Nghiên cứu định lượng saponin triterpenoid trong cao rau má bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao...

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

BÙI THỊ THẢO

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG

SAPONIN TRITERPENOID TRONG

CAO RAU MÁ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI – 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

BÙI THỊ THẢO

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG

SAPONIN TRITERPENOID TRONG

CAO RAU MÁ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU-DƢỢC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Đỗ Quyên TS. Hà Vân Oanh

HÀ NỘI - 2018

LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ các thầy cô giáo cùng đồng nghiệp, cơ quan, gia đình và bạn bè.

Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Đỗ Quyên, TS. Hà Vân Oanh, Ths. Phạm Tuấn Anh những ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn, hết lòng chỉ bảo tận tình và động viên tôi trong suốt quá trình

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

học tập và nghiên cứu khoa học.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, Phòng sau đại học, các thầy cô giáo bộ môn Thực vật - Dƣợc liệu – Dƣợc cổ truyền – Đại học Dƣợc Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện và đóng góp ý kiến cho tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu.

Lời cuối cùng, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và đạt đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay.

Hà Nội, ngày 03 tháng 4 năm 2018 Học viên

Bùi Thị Thảo

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC BẢNG 1

Chƣơng 1: TỔNG QUAN

2

1.1. Tổng quan về cây Rau má (Centella asiatica (L.) Urb)

2

1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của cây Rau má

2

1.1.2. Thành phần hóa học

4

1.1.3. Tác dụng dược lý và công dụng của cây Rau má

6

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

ĐẶT VẤN ĐỀ

1.2. Tổng quan về các phƣơng pháp định lƣợng saponin triterpenoid

10

trong cây Rau má

1.2.1. Chuyên luận Rau má và phương pháp định lượng saponin

10

triterpenoid trong một số chuyên luận Dược điển 1.2.2. Các nghiên cứu khác

12

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

17

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

17

2.2. Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị

17

2.2.1. Chất chuẩn

17

2.2.2. Hóa chất

17

2.2.3. Thiết bị

17

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

18

2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng saponin triterpenoid trong cao

18

Rau má bằng HPLC 2.3.2. Thẩm định phương pháp định lượng saponin triterpenoid trong

19

cao Rau má bằng HPLC 2.3.3. Định lượng saponin triterpen trong một số mẫu cao Rau má

21

2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu

22

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

23

3.1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng saponin

23

triterpenoid trong cao Rau má bằng HPLC 3.1.1. Kết quả điều chế cao khô Rau má

23

3.1.2. Triển khai các phương pháp định lượng saponin triterpenoid

24

trong cao Rau má bằng HPLC 3.1.3. Chương trình sắc ký định lượng saponin triterpenoid của cao Rau

33

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

má bằng HPLC

3.1.4. Thẩm định phương pháp định lượng saponin triterpenoid trong

34

cao Rau má bằng HPLC

3.2. Kết quả định lƣợng saponin triterpen trong một số mẫu cao Rau má

41

4. CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN

46

4.1. Về xây dựng chƣơng trình sắc ký

46

4.2. Về thẩm định phƣơng pháp

47

4.3. Về kết quả định lƣợng saponin triterpen trong một số mẫu cao Rau

48

má

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

49

A. KẾT LUẬN

49

B. ĐỀ XUẤT

50

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

STT

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Tên đầy đủ chữ viết tắt

1

ACN

2

As

3

AOAC DAD

4

DĐVN

5 6 7

8

9 10 11 12 13 14

Asymmetry factor: Hệ số đối xứng pic Association of Official Analytical Chemists: Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức Diode array detector: Detector mảng diod Dƣợc điển Việt Nam

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

3

Acetonitril

EP

EtOH

HPLC

HPTLC MeOH NXB

European Pharmacopoeia: Dƣợc điển Châu Âu Ethanol

High performance liquid chromatography: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

High performance thin layer chromatography: Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Methanol

Nhà xuất bản

R

Correlation coefficient: Hệ số tƣơng quan

Rs

Resolution: Độ phân giải

RP-HPLC % RSD

Reverse phase-HPLC: Sắc ký lỏng pha đảo % Relative standard deviation: % Độ lệch chuẩn tƣơng đối Standard deviation: Độ lệch chuẩn

15

SD

16

SKĐ

17

tr

Retention time: Thời gian lƣu

18

x

Giá trị trung bình

19

USP

20

UV-VIS

Sắc ký đồ

United States Pharmacopoeia: Dƣợc điển Mỹ Ultraviolet-Visible: Tử ngoại và khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Bảng 1.1

Tên bảng Các điều kiện định lƣợng saponin triterpenoid trong Rau má bằng HPLC

Bảng 3.1 Khối lƣợng cao Rau má

Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6

13, 14, 15 24

Thời gian lƣu và diên tích pic của mẫu chuẩn asiaticosid khi tiêm 6 lần lặp lại ở nồng độ 300µg/ml

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Bảng 3.2

Trang

35

Thời gian lƣu 6 chất của mẫu cao Rau má chuẩn khi tiêm 6 lần lặp lại ở nồng độ 5 mg/ml

35

Diện tích pic của cao Rau má chuẩn 6 chất của mẫu cao Rau má chuẩn khi tiêm 6 lần lặp lại ở nồng độ 5 mg/ml

36

Tổng diện tích pic saponin triterpenoid và hàm lƣợng saponin triterpenoid tính theo asiaticosid của 6 mẫu thử CRM-96

38

Tổng diện tích pic saponin triterpenoid và hàm lƣợng saponin triterpenoid tính theo asiaticosid của 12 mẫu thử CRM-96

Bảng 3.7 Nồng độ của 6 mẫu thử thêm chuẩn

40 41

Hàm lƣợng saponin triterpenoid toàn phần, hàm lƣợng saponin

Bảng 3.8 glycosid và hàm lƣợng saponin aglycon trong các mẫu cao Rau má

42, 43

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT

Tên hình

Trang

Đặc điểm thực vật cây Rau má

3

Hình 1.2

Cấu trúc các saponin triterpenoid khung ursan trong Rau má

4

Hình 1.3

Cấu trúc saponin triterpenoid khung oleanan trong Rau má

5

Hình 3.1

Sắc ký đồ mẫu chuẩn asiaticosid theo chƣơng trình 1

25

Hình 3.2

Sắc ký đồ mẫu cao Rau má chuẩn theo chƣơng trình 1

25

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 1.1

Hình 3.3

Sắc ký đồ mẫu chuẩn asiaticosid theo chƣơng trình 2

27

Hình 3.4

Sắc ký đồ mẫu cao Rau má chuẩn theo chƣơng trình 2

27

Hình 3.5

Sắc ký đồ mẫu chuẩn asiaticosid theo chƣơng trình 3

29

Hình 3.6

Sắc ký đồ mẫu cao Rau má chuẩn theo chƣơng trình 3

29

Hình 3.7

Sắc ký đồ mẫu chuẩn asiaticosid theo chƣơng trình 4

30

Hình 3.8

Sắc ký đồ mẫu cao Rau má chuẩn theo chƣơng trình 4

30

Sắc ký đồ của các mẫu cao: CRM-30; CRM-70; cao Rau má

Hình 3.9

chuẩn; CRM-96 theo chƣơng trình 4

32

Sắc ký đồ các mẫu cao Rau má chuẩn; mẫu CRM-96; mẫu

Hình 3.10

chuẩn asiaticosid; mẫu trắng

37

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan giữa nồng độ và diện tích pic

38

Hình 3.12 Sắc ký đồ của 6 mẫu thử CRM-96

38

ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Rau má (Centella asiatica (L.) Urban) là một loại cây mọc nhiều ở nƣớc ta, đƣợc ngƣời dân sử dụng làm rau để ăn hoặc dùng tƣơi, xay lấy nƣớc uống để giải nhiệt, giải độc [4] ngoài ra Rau má còn đƣợc giã nát, đắp ngoài làm tan các vết bầm tím do ngã, làm tan ung nhọt [1]. Thành phần hóa học của cây Rau má đã đƣợc nghiên cứu gồm các nhóm chất nhƣ: saponin, flavonoid, tinh dầu …[29]. Trong đó, saponin triterpenoid là thành phần chính, và là nhóm chất chính có hoạt tính sinh học của cây Rau má nhƣ làm lành vết thƣơng, vết bỏng

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

[13] ; chống oxi hóa [28], chống trầm cảm trên thực nghiệm [66], [67]…

Hiện nay, một số sản phẩm nhƣ kem bôi liền sẹo Madecassol®, Vicenla®, hay viên nang Helaf® hỗ trợ điều trị trĩ, táo bón và kiết lỵ đang đƣợc lƣu hành trên thị trƣờng có thành phần chính là cao Rau má. Tuy nhiên, Dƣợc điển Việt Nam V [2] trong chuyên luận Rau má chƣa có chỉ tiêu định lƣợng nhóm chất saponin triterpenoid. Để góp phần đảm bảo chất lƣợng các chế phẩm thuốc từ dƣợc liệu nói chung và cao Rau má nói riêng, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu định lƣợng saponin triterpenoid trong cao Rau má bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với hai mục tiêu chính:

- Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng saponin triterpenoid trong cao Rau má bằng HPLC;

- Ứng dụng phƣơng pháp HPLC đã xây dựng để định lƣợng saponin triterpenoid trong một số mẫu cao Rau má.

1

Chƣơng 1.TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây Rau má (Centella asiatica (L.) Urb) 1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của cây Rau má Vị trí cây Rau má trong hệ thống phân loại thực vật Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [58], cây Rau má thuộc chi Centella (L.) Urban, một chi nằm trong họ Hoa tán (Apiaceae). Vị trí phân loại của loài Centella asiatica (L.) Urb trong hệ thống phân loại thực vật có thể tóm tắt nhƣ sau:

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Thù du (Cornidae)

Bộ Nhân sâm (Hoa tán) (Apiales) Họ Hoa tán (Apiaceae) Chi Centella (L.) Urban

Theo Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ [3], chi Centella (L.) Urban ở Việt Nam chỉ có 1 loài, C. asiatica, trong khi đó chi Centella (L.) Urban trên thế giới có hơn 50 loài theo The plant list đã đƣợc công nhận [60]. Đặc điểm thực vật

Cây thảo nhỏ, cao 7 – 10 cm. Thân mảnh, mọc bò, hơi có lông khi còn non, bén rễ ở các mấu. Lá mọc so le, nhƣng thƣờng tụ họp 2 – 5 cái ở một mấu, phiến lá nhẵn, hình thận hoặc gần tròn, mép khía tai bèo; cuống lá mảnh, dài 3 – 5 cm, có khi đến 7 – 8 cm [1], [4].

Cụm hoa gồm những tán đơn mọc riêng lẻ hoặc 2 – 5 cái ở kẽ lá, mỗi tán mang 1 – 5 hoa (thƣờng là 3) màu trắng hoặc phớt đỏ, hoa giữa không có cuống; tổng bao có 2 – 3 mảnh hình trái xoan, lõm, dạng màng; cánh hoa hình tam giác hoặc trái xoan; nhị có chỉ nhị ngắn, bao phấn hình mắt chim; bầu hình cầu [1], [4].

2

Quả màu nâu đen, đỉnh lõm, có 7- 9 cạnh lồi, nhẵn hoặc có lông nhỏ, có

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

vân mạng. Mùa hoa quả từ tháng 4 đến tháng 6 [1], [4].

Hình 1. Đặc điểm thực vật cây Rau má

Chú thích: 1. Toàn cây, 2. Hình thái lá, 3. Cách mọc của lá, 4. Hai mặt lá; 5. Cách mọc của cụm hoa, 6. Cụm hoa, 7. Hoa nguyên vẹn, 8. Tràng hoa, 9. Bầu và bộ nhị, 10.

Bầu cắt dọc, 11. Bầu cắt ngang.

Phân bố Chi Centella (L.) Urban phân bố tập trung ở vùng Bắc Phi, còn loài Centella asiatica (L.) chỉ thấy ở vùng nhiệt đới Nam và Đông Nam Á, các tỉnh Nam Trung Quốc bao gồm cả đảo Hải Nam [1], [4]. Ở Việt Nam, Rau má là loại cây rất quen thuộc. Cây mọc tự nhiên khắp nơi, từ vùng hải đảo, ven biển đến vùng núi, độ cao dƣới 1800 m. Ở một số nơi

3

thuộc vùng Nam và Đông Nam Á, Rau má phân bố đến độ cao 2500 m. Cây ƣa ẩm, hơi chịu bóng; thƣờng mọc thành đám ở vƣờn, bãi sông suối, nƣơng rẫy, bờ ruộng cao và ven rừng [1], [4].

1.1.2. Thành phần hóa học Thành phần hóa học của cây Rau má gồm saponin triterpenoid, alcaloid, flavonoid, tinh dầu, acid béo, các vitamin B, C và một số acid amin khác [1], [20], [29].

- Saponin triterpenoid: là thành phần chính và quan trọng nhất của Rau má

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

gồm các triterpenoid nhƣ asiaticosid, madecassosid, centellosid và các acid triterpenic là acid asiatic, acid madecassic, acid centellic, acid brahmic, isobrahmic …[20]. Trong số các saponin triterpenoid nêu trên, 6 hợp chất asiaticosid B - acid terminolic, madecassosid - acid madecassic, và asiaticosid acid asiatic là 3 cặp glycosid - aglycon tƣơng ứng là thành phần chính, chiếm đa số [8], [64].

Về cấu trúc các saponin triterpenoid trong Rau má có thể đƣợc chia thành 2 nhóm chính: cấu trúc ursan và oleanan.

Nhóm ursan gồm 4 saponin chính là asiaticosid, madecassosid, acid asiatic, và acid madecassic. Hai glycosid (asiaticosid, madecassosid) đều có 3 đơn vị đƣờng nối với phần aglycon bằng dây nối ester, không phải dây nối Oglycosid [20].

- Acid asiatic: R = H, R1 = OH - Acid madecassic: R = OH, R1 = OH - Asiaticosid: R = H, R1 = O – Glu (6→1) – Glu (4→1) - Rham - Madecassosid: R = OH, R1 = O – Glu (6→1) – Glu ( 4→1) - Rham

Hình 1.1. Cấu trúc các saponin triterpenoid khung ursan trong Rau má

4

Nhóm oleanan gồm 2 saponin chính là asiaticosid B và acid terminolic.

Hai chất này cũng là 1 cặp glycosid - aglycon tƣơng ứng.

- Acid terminolic: R = OH, R1 = OH - Asiaticosid B: R = OH, R1 = O - Glu

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

(6→1) – Glu (4→1) - Rham

Hình 1.2. Cấu trúc saponin triterpenoid khung oleanan trong Rau má - Flavonoid: bên cạnh nhóm chất chính saponin triterpenoid thì flavonoid cũng đƣợc tìm thấy nhiều trong Rau má. Các flavonoid này đa số ở dạng glycosid,

nhƣ

3-β

glucosylquercetin,

3-β

glucosylkaempferol,

7-

β-

glucosylkaempferol, có phần aglycon là các flavon [29].

- Tinh dầu: Theo Quin và cộng sự, thành phần tinh dầu của Rau má tƣơng tự nhƣ những loài thuộc chi Hydrocotyle (họ Apiaceae), trong đó caryophyllen, farnesol, và elemen là các cấu tử chính [49]

Năm 2002, nhóm nghiên cứu ngƣời Malaysia đã tiến hành cất kéo hơi nƣớc riêng rẽ các bộ phận lá, thân bò và rễ Rau má và phân tích GC-MS cho thấy cả ba mẫu thí nghiệm đều có tinh dầu với hàm lƣợng khác nhau. Tuy nhiên, trong khi rễ và thân bò chỉ phát hiện có thành phần sesquiterpen thì lá chứa cả monoterpen và diterpen. Các cấu tử chính trong cả ba mẫu nghiên cứu là βcaryophylen, α-humulen, (e)-b-farnesen, epi-bicyclosesquiphellandren, δcadinen, α-copaen và β-elemen [41].

Một nghiên cứu khác (2005) cho thấy mẫu Rau má mọc ở Nam Phi có hàm lƣợng tinh dầu chỉ đạt 0,06% (tt/tt), trong đó có 11 hydrocarbon monoterpenoid, 9 dẫn chất monoterpenoid oxi hóa, 15 hydrocarbon sesquiterpenoid, 5 dẫn chất sesquiterpenoid oxi hóa và 1 sesquiterpenoid sulfid. Các cấu tử chính trong tinh dầu là α-humulen, β-caryophyllen và bicyclogermacren [42].

5

Nhƣ vậy, qua các nghiên cứu về tinh dầu đƣợc thực hiện bởi nhiều tác giả khác nhau, mẫu thu hái ở các thời gian và địa điểm khác nhau thì kết quả đều cho thấy β-caryophyllen là thành phần chính luôn có mặt trong các bộ phận Rau má.

- Acid amin: trong Rau má có chứa một số acid amin nhƣ alanin, arginin, acid aspartic, acid glutamic…[1], [20].

- Ngoài ra Rau má còn có một số thành phần khác nhƣ alcaloid, tannin, sterol, phenolic, carbohydrat, vitamin, chất khoáng …[29], [64].

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1.1.3. Tác dụng dƣợc lý và công dụng của cây Rau má Tác dụng làm lành vết loét dạ dày

Dịch chiết rau má có tác dụng ngăn chặn ổ loét dạ dày ở chuột thí nghiệm bị stress do gò bó và hạ nhiệt [16] hoặc gây loét bằng tác nhân acid acetic [18].

Ngoài ra, Rau má còn có tác dụng tốt trong việc ngăn chặn tác hại của ethanol lên niêm mạc dạ dày thông qua tăng cƣờng hàng rào niêm mạc và giảm tác động gây hại của gốc tự do [17].

Thử nghiệm lâm sàng trên ngƣời lớn cho thấy 93 % ca loét dạ dày tá tràng đƣợc điều trị với chế phẩm từ rau má cho thấy hiệu quả rõ rệt. Thử nghiệm đƣợc tiến hành trên ngƣời lớn bình thƣờng cho thấy làm tăng số lƣợng hồng cầu và đƣờng máu, tăng nồng độ hemoglobin, cholesterol huyết tƣơng và protein toàn phần; giảm nồng độ ure và phosphat máu [16].

Tác dụng lên da và quá trình làm lành vết thương

Dịch chiết toàn phần và phân đoạn triterpenoid từ Rau má tác động lên nhiều giai đoạn khác nhau của quá trình khôi phục tổn thƣơng da. Nó có tác dụng tăng sinh tế bào, tăng quá trình tổng hợp, trƣởng thành và liên kết chéo của collagen và tăng biểu mô hóa tế bào và tạo mạch ở vị trí tổn thƣơng; qua đó có tác dụng thúc đẩy nhanh quá trình làm lành vết thƣơng [57], [59].

6

Chế phẩm kem từ dịch chiết ethanol Rau má đƣợc chứng minh có tác dụng cải thiện kết cấu da và tăng tái tạo da ở ngƣời cao tuổi. Thuốc cũng cải thiện triệu chứng ngứa và các rối loạn khác về da [57].

Thử nghiệm lâm sàng với chế phẩm kem chứa cao Rau má, α-tocopherol và collagen-elastin hydrolysat cho thấy chế phẩm giúp ngăn chặn sự phát triển của các vết rạn trên da ở phụ nữ mang thai có tiền sử rạn da ở lần mang thai trƣớc đó [59].

Tác dụng điều hòa miễn dịch, chống ung bướu và gây độc tế bào

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Một số nghiên cứu thử nghiệm trên chuột cho thấy Rau má và các thành phần hoạt tính của nó có tác dụng điều hòa miễn dịch rất tốt [46], [65].

Uống chế phẩm Brahma Rasayana có chứa Rau má làm tăng đáng kể số lƣợng tế bào máu, tế bào tủy xƣơng, tế bào NK trên chuột bị tiếp xúc với bức xạ gamma. Bên cạnh đó, thuốc còn làm giảm tác động của tia bức xạ gây ra sự peroxid hóa ở gan, mà cơ chế có thể là giúp tăng sinh tế bào gốc và ngăn chặn gốc tự do gây tổn thƣơng [32], [65].

Dịch chiết thô và các phân đoạn chiết từ Rau má có tác dụng làm chậm sự phát triển của các khối u rắn và cổ trƣớng do tác động trực tiếp lên quá trình tổng hợp DNA [10], điều hòa sản xuất yếu tố hoại tử khối u (TNF-α) và nitric oxid ở đại thực bào là yếu tố đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng viêm và chống viêm [45]; giúp tăng thời gian sống của chuột có khối u đang phát triển.

Nghiên cứu cho thấy dịch chiết nƣớc Rau má có tác dụng ngăn chặn quá trình sinh ung thƣ ruột kết [14]; hoạt chất acid asiatic có tác dụng chống ung thƣ da [43].

Tác dụng lên thần kinh trung ương Dịch chiết nƣớc từ Rau má có tác động tốt lên khả năng học tập, giúp tăng cƣờng trí nhớ và khả năng nhận thức trên chuột và trẻ em [40].

Rau má có tác dụng bảo vệ và phục hồi tế bào thần kinh thông qua thúc đẩy tái tạo dây thần kinh, làm dài sợi trục trên in vitro. Hoạt chất acid asiatic cũng

7

đƣợc chứng minh hiệu quả trong điều trị tổn thƣơng neuron do ngăn chặn sự oxi hóa tế bào thần kinh [33], [56].

Triterpenoid từ Rau má có tác dụng chống trầm cảm ở chuột bị ép bơi thông qua làm giảm nồng độ corticosteron huyết tƣơng, cải thiện sự mất thăng bằng acid amin và tăng hàm lƣợng chất dẫn truyền thần kinh monoamin trong não chuột [66], [67].

Một số nghiên cứu cho thấy Rau má, đặc biệt là phân đoạn saponin có tác dụng an thần và giảm đau trên chuột thí nghiệm; giảm hoạt động của dây thần

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

kinh vận động và tăng tác dụng của thuốc an thần gây ngủ barbiturat. Tác dụng của các hoạt chất trong rau má lên hệ thần kinh trung ƣơng giống với chlorpromazin và reserpin [37].

Cao khô dịch chiết methanol và ethyl acetat từ Rau má có tác dụng giải lo âu trên mô hình chữ thập nâng cao [33].

Tác dụng lên tim mạch

Rau má có tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim khỏi tác động của chất gây tổn thƣơng cơ tim (Adriamycin) [25] và cải thiện tình trạng tổn thƣơng tái tƣới máu và thiếu máu cục bộ cơ tim (nguyên nhân gây nhồi máu cơ tim) ở chuột thí nghiệm [44].

Thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng và mù đôi trên các bệnh nhân mắc chứng tăng huyết áp tĩnh mạch cho thấy rau má và các saponin từ Rau má giúp cải thiện tình trạng phù mắt cá chân, cải thiện vi tuần hoàn, tăng hiệu quả lọc ở mao mạch và tác dụng này phụ thuộc vào liều sử dụng [11], [15], [26].

Tác dụng bảo vệ gan Nghiên cứu in vitro cho thấy Rau má có tác dụng chống ung thƣ gan [34].

Phân đoạn glycosid từ rau má hiệu quả trong việc ngăn chặn tác nhân dimethylnitrosamin gây xơ gan ở chuột [38].

Thực tế trên lâm sàng đã sử dụng cao Rau má chuẩn hóa giúp cải thiện rối loạn chức năng gan mạn tính ở ngƣời [21].

8

Tác dụng chống viêm và chống oxi hóa Rau má và các hoạt chất saponin của nó thể hiện hoạt tính kháng viêm tốt trên thực nghiệm. Cơ chế kháng viêm đƣợc cho là do giảm sự sản sinh NO và ngăn chặn tác động của tia xạ có hại lên cơ thể, nhờ đó cũng giúp tổn thƣơng dễ dàng hồi phục [35].

Tác dụng chống oxi hóa của Rau má đƣợc nghiên cứu trên các mô hình khác nhau. Dịch chiết methanol Rau má thể hiện tác dụng chống oxi hóa trên chuột có khối u lympho [28]. Dịch chiết còn cho thấy hoạt tính bảo vệ tế bào quả.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

thần kinh chuột khỏi các tổn thƣơng oxy hóa gây nên, giúp chống lão hóa hiệu Ngoài ra, Rau má còn sở hữu rất nhiều tác dụng dƣợc lý khác đã đƣợc chứng minh thông qua các thử nghiệm in vitro và in vivo nhƣ tác dụng tăng đồng hóa, chống lao và phong, chống vảy nến, chống giun sán và đơn bào, chống virus, chống co thắt, chống sinh sản quá nhanh ở chuột [7], [52], [53], [69].

Công dụng

Hầu hết các tác dụng của Rau má đều đƣợc ứng dụng để chữa bệnh. Hiện nay loại cây thảo quý này đƣợc dùng cả theo phƣơng pháp Y học dân gian và Y học hiện đại.

Nhân dân ta dùng Rau má làm rau sống để ăn. Nƣớc rau má là loại nƣớc giải khát phổ biến ở các tỉnh phía Nam. Hay dùng tƣơi, xay với nƣớc, lọc lấy dịch ép thêm đƣờng để uống, ngày dùng 30-40g [1], [4].

Trong Y học dân gian ở các nƣớc trên thế giới, Rau má đƣợc dùng rộng rãi làm thuốc chữa các bệnh ngoài da nhƣ rôm sảy, mẩn ngứa, làm thuốc liền sẹo; đắp ngoài chữa các vết thƣơng do ngã, gãy xƣơng, bong gân và làm tan ung nhọt. Rau má còn đƣợc sử dụng đơn lẻ hay phối hợp với các vị thuốc khác theo đƣờng toàn thân, chữa các bệnh về gan, chữa loét dạ dày, sốt, cảm mạo, đau đầu, thổ huyết, kiết lỵ, viêm amidan, viêm phế quản và viêm đƣờng tiết niệu [1], [4].

Một số nƣớc nhƣ Trung Quốc, Ấn Độ dùng Rau má làm thuốc bổ thần kinh.

9

Trong công nghệ dƣợc phẩm, Rau má đƣợc chiết xuất bào chế thành cao định chuẩn, có hàm lƣợng hoạt chất xác định (saponin triterpenoid tính theo asiaticosid) làm nguyên liệu bán thành phẩm.

Một số dạng chế phẩm chứa cao Rau má đang lƣu hành hiện nay - Kem chống lão hóa - Kem dƣỡng da làm lành vết sẹo - Dầu gội để điều trị tóc hƣ - Nƣớc uống rau má và chè thanh nhiệt

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

- Gotu kola herb 435 mg: Tăng cƣờng hệ miễn dịch góp vai trò chuyển hóa tốt cho cơ thể giúp giảm acid uric, rối loạn lipid máu. Tăng cƣờng dƣỡng chất cho não, trung hòa các gốc tự do, bảo vệ và chống lão hóa cho tế bào thần kinh não. Giúp thanh nhiệt giải độc, giải độc gan, giúp dƣỡng âm.

1.2. Tổng quan về các phương pháp định lượng saponin triterpenoid trong cây Rau má

Các phƣơng pháp đã đƣợc triển khai để định lƣợng saponin triterpenoid, thành phần hoạt chất chính của cây Rau má, bao gồm các phƣơng pháp so màu, quang phổ, sắc ký lỏng. Trong đó sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến nhất để định lƣợng saponin triterpenoid trong cây Rau má, có thể xác định hàm lƣợng đơn thành phần là asiaticosid hay acid asiatic, hoặc định lƣợng đồng thời đa thành phần 2, 3 hoặc 4 chất asiaticosid, madecassosid, acid asiatic, acid madecasic trong cùng một phép thử.

1.2.1. Chuyên luận Rau má và phương pháp định lượng saponin triterpenoid trong một số chuyên luận Dược điển Chuyên luận Rau má trong Dƣợc điển Việt Nam V [2] quy định dƣợc liệu là toàn cây tƣơi hoặc phơi khô của cây rau má (Centella asiatica (L.) Urban).

Về chỉ tiêu định lƣợng, Dƣợc điển Việt Nam V mới chỉ xác định chất chiết đƣợc trong dƣợc liệu bằng phƣơng pháp cân, chƣa xác định đƣợc hàm lƣợng saponin triterpenoid toàn phần trong Rau má.

10

Dƣợc điển Trung Quốc [19] có chuyên luận về dƣợc liệu Rau má, quy định dƣợc liệu là toàn bộ cây phơi khô của cây Rau má (Centella asiatica (L.) Urban). Hàm lƣợng saponin triterpenoid của Rau má đƣợc tính theo hàm lƣợng của madecassosid và asiaticosid, yêu cầu ≥ 0,8 % (tính theo dƣợc liệu khô tuyệt đối), xác định hàm lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC với pha động là ACN : H2O (chứa 2 µmol/l β-cyclodextrin), chƣơng trình đẳng dòng theo tỉ lệ [24 : 76], detector UV, bƣớc sóng 205 nm.

Chuyên luận Rau má của Dƣợc điển Châu Âu (EP 8.0) [22], quy định

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

dƣợc liệu Rau má là phần trên mặt đất, phơi khô của cây Rau má (Centella asiatica (L.) Urban). Yêu cầu về hàm lƣợng saponin triterpenoid toàn phần đƣợc tính theo asiaticosid, gồm 4 chất: madecassosid, asiaticosid, acid madecassic, acid asiatic, với hàm lƣợng saponin triterpenoid toàn phần ≥ 6 %.

Sử dụng HPLC với pha tĩnh là cột sắc ký ODS, thành phần pha động gồm có kênh A (ACN) và kênh B (H3PO4 0,3 %), gradient nồng độ. Tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm 10 µl, detector UV, λ = 200 nm.

Thời gian (phút)

0 – 65

65 – 66

66 – 76

76 – 85

22

55

95

22

Kênh A (%)

Năm 2017, chuyên luận Rau má của Dƣợc điển Châu Âu (EP 9.0) [ 23] đã thay đổi so với EP 8.0, vẫn quy định hàm lƣợng saponin triterpenoid của cây Rau má ≥ 6 % tuy nhiên, bên cạnh 4 chất đã nêu trong chuyên luận EP 8.0, thì có thêm 2 chất là 1 cặp glycosid và aglycon tƣơng ứng asiaticosid B – acid terminolic đƣợc tính thêm vào hàm lƣợng saponin triterpenoid. Về cơ bản điều kiện sắc ký HPLC giống với chuyên luận của EP 8.0, chỉ khác về chƣơng trình pha động, cụ thể nhƣ sau: Thời gian (phút)

0 – 65

65 – 66

66 – 75

Kênh A (%)

22 – 55

55 – 95

95

Dƣợc điển Mỹ (USP 38) [62] có chuyên luận dƣợc liệu Rau má, bên cạnh đó cũng có chuyên luận về cao Rau má (Powdered Centella asitica L. Extract).

