Nghiên cứu điều kiện thuỷ phân tinh bột sắn để sản xuất polymaltose de 30 bằng phương pháp enzyme

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề Tài NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN THỦY PHÂN TINH BỘT SẮN ĐỂ SẢN XUẤT POLYMALTOSE DE 30 BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYME Người hướng dẫn:

TH.S VŨ THỊ THUẬN

Sinh viên thực hiện:

NGÔ THỊ TRANG

Lớp:

1203

Hà Nội – 2016

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề Tài NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN THỦY PHÂN TINH BỘT SẮN ĐỂ SẢN XUẤT POLYMALTOSE DE 30 BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYME

Người hướng dẫn:

TH.S VŨ THỊ THUẬN

Sinh viên thực hiện:

NGÔ THỊ TRANG

Lớp:

1203

Hà Nội – 2016

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này, trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo cùng toàn thể cán bộ khoa Công nghệ Sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội đã dạy dỗ, chỉ bảo tận tình trong thời gian học tập tại trường, nơi trang bị kiến thức giúp tôi bước vào cuộc sống.

Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới Ths. Vũ Thị Thuận, chủ nhiệm bộ môn công nghệ đường bột- Viện Công nghiệp Thực phẩm đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm về chuyên môn và luôn giúp đỡ, động viên tinh thần cho tôi. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các anh chị cán bộ trong phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thiện luận văn này.

Cuối cùng, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình.

Do thời gian và trình độ hạn chế, không tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong được sự chỉ bảo và giúp đỡ của các thầy cô.

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2016 Sinh viên

Ngô Thị Trang

MỤC LỤC MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................... 3 1.1. GIỚI THIỆU VỀ POLYMALTOSE .................................................................... 3 1.1.1. Cấu tạo và tính chất.............................................................................................. 3 1.1.2. Ứng dụng của polymaltose .................................................................................. 4 1.1.2.1. Ứng dụng trong dược phẩm ......................................................................... 4 1.1.2.2. Ứng dụng trong thực phẩm ......................................................................... 5 1.2. TINH BỘT- NGUYÊN LIỆU ĐỂ SẢN XUẤT POLYMALTOSE .................... 5 1.2.1. Giới thiệu về tinh bột ........................................................................................... 5 1.2.2. Tinh bột sắn.......................................................................................................... 7 1.2.2.1. Cấu tạo và tính chất của tinh bột sắn ........................................................... 7 1.2.2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn ................................................................ 7 1.3. ENZYM SỬ DỤNG TRONG SẢN XUẤT POLYMALTOSE ........................... 8 1.3.1. Quá trình dịch hóa tinh bột bằng enzym α- amylase ........................................... 9 1.3.1.1. Giới thiệu enzym α- amylase và nguồn sinh tổng hợp ................................. 9 1.3.1.2. Cơ chế thủy phân tinh bột của enzym α- amylase. ..................................... 10 1.3.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới enzym α- amylase [5,9]..................................... 10 1.3.1.4. Giới thiệu một số enzym dịch hóa. ............................................................. 13 1.3.2. Quá trình đường hóa tinh bột bằng enzym pullulanase ..................................... 14 1.3.2.1 Giới thiệu enzym pullulanase và nguồn sinh tổng hợp ............................... 14 1.3.2.2. Cơ chế thủy phân tinh bột của enzym pullulanase ..................................... 16 1.3.2.3. Giới thiệu một số chế phẩm enzym pullulanase ......................................... 16 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 17 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT ............................................................................. 17 2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................................ 17 2.1.2. Hóa chất ............................................................................................................. 17 2.1.3. Thiết bị ............................................................................................................... 17

2.2 PHƯƠNG PHÁP .................................................................................................... 17 2.2.1. Phương pháp phân tích ...................................................................................... 17 2.2.1.1. Xác định nồng độ chất khô bằng chiết quang kế ........................................ 17 2.2.1.2. Xác định pH bằng máy đo pH .................................................................... 18 2.2.1.3. Xác định nồng độ dịch bột bằng brome kế ................................................. 18 2.2.1.4. Xác định độ nhớt của dịch thủy phân bằng máy đo độ nhớt ...................... 18 2.2.1.5. Xác định độ ẩm của tinh bột sắn bằng máy sấy hồng ngoại ...................... 18 2.2.1.6. Xác định hàm lượng tinh bột theo phương pháp Béc-tơ-răng .................. 18 2.2.1.7. Xác định hàm lượng đường khử (DE) theo phương pháp phân tích LaneEynon ........................................................................................................................ 19 2.2.1.8. Xác định một số đường glucose, maltose bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) ......................................................................................................... 21 2.2.2. Phương pháp công nghệ ..................................................................................... 21 2.2.2.1. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình dịch hóa tinh bột ........ 21 2.2.2.2. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình đường hóa tinh bột ..... 21 2.2.2.3. Xây dựng quy trình công nghệ thủy phân tinh bột sắn để sản xuất polymaltose DE 30 ................................................................................................... 21 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN................................... 22 3.1. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN DỊCH HÓA TINH BỘT LÀM NGUYÊN LIỆU PHÙ HỢP CHO QUÁ TRÌNH ĐƯỜNG HÓA TẠO POLYMALTOSE DE 30 .... 22 3.1.1. Lựa chọn enzyme dịch hóa thích hợp cho quá trình sản xuất polymaltose ....... 22 3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của mức độ thủy phân tinh bột trong quá trình dịch hóa đến quá trình đường hóa tạo polymaltose DE 30 ............................................ 23 3.1.3. Xác định nồng độ enzyme thích hợp trong quá trình dịch hóa tạo DE 10......... 25 3.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ dịch bột đến quá trình dịch hóa tạo DE 10................. 26 3.1.5. Ảnh hưởng của thời gian dịch hóa tinh bột sắn tạo dịch có DE 10 .................. 27 3.1.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân tới quá trình dịch hóa ................................ 28 3.1.7. Xác định ảnh hưởng của pH tới quá trình dịch hóa ........................................... 29

3.2. NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN ĐƯỜNG HÓA THÍCH HỢP ĐỂ TẠO POLYMALTOSE DE 30 ............................................................................................. 30 3.2.1. Lựa chọn enzyme thích hợp cho quá đường hóa tạo tạo polymaltose. .............. 30 3.2.2. Xác định nồng độ enzyme promozyme D2 thích hợp trong quá trình đường hóa tạo polymaltose DE 30................................................................................................ 31 3.2.3. Xác định nồng độ cơ chất thích hợp cho quá trình đường hoá .......................... 32 3.2.4. Nghiên cứu điều kiện pH thích hợp cho quá trình đường hoá ........................... 34 3.2.5. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình đường hóa....................................... 35 3.2.6. Xác định thời gian thích hợp cho quá trình đường hoá ..................................... 36 3.3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CHẤT LƯỢNG DỊCH POLYMALTOSE.............. 38 3.4. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ THỦY PHÂN TINH BỘT SẮN TẠO DỊCH POLYMALTOSE CÓ DE 30. ................................................................ 39 3.4.1. Quy trình công nghệ thủy phân tinh bột sắn tạo dịch polymaltose DE 30 ........ 40 3.4.2. Thuyết minh sơ đồ quy trình công nghệ ............................................................ 40 KẾT LUẬN ................................................................................................................... 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 42

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

Arg

Arginine

cP (CentiPoise)

Đơn vị đo độ nhớt

Da (Dalton)

Đơn vị trọng lượng phân tử

DE (Dextrose Equivalent)

Số đương lượng đường khử quy ra glucose

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

HPLC (High performance

Sắc kí lỏng cao áp

liquid chromatography) IPC

Phức hợp sắt-polymaltose

KNU/g

Đơn vị đo hoạt lực enzyme

TB

Tinh bột

Trp

Tryptophan

Tyr

Tyrosine

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số tính chất của enzyme pullulanase ...... Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của mỗi loại enzyme đến kết quả dịch hóa.................................22 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của DE dịch hóa đến quá trình đường hóa tạo polymaltose.......24 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình dịch hóa .............................. 25 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến quá trình dịch hóa .............................. 26 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian dịch hóa đến chất lượng dịch hóa ......................... 27 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ dịch hóa đến chất lượng dịch hóa .......................... 28 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của pH đến quá trình dịch hóa .................................................... 29 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của enzyme đường hóa đến quá trình đường hóa ....................... 30 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ Promozyme D2 đến quá trình đường hoá .............. 31 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất trong quá trình đường hóa ....................... 33 Bảng 3.11. Xác định pH thích hợp cho quá trình đường hóa ........................................ 34 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình đường hóa ...................................... 36 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình đường hóa ..................................... 37 Bảng 3.14. Kết quả phân tích chất lượng dịch polymaltose .......................................... 38

DANH MỤC HÌNH Hình 1. 1.Cấu tạo polymaltose ......................................................................................... 3 Hình 1.2. Cấu tạo của Amylose ....................................................................................... 6 Hình 1.3. Cấu tạo của Amylopectin ................................................................................. 6 Hình 3.1. Sơ đồ quy trình công nghệ thủy phân tinh bột sắn tạo dịch polymaltose DE 30....................................................................................................................................40

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

MỞ ĐẦU Tinh bột là nguồn nguyên liệu dồi dào chứa trong các loại rau, củ, quả và ngũ cốc, có vai trò quan trọng trong việc cung cấp các dinh dưỡng thiết yếu cho cơ thể.

Ngoài ra tinh bột còn được sử dụng làm nguyên liệu chính trong các ngành công nghiệp như: thực phẩm, dược phẩm, dệt. Một trong những loại nguyên liệu được sử dụng phổ biến nhất là tinh bột sắn. Hiện nay, cây sắn đang được dần chuyển đổi từ cây lương thực thực phẩm sang cây công nghiệp có lợi thế cạnh tranh cao, nhờ đó sản lượng tinh bột sắn mỗi năm ngày càng tăng. Sản lượng lớn, giá thành rẻ so với các loại tinh bột khác tinh bột sắn dần khẳng định vị thế của mình trở thành nguồn nguyên liệu chính trong sản suất công nghiệp. Ngoài ra, tinh bột sắn còn được biết đến là nguồn nguyên liệu sản xuất polymaltose để ứng dụng trong tạo phức sắt- polymaltose (IPC).

Phức sắt- polymaltose có khả năng chữa bệnh thiếu máu - căn bệnh đang được quan tâm hàng đầu trên thế giới. Thiếu máu do thiếu sắt là căn bệnh khá phổ biến ở trẻ em và phụ nữ mang thai, thiếu máu làm ảnh hưởng đến các chức năng như hệ miễn dịch, hệ thần kinh, suy giảm nhận thức…. Phức sắt- polymaltose được giới chuyên gia trên Thế Giới đánh giá rất cao do khả năng hấp thu tốt và độ an toàn của chúng, nó đã được sản xuất rộng rãi trên quy mô công nghiệp tại nhiều quốc gia. Ở Việt Nam, phức sắtpolymaltose (IPC) hầu hết là hàng nhập khẩu do nguồn nguyên liệu sản xuất IPC chưa được nghiên cứu và sản xuất. Vì vậy việc nghiên cứu và sản xuất polymaltose để ứng dụng trong sản xuất phức sắt- polymaltose - bào chế thuốc chống thiếu máu phục vụ nhu cầu trong nước là vấn đề rất cần thiết mang tính khoa học và thực tiễn cao.

Polymalose là sản phẩm thủy phân từ tinh bột, dễ tan trong nước, có cấu trúc polyme mạch thẳng bao gồm các phân tử D-glucose liên kết với nhau, có công thức cấu tạo (C6H10O5)n với khối lượng phân tử dao dộng tương đối lớn khoảng 25000- 32000 Dalton, gồm từ 3- 20 gốc glucose liên kết với nhau chủ yếu là liên kết α-1,4 glucoside.

Polymaltose được sản xuất và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực chế biến dược phẩm và thực phẩm. Để tổng hợp các phức sắt- polymaltose (IPC) đạt được hiệu quả và chất lượng cao thì nguồn nguyên liệu polymaltose phải có giá trị DE thích hợp cho KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

1

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

quá trình tạo phức. Đây là một phần nghiên cứu thuộc đề tài cấp nhà nước của Viện Công nghiệp Thực phẩm. Theo nghiên cứu này, polymaltose có mức độ thủy phân phù hợp nhất là DE 30. Với DE 30, polymaltose cho hiệu suất gắn kết và hiệu suất thu hồi trong quá trình tạo phức IPC đạt kết quả tốt nhất. Để chủ động nguồn nguyên liệu polymaltose trong sản xuất phức sắtpolymaltose (IPC) và tránh phụ thuộc vào việc nhập khẩu thì việc nghiên cứu công nghệ sản xuất polymaltose DE 30 là rất cần thiết. Quá trình sản xuất polymaltose DE 30 bao gồm quá trình thủy phân tinh bột sắn tạo dịch polymaltose và quá trình thu hồi sản phẩm polymaltose dạng bột. Nhưng do thời gian thực tập có hạn nên chúng tôi chỉ đặt vấn đề: “Nghiên cứu điều kiện thủy phân tinh bột sắn để sản xuất polymaltose DE 30 bằng phương pháp enzym” Mục tiêu đề tài Nghiên cứu được điều kiện thủy phân tinh bột sắn tạo dịch polymaltose bằng phương pháp enzyme đạt chất lượng DE 30, glucose (G1) maltose oligomers (G

3)

3%, maltose (G2)

15%,

80%.

Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu các điều kiện dịch hóa tinh bột làm nguyên liệu phù hợp cho quá trình đường hóa tạo dịch polymaltose DE 30.

Nghiên cứu các điều kiện đường hóa tạo dịch polymaltose DE 30.

Xây dựng quy trình công nghệ thủy phân tinh bột sắn tạo dịch polymaltose DE 30.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ POLYMALTOSE 1.1.1. Cấu tạo và tính chất Polymaltose là sản phẩm thủy phân bằng tinh bột, có cấu trúc polyme mạch thẳng bao gồm các phân tử D-glucose liên kết với nhau, có công thức cấu tạo: (C6H10O5)n với khối lượng phân tử dao động tương đối lớn từ 25000-32000 Dalton, gồm từ 3-20 gốc glucose liên kết với nhau chủ yếu bằng liên kết α-1,4 glucoside [36].

Hình 1.1. Cấu tạo polymaltose (liên kết α-1,4 glucoside, n=1-18) Polymaltose là một dạng của maltoolygosaccharide, nó được sản xuất từ tinh bột sắn với sự tham gia của vi sinh vật và được ứng dụng nhiều trong thực phẩm và dược phẩm bởi các tính chất sau [9,26,34]: • Độ ngọt thấp chỉ bằng 30% so với đường saccharose dung dịch 10% ở nhiệt độ 250C, do đó có thể thay thế đường saccharose trong các thực phẩm để giảm độ ngọt sản phẩm mà không ảnh hưởng đến hương vị sẵn có của sản phẩm.

• Tác dụng chống táo bón.

• Đặc biệt, polymaltose là một dạng polysaccharide mạch thẳng nên có khả năng liên kết với phức sắt để tạo phức IPC rất tốt.

• Polymaltose có thể được hấp thu từ từ trong máu cung cấp năng lượng cho cơ thể một cách đều đều, giữ ổn định đường trong máu trong thời gian dài.

• Được dùng để căn chỉnh kích thước màng, ổn định các tính chất của các sản phẩm thực phẩm và nguyên liệu.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

3

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

• Độ tan giảm theo nồng độ dịch, polymaltose có khả năng hút ẩm rất cao và độ nhớt trung bình. Chính vì vậy, polymaltose có khả năng duy trì độ ẩm cao, giữ được độ ẩm phù hợp trong thực phẩm đặc biệt là các loại bánh tươi.

Khi bổ sung vào thực phẩm, đồ uống polymaltose là tác nhân gây kìm hãm thành phần máu, vì nó thay thế một phần glucose nên hàm lượng glucose thấp. Ngoài ra sẽ ngăn cản sự kết tinh của đường saccharose và bảo vệ cấu trúc của sản phẩm trong thời gian bảo quản.

1.1.2. Ứng dụng của polymaltose Polymaltose có khả năng giữ ẩm tốt và hạn chế kết tinh, làm giảm hiện tượng thoái hóa bằng cách ức chế quá trình tái cấu trúc chuỗi amylose và amylopectin cùng sự liên kết giữa tinh bột- gluten. Sản phẩm có thể ở dạng bột màu trắng hoặc dạng dung dịch đậm đặc. Polymaltose được thừa nhận là một chất phụ gia cho thực phẩm và dược phẩm an toàn cho người dùng trực tiếp. Polymaltose được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực chế biến thực phẩm và dược phẩm [6].

1.1.2.1. Ứng dụng trong dược phẩm Polymaltose là một dạng polysaccharide mạch thẳng nên có khả năng liên kết với phức sắt để tạo phức IPC rất tốt, tan trong nước, đáp ứng được các yêu cầu chữa các bệnh có độc tính thấp, dễ kết hợp với máu và có độ ổn định cao. Phức sắt-polymaltose đã được sử dụng làm thuốc chống thiếu máu cả ở dạng viên nén và dạng dung dịch, được ghi nhận là hiệu quả trong việc tăng nồng độ hemoglobin trong máu [3,11].

Thiếu máu do sắt là hội chứng thiếu máu thường gặp nhất. Thiếu máu khiến cơ thể mệt mỏi, giảm khả năng lao động, suy giảm khả năng phát triển thể chất và tư duy.

Người ta nhận thấy rằng hầu hết các trường hợp thiếu máu do thiếu sắt đều có thể điều trị bằng cách bổ sung sắt hàng ngày dưới dạng thuốc hoặc thực phẩm giàu sắt. Nhiều loại thuốc chứa sắt điều trị thiếu máu đã được sản xuất trên thế giới bao gồm cả sắt vô cơ và sắt hữu cơ hóa trị II hoặc III. Tuy nhiên, với liều lượng cao, sắt tồn tại ở trạng thái ion dễ gây các hiệu ứng phụ có hại như rối loạn đường ruột, ngộ độc sắt, biến màu men răng,… Nhược điểm này có thể khắc phục bằng cách ổn định các nhân tố sắt oxi-

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

4

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

hidroxide (FeOOH) không ion kích thước nano bằng các tác nhân tạo phức tan trong nước đó là phức sắt- polymaltose (IPC) [3,17,19,28].

Ngoài ra polymaltose còn được sử dụng làm tá dược đóng viên nén được sử bổ sung vào các thực phẩm chức năng, thực phẩm ăn kiêng, thuốc bổ,… làm cho người bệnh hấp thu tốt hơn, đối với người bệnh tiêu đường thì giúp cho đường máu ổn định hơn [11].

1.1.2.2. Ứng dụng trong thực phẩm Trong công nghiệp bánh kẹo, polymaltose được sử dụng trong sản xuất kẹo ngọt, các món tráng miệng, kẹo mềm, bánh ngọt, bánh nướng, kem bơ,...[7,26].

Trong công nghiệp đồ uống, polymaltose được sử dụng làm chất độn tạo viên, đặc biệt là đồ uống cho trẻ em, đồ uống và thức ăn nhanh dành riêng cho vận động viên thể thao, làm kẹo gum mềm, làm chất trợ sấy, chất giữ hương yếu tố tạo hình [6,26].

Sản phẩm còn được sử dụng làm chất kết dính, kẹo gum, làm dịu hương, chất tăng vị cho đồ uống, sử dụng thay thế glucose và saccharose, đưa vào thành phần bơ, sữa bột, cà phê hòa tan,...[26,34].

1.2. TINH BỘT- NGUYÊN LIỆU ĐỂ SẢN XUẤT POLYMALTOSE Nguồn nguyên liệu sản xuất polymaltose là tinh bột. Tinh bột chứa phần lớn trong các nguyên liệu củ và hạt ngũ cốc. Tinh bột, cùng với protein và chất béo là một thành phần quan trọng bậc nhất trong chế độ dinh dưỡng của loài người cũng như nhiều loài động vật khác. Các nguyên liệu khác nhau thì thành phần tinh bột trong đó cũng khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm nguồn nguyên liệu tinh bột: trong sắn chiếm 95%, khoai lang chiếm 81%, lúa, gạo, ngô chiếm 35-70%, khoai tây chiếm 18%,...[1].

1.2.1. Giới thiệu về tinh bột Tinh bột là polysaccharide chủ yếu trong các hạt, củ, thân cây và lá cây. Tinh bột cũng có nhiều ở các loại củ như sắn, khoai tây, củ mài. Một lượng đáng kể tinh bột cũng có trong các loại quả như chuối và nhiều loại rau. Tinh bột được thực vật tạo ra trong tự nhiên trong các quả, củ như ngũ cốc do đó các loại lương thực này được coi là nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản xuất tinh bột. Hình dạng và thành phần hóa học của tinh bột phụ thuộc vào giống cây, điều kiện trồng trọt,… Tinh bột không phải là một KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

5

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

chất riêng biệt, nó bao gồm hai cấu tử amylose và amylopectin. Hai chất này khác hẳn nhau về tính chất lí học và hóa học. Dựa vào sự khác nhau đó có thể phân chia được hai thành phần trên để điều chế dưới dạnh tinh khiết [1,2].

Tinh bột có trọng lượng phân tử cao gồm các đơn vị glucose được nối với nhau nhờ liên kết α- glucoside, có công thức phân tử là (C6H10O5)n ở đây n có thể từ vài trăm đến hơn một triệu. Tính chất của tinh bột được quyết định bởi tính chất của 2 phân tử tạo nên tinh bột là amylose và amylopectin và tỉ lệ giữa chúng [9]. Amylose dễ hòa tan trong nước ấm, tạo nên dịch có độ nhớt không cao còn amylopectin chỉ hòa tan khi đun nóng và cho dịch có độ nhớt cao. Dịch amylose không bền, nhất là ở nhiệt độ thấp, nó dễ dàng tạo nên dạng gel vô định hình, sau đó trở thành các gel tinh thể và các kết tủa không thuận nghịch. Các phân tử amylopectin không có xu hướng kết tinh, chúng có khả năng giữ nước lớn nên dịch thường không bị thoái hóa [6,33].

Tinh bột giữ vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm do những tính chất lí hóa của chúng, tinh bột thường được dùng làm chất tạo độ nhớt sánh cho các thực phẩm dạng lỏng hoặc là các tác nhân làm bền keo hoặc nhũ tương, như các yếu tố kết dính và làm đặc tạo độ cứng, độ đàn hồi cho nhiều loại thực phẩm, dược phẩm, công nghiệp dệt, hóa dầu [6,18].

Hình 1.2. Cấu tạo của Amylose

Hình 1.3. Cấu tạo của Amylopectin

Hạt tinh bột khi được sử lý thủy nhiệt thì sẽ xảy ra hiện tượng hồ hóa và hòa tan.

Trước hết hạt tinh bột sẽ hấp thụ nước làm liên kết ở phân tử tinh bột yếu đi, lúc này các phân tử tinh bột xê dịch, nhão ra và trương phồng lên. Độ nhớt của dung dịch tăng KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

6

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

mạnh đến một mức nào đó, hạt tinh bột vỡ ra, phân tử tinh bột bị thủy phân, hòa tan và độ nhớt của dung dịch giảm dần, lúc này các phân tử tinh bột phân bố đồng đều trong các khối nước tạo thành một hệ thống đồng thể (gọi là hồ tinh bột). Nhiệt độ hồ hóa (nhiệt độ để chuyển hạt tinh bột từ trạng thái ban đầu có mức độ hydrat hóa khác nhau thành dung dịch keo) phụ thuộc vào kích thước của hạt tinh bột, nguồn tinh bột, và thành phần amylose/ amylopectin có trong tinh bột. Hồ tinh bột có tính chất nhớt dẻo. Độ nhớt của tinh bột phụ thuộc vào nhiều yếu tố: Nồng độ tinh bột, đường kính của các hạt phân tán, nhiệt độ, pH. Khi để nguội hồ tinh bột một thời gian dài, tinh bột bị thoái hóa kèm theo tách nước và đặc cứng. Tính chất thủy nhiệt và sự hồ hóa của tinh bột là một đặc tính được quan tâm đến nhiều trong các phản ứng enzyme [18,33].

1.2.2. Tinh bột sắn 1.2.2.1. Cấu tạo và tính chất của tinh bột sắn Tinh bột sắn có màu sáng trắng, có độ pH từ 4,5 đến 6,5. Hạt tinh bột sắn có kích thước 5- 40 µm, chủ yếu là hình tròn, có bề mặt nhẵn. Hàm lượng amylopectin trong tinh bột sắn tương đối cao, chiếm 78- 80%, amylose chiếm 12%. Tinh bột sắn có độ nở, khả năng hồ hóa và độ hòa tan cao. Khoảng nhiệt độ hồ hóa của tinh bột sắn là 58- 70%, độ nhớt dung dịch bột tăng nhanh và có độ chính xác cao so với tinh bột từ các nguồn khác. Ngoài ra hồ tinh bột có xu hướng thoái hóa thấp và độ bền gel cao, đây là tính chất quan trọng giúp tinh bột có nhiều ứng dụng trong công nghiệp. Xứ lí hóa học và vật lí (gia nhiệt, tăng áp suất hơi), pH của môi trường và sự có mặt của các chất như protein, chất béo, chất có hoạt tính bề mặt đều có ảnh hưởng đến độ nhớt của tinh bột sắn [4,6].

