơn vị kiểm nghiệm.

3.4. Bàn luận Về đặc hiệu cho thấy sự ưu việt của phương pháp khi cột sử dụng là đặc hiệu đối với IgG, pic xuất hiện trong thời gian rửa giải chỉ có duy nhất IgG, loại bỏ hoàn toàn nhiễu từ các thành phần protein khác. Sự ổn định của phương pháp cũng đã được chỉ ra qua việc khảo sát thay đổi các điều kiện sắc ký.

Về định lượng thì thẩm định phương pháp đều cho thấy phù hợp với tiêu chuẩn của AOAC. Khoảng làm việc là 0,03 -5 mg/g trên dịch phù hợp với các mẫu cần phân tích.

Về quy trình xử lý mẫu đã cho thấy tối ưu cho việc tiết kiệm hóa chất, thời gian đơn giản hóa quá trình so với các phương pháp khác. Chỉ cần ly tâm và tủa casein là đã có dịch để phân tích. Quá trình phân tích sử dụng thiết bị HPLC, nên việc chạy hàng loạt mẫu là có khả thi so với phương pháp miễn dich Elisa truyền thống.

Về mặt kinh tế, cột Hitrap Protein G hiện đang được sử dụng rộng và thương mại hóa, nên giá thành cũng không quá cao. Hơn nữa cột có tuổi thọ lên tới vài chục lần tiêm mẫu nên tiết kiệm hơn rất nhiều so với phương pháp miễn dịch Elisa đang ứng dụng rộng rãi hiện nay.

Mặc dù các kết quả định phù hợp với các mẫu thực thu thập nhưng cũng chưa so sánh với phương phổ biến hiện nay là Elisa, nên có tiêu chuẩn chung và so sánh kết quả định lượng giữa hai phương pháp này.

- 36 -

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận ❖ Đã xây dựng phương pháp định lượng IgG trong sữa và các sản phẩm từ sữa, với các điều kiện như sau: Điều kiện xử lý mẫu: - Sử dung dịch NaCl 0,15M làm dung môi hòa tan sữa.

- Sử dụng dung dịch CH3COONa có pH = 2,95 làm dung dịch tủa casein.

- Mẫu được ly tâm 6000 vòng / phút, ở 00C trong 7 phút.

- Khối lượng cân mẫu phù hợp là khoảng 4 g với tỉ lệ pha loãng 5 lần. Điều kiện phân tích bằng HPLC: - Cột Hitrap protein G 1ml, nhiệt độ cột 30 0C - Lựa chon dung dịch đêm nạp Na2HPO4 50mM có pH = 7 có thêm NaCl 0,3M để tránh kết tụ và ảnh hưởng của các protein khác, thể tích dung dịch đệm nạp là 3 ml.

- Lựa chọn dung dịch đệm rửa Glycine 50mM có pH = 2,5. thể tích rửa là 7 mL. - Thể tích tiêm mẫu 100µl, tốc độ dòng 0,5 ml/phút.

- Bước sóng phát hiện λ = 277,4 nm Đã thẩm định phương pháp định lương IgG trong sữa và sản phẩm sữa bằng HPLC với kết quả như sau.

- Phương pháp có tính chọn lọc, đặc hiệu đáp ứng yêu cầu.

- Giới hạn phát hiện là 0,01mg/g. Giới hạn định lượng là 0,03mg/g.

- Khoảng tuyến tính của phương pháp 0,03 mg/g - 5mg/g.

- Độ lặp lại của phương pháp tốt với độ lệch chuẩn tương đối < 3,7% - Độ thu hồi đạt được từ 95% đến 107% đáp ứng yêu cầu theo AOAC. - Độ tái lặp khác ngày là 2,39% đáp ứng với yêu cầu của AOAC là ≤ 5,6%. ❖ Đã áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng 17 mẫu sữa trên thị trường. Từ kết quả trên cho thấy phương pháp phù hợp để xác định hàm lượng IgG trong sữa và sản phẩm sữa.