11

Điều kiện sắc ký để xác định hàm lƣợng saponin triterpenoid quy định trong Dƣợc điển Mỹ và Châu Âu tƣơng đối giống nhau, chỉ khác một chút chƣơng trình gradient nồng độ. Tuy nhiên, Dƣợc điển Mỹ chỉ yêu cầu hàm lƣợng saponin triterpenoid trong cao Rau má ≥ 2 %.

Thời gian (phút)

0 – 65

65 – 66

66 – 76

76 – 85

Kênh A (%)

22 – 55

55 – 95

95

22

Nhận xét: Quy định về hàm lƣợng saponin triterpenoid của cây Rau má có sự khác

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

biệt giữa các Dƣợc điển Trung Quốc, Châu Âu và Mỹ. Trong đó, Dƣợc điển Châu Âu (EP 9.0) quy định hàm lƣợng saponin triterpenoid cao nhất ≥ 6 %.

Trong khi đó, Dƣợc điển Trung Quốc yêu cầu hàm lƣợng saponin triterpenoid ≥ 0,8 % và hàm lƣợng đƣợc tính theo 2 saponin glycosid là asiaticosid và madecassosid.

1.2.2. Các nghiên cứu khác

Hiện trên thế giới có nhiều nghiên cứu định lƣợng saponin triterpenoid trong cây Rau má bằng HPLC. Phần lớn các nghiên cứu thực hiện phân tích trên cột C18, một số ít nghiên cứu trên cột C8, không có nghiên cứu nào sử dụng cột phenylsilyl silica gel. Hệ dung môi pha động thay đổi từ acetonitril và nƣớc/ dung dịch acid hoặc methanol và nƣớc với các tỷ lệ khác nhau. Bƣớc sóng phát hiện đa số là khoảng từ 200 nm – 210 nm.

Các nghiên cứu xác định hàm lƣợng saponin triterpenoid trong cây Rau má bằng HPLC, đơn thành phần hoặc đồng thời đa thành phần đƣợc tóm tắt ở bảng 1.1

12

Bảng 1.1. Các điều kiện định lƣợng saponin triterpenoid trong Rau má bằng HPLC Loại mẫu

Pha tĩnh

1.

Dƣợc liệu Rau má

HiQ siL KYA -C18

2.

Dƣợc liệu Rau má

3.

Dƣợc liệu Rau má

4.

Dƣợc liệu Rau má

5.

6.

Dƣợc liệu Rau má

(250  4,6mm, 5µm)

Tốc độ dòng (ml/phút)

ACN : H2O với % ACN ở 0 - 30 - 35 - 50 phút là 20 - 55 - 55 – 20 %

LiChrospher 18e (150 x 4mm, 5µm)

EtOH:H2O [6 : 4]

CLC-ODS (M) (250 x 4,6mm, 5µm)

MeOH : H2O (1% TFA) [75 : 25] và [70 : 30] và [65 : 35]

X-Terra® RP-18

(150  4,6mm, 5µm)

Phenomenex RP-

C18(250  4,6mm, 5µm) Dƣợc liệu Rau má

Pha động

Detector, bƣớc sóng phát hiện

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

STT

Zorbax Eclipse XDB (150 x 4,6mm, 5µm)

MeOH : ACN : H2O [5 : 57 : 38]

MeOH : H2O với % MeOH ở 0 - 8 - 12 - 18 - 20 - 25 phút là 85 - 85 - 100 - 100 85 – 85 %

MeOH : ACN với % MeOH ở 0 - 30 phút là 80 – 45 %

13

Hoạt chất định lƣợng

TLTK

[70]

1

ELSD

1

UV 254 nm

1

UV 220 nm

1

UV 217 nm

asiaticosid [36] asiaticosid [63] asiaticosid

acid asiatic

[61]

[54]

1

PDA 205 nm

acid asiatic

1

DAD 206 nm

asiaticosid; acid asiatic

[12]

Loại mẫu

Pha tĩnh

Pha động

7.

Dƣợc liệu Rau má

Optimapak C18 (250 x 4,6mm, 5µm)

8.

Dƣợc liệu Rau má

9.

Dƣợc liệu Rau má

10.

11.

12.

Dƣợc liệu Rau má

Dƣợc liệu Rau má

Dƣợc liệu Rau má

Tốc độ dòng (ml/phút)

Detector, bƣớc sóng phát hiện

ACN : H2O với % ACN ở 030-35-40 phút là 20-55-5520 %

1,4

UV

asiaticosid; acid asiatic

C18 (200 x 50mm, 5 µm)

MeOH : H2O [60 : 40]

100

UV 220 nm

asiaticosid; madecassosid

Agilent Zorbax SB-C18 (150 x 4mm, 5µm)

MeOH : H2O [50 : 50], (4 mmmol/L β-cyclodextrin)

0,4

UV 204 nm

asiaticosid B; madecassosid

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

STT

Agilent Zorbax SB-C18 (150 x 4mm, 5µm)

MeOH : H2O [65 : 35], (4 mmmol/L β-cyclodextrin)

COSMOSIL 5C18-MS-II

H2O (0,01 % acid trifluoroacetic) và acetonitril (1,0 % methyl tert-butyl ether, 0,01 % acid trifluoroacetic) [78 : 22]

ZORBAX Eclipse XDB (150  4,6mm, 5µm)

ACN : H2O (1mmol/L KH2PO4) (gradient)

14

0,4

1

1

Hoạt chất định lƣợng

TLTK

[31] [24]

[30] UV 204 nm

acid madecassic; acid terminolic

ELSD

asiaticosid, madecassosid, asiaticosid B

[71]

205 nm

asiaticosid, madecassosid, acid asiatic, acid madecassosic

[55]

STT

Loại mẫu

Pha tĩnh

Pha động

Tốc độ dòng (ml/phút)

Detector, bƣớc sóng phát hiện

ACN : H2O với % ACN ở 0-5-10-20-30 phút là 20-30-65-70 %

1

UV 210 nm

Dƣợc liệu Rau má

TSK-gel ODS-80Tm

14.

Dƣợc liệu Rau má

LiChroCART® (250 x 4mm, 5µm)

ACN : H2O với % ACN ở 0-15-30-35-40-45-55 phút là 20-35-65-80-80-20-20 %

1

UV 206 nm

15.

Dƣợc liệu Rau má

Fused-Core® C18 (100 x 3mm, 2,7 µm)

ACN : acid formic 0,1 % với % ACN ở 0-8-17-23 phút là 18-22-45-80 %

0,64

DAD

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

13.

(150  4,6mm, 5µm)

15

Hoạt chất định lƣợng asiaticosid, madecassosid, acid asiatic acid madecassosic asiaticosid, madecassosid, acid asiatic, acid madecassosic asiaticosid, madecassosid, acid asiatic, acid madecassosic

TLTK

[47]

[50]

[51]

Nhận xét: từ Bảng 1.1 và tham khảo chuyên luận về Rau má trong Dƣợc điển của một số nƣớc, chúng tôi nhận thấy để định lƣợng saponin triterpenoid trong cây Rau má bằng phƣơng pháp HPLC, điều kiện sắc ký đƣợc sử dụng nhƣ sau: - Pha tĩnh: cột sắc ký C18. Kích thƣớc cột chủ yếu là 4,6 × 250 mm, với hạt nhồi có kích thƣớc 5 µm.

- Pha động: hệ dung môi thƣờng là ACN – H2O hoặc ACN – H3PO4 0,3 %, gradient nồng độ.

- Tốc độ dòng: tốc độ thƣờng sử dụng là 1ml/phút.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

- Detector: rất đa dạng có thể là detetor UV ở bƣớc sóng thấp (200 – 206 nm); detector DAD, phát hiện ở bƣớc sóng 200 nm.

Do vậy, chúng tôi cũng tiến hành khảo sát phƣơng pháp định lƣợng saponin triterpenoid trong cao Rau má với các điều kiện sắc ký tƣơng tự đã đƣợc áp dụng cho dƣợc liệu Rau má.

16

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Nguyên liệu nghiên cứu: gồm có + Mẫu cao khô tự điều chế: từ phần trên mặt đất (lá và thân bò) cây Rau má (Centella asiatica (L.) Urban), đƣợc thu hái ở Thái Bình vào tháng 9/2017. + Mẫu cao khô đang lƣu hành trên thị trƣờng: công ty A (mã số CRM-A) và công ty B (CRM-B).

2.2. Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

2.2.1. Chất chuẩn

- Chất chuẩn asiaticosid, độ tinh khiết đạt 88,1 % (ID: Y0001206, giấy chứng nhận chất chuẩn của Hội đồng Dƣợc điển Châu Âu).

- Cao Rau má chuẩn (Centella extract dry HRS), (ID: Y0001764, giấy chứng nhận chất chuẩn của Hội đồng Dƣợc điển Châu Âu).

2.2.2. Hóa chất

- Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (MeOH, ACN) của Merck.

- Dung dịch acid phosphoric (H3PO4) đặc (d=1,685 g/cm3) của Merck.

- Các dung môi, hóa chất dùng để xử lý mẫu (EtOH, MeOH) của Trung Quốc và đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (PA) - Nƣớc cất hai lần.

2.2.3. Thiết bị

- Hệ thống HPLC (Shimadzu, Nhật Bản): Gồm hệ 2 bơm LC-30AD, bộ tiêm mẫu tự động SIL-30AHT, detector DAD, phần mềm Labsolution để truy xuất hình ảnh và số liệu trên máy HPLC. - Cột Shim-pack GIST C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm); tiền cột Shim-pack GIST(G) - Cân phân tích Precisa XT 220A, độ chính xác 0,0001 g.

- Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng Wisd (Hàn Quốc).

17

- Bếp cách thủy (Memmert, WB – 14 LO).

- Bộ dụng cụ chiết hồi lƣu.

- Tủ sấy Shellab; tủ sấy chân không Binder (Đức) - Các dụng cụ khác: bình định mức 5 ml, 10ml, 20ml, 25ml; pipet; phễu lọc; ống đong; ống ly tâm; cốc có mỏ; đũa thủy tinh…

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng saponin triterpenoid trong cao Rau má bằng HPLC Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chuẩn:

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T



+ Chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 50 mg cao khô Rau má cho vào bình định mức 10ml, thêm khoảng 3ml methanol, lắc siêu âm khoảng 10 phút. Sau đó chuyển phần dung dịch vào ống ly tâm, đem ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút. Chuyển phần dịch ở trên vào bình định mức 10ml.

Phần cắn còn lại cho thêm 3ml MeOH và thực hiện lặp lại tƣơng tự nhƣ trên 2 lần nữa. Gộp toàn bộ phần dịch ở trên vào bình định mức 10ml, thêm vừa đủ tới vạch bằng methanol. Lọc qua màng lọc cellulose acetat 0,45µm đƣợc mẫu dùng làm mẫu phân tích.

+ Chuẩn bị các dung dịch chuẩn:

- Dung dịch chuẩn asiaticosid: Cân chính xác khoảng 5 mg chất chuẩn asiaticosid vào bình định mức 10ml, thêm vừa đủ MeOH tới vạch. Lọc qua màng lọc cellulose acetat 0,45µm đƣợc dung dịch chuẩn asiaticosid có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml.

- Dung dịch cao Rau má chuẩn: Tiến hành cân chính xác khoảng 50 mg cao Rau má chuẩn, hòa tan với 10 ml methanol. Tiến hành lọc qua màng lọc 0,45 µm thu đƣợc dung dịch cao chuẩn rau má có nồng độ khoảng 5 mg/ml. 

Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký + Tiến hành trên cột sắc ký C18. + Hệ dung môi pha động:

18

ACN – H2O với các tỷ lệ khác nhau ACN – dung dịch acid H3PO4 0,3 % với các tỷ lệ khác nhau Chỉ tiêu theo dõi: + Khả năng tách của asiaticosid B và madecassosid; giữa acid madecassic và acid terminolic. + Khả năng tách của các pic tritepenoid trong mẫu. +Thời gian lƣu của asiaticosid B, madecassosid, asiaticosid, acid madecassic, acid terminolic và acid asiatic.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

+ Độ phân giải giữa các pic.

2.3.2. Thẩm định phương pháp định lượng saponin triterpenoid trong cao Rau má bằng HPLC

Thẩm định phƣơng pháp HPLC đã đƣợc xây dựng với các chỉ tiêu: Độ phù hợp hệ thống sắc ký; độ đặc hiệu; đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính; độ đúng và độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian) của phƣơng pháp.  Độ phù hợp hệ thống sắc ký

Tiêm sắc ký lặp lại 6 lần của dung dịch chuẩn asiaticosid nồng độ 300 µg/ml và dung dịch cao Rau má chuẩn nồng độ 5 mg/ml. Tính toán độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD% diện tích pic và thời gian lƣu của asiaticosid B, madecassosid, asiaticosid, acid madecassic, acid terminolic, acid asiatic giữa các lần tiêm.

Yêu cầu: theo AOAC [6], tại mức hàm lƣợng hoạt chất >1 % thì RSDdiện tích píc

≤ 2,0 %, RSDthời gian lƣu ≤ 2,0 %

 Độ đặc hiệu Chuẩn bị các mẫu sau: - Mẫu trắng là dung môi methanol.

- Mẫu asiaticosid chuẩn pha trong methanol.

- Mẫu cao Rau má chuẩn pha trong methanol.

19

- Mẫu thử là dịch chiết đã đƣợc xử lý ở quy trình xử lý mẫu đƣợc lựa chọn.

Trên sắc ký đồ mẫu trắng phải không xuất hiện pic có thời gian lƣu tƣơng ứng với thời gian lƣu của mẫu chuẩn, thời gian lƣu của chất phân tích trong mẫu thử phải tƣơng đƣơng với thời gian lƣu của chất phân tích trong sắc ký đồ mẫu chuẩn  Khoảng tuyến tính và đường chuẩn Chuẩn bị một dãy 6 dung dịch chuẩn asiaticosid pha trong methanol có

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

nồng độ tăng dần từ 60 µg/ml đến 360 µg/ml.

Tiến hành sắc ký các mẫu. Xây dựng đƣờng chuẩn, phƣơng trình hồi quy và xác định hệ số tƣơng quan R. Yêu cầu: theo AOAC [6], hệ số tƣơng quan tuyến tính r2 ≥ 0,99.  Độ chính xác - Độ lặp lại

Tiến hành phân tích lặp lại độc lập 6 lần mẫu thử theo quy trình và điều kiện đã khảo sát. Tính kết quả hàm lƣợng saponin triterpen và xác định độ lặp lại của phƣơng pháp bằng cách tính độ lệch chuẩn tƣơng đối giữa các lần định lƣợng. Yêu cầu: theo AOAC [6], tại mức hàm lƣợng hoạt chất > 1 % thì RSD ≤ 1,5 %

- Độ chính xác trung gian

Tiến hành nhƣ phần độ lặp lại nhƣng khác ngày, khác ngƣời thực hiện. Độ chính xác trung gian của phƣơng pháp đƣợc đánh giá qua độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD của 12 lần thử. Yêu cầu: theo AOAC [6], tại mức hàm lƣợng hoạt chất > 1 % thì RSD ≤ 1,5 % (n=12)  Độ đúng của phƣơng pháp Độ đúng đƣợc xác định bằng cách thêm chuẩn vào mẫu thử sao cho nồng độ saponin triterpenoid vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát.

Tiến hành chuẩn bị các dung dịch sau:

20

- Dung dịch thử - Dung dịch thử thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử một lƣợng chính xác chuẩn bằng khoảng 40 % lƣợng saponin triterpenoid có trong mẫu thử, tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký theo điều kiện đã xây dựng. Tiến hành lặp lại thí nghiệm 6 lần.

Từ kết quả chạy sắc ký mẫu thử và mẫu thêm chuẩn sẽ tính đƣợc phần trăm độ thu hồi chất chuẩn so với lƣợng chuẩn thực tế đã thêm vào mẫu thử và tính đƣợc độ lệch chuẩn tƣơng đối của các giá trị này. Yêu cầu: theo AOAC [6],

%.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

tại mức hàm lƣợng hoạt chất > 1 % thì độ thu hồi đạt 97 % – 103 %; RSD < 2 2.3.3. Định lượng saponin triterpen trong một số mẫu cao Rau má Áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng và thẩm định, tiến hành định lƣợng saponin triterpen trong các mẫu cao CRM-N, CRM-30, CRM-70, CRM-96, CRM-A và CRM-B đã đƣợc chuẩn bị. Mỗi mẫu đƣợc tiến hành lặp lại 3 lần và tính hàm lƣợng saponin triterpenoid dựa vào kết quả trung bình của 3 lần định lƣợng này.

 Hàm lƣợng saponin triterpenoid trong cao Rau má tính theo asiaticosid: % saponin triterpenoid

[A1 + A2 ×1,017 + A3 ×1,017 + A4 ×0,526 + A5 × 0,526 + A6 × 0,509 ] × m2 × V1 × p [CT 1]

=

A × m1 × V2 × (100 - a)

 Hàm lƣợng saponin glycosid trong cao Rau má tính theo asiaticosid: % saponin glycosid

=

[A1 + A2 ×1,017 + A3 ×1,017] × m2 × V1 × p

[CT 2]

A × m1 × V2 × (100 - a)

 Hàm lƣợng saponin aglycon trong cao Rau má tính theo asiaticosid: % saponin triterpenoid

=

[A4 ×0,526 + A5 × 0,526 + A6 × 0,509 ] × m2 × V1× p A × m1 × V2 × (100 - a)

[CT 3]

A1

=

Diện tích pic của aisiaticosid trên SKĐ của mẫu thử (mAU.s)

A2

=

Diện tích pic của asiaticosid B trên SKĐ của mẫu thử (mAU.s)

21

=

Diện tích pic của madecassosidtrên SKĐ của mẫu thử (mAU.s)

A4

=

Diện tích pic của acid madecassic trên SKĐ của mẫu thử (mAU.s)

A5

=

Diện tích pic của acid terminolic trên SKĐ của mẫu thử (mAU.s)

A6

=

Diện tích pic của acid asiatic trên SKĐ của mẫu thử (mAU.s)

A

=

Diên tích pic của asiaticosid trên SKĐ của mẫu chuẩn (mAU.s)

m1

=

Khối lƣợng rau má (cao Rau má) dùng để pha mẫu thử (mg)

V1

=

Thể tích dung dịch methanol dùng để pha mẫu thử

m2

=

Khối lƣợng asiaticosid dùng để pha mẫu chuẩn (mg)

V2

=

Thể tích dung dịch methanol dùng để pha mẫu chuẩn

=

Độ tinh khiết của asiaticosid (88,1 %)

=

Độ ẩm của cao khô Rau má

=

Tỉ lệ khối lƣợng phân tử của asiaticosid B; madecassosid so với

p a 1,017

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

A3

asiaticosid

0,526

=

Tỉ lệ khối lƣợng phân tử của acid madecassic; acid terminolic so với asiaticosid

0,509

=

Tỉ lệ khối lƣợng phân tử của acid asiatic so với asiaticosid

2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm Microsoft Office Excel 2013 và phần mềm Microsoft Office Word 2013 để xử lý số liệu và trình bày kết quả.

22

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng saponin triterpenoid trong cao Rau má bằng HPLC 3.1.1. Kết quả điều chế cao khô Rau má Thực tế hiện nay có 2 loại cao Rau má đƣợc các công ty Dƣợc phẩm sản xuất. Nếu cao Rau má là nguyên liệu (bán thành phẩm) dùng cho các chế phẩm dùng ngoài, tác dụng tại chỗ với tác dụng liền sẹo thì thành phần hoạt chất có tác dụng sinh học là saponin triterpenoid đƣợc chiết xuất dƣới dạng aglycon. Nếu

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

cao Rau má dùng với mục đích dùng trong, saponin đƣợc chiết xuất ở dạng glycosid. Với định hƣớng xây dựng phƣơng pháp định lƣợng saponin triterpenoid của cây Rau má đạt đƣợc cả 2 mục tiêu trên, chúng tôi tiến hành điều chế cao Rau má với các dung môi nƣớc và ethanol với tỷ lệ khác nhau nhằm tạo đƣợc một chuỗi các mẫu cao Rau má đƣợc chiết xuất bằng dung môi có độ phân cực tăng dần.

Quy trình điều chế cao khô Rau má đƣợc tiến hành nhƣ sau: Cân 100 g bột dƣợc liệu (đã xác định hàm ẩm) vào bình cầu dung tích 500ml và thấm ẩm dƣợc liệu bằng dung môi chiết xuất. Thí nghiệm đƣợc thiết kế với 4 loại dung môi (1) Nƣớc, (2) EtOH 30º; (3) EtOH 70º và (4) EtOH 96º; cho dung môi chiết xuất ngập toàn bộ dƣợc liệu, cách bề mặt dƣợc liệu khoảng 2 cm và tiến hành chiết hồi lƣu với thời gian 60 phút. Sau đó, rút dịch chiết lần 1 và tiếp tục bổ sung dung môi chiết, tiến hành tƣơng tự lặp lại 2 lần nữa. Tập trung dịch chiết của từng lô dung môi, cất thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm đến hết dung môi. Cắn đƣợc sấy chân không (nhiệt độ khoảng 60ºC) cho đến khi hàm ẩm của các mẫu cao < 5 %.

23

Bảng 3.1. Khối lƣợng cao Rau má

TT

Ký hiệu

Dung môi

Khối lƣợng

chiết

dƣợc liệu (g)

Độ ẩm

Khối

dƣợc liệu

lƣợng cao

(%)

(g)

Tỷ lệ dƣợc liệu : cao

CRM-N

Nƣớc cất

101,02

7,85

12,16

8,3 : 1

2

CRM-30

EtOH 30º

100,15

7,85

9,22

10,8 : 1

3

CRM-70

EtOH 70º

101,44

7,85

6,73

15,1 : 1

4

CRM-96

EtOH 96º

100,03

7,85

5,70

17,5 : 1

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1

3.1.2. Khảo sát các phương pháp định lượng saponin triterpenoid trong cao Rau má bằng HPLC

Pha động là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến hiệu quả sắc ký, bao gồm sự ảnh hƣởng tới độ chọn lọc, thời gian lƣu, hiệu lực tách, độ phân giải, độ rộng của pic. Qua tham khảo các tài liệu cùng với điều kiện phòng thí nghiệm hiện có, nghiên cứu đƣợc tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao trên các mẫu: Dung dịch chuẩn asiaticosid và dung dịch cao định chuẩn Rau má (do Hội đồng Dƣợc điển Châu Âu cấp giấy chứng nhận chất chuẩn). Sau khi đã lựa chọn đƣợc điều kiện sắc ký phù hợp sẽ khảo sát trên các mẫu cao khô Rau má tự điều chế.

Chương trình sắc ký số 1: Thực hiện theo nghiên cứu của Rafamantanana M.H (2009) định lƣợng đồng thời các saponin triterpenoid của cây Rau má với các điều kiện cụ thể sau:  Cột sắc ký: cột C18 (250 nm x 4,6 mm; 5µm).  Nhiệt độ cột ở 25oC.  Hệ dung môi pha động gradient ACN – H2O.  Tốc độ dòng 1 ml/phút.  Bƣớc sóng phát hiện: 200 nm.  Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.

24

Dung môi pha động gradient ACN – H2O cụ thể nhƣ sau : ACN (%)

H2O (%)

0 – 15

20 – 35

80 – 65

15 –30

35 – 65

65 – 35

30 – 35

65 – 80

35 – 20

35 – 40

80

20

40 – 45

80 – 20

20 – 80

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Thời gian (phút)

Hình 3.1. Sắc ký đồ mẫu asiaticosid chuẩn theo chƣơng trình sắc ký số 1

Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu cao Rau má chuẩn theo chƣơng trình sắc ký số 1 (Ghi chú: 1 - asiaticosid B; 2 - madecassosid; 3 - asiaticosid; 4 - acid madecassic; 5 - acid terminolic; 6 - acid asiatic) Nhận xét: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn asiaticosid và cao Rau má chuẩn cho thấy pic asiaticosid ở cả 2 sắc ký đồ đều có thời gian lƣu trùng nhau t = 14,5 phút. Trên sắc ký đồ cũng thể hiện rõ 2 vùng tín hiệu: từ 11 – 15 phút là các 25

saponin glycosid gồm asiaticosid B, madecassosid và asiaticosid; từ 25 – 30 phút là các pic saponin aglycon, là các aglycon tƣơng ứng với 3 saponin glycosid theo thứ tự acid madecassic, acid terminolic, và acid asiatic. 6 pic này đƣợc xác định bằng cách (1) so sánh với asiaticosid chuẩn; (2) so sánh với sắc ký đồ của cao Rau má chuẩn; và (3) kiểm tra và so sánh độ hấp thụ cực đại của các pic có cùng khung cấu trúc triterpenoid.

Với các điều kiện sắc ký của chƣơng trình số 1 đã quan sát đƣợc 6 pic triterpenoid, tuy nhiên khả năng tách hay độ phân giải giữa cặp đồng phân

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

asiaticosid B; madecassosid (Rs = 0,566) và cặp đồng phân acid madecassic; acid terminolic (Rs= 0,892) còn thấp. Vì vậy chúng tôi khảo sát chƣơng trình 2, giữ nguyên thành phần pha động nhƣng thay đổi gradient nồng độ.

Chương trình sắc ký số 2: về cơ bản chƣơng trình sắc ký 2 giống chƣơng trình sắc ký số 1, thành phần pha động gồm ACN – H2O, chỉ thay đổi gradient nồng độ và kéo dài thời gian phân tích.

 Cột sắc ký: cột C18 (250 nm x 4,6 mm; 5µm).  Nhiệt độ cột ở 25oC.

 Hệ dung môi pha động gradient ACN – H2O.  Tốc độ dòng 1 ml/phút.

 Bƣớc sóng phát hiện: 200 nm.  Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.

Dung môi pha động gradient ACN – H2O cụ thể nhƣ sau:

26

ACN (%)

H2O (%)

0 – 15

18 – 22

82 – 78

15 – 30

22 – 45

78 – 55

30 – 35

45 – 20

55 – 80

35 – 40

20 – 82

80 –18

40 – 45

82 – 18

18 – 82

45 – 55

18

82

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Thời gian (phút)

Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu asiaticosid chuẩn theo chƣơng trình sắc ký số 2

Hình 3.4. Sắc ký đồ của mẫu cao rau má chuẩn theo chƣơng trình sắc ký số 2 Nhận xét: Sắc ký đồ của mẫu cao Rau má chuẩn ở chƣơng trình 2 cho thấy khả năng tách cặp đồng phân asiaticosid B và madecassosid đƣợc cải thiện

27

với độ phân giải Rs = 0,732, tuy nhiên đƣờng nền bị nhiễu mạnh, không quan sát đƣợc rõ 2 pic acid madecassic và acid terminolic.

Qua khảo sát 2 chƣơng trình sắc ký cùng với hệ dung môi pha động là ACN – H2O với gradient nồng độ và thời gian phân tích khác nhau cho thấy thành phần hệ dung môi pha động chƣa phù hợp để phân tích đồng thời 6 pic triterpenoid của Rau má. Hệ dung môi này có thể phù hợp để phân tích đơn thành phần hoặc 2 thành phần, nhƣ cặp asiaticosid và acid asiatic.

Tham khảo chuyên luận Rau má của Dƣợc điển Châu Âu sử dụng hệ pha

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

động ACN – H3PO4 0,3 % để định lƣợng saponin triterpenoid của cây Rau má (chƣa có chuyên luận cao Rau má), do vậy chúng tôi tiến hành khảo sát với hệ dung môi pha động gradient ACN – H3PO4 0,3 %.

Chương trình sắc ký số 3: theo chuyên luận Rau má của Dƣợc điển Châu Âu (9.0)

 Cột sắc ký: cột C18 (250 nm x 4,6 mm; 5µm).  Nhiệt độ cột ở 25oC.

 Hệ dung môi pha động gradient ACN – H3PO4 0,3 %.  Tốc độ dòng 1 ml/phút.

 Bƣớc sóng phát hiện: 200 nm.  Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.

Dung môi pha động gradient ACN – H3PO4 0,3 % cụ thể nhƣ sau: Thời gian (phút)

ACN (%)

H3PO4 0,3 % (%)

0 – 65

22 – 55

78 – 45

65 – 66

55 – 95

45 – 5

66 – 75

95

5

28

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu asiaticosid chuẩn theo chƣơng trình 3

Hình 3.6. Sắc ký đồ cao Rau má chuẩn theo chƣơng trình 3

Nhận xét: Sắc ký đồ của mẫu asiaticosid chuẩn và cao Rau má chuẩn khi sử dụng hệ dung môi pha động ACN – H3PO4 0,3 % cho thấy đƣờng nền không bị nhiễu, quan sát đƣợc 6 pic triterpenoid, trong đó 2 pic của 2 đồng phân acid madecassic và acid terminolic tách rõ, với hệ số phân giải Rs= 1,095, chỉ có cặp đồng phân asiaticosid B và madecassosid chƣa đƣợc cải thiện, độ phân giải Rs = 0,597 còn thấp.

Mặt khác, thời gian lƣu của 2 pic asiaticosid B và madecassosid là 10,5 phút, rửa giải sớm hơn so với thời gian lƣu của 2 pic tƣơng ứng khi khảo sát chƣơng sắc ký 1 và 2 (là 12 và 19 phút). Ngoài ra, quan sát trên sắc ký đồ khoảng thời gian từ 70 đến 75 phút, vẫn còn rất nhiều pic khác. Do vậy, chúng tôi khảo sát chƣơng trình 4 với điều kiện tƣơng tự nhƣ chƣơng trình 3, thêm thời gian đẳng dòng ban đầu để làm giảm tốc độ rửa giải, làm tăng khả năng tách 29

giữa asiaticosid B; madecassosid và kéo dài thêm thời gian phân tích với mục đích rửa giải hết các pic còn lại.

Chương trình sắc ký số 4: điều kiện sắc ký tƣơng tự nhƣ chƣơng trình 3, chỉ thay đổi nồng độ của hệ dung môi pha động và kéo dài thời gian phân tích.