Về mặt cảm quan tinh bột sắn là các hạt rất mịn, màu trắng. Để đảm bảo tốt, người ta giữ ẩm của tinh bột trong khoảng 12- 14% nhằm ngăn ngừa sự phát triển của vi sinh vật [33].

1.2.2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn Theo tổ chức Nông lương thế giới (FAO), sản lượng sắn của thế giới năm 2015 ước đạt 288,9 triệu tấn, tăng nhẹ 0,2% so với năm 2014. Châu Phi vẫn là khu vực sản

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

7

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

xuất sắn lớn nhất thế giới với hơn 56% tổng sản lượng đạt 162,5 triệu tấn, tiếp theo là khu vực châu Á với 32,2% đạt gần 93 triệu tấn [37]; Tại khu vực châu Á, Việt Nam là nước đứng thứ 3 sau Thái Lan và Indonesia dẫn đầu về sản lượng sắn trong năm 2015 ước đạt 10,67 triệu tấn. Theo thống kê của bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, trong quý I năm 2015 tổng sản lượng sắn xuất khẩu và các sản phẩm từ sắn đạt 1,37 triệu tấn, với giá trị 420 triệu USD, tăng 24% về lượng và tăng 22,7% về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái. Tính đến ngày 15/8/2015 diện tích trồng sắn cả nước đạt hơn 473 nghìn ha, tăng 0,8% so với cùng kỳ năm 2014. Sắn được trồng nhiều nhất ở Bắc Trung Bộ và Duyên hải miền Trung, nhưng năng suất cao nhất vẫn là ở vùng Đông Nam Bộ. Thị trường tiêu thụ sắn và tinh bột sắn chủ yếu là Trung Quốc (chiếm trên 85% tổng kim ngạch xuất khẩu) [37,38,42].

Theo số liệu của hiệp hội sắn Việt Nam, cả nước có 100 nhà máy sản xuất tinh bột sắn với quy mô công nhiệp, trong đó có 7 nhà máy chế biến cồn từ tinh bột sắn. So với 5 năm trước đây, con số này tăng gấp đôi về số lượng nhà máy và gấp 3 lần về công suất. Cơ cấu sử dụng sắn hàng năm được chia thành 3 nhóm chính gồm: 37% cho sản xuất tinh bột, 33% cho xuất khẩu và 30% cho sản xuất thức ăn chăn nuôi. Sắn được xem là cây dễ trồng, ít kén đất, vốn đầu tư ít, phù hợp với nhiều vùng sinh thái khác nhau và điều kiện kinh tế nông hộ. Hiện nay, cây sắn đang được chuyển đổi từ cây lương thực, thực phẩm sang cây công nghiệp hàng hóa có lợi thế cạnh tranh cao. Vì vậy tinh bột sắn là nguồn nguyên liệu dồi dào, rẻ tiền và được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp như: thực phẩm, dược phẩm, dệt, giấy,…[39,40].

1.3. ENZYM SỬ DỤNG TRONG SẢN XUẤT POLYMALTOSE Quá trình thủy phân tinh bột để sản xuất polymaltose gồm hai giai đoạn.

Giai đoạn 1 là giai đoạn dịch hóa tinh bột làm giảm độ nhớt của tinh bột và làm cho tinh bột tan hoàn toàn giúp cho quá trình đường hóa tốt.

Giai đoạn 2 là giai đoạn đường hóa tạo polymaltose mạch thẳng tức là trong giai đoạn đường hóa chỉ tiến hành thủy phân liên kết α-1,6 glucoside [9,26,27].

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

8

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

1.3.1. Quá trình dịch hóa tinh bột bằng enzym α- amylase Để tạo ra tinh bột tan có DE thích hợp cho quá trình đường hóa tạo polymaltose trước hết phải tiến hành quá trình dịch hóa tinh bột bằng enzym α- amylase.

1.3.1.1. Giới thiệu enzym α- amylase và nguồn sinh tổng hợp α- amylase là enzym nội bào (endo- 1,4 α- D glucan glucohydrolase) thủy phân liên kết α-1,4 glucoside của phân tử amylose một cách ngẫu nhiên. Đó cũng là endoenzym phân cắt bên trong mạch tinh bột. Các α- amylase được phân loại theo tính chất và hoạt động của nó. α- amylase thủy phân tinh bột chủ yếu tạo ra dextrin được xếp vào loại “dịch hóa” [1,2,4,10,22].

Nguồn sinh tổng hợp Enzym α- amylase có thể nhận được từ nhiều loại vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm mốc, nấm men. Tuy nhiên α- amylase từ vi khuẩn vẫn được sử dụng nhiều nhất do một số đặc điểm ưu việt như có hoạt tính và nhiệt độ tối ưu cao hơn so với các α- amylase thu được từ nấm mốc, nấm men [15].

Các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus đóng vai trò quan trọng nhất trong việc sản xuất α-amylase trong công nghiệp bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy chìm. Hiện nay có nhiều phương pháp nghiên cứu sản xuất α- amylase bền nhiệt từ B. licheniformis, trong đó phương pháp nuối cấy bề mặt cho hiệu suất kinh tế cao [5,16,31].

Nấm mốc thuộc chi Aspergillus rất phổ biến trong sản xuất enzyme ngoại bào.

Hiệu suất sinh tổng hợp enzyme có thể tăng lên nhiều nhờ điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường. Phương pháp sử dụng trong nuôi cấy enzyme α- amylase từ nấm mốc là phương pháp nuôi cấy bề mặt, sử dụng chủng Asp. oryzae trong thiết bị với dòng khí phun từ dưới lên có tác dụng đảo trộn các hạt trong môi trường, giúp tăng tốc độ truyền nhiệt và truyền khối, tăng hiệu suất sinh tổng hợp enzyme. Các điều kiện trao đổi oxy, đặc biệt là áp suất oxy hòa tan là những yếu tố quan trọng trong sản xuất α- amylase [13,35].

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

9

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

Xạ khuẩn và nấm men thuộc chi Endomycopsis cũng có khả năng tổng hợp αamylase, tuy nhiên hoạt lực α- amylase của chúng không cao [32,34].

1.3.1.2. Cơ chế thủy phân tinh bột của enzym α- amylase.

Enzyme α- amylase thủy phân tinh bột bằng cách phân cắt ngẫu nhiên tại các liên kết α-1,4 glucoside. Khi thực hiện quá trình thủy phân, α- amylase phân cắt amylose thành maltose, maltotriose, oligosaccharide. Giai đoạn tiếp theo là quá trình thủy phân thành các dextrin phân tử lượng thấp, nhưng quá trình này xảy ra chậm, đặc biệt là các maltotriose vì cơ chất này không thích hợp với các α- amylase. Nếu chịu tác dụng lâu dài thì α- amylase có thể chuyển phần lớn các chất trên thành maltose và glucose [1].

Khi thủy phân amylopectin, giai đoạn đầu dẫn tới sự hình thành các dextrin giới hạn, có nhánh, và trọng lượng phân tử thấp là maltose và glucose. Giai đoạn sau, thủy phân maltotriose diễn ra với tốc độ rất chậm. Sản phẩm cuối cùng ngoài maltose và glucose còn có các dextrin phân tử lượng thấp và isomaltose. Thủy phân tinh bột bằng α- amylase dịch hóa có mức độ polyme không vượt quá 30-40% và tạo thành chủ yếu là dextrin và một ít đường.

Tinh bột

α- amylase, H2O

α- dextrin+ glucose+maltose

Cơ chế tác dụng của α- amylase lên phân tử tinh bột là thủy phân không định vị các liên kết α-1,4 glucoside trong các polysaccharid, kết quả là dịch tinh bột loãng ra và có độ nhớt giảm. Quá trình thủy phân tinh bột bằng enzyme được thực hiện qua một loạt các sản phẩm trung gian có phân tử lượng khác nhau gọi là dextrin. Lúc đầu thu được các dextrin có phân tử lượng lớn, khác biệt so với tinh bột về cấu trúc cũng như tính chất tác dụng với oide. Sau đó các dextrin thu được có phân tử lượng ngày càng thấp dần và tính chất tác dụng với iode cũng thay đổi. Sản phẩm cuối cùng là glucose và maltose [6,20,25,30].

1.3.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới enzym α- amylase [5,9] Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

10

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đối với enzyme được thể hiện qua phương trình Michaelis-Menten: V Trong đó: V: vận tốc của phản ứng Vmax: vận tốc cực đại của phản ứng [S]: nồng độ cơ chất Km: hằng số Michaelis, thể hiện ái lực giữa enzyme và cơ chất Như vậy nồng độ cơ chất thấp, V phụ thuộc tuyến tính vào [S]. Ở nồng độ cơ chất lớn, vận tốc phản ứng đạt cực đại và không phụ thuộc [S]. Nếu nồng độ cơ chất bằng Km thì vận tốc phản ứng bằng một nửa vận tốc cực đại. Tuy nhiên cũng như một số enzyme khác, α- amylase bị ức chế trong trường hợp thừa cơ chất [10]. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Đối với enzyme nói chung, trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme: V= k. [E]

với [E] là nồng độ enzyme

Cũng có trường hợp khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm. Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ của α- amylase Mỗi α- amylase phụ thuộc vào nguồn gốc thu nhận mà có pH thích hợp và đặc trưng riêng. Thường gặp là các α- amylase có pH hoạt động khoảng 5.0-7.0, một số loại có pH hoạt động khá cao pH= 7.5-10, các enzyme này thường gặp ở các chủng ưa kiềm, thuộc nhóm enzyme kiềm tính. Enzyme hoạt động ở vùng pH thấp, thuộc nhóm enzyme axit. Một số α- amylase có vùng pH hoạt động khá rộng, tối ưu ở pH= 6.0-7.0, nhưng ở vùng pH axit thấp và axit cao chúng vẫn giữ được tới 70-80% hoạt tính [32]. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt động của α- amylase Enzyme α- amylase có nguồn gốc khác nhau thì hoạt động ở nhiệt độ tối ưu khác nhau. Phần lớn α- amylase của động vật và một số loại vi sinh vật có nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 40-500C. Một số loại enzyme ưa lạnh còn lại chủ yếu là các loại KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

11

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

enzyme có nhiệt độ tối ưu cao hay còn gọi là enzyme chịu nhiệt. Nhiệt độ tối ưu của enzyme chịu nhiệt thường lớn hơn 650C. Maininh và Campell đã xác định được nhiệt độ tối ưu của các enzyme có nguồn gốc khác nhau như: B. stearothermophilus: 55700C, B. subtilus 600C, B. licheliformis: 90-1050C. Ảnh hưởng của các chất kìm hãm lên hoạt động của α- amylase(inhibitor) Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme α- amylase có cơ chế tác động hoàn toàn khác với cơ chế hoạt động của một số chất bất hoạt enzyme. Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme hoạt động theo cơ chế cạnh tranh và không cạnh tranh với cơ chất. Khi giải phóng khỏi chất kìm hãm enzyme lại hoạt động trở lại. Nghiên cứa cơ chế hoạt động của chất kìm hãm là một biện pháp hữu hiệu để nghiên cứu hoạt động của enzyme, xác định vị trí tâm gắn cơ chất, tâm hoạt động trên các cấu trúc bậc ba của α- amylase. Các chất kìm hãm của α- amylase chia làm hai loại: Chất kìm hãm có cấu trúc tương tự cơ chất Chất kìm hãm có bản chất protein Nhiều chất kìm hãm có bản chất protein chỉ tìm thấy ở thực vật và vi sinh vật.

Các chất này có tính chất đặc biệt là kìm hãm hoạt động của α- amylase động vật và một số chủng Streptomyces, nhưng lại không kìm hãm hoạt động của α- amylase thực vật và hầu hết các loại vi sinh vật khác. Tất cả các chất kìm hãm này đều có vùng đặc trưng chứa trình tự Trp-Arg-Tyr. Ảnh hưởng của Ca2+ lên hoạt tính và độ bền nhiệt của α- amylase Phần lớn α- amylase có hoạt tính và độ bền nhiệt phụ thuộc vào Ca2+ nhưng ở mức độ khác nhau. Ở một số α- amylase cả hoạt tính và độ bền nhiệt đều phụ thuộc vào Ca2+.

Một số khác chỉ làm tăng độ bền nhiệt mà không ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme α- amylase. Ở nhiệt độ thấp Ca2+ hoàn toàn có thể thay thế bằng các ion kim loại hóa trị II thuộc nhóm kiềm thổ, ở nhiệt độ cao thì không thể thay thế. Chỉ có một số ít αamylase mà Ca2+ không ảnh hưởng tới hoạt tính cũng như độ bền nhiệt của enzyme.