- 37 -

Kiến nghị Áp dụng phương pháp để mở rộng định lượng cho các mẫu thực với số lượng lớn hơn không chỉ các mẫu từ sữa bò, mà còn các sản phẩm từ sữa khác như sữa dê, sữa cừu.

- 38 -

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: 1. Bộ Y Tế (2007), Hóa phân tích, tập 2, Nhà xuất bản y học, Hà Nội.tr 123-300.

2. Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.tr 10 - 59.

Tiếng anh 3. Abernethy G, Otter D, Arnold K, Austad J, Christiansen S, Ferreira I, Irvine F, Marsh C, Massom LR, Otter D, Pearce K, Stevens J, Szpylka J, Vyas P, Woollard D, Wu C. (2010), “Determination of Immunoglobulin G in Bovine Colostrum and Milk Powders, and in Dietary Supplements of Bovine Origin by Protein G Affinity Liquid Chromatography: Collaborative Study”, Journal of AOAC International 93, pp.622627.

4. Akita EM, Li-Chan ECY (1998), “Isolation of Bovine Immunoglobulin G Subclasses from Milk, Colostrum, and Whey Using Immobilized Egg Yolk Antibodies”, Journal of Dairy Science 81, pp.54-63.

5. Alastair Aitken, Michèle P. Learmonth (1996), The Protein Protocols Handbook, Humana Press, New Jersey.pp.753-755.

6. Andrews AT, Taylor MD, Owen AJ. (1985), “Rapid analysis of bovine milk proteins by fast protein liquid chromatography”, Journal of Chromatography A 348, pp.177-185.

7. Blakeslee.D, Rapacz.J, Butler.J.E.(1971), “Bovine immunoglobulin allotypes”, Journal of Dairy Science 54, pp.1319-1320.

8. Butler. J.E., Winter. A.J., Wagner.G.G. (1971), “Symposium: Bovine Immune System”, Journal of Dairy Science 54, pp.1309-1340.

9. David E.J. Copestake, Harvey E. Indyk, Don E. Otter. (2006), “Affinity Liquid Chromatography Method for the Quantification of Immunoglobulin G in Bovine Colostrum Powders”, Journal of AOAC International 86, pp.1249-1256.

- 39 -

10. Didier Levieux1, Annie Levieux, Halima El-Hatmi, Jean-Paul Rigaudie`re. (2006), “Immunochemical quantification of heat denaturation of camel (Camelus dromedarius) whey proteins”, Journal of Dairy Research 73, pp.1-9.

11. Dominguez E, Perez MD, Puyol P, Sanchez L, Calvo M (2001), “Effect of pH on antigen-binding activity of IgG from bovine colostrum upon heating”, Journal of Dairy Research 68, pp.511-518.

12. Francisco A. Bonilla. (2008), “Pharmacokinetics of Immunoglobulin Administered via Intravenous or Subcutaneous Routes”, Immunology and Allergy Clinics of North America 28, pp.803–819.

13. Falk Nimmerjahn, Jeffrey V. Ravetch. (2007), “FC-receptors are regulators of Immunity”, Advances in Immunology 96, pp.179-204.

14. S. L. Gelsinger, A. M. Smith, C. M. Jones, A. J. Heinrichs. (2015), “Technical note: Comparison of radial immunodiffusion and ELISA for quantification of bovine immunoglobulin G in colostrum and plasma”, Journal of Dairy Science 98, pp 1-6.

15. GE Healthcare (2007), Affinity Chromatography Principles and Methods. pp.1-154.

16. Hannu Korhonen1, P. Marnila and H. S. Gill. (2000), “Milk immunoglobulins and complement factors”, British Journal of Nutrition 84, pp.75-80.

17. Indyk HE, Filonzi EL, Gapper LW (2006), “Determination of minor proteins of bovine milk and colostrum by optical biosensor analysis’, Journal of AOAC International 89, pp.898 -902.