ACN (%)

H3PO4 0,3 % (%)

0–5

22

78

5 – 70

22 – 55

78 – 45

70 – 71

55 – 95

45 – 5

71 – 80

95

5

80 – 85

95 – 22

5 – 78

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Thời gian (phút)

Hình 3.7. Sắc ký đồ mẫu asiaticosid chuẩn theo chƣơng trình sắc ký số 4

Hình 3.8. Sắc ký đồ cao rau má chuẩn theo chƣơng trình sắc ký số 4 Nhận xét: Sắc ký đồ của mẫu asiaticosid chuẩn và cao Rau má chuẩn ở điều kiện sắc ký của chƣơng trình 4 cho thấy khả năng tách hay độ phân giải của 30

2 saponin glycosid là asiaticosid B và madecassosid cải thiện rõ rệt Rs = 1,043; và 2 saponin aglycon là acid terminolic và acid madecassic là Rs = 1,508. Đồng thời, 6 pic triterpenoid thu đƣợc có độ cân xứng cao với hệ số đối xứng ~ 1. Vì vậy chúng tôi lựa chọn điều kiện sắc ký của chƣơng trình 4 là điều kiện sắc ký của phƣơng pháp định lƣợng saponin triterpenoid trong cao Rau má bằng HPLC. Áp dụng điều kiện sắc ký của chƣơng trình 4 khảo sát các mẫu cao CRM-

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

96; CRM-70; CRM-30 thu đƣợc các sắc ký đồ nhƣ hình sau:

31

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T Hình 3.9. Sắc ký đồ của các mẫu cao: CRM-30; CRM-70; cao Rau má chuẩn; CRM-96 theo chƣơng trình sắc ký số 4

32

Nhận xét: Theo chƣơng trình sắc ký đã lựa chọn, căn cứ vào sắc ký đồ của mẫu cao Rau má chuẩn quan sát trên sắc ký đồ của các mẫu cao CRM-30; CRM-70; CRM-96 đều xác định đƣợc 6 pic saponin triterpenoid và sắc ký đồ cũng thể hiện rõ hai vùng tín hiệu: từ 15 – 22 phút gồm các pic saponin glycosid theo thứ tự asiaticosid B, madecassosid và asiaticosid; từ 42 – 54 phút gồm các pic saponin aglycon theo thứ tự acid madecassic, acid terminolic và acid asiatic. Các pic trong các mẫu cao đều tách nhau khá rõ, đăc biệt các cặp đồng phân gồm asiaticosid B và madecassosid ; cặp đồng phân acid terminolic

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

và acid asiatic đều có độ phân giải Rs > 1. Chúng tôi lựa chọn mẫu CRM-96 là đối tƣợng để thẩm định phƣơng pháp xây dựng đƣợc.

3.1.3. Chương trình sắc ký định lượng saponin triterpenoid của cao Rau má bằng HPLC

+ Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chuẩn:

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 50 mg cao khô Rau má cho vào bình định mức 10ml, thêm khoảng 3ml methanol, lắc siêu âm khoảng 10 phút. Sau đó chuyển phần dung dịch vào ống ly tâm, đem ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút. Chuyển phần dịch ở trên vào bình định mức 10ml. Phần cắn còn lại cho thêm 3ml MeOH và thực hiện lặp lại tƣơng tự nhƣ trên 2 lần nữa. Gộp toàn bộ phần dịch ở trên vào bình định mức 10ml, thêm vừa đủ tới vạch bằng methanol. Lọc qua màng lọc cellulose acetat 0,45µm đƣợc mẫu dùng làm mẫu phân tích.

 Dung dịch asiaticosid chuẩn: Cân chính xác khoảng 5 mg chất chuẩn asiaticosid cho vào bình định mức 10 ml, hòa tan bằng methanol tới vạch. Lọc qua màng lọc cellulose acetat 0,45 µm đƣợc dung dịch chuẩn asiaticosid. Từ dung dịch chuẩn gốc pha các dung dịch chuẩn asiaticosid có nồng độ là 60 µg/ml, 120 µg/ml, 180 µg/ml, 240 µg/ml, 300 µg/ml, 360 µg/ml.  Dung dịch cao Rau má chuẩn: Tiến hành cân chính xác khoảng 50 mg cao Rau má chuẩn, hòa tan với 10 ml methanol. Tiến hành lọc qua màng lọc

33

cellulose acetat 0,45µm đƣợc dung dịch cao Rau má chuẩn có nồng độ khoảng 5 mg/ml. + Pha tĩnh: cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm). + Pha động: kênh A: ACN ; kênh B: H3PO4 0,3 % gradient nồng độ nhƣ sau: ACN (%)

H3PO4 0,3 % (%)

0–5

22

78

5 – 70

22 – 55

78 – 45

70 – 71

55 – 95

45 – 5

71 – 80

95

5

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Thời gian (phút)

80 – 85

95 – 22

5 – 78

+ Bƣớc sóng phát hiện: 200 nm. + Tốc độ dòng: 1 ml/phút. + Nhiệt độ cột: 25 oC.

+ Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.

3.1.4. Thẩm định phương pháp định lượng saponin triterpenoid trong cao Rau má bằng HPLC

 Độ phù hợp hệ thống

Tiêm sắc ký lặp lại 6 lần dung dịch cao Rau má chuẩn nồng độ 5 mg/ml và dung dịch chuẩn asiaticosid có nồng độ 300 μg/ml theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn ở mục 3.1.3. Ghi lại sắc ký đồ, xác định các thông số của pic chất phân tích, bao gồm diện tích pic và thời gian lƣu đƣợc thể hiện ở bảng 3.2, 3.3, 3.4.

34

Bảng 3.2. Thời gian lƣu và diện tích pic của mẫu chuẩn asiaticosid khi tiêm 6 lần lặp lại ở nồng độ 300 µg/ml Thời gian lƣu (phút)

Diện tích píc (mAU.s)

1

20,964

938361

2

20,973

938293

3

21,103

937332

4

20,980

939436

5

21,007

938275

6

21,020

939700

x

21,008

938566

0,243

0,084

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

STT

RSD (%)

Bảng 3.3. Thời gian lƣu 6 chất của mẫu cao Rau má chuẩn khi tiêm 6 lần lặp lại ở nồng độ 5 mg/ml

STT

Thời gian lƣu (phút)

1

2

3

4

5

6

15,726

16,117

20,965

43,429

44,062

53,428

15,788

16,175

21,019

43,530

44,162

53,526

15,791

16,182

21,022

43,511

44,143

53,448

15,792

16,182

21,028

43,489

44,121

53,502

Lần 5

15,788

16,178

21,019

43,500

44,131

53,499

Lần 6

15,776

16,166

21,008

43,490

44,122

53,493

15,777

16,167

21,010

43,492

44,124

53,483

0,162

0,155

0,110

0,079

0,077

0,069

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4

x RSD (%)

(Ghi chú: 1 - asiaticosid B; 2 - madecassosid; 3 - asiaticosid; 4 - acid madecassic; 5 - acid terminolic; 6 - acid asiatic)

35

Bảng 3.4. Diện tích pic của 6 chất của mẫu cao Rau má chuẩn khi tiêm 6 lần lặp lại ở nồng độ 5 mg/ml Diện tích píc (mAU.s)

STT

2

3

4

5

6

Lần 1

575805

587507

1368067

143589

203489

392217

Lần 2

574371

575034

1352997

142715

204840

393111

Lần 3

572594

584834

1370844

144946

205981

395263

Lần 4

572337

582783

1379900

142902

203116

397904

Lần 5

574659

579641

1361564

142812

203375

396173

Lần 6

579056

579242

1369322

143555

202942

393517

545112

540551

545744

545124

543037

544606

1,814

1,810

1,813

1,811

1,812

1,814

x

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1

RSD(%)

Nhận xét: Kết quả cho thấy các giá trị RSD của diện tích pic và thời gian lƣu đều nhỏ hơn 2 %, đạt theo tiêu chuẩn của AOAC [6]. Nhƣ vậy các điều kiện sắc ký đã chọn và hệ thống HPLC sử dụng là ổn định, phù hợp để phân tích định lƣợng saponin triterpenoid trong cao Rau má.  Độ đặc hiệu

Tiến hành sắc ký lần lƣợt 4 mẫu: mẫu asiaticosid chuẩn, mẫu cao Rau má chuẩn, mẫu thử CRM-96 và mẫu trắng (dung môi methanol) với chƣơng trình đã lựa chọn trong mục 3.1.3. Kết quả sắc ký đồ các mẫu cao Rau má chuẩn, mẫu CRM-96, mẫu chuẩn asiaticosid, mẫu trắng thể hiện ở hình 3.10.

36

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu cao Rau má chuẩn, mẫu CRM-96, mẫu chuẩn asiaticosid, mẫu trắng

Nhận xét:

Trên sắc ký đồ thu đƣợc cho thấy, thời gian lƣu của asiaticosid B, madecassosid, asiaticosid, acid madecassic, acid terminolic và acid asiatic ở mẫu cao Rau má chuẩn và mẫu thử (CRM-96) là tƣơng đƣơng nhau. Tại thời gian lƣu của asiaticosid ở mẫu cao Rau má chuẩn, dung dịch chuẩn asiaticosid và mẫu thử (CRM-96) đều cho tín hiệu chất phân tích. Tƣơng ứng các vị trí thời gian lƣu đó, trên sắc ký đồ mẫu trắng không cho tín hiệu chất phân tích, chứng tỏ phƣơng pháp và hệ thống sắc ký có tính đặc hiệu cao.  Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn asiaticosid có nồng độ tăng dần từ 60 µg/ml đến 360 µg/ml rồi tiến hành sắc ký mỗi nồng độ 3 lần với các điều kiện đã lựa chọn trong mục 3.1.3. Kết quả khảo sát sự tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ asiaticosid đƣợc trình bày trong hình 3.11.

37

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan giữa nồng độ và diện tích pic Nhận xét: Kết quả cho thấy, trong khoảng nồng độ của asiaticosid từ 60 µg/ml đến 360 µg/ml có sự tƣơng quan chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích píc với phƣơng trình hồi quy y = 3205,2x - 21441, hệ số tƣơng quan r2 = 0,9971.

Nhƣ vậy đƣờng chuẩn xây dựng đƣợc có độ tuyến tính cao đảm bảo để thực hiện phép phân tích định lƣợng saponin triterpenoid trong cao Rau má.  Độ chính xác -

Độ lặp lại

Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc tính dựa trên kết quả phân tích các mẫu độc lập trong cùng một điều kiện phân tích. Tiến hành định lƣợng 6 lần độc lập trên mẫu thử CRM-96 theo quy trình đã chọn. Tính kết quả hàm lƣợng saponin triterpenoid trong mẫu thử theo công thức [CT1] ở mục 2.3.3. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.5.

38

Bảng 3.5. Tổng diện tích pic saponin triterpenoid và hàm lƣợng saponin triterpenoid tính theo asiaticosid của 6 mẫu thử CRM-96

STT

Khối lƣợng (g)

Tổng diện tích pic

Hàm lƣợng saponin

saponin triterpenoid tính

triterpenoid tính theo

theo asiaticosid (mAU.s)

asiaticosid (%)

0,0531

1034651

5,249

2

0,0536

1040379

5,219

3

0,0526

1033536

5,283

4

0,0534

1041163

5,282

0,0524

1036715

5,320

0,0521

1037621

5,355

5 6

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1

Hàm lƣợng trung bình (%) (n=6)

5,284 ± 0,049

RSD (%) (n=6)

0,919

Hình 3.12. Sắc ký đồ của 6 mẫu thử CRM-96 Nhận xét: Theo AOAC [6], tại mức hàm lƣợng > 1 %, độ lặp lại của phƣơng pháp RSD < 1,5 %. Kết quả phân tích cho thấy, phƣơng pháp đã xây dựng có độ lặp lại tốt và đạt yêu cầu của AOAC.

39

- Độ chính xác trung gian Tiến hành nhƣ phần độ lặp lại nhƣng khác ngày, khác ngƣời thực hiện. Độ chính xác trung gian của phƣơng pháp đƣợc đánh giá qua độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD (%) của 12 lần thử.

Bảng 3.6. Tổng diện tích pic saponin triterpenoid và hàm lƣợng saponin triterpenoid tính theo asiaticosid của 12 mẫu thử CRM-96 Ngày 1 Khối

Tổng diện tích

Hàm lƣợng

Khối

Tổng diện tích

Hàm lƣợng

lƣợng

pic saponin

saponin

lƣợng

pic saponin

saponin

(g)

triterpenoid

triterpenoid

(g)

triterpenoid

triterpenoid

tính theo

tính theo

tính theo

tính theo

asiaticosid

asiaticosid

asiaticosid

asiaticosid

(mAU.s)

(%)

(mAU.s)

(%)

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

TT

Ngày 2

1

0,0531

1034651

5,249

0,0523

1018796

5,238

2

0,0536

1040379

5,219

0,0524

1020057

5,234

3

0,0526

1033536

5,285

0,0535

1039297

5,227

4

0,0534

1041163

5,282

0,0531

1038954

5,261

5

0,0524

1036715

5,320

0,0525

1048398

5,360

6

0,0521

1037621

5,355

0,0491

949567

5,200

Hàm lƣợng trung bình (n=6)

RSD(%) (n=6)

5,284 ± 0,049

Hàm lƣợng trung bình

0,919

(n=6)

RSD(%) (n=6)

5,253 ± 0,055 1,062

Hàm lƣợng trung bình (%) (n=12)

5,269 ± 0,052

RSD (%) (n=12)

0,996

40

Nhận xét: Theo AOAC [6], tại mức hàm lƣợng > 1 %, độ chính xác trung gian của phƣơng pháp RSD = 0,996 % < 1,5 %. Kết quả phân tích cho thấy, phƣơng pháp đã đạt yêu cầu của AOAC về độ chính xác trung gian.  Độ đúng Xác định độ đúng bằng phƣơng pháp thêm chuẩn, trong đó dung dịch thử thêm chuẩn đƣợc chuẩn bị bằng cách thêm vào 10ml dung dịch chuẩn asiaticosid 135 µg/ml vào 30mg mẫu thử CRM-96. Tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn nhƣ mục 3.1.3. Lặp lại thí nghiệm 6 lần với 6

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mẫu riêng biệt. Dựa vào đƣờng chuẩn, tính đƣợc lƣợng saponin triterpenoid trong các mẫu. Kết quả đƣợc trình ở bảng 3.7.

Bảng 3.7. Nồng độ của 6 mẫu thử thêm chuẩn

STT 1 2 3 4 5 6

Khối lƣợng

Cc

Cm

Cm+c

Độ thu hồi

mẫu thử (mg)

(µg/ml)

(µg/ml)

(µg/ml)

(%)

29,90

135

199,8

335,4

99,73

30,12

135

206,6

338,1

101,73

31,58

135

209,7

339,6

102,51

30,02

135

205,3

337,6

101,36

32,67

135

208,3

338,8

102,25

29,88

135

199,8

335,4

99,74

Độ thu hồi trung bình

101,22 ± 1,21

RSD (%)

1,26

Nhận xét: Độ thu hồi của phƣơng pháp dao động từ 99,73 % – 102,51 % và RSD = 1,26 %, đạt yêu cầu về độ thu hồi của AOAC, tại mức hàm lƣợng > 1 %, độ thu hồi trong khoảng 97 % - 103 % và RSD < 2 % [6]

41

3.2. Kết quả định lƣợng saponin triterpenoid trong một số mẫu cao Rau má Chuẩn bị các dung dịch mẫu thử, dung dịch chuẩn asiaticosid và dung dịch cao Rau má chuẩn nhƣ mục 3.1.3.

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Tiến hành sắc ký và ghi lại diện tích pic của saponin triterpenoid tính theo asiaticosid của dung dịch mẫu thử và dung dịch mẫu chuẩn. Hàm lƣợng saponin triterpenoid toàn phần, hàm lƣợng saponin glycosid và hàm lƣợng saponin aglycon trong các mẫu cao Rau má trong một số mẫu cao Rau má đƣợc tính theo các công thức tƣơng ứng [CT1], [CT2], [CT3] ở mục 2.3.3.

Bảng 3. 8. Hàm lƣợng saponin triterpenoid toàn phần, hàm lƣợng saponin glycosid, và hàm lƣợng saponin aglycon trong các mẫu cao Rau má

Ký hiệu mẫu

CRM-96

CRM-70

Độ ẩm (%)

1,85

Khối lƣợng cân (mg)

Hàm lƣợng saponin triterpen tính theo asiaticosid (%)

52,30

5,258

52,43

5,234

53,51

5,255

54,51

4,773

Hàm lƣợng saponin triterpen trung bình tính theo asiaticosid (%)

Hàm lƣợng saponin glycosid trung bình tính theo asiaticosid (%)

Hàm lƣợng saponin aglycon trung bình tính theo asiaticosid (%)

5,249 ± 0,006

4,732 ± 0,193

0,517 ± 0,022

4,846 ± 0,062

3,952 ± 0,039

0,893 ± 0,029

3,20 52,32

4,880

42

CRM-N

CRM-A

CRM-B

3,25

2,85

1,50

1,85

4,883

52,61

1,099

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

CRM-30

51,54

51,25

1,107

51,11

1,103

51,14

2,094

51,22

2,114

52,21

2,064

54,51

0,618

49,12

0,599

53,32

0,608

59,21

0,882

50,67

0,854

58,92

0,877 43

1,103 ± 0,004

0,782 ± 0,004

0,320 ± 0,001

2,091 ± 0,025

2,036 ± 0,021

0,055 ±0,001

0,609 ± 0,009

0,591 ± 0,008

0,017 ± 0,001

0,871 ± 0,014

0,852 ± 0,014

0,018 ± 0,001

Hàm lƣợng saponin triterpenoid toàn phần glycosid, aglycon của các mẫu cao Rau má đƣợc trình bày ở bảng 3.8. Trong đó, hàm lƣợng saponin triterpenoid trong mẫu cao Rau má đƣợc chiết bằng EtOH 96º là cao nhất (5,249 %), sau đó đến cao Rau má chiết bằng EtOH 70º (4,846 %), đến cao Rau má chiết bằng nƣớc (2,091 %), cao Rau má chiết bằng EtOH 30º (1,103 %), thấp nhất là 2 mẫu cao Rau má đang lƣu hành CRM-A (0,608 %) và CRM-B (0,871 %).

Kết quả cũng cho thấy hàm lƣợng saponin triterpenoid toàn phần của cao

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Rau má chủ yếu do thành phần glycosid, còn phần aglycon chiếm 1 lƣợng nhỏ.

Tỷ lệ của saponin dạng glycosid với aglycon ở các mẫu cao nhƣ sau: CMR-96 (glycosid – aglycon) là 9,15 : 1; CRM-70 là 4,42 : 1; CRM-30 là 2,44 : 1; CRM-N là 37 : 1; riêng 2 mẫu cao đang lƣu hành trên thị trƣờng CMR-A là 34 : 1; và CMR-B là 47 : 1

44

Chƣơng 4. BÀN LUẬN 4.1. Về xây dựng chƣơng trình sắc ký *Về lựa chọn điều kiện sắc ký Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng tách và phát hiện chất phân tích trong HPLC là pha tĩnh sử dụng, chƣơng trình dung môi và detector. Trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ khảo sát chƣơng trình dung môi chạy sắc ký, còn cột sắc ký và detector đƣợc cố định.

Trong chuyên luận Rau má của Dƣợc điển Châu Âu, Dƣợc điển Trung

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Quốc hay chuyên luận cao Rau má của Dƣợc điển Mỹ và trong hầu hết tài liệu tham khảo trình bày ở bảng 1.1 để định lƣợng các saponin triterpenoid (đơn thành phần nhƣ asiaticosid; acid asiatic hoặc đồng thời 4 chất asiaticosid, madecassosid; acid asiatic; acid madecassic) trong Rau má (cao Rau má) đều sử dụng cột sắc ký pha đảo C18. Ngoài ra, các saponin triterpenoid đều là các chất phân cực, đặc biệt trong đó có các cặp đồng phân asiaticosid B và madecassosid; acid madecassic và acid terminolic có độ phân cực gần nhau (log Pasiaticosid B = 1,1 và log P madecassosid = - 1,2; log Pacid madecassic = 4,4 và log Pacid terminolic = 4,5). Do vậy, trong đề tài này chúng tôi lựa chọn pha tĩnh là cột sắc ký là C18 vì về cấu tạo C18 kém phân cực hơn so với C8 nên khả năng lƣu giữ các chất cần phân tích tốt hơn -> rửa giải chậm hơn -> tách tốt hơn.

Detector DAD có khả năng theo dõi các chất ở nhiều bƣớc sóng khác nhau, có độ nhạy cao hơn detector UV-VIS. Tuy nhiên, các saponin triterpenoid (asiaticosid B, madecassosid, asiaticosid, acid madecassic, acid terminolic, acid asiatic) không có chứa nối đôi liên hợp nên hầu nhƣ không hấp thụ ánh sáng có bƣớc sóng cao. Do vậy detector đƣợc sử dụng là DAD với bƣớc sóng phát hiện thấp 200 nm. Đây là bƣớc sóng mà một số dung môi cũng có thể hấp thụ gây nhiễu đƣờng nền, trong đó có dung môi methanol. Do đó nghiên cứu không tiến hành khảo sát hệ dung môi pha động có thành phần là methanol.

45

Về thành phần pha động, chúng tôi xây dựng chƣơng trình có dựa trên một số nghiên cứu trƣớc đây. So với nghiên cứu chọn hệ pha động gồm kênh A (ACN) và kênh B (H2O) thì khả năng tách của asiaticosid B và madecassosid rất thấp ảnh hƣởng đến kết quả định lƣợng thì đề tài này chúng tôi lựa chọn thành phần pha động gồm kênh A (ACN) và kênh B (H3PO4 0,3 %) đã cải thiện đƣợc khả năng tách giữa hai cặp đồng phân asiaticosid B và madecassosid; cặp acid acid terminolic và acid madecassic (Rs > 1) vì khi pH pha động có tính acid ảnh hƣởng đến trạng thái tồn tại của phân tử, làm giảm độ phân cực dẫn đến làm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

giảm tốc độ rửa giải. Ngoài ra, lựa chọn H3PO4 0,3 % làm thành phần pha động vì đây là acid vô cơ, ít hấp thụ UV ở bƣớc sóng thấp 200 nm còn các acid khác nhƣ acid formic hấp thụ UV ở bƣớc sóng 200 nm do đó có thể gây nhiễu đƣờng nền, ảnh hƣởng tới độ chính xác khi định lƣợng các chất phân tích.

Về chƣơng trình gradient, so với EP 9.0, chúng tôi thêm thời gian đẳng dòng trong 5 phút đầu nhằm mục đích giảm tốc độ rửa giải để tăng khả năng tách giữa hai đồng phân glycosid (asiaticosid B và madecassosid) (Rs = 1,043 > Rs = 0,597). Ngoài ra, vì mẫu cao Rau má gồm có nhiều thành phần nên thời gian phân tích kéo dài lên 85 phút để đảm rửa giải hết các chất khác trong mẫu cao, đặc biệt là những chất có độ lƣu giữ mạnh giúp tăng độ bền cho cột.

4.2. Về thẩm định phƣơng pháp

Phƣơng pháp đã tiến hành thẩm định với các chỉ tiêu: độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian), đƣờng chuẩn và tính tuyến tính, độ đúng. Kết quả cho thấy phƣơng pháp đạt độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính có hệ số tƣơng quan chặt chẽ giữa nồng độ hoạt chất và đáp ứng phân tích (diện tích pic sắc ký) (r2 = 0,9971) tƣơng tự nhƣ nghiên cứu của Mingfu Wang [39], tốt hơn nghiên cứu của tác giả B.T. Schaneberg (R= 0,995) [9]. Độ đúng đƣợc tính toán dựa vào phần trăm tìm lại chuẩn, kết quả thu đƣợc có RSD = 1,26 %, độ thu hồi từ 99,73 % – 102,51 % đạt yêu cầu theo AOAC, cũng phù hợp với nghiên cứu của Mingfu Wang [39] (RSD: 98,25 % 46

104,20 %). Độ lặp lại (RSD = 0,919 %) và độ chính xác trung gian (RSD = 0,996 %) của phƣơng pháp cũng đạt tiêu chuẩn của AOAC (RSD < 2,7 %). Do vậy, phƣơng pháp đã xây dựng hoàn toàn thích hợp để định lƣợng các saponin triterpenoid trong các mẫu cao Rau má trên thực tế.

4.3. Về kết quả định lƣợng saponin triterpen trong một số mẫu cao Rau má Kết quả cho thấy khi các mẫu cao Rau má đƣợc chuẩn bị bằng cách chiết với các dung môi nƣớc hay cồn thấp độ làm thay đổi hàm lƣợng của các

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

glycosid và aglycon. Các saponin glycosid (asiaticosid B, madecassosid, asiaticosid) là những chất phân cực nên khả năng tan trong nƣớc tốt hơn là EtOH 30º vì vậy mẫu cao CRM-N cho hàm lƣợng saponin glycosid cao hơn so với mẫu cao CRM-30. Ngoài ra, căn cứ vào tỷ lệ glycosid : aglycon khác nhau giữa các mẫu cao tùy thuộc với mục đích khác nhau là chế phẩm dùng ngoài (kem bôi liền sẹo; kem bôi trị vết bỏng) hay chế phẩm dùng trong (thuốc bổ thần kinh dạng viên nang, trà thanh nhiệt, giải độc...) để chiết dƣợc liệu với các dung môi thích hợp.

Với 2 mẫu cao thƣơng phẩm hiện nay (CRM-A và CRM-B) cho hàm lƣợng saponin triterpen thấp (0,609 % và 0,871 %) do 2 mẫu cao này đƣợc chiết bằng nƣớc.

Theo nghiên cứu của Mark Roman [51] thì các mẫu Rau má thu hái ở Châu Âu cho hàm lƣợng saponin tritterpenoid toàn phần khá cao (32,6 %) còn trong nghiên cứu của Mingfu Wang [39] mẫu Rau má thu hái ở Trung Quốc cho hàm lƣợng saponin tritereponid (6,22 %) và nghiên cứu của B.T. Schaneberg [9], các mẫu Rau má thu hái ở Mỹ cho hàm lƣợng saponin triterpen toàn phần khá thấp (4,33 %). Nhƣ vậy, có thể thấy các mẫu Rau má thu hái ở Châu Âu cho hàm lƣợng saponin triterpenoid toàn phần cao hơn rất nhiều so với các mẫu Rau má ở Châu Á nhƣ Việt Nam, Trung Quốc hay Mỹ. Điều này có thể lý giải do điều kiện canh tác, điều kiện thổ nhƣỡng và khí hậu vùng trồng khác nhau và kết 47

quả này cũng hoàn toàn phù hợp với yêu cầu về hàm lƣợng saponin triterenoid

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

trong các Dƣợc điển của các nƣớc.

48

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT A. KẾT LUẬN Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã thu đƣợc kết quả nhƣ sau: - Đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng saponin triterpenoid toàn phần trong cao Rau má bằng HPLC, cụ thể điều kiện sắc ký nhƣ sau: + Pha tĩnh: cột sắc ký C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm). + Pha động: kênh A: ACN và kênh B: H3PO4 0,3 %, gradient nồng độ + Bƣớc sóng phát hiện: 200 nm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

+ Tốc độ dòng: 1 ml/phút + Nhiệt độ cột: 25 oC

+ Thể tích tiêm mẫu: 10 µl Thời gian (phút)

ACN (%)

H3PO4 0,3 % (%)

0-5

22

78

5 - 70

22 – 55

78 - 45

70 - 71

55 - 95

45 - 5

71 - 80

95

95

80 - 85

95 - 22

5 - 78

- Đã thẩm định đƣợc phƣơng pháp định lƣợng saponin triterpenoid trong cao Rau má bằng HPLC với các chỉ tiêu: Độ phù hợp hệ thống sắc ký, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn, độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian), độ đúng của phƣơng pháp. Kết quả thu đƣợc cho thấy các chỉ tiêu thẩm định: hệ thống sắc ký phù hợp, độ đặc hiệu đảm bảo, độ tuyến tính có tƣơng quan chặt chẽ giữa diện tích pic với nồng độ trong khoảng 60 - 360 μg/ml (R = 0,999), độ lặp lại tốt (RSD = 0,919 %), độ chính xác trung gian đạt (RSD = 0,996 %), độ đúng từ 99,73 – 102,51 % nằm trong khoảng giới hạn 97 % - 103 % đối với hàm lƣợng mẫu ≥ 1 %.

49

- Đã áp dụng phƣơng pháp xây dựng đƣợc để định lƣợng saponin triterpenoid trong 6 mẫu cao Rau má. Trong sáu mẫu cao Rau má gồm có 4 mẫu cao đƣợc điều chế từ dịch chiết EtOH 96º, EtOH 70º, EtOH 30º, nƣớc và 2 mẫu cao của công ty A và B cung cấp. Hàm lƣợng saponin triterpenoid dao động từ 0,609 % đến 5,249 %. Mẫu cao Rau má CRM-BV cho hàm lƣợng saponin triterpenoid thấp nhất (0,609 %), trong khi mẫu CRM-96 cho hàm lƣợng saponin triterpenoid cao nhất (5,249 %).

B. ĐỀ XUẤT

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Có thể áp dụng phƣơng pháp định lƣợng saponin triterpenoid trong cao Rau má bằng HPLC để xây dựng tiêu chí định lƣợng cao Rau má.

50

TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1.

Đỗ Huy Bích và cộng sự (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 2, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr.582-586 Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, NXB Y học, tr

3.

Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, quyển II, NXB Trẻ, tr. 477.

4.

Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, tr. 631-632.

5.

Đỗ Quyên, Nguyễn Tiến Tiệp (2015), "Xây dựng phƣơng pháp định

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

2.

lƣợng asiaticosid trong rau má bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao", Báo cáo nghiệm thu đề tài khoa học công nghệ, Đại Học Dược Hà Nội.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH 6.

AOAC

(2012),

AOAC

official

methods

of

analysis.

Appendix

K:Guidelines for dietary supplements and botanicals, Part 1: AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for DietarySupplements and Botanicals.

7.

Ambasta S. (1986), "The useful plants of India", Council of Scientific & Industrial Research, pp. 56-59

8.

Anjana Devkota, Stefano Dall' Acqua, Pramod Kumar Jha, Gabbriel Innocenti (2010), "Variation in the active constituent contents in Centella asiatica grown in different habitats in Nepal", Journal of Plant Science, pp. 43-47.

9.

B. T. Schaneberg, Mikell J.R, E. Bedir, Khan I. A (2003), "An improved HPLC method for quantitative determination of six triterpenes in Centella asiatica extracts and commercial products", Pharmazie 58, pp. 381–384

10.

Babu T., Kuttan G., and Padikkala J.(1995), "Cytotoxic and anti-tumour

properties of certain taxa of Umbelliferae with special reference to Centella asiatica (L.) Urban", Journal of Ethnopharmacology, pp. 48(1): 53-57.

11.

Belcaro G.V., Grimaldi R., and

Guidi G. (1990), "Improvement of

capillary permeability in patients with venous hypertension after treatment with TTFCA", Angiology, 41(7), pp. 533-540.

12.