EDTA là chất khử Ca2+ nên làm giảm hoạt lực của α- amylase. Ca2+ làm giảm hoạt tính của α- amylase mạnh nhất (gần 80%) ở nồng độ 5mM. Vì vậy ion Ca2+ giữ vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc cũng như hoạt động của enzyme α- amylase [8].

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

12

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

1.3.1.4. Giới thiệu một số enzym dịch hóa.

-

Enzyme Termamyl Termamyl 120L là chế phẩm enzyme dạng lỏng của hãng Novo- Đan Mạch, chịu

nhiệt cao và pH trung tính. Chế phẩm này được sản xuất từ

vi sinh vật Bacillus

licheniformis. Termamyl là enzyme ở dạng endo- amylase có tác dụng thủy phân các liên kết α-1,4 glucoside. Cơ chế tinh bột dưới tác dụng của Termamyl sẽ tạo thành các dextrin và các oligosaccharide tan trong nước. Termamyl hoạt động ở nhiệt độ tối ưu từ 90-1000C, pH 5-6. Nếu bảo quản Termamyl ở 50C thì hoạt tính có thể duy trì tối thiểu 1 năm [23].

-

Enzyme Liquozyme Supra (Novozyme- Đan Mạch) Liquozyme Supra là một hỗn hợp dạng lỏng của các enzyme α- amylase bền

nhiệt được sử dụng dịch hóa tinh bột. Chế phẩm enzyme được sản xuất từ chủng tái tổ hợp Bacillus licheniformis. Hoạt lực của enzyme đạt 135KNU/g, hoạt động ở nhiệt độ tối ưu từ 105-1100C, pH 5.1-5.6, liều lượng khuyến cáo được sử dụng là 0.25-0.65 kg/tấn tinh bột [21].

-

Enzyme Amylex® HT [14,23] Amylex® HT là tên thương mại của enzyme thuộc nhóm α- amylase dạng lỏng

màu nâu và chịu nhiệt. Amylex® HT có xuất xứ từ Mỹ, được sản xuất bằng quy tình công nghệ cao và tự động hóa. Amylex® HT là enzyme đạt tiêu chuẩn thực phẩm làm giảm nhanh độ nhớt của dịch tinh bột và sinh ra một lượng lớn các dextrin phân tử thấp.

Công dụng: Amylex® HT sử dụng trong công nghệ tinh bột để dịch hóa tinh bột tạo ra các dextrin có phân tử thấp. Do khả năng chịu nhiệt, khoảng pH hoạt động rộng 4.0 -7.0 và nhu cầu canxi thấp nên Amylex® HT có thể dịch hóa tinh bột ở nhiệt độ cao khoảng 80- 900C mà không cần bổ sung thêm ion canxi. Đặc điểm: Amylex® HT là dung dịch có màu nâu. Enzyme có mùi nhẹ đặc trưng của sản phẩm lên men. Enzyme tan trong nước, bị mất hoạt tính ở pH< 4.0 và pH> 7.0, enzyme bị ức chế hoạt động ở nhiệt độ trên 950C, mất hoạt tính hoàn toàn khi nhiệt độ vượt quá 100 0C trong thời gian nhất định.

Liều lượng: Liều lượng sử dụng tùy thuộc vào bản chất và tỷ lệ chất khô trong cơ chất, chỉ số DE của dịch dextrose cuối, nhiệt độ và pH dịch hóa, thời gian dịch hóa KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

13

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

(thông thường là 30-120 phút). Liều lượng enzyme khuyến cáo: Tỷ lệ sử dụng không vượt quá 0,5 kg Amylex® HT/ tấn tinh bột khô.

1.3.2. Quá trình đường hóa tinh bột bằng enzym pullulanase 1.3.2.1 Giới thiệu enzym pullulanase và nguồn sinh tổng hợp Enzyme pullulanase là enzyme đường hóa cắt mạch nhánh, theo danh pháp quốc tế enzyme pullulanase gọi là pullulan 6-glucanohydrolase (EC. 3.2.1.41). Enzyme pullulanase là enzyme thủy phân liên kết α-1,6 glucoside trong phân tử amylopectin, αdextrin, glycopen, pullulan, tuy nhiên nó không có tác dụng đối với amylase và các oligosaccharide mạch thẳng [34].

Nguồn sinh tổng hợp Enzyme pullulanase có trong thực vật như đậu Hà lan, cây yến mạch, malt gạo,… nhưng nguồn sản xuất dồi dào và phong phú nhất là các chủng vi sinh vật.

Pullulanase lần đầu tiên được tìm thấy từ Klebsiella pneumoniae, sau này người ta phát hiện thấy pullulanase được sinh tổng hợp từ các nguồn vi sinh vật rất đa dạng như Encherichia intermedia, Streptococcus mitis, Bacillus acidopullulyticus, Streptomyces flavochromogenas, Oryza sativa, Bacillus macrans, Bacillus pomyxa, Aerobacter aerogenes,…[34] Pullulanase thu từ K. pneumoniae được dùng trong nghiên cứu cấu trúc của tinh bột và glycogen, thủy phân cấu trúc phân nhánh α-1,6 glucoside. Trong sản xuất các loại đường glucose, maltose từ tinh bột trên quy mô công nghiệp người ta ứng dụng pullulanase từ K. pneumoniae và B. acidopullulyticus để tăng hiệu suất chuyển hóa. Ví dụ trong công nghệ sản xuất maltose nếu kết hợp pullulanase với α- amylase và βamylase thì hiệu suất chuyển hóa tăng 97% [9].

Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật DNA tái tổ hợp người ta đã tách gen mã hóa pullulanse từ chủng Desulfurococcus mucosus DSM2162 ghép vào chủng B. subtilis JA803 để sinh tổng hợp enzyme pullulanase [15].

Enzyme từ các chủng vi sinh vật khác nhau có những đặc tính kỹ thuật giống và khác nhau. Bảng dưới đây cho thấy một số đặc tính kỹ thuật của enzyme pullulanase từ 2 chủng K. pneumoniae và B. acidopullulyticus. Hiện nay 2 chủng này được sử dụng để KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

14

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

sinh tổng hợp enzyme trên quy mô công nghiệp của 2 hãng nổi tiếng thế giới đó là Amano (Nhật Bản) và Novozyme (Đan Mạch).

Bảng 1.1. Một số tính chất của enzyme pullulanase [34] Pullulanase

K. pneumonia

B. acidopullulyticus

Nội bào

Ngoại bào

Chủng 11647

Chủng 11777

sinh

sinh

(Ngoại bào sinh

(Ngoại bào

enzyme

enzyme

enzyme)

sinh enzyme)

90.000

66.000

100.000

90.000

7.000(1)

7.200(1)

100(2)

50(2)

pH tối ưu

6.0

6.6

5.2

5.5

Khoảng pH ổn định

5.5-12

5.0-11.5

4-9

4- 9

Khả năng chịu nhiệt

400C

45-550C

550C

550C

Điểm đẳng điện (pI)

3.8-4.46

3.7-4.3

5.0

4.9

Kiểu hoạt động

Endo

Endo

Endo

Endo

Trọng lượng phân tử (Dalton) Hoạt lực/ mg protein (UI/mg)

(1) Sử dụng cơ chất pullulanase

(2) Sử dụng cơ chất là amylopectin

Phần lớn pullulanase đều có trọng lượng phân tử tương đối gần nhau khoảng 90.000- 100.000 Da, nhưng pullulanase của B. polymyxa có trọng lượng phân tử chỉ 48.000 Da [27]. Trọng lượng phân tử xác định được bằng điện di gel từ 2 chủng K. pneumoniae và B. acidopullulyticus là 66.000- 90.000 Da [35].

Pullulanase có nguồn gốc khác nhau thì hoạt động ở các nhiệt độ tối ưu và pH khác nhau. Enzyme pullulanase của chủng Baccillus. Sp. 202-1 là 550C, chủng Streptococcus mitis là 300C. Pullulanase từ chủng B. acidopullulyticus hoạt động ở pH thích hợp nhất ở pH 5,5 và nhiệt độ 550C, tuy nhiên nhiệt độ thích hợp nhất cho sinh tổng hợp enzyme từ chủng này là 350C [22]. pH tối ưu cho hoạt động của pullulanase từ K. pneumoniae là 6.0- 7.0 và enzyme duy trì được 80% hoạt lực khi pH 5- 10, nhiệt độ tối ưu là 550C và nhiệt độ enzyme ổn định 40-550C [23,26].

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

15

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

1.3.2.2. Cơ chế thủy phân tinh bột của enzym pullulanase Pullulanase có tác dụng thủy phân liên kết α-1,6 glucoside của phân tử amylopectin, các oligosaccharide mạch nhánh nên có giá trị DE tăng theo thời gian phản ứng. Khả năng thủy phân của pullulanase từ chủng Streptococcus mitis trên cơ chất amylopectin và glycogen là 50% và 30%. Pullulanase không thủy phân các liên kết α-1,6 glucoside trong isopanose, isomaltose và một số mạch nhánh ngắn [9,12].

Pullulanase kết hợp với enzyme α- amylase trong thủy phân tinh bột để sản xuất ra một loạt các maltooligosaccharide khác nhau như: maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose,…. và làm tăng đường khử theo thời gian thủy phân.

1.3.2.3. Giới thiệu một số chế phẩm enzym pullulanase -

Enzyme Promozyme D2 Promozyme D2 là tên thương mại của ezyme Pullulanase thủy phân liên kết α-

1,6 glucoside của amylopectin trong phân tử tinh bột. Promozyme D2 được sản xuất từ chủng Bacillus subitis đột biến của hãng Novo- Đan Mạch, hoạt lực enzyme 1350 PNU/g. Chế phẩm dạng lỏng, có màu vàng, hoạt động ở nhiệt độ 45- 650C, pH= 5-7, tỷ lệ sử dụng từ 0.1- 0.5%( so với tinh bột). Bảo quản ở nhiệt độ từ 0-250C, bị bất hoạt ở 800C trong 40 phút và 850C trong 5 phút [29].

-

Enzyme pullulanase “Amano” 3 Enzyme pullulanase “Amano” 3 là chế phẩm sản xuất từ chủng Klebsiella

pneumoniae của hãng Amano- Nhật Bản. Chế phẩm dạng lỏng, có màu vàng sáng, hoạt động tốt ở 40- 650C, pH= 5.5- 7.5, có thể duy trì được hoạt lực ở 0- 50C trong 6 tháng.

Enzyme mất hoạt tính ở 800C trong 40 phút và 850C trong 5 phút [42].

-

Enzyme Kleistase PL Enzyme Kleistase PL là chế phẩm được sản xuất từ chủng Pullulanibacillus

naganoensis của hãng Amano- Nhật Bản. Chế phẩm dạng lỏng, có màu vàng, hoạt động ở nhiệt độ tối ưu 50- 650C, pH=5-6, hoạt lực 405 PNU/g, được bảo quản ở 50C, bị bất hoạt ở 80- 850C [42].

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

16

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT 2.1.1. Nguyên liệu * Tinh bột sắn (Việt Nam) có chất lượng như sau: - Hàm lượng tinh bột:

85%

- Độ ẩm: 12-14% * Enzyme: - Chế phẩm enzyme dịch hóa: Chế phẩm enzyme dịch hóa: Amylex®HT (Mỹ), Termamyl (Novozyme-Đan Mạch), Liquozyme Supra (Novozyme-Đan Mạch) - Chế phẩm enzyme đường hóa: Promozyme D2 (Novozyme-Đan Mạch), Pullulanase “Amano” 3 (Amanozyme-Nhật Bản), Kleistase PL (Amanozyme - Nhật Bản).

- Than hoạt tính (Nhật) 2.1.2. Hóa chất CuSO4.5H2O, KNaC4H4O6, NaOH, HCl, KOH, K3Fe(CN)6, nước cất, glucose, Acetonitril (CAN), chỉ thị xanh metylen,…

2.1.3. Thiết bị Thiết bị phòng thí nghiệm: Chiết quang kế, Brome kế - Germany, máy đo pH Thermor Orion – Model 410 (China), máy đo độ nhớt Viscosimetre capillaire (Germany), máy đo độ ẩm Precisa HA60 (Switzerland), máy sắc kí lỏng cao áp HPLC, nồi ổn định nhiệt (Germany) và các thiết bị thí nghiệm thông thường.

2.2 PHƯƠNG PHÁP 2.2.1. Phương pháp phân tích 2.2.1.1. Xác định nồng độ chất khô bằng chiết quang kế Chiết quang kế là một dụng cụ quang học dựa trên sự khúc xạ khác nhau trong môi trường có nồng độ chất tan khác nhau. Dịch đem đo cần trong suốt, ở 200C để đảm bảo độ chính xác.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

17

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

Tiến hành đo: Sau khi dịch hóa xong ta lấy một phần dịch đem lọc, làm lạnh tới 200C rồi lấy một giọt dịch cho lên bề mặt chiết quang kế. Đậy nắp kính lại, điều chỉnh vít xoáy sao cho đọc rõ kết quả trên chiết quang kế, ta ghi lại kết quả đó chính là nồng độ phần trăm chất khô.