18. Leyton W. Gapper, David E. J. Copestake, Don E. Otter, Harvey E. Indyk, (2007), “Analysis of bovine immunoglobulin G in milk, colostrum and dietary supplements: A review”, Analytical and Bioanalytical Chemistry 389, pp.93-109.

19. Louise E. Bennett, William N. Charman, Desmond B. Williams, Susan A. Charman.

(1994), “Analysis of bovine immuglobulin G by capillary gel electrophoreis”, Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis 12, pp. 1103-1108.

20. Marjeta Urh, Dan Simpson, Kate Zhao. (2009), “Affinity Chromatography: General Methods”, Methods in Enzymology 463, pp.417-438.

- 40 -

21. Michaelidou A, Steijns J. (2006), “Nutritional and technological aspects of minor bioactive components in milk and whey: Growth factors, vitamins and nucleotides”, International Dairy Journal 16, pp.1421–1426.

22. Merin U, Bernstein S, van Creveld C, Yagil R, Gollop N (2001), “Camel (Camelus dromedarius) colostrum and milk composition during the lactation”, Milchwissenschaft 56, pp.70-74.

23. Mian bin Wul, Yin-jun Xu. (2009), “Isolation and Purification of Lactoferrin and Immunoglobulin G from Bovine Colostrum with Serial Cation-Anion Exchange Chromatography”, Biotechnology and Bioprocess Engineering 14, pp.155-160.

24. Normansell DE. (1987), “Human immunoglobulin subclasses”, Diagnostic and Clinical Immunology 5, pp.115-128.

25. Sameh Magdeldin, Annette Moser. (2012), “Affinity Chromatography: Principles and Applications”, In Tech, USA.pp.3-28.

26. G. C. Schild, Michele Henry-Aymard, H. G. Pereira. (1972), “A Quantitative, SingleRadial-Diffusion Test for Immunological Studies with Influenza Virus”, Journal of General Virology 16, pp.231-236.

27. Shimadzu, Introduction to HPLC, LC World Talk Special Issue Volume 1, Japan, pp.128.

28. Sindayikengera Séverin, Xia Wenshui. (2005), “Milk Biologically Active Components as Nutraceuticals: Review”, Critical Reviews in Food Science and Nutrition 45, pp.645– 656.

29. Robert Karlsson, Lars Fägerstam, Helena Nilshans, Björn Persson. (1993), “Analysis of active antibody concentration. Separation of affinity and concentration parameters”, Journal of Immunological Methods 166, pp.75-84.

30. Zafar Rasheed. (2008), “Hydroxyl radical damaged Immunoglobulin G in patients with rheumatoid arthritis: Biochemical and immunological studies”, Clinical biochemistry 41, pp.663-669.

- 41 -

PHỤ LỤC 1.Khảo sát pH dung dịch đệm nạp

pH dung dịch nạp=6

pH dung dịch nạp=7

pH dung dịch nạp=8

pH dung dịch nạp=9 - 42 -

2 Khảo sát thể tích dung dịch nạp

Thể tích nạp = 2ml

Thể tích nạp = 3ml

Thể tích nạp = 4ml

Thể tích nạp = 5ml

- 43 -

3.Khảo sát pH dung dịch đệm rửa

pH dung dịch rửa = 2.5

pH dung dịch rửa = 3

pH dung dịch rửa = 4

- 44 -

4.Khảo sát thể tích dung dịch đệm nạp

Thể thích rửa =5 ml

Thể thích rửa =6 ml

- 45 -

Thể thích rửa =7 ml

Thể thích rửa =8 ml

5. Mẫu thực

1841

1836 - 46 -

1816

1818

1807

1856

1817

1839

1843

1813 - 47 -

1815

930

929

1851

932

926

1003

- 48 -

6.Thông số chất chuẩn

- 49 -