Borhan M., Ahmad R., Rusop M., and Abdullah S. (2013), "Green

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

extraction: enhanced extraction yield of asiatic acid from Centella asiatica (L.) nanopowders", Journal of Applied Chemistry, pp.78-83 13.

Bulka W., Znajdek-Awiżeń P., Studzińska-Sroka E., and Brzezińska M. (2013), "Centella asitica in cometology", Postepy Permabl Alergol, 30(1), pp. 46-49.

14.

Bunpo

P.

(2004),

"Inhibitory

onazoxymethane-induced

aberrant

effects

of

crypt

focus

Centella

asiatica

formation

and

carcinogenesis 50 in the intestines of F344 rats", Food and chemical toxicology, 42(12), pp. 1987-1997.

15.

Cesarone M., Belcaro G., Rulo A., Griffin M. (2001), "Microcirculatory effects of total triterpenic fraction of Centella asiatica in chronic venous hypertension: measurement by laser Doppler, TcPO2-CO2, and leg volumetry", Angiology 52, pp. 45-48.

16.

Chatterjee T.K., Chakraborty A., Pathak M., Sengupta G.C. (1992), "Effects of plant extract Centella asiatica (Linn.) on cold restraint stress ulcer in rats", Indian J Exp Biol, 30(10), pp. 889-891.

17.

Cheng C., Cheng C. and Koo M. (2001), "Effects of Centella asiatica on ethanol induced gastric mucosal lesions in rats", Life sciences, 67(21), pp.

2647-2653.

18.

Cheng C.L, Guo J.S, Luk J., Koo M.W (2004), "The healing effects of Centella extract and asiaticoside on acetic acid induced gastric ulcers in rats", Life sciences, 74(18), pp. 2237-2249.

19.

China Pharmacopoeia Committee (2015), Pharmacopoeia of the People's Republic of China, pp 94-95.

20.

Chong N.J, A.Z. (2011), "A systematic review on the chemical constituents of Centella asiatica", Research Journal of Pharmaceutical,

21.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Biological and Chemical Sciences, 2(3), pp. 445-459. .

Darnis F. (1978), "Use of a titrated extract of Centella asiatica in chronic hepatic disorders ", La semaine des hopitaux: organe fonde par l'Association d'enseignement medical des hopitaux de Paris, 55(37-38): pp. 1749-1750.

22.

European

pharmacopoeia

8.0

Commission

(2014),

European

pharmacopoeia 8.0, pp 1246-1248.

23.

European

pharmacopoeia

9.0

Commission

(2017),

European

pharmacopoeia 9.0, pp 1311-1313.

24.

Gao M., Yuan X., and Xiao H. (2008), "Preparation of asiaticoside and madecassoside from the extract of Centella asiatica (L.) Urb using preparative high performance liquid chromatography", Se pu= Chinese journal of chromatography/Zhongguo hua xue hui, 26(3), pp. 362-365.

25.

Gnanapragasam A. (2004), " Protective effect of Centella asiatica on antioxidant

tissue

defense

system

against

adriamycin

induced

cardiomyopathy in rats", Life sciences, 76(5), pp. 585-597.

26.

Incandela L., Belcaro G., De Sanctis M.T., Cesarone M.R (2001), "Total triterpenic fraction of Centella asiatica in the treatment of venous

hypertension: a clinical, prospective, randomized trial using a combined microcirculatory model", Angiology, 52, pp. 61-72.

27.

Jacinda James , and Ian Dubery (2011), "Identification and Quantification of Triterpenoid Centelloids in Centella asiatica (L.) Urban by Densitometric TLC", Journal of Planar Chromatography, pp 82-87.

28.

Jayashree G. (2003), "Anti-oxidant activity of Centella asiatica on lymphoma-bearing mice", Fitoterapia, 74(5), pp. 431-434.

Joanne

Barnes, Linda A Anderson, and J David Phillipson (2007),

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

29.

Herbal medicines third edition, pp. 371 - 373.

30.

Kai G., Yuan C., Zhou B., Jin R., Yuan Y. (2009), "Separation of Madecassoside and Madecassic Acid Isomers by High Performance Liquid Chromatography Using beta Cyclodextrin as Mobile Phase Additive", Bulletin Korean chemical society, pp. 29(3): 551.

31.

Kim W.J., Jaehoon K., Jae-Duck K., and Youn-Woo L.(2009) "Extraction of bioactive components from Centella asiatica using subcritical water", The Journal of Supercritical Fluids, pp. 48(3): 211-216.

32.

Kumar P. (1996), "Radioprotective effects of Rasayanas, Indian journal of experimental biology", Indian journal of experimental biology, 34(9), pp.

848-850.

33.

Lee M.K, Kim S.R., Sung SH., Lim D. (2000), "Asiatic acid derivatives protect cultured cortical neurons from glutamate-induced excitotoxicity", Researc communications in molecular pathology and pharmacology, 108(1-2), pp. 75-86.

34.

Lin L.T, Liu L.T., Chiang L.C. and Lin C.C. (2002), "In vitro anti‐hepatoma activity of fifteen natural medicines from Canada", Phytotherapy Research, 16(5), pp. 440-444.

35.

Lin Y.C., Dai Y.S., Chen B.F., and Chang A. (1999), "The Eifect of Tetrandrine and Extracts of Centella asiatica on Acute Radiation Dermatitis in Rats", Biol. Pharm. Bull, 22(7), pp. 703-706.

36.

Loc N.H. and N.T.D. Nhat (2013), "Production of asiaticoside from centella (Centella asiatica L. Urban) cells in bioreactor", Asian Pacific journal of tropical biomedicine, 3(10), pp. 806-810.

37.

Malhotra C. (1961), "Chemical and pharmacological studies on

38.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hydrocotyle asiatica Linn", Indian J. Pharm, pp. 23.

Ming Z. S. L., and Cao L. (2004), "Effect of total glucosides of Centella asiatica on antagonizing liver fibrosis induced by dimethylnitrosamine in rats", Chinese journal of integrated traditional and Western medicine, 24(8), pp. 731-734.

39.

Mingfu Wang (2003), "Improved HPLC dertermininition of the Centella asiatica terpenes", The Handbook of Analytical Methods for the Dietary Supplements, pp. 1333-1345.

40.

Nalini K., Aroor A.R. and Rao. A (1992), "Effect of Centella asiatica fresh leaf aqueous extract on learning and memory and biogenic amine turnover in albino rats", Fitoterapia, 63(3), pp. 231-238.

41.

Nor Azah Mohd Ali (2002), "Proceedings of Seminar on Medicinal Plants", FRIM, pp. 237-239.

42.

Oyedeji O.A. (2008) "Chemical composition and antibacterial activity of the essential oil of Centella asiatica growing in South Africa", Pharm Biol. Bull, pp. 43(3): 249-252.

43.

Park B.C., Bosire K.O., Lee E.S., Lee Y.S., Kim J.A. (2005), "Asiatic acid induces apoptosis in SK-MEL-2 human melanoma cells", Cancer letters, 218(1): 81-90.

44.

Pragada R., Veeravalli K.K., Chowdary K.P., and Routhu K.V. (2004), "Cardioprotective activity of Hydrocotyle asiatica L. in ischemiareperfusion

induced

myocardial

infarction

in

rats,Journal

of

ethnopharmacology", Journal of ethnopharmacology, 93(1), pp. 105-108.

45.

Punturee K. (2005), "Immunomodulatory activities of Centella asiatica and Rhinacanthus nasutus extracts", Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 6(3), pp 396.

Punturee K. C.P., and Vinitketkumneun U.(2004), "Thai medicinal

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

46.

plants modulate nitric oxide and tumor necrosis factor-α in J774 2 mouse macrophages", Journal of ethnopharmacology, 95(2), pp. 183-189.

47.

Puttarak P. and Panichayupakaranant P. (2012), "Factors affecting the content of pentacyclic triterpenes in Centella asiatica raw materials", Pharmaceutical biology, 50(12), pp. 1508-1512.

49.

Quin D.R. and Zhang W. D. ((1998)), "Essential oil from Centella asiatica and its antipressant activity", Di Er Jun Yi Da Xue Xue Bao, 19(2), pp. 186-187.

50.

Rafamantanana M.H., Rozet E., Raoelison G.E., Cheuk K. (2009), "An improved HPLC-UV method for the simultaneous quantification of triterpenic glycosides and aglycones in leaves of Centella asiatica (L.) Urb (Apiaceae)", Journal of Chromatography B, 877(23), pp. 2396-2402.

51.

Roman M. (2011), "Determination of Triterpenes in Centella asiatica (Gotu Kola) by HPLC-CAD".

52.

Sampson J., Raman A., Karlsen G., Navsaria H. (2001), "In vitro keratinocyte antiproliferant effect of Centella asiatica extract and triterpenoid saponins", Phytomedicine, 8(3), pp. 230-235.

53.

Sarkar P. S.P., Sinha B., and Sukul N.C (1998), "Antifilarial Effect of a Combination of Botanicals from Acacia auriculiformis and Centella asiatica on Canine Dirofilariasis", Pharmaceutical biology, 36(2), pp.

107-110.

54.

Sharma P.D. (2011), "Bioanalytical HPLC method development and validation for quantification of asiatic acid from Centella asiatica Linn.", International Journal of Pharmaceutical Sciences Review & Research

55.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

communications, 10(2), pp 97 -102.

Shen Q., Yu L.S., Zhou H., Zeng S. (2014), "Simultaneous determination of madecassoside, asiaticoside and their aglycones in Centella asiatica (L.) urban extracts by RP-HPLC", Zhejiang da xue xue bao. Yi xue ban= Journal of Zhejiang University. Medical sciences, 43(2), pp. 135-140 56.

Soumyanath A., Zhong Y.P., Gold S.A., Yu X. (2005), "Centella asiatica accelerates nerve regeneration upon oral administration and contains multiple active fractions increasing neurite elongation in‐vitro", Journal of Pharmacy and Pharmacology, 57(9), pp. 1221-1229

57.

Suguna L. P., Sivakumar G., and Chandrakasan G. (1996), "Effects of Centella asiatica extract on dermal wound healing in rats", Indian Journal of Experimental Biology, 34(12), pp. 1208-1211.

58.

Takhtajan Armen (2009), Flowering plants, Springer.

59.

Tenni R., Zanaboni G., De Agostini MP. (1987), "Effect of the triterpenoid fraction of Centella asiatica on macromolecules of the connective matrix in human skin fibroblast cultures", The Italian journal of biochemistry, pp. 37(2): 69-77.

60.

http://www.theplantlist.org/.

61.

Thongnopnua P. (2008), "High-performance liquid chromatographic determination of asiatic acid in human plasma", Thai J. Pharm.

Sci,32(10), pp 34-38.

62.

United States Pharmacopeia Convention (2015), The United States Pharmacopeia and National Formulary, pp 5849-5854.

63.

Verma R., Bhartariya K.G, Gupta K.G (1999), "Reverse-phase high performance liquid chromatography of asiaticoside in Centella asiatica",

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Phytochemical analysis, 10(4), pp. 191-193.

64.

WHO (1999), "WHO monographs on selected medical plants", pp. 77-85

65.

Wang X.-S, Dong Q., Zuo J.P., Fang J.N. (2003), "Structure and potential immunological activity of a pectin from Centellaasiatica (L.) Urban", Carbohydrate research, 338(22), pp.2393-2402.

66.

Yao C., Han T., Qin L., Rui Y., and Zheng H. (2000) "Effect of total triterpenes from Centella asiatica on the depression behavior and concentration of amino acid in forced swimming mice [J]", Journal of Chinese Medicinal Materials, pp. 12-15.

67.

Yao C., Han T., Rui Y., Yin M., and Qin L. (2005), "Effects of total triterpenes of Centella asiatica on the corticosterone levels in serum and contents of monoamine in depression rat brain", Journal of Chinese Medicinal Materials, 28(6), pp. 492-6.

69.

Yoosook C., Bunyapraphatsara N., Boonyakiat Y. and Kantasuk C. (2000), "Anti-herpes simplex virus activities of crude water extracts of Thai medicinal plants", Phytomedicine, 6(6), pp. 411-419.

70.

Yu Q., Gao W.Y., Chen H.X., Duan H.Q. (2007), "Determination of asiaticoside in Centella asiatica extract by HPLC-ELSD", Zhongguo Zhong yao za zhi, 32(6), pp. 503-505.

Zhang F.L.,

Wei Y.J., Zhu J., Gong Z.N. (2008), "Simultaneous

quantitation of three major triterpenoid glycosides in Centella asiatica extracts by high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection", Biomedical Chromatography, 22(2), pp. 119124.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

71.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

PHỤ LỤC 1: SẮC KÝ ĐỒ MẪU CAO RAU MÁ CHUẨN HỘI ĐỒNG DƯỢC ĐIỂN CHÂU ÂU CHỨNG NHẬN

23/03/2018 10:53:53 SA Page 1 / 1

PHỤ LỤC 2 SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT THEO CHƯƠNG TRÌNH 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: asiaticosidgra1 : asiaticosidgra1 : asiaticosidgra1.lcd : gra1.lcd : : 1-6 : 10 uL : 08/01/2108 4:05:22 CH : 08/01/2018 11:30:48 SA

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

PDA Multi 1 200nm,4nm

14.447

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

100 75

50

25

0 0

5

10

15

20

25

30

35

40 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid Total

Ret. Time 14.447

Area 954447 954447

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\CRM\khao sat\gra1\asiaticosidgra1.lcd

23/03/2018 10:38:08 SA Page 1 / 1

PHỤ LỤC 2 SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT THEO CHƯƠNG TRÌNH 1

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: caochuangra1 : caochuangra1 : caochuangra1.lcd : gra1.lcm : : 1-1 : 10 uL : 08/01/2018 12:31:32 CH : 08/01/2018 10:29:14 SA

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

PDA Multi 1 200nm,4nm

12.167 12.343

150

25.341 25.541

100

50

0 0

5

10

15

20

25

28.698

14.643

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

30

35

40 min

<Peak Table> PDA Ch1 200nm Peak# 1 2 3 4 5 6

Name

asiaticosid B madecasossid asiaticosid acid madecassosid acid terminolic acid asiatic

Ret. Time

12.167 12.343 14.643 25.341 25.541 28.698

Area

549959 526107 1267560 136798 174188 355646

Resolution(USP) -0.566 8.400 46.585 0.892 13.575

Tailing Factor --1.020 --1.069

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\CRM\khao sat\gra1\caochuan.lcd

23/03/2018 10:26:39 SA Page 1 / 1

PHỤ LỤC 3 SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT THEO CHƯƠNG TRÌNH 2

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: asiaticosidgra2 : asiaticosidgra2 : asiaticosidgra2 : gra2.lcm : : 1-18 : 10 uL : 09/01/2018 4:33:17 CH : 10/01/2018 11:30:28 SA

Sample Type

: Unknown : System Administrator : System Administrator

Acquired by Processed by

<Chromatogram>

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU PDA Multi 1 200nm,4nm

20.795

125 100 75 50 25 0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid Total

Ret. Time 20.795

Area 676535 676535

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\CRM\khao sat\gra2\chuangra2.lcd

23/03/2018 10:18:55 SA Page 1 / 1

PHỤ LỤC 3 SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT THEO CHƯƠNG TRÌNH 2

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: caochuangra2 : caochuangra2 : caochuangra2.lcd : gra2.lcm : : 1-16 : 10 uL : 09/01/2018 3:45:17 CH : 10/01/2018 11:48:09 SA

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

<Chromatogram> mAU PDA Multi 1 200nm,4nm

100

50

0 0

5

10

15

20

29.039 29.208

19.016 19.168

150

25

30

31.580

20.790

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

200

35

40

min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic

Ret. Time 19.016 19.168 20.790 29.039 29.208 31.580

Area 415371 392751 1089012 62405 100730 286917

Resolution(USP) -0.732 8.415 51.032 1.092 13.243

Tailing Factor

--1.019 0.837 1.057 1.037

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\CRM\khao sat\ACN-H20\gra2\caochuangra2.lcd

23/03/2018 10:26:39 SA Page 1 / 1

PHỤ LỤC 4 SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT THEO CHƯƠNG TRÌNH 3

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: asiaticosidgra3 : asiaticosidgra3 : asiaticosidgra3 : gra3.lcm : : 1-16 : 10 uL : 10/01/2018 4:33:17 CH : 11/01/2018 11:30:28 SA

Sample Type

: Unknown : System Administrator : System Administrator

Acquired by Processed by

<Chromatogram>

50

25

0

D ẠY da K 14.898 y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

10

20

30

40

50

PDA Multi 200nm, 4nm

60

70

min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid Total

Ret. Time 14.898

Area 826135 826135

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\CRM\khao sat\gra3\asiaticosidgra3.lcd

23/03/2018 4:45:15 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 4 SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT THEO CHƯƠNG TRÌNH 3

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: caochuan1 : caochuan1 : caochuan (1).lcd : gra3.lcm : : 1-1 : 10 uL : 10/01/2018 5:08:11 SA : 10/01/2018 4:21:55 CH

Sample Type Level Acquired by Processed by

: Standard :1 : System Administrator : System Administrator

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic Total

Ret. Time 10.562 10.808 14.929 36.310 36.486 46.638

Area 549306 486029 1268067 126539 164489 348247

Tailing Factor

--0.929 --1.001

Resolution(USP)

-1.095 8.168 41.025 0.597 15.803

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\CRM\khao sat\gra3\caochuan(1).lcd

23/03/2018 2:18:06 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 5 SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT THEO CHƯƠNG TRÌNH 4

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename : Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: asiaticosidgra4 : asiaticosidgra4 : asiaticosidgra4 : gra4.lcm : 1-6 : 10 uL : 10/01/2018 6:43:41 SA : 10/01/2018 11:04:31 SA

Sample Type Level Acquired by Processed by

: Standard :1 : System Administrator : System Administrator

mAU

PDA Multi 1 200nm,4nm

20.964

75

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

50

25

0 0

10

20

30

40

50

60

70

min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid Total

Ret. Time 20.964

Area 938361 938361

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\CRM\khao sat\gra4\(1)chuan300.lcd

23/03/2018 4:45:15 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 5 SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT THEO CHƯƠNG TRÌNH 4 <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: caochuan1 : caochuan1 : caochuan (1).lcd : rauma.lcm : : 1-1 : 10 uL : 10/01/2018 5:08:11 SA : 10/01/2018 4:21:55 CH

Sample Type Level Acquired by Processed by

: Standard :1 : System Administrator : System Administrator

<Chromatogram> mAU 20.965

PDA Multi 1 200nm,4nm

43.429 44.062

50

53.428

15.726 16.117

75

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

25

0 0

10

20

30

40

50

60

70

80 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic Total

Ret. Time 15.726 16.117 20.965 43.429 44.062 53.428

Area 575805 587507 1368067 143539 203489 392247

Tailing Factor

--1.066 1.090 1.044 1.036

Resolution(USP)

-1.043 13.235 59.251 1.508 20.845

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\CRM\khao sat\gra4\caochuan (1).lcd

23/03/2018 5:19:15 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 6 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ THÍCH HỢP HỆ THỐNG

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: chuan300(1) : chuan300(1) : (1)chuan300.lcd : rauma.lcm : batchrauma.lcb : 1-6 : 10 uL : 23/02/2018 6:43:41 SA : 23/02/2018 4:34:23 CH

Sample Type Level Acquired by Processed by

: Standard 1 : System Administrator : System Administrator

mAU

PDA Multi 1 200nm,4nm

20.964

75

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

50

25

0 0

10

20

30

40

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid Total

Ret. Time 20.964

Area 938361 938361

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\23-2\do phu hop\chuan asiaticosid\(1)chuan300.lcd

23/03/2018 5:41:41 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 6 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ THÍCH HỢP HỆ THỐNG

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: caochuan1 : caochuan1 : caochuan (1).lcd : rauma.lcm : batchrauma.lcb : 1-1 : 10 uL : 23/02/2018 8:08:11 SA : 23/02/2018 5:35:12 CH

Sample Type Level Acquired by Processed by

: Standard :1 : System Administrator : System Administrator

PDA Multi 1 200nm,4nm

20.965

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

100

43.429 44.062

50

53.428

15.726 16.117

75

25

0 0

10

20

30

40

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic Total

Ret. Time 15.726 16.117 20.965 43.429 44.062 53.428

Area 575805 587507 1368067 143539 203489 392247

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\23-2\tham dinh\do phu hop\caochuan\caochuan (1).lcd

23/03/2018 6:11:59 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 7 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ ĐẶC HIỆU

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: chuan300 : chuan300 : (1)chuan300.lcd : rauma.lcm : batch 260218.lcb : 1-6 : 10 uL : 27/02/2018 6:43:41 SA : 27/02/2018 4:34:23 CH

Sample Type Level Acquired by Processed by

: Standard 1 : System Administrator : System Administrator

mAU

PDA Multi 1 200nm,4nm

20.964

75

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

50

25

0 0

10

20

30

40

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid Total

Ret. Time 20.964

Area 938361 938361

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\do dac hieu\(1)chuan300.lcd

23/03/2018 6:15:27 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 7 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ ĐẶC HIỆU

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: caochuan : caochuan : caochuan.lcd : rauma.lcm : rauma.lcb : 1-7 : 10 uL : 27/02/2018 8:40:12 SA : 27/02/2018 6:14:42 CH

Sample Type Level Acquired by Processed by

: Standard 1 : System Administrator : System Administrator

PDA Multi 1 200nm,4nm

21.019

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

100

43.530 44.162

50

53.526

15.788 16.175

75

25

0 0

10

20

30

40

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic Total

Ret. Time 15.788 16.175 21.019 43.530 44.162 53.526

Area 574377 575034 1352997 142715 204840 393111

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\do dac hieu\caochuan.lcd

23/03/2018 6:19:15 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 7 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ ĐẶC HIỆU

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: caothu : caothu : thu3.lcd : rauma.lcm : batch 260218.lcb : 1-8 : 10 uL : 27/02/2018 10:46:08 SA : 27/02/2018 6:06:32 CH

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

43.435 44.065

20

53.431

15.732

30

PDA Multi 1 200nm,4nm

21.975

16.123

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

10

0

0

10

20

30

40

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic

Ret. Time 15.732 16.123 20.975 43.435 44.065 53.431

Area 196016 321528 325894 124112 82295 145080

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\do dac hieu\thu3.lcd

23/03/2018 6:22:07 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 7 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ ĐẶC HIỆU

Analysis Report <Sample Information> Sample Name : MeOH Sample ID : MeOH Data Filename : MeOH1.lcd Method Filename : rauma.lcm Batch Filename : batchrauma.lcb Vial # : 1-9 Injection Volume : 10 uL Date Acquired : 27/02/2018 12:31:29 SA Date Processed : 27/02/2018 5:19:17 CH

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

mAU 500

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram> PDA Multi 1 200nm,4nm

400 300 200 100 0 0

10

20

30

40

50

60

70

80 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Ret. Time Total

Area

Height

Conc.

Unit

Mark

Name

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\do dac hieu\MeOH1.lcd

22/03/2018 3:15:25 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 8 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ TUYẾN TÍNH

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: chuan60 : chuan60 : chuan60.lcd : rauma.lcm : batchrauma.lcb : 1-1 : 10 uL : 26/02/201812:31:46 CH : 26/02/2018 2:10:48 CH

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

21.064

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

15

10

5

0

0

5

10

15

20

PDA Multi 1 200nm,4nm

25

30 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid Total

Ret. Time 21.064

Area 188285 188285

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\duong tuyen tinh\chuan60.lcd

23/03/2018 12:31:38 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 8 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ TUYẾN TÍNH

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: chuan120 : chuan120 : chuan120.lcd : rauma.lcm : batchrauma.lcb : 1-2 : 10 uL : 26/02/2018 3:03:20 CH : 26/02/2018 3:33:38 CH

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

21.246

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

20

10

0

0

5

10

15

20

PDA Multi 1 200nm,4nm

25

30 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid Total

Ret. Time 21.246

Area 338891 338891

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\duong tuyen tinh\chuan120.lcd

23/03/2018 12:33:30 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 8 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ TUYẾN TÍNH

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: chuan180 : chuan180 : chuan180.lcd : rauma.lcm : batchrauma.lcb : 1-3 : 10 uL : 26/02/2018 5:24:11 CH : 26/02/2018 7:00:02 CH

Sample Type Level Acquired by Processed by

: Standard 1 : System Administrator : System Administrator

21.004

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

40 30 20 10 0 0

5

10

15

20

PDA Multi 1 200nm,4nm

25

30 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid Total

Ret. Time 21.004

Area 574386 574386

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\duong tuyen tinh\chuan180.lcd

23/03/2018 3:24:48 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 8 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ TUYẾN TÍNH

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: chuan240 : chuan240 : chuan240.lcd : rauma.lcm : batchrauma.lcb : 1-4 : 10 uL : 26/02/2018 8:59:42 CH : 26/02/2018 10:30:44 CH

Sample Type Level Acquired by Processed by

: Standard 1 : System Administrator : System Administrator

20.998

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

50

25

0 0

5

10

15

20

PDA Multi 1 200nm,4nm

25

30 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid Total

Ret. Time 20.998

Area 725915 725915

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\duong tuyen tinh\chuan240.lcd

23/03/2018 12:37:02 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 8 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ TUYẾN TÍNH

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: chuan300 : chuan300 : chuan300.lcd : rauma.lcm : batchrauma.lcb : 1-5 : 10 uL : 26/02/2018 11:20:15 CH : 27/02/2018 1:05:20 SA

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administraton : System Administraton

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

21.013

mAU

75

50

25

0 0

5

10

15

20

PDA Multi 1 200nm,4nm

25

30 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid Total

Ret. Time 21.013

Area 937332 937332

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\duong tuyen tinh\chuan300.lcd

22/03/2018 3:32:39 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 8 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ TUYẾN TÍNH

Analysis Report <Sample Information> : chuan360 : chuan360 : chuan360 : rauma.lcm : batchrauma.lcb : 1-6 : 10 uL : 27/02/2018 2:10:44 SA : 27/02/2018 4:23:59 SA

Sample Type : Standard Level 1 Acquired by : System Administrator Processed by : System Administrator

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

<Chromatogram>

21.006

mAU

75

50

25

0 0

5

10

15

20

PDA Multi 1 200nm,4nm

25

30 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid Total

Ret. Time 21.006

Area 1145100 1145100

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\duong tuyen tinh\chuan360.lcd

23/03/2018 6:28:02 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 9 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ LẶP LẠI

Analysis Report <Sample Information> Sample Name : CAO1 Sample ID : cao1 Data Filename : cao1.lcd Method Filename : rauma.lcm Batch Filename : batch01032018.lcb Vial # : 1-1 Injection Volume : 10 uL Date Acquired : 01/03/2018 6:15:37 CH Date Processed : 02/03/2018 9:53:50 SA

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

PDA Multi 1 200nm,4nm

10

0 0

10

20

30

40

53.726

20

43.702 44.335

15.846

16.243

30

21.135

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic Total

Ret. Time 15.846 16.243 21.135 43.702 44.335 53.726

Area 193760 324456 323597 124587 82163 145807 1194369

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\do lap lai\cao1.lcd

23/03/2018 1:18:18 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 9 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ LẶP LẠI

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: cao2 : cao2 : cao2.lcd : rauma.lcm : batch01032018.lcb : 1-2 : 10 uL : 01/03/2018 7:51:09 CH : 02/03/2018 6:30:09 CH

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

15.933

30

PDA Multi 1 200nm,4nm

21.156

16.321

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

10

0 0

10

20

30

40

53.719

43.699 44.334

20

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terrminolic 6 acid asiatic

Ret. Time 15.933 16.321 21.156 43.699 44.334 53.719

Area 197582 324019 325462 126965 82401 147556

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\do lap lai\cao2.lcd

23/03/2018 1:19:15 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 9 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ LẶP LẠI

Analysis Report <Sample Information> Sample Name : cao3 Sample ID : cao3 Data Filename : cao3.lcd Method Filename : rauma.lcm Batch Filename : batch01032018.lcb Vial # : 1-3 Injection Volume : 10 uL Date Acquired : 01/03/2018 9:26:40 CH Date Processed : 02/03/2018 6:32:17 CH

Sample Type

: Unknown : System Administrator : System Administrator

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Acquired by Processed by

<Chromatogram>

15.926

30

PDA Multi 1 200nm,4nm

21.160

16.315

mAU

10

0 0

10

20

30

40

53.716

43.697 44.333

20

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 madecassosid 2 asiaticosid 3 acid madecassosid 4 acid terminolic 5 acid asiatic 6 acid asiatic

Ret. Time 15.926 16.315 21.160 43.697 44.333 53.716

Area 193588 325002 325235 124385 82778 145145

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\do lap lai\cao3.lc

23/03/2018 1:20:45 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 9 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ LẶP LẠI

Analysis Report <Sample Information> Sample Name : cao4 Sample ID : cao4 Data Filename : cao4.lcd Method Filename : rauma.lcm Batch Filename : batch01032018.lcb Vial # : 1-4 Injection Volume : 10 uL Date Acquired : 01/03/2018 11:02:11 CH Date Processed : 02/03/2018 6:33:25 CH

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

15.921

30

PDA Multi 1 200nm,4nm

21.149

16.308

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

10

0 0

10

20

30

40

53.701

43.677 44.311

20

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 madecassosid 2 asiaticosid 3 acid madecassic 4 acid terminolic 5 acid asiatic 6 acid asiatic

Ret. Time 15.921 16.308 21.149 43.677 44.311 53.701

Area 194849 327081 324498 123779 82487 145038

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\do lap lai\cao4.lcd

23/03/2018 6:25:35 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 9 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ LẶP LẠI

Analysis Report <Sample Information> : cao5 : cao5 : cao 5.lcd : rauma.lcm : batch010318.lcb : 1-5 : 10 uL : 01/03/2018 1:10:11 CH : 02/03/2018 9:53:10 SA

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

<Chromatogram>

43.435 44.065

20

53.431

15.732

30

PDA Multi 1 200nm,4nm

21.975

16.123

mAU

10

0 0

10

20

30

40

50

60 min

<Peak Table> PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic

Ret. Time 15.732 16.123 20.975 43.435 44.065 53.431

Area 196016 321528 325894 124112 82295 145080

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\do lap lai\cao 5.lcd

23/03/2018 6:27:13 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 10 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ CHÍNH XÁC TRUNG GIAN

Analysis Report <Sample Information> : cao6 : cao6 : cao6.lcd : rauma.lcm :batch01032018.lcb : 1-6 : 10 uL : 03/03/2018 2:45:11 CH : 02/03/2018 9:53:01 SA