2.2.1.2. Xác định pH bằng máy đo pH 2.2.1.3. Xác định nồng độ dịch bột bằng brome kế Bột được hòa tan với nước theo tỉ lệ đã định sẵn, sau đó đổ đầy dịch vào ống đong, thổi hết bọt khí phía trên rồi thả nhẹ brome kế vào. Đọc số ghi trên brome kế, đó chính là nồng độ dịch bột. Đơn vị tính là Be. 2.2.1.4. Xác định độ nhớt của dịch thủy phân bằng máy đo độ nhớt Thủy phân tinh bột theo các điều kiện đã quy định (tỉ lệ bột/nước, nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân, pH), sau thủy phân ta để dịch thủy phân nguội đến 800C rồi đem đo độ nhớt bằng máy đo độ nhớt Viscosimetre capillaire (Germany).

2.2.1.5. Xác định độ ẩm của tinh bột sắn bằng máy sấy hồng ngoại Dùng máy sấy hồng ngoại (Precisa HA60 – Thụy Sỹ) để xác định hàm lượng ẩm trong tinh bột. Đây là phương pháp xác định hàm ẩm nhanh và thuận tiện nhất.

2.2.1.6. Xác định hàm lượng tinh bột theo phương pháp Béc-tơ-răng Sử dụng phương pháp Béc- tơ- răng là phương pháp dựa trên tính chất tinh bột bị phân hủy bởi axit HCl thành đường glucose. Trong điều kiện này, dextrin cũng bị axit thủy phân thành glucose. Dung dịch sau khi bị thủy phân được xác định tổng lượng đường glucose theo phương pháp Béc-tơ-răng rồi trừ đi lượng đường glucose và dextrin.

Cách tiến hành: Cân 2g mẫu cho vào bình nón dung tích 250ml, thêm vào 10ml nước cất, 5ml axit HCl 2%. Đậy bằng nút cao su có gắn thủy tinh dài (ống sinh hàn) lắc nhẹ và đem đun nóng trong nồi cách thủy ở 1000C trong 3 giờ liền, kể từ lúc bắt đầu sôi. Thủy phân xong hoàn toàn ra làm nguội tới nhiệt độ phòng rồi cho vào 4-5 giọt metyl da cam và dùng NaOH đặc trung hòa tới đổi màu. Trung hòa xong ta chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 250ml rồi thêm nước cất tới ngấn bình và đem lọc. Sau KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

18

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

đó ta có thể dùng một trong những phương pháp xác định đường về định lượng glucose chứa trong dung dịch pha loãng và suy ra hàm lượng tinh bột trong nguyên liệu. Dùng pipet hút 20ml dung dịch ferixyanua Kali cho vaò trong bình nón dung tích 250ml.

Thêm 5ml KOH2,5N và 2 giọt xanh metylen 0.5% rồi lắc đều, đặt trên bếp 1, 2 phút thì sôi. Dung dịch lọc xong đem ra chuẩn tới khi mất màu xanh metylen.

Cách tính kết quả: Hàm lượng đường glucose được tính theo công thức: X= Trong đó:

( )

X – là hàm lượng đường glucose cần tìm. m – là số ml dịch đường tiêu hao khi chuẩn 20ml dịch ferixyanua Kali.

Hàm lượng tinh bột trong nguyên liệu tính theo công thức: TB =

(%)

Trong đó: a: Số gam glucose tương ứng 20ml dung dịch ferixyanua Kali b: Số ml dịch đường loãng tiêu hao khi định phân m: Số gam tinh bột thủy phân 0,9: Hệ số chuyển glucose thành tinh bột 2.2.1.7. Xác định hàm lượng đường khử (DE) theo phương pháp phân tích LaneEynon Định nghĩa: DE là số đương lượng đường khử quy ra glucose được tạo thành trong quá trình thủy phân tinh bột tính theo phần trăm chất khô.

Mục đích: Trong quá trinh thủy phân tinh bột, việc xác định giá trị DE cho biết mức độ thủy phân tinh bột thành đường khử.

Cơ sở phương pháp: Glucose, maltose và các dextrin là các loại đường khử vì trong phân tử có nhóm aldehyde. Trong môi trường kiềm yếu đường khử dễ dàng khử ion Cu2+ thành Cu+ duới dạng kết tủa CuO có màu đỏ nâu. Để xác định DE, sử dụng dung dịch Fehling A chứa Cu+ và dung dịch Fehling B có chứa Natri Kalitatrat KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

19

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

(KNaC4H4O6) trong môi trường kiềm yếu. Vì thời gian phản ứng diễn ra nhanh chóng (khoảng 2 phút) nên dịch vẫn còn dư Cu+. Hiện tượng này có thể quan sát thấy nhờ khả năng tạo phức không màu của xanh metylen với dung dịch đường khử khi hết Cu+. Cụ thể là 2 -3 giọt xanh metylen vào dung dịch phản ứng, kkhi vừa hết Cu2+, đường khử sẽ tạo thành phức không màu với xanh metylen làm cho màu của dung dịch từ màu xanh metylen chuyển thành màu trắng. Căn cứ vào đó kết thúc quá trình phản ứng.

Dựa vào số ml dung dịch đường khử tiêu hao đem tra bảng Eynon-Lane sẽ tính được đương lượng đường khử quy ra glucose cần xác định. Lượng đường khử tính theo glucose được tính theo phần trăm chất khô gọi là DE. Hóa chất: - Dung dịch Fehling A: CuSO4.5H2O - Dung dịch Fehling B: KNaC4H4O6, NaOH - Chỉ thị xanh metylen tinh thể Cách tiến hành: Dung dich đường được pha loãng sao cho sau khi pha loãng có nồng độ đường khử phù hợp. Trong khi tiến hành thường hút 0.01% dịch đường định mức 100ml.

Dịch đường chuẩn bị ở trên cho vào buret 50ml. Chuẩn bị ba bình tam giác 250ml, hút vào mỗi bình 5ml dung dịch Fehling A và 5ml dung dịch Fehling B. Sau đó cho vào bình 15-20 ml dịch. Đun hỗn hợp cho đến khi sôi. Sau khi sôi 2-3 phút thì cho 2-3 giọt xanh metylen vào và tiếp tục định phân bằng dung dịch đường đã pha loãng đến khi mất màu chỉ thị chuyển sang màu đỏ nâu. Kết thúc quá trình định phân ta ghi được lượng đường đã định phân. Định phân 3 lần và lấy kết quả trung bình. Căn cứ theo lượng dịch tiêu hao ta tra bảng Lane- Eynon để tính DE. Cách tính kết quả: Ta xác định một số yếu tố: - Xác định nồng dộ chất khô bằng chiết quang kế.

- Xác định pH bằng máy đo pH. - Xác định nồng độ bột bằng brome kế.

Sau đó tính DE theo công thức:

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

20

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP DE =

(%)

Trong đó: A: Lượng đường khử tra bảng Lane- Eynon B: Tỷ lệ pha loãng Bx: Nồng độ % chất khô 2.2.1.8. Xác định một số đường glucose, maltose bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) 2.2.2. Phương pháp công nghệ 2.2.2.1. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình dịch hóa tinh bột Tiến hành lựa chọn enzyme dịch hóa tạo cơ chất thích hợp cho quá trình đường hóa, phù hợp với điều kiện sản xuất, sẵn có trên thị trường, có hiệu quả dịch hóa cao từ một số loại enzyme như: Amylex®HT, Termamyl, Liquozyme Supra. Kết quả được đánh giá bởi chỉ số DE, độ nhớt.

Xác định các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme dịch hóa như: nồng độ tinh bột, tỷ lệ enzyme, nhiệt độ, pH, thời gian và các yếu tố khác. Kết quả được đánh giá bởi chỉ số DE, độ nhớt,…

2.2.2.2. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình đường hóa tinh bột Từ một số loại enzyme đường hóa pullulanase thương mại như: Promozyme D2, Pullulanase “Amano” 3, Kleistase PL. Tiến hành lựa chọn enzyme thích hợp cho quá trình đường hóa tạo polymaltose DE 30. Kết quả được đánh giá bởi chỉ số DE, độ nhớt và hàm lượng maltotriose.

Xác định các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme đường hóa tạo polymaltose như: nồng độ cơ chất tinh bột, tỷ lệ enzyme, nhiệt độ, pH, thời gian và các yếu tố khác. Kết quả được đánh giá bởi chỉ số DE, độ nhớt và đường khử…

2.2.2.3. Xây dựng quy trình công nghệ thủy phân tinh bột sắn để sản xuất polymaltose DE 30 Từ kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu, tiến hành xây dựng quy trình công nghệ thủy phân tinh bột sắn để sản xuất polymaltose DE 30.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

21

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN DỊCH HÓA TINH BỘT LÀM NGUYÊN LIỆU PHÙ HỢP CHO QUÁ TRÌNH ĐƯỜNG HÓA TẠO POLYMALTOSE DE 30 3.1.1. Lựa chọn enzyme dịch hóa thích hợp cho quá trình sản xuất polymaltose Enzyme thủy phân tinh bột có rất nhiều loại, tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà ta lựa chọn enzyme cho phù hợp. Hiện nay, enzyme dịch hóa trên thị trường có một số loại mới, để đánh giá hiệu quả của chúng, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đánh giá khả năng thủy phân tinh bột thông qua chỉ số DE, khả năng làm giảm độ nhớt (cP), nồng độ chất hòa tan trong dịch, khả năng cung cấp của ba loại enzyme là Termamyl, Amylex HT, Supra liquor. Quá trình dịch hóa được tiến hành với các điều kiện sau: Nồng độ bột 25%, nồng độ enzyme của mỗi loại là 0,03%, nhiệt độ dịch hóa 900C, thời gian dịch hóa 20 phút, pH dịch hóa là pH 6. Kết quả được ghi trong bảng 3.1: Bảng 3.1. Ảnh hưởng của mỗi loại enzyme đến kết quả dịch hóa Tên chế phẩm

Nồng độ chất khô

DE

Độ nhớt

Enzyme

trong dịch (0Bx)

(%)

(cP)

Termamyl

22,8

12,3

17

Supra liquor

24,3

14,9

15

Amylex HT

24,4

14,8

15

Qua bảng 3.1 cho thấy enzyme Supra liquor và Amylex HT có hoạt lực tương đương nhau và mạnh hơn enzyme Termamyl, bởi trong quá trình dịch hóa có giá trị DE cao hơn, độ nhớt thấp hơn, nồng độ chất hòa tan cao hơn và ba loại enzyme này đều có sẵn trên thị trường. Nếu enzyme có hoạt lực cao thì trong sản xuất lượng enzyme cần dùng là ít hơn, độ nhớt giảm nhanh giúp quá trình lọc dễ hơn. Nhưng enzyme Amylex HT là một loại enzyme mới, nên nó có khả năng bất hoạt ở 1000C, đây là một yếu tố quan trọng là không cần dùng đến thiết bị áp lực để bất hoạt enzyme. Vì vậy chúng tôi

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

22

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

chọn enzyme Amylex HT cho quá trình dịch hóa tạo nguyên liệu cho quá trình sản xuất polymaltose.