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

<Chromatogram>

43.441 44.073

20

53.437

15.741

30

PDA Multi 1 200nm,4nm

20.972

16.130

mAU

10

0 0

10

20

30

40

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic

Ret. Time 15.741 16.130 20.972 43.441 44.073 53.437

Area 197652 323575 325523 127549 83153 145266

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\do lap lai\cao 6.lcd

24/03/2018 2:47:08 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 10 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ CHÍNH XÁC TRUNG GIAN

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: cao1 : cao1 : cao1.lcd : rauma.lcm : rauma.lcb : 1-1 : 10 uL : 02/03/2018 6:09:59 CH : 03/03/2018 2:40:03 CH

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

10

0 0

10

20

30

40

53.702

20

43.691 44.324

15.920

30

PDA Multi 1 200nm,4nm

21.136

16.308

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic

Ret. Time 15.920 16.308 21.136 43.691 44.324 53.702

Area 192850 324274 314727 119803 81262 142227

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\do chinh xac trung gian\cao1.lcd

24/03/2018 2:48:22 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 10 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ CHÍNH XÁC TRUNG GIAN

Analysis Report <Sample Information>

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sample Name : cao2 Sample ID : cao2 Data Filename : cao2.lcd Method Filename : rauma.lcm Batch Filename : rauma.lcb Vial # : 1-2 Injection Volume : 10 uL Date Acquired : 02/03/2018 7:45:29 CH Date Processed : 03/03/2018 3:55:03 CH

<Chromatogram>

10

0

0

10

20

30

40

53.704

20

43.689 44.322

15.916

30

PDA Multi 1 200nm,4nm

21.127

16.303

mAU

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic

Ret. Time 15.916 16.303 21.127 43.689 44.322 53.704

Area 192780 321097 318841 119806 80622 143772

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\do chinh xac trung gian\cao2.lcd

24/03/2018 2:48:22 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 10 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ CHÍNH XÁC TRUNG GIAN

Analysis Report

<Sample Information> Sample Name : cao3 Sample ID : cao3 Data Filename : cao3.lcd Method Filename : rauma.lcm Batch Filename : rauma.lcb Vial # : 1-3 Injection Volume : 10 uL Date Acquired : 02/03/2018 9:21:00 CH Date Processed : 03/03/2018 4:00:22 CH

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

<Chromatogram> mAU 21.116

16.287

15.902

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

30

PDA Multi 1 200nm,4nm

10

0 0

10

20

30

40

53.699

43.685 44.319

20

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic

Ret. Time 15.902 16.287 21.116 43.685 44.319 53.699

Area 196908 331903 320342 123482 82240 143310

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\do chinh xac trung gian\cao3.lcd

24/03/2018 2:50:53 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 10 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ CHÍNH XÁC TRUNG GIAN

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: cao4 : cao4 : cao4.lcd : rauma.lcm : rauma.lcb : 1-4 : 10 uL : 02/03/2018 10:56:31 CH : 03/03/2018 3:57:33 CH

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

15.911

30

PDA Multi 1 200nm,4nm

21.127

16.298

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

10

0 0

10

20

30

40

53.710

43.699 44.332

20

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic

Ret. Time 15.911 16.298 21.127 43.699 44.332 53.710

Area 194366 330108 325665 121438 82343 142849

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\do chinh xac trung gian\cao4.lcd

24/03/2018 2:54:00 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 10 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ CHÍNH XÁC TRUNG GIAN

Analysis Report <Sample Information> Sample Name : cao5 Sample ID : cao5 Data Filename : cao5.lcd Method Filename : rauma.lcm Batch Filename : rauma.lcb Vial # : 1-5 Injection Volume : 10 uL Date Acquired : 03/03/2018 1:43:05 SA Date Processed : 03/03/2018 4:11:52 CH

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

43.691 44.324

20

53.671

15.884

30

PDA Multi 1 200nm,4nm

21.108

16.269

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

10

0 0

10

20

30

40

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic

Ret. Time 15.884 16.269 21.108 43.691 44.324 53.671

Area 198853 333980 326083 121341 82366 143957

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\do chinh xac trung gian\cao5.lcd

24/03/2018 2:55:13 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 10 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ CHÍNH XÁC TRUNG GIAN

Analysis Report <Sample Information> : cao6 : cao6 : cao6.lcd : rauma.lcm : rauma.lcb : 1-6 : 10 uL : 03/03/2018 5:03:05 SA : 03/03/2018 6:40:13 CH

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

<Chromatogram>

43.431 44.063

20

53.430

15.719

30

PDA Multi 1 200nm,4nm

21.956

16.111

mAU

10

0 0

10

20

30

40

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic

Ret. Time 15.719 16.111 20.956 43.431 44.063 53.430

Area 184168 293095 294220 119421 76352 133031

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\do chinh xac trung gian\cao6.lcd

25/03/2018 3:36:26 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 11 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ ĐÚNG

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: themchuan1 : themchuan1 : themchuan1.lcd : rauma.lcm : batch 030318.lcb : 1-1 : 10 uL : 04/3/2018 7:40:03 SA : 04/3/2018 11:20:23 SA

Sample Type Level Acquired by Processed by

: Standard 1 : System Administrator : System Administrator

50 40

20 10 0 0

10

43.453 44.086

15.771 16.165

30

53.450

PDA Multi 1 200nm,4nm

21.006

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

20

30

40

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic

Ret. Time 15.771 16.165 21.006 43.453 44.086 53.450

Area 111869 212587 611991 78186 49519 87353

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\dodung\batch\themchuan1.lcd

25/03/2018 3:40:50 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 11 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ ĐÚNG

Analysis Report <Sample Information> Sample Name : them chuan 2 Sample ID : themchuan2 Data Filename : them chuan 2.lcd Method Filename : rauma.lcm Batch Filename : batch 03032018.lcb Vial # : 1-2 Injection Volume : 10 uL Date Acquired : 04/03/2018 9:02:34 SA Date Processed : 04/03/2018 1:01:08 CH

Sample Type Level Acquired by Processed by

: Standard 1 : System Administrator : System Administrator

50 40

20 10 0 0

10

43.458 44.089

15.747 16.140

30

53.448

PDA Multi 1 200nm,4nm

20.985

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

20

30

40

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic

Ret. Time 15.747 16.140 20.985 43.458 44.089 53.448

Area 118403 212851 613525 78539 50218 86577

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\dodung\batch\them chuan 2.lcd

25/03/2018 3:41:58 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 11 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ ĐÚNG

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: themchuan3 : themchuan3 : themchuan 3.lcd : rauma.lcm : batchrauma.lcb : 1-3 : 10 uL : 04/03/2018 11:40:00 SA : 04/03/2018 5:02:05 CH

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

50 40

20 10 0 0

10

43.408 44.034

15.739 16.131

30

53.402

PDA Multi 1 200nm,4nm

20.976

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

20

30

40

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic Total

Ret. Time 15.739 16.131 20.976 43.408 44.034 53.402

Area 118131 215602 614502 80746 49428 88063 1166472

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\dodung\batch\themchuan 3.lcd

25/03/2018 3:47:34 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 11 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ ĐÚNG

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: themchuan4 : themchuan4 : themchuan 4.lcd : rauma.lcm : batchrauma.lcb : 1-4 : 10 uL : 04/03/2018 1:10:00 CH : 04/03/2018 6:38:10 CH

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

20 10 0

10

53.387

30

43.395 44.025

40

20.924

50

PDA Multi 1 200nm,4nm

15.692 16.090

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

20

30

40

0 50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic

Ret. Time 15.692 16.090 20.924 43.395 44.025 53.387

Area 116688 215354 612590 78673 47027 86708

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\dodung\batch\themchuan 4.lcd

25/03/2018 3:49:04 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 11 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ ĐÚNG

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: themchuan5 : themchuan5 : themchuan5.lcd : rauma.lcm : batchrauma.lcb : 1-5 : 10 uL : 04/03/2018 2:40:03 CH : 04/03/2018 8:10:00 CH

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

<Chromatogram>

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

50 40

20 10 0

0

10

43.442 44.072

15.770 16.162

30

53.430

20.990

PDA Multi 1 200nm,4nm

20

30

40

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic

Ret. Time 15.770 16.162 20.990 43.442 44.072 53.430

Area 120613 213185 613502 79683 47804 87150

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\dodung\batch\themchuan5.lcd

25/03/2018 3:50:28 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 11 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ ĐÚNG

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: themchuan6 : themchuan6 : themchuan6.lcd : rauma.lcm : batchrauma.lcb : 1-6 : 10 uL : 04/03/2018 4:10:06 CH : 04/03/2018 10:40:13 CH

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

<Chromatogram>

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU

50 40

20 10 0

0

10

43.467 44.102

15.769 16.163

30

53.458

21.002

PDA Multi 1 200nm,4nm

20

30

40

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic

Ret. Time 15.769 16.163 21.002 43.467 44.102 53.458

Area 115866 207555 614162 79341 47266 86431

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\dodung\batch\themchuan6.lcd

26/03/2018 6:28:02 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 12 SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU CAO

Analysis Report <Sample Information> Sample Name : cao96 Sample ID : cao1 Data Filename : cao1.lcd Method Filename : rauma.lcm Batch Filename : batchrauma.lcb Vial # : 1-1 Injection Volume : 10 uL Date Acquired : 19/03/2018 6:15:37 CH Date Processed : 19/03/2018 9:53:50 SA

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

PDA Multi 1 200nm,4nm

10

0 0

10

20

30

40

53.726

20

43.702 44.335

15.846

16.243

30

21.135

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic Total

Ret. Time 15.846 16.243 21.135 43.702 44.335 53.726

Area 193760 324456 323597 124587 82163 145807 1194369

Resolution (USP) -1.052 13.288 58.249 1.484 20.778

Tailing Factor --1.098 1.058 1.076 1.046

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\tham dinh\do lap lai\cao96..lcd

26/03/2018 4:55:22 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 12 SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU CAO

Analysis Report <Sample Information> Sample Name : cao70 Sample ID : cao70 Data Filename : cao70(1).lcd Method Filename : rauma.lcm Batch Filename : rauma.lcb Vial # : 1-1 Injection Volume : 10 uL Date Acquired : 21/03/2108 12:32:03 SA Date Processed : 21/03/2018 6:23:15 CH

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

PDA Multi 1 200nm,4nm

43.675 44.311

20

53.703

15.892

16.279

30

21.114

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

10

0 0

10

20

30

40

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecasossid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic Total

Ret. Time 15.892 16.279 21.114 43.675 44.311 53.703

Area 170855 282714 281611 102427 72037 126565

Tailing factor --1.037 1.031 1.009 1.028

Resolution

-1.047 13.527 59.071 1.487 20.843

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\ung dung\cao 70_ khong\cao70(1).lcd

26/03/2018 4:37:57 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 12 SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU CAO

Analysis Report <Sample Information> Sample Name : cao30 Sample ID : cao30 Data Filename : cao30(1).lcd Method Filename : rauma2602.lcm Batch Filename : rauma.lcb Vial # : 1-3 Injection Volume : 10 uL Date Acquired : 20/03/2018 2:07:34 SA Date Processed : 20/03/2018 6:44:00 CH

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

PDA Multi 1 200nm,4nm

15.902 16.286

7.5

43.667 44.309

21.122

10.0

5.0

2.5

0.0 0

10

20

53.700

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

30

40

50

60 min

Tailing factor --1.030 1.079 1.023 1.031

Resolution

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecasossid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic Total

Ret. Time 15.902 16.286 21.122 43.667 44.309 53.700

Area 31536 35129 75274 19638 24609 63836

-1.069 13.765 61.232 1.561 20.584

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\ung dung\cao 30_khong\cao30(1).lcd

26/03/2018 4:33:57 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 12 SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU CAO

Analysis Report <Sample Information> Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: caonuoc : caonuoc1 : caonuoc(1).lcd : rauma.lcm : batchrauma.lcb : 1-9 : 10 uL : 22/03/2018 3:48:44 SA : 22/03/2018 8:30:04 SA

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

43.598 44.298

10

PDA Multi 1 200nm,4nm

53.704

15.904 16.293

15

21.135

mAU

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

<Chromatogram>

5

0 0

10

20

30

40

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecassosid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic Total

Ret. Time 15.904 16.293 21.135 43.598 44.298 53.704

Area 84060 141136 135016 2006 4320 4241

Tailing factor

-1.044 1.044 3.122 1.153 0.926

Resolution

-1.064 13.536 69.864 1.973 21.526

C:\LabSolutions\Data\Rau ma\Cao rau ma\26-2\ung dung\cao nc\caonuoc(1).lcd

26/03/2018 12:52:55 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 12 SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU CAO

Analysis Report <Sample Information> Sample Name: CRMA Sample ID

: CRMA

Sample Type

: Unknown

Acquired by Processed by

: System Administrator : System Administrator

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Data Filename: CRMA.lcd Method Filename : rauma.lcm Batch Filename : rauma.lcb Vial # : 1-8 Injection Volume : 10 uL Date Acquired : 18/03/2018 5:45:16 SA Date Processed : 18/03/2018 11:25:09 SA

<Chromatogram>

PDA Multi 1 200nm,4nm

15.829 16.193

43.494 44.158

22.157

7.5

5.0

2.5

0.0 0

10

53.566

mAU

20

30

40

50

60 min

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecasossid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic Total

Ret. Time 15.829 16.193 22.157 43.494 44.158 53.566

Area 14060 20443 78983 2028 2070 3291

Tailing factor --0.958 1.373 1.41 0.938

Resolution

-0.931 13.476 48.234 1.721 22.259

26/03/2018 6:29:46 CH Page 1 / 1

PHỤ LỤC 12 SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU CAO

Analysis Report <Sample Information> : CRMB

Sample ID

: CRMB

Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed

: CRMB.lcd : rauma.lcm : rauma.lcb : 1-9 : 10 uL : 17/03/2018 7:20:47 SA : 17/03/2018 10:48:12 SA

Sample Type

:Unknown

Acquired by Processed by

: SystemAdministrator : SystemAdministrator

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sample Name

<Chromatogram> mAU

<Peak Table>

PDA Ch1 200nm Peak# Name 1 asiaticosid B 2 madecasossid 3 asiaticosid 4 acid madecassic 5 acid terminolic 6 acid asiatic Total

Ret. Time 15.808 16.196 21.029 43.523 44.159 53.559

Area 47179 66758 62511 2420 2113 3001

Tailing factor 0.966 0.895 1.082 22.883 1.397 0.955

Resolution

-1.319 15.331 68.860 2.083 21.902

BỘ Y TẾ

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

MÃ VÂN KIỀU

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (Paris polyphylla var. chinensis Franchet) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI – 2018

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

MÃ VÂN KIỀU

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA

(Paris polyphylla var. chinensis Franchet) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu PGS.TS. Đỗ Thị Hà Nơi thực hiện: Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng

HÀ NỘI – 2018

MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .......................................................................................2

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ..........................................2 1.1.1. Dƣợc liệu Bảy lá một hoa .........................................................................2 1.1.2. Vị trí phân loại chi Paris L ........................................................................2 1.1.3. Đặc điểm thực vật .....................................................................................3 1.1.4. Sinh thái và phân bố ..................................................................................4 1.1.5. Công dụng .................................................................................................4 1.1.6. Thành phần hóa học ..................................................................................5 1.1.7. Tình hình nghiên cứu định tính, định lƣợng .............................................7 1.1.8. Tác dụng sinh học .....................................................................................8 1.2. MỘT SỐ HỢP CHẤT SẼ NGHIÊN CỨU TỪ BẢY LÁ MỘT HOA ............10 1.2.1. Paris saponin I ...........................................................................................10 1.2.2. Paris saponin II ........................................................................................ 11 1.2.3. Paris saponin V ......................................................................................... 12 1.2.4. Paris saponin VII ....................................................................................13 1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO..............................14 1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao .............................................14 1.3.2. Máy HPLC ..............................................................................................15 1.3.3. Các thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký............................................15

1.3.4. Ứng dụng của kỹ thuật HPLC .................................................................16 1.3.5. Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector) ........................18 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................20 2.1. ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ ............................................20 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ..............................................................................20 2.1.2. Dung môi, hóa chất .................................................................................20 2.1.3. Dụng cụ, thiết bị ......................................................................................21

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..........................................................................21 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................22 2.3.1. Chuẩn bị mẫu thử ....................................................................................22 2.3.2. Chuẩn bị các chất đối chiếu ....................................................................23 2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký .............................................................23 2.3.4. Thẩm định phƣơng pháp phân tích ..........................................................24 2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu .......................................................................26 CHƢƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .....................................................27 3.1. ĐỘ ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN................................27 3.1.1. Độ ẩm của dƣợc liệu ...............................................................................27 3.1.2. Chiết xuất ................................................................................................27 3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ...............................................................28 3.2.1. Lựa chọn cột sắc ký .................................................................................28 3.2.2. Lựa chọn pha động ..................................................................................28 3.2.3. Lựa chọn tốc độ dòng ..............................................................................29 3.2.4. Lựa chọn bƣớc sóng phát hiện ................................................................29 3.3. NHẬN DẠNG CÁC PIC TRÊN SẮC KÝ ĐỒ CỦA CÁC CHẤT ĐỐI CHIẾU ...................................................................................................................31

3.4. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG BẢY LÁ MỘT HOA ..............................................................................33 3.4.1. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký ...............................................37 3.4.2. Độ lặp lại của phƣơng pháp ...................................................................39 3.4.3. Khoảng nồng độ tuyến tính .....................................................................41 3.4.4. Độ đúng ...................................................................................................45 3.4.5. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) .......................43

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

3.5. ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG BẢY LÁ MỘT HOA ..............................................................................44 3.5.1. Xác định hàm lƣợng các chất trong phần thân rễ cây Bảy lá một hoa ...44 3.5.2. Xác định hàm lƣợng các chất trong phần thân rễ cây Bảy lá một hoa thu hái đƣợc .................................................................................................45 3.5.3. Xác địn hàm lƣợng các chất có trong một số sản phẩm phân lập đƣợc từ cây Bảy lá một hoa .................................................................................47 CHƢƠNG IV: BÀN LUẬN......................................................................................51 4.1. VỀ PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU ...........................................................51 4.2. VỀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ......................................................51 4.3. VỀ THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ...........................................................51 4.4. VỀ KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG CÁC CHẤT VÀ SO SÁNH THÀNH PHẦN CÁC DỊCH CHIẾT ...................................................................................52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................................55 KẾT LUẬN ...........................................................................................................55 ĐỀ XUẤT .............................................................................................................55

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AEPPC:

Dịch chiết Bảy lá một hoa (aqueous

extracts of Paris

polyphylla var. chinensis) DAD: HPLC:

Detector mảng diod (Diod Array Detector) Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid Chromatography)

HPLC – MS: Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (High- Performance Liquid Chromatography–Mass Spectrometry) Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ:

Giới hạn định lƣợng (Limit of Qualification)

NMR:

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

LOD:

Resonance)

RSD:

Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation)

S/N:

Tín hiệu/nhiễu đƣờng nền (Signal/Noise)

SKĐ:

Sắc ký đồ

STT:

Số thứ tự

PS I:

Paris saponin I

PS II:

Paris saponin II

PS VI:

Paris saponin VI

PS VII:

Paris saponin VII

PPC:

Paris polyphylla var. chinensis

cs:

Cộng sự

DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm bột dƣợc liệu ............................................ 27 Bảng 3.2. Sự phù hợp của hệ thống HPLC về thời gian lƣu. ...........................33 Bảng 3.3. Sự phù hợp của hệ thống HPLC về diện tích pic. .......................... 34 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PS VII ........................................... 35 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PS VI. ........................................... 36

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PS II .............................................. 36 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PS I ............................................... 37 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PS VII .............. 37 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PS VI ................ 38 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PS II ............... 39 Bảng 3.11. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PS I ................. 39 Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ đúng với PS VII ........................................... 41 Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ đúng với PS VI ............................................ 41 Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng với PS II .............................................. 42 Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng với PS I ............................................... 42 Bảng 3.16. Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng ............................................. 43 Bảng 3.17. Kết quả khảo sát LOD và LOQ .................................................... 43 Bảng 3.18. Kết quả xác định nồng độ các chất phân tích trong phần thân rễ của cây Bảy lá một hoa ...............................................................................….44 Bảng 3.19. Kết quả xác định hàm lƣợng các chất phân tích trong phần thân rễ của cây Bảy lá một hoa ...............................................................................….45 Bảng 3.20. Kết quả xác định nồng độ các chất có trong thân rễ của một số mẫu cây Bảy lá một hoa ...................................................................................46 Bảng 3.21. Kết quả xác định hàm lƣợng các chất có trong thân rễ của một số mẫu cây Bảy lá một hoa ...................................................................................47 Bảng 3.22. Kết quả xác định nồng độ và hàm lƣợng chất phân tích trong các dung dịch thử của phần trên mặt đất cây Bảy lá một hoa ................................48 Bảng 3.23. Kết quả xác định hàm lƣợng của chất phân lập PS II ..................... 49

DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Cây bảy lá một hoa - Paris polyphylla var. chinensis Franchet..2 Hình 1.2. Cấu trúc 2 aglycon của nhóm saponin steroid chính trong chi Paris.5 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học một số hợp chất saponin steroid chính ở một số loài thuộc chi Paris. ......................................................................................... 6 Hình 1.4. Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC..................................................... 15

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 1.5. Cấu tạo detector mảng diod (DAD). ............................................... 18 Hình 3.1. Phổ UV – Vis với detector DAD của các chất nghiên cứu .............29 Hình 3.2. SKĐ của hỗn hợp 4 chất nghiên cứu. ............................................. 30 Hình 3.3. SKĐ của dịch chiết cây Bảy lá một hoa . ....................................... 31 Hình 3.4. SKĐ của chất đối chiếu PS VII. ..................................................... 31 Hình 3.5. SKĐ của chất đối chiếu PS VI. ....................................................... 32 Hình 3.6. SKĐ của chất đối chiếu PS II. ........................................................ 32 Hình 3.7. SKĐ của chất đối chiếu PS I........................................................... 32 Hình 3.8. SKĐ của mẫu trắng ......................................................................... 34 Hình 3.9. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của PS VII ....................... 38 Hình 3.10. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của PS VI ...................... 38 Hình 3.11. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của PS II ........................ 39 Hình 3.12. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của PS I ......................... 40 Hình 3.13. SKĐ của dung dịch thử cây Bảy lá một hoa thu hái tại Cao Bằng (trái) và hỗn hợp chuẩn (phải) .........................................................................46 Hình 3.14. SKĐ của dung dịch thử của phần trên mặt đất cây Bảy lá một hoa (trên) và hỗn hợp chuẩn (dƣới) ....................................................................... 48 Hình 3.15. SKĐ của dung dịch thử sản phẩm PS II phân lập đƣợc (a) và của dung dịch đối chiếu PS II (b)................................................................50

LỜI CẢM ƠN

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng một số hợp chất phân lập được từ cây Bảy lá một hoa– Paris polyphylla var. chinensis Franchet”, ngoài sự làm việc nghiêm túc, sự cố gắng, nỗ lực hết mình của bản thân, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự khích lệ từ phía thầy cô, gia đình, bạn bè và nhà trƣờng.

Trƣớc hết, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: GS .TS Thái Nguyễn Hùng Thu PGS .TS Đỗ Thị Hà ngƣời đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hƣớng dẫn nghiên cứu, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: NCS.ThS Cao Ngọc Anh đã cho tôi những đóng góp quý giá về đề tài.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị em Khoa Vật lý – Đo lƣờng, Khoa Hóa thực vật, Viện Dƣợc liệu và Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng. Đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn thầy cô Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, đặc biệt là những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng.

Tác giả trân trọng cám ơn sự tài trợ một phần kinh phí từ Ngân sách sự nghiệp Khoa học của Bộ Y tế, tên đề tài “Nghiên cứu cây Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var. chinensis Smith. theo hƣớng hỗ trợ điều trị ung thƣ vú, Đề tài cấp Bộ Y tế; 50/HĐ-K2ĐT, ngày 11/8/2017”.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên về mọi mặt và giúp đỡ tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 4 năm 2018

Mã Vân Kiều

ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, xu hƣớng trở về với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn thuốc mới và sử dụng thuốc từ thảo dƣợc ngày càng tăng. Ở Việt Nam, với lợi thế địa hình và khí hậu tạo ra nguồn tài nguyên cây cỏ vô cùng phong phú cũng nhƣ nguồn dƣợc liệu dồi dào, cùng với tri thức sử dụng cây cỏ làm thuốc lâu đời.

Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var. chinensis Franchet) là cây thuốc rất quý và rất hiếm ở Việt Nam. Bảy lá một hoa (Paris chinensis) hiện chỉ còn có ở

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

một vài khu rừng nguyên sinh vùng núi cao, trong đó có ở Vƣờn Quốc gia Pù Mát (Nghệ An), Vƣờn Quốc gia Hoàng Liên (Lào Cai). Trên thế giới, chi Paris hiện đã biết có 22 loài, phân bố ở Bhutan, Trung Quốc, India, Japan, Korea, Lào, Mongolia, Myanmar, Nepal, Nga, Sikkim, Thái Lan, Việt Nam.

Với thành phần hóa học chính là Saponin steroid và Polyphyllin, Bảy lá một hoa (Paris chinensis) đã đƣợc chứng minh có các tác dụng điều trị ung thƣ, cầm máu, giảm đau, chống viêm, cầm máu, kích thích miễn dịch, chữa rắn độc cắn,... Ở Việt Nam, NCS. Nguyễn Thị Duyên là ngƣời đầu tiên nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Bảy lá một hoa (Paris chinensis), đã nhận biết, chiết xuất và phân lập đƣợc môt số thành phần từ cây Bảy lá một hoa là gracillin, paris saponin D, paris saponin H, paris saponin I, paris saponin II, paris saponin VI, paris saponin VII, diosgenin, pennogenin, dioscin…. Tuy nhiên hiện nay vẫn chƣa có tài liệu nào xây dựng đƣợc tiêu chuẩn để kiểm nghiệm chất lƣợng của dƣợc liệu này và các sản phẩm có chứa nó. Để đánh giá tiềm năng và góp phần tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp định lƣợng một số chất phân lập đƣợc của cây Bảy lá một hoa – Paris polyphylla var. chinensis Franchet” với 2 mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính và định lượng bằng HPLC một số hợp chất phân lập được từ cây Bảy lá một hoa.

2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng một số chất phân lập được trong dược liệu và các sản phẩm chiết xuất từ Bảy lá một hoa thu hái ở Việt Nam. 1

CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1.

TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

1.1.1. Dƣợc liệu Bảy lá một hoa Bảy lá một hoa còn có các tên gọi thông thƣờng khác là thất diệp nhất chi hoa, tảo hƣu, cúa dô (H’Mông), tên nƣớc ngoài Parisette, Herbe – Paris (Pháp).

Tên khoa học là Paris polyphylla var. chinensis Franchet. thuộc họ Trọng lâu

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

(Trilliaceae), chi Paris [1].

Hình 1.1. Cây bảy lá một hoa - Paris polyphylla var. chinensis Franchet (tên đồng nghĩa Paris chinensis Franchet) được trồng tại Sapa – Lào Cai 1.1.2. Vị trí phân loại chi Paris L. Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (1987), vị trí phân loại của chi Paris L. là: Phân giới thực vật bậc cao.

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta).

Lớp Hành (Liliopsida).

Phân lớp Loa kèn (Lilidae).

Bộ củ nâu (Dioscoreales).

Họ Bảy lá một hoa (Trọng lâu) (Trilliaceae).

2

Chi Bảy lá một hoa, Tảo hƣu (Paris L.) [2].

Trên thế giới, cho đến nay ngƣời ta đã biết khoảng 22 loài [11], thuộc chi Paris, phân bố ở vùng nhiệt đới và ôn đới, chủ yếu ở châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Butan, Nê pan, Pakistan, Mianma, Thái lan, Việt Nam), châu Âu và châu Mỹ; trong đó có hai loài đƣợc quan tâm nhất là Paris polyphylla var. yunnanensis và Paris polyphylla var. chinensis Franchet [1], [4], [9]. Theo thông tin cập nhật trên trang “The plantlist”, đến thời điểm 2016 có 36 loài thuộc chi Paris đã đƣợc chấp nhận tên khoa học.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Ở Việt Nam, chi Paris L. có 6 loài [4] gồm: (1). Paris delavayi Franch.

(Trọng lâu kim tiền) phân bố ở Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Phó Bảng), Cao Bằng (Nguyên Bình), Vĩnh Phúc (Tam Đảo); (2). Paris polyphylla Smith (Trọng lâu nhiều lá) phân bố ở Sơn La (Mộc Châu); (3). Paris hainanensis Levl. (Trọng lâu hải nam) phân bố ở Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Hải An), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Ninh Bình (Cúc Phƣơng), Kon Tum (Kon Plong); (4). Paris yunnanensis Franch.

(Trọng lâu vân nam) phân bố ở Lào Cai (Sa Pa), Lai Châu (Phong Thổ); (5). Paris chinensis Franch. (Bảy lá một hoa, Tảo hƣu) phân bố ở Lào Cai (Sa Pa), Yên Bái (Nghĩa Lộ), Lai Châu (Tuần Giáo), Phú Thọ (Thanh Sơn), Hà Tây (Ba Vì), Hoà Bình (Lƣơng Sơn, Mai Châu, Pà Cò); (6). Paris fargesii Franch. phân bố ở Sa Pa (Lào Cai).

Gần đây, các nhà nghiên cứu đã bổ sung thêm thành phần loài thuộc chi Paris ở Việt Nam gồm: (7) Paris vietnamensis (Takht.) H. Li; (8). Paris caobangensis Y.H. Ji, H. Li, Z. K. Zhou; (9) Paris cronquistii (Takht.) H. Li.; (10).

Paris xichouensis (H. Li) Y. H. Ji, H. Li & Z. K. Zhou; (11). P dunniana H. Lesv [12].

1.1.3. Đặc điểm thực vật Cây cỏ nhiều năm, cao 40 - 100 cm; thân rễ gần hình trụ ngắn, nằm ngang, đƣờng kính khoảng 2 cm; thân trên mặt đất thẳng đứ vfng, đơn độc không phân nhánh, nảy mầm vào mùa xuân, tàn lụi vào mùa đông. Lá 5 - 6, xếp thành 1 vòng trên thân; phiến lá mỏng, màu lục, hình trứng ngƣợc, hình thuôn, kích thƣớc 25  5 3

- 7 cm, 5 - 7 gân chính, xuất phát từ gốc, chóp nhọn, gốc tròn hoặc hình nêm, cuống dài 2,5 - 4 cm. Hoa mọc đơn độc ở đỉnh thân, to, đều, lƣỡng tính; cuống dài 15 - 40 cm, thẳng đứng. Đài 5 - 6, dạng lá, rời nhau, hình mũi giáo, kích thƣớc 5 8 × 1,5 - 2,5 cm, màu lục. Cánh hoa 5 - 6, màu vàng, dạng dải, kích thƣớc 4,5 - 6  0,1 cm, bằng nhau. Nhị 10 - 12, dài 1,5 - 3 cm; chỉ nhị dẹp, dài 0,5 - 1,2 cm, đính ở gốc mảnh bao hoa; bao phấn hình thuôn, đính gốc, 2 ô, mở bằng khe dọc, đỉnh trung đới kéo dài thành hình kim, dài 1 - 3 mm. Bầu thƣợng, hình trứng, 4 - 5 lá

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

noãn, 5 - 6 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn; vòi nhuỵ 5 - 6, dính nhau phần gốc; đầu nhuỵ 5 - 6. Quả nang, mở ở lƣng ô. Hạt màu nâu tối, hình cầu hoặc hình bầu dục, nhẵn, vỏ hạt mọng nƣớc hoặc không, có nội nhũ rắn chắc hoặc nạc chứa dầu, mỡ, tinh bột, phôi nhỏ, hình cầu hoặc hình trứng [9], [11].

1.1.4. Sinh thái và phân bố

Bảy lá một hoa mọc nơi đất ẩm, nhiều mùn, gần bờ nƣớc, khe suối hay hốc đá, dƣới tán rừng kín thƣờng xanh ở độ cao trên 600 m. Mùa ra hoa tháng 2 - 6, mùa quả tháng 3 - 10.

Bảy lá một hoa phân bố ở Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Phó Bảng), Cao Bằng (Nguyên Bình), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Sơn La (Mộc Châu), Ninh Bình (Cúc Phƣơng), Kon Tum (Kon Plong), Lai Châu (Phong Thổ), Phú Thọ (Thanh Sơn), Hà Tây (Ba Vì), Hoà Bình (Lƣơng Sơn, Mai Châu: Pà Cò). Ngoài ra, Bảy lá một hoa còn có ở Mianma, Trung Quốc, Lào, Thái Lan [1], [6], [9].

1.1.5. Công dụng

Bảy lá một hoa là một vị thuốc dùng trong dân gian. Theo đông y, bảy lá một hoa có vị ngọt, hơi cay, tính bình không độc. Tác dụng chủ yếu của nó là thanh nhiệt giải độc. Thân rễ bảy lá một hoa chữa sốt, sốt rét cơn, kinh giản, giải độc, nhất là bị rắn cắn, chữa mụn nhọt, viêm tuyến vú, sốt rét ho lao, ho lâu ngày, hen xuyễn. Dùng ngoài với tác dụng tiêu sƣng, sát trùng. Giã than rễ đắp lên những nơi sƣng đau, vết rắn cắn, tràng nhạc, mụn lở, nhọt. [1], [4], [9].

Ngày dùng 4-12g dƣới dạng thuốc sắc, dùng ngoài không kể liều lƣợng. Ở Trung Quốc, vị thuốc tảo hƣu đƣợc chế biến từ thân rễ nhiều loài cây 4

thuộc chi Paris mọc ở những tỉnh miền Tây Nam Trung Quốc đã đƣợc dùng chủ yếu làm thuốc chữa sốt, giải độc và chữa ho. Ở Ấn Độ và Nê Pan, thân rễ bảy lá một hoa trị giun sán bằng cách uống bột thân rễ mỗi lần một thìa cà phê, ngày một lần, liền trong hai ngày. Để trị mụn nhọt và nhọt độc, hàng ngày bôi bột nhão chế từ thân rễ bảy lá một hoa một cách đều đặn.

1.1.6. Thành phần hoá học Công bố năm 2014 của nhóm tác giả Wei Jin Chao tổng quan về thành phần

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

hóa học của saponin cho biết hiện đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của trên 126 hợp chất từ chi Paris, trong đó chủ yếu lá các saponin steroid. Ngoài ra, chi Paris còn có mặt các phytoecdyson, phytosterol, flavonoid, phenylpropanoid glycosid, spingolipid…Trong đó, thành phần chính đƣợc quan tâm nghiên cứu là saponin steroid [30].

- Saponin steroid: khoảng 94 saponin steroid đƣợc phân lập từ chi Paris trong spirostan saponin có phần aglycon là pennogenin và diosgenin là thành phần chính, ngoài ra còn có mặt các saponin hàm lƣợng thấp hơn nhƣ prototype saponin, hydroxylated pennogenin, nuatigenin, isonuatigenin, pregnenolon…

Cấu trúc 2 aglycon của nhóm saponin steroid chính trong chi Paris xem ở Hình 1.1.

Hình 1.2. Cấu trúc 2 aglycon của nhóm saponin steroid chính trong chi Paris.

5

Các nghiên cứu về thành phần hóa học chủ yếu tập trung ở loài Paris polyphylla var. yunanensis và Paris polyphylla var. polyphylla, một số ít công bố trên các loài khác nhƣ P. polyphylla var. chinensis, P. luquanensis, P. polyphylla var. pseudothibetica, P. pubescens, P. axialis, P. vietnamensis, P. fargesii, P. delavayi,….Thành phần hóa học chính và có nhiều hoạt tính sinh học đƣợc công bố cho đến thời điểm hiện nay là saponin steroid có aglycon là diosgenin và penogenin [37].

Diosgenin saponin có các hợp chất đáng chú ý sau: diosgenin, chonglou

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

saponin I (polyphylin D, paris saponin I), chonglou saponin II (paris saponin II, paris II, polyphyllin II), dioscin (paris saponin III), paris IV, paris V, gracillin, polyphyllin C, E, F, trillin… Penogenin saponin gồm có các hợp chất đáng chú ý sau: chonglou saponin VI (paris saponin VI, paris VI), chonglou saponin VII (paris saponin VII, paris VII, Tg), paris saponin H (paris H) [37].

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học một số hợp chất saponin steroid chính ở một số loài thuộc chi Paris.

6

1.1.7. Tình hình nghiên cứu định tính, định lƣợng 1.1.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Mặc dù có nhiều công bố về chi Paris ở nƣớc ngoài, nhƣng chủ yếu tập trung trên đối tƣợng Paris polyphylla var. yunnanensis, các nghiên cứu trên đối tƣợng Paris polyphylla var. chinensis còn khá khiêm tốn.

Năm 2010, Ting Zhang và các cộng sự đã sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với máy sắc ký lỏng khối phổ để định lƣợng saponin steroid trong thân rễ của Paris polyphylla var. yunnanensis và P. polyphylla var. chinensis. Các thí

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

nghiệm đƣợc tiến hành với điều kiện sắc ký dùng cột C18, gradient pha động gồm acid formic 0,1 % và acetonitril. Các mảnh đặc trƣng của saponin steroid diosgenin và pennogenin đã đƣợc nghiên cứu sử dụng nguồn ion hóa ở chế độ ion âm. Dữ liệu phổ khối đã cung cấp thông tin cấu trúc về chuỗi đƣờng của các chuỗi oligosaccharid và các aglycon của saponin steroid. Kết quả xác định đƣợc mƣời saponin và bảy saponin trong P. polyphylla var. yunnanensis và P. polyphylla var. chinensis, bao gồm bốn hợp chất không rõ. Các giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) dao động từ 0,5 đến 10 ng / ml và từ 2 đến 34 ng / mL tùy thuộc vào từng chất khác nhau trong 6 chất đã tìm ra. Khả năng thu hồi từ 92% đến 104% đối với tất cả các hợp chất. Phƣơng pháp này đã đƣợc sử dụng thành công để định lƣợng đồng thời sáu saponin steroid chủ yếu trong thân rễ của hai loài Paris này. [33]

1.1.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Các nghiên cứu về phƣơng pháp định tính, định lƣợng thành phần trong Paris polyphylla var. chinensis Franchet ở Việt Nam cho đến nay còn rất hạn chế.

Tháng 7 năm 2017, trong luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Duyên [10] đã bƣớc đầu đề xuất dấu vân tay hóa học của một số loài thuộc chi Paris bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả cho thấy có sự khác biệt về thành phần hóa học giữa các loài thuộc chi Paris thu ở Việt Nam. Mặt khác, thông qua tín hiệu píc của các hợp chất trên sắc ký đồ TLC và HPLC, sự có mặt của các hợp chất của loài Paris polyphylla var. chinensis 7

thu hái tự nhiên và trồng cũng có những khác biệt. Đặc biệt, hợp chất paris saponin II trong phần trên mặt đất mẫu trồng có cƣờng độ píc cao hơn loài thu tự nhiên.

Những nghiên cứu bƣớc đầu này đã đề xuất 2 phƣơng pháp HPLC và TLC để xác định dấu vân tay của một số loài thuộc chi Paris phục vụ cho các nghiên cứu sâu về lĩnh vực này trong tƣơng lai.

1.1.8. Tác dụng sinh học 1.1.8.1. Tác dụng chống ung thư Theo tác giả Sun Jing và cs, cao chiết cồn 95% của loài Paris polyphylla

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

có tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thƣ gan ngƣời SMMC-7721 phụ thuộc theo thời gian và nồng độ [23]. Một nghiên cứu khác của nhóm tác giả Qin Xu-Jie và cs năm 2016 đã đánh giá tác dụng của các saponin steroid phân lập từ thân và lá của loài P. polyphylla var. yunnanensis trên các dòng tế bào ung thƣ gan Hep G2, HEK293. Nhóm tác giả Nhật Bản là Mimaki Yoshihiro năm 2000 đã đánh giá tác dụng của saponin steroid từ thân rễ Paris polyphyla var. chinensis trên tế bào ung thƣ vú [27].

Theo Kang li-Pin và cs, các polyhydroxylated steroidal glycosid phân lập từ Paris polyphylla gồm các parisyunnanosid G-I, parisyunnanosid J, padelaosid B, pinnatasteron, 20-hydroxyecdyson, paris saponin I, Th, proto-glacillin có tác dụng độc tế bào ung thƣ máu CCRF [24].

Polyphyllin

D

(PD;

diosgenyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1/2)-(α-L-

arabinofuranosyl)-(1/4)]-[-D-glucopyranosid) là thành phần mang lại tác dụng cho loài Paris polyphylla có tác dụng chống ung thƣ vú [20].

Polyphyllin D thể hiện tác dụng trong điều trị ung thƣ gan. Theo nghiên cứu, poyphyllin D có tác dụng ức chế đối với dòng tế bào ung thƣ gan HepG2 và cả dòng tế bào ung thƣ gan kháng thuốc R-HepG2 với IC50 lần lƣợt là 7 µM và 5 µM, tỉ số kháng thuốc là 0,7 [21].

Theo Lin-Lin Gao và cộng sự, dioscin phân lập từ Paris chinensis thể hiện tác dụng ức chế sự tăng trƣởng của dòng tế bào ung thƣ buồng trứng SKOV3 phụ thuộc thời gian và liều. Dioscin làm tăng đáng kể quá trình chết tự nhiên của tế bào 8

do làm tăng nồng độ Ca+ quá mức trong ti thể, dẫn đến tăng nồng độ enzym caspase-3 và cytochrom C trong tế bào SKOV3 [18] .

1.1.8.2. Tác dụng khác Ngoài tác dụng chống ung thƣ, một số loài thuộc chi Paris còn có tác dụng sinh học khác nhƣ: + Tác dụng chống oxy hóa in vitro từ lá của Paris polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch.) Hand.-Mazz [26]; + Tác dụng kháng virus, kháng nấm của cao chiết cồn 70% thân rễ Paris

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

polyphylla Smith trên Cladosporium cladosporioides và các loài Candida [12] và dịch chiết ethanol 95% từ thân rễ loài này tác dụng kháng Enterovirus 71 (EV71) và coxsackievirus B3 (CVB3); tác dụng kháng EV71 mạnh hơn [34]; + Tác dụng kháng ký sinh trùng in vivo của dịch chiết methanol từ rễ P. polyphylla var. yunnanensis và saponin dioscin và polyphyllin D phân lập từ thân rễ loài này trên ký sinh trùng Dactylogyrus intermedius [14];

+ Tác dụng hạ sốt, giảm đau, an thần của Paris polyphylla và một số saponin chính phân lập từ loài này và cao chiết cồn 6 loài thuộc chi Paris gồm P. polyphylla var. yunnanensis, P. polyphylla var. chinensis, P. fargesii, P. thibetica, P. vietnamensis và P. stenophylla có tác dụng giảm đau, an thần. Trong đó, các loài P. polyphylla var. yunnanensis và P. polyphylla var. chinensis thể hiện tác dụng giảm đau tốt hơn các loài còn lại, trong khi P. polyphylla var. chinensis, P. fargesii và P. thibetica có tác dụng an thần tốt hơn.

9

1.2.

MỘT SỐ HỢP CHẤT SẼ NGHIÊN CỨU TỪ BẢY LÁ MỘT HOA

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1.2.1. Paris saponin I

Tên khác: Polyphyllin I, Polyphyllin D

Công thức phân tử: C44H70O16 (M = 855,028 g/mol) [17].

1.2.1.1 Tính chất vật lý Bột màu trắng.

1.2.1.2. Tính chất dược lý

Paris saponin I, phân lập từ loài Paris polyphylla đƣợc chứng minh có tác dụng điều trị ung thƣ gan. Theo nghiên cứu, paris saponin I có tác dụng ức chế đối với dòng tế bào ung thƣ gan HepG2 và cả dòng tế bào ung thƣ gan kháng thuốc RHepG2 với IC50 lần lƣợt là 7 µM và 5 µM, tỉ số kháng thuốc là 0,7. Cơ chế tác dụng do hợp chất paris saponin I kích thích quá trình chết của tế bào thông qua việc làm rối loạn chức năng ti thể. Hợp chất paris saponin I làm giảm điện thế màng ti thể, sinh ra H2O2 và giải phóng các yếu tố kích hoạt quá trình chết của tế bào cytochrom C và AIF. Tác dụng này phụ thuộc theo nồng độ và thời gian [21].

Bên cạnh đó, paris saponin I còn có tác dụng gây độc tế bào ung thƣ vú. Kết quả nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng sau 48 h nuôi cấy, chất paris saponin I ức chế cả hai dòng tế bào ung thƣ vú MCF-7 và MDA-MB-231 với IC50 tƣơng ứng là 5 µM và 2,5 µM, cao hơn so với tamoxifen có IC50 lần lƣợt là 18 µM và 30 µM. Cơ chế tác dụng cũng là do paris saponin I gây rối loạn chức năng ti thể, dẫn đến quá trình chết tế bào. Khi nghiên cứu trên chuột thực nghiệm bị ung thƣ vú do tế bào MCF10

7, sau 10 ngày điều trị, paris saponin I làm giảm kích thƣớc khối u khoảng ~40% ở liều 2,05 mg/kg và ~50% ở liều 2,73 mg/kg. Ở cả hai mức liều này, chất polyphyllin D đều không gây độc với gan và tim [23].

Theo nghiên cứu của Yoshihiro Mimaki và cộng sự phân lập đƣợc 11 saponin steroid trong đó có paris saponin I từ cao methanol phần thân rễ Paris polyphylla var. chinensis. Dịch chiết metanol ức chế 99% tăng sinh tế bào ung thƣ HL-60 ở mức liều 10 µg/ml, IC50=3,3 µg/ml.

Năm 2015, Hao Jiang và cộng sự nghiên cứu tác dụng chống ung thƣ phổi

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

của paris saponin I từ Paris polyphylla Smith var. chinensis (Franch) Hara và Paris polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch) Hand-Mazz. Kết quả cho thấy paris saponin I ức chế dòng tế bào ung thƣ phổi kháng gefitinib PC 9 ZD in vitro với IC50 là 2,5132 μg/ml sau 24 h, giảm tỉ lệ kháng thuốc 1,77 lần. Tác dụng này là do làm tăng tính nhạy cảm của dòng tế bào này với phƣơng pháp xạ trị. Cơ chế đƣợc cho là do paris saponin I gây gián đoạn chu kì tế bào ở pha G2/M và gây ra quá trình chết tế bào do làm tăng enzym caspase 3, yếu tố làm tăng giải phóng cytochrom C Bax, enzym chặn chu kỳ tế bào P21waf1/cip1, giảm sản xuất Bcl 2 – yếu tố ức chế giải phóng cytochrom C [35].

1.2.1.3. Phương pháp định lượng

Sử dụng phƣơng pháp HPLC với cột Thermo BDS Hypersil C 18 (4,6mm× 100 mm; 2,4 µm); nhiệt độ cột: 30oC, pha động: acetonitril và nƣớc với tỷ lệ nƣớc ban đầu là 45%, tăng tuyến tính đến 55% trong 15 phút; tốc độ dòng: 0,8 mL/phút; bƣớc sóng 203 nm.

1.2.2. Paris saponin II

Tên khác: Polyphyllin II 11

Công thức phân tử: C44H70O16 (M = 855,028 g/mol).

1.2.2.1. Tính chất Bột màu trắng.

1.2.2.2. Tác dụng dược lý Năm 2006, Huang Y và cộng sự đã phân lập đƣợc 11 hợp chất, chủ yếu là saponin diosgenin và pennogenin từ Paris vietnamensis (Takht.). Các hợp chất này đƣợc đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thƣ HepG2 và SGC-7901. Kết quả cho

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

thấy có 4 hợp chất có tác dụng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thƣ gan HepG2 và ung thƣ dạ dày SGC-7901 trong đó có hợp chất paris saponin II [21].

1.2.2.3. Phương pháp định lượng Sử dụng phƣơng pháp HPLC với cột Thermo BDS Hypersil C18 (4,6mm× 100 mm; 2,4 µm); nhiệt độ cột: 30oC, pha động: acetonitril và nƣớc với tỷ lệ nƣớc ban đầu là 45%, tăng tuyến tính đến 55% trong 15 phút; tốc độ dòng: 0,8 mL/phút; bƣớc sóng 203 nm.

1.2.3. Paris saponin VI

Tên khác: Polyphyllin VI Công thức phân tử: C39H62O13 (M = 738,912 g/mol).

1.2.3.1. Tính chất vật lý Bột màu trắng.

1.2.3.2. Tác dụng dược lý Năm 2006, Huang Y và cộng sự đã phân lập đƣợc 11 hợp chất, chủ yếu là 12

saponin diosgenin và pennogenin từ Paris vietnamensis (Takht.). Các hợp chất này đƣợc đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thƣ HepG2 và SGC-7901. Kết quả cho thấy có 4 hợp chất có tác dụng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thƣ gan HepG2 và ung thƣ dạ dày SGC-7901 trong đó có hợp chất paris saponin VI [38].

1.2.3.3. Phương pháp định lượng Sử dụng phƣơng pháp HPLC với cột Thermo BDS Hypersil C18 (4,6mm× 100 mm; 2,4 µm); nhiệt độ cột: 30oC, pha động: acetonitril và nƣớc với tỷ lệ nƣớc

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

ban đầu là 35%, tăng tuyến tính đến 45% trong 15 phút; tốc độ dòng: 0,8 mL/phút; bƣớc sóng 203 nm.

1.2.4. Paris saponin VII

Tên khác: Polyphyllin VII

Công thức phân tử: C52H82O11 (M = 1031,2 g/mol).

1.2.4.1. Tính chất vật lý

Dạng bột màu trắng.

1.2.4.2. Nguồn gốc

Từ Paris quadrifolia L. nhóm nghiên cứu của Jerzy Gajdus [21] đã phân lập đƣợc 6 saponin pennogenin. Trong đó có hợp chất paris saponin VII. 1.2.4.3. Tác dụng dược lý Từ Paris quadrifolia L. nhóm nghiên cứu của Jerzy Gajdus [21] đã phân lập đƣợc 6 saponin pennogenin. Trong đó có hợp chất paris saponin VII thể hiện tác dụng ức chế các dòng tế bào ung thƣ HL-60, Hela và MCF-7 với IC50 là 1,0 ± 0,04 μg/ml, 1,8 ± 0,072 μg/ml, 2,4 ± 0,096 μg/ml và 2,0 ± 0,08 μg/ml, 2,5 ± 0,125 13

μg/ml, 3,2 ± 0,128 μg/ml. Một nghiên cứu sau đó cũng chỉ ra rằng hợp chất trên làm giảm khả năng sống của dòng tế bào Hela, IC50 là 0,87 ± 0,05 μg/ml, thông qua cơ chế kích thích quá trình apoptosis bằng cả con đƣờng nội sinh và ngoại sinh [38].

Năm 2014, Wenjie Zhang và cộng sự nghiên cứu tác dụng chống ung thƣ của Paris saponin VII từ thân rễ Paris polyphylla. Kết quả cho thấy hợp chất paris saponin VII ức chế tăng sinh tế bào ung thƣ cổ tử cung Hela với IC50 2,62 ± 0,11μM. Cơ chế tác dụng có thể do hợp chất này kích thích quá trình tự

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

hủy diệt của tế bào bằng con đƣờng nội sinh thông qua việc làm tăng các enzym caspase-3, caspase-9, protein Bax và làm giảm protein Bcl-2 trong tế bào Hela [36].

Năm 2008, nhóm của Dawei Deng nghiên cứu tác dụng chống nấm của Paris polyphylla Smith trên Cladosporium cladosporioides và các loài Candida.

Kết quả cho thấy dịch chiết ethanol 70% thân rễ loài này có tác dụng kháng C. cladosporioides. Nghiên cứu sâu hơn, nhóm đã phân lập đƣợc 3 saponin trong đó có paris saponin VII, saponin này đều tác dụng chống nấm [35].

1.2.4.4.

Phương pháp định lượng

Sử dụng phƣơng pháp HPLC với cột Thermo BDS Hypersil C18 (4,6mm× 100 mm; 2,4 µm); nhiệt độ cột: 30oC, pha động: acetonitril và nƣớc với tỷ lệ nƣớc ban đầu là 35%, tăng tuyến tính đến 50% trong 15 phút; tốc độ dòng: 0,8 mL/phút; bƣớc sóng 203 nm.

1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dƣới áp suất cao. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tƣơng đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào các yếu tố đó. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bởi detector và đƣợc 14

ghi lại nhờ máy ghi và bộ phận xử lý số liệu thành SKĐ với các thông tin về pic của chất phân tích.

Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc ký khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [6].

1.3.2. Máy HPLC Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Bình chứa pha động, bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký ở áp suất cao, hệ tiêm mẫu để đƣa

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mẫu vào pha động, cột sắc ký, detector, hệ thu nhận và xử lý dữ liệu.

Hệ thống cấp dung môi

Hệ thu nhận xử lý dữ liệu (máy ghi, máy tính)

Bơm

Bộ phận tiêm mẫu

Detector

Cột sắc ký

Thải

Hình 1.4. Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC.

1.3.3. Các thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký 1.3.3.1. Thời gian lưu tR

Thời gian lƣu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector. Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lƣu của mỗi chất là hằng định, vì vậy có thể dùng thời gian lƣu để phát hiện định tính các chất.

Thời gian chết tM là thời gian lƣu của chất không bị lƣu giữ.

Thời gian lƣu hiệu chỉnh t’R = tR – tM. 1.3.3.2. Hệ số dung lượng k’ và hệ số chọn lọc  Hệ số dung lƣợng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lƣợng chất tan trong pha tĩnh 15

và lƣợng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.  Hệ số chọn lọc  đặc trƣng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B. Thƣờng chọn  dao động từ 1,05 – 2. Nếu  quá lớn, thời gian phân tích sẽ dài.

1.3.3.3. Độ phân giải RS Độ phân giải của cột đánh giá khả năng tách hai chất trong hỗn hợp trên cột sắc ký: Rs =

RS: độ phân giải

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

trong đó:

=

(tR)1, (tR)2: thời gian lƣu chất 1, 2

W1, W2: lần lƣợt là độ rộng pic 1, 2 ở các đáy pic

W1/2 1, W1/2 2: lần lƣợt là độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic RS  1,5 thì 2 pic coi nhƣ tách đƣợc hoàn toàn.

1.3.3.4. Số đĩa lý thuyết

Mỗi cột sắc ký có thể đƣợc coi gồm nhiều lớp mỏng xếp sát nhau gọi là đĩa lý thuyết. Ở mỗi đĩa lý thuyết sẽ diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Số đĩa lý thuyết là đại lƣợng đặc trƣng cho hiệu lực cột sắc ký.

N =16(

trong đó:

) = 5,54(

)

W là chiều rộng pic ở đáy pic

W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic 1.3.4. Ứng dụng của kỹ thuật HPLC 1.3.4.1. Định tính Ngƣời ta có thể dùng HPLC để định tính bằng một số cách sau [6]: - So sánh thời gian lƣu của các chất phân tích trong dung dịch thử với thời gian lƣu của chất chuẩn chạy cùng điều kiện sắc ký.

- So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã thêm chuẩn đối chiếu.

- So sánh phổ UV-Vis (chồng phổ) giữa phổ mẫu thử với phổ chất đối chiếu bằng 16

detector DAD thông qua hệ số Match.

- Có thể kết nối HPLC – phổ IR hoặc HPLC – MS định tính dựa vào nhóm chức (IR) hoặc số khối (MS).

1.3.4.2. Định lượng Tất cả các phƣơng pháp định lƣợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc [6]: nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.

Có 4 phƣơng pháp định lƣợng thƣờng đƣợc sử dụng trong sắc ký:  Phƣơng pháp chuẩn ngoại

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

 Phƣơng pháp chuẩn nội

 Phuơng pháp thêm chuẩn

 Phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích Trong luận văn này phƣơng pháp chuẩn ngoại đƣợc chọn sử dụng. Đây là phƣơng pháp định lƣợng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều đƣợc tiến hành trong cùng điều kiện. So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) của mẫu chuẩn sẽ tính đƣợc nồng độ của các chất trong mẫu thử.

Có thể sử dụng chuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm.  Chuẩn hóa 1 điểm

Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử. Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức:

CX =CS (

trong đó:

)

CX: nồng độ chất thử CS: nồng độ chất chuẩn SX: diện tích (chiều cao) của pic mẫu thử SS: diện tích (chiều cao) của pic mẫu chuẩn

 Chuẩn hóa nhiều điểm Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu đƣợc là diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn. Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự tƣơng quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao 17

H) pic với nồng độ của chất chuẩn (C). Sử dụng đoạn tuyến tính của đƣờng chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định. Có thể tính theo 2 cách: - Áp dữ kiện diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đƣờng chuẩn sẽ suy ra đƣợc nồng độ của nó.

- Xây dựng đƣờng hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) pic với nồng độ chất cần xác định.

S  a C  b

S: Diện tích pic

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

a: Độ dốc của đƣờng chuẩn

b: Giao điểm của đƣờng chuẩn với trục tung C: Nồng độ của chất thử

Dựa vào phƣơng trình hồi quy này ta tính đƣợc nồng độ chất thử: C 

Sb a

Chú ý: Độ lớn của diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu thử phải nằm trong khoảng nồng độ tuyến tính của đƣờng chuẩn.

1.3.5. Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector) Detector mảng diod (DAD) là một loại detector hấp thụ UV – Vis, đƣợc dùng phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV – Vis (trong khoảng 190 – 800 nm) của các chất phân tích. Một chùm sáng có phổ rộng đi qua mẫu, sau đó đƣợc tách ra thành các bƣớc sóng đơn. Detector có mảng diod để nhận bức xạ đã tán sắc từ một cách tử. Mỗi diod nhạy với một bƣớc sóng nhất định, do đó detector DAD cho phép đo nhiều bƣớc sóng khác nhau cùng một lúc.

Thông thƣờng, chỉ có một hoặc hai bƣớc sóng đƣợc theo dõi trong quá trình chạy sắc ký. Phổ DAD của các pic có thể cung cấp thông tin về độ tinh khiết của pic.

18

Hình 1.4. Cấu tạo detector mảng diod (DAD).

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Quang phổ và sắc ký đồ có thể đƣợc biểu thị trên màn hình nhờ phần mềm của hệ thống xử lý tín hiệu bằng máy tính. Có thể gọi DAD là detector sóng quét bên cạnh detector đo ở bƣớc sóng cố định hoặc thay đổi. Mặt khác, hệ thống này có thể cho đồ thị 3D: độ hấp thụ, bƣớc sóng và thời gian.

Ứng dụng: Đầu dò DAD giúp lựa chọn bƣớc sóng phù hợp cho phân tích, có khả năng vẽ phổ UV – Vis của pic chuẩn và pic thử rồi chồng hai phổ với nhau để thấy sự giống nhau về dạng phổ thông qua hệ số Match.

Khi hệ số match xấp xỉ 1000 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hoàn toàn.

Hệ số match trên 900 thì chỉ ra 2 phổ tƣơng tự. Hệ số match càng gần 1000 thì sự tƣơng tự của 2 phổ càng cao. Hệ số match dƣới 900 chỉ ra 2 phổ khác nhau [1].

19

CHƢƠNG II ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu là cây Bảy lá một hoa thu hái tại Lào Cai vào tháng 11 năm 2017 (PPC 01). Mẫu nghiên cứu đã đƣợc giám định tên khoa học tại Khoa Tài nguyên Dƣợc liệu-Viện Dƣợc liệu (ThS. Nguyễn Quỳnh Nga giám định tên).

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

2.1.2. Dung môi, hóa chất

 Hóa chất tinh khiết phân tích: acid phosphoric.

 Dung môi loại dùng cho HPLC: acetonitril, methanol (Merck – Đức).  Cồn 96o, nƣớc cất hai lần, dung môi n-hexan, ethyl acetat, chloroform, aceton, dichloromethan… (đạt tiêu chuẩn Dƣợc điển Việt Nam IV)  Một số sản phẩm chiết xuất từ các bộ phận khác nhau của Bảy lá một hoa bằng ethanol và sản phẩm phân lập đã đƣợc xác định cấu trúc là PS II.  Chất chuẩn: sử dụng làm chất đối chiếu

+ Paris saponin I: Chuẩn làm việc của Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd (Trung Quốc), số lô: PRF8051026. Hàm lƣợng: 99,92 % (khan), độ ẩm: 1,38%.

+ Paris saponin II: Chuẩn làm việc của Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd (Trung Quốc), số lô: PRF8051027. Hàm lƣợng: 99,78% (khan), độ ẩm: 1,34%. + Paris saponin VI: Chuẩn làm việc của Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd (Trung Quốc), số lô: PRF8051211. Hàm lƣợng: 99,95% (khan), độ ẩm: 1,20%. + Paris saponin VII: Chuẩn làm việc của Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd (Trung Quốc), số lô: PRF8041822. Hàm lƣợng: 99,37% (khan), độ ẩm: 1,12%.