3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của mức độ thủy phân tinh bột trong quá trình dịch hóa đến quá trình đường hóa tạo polymaltose DE 30 Trước khi nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện thủy phân tinh bột trong quá trình dịch hóa làm nguyên liệu cho quá trình đường hóa tạo polymaltose DE 30 thì phải xác định được mức độ dịch hóa tinh bột đến mức độ nào là phù hợp để lựa chọn được giá trị DE thích hợp cho quá trình đường hóa tiếp theo. Do vậy trong thí nghiệm này chúng tôi muốn tìm được giá trị DE thích hợp trong quá trình dịch hóa làm nguyên liệu trong quá trình đường hóa để sản xuất polymaltose DE 30 đạt được chất lượng như yêu cầu đặt ra. Điều kiện thí nghiệm: Hòa tinh bột sắn với nồng độ 20% và tiến hành dịch hóa bằng enzyme Amylex HT nhằm tạo ra các giá trị DE khác nhau, sau đó tiến hành bổ sung enzyme đường hóa pullulanase 0,5% (so với bột) vào các mẫu dịch hóa có DE khác nhau, tiếp tục đường hóa ở pH 6, nhiệt độ 550C, thời gian 24 giờ. Kiểm tra phân tích DE đường hóa, hàm lượng glucose, maltose và các oligosaccharide khác tạo thành bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Kết quả được ghi trong bảng 3.2:

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

23

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của DE dịch hóa đến quá trình đường hóa tạo polymaltose DE 30

TT

DE dịch hóa

DE đường hóa

Glucose Maltose Các oligo khác Glucose Maltose Các oligo khác

0,38 4,9 94,72 0,44 5,01 94,55

26,5

Glucose Maltose Các oligo khác

0,51 5,86 93,63

29,9

Glucose Maltose Các oligo khác

0,64 6,92 92,44

34,5

Glucose Maltose Các oligo khác

0,9 8,1 91,0

1

4,0

20,0

2

6,0

25,1

3

4

5

8,0

10,0

12,0

Tỷ lệ các thành phần đường trong dịch so với đường tổng Tên đường %

Qua bảng trên cho thấy giá trị DE đường hóa tăng theo tỷ lệ thuận với DE dịch hóa. Nhưng với DE dịch hóa là 4,6,8 cho giá trị DE đường hóa không đạt yêu cầu đặt ra (DE<30), mặc dù ở giá trị DE này cho hàm lượng glucose và maltose thấp nhất (hàm lượng glucose, maltose càng thấp càng tốt cho quá trình tạo phức). Còn với DE dịch hóa là 10 cho giá trị DE đường hóa 29,9 đạt yêu cầu đặt ra, mặt khác ở giá trị DE này cho hàm lượng glucose và maltose cao hơn không đáng kể và vẫn đạt yêu cầu đặt ra.

Còn với DE dịch hóa là 12 cho giá trị DE đường hóa không đạt yêu cầu (DE>30). Do vậy ta chọn mức độ thủy phân trong quá trình dịch hóa là DE 10.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

24

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

3.1.3. Xác định nồng độ enzyme thích hợp trong quá trình dịch hóa tạo DE 10 Trong điều kiện nồng độ cơ chất thích hợp, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính với nồng độ enzyme. Tuy nhiên khi nồng độ enzyme quá cao, vận tốc phản ứng tăng chậm và tốn kém hơn trong sản xuất, nếu nồng độ enzyme quá thấp thì DE dịch hóa không đạt và độ nhớt lại cao. Vì vậy cần xác định nồng độ enzyme dịch hóa thích hợp để đạt được DE 6 với điều kiện sau: -

Nồng độ bột 20%

-

Nhiệt độ dịch hóa 900C

-

Thời gian dịch hóa 20 phút

-

pH dịch hóa là 6

-

Nồng độ enzyme Amylex HT được thử là khác nhau từ 0,01- 0,05% (so với nồng độ bột).

Kết quả được ghi trong bảng 3.3: Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình dịch hóa Nồng độ enzyme

Nồng độ chất khô

DE

Độ nhớt

(%)

(0Bx)

(%)

(cP)

1

0,01

19,1

5.6

25

2

0,02

19,6

6,1

22

3

0,03

19,6

7,9

20

4

0,04

19,8

10,1

16

5

0,05

19,8

14,9

15

TT

Kết quả thu được từ bảng 3.3 cho thấy với nồng độ enzyme 0,04% cho kết quả DE dịch hóa 10,1 đáp ứng được yêu cầu, còn nếu nồng độ enzyme thấp hơn hoặc cao hơn đều cho kết quả (DE) không đạt yêu cầu. Do vậy nồng độ enzyme được chọn cho quá trình dịch hóa là 0,04% là thích hợp nhất.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

25

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

3.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ dịch bột đến quá trình dịch hóa tạo DE 10 Nồng độ cơ chất là yếu tố có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của enzyme, nếu hàm lượng tinh bột thấp, enzyme dễ dàng tiếp xúc và xúc tác phân hủy mạch tinh bột, phân cắt liên kết glucoside, nhưng nếu hàm lượng tinh bột quá thấp hoặc quá cao, sẽ ngăn cản enzyme tiếp xúc với cơ chất, do đó làm giảm tốc độ phản ứng thủy phân của enzyme. Trong quá trình thủy phân, nồng độ cơ chất ảnh hưởng đến chỉ số DE, độ nhớt của dịch thuỷ phân. Quá trình thuỷ phân tinh bột sắn được thực hiện ở các nồng độ tinh bột khác nhau trong điều kiện sau: -

Nồng độ enzyme: 0,04%

-

Nhiệt độ dịch hoá: 900C; pH 6; thời gian dịch hoá 20 phút

-

Nồng độ bột được thử từ 10-30% Mức độ dịch hoá được xác định bởi giá trị DE và độ nhớt. Kết quả được thể hiện

ở bảng 3.4: Bảng 3. 4. Ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến quá trình dịch hóa Nồng độ cơ chất

Nồng độ chất

DE

Độ nhớt

(%)

khô (Bx)

(%)

(cP)

1

10

9,4

10,2

11

2

15

14,5

10,2

12

3

20

19,7

10,1

16

4

25

24,6

10,1

18

5

30

28,5

9.6

23

TT

Qua bảng 3.4 cho thấy với nồng độ cơ chất 10 - 25% cho giá trị DE tương đương nhau và đạt yêu cầu, còn độ nhớt tăng dần theo nồng độ bột nhưng với độ nhớt ≤ 20 quá trình lọc vẫn dễ dàng, ở nồng độ bột cao 30% mức độ thủy phân cũng bắt đầu giảm và độ nhớt cao sẽ ảnh hưởng đến quá trình lọc sau này. Do vậy nồng độ bột được chọn là 25% là phù hợp nhất, còn nếu nồng độ bột thấp hơn thì tốn nhiều thiết bị, công cô đặc,... ảnh hưởng đến giá thành sản phẩm.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

26

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

3.1.5. Ảnh hưởng của thời gian dịch hóa tinh bột sắn tạo dịch có DE 10 Trong quá trình thủy phân, thời gian đóng vai trò rất quan trọng, nếu thời gian dịch hóa quá dài hoặc quá ngắn đều ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và giá thành sản phẩm. Vì vậy trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành xác định ảnh hưởng của thời gian đến quá trình dịch hóa, để tìm thời gian thủy phân thích hợp cho quá trình dịch hóa tạo DE 10.

Trong quá trình dịch hóa, thời gian ngắn thì tinh bột chưa được thủy phân triệt để, sẽ có độ nhớt cao và DE thấp. Nếu thời gian thủy phân dài mà không mang lại hiệu quả thì gây lãng phí nhiệt năng, công lao động,... Vì vậy cần phải xác định thời gian dịch hóa thích hợp để tạo DE 10. Các thông số được cố định là: - Nồng độ tinh bột sắn bột: 25% - pH: 6, nồng độ enzyme 0,04%, nhiệt độ 900C - Thời gian dịch hoá được thử từ 10-30 phút Kết quả ghi trong bảng 3.5: Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian dịch hóa đến chất lượng dịch hóa TT

Thời gian

Nồng độ

DE

Độ nhớt

(phút)

chất khô (0Bx)

(%)

(cP)

1

10

24,1

9,1

19

2

15

24,4

9,7

19

3

20

24,7

10,1

18

4

25

24,7

10,2

18

5

30

24,8

10,2

18

Qua bảng 3.5 cho thấy: Với thời gian dịch hóa 10-15 phút quá trình thủy phân chưa triệt để, giá trị DE thấp không đạt yêu cầu. Còn với thời gian dịch hóa 20 phút cho giá trị DE đạt yêu cầu, nếu kéo dài thời gian dịch hóa 25 - 30 phút giá trị DE tăng không đáng kể so với thời gian dịch hóa 20 phút và độ nhớt không thay đổi. Do vậy ta chọn thời gian dịch hóa 20 phút là phù hợp nhất để sản xuất polymaltose.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

27

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

3.1.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân tới quá trình dịch hóa Nhiệt độ cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme trong quá trình thuỷ phân tinh bột. Mỗi enzyme có một nhiệt độ hoạt động tối ưu khác nhau. Vì vậy để tăng hiệu quả trong sản xuất cần xác định nhiệt độ thích hợp cho enzyme thủy phân.

Trong quá trình nghiên cứu cần duy trì nhiệt độ ổn định trong thời gian xác định. Điều kiện thí nghiệm là: -

Nồng độ tinh bột sắn bột: 25 %

-

Nồng độ enzyme 0,04%; pH 6; thời gian dịch hoá 20 phút.

Ta thay đổi nhiệt độ dịch hoá để xem xét ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng

dịch hoá tinh bột (được đánh giá thông qua chỉ số DE và độ nhớt) từ đó tìm ra nhiệt độ dịch hoá thích hợp cho enzyme Amylex HT hoạt động. Kết quả được ghi trong bảng 3.6: Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ dịch hóa đến chất lượng dịch hóa Nhiệt độ

Nồng độ

DE

Độ nhớt

dịch hóa (0C )

chất khô (0Bx)

(%)

(cP)

1

75

20,7

8,2

26

2

80

22,8

9,4

22

3

85

24,6

10,1

18

4

90

24,5

10,0

18

5

95

24,3

9,7

19

TT

Theo quy luật các phản ứng hoá học thông thuờng, nhiệt độ càng cao thì vận tốc phản ứng càng tăng. Ở nhiệt độ càng cao thì độ nhớt càng giảm. Tuy nhiên do enzyme có bản chất của protein nên ở nhiệt độ quá cao, protein bị biến tính, làm hoạt tính của enzyme giảm và không hoạt động trở lại được. Ở nhiệt độ 750C – 800C mức độ thuỷ phân đạt chưa cao. Ở nhiệt độ 85 – 900C là nhiệt độ tốt nhất cho quá trình dịch hóa, mức độ thuỷ phân đạt cao nhất, còn ở nhiệt độ 950C tốc độ thuỷ phân của enzyme giảm, bởi nhiệt độ cao gần tới ngưỡng của nhiệt độ bất hoạt enzyme. Do vậy nhiệt độ dịch hoá được chọn để sản xuất polymaltose là 85-900C .

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

28

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

3.1.7. Xác định ảnh hưởng của pH tới quá trình dịch hóa pH có ảnh hưởng lớn tới vận tốc thuỷ phân của enzyme. Mỗi enzyme đều có pH hoạt động thích hợp, tại pH thích hợp enzyme hoạt động mạnh nhất. Mục đích của nghiên cứu này là xem xét ảnh hưởng của pH tới quá trình thủy phân của enzyme, từ đó chọn pH thích hợp cho dịch hóa tạo nguyên liệu cho quá trình sản xuất polymaltose.

- Tinh bột sắn được hòa trong nước với nồng độ 25% - Enzyme Amylex HT nồng độ 0,04% - thời gian dịch hóa 20 phút - Nhiệt độ dịch hóa 900C - pH được thử từ 4 - 8 Kết quả được ghi trong bảng 3.7.

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của pH đến quá trình dịch hóa Nồng độ

DE (%)

Độ nhớt (cP)

22,9

7,8

28

5

24,6

10,1

18

3

6

24,7

10,0

18

4

7

23,9

8,3

25

5

8

22,6

8,0

27

TT

pH dịch hóa

1

4

2

chất khô (0Bx)

Kết quả cho thấy: pH thấp (4) hoặc cao (8) đều cho giá trị DE không đạt yêu cầu, mặt khác độ nhớt cao ảnh hưởng đến quá trình đường hóa và lọc. pH 5 - 6 cho kết quả dịch hóa tốt và độ nhớt thấp nhất, ở pH này cũng là pH của tinh bột, nên quá trình dịch hóa ta không phải điều chỉnh pH. Vậy pH thích hợp với quá trình dịch hóa là: 5- 6.

Kết luận: Điều kiện thích hợp cho quá trình dịch hóa tinh bột sắn tạo DE 10 là: nồng độ bột 25%, Nồng độ enzyme Amylex HT 0,04%, nhiệt độ dịch hóa là 85-900C, pH dịch hóa 5-6, thời gian dịch hóa 20 phút.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

29

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

3.2. NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN ĐƯỜNG HÓA THÍCH HỢP ĐỂ TẠO POLYMALTOSE DE 30 Dịch tinh bột sau khi đã dịch hoá được chuyển tiếp sang giai đoạn đường hoá với sự tham gia của enzyme Pullulanase phân cắt các liên kết α – 1,6 glucoside trong các sản phẩm trung gian của quá trình dịch hóa. Ở giai đoạn này cần nghiên cứu lựa chọn enzyme và các điều kiện thích hợp nhất cho hoạt động xúc tác phản ứng cắt các mạch oligosaccharide nhánh tốt nhất để tạo polymaltose mạch thẳng.