20

2.1.3. Dụng cụ, thiết bị Sử sụng các thiết bị của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng đƣợc hiệu chuẩn định kỳ theo quy định:  Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 detector DAD.  Cột sắc ký Phenomenex Luna 5u C18 100A (150 mm  4,6 mm, 5 µm).  Cột sắc ký Phenomenex C18 (100 mm  4,6 mm).

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

 Cột sắc ký Waters – C18 (250 mm  4,6 mm, 5 µm).  Bể siêu âm ELMAS 180/H (Đức).

 Tủ sấy UNB 400 Memmert (Đức).

 Tủ sấy chân không Shellab1430 D-2E (Đức).

 Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45µm.

 Cân phân tích MS 105 Mettler Toledo (Thụy Sĩ) (d = 0,00001 g).  Cân phân tích XS-204 Mettler Toledo (Thụy Sĩ) (d = 0,0001 g).  Bể cách thủy ổn nhiệt WNB14 – Memmert (Đức).  Máy đo pH (Mettler Toledo – Thụy Sỹ).  Micropipet 10-100L, 100-1000L.

 Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống đong...

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

 Khảo sát các điều kiện sắc ký với HPLC để có thể tách hoàn toàn các hợp chất trong hỗn hợp các chất nghiên cứu với nhau và với các hợp chất khác trong dịch chiết cây Bảy lá một hoa.  Định tính các chất dựa vào thời gian lƣu trên sắc ký đồ, kết hợp với chồng phổ UV của chất đối chiếu và thử bằng HPLC detector DAD.  Thẩm định các điều kiện định lƣợng một số hợp chất trên với chất đối chiếu là các chất chuẩn.  Áp dụng để sơ bộ xác định hàm lƣợng các hợp chất trên có trong các phân đoạn thu đƣợc trong quá trình chiết xuất và trong các mẫu cây Bảy lá một 21

hoa đã thu hái đƣợc.

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Chuẩn bị mẫu thử 2.3.1.1. Xác định độ ẩm của bột dược liệu Phần thân rễ (dƣợc liệu) cây Bảy lá một hoa sau khi đƣợc làm khô tự nhiên, nghiền thành bột thô rồi xác định độ ẩm của dƣợc liệu theo phƣơng pháp mất khối lƣợng do làm khô (Phụ lục 9.6, Dƣợc điển Việt Nam IV).

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Dùng chén thủy tinh có nắp mài làm bì đựng mẫu thử, làm khô bì trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC dƣới áp suất thƣờng trong 30 phút, để nguội tới nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm có silica gel rồi cân để xác định khối lƣợng bì. Cân ngay mẫu thử vào bì này một lƣợng chính xác khoảng 1 g, dàn mỏng thành lớp có độ dày khoảng 5 mm, sấy ở 105oC đến khối lƣợng không đổi. Từ đó xác định độ ẩm của bột mẫu nghiên cứu [4].

2.3.1.2. Chiết xuất

Tiến hành khảo sát các phƣơng pháp chiết xuất nhƣ: ngâm ở nhiệt độ phòng, chiết soxhlet và chiết hồi lƣu với các dung môi khác nhau. Phƣơng pháp chiết hồi lƣu với dung môi là methanol đƣợc lựa chọn để chiết xuất thu đƣợc dịch chiết toàn phần.

Tiến hành cân khoảng 100 g bột dƣợc liệu phần thân rễ cây Bảy lá một hoa (đã xác định độ ẩm), chiết hồi lƣu với methanol nhiều lần, gộp dịch lọc, bay hơi dung môi dƣới áp suất giảm đến cắn, cắn đƣợc sấy khô và bảo quản ở 4-6 oC. 2.3.1.3. Tính hiệu suất chiết Hàm lƣợng % của cắn toàn phần so với khối lƣợng bột dƣợc liệu đƣợc tính theo công thức sau: X (%) 

a 100 100 M  (100  x)

22

trong đó: X: Hàm lƣợng (%) M: Khối lƣợng dƣợc liệu đem chiết (g) x: Độ ẩm dƣợc liệu (%) a: Khối lƣợng cắn toàn phần thu đƣợc (g) 2.3.1.4.

Pha dung dịch thử

Tiến hành cân chính xác khoảng 0,2 g cắn, hòa tan hoàn toàn bằng methanol trong bình định mức 50 mL, thêm methanol vừa đủ lắc đều, lọc qua

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

màng lọc 0,45 m trƣớc khi định tính và định lƣợng bằng HPLC. 2.3.2. Chuẩn bị các chất đối chiếu

Cân chính xác một lƣợng từng chất đối chiếu, tính khối lƣợng chẩn có đƣợc theo hàm lƣợng và độ ẩm, hòa tan và định mức bằng methanol để thu đƣợc các dung dịch đối chiếu gốc. Các dung dịch đối chiếu gốc này đƣợc pha loãng bằng methanol để xây dựng dãy dung dịch chuẩn (dung dịch đối chiếu) hoặc thành các dung dịch hỗn hợp chuẩn.

2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký 2.3.3.1. Chọn cột sắc ký

Hiện nay sắc ký phân bố pha đảo là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến với nhiều tính ƣu việt. Dựa trên tính chất của các hợp chất phân lập đƣợc từ cây Bảy lá một hoa, qua tham khảo tài liệu nghiên cứu về phƣơng pháp tách chiết, định lƣợng một số thành phần trong cây Bảy lá một hoa, sắc ký phân bố pha đảo đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu này.

Tiến hành khảo sát trên các cột C18 có kích thƣớc hạt nhồi là 5 µm, với chiều dài cột là 10 cm, 15 cm và 25 cm.

2.3.3.2. Chọn pha động Pha động là một trong những yếu tố quyết định thời gian lƣu giữ các chất phân tích và hiệu quả của sự tách sắc ký.

Qua nghiên cứu tính chất lý hóa của các chất nghiên cứu và tham khảo một số tài liệu. Tiến hành khảo sát với nhiều hệ dung môi khác nhau có thành phần là 23

acetonitril, methanol, nƣớc sao cho các pic của các hợp chất nghiên cứu tách riêng rẽ với thời gian phân tích hợp lý.

2.3.3.3. Chọn tốc độ dòng Tiến hành khảo sát tốc độ dòng trong khoảng 0,8 - 1,2 mL/phút để xác định tốc độ dòng phù hợp cho một thời gian lƣu tối ƣu.

2.3.3.4. Chọn bước sóng phát hiện Quét phổ UV – Vis của các hợp chất nghiên cứu để xác định cực đại hấp thụ của chúng, từ đó chọn bƣớc sóng thích hợp nhất mà tại đó các chất phân tích

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

đều có độ hấp thụ đủ lớn.

2.3.4. Thẩm định phƣơng pháp phân tích

Phép định lƣợng các hợp chất phân lập đƣợc từ cây Bảy lá một hoa bằng phƣơng pháp HPLC đƣợc thẩm định thông qua các chỉ tiêu:  Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký  Độ lặp lại của phƣơng pháp

 Độ tuyến tính và khoảng xác định  Độ đúng

 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lƣợng LOQ 2.3.4.1. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký

Độ chính xác của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, đƣợc xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã đƣợc xử lý.

Cách xác định: tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch đối chiếu đã chuẩn bị ở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lƣu, diện tích pic. Độ lặp lại của hệ thống đƣợc biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD của các đáp ứng phân tích.

Yêu cầu: RSD  2,0%.

Ngoài ra, sự phù hợp của hệ thống còn thể hiện ở tính chọn lọc. Tính chọn lọc là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác (tạp chất hoặc các chất cản trở khác).

Trong HPLC, tính chọn lọc thể hiện: trên sắc ký đồ thu đƣợc từ mẫu trắng 24

và các mẫu tự tạo, pic của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các pic tạp.

Tiến hành: tiêm lần lƣợt mẫu trắng, dung dịch thử, dung dịch đối chiếu vào hệ thống sắc ký; so sánh các sắc ký đồ thu đƣợc.

Yêu cầu: tại thời gian lƣu của chất đối chiếu không xuất hiện pic lạ trên mẫu trắng, mẫu nền.

2.3.4.2. Độ lặp lại của phương pháp Độ lặp lại của một phƣơng pháp phân tích (độ chính xác của tổng thể quy trình phân tích) là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

trình thử nghiệm đƣợc áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, đƣợc xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhƣng các lần lặp lại phải đƣợc thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu...) đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích.

Tiến hành: pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi tiêm vào hệ thống sắc ký, tiêm lặp lại nhiều lần, lấy giá trị trung bình. Độ lặp lại đƣợc biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD của các đáp ứng phân tích.

Yêu cầu: RSD  2,0%.

2.3.4.3. Độ tuyến tính và khoảng xác định

Độ tuyến tính của một phƣơng pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định. Kết quả đƣợc biểu thị bằng phƣơng trình hồi quy y = ax + b và hệ số tƣơng quan r.

Khoảng xác định: là khoảng nồng độ đã đƣợc khảo sát đảm bảo tuyến tính (gọi là khoảng tuyến tính). Khảo sát nồng độ từ 40% đến 200% nồng độ dự kiến phân tích của mẫu.

Cách xác định: chuẩn bị một dãy chất đối chiếu gồm 5 mẫu có nồng độ tăng dần trong khoảng thích hợp. Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng phƣơng trình hồi quy tuyến tính.

Yêu cầu: R2  0,99 (r  0,995).

25

2.3.4.4. Độ đúng Độ đúng là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị thực.

Cách xác định: pha dung dịch thử và dung dịch đối chiếu theo quy trình chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Thêm vào mẫu thử những lƣợng chất đối chiếu khác nhau sao cho tổng lƣợng hoạt chất có trong mẫu nằm trong khoảng tuyến tính rồi tiến hành định lƣợng để xác định hàm lƣợng của các chất trong mẫu thử và mẫu thử có thêm chất đối chiếu dựa trên phƣơng trình

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

đƣờng chuẩn, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Độ đúng sẽ đƣợc tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa lƣợng chất đối chiếu tìm đƣợc so với lƣợng chất đối chiếu thêm vào.

Yêu cầu: độ tìm lại: 95,0 – 105,0%.

2.3.4.5. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ LOD là lƣợng chất thấp nhất của chất cần phân tích có thể phát hiện đƣợc về mặt định tính.

LOQ là lƣợng thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử có thể phát hiện đƣợc về mặt định lƣợng với độ đúng và độ chính xác thích hợp.

Cách xác định: xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đƣờng nền (S/N). Pha loãng dung dịch đối chiếu từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp nhất có thể phát hiện đƣợc bằng sắc ký. Đo tín hiệu liên tục từ mẫu trắng (B) và mẫu thử (S). Thiết lập tỷ số S/N.

 LOD: là nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 3 lần nhiễu đƣờng nền (S/N = 3/1).  LOQ: là nồng độ tối thiểu chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 10 lần nhiễu đƣờng nền (S/N = 10/1).

2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu Các kết quả sắc ký đƣợc xử lý bằng các phần mềm Chemstation của thiết bị HPLC. Sử dụng các phƣơng pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lƣợng đặc trong kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Excel.

26

CHƢƠNG III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. ĐỘ ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN 3.1.1. Độ ẩm của dƣợc liệu Lấy ngẫu nhiên bột dƣợc liệu ở các vị trí khác nhau rồi xác định độ ẩm của dƣợc liệu theo phƣơng pháp mất khối lƣợng do làm khô. Kết quả thu đƣợc nhƣ ở Bảng 3.1.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm bột dược liệu

STT 1 2 3

Khối lượng dược liệu trước sấy (g) 1,0231

Khối lượng dược liệu sau sấy (g) 0,9032

1,0145

0,9037

10,92

1,0567

0,9388

11,16

Trung bình

Độ ẩm (%) 11,72

11,27

3.1.2. Chiết xuất

 Khối lượng cắn toàn phần:

Cân 100,9438 g dƣợc liệu phần thân rễ cây Bảy lá một hoa (độ ẩm 11,27%) đã đƣợc làm nhỏ, chiết hồi lƣu 5 lần, mỗi lần với 1000 mL methanol trong thời gian 60 phút, thu dịch chiết, lọc, bay hơi dung môi dƣới áp suất giảm đến cắn. Cắn đƣợc sấy áp suất giảm ở 60oC đến khối lƣợng không đổi, thu đƣợc 16,0042 g cắn toàn phần, bảo quản ở 4-6oC. Nhận xét: Để định lƣợng các hợp chất trong Bảy lá một hoa đạt kết quả tốt, trƣớc hết cần phải chiết kiệt hoạt chất và làm sạch dịch chiết. Phƣơng pháp chiết siêu âm với methanol đã đƣợc chọn. Đây là phƣơng pháp dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm, thời gian chuẩn bị mẫu ngắn đồng thời cho hiệu suất tƣơng đối cao.  Hiệu suất chiết cắn toàn phần: Với khối lƣợng dƣợc liệu đem chiết (M) là 100,9438 g có độ ẩm (x) là 11,27% và khối lƣợng cắn toàn phần thu đƣợc (a) là 16,0042 g, hiệu suất thu đƣợc cắn toàn 27

phần là 17,87%.

3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 3.2.1. Lựa chọn cột sắc ký Vì mẫu phân tích là dƣợc liệu có nhiều thành phần nên cần có sự tách tốt và thời gian phân tích phù hợp. Cột C18 với kích thƣớc hạt nhồi 5 µm và chiều dài cột 10 cm, 15 cm và 25 cm đƣợc chọn để khảo sát.

Với cột Phenomenex Luna 5u C18 100A (150 mm  4,6 mm, 5 µm) hoặc cột

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Phenomenex Luna 5u C18 (100 mm x 4,6 mm) có kích thƣớc hạt 5 µm, bằng nhiều hệ dung môi khác nhau thu đƣợc các sắc ký đồ trong đó các pic không tách riêng đƣợc.

Trong số các cột khảo sát, chỉ có cột Water – C18 (250 mm  4,6 mm, 5 µm) là phù hợp, cho các pic tách tốt, thời gian lƣu hợp lý (hình 3.2, 3.3).

3.2.2. Lựa chọn pha động

Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký với cột Waters – C18 (250 mm  4,6 mm, 5 µm). Quá trình khảo sát tiến hành ở nhiệt độ 40 oC.

Chúng tôi tiến hành khảo sát pha động với các hệ dung môi: methanol – nƣớc (có 0,1% acid formic), acetonitril – nƣớc (có 0,1% acid formic), acetonitril – nƣớc (có 0,1% acid phosphoric), methanol – nƣớc (có 0,1% acid phosphoric) với tỷ lệ thành phần khác nhau.

Kết quả khảo sát cho thấy sử dụng hệ pha động acetonitril (kênh A) và dung dịch acid phosphoric 0,1% (kênh B) với chế độ gradient dung môi cho kết quả tốt nhất. Với chƣơng trình chạy nhƣ sau: Thời gian (phút) 0

% kênh A 40

% kênh B 60

15

45

55

35

55

45

36

100

0

40

40

60

Với chƣơng trình chạy này có khả năng tách tốt cả 4 hợp chất cần phân tích, cho pic nhọn, cân đối và thời gian lƣu hợp lý, thời gian phân tích không quá dài. Vì 28

vậy, hệ dung môi trên đƣợc chọn làm pha động trong nghiên cứu này.

3.2.3. Lựa chọn tốc độ dòng Tiến hành khảo sát ở các tốc độ dòng khác nhau 0,8 mL/phút; 1,0 mL/phút; 1,1 mL/phút và 1,2 mL/phút. Kết quả cho thấy tốc độ dòng 1,0 mL/phút là phù hợp vì kết quả tách tốt, pic cân đối, thời gian lƣu hợp lý.

3.2.4. Lựa chọn bƣớc sóng phát hiện Lấy phổ UV – Vis từ máy HPLC với detector DAD của các pic tƣơng ứng với chất nghiên cứu. Hình ảnh phổ UV - Vis của các chất nghiên cứu đƣợc thể hiện

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

trong hình 3.1.

PS I

PS II

PS VI

PS VII

Hình 3.1. Phổ UV – Vis với detector DAD của các chất nghiên cứu 29

Dựa vào phổ hấp thụ của các chất đối chiếu, bƣớc sóng 203 nm đƣợc chọn cho các nghiên cứu tiếp theo để tất cả các chất đều có thể cho pic có diện tích đủ lớn.

Qua khảo sát, điều kiện sắc ký lựa chọn đƣợc nhƣ sau: - Cột: Water– C18 (250 mm  4,6 mm, 5 µm), nhiệt độ 40 oC. - Pha động: sử dụng hệ pha động acetonitril (kênh A) và dung dịch acid phosphoric 0,1 % (kênh B) với chế độ gradient dung môi. % kênh A 40

% kênh B 60

15

45

55

35

55

45

36

100

0

40

40

60

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Thời gian (phút) 0

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút.

- Detector DAD với  = 203 nm.

- Thể tích tiêm: 10 L.

Với điều kiện sắc ký nhƣ trên, các chất trong hỗn hợp chuẩn và trong mẫu thử chuẩn bị từ dịch chiết toàn phần Bảy lá một hoa đều đƣợc tách tƣơng đối tốt, pic cân đối, thời gian lƣu hợp lý. Các SKĐ thu đƣợc nhƣ ở hình 3.2 và hình 3.3.

Hình 3.2. SKĐ của hỗn hợp 4 chất đối chiếu.

30

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 3.3. SKĐ của dịch chiết Bảy lá một hoa.

Tiến hành sắc ký với từng chất đối chiếu (hình 3.4 đến hình 3.7) và so sánh với SKĐ thu đƣợc của hỗn hợp 4 chất (hình 3.2) xác định đƣợc thời gian lƣu của các chất PS VII, PS VI, PS II và PS I lần lƣợt là khoảng 10,5 phút; 13,2 phút; 22,7 phút và 25,6 phút.

3.3. NHẬN DẠNG CÁC PIC TRÊN SẮC KÝ ĐỒ CỦA CÁC CHẤT ĐỐI CHIẾU Thực hiện chƣơng trình sắc ký đã chọn ở mục 3.2 với 4 chất đối chiếu thu đƣợc các SKĐ nhƣ ở các hình 3.4 – 3.7.

Hình 3.4. SKĐ của chất đối chiếu PS VII.

31

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T Hình 3.5. SKĐ của chất đối chiếu PS VI.

Hình 3.6. SKĐ của chất đối chiếu PS II.

Hình 3.7. SKĐ của chất đối chiếu PS I. 32

Tiến hành so sánh phổ UV-Vis trên máy HPLC với detector DAD của các pic có cùng thời gian lƣu trên sắc ký đồ với hỗn hợp chất đối chiếu và mẫu thử là dịch chiết Bảy lá một hoa.

Kết quả thu đƣợc khi tiến hành chồng phổ UV – Vis với detector DAD của phổ chất đối chiếu và phổ mẫu thử với cùng thời gian lƣu cho hệ số Match của các chất nhƣ sau: PS VII là 990,1; PS VI là 994,5; PS II là 996,7 và PS I là 998,3.

Từ kết quả trên chỉ ra rằng giữa phổ của mẫu thử trong dịch chiết Bảy lá một hoa và phổ của các chất đối chiếu là khá tƣơng đồng.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

3.4. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG BẢY LÁ MỘT HOA

3.4.1. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch đối chiếu đã chuẩn bị ở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lƣu, diện tích pic. Độ lặp lại của hệ thống đƣợc biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.2 và bảng 3.3.

Bảng 3.2. Sự phù hợp của hệ thống HPLC về thời gian lưu.

STT

Thời gian lưu (phút)

PS VII

PS VI

PS II

PS I

1

10,476

13,182

22,737

25,611

2

10,522

13,220

22,758

25,624

3

10,546

13,240

22,785

25,640

4

10,521

13,220

22,769

25,630

5

10,537

13,234

22,780

25,640

6

10,526

13,227

22,772

25,635

10,521

13,221

22,767

25,630

0,23

0,15

0,08

0,04

Trung bình RSD (%)

33

Bảng 3.3. Sự phù hợp của hệ thống HPLC về diện tích pic.

STT

Diện tích pic (mAU.s) PS VI

PS II

PS I

1

120,8

154,4

379,3

864,9

2

120,5

150,0

378,7

865,9

3

121,2

151,2

380,9

868,8

4

118,6

148,4

375,1

856,0

5

120,5

151,2

381,2

870,5

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

PS VII

6

Trung bình RSD(%)

120,5

151,4

382,7

873,3

120,4

151,1

379,7

866,6

0,75

1,31

0,70

0,69

Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy, RSD của thời gian lƣu và diện tích pic đều nhỏ hơn 2%, chứng tỏ hệ thống sắc ký có độ lặp lại cao đối với các chất phân tích.

Tính chọn lọc đƣợc kiểm tra bằng cách tiêm lần lƣợt mẫu trắng (dung môi pha mẫu), dung dịch thử, dung dịch đối chiếu vào hệ thống sắc ký, kết quả cho thấy dung dịch hỗn hợp chuẩn và dung dịch thử cho pic ở thời gian lƣu tƣơng ứng (hình 3.3 và hình 3.4), còn mẫu trắng không xuất hiện pic ở các thời gian lƣu tƣơng ứng (hình 3.8).

Hình 3.8. SKĐ của mẫu trắng.

34

3.4.2. Độ lặp lại của phƣơng pháp Tiêm 6 mẫu thử riêng biệt vào hệ thống sắc ký, mỗi mẫu thử tiêm lặp lại nhiều lần, lấy giá trị trung bình. Hệ số F là tỷ lệ giữa diện tích pic thu đƣợc trên sắc ký đồ với khối lƣợng cắn đƣợc lấy để chuẩn bị mẫu và đƣợc tính riêng theo từng pic ứng với các hợp chất nghiên cứu.

F

trong đó:

Spic: Diện tích pic

S pic mc

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mc: Khối lƣợng cắn

Độ lặp lại đƣợc biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD của hệ số F. Kết quả khảo sát với từng hợp chất đƣợc ghi trong các bảng 3.4 – 3.7.

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PS VII

STT

Khối lƣợng cắn m (g)

1

0,2034

Diện tích pic S (mAU.s) 163,4

2

0,2118

173,3

818,22

3

0,2130

172,2

808,45

4

0,2044

170,1

832,19

5

0,2088

169,6

812,26

6

0,2130

174,3

818,31

Hệ số F 803,34

Trung bình

815,46

RSD (%)

1,23

35

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PS VI Khối lƣợng cắn m (g)

1

0,2034

Diện tích pic S (mAU.s) 98,8

2

0,2118

100,8

475,92

3

0,2130

100,9

473,71

4

0,2044

101,4

496,09

5

0,2088

100,9

483,24

6

0,2130

101,0

474,18

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

STT

Hệ số F 485,74

Trung bình

481,48

RSD (%)

1,81

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PS II

0,2034

Diện tích pic S (mAU.s) 244,8

1203,54

2

0,2118

247,1

1166,67

3

0,2130

245,1

1150,70

4

0,2044

245,6

1201,57

5

0,2088

246,7

1181,51

6

0,2130

247,2

1160,56

STT

Khối lƣợng cắn m (g)

1

Hệ số F

Trung bình

1177,43

RSD (%)

1,86

36

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PS I

0,2034

Diện tích pic S (mAU.s) 1562,1

7679,94

2

0,2118

1578,4

7452,31

3

0,2130

1584,4

7438,50

4

0,2044

1594,6

7801,37

5

0,2088

1598,1

7653,74

6

0,2130

1607,9

7548,83

Khối lƣợng cắn m (g)

1

Hệ số F

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

STT

Trung bình

7595,78

RSD (%)

1,86

Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD nhỏ. Nhƣ vậy chƣơng trình sắc ký đã lựa chọn có độ lặp lại cao.

3.4.3. Khoảng nồng độ tuyến tính

Với các khối lƣợng chất đối chiếu là 2,15mg (tƣơng ứng 2,11 mg PS VII);2,02 mg (tƣơng ứng 1,99 mg PS VI); 2,39 mg (tƣơng ứng 2,35 mg PS II); 2,57 mg (tƣơng ứng 2,53 mg PS I) các dung dịch chuẩn gốc đƣợc pha. Từ dung dịch chuẩn gốc thu đƣợc pha thành dãy các dung dịch chuẩn gồm 5 mẫu có nồng độ tăng dần trong khoảng thích hợp, tiêm vào hệ thống sắc ký để khảo sát độ tuyến tính. Kết quả đƣợc ghi trong các bảng 3.8 – 3.11.

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PS VII

1

% so với mức định lượng 40

Nồng độ PS VII (mg/mL) 0,0211

Diện tích píc (mAU.s) 53,2

2

80

0,0423

96,2

3

100

0,0528

120,4

4

140

0,0739

168,4

5

200

0,1056

245,7

STT

Phƣơng trình hồi quy: y=2288,3.x+1,4 Hệ số tƣơng quan: r = 0,9993 37

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 3.9. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của PS VII

Bảng 3.9. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PS VI

1

% so với mức định lượng 40

Nồng độ PS VI (mg/mL) 0,0199

Diện tích píc (mAU.s) 64,8

2

80

0,0399

123,3

3

100

0,0499

151,1

4

140

0,0698

226,1

5

200

0,0997

307,9

STT

Phƣơng trình hồi quy: y=3099,7.x+1,5 Hệ số tƣơng quan: r = 0,9985

Hình 3.10. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của PS VI 38

Bảng 3.10. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PS II.

1

% so với mức định lượng 40

Nồng độ PS II (mg/mL) 0,0588

Diện tích píc (mAU.s) 161,8

2

80

0,1176

313,7

3

100

0,1470

379,7

4

140

0,2059

544,4

5

200

0,2941

779,7

STT

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Phƣơng trình hồi quy: y=2633x+2,2 Hệ số tƣơng quan: r = 0,9997

Hình 3.11. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của PS II

Bảng 3.11. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PS I

1

% so với mức định lượng 40

Nồng độ PS I (mg/mL) 0,1266

Diện tích píc (mAU.s) 363,2

2

80

0,2533

730,0

3

100

0,3166

866,6

4

140

0,4432

1300,2

5

200

0,6331

1792,9

STT

Phƣơng trình hồi quy: y=2850,5.x+0,1 Hệ số tƣơng quan: r = 0,9988 39

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 3.12. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của PS I

Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy có sự tƣơng quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic trong khoảng nồng độ khảo sát. Với kết quả này đƣợc sử dụng làm cơ sở để lựa chọn nồng độ định lƣợng của các hợp chất nghiên cứu.

3.4.4. Độ đúng

Thêm vào mẫu thử một lƣợng chính xác chất đối chiếu sao cho tổng lƣợng hoạt chất có trong mẫu nằm trong khoảng tuyến tính. Tiến hành khảo sát độ đúng, kết quả chi tiết cho từng chất đƣợc thể hiện ở các bảng 3.12 – 3.15 và đƣợc tổng hợp trong bảng 3.16.

40

Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ đúng với PS VII C cũ (mg/mL)

S pic mới (mAU.s)

C mới (mg/mL)

C thêm (mg/mL)

C tìm lại % (mg/mL) tìm lại

1

0,1045

0,0369

109,4

0,0480

0,0111

0,0111

100,44

2

0,1056

0,0373

110,8

0,0486

0,0111

0,0113

102,49

3

0,1053

0,0372

110,1

0,0483

0,0111

0,0111

100,67

4

0,1076

0,0380

135,2

0,0593

0,0221

0,0213

96,48

5

0,1032

0,0364

134,2

0,0589

0,0221

0,0224

101,52

6

0,1055

0,0372

133,4

0,0585

0,0221

0,0213

96,26

7

0,1056

0,0373

159,7

0,0701

0,0332

0,0328

98,87

8

0,1023

0,0361

158,9

0,0697

0,0332

0,0336

101,32

9

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

S Lƣợng cân T thử T (g)

0,1089

0,0384

162,2

0,0711

0,0332

0,0327

98,66

Trung bình

99,63

RSD (%)

2,22

Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ đúng với PS VI

S T T

Lƣợng cân thử (g)

C cũ (mg/mL)

S pic mới (mAU.s)

C mới (mg/mL)

1

0,1045

0,0166

83,3

0,0275

0,01075

0,0109

101,34

2

0,1056

0,0168

84,0

0,0277

0,01075

0,0110

101,86

3

0,1053

0,0167

83,1

0,0274

0,01075

0,0107

99,54

4

0,1076

0,0171

115,4

0,0381

0,02150

0,0210

97,65

5

0,1032

0,0164

114,0

0,0376

0,02150

0,0212

98,75

6

0,1055

0,0168

116,0

0,0383

0,02150

0,0215

100,13

7

0,1056

0,0168

146,5

0,0483

0,03225

0,0316

97,91

8

0,1023

0,0162

151,7

0,0501

0,03225

0,0338

104,86

9

0,1089

0,0173

149,2

0,0492

0,03225

0,0319

99,05

C thêm C tìm lại % (mg/mL) (mg/mL) tìm lại

Trung bình

100,12

RSD (%)

2,27

41

Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng với PS II Lƣợng cân thử (g)

C cũ (mg/mL)

S pic mới (mAU.s)

C mới (mg/mL)

C thêm (mg/mL)

1

0,1045

0,0476

190,2

0,0736

0,02542

0,0260

102,38

2

0,1056

0,0481

190,2

0,0736

0,02542

0,0255

100,41

3

0,1053

0,0480

189,4

0,0733

0,02542

0,0253

99,72

4

0,1076

0,0490

257,8

0,0998

0,05083

0,0508

99,90

5

0,1032

0,0470

254,3

0,0985

0,05083

0,0514

101,17

6

0,1055

0,0481

250,1

0,0968

0,05083

0,0488

95,91

7

0,1056

0,0481

311,2

0,1205

0,07587

0,0724

95,38

8

0,1023

0,0466

312,7

0,1211

0,07587

0,0744

98,12

9

0,1089

0,0496

315,9

0,1223

0,07587

0,0727

95,79

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

S T T

C tìm lại % (mg/mL) tìm lại

Trung bình

98,75

RSD (%)

2,60

Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng với PS I

S T T

Lƣợng cân thử (g)

C cũ (mg/mL)

S pic mới (mAU.s)

C mới (mg/mL)

C thêm (mg/mL)

C tìm lại (mg/mL)

% tìm lại

1

0,1045

0,2899

948,1

0,3464

0,0543

0,0565

104,17

2

0,1056

0,2929

950,1

0,3471

0,0543

0,0542

99,89

3

0,1053

0,2921

948,1

0,3464

0,0543

0,0543

100,08

4

0,1076

0,2985

1111,2

0,4060

0,1085

0,1075

99,08

5

0,1032

0,2863

1090,8

0,3985

0,1085

0,1122

103,46

6

0,1055

0,2926

1098,4

0,4013

0,1085

0,1086

100,13

7

0,1056

0,2929

1268,4

0,4634

0,1628

0,1705

104,75

8

0,1023

0,2838

1244,3

0,4546

0,1628

0,1708

104,96

9

0,1089

0,3021

1289,5

0,4711

0,1628

0,1690

Trung bình

103,86 102,26

RSD (%)

2,35

42

Bảng 3.16. Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng của 4 hợp chất phân tích STT

Hợp chất

1

Độ tìm lại (%) min – max

PS VII

99,63

96,26 – 102,49

2

PS VI

100,12

97,65– 104,86

3

PS II

98,75

95,38– 102,38

4

PS I

102,26

99,08– 104,96

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Trung bình

Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy phƣơng pháp phân tích đã lựa chọn cho độ thu hồi tƣơng đối tốt (nằm trong khoảng 95,0 đến 105,0% đáp ứng yêu cầu độ đúng của một phƣơng pháp phân tích, nhất là trong một nền mẫu phức tạp nhƣ dƣợc liệu).