3.2.1. Lựa chọn enzyme thích hợp cho quá đường hóa tạo tạo polymaltose.

Hiện nay trên thị trường có một số loại enzyme đường hóa chuyên thủy phân liên kết α-1,6 glucoside. Để lựa chọn được enzyme đường hóa thích hợp cho sản xuất polymaltose có DE 30 người ta có thể sử dụng enzyme: Pullulanase “Amano” 3, Kleistase PL, Promozyme D2. Dựa vào mức độ thủy phân cắt mạch nhánh và độ nhớt của dịch sau đường hóa,... để chọn được enzyme đường hóa thích hợp. Điều kiện thí nghiệm: - Dịch hóa tinh bột đạt DE 10, tiếp tục thử đường hóa với các loại enzyme Pullulanase “Amano” 3, Kleistase PL, Promozyme D2.

-

Đường hóa với nồng độ mỗi loại enzyme là 0,5% (so với nồng độ bột)

-

pH 6,0

-

Nhiệt độ 550C

-

Thời gian 30 giờ

Kết quả thí nghiệm được ghi trong bảng 3.8: Bảng 3.8. Ảnh hưởng của enzyme đường hóa đến quá trình đường hóa STT

Tên chế phẩm enzyme

DE đường hóa

Độ nhớt

(%)

(cP)

1

Pullulanase “Amano” 3

30,0

18

2

Kleistase PL

26,7

23

3

Promozyme D2.

30,1

18

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

30

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

Qua bảng 3.8 cho thấy cùng điều kiện đường hóa như nhau nhưng enzyme Kleistase PL cho kết quả thủy phân kém nhất DE đường hóa đạt thấp nhất, độ nhớt đạt cao nhất, điều này có thể giải thích rằng enzyme này có hoạt lực thấp hơn nên với nồng độ enzyme như vậy chưa đủ để cắt hết mạch nhánh. Còn enzyme Pullulanase “Amano” 3, Promozyme D2 cho kết quả gần tương đương nhau và đều đáp ứng được với yêu cầu chất lượng đưa ra. Vì vậy để sản xuất polymaltose DE 30 chúng tôi chọn chế phẩm Promozyme D2 của Novozyme bởi enzyme này có sẵn trên thị trường, giá thành hạ hơn và dễ mua hơn.

3.2.2. Xác định nồng độ enzyme promozyme D2 thích hợp trong quá trình đường hóa tạo polymaltose DE 30 Mục đích của thí nghiệm là xác định lượng enzyme tối thiểu đủ để xúc tác phản ứng chuyển hóa đạt hiệu suất cao nhất, tạo sản phẩm mong muốn. Các thí nghiệm được tiến hành với điều kiện đường hoá: - DE dịch hóa 10 - Nồng độ cơ chất 250Bx - Nhiệt độ 550C, pH 6, thời gian đường hóa 30 giờ - Nồng độ enzyme đường hóa được thử 0,1- 0,5% ( so với nồng độ cơ chất) Kết quả được ghi trong bảng 3.9: Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ Promozyme D2 đến quá trình đường hoá TT

Nồng độ Enzyme

DE đường hóa

Độ nhớt

(%)

(%)

(cP)

1

0,1

21,8

18

2

0,2

24,7

18

3

0,3

30,1

17

4

0,4

30,2

17

5

0,5

30,2

17

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

31

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

Kết quả bảng trên cho thấy: Với nồng độ enzyme là 0,1- 0,2 % cho giá trị DE đường hóa thấp không đạt yêu cầu. Còn với nồng độ enzyme 0,3 - 0,5% cho giá trị DE và độ nhớt tương đương nhau và đáp ứng được yêu cầu đặt ra, mặt khác qua bảng trên ta cũng thấy rằng với nồng độ enzyme đường hóa là 0,3% đã đủ để cắt hết mạch nhánh bởi vì nếu ta có tăng nồng độ enzyme lên nhưng DE cũng không tăng. Do vậy nồng độ enzyme đường hóa được chọn là 0,3%.

3.2.3. Xác định nồng độ cơ chất thích hợp cho quá trình đường hoá Khi nồng độ cơ chất cao sẽ tiết kiệm được nhiều chi phí trong sản xuất như tiết kiệm được lượng nước sử dụng, tiết kiệm năng lượng cô đặc. Tuy nhiên enzyme bị ức chế khi thừa cơ chất dẫn tới hiệu suất thu hồi sản phẩm thấp. Vì vậy cần nghiên cứu lựa chọn nồng độ cơ chất thích hợp nhất, ở đó thu được sản phẩm với hàm lượng và hiệu suất chuyển hóa cao nhất. Các thí nghiệm tiến hành với điều kiện: - Dịch hóa DE 10, tiến hành pha loãng hoặc cô đặc dịch sau dịch hóa tạo ra các nồng độ cơ chất khác nhau để thử.

- Đường hóa với điều kiện: pH = 6.0, nhiệt độ 550C, thời gian 30 giờ, nồng độ enzyme promozyme D2 là 0,3% so với cơ chất, nồng độ cơ chất được thử khác nhau từ 15 -300 Bx. Kết quả được đánh giá dựa vào DE đường hóa và một số thành phần đường trong dịch.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

32

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất trong quá trình đường hóa Tỷ lệ các thành phần đường so TT

1

2

3

4

Nồng độ cơ chất

DE đường hóa

( 0Bx)

(%)

15

20

25

30

30,3

30,1

30,0

28,7

với đường tổng Tên đường

(%)

Glucose

0,85

Maltose

6,4

Các oligo khác

92,75

Glucose

0,61

Maltose

5,5

Các oligo khác

93,89

Glucose

0,58

Maltose

5,4

Các oligo khác

94,02

Glucose

0.49

Maltose

4,7

Các oligo khác

94,81

Kết quả từ bảng 3.10 cho thấy: Với nồng độ dịch bột là 300Bx thì DE đường hóa không đạt yêu cầu, mặt khác ở nồng độ dịch bột 300Bx quá trình lọc rất khó khăn.

Còn ở nồng độ cơ chất 15, 20, 250Bx cho giá trị DE đường hóa gần tương đương nhau đạt yêu cầu và hàm lượng glucose, maltose tạo ra cũng rất thấp điều này rất tốt cho quá trình tạo phức. Nhưng ở nồng độ dịch bột 15, 200Bx khi thu hồi lại mất thời gian cô và sấy lâu hơn sẽ ảnh hưởng đến giá thành. Do vậy nồng độ dịch bột thích hợp nhất để sản xuất polymaltose là 250Bx.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

33

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

3.2.4. Nghiên cứu điều kiện pH thích hợp cho quá trình đường hoá Mỗi loại enzyme của từng chủng vi sinh vật có những khoảng pH hoạt động tối thích khác nhau. Nếu nằm ngoài khoảng pH tối ưu thì enzyme hoạt động kém hiệu quả. Để xác định khoảng pH thích hợp cho enzyme pullulanase hoạt động tốt nhất, chúng tôi tiến hành thực hiện các thí nghiệm ở các giá trị pH khác nhau. Điều kiện của quá trình đường hoá: - DE dịch hóa 10 - Nồng độ dịch bột 250Bx - Nồng độ enzyme 0,3 %, nhiệt độ 550C, thời gian đường hóa 30 giờ Kết quả được trình bày ở bảng 3.11: Bảng 3.11. Xác định pH thích hợp cho quá trình đường hóa TT

pH

DE đường hóa (%)

Tên đường

%

Glucose Maltose Các oligo khác Glucose Maltose Các oligo khác Glucose Maltose Các oligo khác Glucose Maltose Các oligo khác

0,30 4,1 95,6 0,37 4,9 94,73 0,49 5,4 94,11 0,51 5,3 94,19

23,3

Glucose Maltose Các oligo khác

0,43 4,8 94,77

21,4

Glucose Maltose Các oligo khác

0,35 4,6 95,05

1

5,0

22,5

2

5,5

27,2

3

6,0

30,0

4

6,5

30,1

5

6

7,0

7,5

Tỷ lệ các thành phần đường trong dịch so với đường tổng

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

34

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

Từ kết quả bảng 3.11 dễ dàng nhận thấy: pH là yếu tố có ảnh hưởng lớn đến quá trình đường hóa, với pH < 6,0 và pH ≥ 7,0 thì DE đường hóa đều không đạt yêu cầu đặt ra. Điều đó có thể giải thích enzyme chỉ hoạt động trong những khoảng pH thích hợp, làm tăng vận tốc phản ứng, ngoài khoảng đó đều ức chế hoạt động. Như vậy qua kết quả bảng trên cho thấy enzyme promozyme D2 hoạt động tốt trong khoảng pH = 6,0 6,5 cho giá trị DE đạt cao nhất là 30-30,1 và các thành phần đường như glucose, maltose,... vẫn đạt yêu cầu chất lượng để tham gia phản ứng tạo phức. Do vậy pH được chọn cho giảm hoạt lực enzyme rất nhanh chóng khi nhiệt độ phản ứng tăng cao. Mặt khác ưu điểm của loại enzyme kém bền nhiệt là có thể vô hoạt khi nâng nhiệt độ cao, do đó nhiệt độ là yếu tố công nghệ thường được sử dụng để điều tiết phản ứng của enzyme theo chiều hướng mong muốn.

3.2.5. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình đường hóa Mỗi loại enzyme từ các chủng vi sinh vật khác nhau có khoảng nhiệt độ hoạt động tối thích khác nhau. Do vậy cần phải xác định nhiệt độ thích hợp nhất để enzyme hoạt động thuỷ phân ở mức độ cao nhất. Quá trình đường hoá với điều kiện: -

Nồng độ cơ chất 250Bx

-

DE dịch hoá 10

-

Nồng độ enzyme Promozyme D2 0,3% so với cơ chất

-

pH = 6,0

-

Thời gian đường hóa 30 giờ Kết quả được trình bày ở bảng 3.12:

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

35

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình đường hóa TT

1

2

3

4

0

Nhiệt độ ( C)

DE đường hóa (%)

50

55

60

65

26,5

30,1

25,6

18,4

Tỷ lệ các thành phần đường so với đường tổng Tên đường % Glucose

0,47

Maltose

4,5

Các oligo khác

95,03

Glucose

0,57

Maltose

5,6

Các oligo khác

93,83

Glucose

0,44

Maltose

3,9

Các oligo khác

95,66

Glucose

0,28

Maltose

2,1

Các oligo khác

97,62

Kết quả bảng 3.12 cho thấy đường hóa ở nhiệt độ 550C cho giá trị DE 30,1 đạt được yêu cầu cho tạo phức tốt nhất và hàm lượng đường glucose, maltose,… tạo ra tuy có cao hơn ở nhiệt độ đường hóa 50, 60, 650C nhưng cao hơn không đáng kể và nó vẫn đảm bảo được chất lượng sản phẩm so với đăng ký. Còn đường hóa ở nhiệt độ 50, 60, 650C cho giá trị DE đường hóa không đạt yêu cầu, tức là enzyme hoạt động kém hơn chưa cắt hết mạch nhánh, điều đó cho thấy enzyme chỉ xúc tác mạnh khi nhiệt độ thích hợp.

Do vậy nhiệt độ đường hóa được chọn để sản xuất polymaltose DE 30 là 55 0C. 3.2.6. Xác định thời gian thích hợp cho quá trình đường hoá Nghiên cứu xác định thời gian đường hóa tối thiểu mà enzyme có thể cắt hết mạch nhánh tạo polymaltose DE 30 là việc cần được xác định. Vì trong một thời gian nhất định enzyme đường hóa sẽ thủy phân cắt hết mạch nhánh tạo polymaltose, nếu có kéo dài thêm thời gian thì cũng không làm chất lượng sản phẩm tốt hơn mà gây lãng phí

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

36

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

năng lượng, nhân công,… Sau những khoảng thời gian khác nhau tiến hành lấy mẫu và phân tích đánh giá chất lượng sản phẩm. Quá trình đường hóa với điều kiện: -

Nồng độ enzyme Promozyme D2 0,3% so với cơ chất

-

DE dịch hóa 10

-

Nồng độ cơ chất: 250 Bx

-

pH = 6,0

-

Nhiệt độ đường hóa 550C Kết quả được trình bày ở bảng 3.13: Bảng 3.13. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình đường hóa Thời gian

TT

1

2

3

4

5

Tỷ lệ các thành phần đường so với

đường hóa

DE đường hóa

(giờ)

(%)

10

15

20

25

30

21,6

25,1

30,1

30,2

30.2

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

đường tổng Tên đường

%

Glucose

0,36

Maltose

4,4

Các oligo khác

95,24

Glucose

0,47

Maltose

4,9

Các oligo khác

94,63

Glucose

0,55

Maltose

5,4

Các oligo khác

94,05

Glucose

0,59

Maltose

5,7

Các oligo khác

93,71

Glucose

0,60

Maltose

5,7

Các oligo khác

93,7

37

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

Kết quả bảng 3.13 cho thấy: Giá trị DE tăng theo thời gian đường hoá và khi thời gian đường hóa tăng đến 20 giờ thì DE đường hóa gần như không tăng thêm. Điều này có thể giải thích rằng quá trình thủy phân với thời gian < 20 giờ mạch nhánh vẫn chưa được cắt hết, enzyme vẫn tiếp tục thủy phân, còn nếu quá trình thủy phân kéo dài trên 20 giờ thì giá trị DE đường hóa cũng không tăng, chứng tỏ mạch nhánh đã được thủy phân hết, nên có kéo dài thời gian thủy phân trên 20 giờ là không cần thiết mà chỉ gây lãng phí. Do vậy thời gian thích hợp nhất được chọn để đường hóa tạo polymaltose DE 30 là 20 giờ.

Kết luận: Nồng độ enzyme đường hóa là 0,3% , nồng độ dịch bột thích hợp cho quá trình đường hóa là 250Bx, pH thích hợp cho quá trình đường hóa là pH 6, nhiệt độ thích hợp cho quá trình đường hóa là 550C và thời gian thủy phân thích hợp cho quá trình đường hóa là 20 giờ 3.3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CHẤT LƯỢNG DỊCH POLYMALTOSE Sau khi dịch hóa, đường hóa thu được dịch polymaltose, chúng tôi tiến hành phân tích chất lượng dịch polymaltose. Kết quả ghi trong bảng 3.14: Bảng 3.14. Kết quả phân tích chất lượng dịch polymaltose TT

Tên chỉ tiêu

3

Nồng độ chất khô

4

Đơn vị tính 0

Kết quả

Bx

25

DE

%

30

5

Glucose

%

0,55

6

Maltose

%

5,6

8

Oligosaccharide (G≥3)

%

93,85

9

pH Độ nhớt

6,0 cP

17

Qua kết quả phân tích cho thấy chất lượng dịch polymaltose đạt chất lượng tốt, đảm bảo yêu cầu đặt ra của đề tài, đáp ứng được cho quá trình tạo phức IPC. KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

38

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

Sắc ký đồ phân tích hàm lượng glucoza và maltoza trong dịch polymaltose

0.4

0.2

Volts

Glucose std

Volts

7.013

Maltose std 9.767

0.4

0.2

0.0

0.0

0

5

10

0

5

Minutes

10

15

Minutes

Sắc ký đồ HPLC chất chuẩn glucose

Sắc ký đồ HPLC chất chuẩn Maltose

M altose 9.953

0.2

Glucose 7.060

Volts

0.4

0.0

0

5

10 Minutes

Sắc ký đồ HPLC mẫu polymaltose

3.4. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ THỦY PHÂN TINH BỘT SẮN TẠO DỊCH POLYMALTOSE CÓ DE 30.

Từ kết quả nghiên cứu các điều kiện thủy phân tinh bột sắn tạo dịch polymaltose có DE 30 ở qui mô phòng thí nghiệm. Chúng tôi tiến hành xây dựng sơ đồ quy trình công nghệ thủy phân tinh bột sắn tạo dịch polymaltose DE 30 để sản xuất polymaltose

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

39

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

3.4.1. Sơ đồ quy trình công nghệ thủy phân tinh bột sắn tạo dịch polymaltose DE 30 Tinh bột sắn

Hòa bột 25%

Dịch hóa (tº = 85-90ºC, T= 20 phút)

Amylex HT 0,04%

Đường hóa tº= 55ºC, T= 20 giờ

Promozyme D2 0,3%

Dịch thủy phân polymaltose DE 30

Hình 3.1. Sơ đồ quy trình công nghệ thủy phân tinh bột sắn tạo dịch polymaltose DE 30

3.4.2. Thuyết minh sơ đồ quy trình công nghệ Hòa bột: Lựa chọn tinh bột sắn đạt tiêu chuẩn chất lượng cho sản xuất polymaltose, được hoà với nước tạo thành dạng sữa tinh bột nồng độ 25%. Sau khi hoà đều dịch bột được tiến hành quá trình dịch hoá.

Dịch hoá: Dịch sữa bột được nâng nhiệt từ từ, khi nhiệt độ đạt 50OC thì cho enzyme dịch hoá với tỷ lệ 0,04% so với nồng độ tinh bột. Khuấy đều và tiếp tục nâng nhiệt từ từ lên nhiệt độ dịch hoá 85-90OC. Khi đạt nhiệt độ dịch hoá giữ ở nhiệt độ này 20 phút. Trong quá trình dịch hóa phải thường xuyên phân tích, kiểm tra DE. Đường hoá: Dịch bột hòa tan sau khi dịch hóa được làm nguội và điều chỉnh pH = 6,0 kiểm tra nhiệt độ khi đạt 550C, cho enzyme đường hoá với nồng độ 0,3%, khuấy đều và giữ nhiệt độ ổn định 550C trong suốt quá trình đường hoá 20 giờ. Khi kết thúc nâng nhiệt lên 1000C trong 10 phút để diệt enzyme, thu được dịch polymaltose có DE 30.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

40

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

KẾT LUẬN Sau quá trình nghiên cứu chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Xác định được các điều kiện dịch hóa tinh bột làm nguyên liệu phù hợp cho quá trình đường hóa tạo polymaltose DE 30. + Nồng độ tinh bột: 25% + Nồng độ enzyme Amylex®HT: 0,04% + Nhiệt độ dịch hóa: 85-900C + Thời gian dịch hóa: 20 phút + pH dịch bột trong quá trình dịch hóa: 5-6 2. Nghiên cứu được các điều kiện thích hợp cho quá trình đường hóa tạo dịch polymaltose DE 30. + Nồng độ tinh bột: 250Bx + Nồng độ enzyme Promozyme D2: 0,3% + Nhiệt độ đường hóa: 550C + Thời gian đường hóa: 20 giờ + pH dịch bột trong quá trình dịch hóa: 6 3. Xây dựng được quy trình công nghệ thủy phân tinh bột sắn tạo dịch polymaltose DE 30.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

41

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thắng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Diên (1997). Hóa sinh công nghiệp.

NXB KHXH. 2. Nguyễn Chí Thanh (2000). Nghiên cứu sử dụng hệ enzym amylase để nâng cao hiệu quả sản xuất glucose tinh thể từ bột sắn. Luận văn thạc sỹ khoa học - Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.

3. Nguyễn Thị Hạnh, Đào Quốc Hương (2009). Nghiên cứu tổng hợp phức chất sắt-polymaltose. Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 4. Nguyễn Thị Minh Hạnh, Nguyễn Thị Bích Liên, Ngô Thị Vân, Phan Thị Khánh Hoa và Nguyễn Thùy Linh (2003). Nghiên cứu quy trình công nghệ, thiết bị và mô hình chế biến tinh bột biến tính. Báo cáo khoa học và kỹ thuật. Đề tài nhánh thuộc đề tài cấp Nhà nước KC 07-14. Viện Công nghiệp Thực phẩm.

5. Trương Anh Tuấn (2003). “Tối ưu hóa quá trình sản xuất tinh bột biến tính DE 12 bằng phương pháp enzym”. Luận văn tốt nghiệp-Đại Học Bách Khoa Hà Nội.

6. Vũ Thị Thuận (2010). Sản xuất thử nghiệm tinh bột biến tính bằng công nghệ enzyme làm nguyên liệu cho công nghiệp dược, công nghiệp thực phẩm. Báo cáo khoa học kỹ thuật. Dự án cấp nhà nước SXTN 01.08/CNSHCB. Viện Công nghiệp Thực phẩm.

TIẾNG ANH 7. Abbas K. A, Sahar K. Khalil, Anis Shobirin Meor Hussin (2010). Modified Starches and Their Usages in Selected Food Products: A Review Study. Journal of Agricultural Science. Vol. 2. No. 2. P.90-100.

8. Barker,

S.A (1980),

EconomicMicrobiology:

Microbial Enzymes and

Bioconversion, 5, AcademicPress, pp331.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

42

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

9. Bender et. al (1985). Studies on production of

maltooligosaccharides by

pullulananse from K. Pneumoniae. Carbonhydrate research. 135, 291-302.

10. Borgia P.T and Campell L.L(1978). Amylase in food processing. J. Bacteriology.

Vol. 134. P.223-232.

11. Burkhardt- Herold Susanna et. al(2007). Interaction between iron(III)- hydroxide polymaltose complex and commonly used drug/ simulation and in vitro studies.

Arzneimittel-Forschung. 57(6A). P.126-131.

12. Chang-Kyu Lee, Quang-Tri Le, Yung-Hee Kim, Jae-Hoon Shim and Kwan-Hwa Park (2008). Enzymatic Synthesis and Properties of

Highly Branched Rice

Starch Amylose and Amylopectin Cluster. J. Agric. Food Chem. 56. P, 126-131.

13. Clark, D.S, Estell D,A 1992. Enzyme Engineering XI. Academy of Sciences.

New York.

14. Danisco company, Amylex® HT – Production description – PD 215999-4.0.

15. Fiona Dufner, Costanzo Bertoldo, Jens T. Andersen, Karen Wagener and Garaabeb Antrannikian (2000). “A new thermoactive pullulanase from Desulfurococcus characterization of

mucosus:

cloning,

sequencing,

purification,

the recombiant enzyme after expression in

and

Bacillus

subtilis”.

16. Hannes Melasniemi, Vantaa, Matti (1990). “Amylase of new type”. United States 4971906.

17. K. Eichsen, R. J. Ulvik et al (2005). Effects of ferrous sulphate and non-ionic iron-polymaltose complex on markers of oxidative tissue damage in patients with inflammatory bowel disease. Aliment. Phamarcol. Ther. 22, 831-838.

18. Kainuma, K. Lobaysahi, S. Harado. T (1978). Carbonhydrate research. P.345357.

19. Lekha Saha, Promila Pandhi et. al (2007). Comparison of efficacy, tolerability, and cost of iron polymaltose complex with ferrous sulphate in the treatment of iron deficiency anemia in pregnant womer. MedGenMed, 9(1):1.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

43

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

20. Lincon P.S (1975). Starch conversion by soluble and immobilized amylase.

Biodeechnol. Bioeng. Vol. 17. P.153-165.

21. Liquozyme supra. Abstract.

22. Mac Allister A. (1975). Technologies based on enzymatic catalysis. Enzymes in food processing. Academic press. New York. P.230-340.

23. Novo enzyme at work (1989). Pp.12-13.

24. Novo NordishTermamyl 120L, Product sheet 25. Novo Nordisk. Enzyme for conversion of starch.

26. Okada Shigetaka et. al (1988). “Maltotriose- Rich maltooligosaccharide Mixture” Handbook of Amylases and related enzymes. Pergamon press. Pp.210213.

27. Pantet US 5208151 (1993). A process for the preparation of derivatives of maltooligosaccharides.

28. Pauline T. Lieu, marja Heiskala et.al. The role of iron in healthand disease.

Molecuala Aspects of Medicine. 22. 1-87.

29. Promozyme D2 (2001). Product sheet.

30. Sakian Khatoon, Y. N. Sreerama, D. Raghavendra, Suvendu Bhattacharya and K. K. Bhat (2009). Properties of enzyme modified corn, rice and tapioca starches. Food Research International J. Vol. 42. Issue 10. P.1426-1433.

31. Shinke, Ryu,Takashi (1989). “Thermostable amylase and use there of” European Patent Application 0357137A2.

32. Ueda , S., Nanri, N. (1967). Aplication of microbiology, 15, pp 492-296.

33. Whistel, R. L. Pashall (1967), Starch: Chemistry and technology, Academic prees, Neww York anh London.

34. Yamamoto Takehiko et. al (1988). Pullulanese in several microorganisms and plan. Handbook of amylase related enzymes: Their sources, isolation method, properties and application. Pergamon Press. P.131-159.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

44

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

35. Yamamoto Takehiko, Kitahata Sumio, Chiba Seiya, Noshi minamiura, Yamane Kunio. Et.al (1995). Enzyme chemistry and moleccular biology of amylasae and related enzymes. CRC Press. Inc.

INTERNET 36. http://acacl.ethz.ch/koppenol/IRON_Metabolism_2012_E.pdf 37. http://chauduc.vn/view-127751/thi-truong-san-lat-va-tinh-bot-san-nam-2015trien-vong-nam-2016/.

38. http://www.omard.gov.vn/site//vi-VN/50/11447/9950/Phat-huy-tiem-nang-tucay-san.aspx.

39. http://orientbiofuels.com.vn/index.php/vi/cay-san/tong-quan-ve-cay-san 40. http://thanhnien.vn/doi-song/nhip-song-dia-phuong/phat-trien-ben-vung-caysan-viet-nam-526380.html.

41. http://thitruongsan.com/toan-canh-thi-truong-san-thang-9_2560.html.

42. http://www.amano-enzyme.co.jp/eng/enzyme/15.html

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

45