3.4.5. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) Xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đƣờng nền (S/N).

Pha loãng dung dịch đối chiếu từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp nhất có thể phát hiện đƣợc bằng sắc ký rồi tiến hành sắc ký, so sánh đáp ứng với mẫu trắng. Tỷ lệ S/N = 3/1 thƣờng đƣợc chấp nhận để thiết lập giới hạn phát hiện. Tỷ lệ S/N = 10/1 thƣờng đƣợc chấp nhận để thiết lập giới hạn định lƣợng. Kết quả đƣợc ghi trong bảng 3.17.

Bảng 3.17. Kết quả khảo sát LOD và LOQ. P VII

P VI

P II

PI

LOD(g/mL)

1,06

0,998

1,47

2,50

LOQ(g/mL)

3,50

3,29

4,85

8,25

Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy giới hạn định lƣợng LOQ thấp hơn nồng độ định lƣợng nhiều lần, phƣơng pháp phân tích có độ nhạy cao.

43

3.5. ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG BẢY LÁ MỘT HOA Từ những kết quả thẩm định phƣơng pháp định lƣợng các hợp chất phân lậpđƣợc từ cây Bảy lá một hoa bằng HPLC thu đƣợc ở trên, cho thấy có thể áp dụng phƣơng pháp này để xác định hàm lƣợng một số thành phần trong cây và trong các sản phẩm chiết xuất, phân lập từ cây Bảy lá một hoa.

Phƣơng pháp đã đƣợc áp dụng để xác định hàm lƣợng các hợp chất nghiên cứu trong 1 số mẫu thân rễ cây Bảy lá một hoa thu hái đƣợc, trong 1 phân đoạn của

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

quá trình chiết xuất bằng methanol và 1 sản phẩm phân lập từ các mẫu cây Bảy lá một hoa khác nhau.

3.5.1.

Xác định hàm lƣợng các chất có trong phần thân rễ cây Bảy lá một hoa Tiến hành cân một lƣợng chính xác khoảng 0,2000 g cắn toàn phần chiết bằng

methanol từ thân rễ cây Bảy lá một hoa (PPC 01) nghiên cứu ở trên. Hòa tan bằng methanol và bình định mức thành 50 mL, lọc qua màng lọc 0,45 m. Tiến hành sắc ký song song mẫu thử với hỗn hợp các chất đối chiếu. Nồng độ các chất nghiên cứu tính đƣợc nhƣ ở bảng 3.18.

Bảng 3.18. Kết quả xác định nồng độ chất phân tích trong các dung dịch thử Khối lượng cắn sử dụng (g) 0,2034

Nồng độ các hợp chất trong mẫu thử (mg/mL) PS VII PS VI PS II PS I 0,0948 0,5779 0,0717 0,0326

2

0,2118

0,0760

0,0333

0,0957

0,5766

3

0,2130

0,0755

0,0333

0,0949

0,5788

4

0,2044

0,0746

0,0335

0,0951

0,5826

5

0,2088

0,0744

0,0333

0,0955

0,5838

6

0,2130

0,0764

0,0334

0,0957

0,5874

STT 1

Từ khối lƣợng và độ ẩm dựợc liệu đem chiết cùng tổng lƣợng cắn thu đƣợc tính ra hàm lƣợng từng chất có trong 100 g dƣợc liệu nhƣ ở bảng 3.19.

44

Bảng 3.19. Kết quả xác định hàm lượng các chất có trong phần thân rễ của cây Bảy lá một hoa.

STT

Hàm lượng (g/100g dược liệu) PS VII PS VI PS II

PS I

0,315

0,143

0,416

2,509

2

0,321

0,140

0,404

2,434

3

0,317

0,140

0,398

2,430

4

0,326

0,146

0,416

2,548

5

0,318

0,143

0,409

2,500

6

0,321

0,140

0,401

2,466

Trung bình

0,320

0,142

0,407

2,481

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1

Các số liệu trong bảng 3.19 mới chỉ là kết quả sơ bộ. Cần làm thêm trên số lƣợng mẫu đủ lớn để có số liệu chính xác hơn về hàm lƣợng các chất trên trong cây Bảy lá một hoa.

3.5.2.

Xác định hàm lƣợng các chất có trong một số mẫu Bảy lá một hoa thu

hái đƣợc

Tiến hành kiểm tra sơ bộ sự có mặt của các chất nghiên cứu trong một số

mẫu thu hái đƣợc nhƣ sau: STT

2

Ký hiệu Bộ phận dùng mẫu (nghiên cứu) phân tích PPC 04 Thân rễ, phần trên mặt đất PPC 05 Thân rễ

3

PPC 16

1

Thân rễ

Nơi thu thực tế

Ngày thu

Mã số tiêu bản

Cao Bằng

09.2017

TB-9006

Lai Châu

12.2016

TB-122016

Lào Cai

12.2017

TB-201217

Quá trình chiết xuất các chất từ phần thân rễ của cây Bảy lá một hoa thu hái đƣợc ở một số nơi đƣợc tiến hành nhƣ tƣơng tự nhƣ trên.

Tiến hành cân chính xác 1 lƣợng cắn hoà tan và định mức thành 50 mL bằng methanol, lọc qua bông và qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hành sắc ký song song mẫu 45

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

thử với mẫu hỗn hợp các chất đối chiếu. Sắc ký đồ thu đƣợc nhƣ hình 3.13.

Hình 3.13. SKĐ của dung dịch thử cây Bảy lá một hoa thu hái tại Cao Bằng (trái) và hỗn hợp chuẩn (phải)

Nồng độ các chất nghiên cứu trong mẫu thử tính đƣợc nhƣ ở bảng 3.20.

Bảng 3.20. Kết quả xác định nồng độ các chất có trong thân rễ của một số mẫu cây Bảy lá một hoa Nồng độ các hợp chất trong mẫu thử (mg/mL) STT Nơi thu hái PS VII PS II PS I 1 2 3 4 5

Lào Cai (PPC 16)

Cao Bằng (PPC 04)

6 7 8 9

Lai Châu (PPC 05)

0,0921

0,0446

0,2224

0,0958

0,0464

0,2059

0,0874

0,0416

0,1992

0,0434

0

0

0,0429

0

0

0,0443

0

0

0,0324

0,1348

0,2447

0,0296

0,1272

0,2298

0,0295

0,1496

0,2447

46

Từ khối lƣợng và độ ẩm dƣợc liệu đem chiết cùng tổng lƣợng cắn thu đƣợc tính ra hàm lƣợng từng chất có trong 100 g dƣợc liệu nhƣ ở bảng 3.21.

Bảng 3.21. Kết quả xác định hàm lượng các chất có trong thân rễ của một số mẫu cây Bảy lá một hoa STT

Hàm lượng (g/100g dược liệu) Nơi thu hái

PS II

PS I

0,223

0,101

0.521

0,228

0,103

0.476

0,215

0,096

0.476

0.222

0,100

0,491

0,105

0

0

0,103

0

0

0,107

0

0

0,078

0,305

0.573

0,073

0,291

0.546

0,070

0,298

0.564

0.074

0,298

0,561

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1

PS VII

2

Lào Cai (PPC 16)

3

Trung bình

4 5

Cao Bằng (PPC 04)

6

Trung bình

7 8

Lai Châu (PPC 05)

9

Trung bình

3.5.3.

0.105

Xác định hàm lƣợng các chất có trong một số sản phẩm phân lập từ cây Bảy lá một hoa

Sản phẩm chiết xuất phần trên mặt đất của cây Bảy lá một hoa Quá trình chiết xuất và phân lập các chất từ phần trên mặt đất của cây Bảy lá một hoa (PPC 01) đƣợc tiến hành bằng methanol tƣơng tự với phần thân rễ.

Cân chính xác khoảng 0,2000g cắn toàn phần methanol sản phẩm của nhóm 47

nghiên cứu chiết xuất phân lập. Hoà tan và định mức thành 50mL bằng methanol, lọc qua bông và qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hành sắc ký song song mẫu thử với mẫu hỗn hợp các chất đối chiếu. Sắc ký đồ thu đƣợc nhƣ ở hình 3.14 cho thấy trong dịch chiết methanol của phần trên mặt đất của Bảy lá một hoa chỉ có PS II không thấy xuất hiện các pic tƣơng ứng với PS I, PS VI và PS VII. Tính nồng độ PS II theo phƣơng pháp so sánh diện tích, từ hiệu suất cắn thu đƣợc tính ra hàm lƣợng từng

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

chất có trong 100 g dƣợc liệu nhƣ ở bảng 3.22.

Hình 3.14. SKĐ của dung dịch thử của phần trên mặt đất cây Bảy lá một hoa (trên) và hốn hợp chuẩn (dưới) 48

Bảng 3.22. Kết quả xác định nồng độ và hàm lượng chất phân tích trong các dung dịch thử của phần trên mặt đất cây Bảy lá một hoa Khối lượng cắn sử dụng (g)

Nồng độ PS II trong mẫu thử (mg/mL)

Hàm lượng PS II (g/100g dược liệu)

1

0,2134

0,05823

0,262

2

0,2054

0,05602

0,262

3

0,2003

0,05739

0,275

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

STT

4

0,2116

0,05901

0,268

5

0,2165

0,06125

0,272

6

0,2017

0,06007

0,286

Trung bình

0,271

Sản phẩm PS II phân lập được từ cây Bảy lá một hoa

Phần trên mặt đất của Bảy lá một hoa có hàm lƣợng không khác biệt nhiều với phần thân rễ nhƣng chỉ chứa PS II không có các thành phần PS I, PS VI và PS VII nên bộ phận này đƣợc chọn để phân lập và tinh chế PS II làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn.

Tiến hành cân chính xác khoảng 0,00200g sản phẩm PS II phân lập đƣợc, hòa tan và định mức thành 10 mL bằng methanol, lọc qua màng lọc 0,45µm. Tiến hành sắc ký song song mẫu thử với mẫu đối chiếu. Sắc ký đồ thu đƣợc nhƣ hình 3.15.

a) 49

b) Hình 3.15. SKĐ của dung dịch thử sản phẩm PS II phân lập được (a)

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

và của dung dịch đối chiếu PS II (b).

Bảng 3.23. Kết quả xác định hàm lượng của chất phân lập PS II

STT

Khối lượng chât phân lập sử dụng (mg)

1

2,97

Diện tích thử (mAu.s) 354,3

2,40

286,2

91,36

2,03 2,38

240,8 287,2

90,87 92,45

2,50

296,1

90,74

2,21

280,3

97,17

2,41

304,7

96,86

2 3 4 5 6 7

Diện tích chuẩn (mAu.s)

282,7

Hàm lượng (%) 91,39

Trung bình

92,98

RSD

3,03

50

CHƢƠNG IV BÀN LUẬN 4.1. VỀ PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU Để định lƣợng các chất trong cây Bảy lá một hoa đạt kết quả tốt, trƣớc hết cần phải chiết kiệt hoạt chất và làm sạch dịch chiết. Qua thực nghiệm, phƣơng pháp chiết hổi lƣu với dung môi methanol đƣợc lựa chọn. Đây là phƣơng pháp dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm, không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

và không tốn nhiều thời gian do vậy phù hợp để áp dụng cho nghiên cứu này.

Với phƣơng pháp chiết hồi lƣu bằng methanol nhiều lần đã cho phép lấy kiệt các hoạt chất. Dịch chiết lần cuối sau khi loại bớt dung môi đƣợc kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng và bằng HPLC đều không thấy xuất hiện các vết và pic của các hợp chất tƣơng ứng.

4.2.

VỀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ

Dựa trên các nghiên cứu đã đƣợc công bố, kết hợp với các điều kiện có sẵn chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký nhƣ mô tả ở mục 3.2 và đã xây dựng đƣợc chƣơng trình sắc ký. Việc đánh giá thông số qua xác định tính phù hợp của hệ thống sắc ký, khả năng tách pic ra khỏi chất khác, hình ảnh của pic trên SKĐ và thời gian lƣu. Kết quả là thời gian lƣu không quá dài, píc cân đối, các pic trên sắc ký đồ thu đƣợc tách tƣơng đối tốt, pic của chất PS II có độ phân giải thấp nhất cũng đạt giá trị 1,5. Nhƣ vậy chứng tỏ, các chƣơng trình sắc ký sử dụng trong đề tài là phù hợp để định lƣợng các thành phần trong cây Bảy lá một hoa.

4.3. VỀ THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP Sau khi xây dựng quy trình phân tích đã đƣợc thẩm định theo quy định chung. Kết quả thẩm định cho thấy phƣơng pháp đã đáp ứng đƣợc các yêu cầu của một phƣơng pháp phân tích.

-

Độ chọn lọc: Kết quả thu đƣợc từ sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu

thử cho thấy tại thời gian lƣu của các pic phân tích không xuất hiện các pic phụ của tạp chất trong mẫu thử cũng nhƣ không có pic tại các vị trí đó trong sắc ký đồ 51

của mẫu trắng. Chứng tỏ phƣơng pháp có độ chọn lọc cao và các chất phân lập đƣợc là tinh khiết.

-

Khoảng nồng độ tuyến tính: Với các khoảng nồng độ khảo sát của các chất đều

cho thấy đƣờng hồi quy trong khoảng nồng độ đã chọn có hệ số tƣơng quan đều đạt trên 0,995 chứng tỏ sự tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ của chất và diện tích pic là khá chặt chẽ.

- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng: giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp chúng tôi xây dựng đƣợc khá thấp cho phép có thể dùng để

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

đánh giá sự có mặt của các hợp chất trên trong mẫu cây Bảy lá một hoa nhƣ là “dấu vân tay” để so sánh thành phần các phân đoạn thu đƣợc trong chiết xuất và đánh giá hàm lƣợng các chất trong dƣợc liệu.

- Độ đúng: Độ đúng đã đƣợc kiểm tra với tất cả các hợp chất với tỷ lệ tìm lại ở các nồng độ khác nhau trong khoảng nồng độ tuyến tính. Điều này khẳng định phƣơng pháp có độ chính xác và độ lặp lại theo yêu cầu.

Nhƣ vậy, với chƣơng trình định lƣợng các chất trong cây Bảy lá một hoa bằng phƣơng pháp HPLC mà chúng tôi xây dựng đƣợc là đủ tin cậy. Phƣơng pháp có ƣu điểm là đơn giản, tiết kiệm thời gian và chi phí kiểm nghiệm.

4.4. VỀ KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG CÁC CHẤT VÀ SO SÁNH THÀNH PHẦN CÁC DỊCH CHIẾT KHÁC NHAU

Kết quả phân tích các chất nghiên cứu trong thành phần các dịch chiết khác nhau:

Từ cắn toàn phần mẫu thân rễ cây Bảy lá một hoa dùng trong nghiên cứu này đã sơ bộ xác định hàm lƣợng có trong 100g dƣợc liệu của 4 chất nghiên cứu nhƣ sau: 0,320 g Paris saponin VII; 0,142 g Paris saponin VI; 0,407 g Paris saponin II và 2,481 g Paris saponin I. Trong cắn toàn phần của một số mẫu Bảy lá một hoa do nhóm chiết suất phân lập tạo ra thấy có sự khác nhau giữa thành phần và hàm lƣợng các chất nghiên cứu. Hàm lƣợng tính theo 100g dƣợc liệu của một số mẫu dƣợc liệu nhƣ sau: 52

+ Mẫu Lào Cai (PPC 16): 0,444 g paris saponin VII; 0,200 g paris saponin II và 0,981 g Paris saponin I. + Mẫu Cao Bằng (PPC 04): 0,211 g paris saponin VII. + Mẫu Lai Châu (PPC 05): 0,147 g paris saponin VII; 0,596 g paris saponin II và 1,122 g paris saponin I. Trong quá trình nghiên cứu, nhóm nghiên cứu đã phân lập đƣợc PS II từ phần trên mặt đất của cây Bảy lá một hoa, để sơ bộ đánh giá hàm lƣợng của PS II cũng nhƣ sơ bộ kiểm tra sự có mặt của các chất đã nghiên cứu trong phần trên mặt

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

đất, chúng tôi đã sử dụng phƣơng pháp định lƣợng trên để kiểm tra cắn toàn phần của phần trên mặt đất.

Trong cắn toàn phần của phần trên mặt đất chỉ thấy có mặt của PS II, không thấy có mặt các chất PS I, PS VI và PS VII. Hàm lƣợng tính cho 100g dƣợc liệu của chất nghiên cứu là 0,271 g Paris saponin II.

Theo kết quả phân tích sản phẩm phân lập PS II cho thấy sản phẩm có độ tinh khiết khá cao nhƣng vẫn chƣa đạt đƣợc yêu cầu cần thiết là có hàm lƣợng trên 95%. Mặc dù hàm lƣợng chất này không có khác biệt nhiều so với phần thân rễ cây Bảy lá một hoa nhƣng chiếm một tỷ lệ cao hơn trong cắn toàn phần của phần trên mặt đất. Phần cắn trên mặt đất cũng có số lƣợng các saponin ít hơn nên chất PS II cũng dễ phân lập hơn. Luận văn đã sơ lƣợc đánh giá về hàm lƣợng của PS II phân lập đƣợc với hàm lƣợng trung bình là 92,98 %. Kết quả của các lọ và các lần phân phân lập khác nhau cũng khác nhau có thể do ảnh hƣởng trong quy trình phân lập nhƣ độ ẩm, nhiệt độ… Do vậy cần tiến hành cải tiến quy trình phân lập, tinh chế để hợp chất thu đƣợc có độ tinh khiết cao hơn, ổn định hơn mới có thể làm nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu.

Thành phần của phần trên mặt đất và thân rễ Bảy lá một hoa có sự khác nhau về thành phần và hàm lƣợng. Tuy nhiên số lƣợng mẫu chƣa nhiều và cần khảo sát trên các bộ phận của cùng mẫu cây và nhiều mẫu thu hái ở các địa điểm và thời gian khác nhau để có kết luận chính xác hơn.

Hàm lƣợng các chất nghiên cứu trong mẫu dƣợc liệu thu hái tại khu vực Lào 53

Cai đƣợc xác định qua một số lần chiết xuất. Tuy các kết quả thu đƣợc chƣa thể đại diện cho hàm lƣợng các chất trong dƣợc liệu thu hái ở các khu vực khác nhau, nhƣng vẫn có giá trị để dùng ƣớc lƣợng hàm lƣợng các chất trong phần thân rễ cây Bảy lá một hoa. Cụ thể nhƣ sau: Cần làm thêm trên số lƣợng mẫu đủ lớn để có số liệu chính xác hơn về hàm lƣợng các chất trên có trong phần thân rễ của cây Bảy lá một hoa theo hƣớng: - Địa điểm thu hái mẫu khác nhau

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

- Thời gian thu hái mẫu khác nhau.

54

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Qua thời gian triển khai thực nghiệm luận văn đã đạt đƣợc các mục tiêu đề ra và thu đƣợc các kết quả nhƣ sau: 1.

Đã chọn đƣợc phƣơng pháp xử lý mẫu đơn giản, dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm, không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt là chiết với methanol. Đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng đồng thời 4 hợp chất phân lập

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

2.

đƣợc từ Bảy lá một hoa bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với các điều kiện sắc ký cụ thể nhƣ sau:

 Cột: Waters – C18 (250 mm  4,6 mm, 5 µm), nhiệt độ 40oC.  Pha động: acetonitril – nƣớc (có 0,1% acid phophoric) với chế độ gradient dung môi trong thời gian phân tích là 40 phút.

 Detector DAD ở bƣớc sóng 203 nm.  Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút.  Thể tích tiêm: 10 L.

Phƣơng pháp xây dựng đã đƣợc thẩm định, kết quả cho thấy các chỉ tiêu đều đạt yêu cầu, đảm bảo phƣơng pháp có thể áp dụng vào định lƣợng các chất nghiên cứu trong các phân đoạn chiết xuất cũng nhƣ trong cây Bảy lá một hoa.

3.

Đã áp dụng phƣơng pháp để sơ bộ xác định hàm lƣợng các chất nghiên

cứu trong 04 mẫu cây Bảy lá một hoa thu hái đƣợc, trong 1 cắn toàn phần của các bộ phận khác nhau của dƣợc liệu nghiên cứu và sản phẩm phân lập đƣợc từ cây Bảy lá một hoa. Kết quả cho thấy phƣơng pháp xây dựng hoàn toàn có thể áp dụng với các mẫu nghiên cứu khác nhau của Bảy lá một hoa. ĐỀ XUẤT -

Do thời gian có hạn, chúng tôi mới chỉ tiến hành phân tích trên mẫu cây Bảy lá một hoa thu hái tại Lào Cai, Nghệ An, Lai Châu nên chƣa có tính đại diện cao. Vì vậy, cần mở rộng nghiên cứu, phân tích những mẫu cây Bảy lá 55

một hoa tại các khu vực và các mùa thu hái khác nhau ở Việt Nam để có số liệu chính xác về hàm lƣợng các hợp chất có trong phần thân rễ của cây Bảy lá một hoa.

Hoàn thiện phƣơng pháp hơn nữa, để có thể góp phần tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu cây Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var. chinensis).

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

-

56

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1.

Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chƣơng, Nguyễn Thƣợng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2006), Cây Thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập I, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr. 182 – 184.

Bộ Y tế (2007), Thực vật học, NXB Y học, tr. 342, 402.

3.

Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học

4.

Bộ Y tế (2014), “Hƣớng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích”,

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

2.

Thông tư 44/2014/TT-BYT Quy định việc đăng ký thuốc, tr.261-274.

5.

Bộ Y tế (2010), Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, NXB Y học, Hà Nội, tr. 158-179.

6.

Bộ Y tế (2012), Hóa phân tích dụng cụ, Tập 2, NXB Y học, Hà Nội, tr.126-143.

7.

Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam (bộ mới), Tập I, NXB Y học, tr.

134 – 135.

8.

Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, tập I, NXB Y học, tr.133.

9.

Nguyễn Thị Đỏ (2007), Thực vật chí Việt Nam 8, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr. 311 – 321.

10.

Nguyễn Thị Duyên (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Bảy lá một hoa – Paris polyphylla var. chinensis Franchet thu thập tại Việt Nam, Luận án tiến sĩ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

11.

Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học, tr. 90-92.

12.

Nguyễn Quỳnh Nga, Nguyễn Văn Khiêm và cs (2015), Nghiên cứu phân loại một số loài thuộc chi Paris ở Việt Nam sử dụng đặc điểm hình thái và 57

chỉ thị PCR-RFLP, đề tài cấp cơ sở cấp Viện Dƣợc liệu.

TIẾNG ANH 13.

Chen G. L., Gao W. S., Hou G. L et al (2013), "Effect of Paris saponin on antitumor and immune function in U14 tumor-bearing mice", African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines, 10(3), pp. 503-507.

14.

Cheung J Y-N, Ong R C-Y, Suen Y-K et al (2005), "Polyphyllin D is a

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

potent apoptosis inducer in drug-resistant HepG2 cells",Cancer Letters, 217(2), pp. 203-211.

15.

Deng D., Lauren D. R, Cooney J. M et al (2008), "Antifungal saponins from Paris polyphylla Smith", Planta Medica. 74(11), pp. 1397-1402.

16.

Gajdus

J., Kaczyński Z., Kawiak A. et al (2014), "Isolation and

identification of cytotoxic compounds from the rhizomes of Paris quadrifolia L", Pharmacognosy Magazine. 10(Suppl 2), pp. S324.

17.

Gao L-L, Li F-R, Jiao P et al (2011), "Apoptosis of human ovarian cancer cells induced by Paris chinensis dioscin via a Ca (2+)-mediated mitochondrion pathway", Asian Pacific Journal of Cancer Prevention 12(5), pp. 1361.

18.

Gao L-L, Li F-R, Jiao P et al (2011), "Paris chinensis dioscin induces G2/M cell cycle arrest and apoptosis in human gastric cancer SGC-7901 cells", World Journal of Gastroenterology17(39), pp. 4389-4395.

19.

Guang L. C., WeiShi G., GaiLing H. et al. (2013), "Effect of Paris saponin on antitumor and immune function in U14 tumor-bearing mice", African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines. 10(3), pp. 503-507.

20.

Heung J Y-N, Ong Rose C-Y, Suen Y-K et al (2005), "Polyphyllin D is a potent apoptosis inducer in drug-resistant HepG2 cells", Cancer Letters.

217(2), pp. 203-211.

58

21.

Huang Y., Wang Q., Ye W. C., (2005b). “A new homo-cholestane glycoside from Paris polyphylla var. chinensis”, Chinese Journal of Natural Medicine, 3, pp. 138-140.

22.

Huang Y., Cui L. J, Wang Q., Ye W. C. (2006), “Separation and identification ofactive constituents of Paris vietnamensis”. Act. Phama.

Sin. 41, pp. 361-364.

23.

Justyna Stefanowicz-Hajduk, Rafal Bartoszewski, Sylwia Bartoszewska et al (2015), “Pennogenyl Saponins from Paris quadrifolia L. Induce

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Extrinsic and Intrinsic Pathway of Apoptosis in Human Cervical Cancer HeLa Cells”, PLosONE. 10(8), pp. 0135993.

24.

Kang L-P, Liu Y-X, Eichhorn Tolga et al (2012), "Polyhydroxylated steroidal glycosides from Paris polyphylla", Journal of natural products.

75(6), pp. 1201-1205.

25.

Lee M-S, Chan Judy Y-W, Kong S-K et al (2005), "Effects of polyphyllin D, a steroidal saponin in Paris polyphylla, in growth inhibition of human breast cancer cells and in xenograft", Cancer Biology & Therapy. 4(11), pp. 1248-1254.

26.

Matsuda Hisashi, Pongpiriyadacha Yutana, Morikawa Toshio et al (2003), "Protective effects of steroid saponins from Paris polyphylla var. yunnanensis on ethanol-or indomethacin-induced gastric mucosal lesions in rats: structural requirement for activity and mode of action", Bioorganic & medicinal chemistry letters. 13(6), pp. 1101-1106.

27.

Mimaki Yoshihiro, Kuroda Minpei, Obata Yuusuke et al (2000), "Steroidal saponins from the rhizomes of Paris polyphylla var. chinensis and their cytotoxic activity on HL-60 cells", Natural Product Letters. 14(5), pp. 357364.

28.

Pharmacopoea of the people’s republic of China, Paridis Rhizoma (Chonglou, Paris root) (2010), pp.312.

59

29.

Qin X-J , Sun D-J, Ni W, Chen C-X, Hua Y, He L, Liu H-Y(2012), Steroidal saponins with antimicrobial activity from stems and leaves of Paris polyphylla var. yunnanensis, steroidal 77, pp. 1242-1248. 16.

30.

Qin X. J., Yu M. Y., Ni W., Yan H., Chen C. X., Cheng Y. C., He L., Liu H. Y. (2016), Steroidal saponins from stems and leaves of Paris polyphylla var. yunnanensis, Phytochemistry 121, 20-29.

31.

Shen S., Chen D., Li X. et al (2014), "Optimization of extraction process and antioxidant activity of polysaccharides from leaves of Paris

32.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

polyphylla", Carbohydrate polymers. 104, pp. 80-86.

Wang Y., Hao J., Gao W. et al (2013), "Study on hemostatic activities of the rhizome of Paris bashanensis", Pharmaceutical Biology. 51(10), pp.

1321-1325.

33.

Wang

Y-C, Yi T-Y and Lin K-H (2011), "In vitro activity of Paris

polyphylla Smith against enterovirus 71 and coxsackievirus B3 and its immune modulation", The American Journal of Chinese medicine. 39(06), pp. 1219-1234.

34.

Wang G-X, Han J, Zhao L-W et al (2010), "Anthelmintic activity of steroidal saponins from Paris polyphylla", Phytomedicine. 17(14), pp.

1102-1105.

35.

Wei J‐C, Gao W‐Y, Yan X‐D et al (2014), "Chemical constituents of plants from the Genus Paris", Chemistry & Biodiversity. 11(9), pp. 1277-1297.

36.

Zhang W., Zhang D., Ma X. et al (2014), “Paris saponin VII suppressed the growth of human cervical cancer Hela cells”, European Journal of Medical Research, 19(1), pp. 1-7.

60

Zhang T., Liu H., Liu X. T., Chen X. Q., Wang Q., (2009), “Qualitative and quantitative analysis of steroidal saponins in crude extracts from Paris polyphylla var. yunnanensis and P. polyphylla var. chinensis by high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry”, ` pp. 809–813.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

37.

61

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

PHỤ LỤC

62

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sắc ký đồ mẫu trắng

63

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sắc ký đồ mẫu đối chiếu

64

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sắc ký đồ mẫu thử 1

65

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sắc ký đồ mẫu thử 2

66

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sắc ký đồ mẫu thử 3

67

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sắc ký đồ mẫu thử 4

68

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sắc ký đồ mẫu thử 5

69

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sắc ký đồ mẫu thử 6

70

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sắc ký đồ tuyến tính 40%

71

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu PS I

72

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu PS II

73

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu PS VI

74

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu PS VII

75

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sắc ký đồ giới hạn phát hiện của PS I

76

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sắc ký đồ giới hạn phát hiện của PS II

77

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sắc ký đồ giới hạn phát hiện của PS VI và PS VII

78

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Phổ UV-VIS của Paris saponin I

79

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Phổ UV-VIS của Paris saponin II

80

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Phổ UV-VIS của Paris saponin VI

81

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Phổ UV-VIS của Paris saponin VII

82

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sắc ký đồ chồng phổ của dung dịch chuẩn – thử của Paris saponin I

83

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Paris saponin II

84

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Sắc ký đồ dung dịch thử Paris saponin II

85

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Chứng chỉ phân tích chất đối chiếu Paris saponin I

86

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Chứng chỉ phân tích chất đối chiếu Paris saponin II

87

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Chứng chỉ phân tích chất đối chiếu Paris saponin VI

88

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Chứng chỉ phân tích chất đối chiếu Paris saponin VII

89