KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT GLYCOSIDES TỪ CÂY CỎ NGỌT Stevia Rebaudiana Bertoni (Bert.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT GLYCOSIDES TỪ CÂY CỎ NGỌT Stevia Rebaudiana Bertoni (Bert.)

SVTH : VÕ THỊ THU TRANG Bộ môn : CÔNG NGHỆ HÓA HỌC Niên khóa: 2004-2008

Tháng 10/2008

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT GLYCOSIDES TỪ CÂY CỎ NGỌT Stevia Rebaudiana Bertoni (Bert.)

Tác giả

VÕ THỊ THU TRANG

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu Cấp bằng Kỹ sư ngành Công nghệ hóa học

Giáo viên hướng dẫn Th.S NGUYỄN HỮU ANH TUẤN

Tháng 10/2008 i

LỜI CÁM ƠN Con thành kính ghi ơn công lao sinh thành và dưỡng dục của cha mẹ, cùng toàn thể gia đình đã luôn bên con trong cuộc sống.

Tôi xin chân thành cảm ơn Th.S Nguyễn Hữu Anh Tuấn đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin cám ơn T.S Võ Duy Huấn đã góp ý giúp tôi giải đáp những khúc mắc trong

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

quá trình thực hiện đề tài.

Xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể thầy cô Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh và thầy cô Bộ môn Công Nghệ Hóa Học đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học đại học.

Cuối cùng xin cám ơn toàn thể bạn bè đã giúp đỡ, động viên, chia sẻ những khó khăn với tôi trong quá trình thực hiện đề tài.

Thành phố Hồ Chí Minh Võ Thị Thu Trang

ii

TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát quá trình tách chiết hoạt chất glycosides từ cây cỏ ngọt Stevia Rebaudiana Bertoni (Bert.)”

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết tách các hoạt chất gây ngọt (hệ dung môi chiết, nhiệt độ chiết, thời gian chiết và tỉ lệ DM/NL) lên lượng cao tổng và cao BuOH.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Mục đích: tối ưu các thông số ảnh hưởng đến hiệu suất chiết tách các hoạt chất cho nguồn nguyên liệu cỏ ngọt Hải Hưng. Đây là qui hoạch thực nghiệm bốn yếu tố được bố trí theo phương pháp bề mặt đáp ứng kiểu phương án quay bậc hai có tâm. Bốn yếu tố khảo sát là hệ dung môi chiết (cồn 15, cồn 10, cồn 5), nhiệt độ chiết (65 oC, 70oC, 75oC), thời gian chiết (20 phút, 30 phút, 40 phút) và tỉ lệ DM/NL (65, 75, 85) Kết quả: Từ phân tích ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát lên các đáp ứng, các thông số tối ưu đã được thiết lập dựa trên giản đồ tối ưu với cơ sở là làm cực đại các đáp ứng. Điều kiện chiết tách kiến nghị cho nguồn nguyên liệu Hải Hưng là hệ dung môi (cồn, nước) 6,51%, nhiệt độ chiết 64,03oC, thời gian chiết 44,45 phút với tỉ lệ DM/NL là 55; khi đó lượng cao tổng thu được là 1,84g và lượng cao BuOH là 0,22g.

iii

MỤC LỤC Trang Trang tựa ..................................................................................................................... i Lời cám ơn ................................................................................................................. ii Tóm tắt ..................................................................................................................... iii Mục lục ..................................................................................................................... iv Danh sách các chữ viết tắt.......................................................................................... vi

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Danh sách các bảng .................................................................................................. vii Danh sách các hình ảnh – sơ đồ ............................................................................... viii

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU........................................................................................ 1 1.1.

1.2.

1.3.

1.4.

Đặt vấn đề .....................................................................................................1 Mục đích đề tài..............................................................................................2

Nội dung đề tài..............................................................................................2 Yêu cầu .........................................................................................................2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3 2.1.

Tổng quan cây cỏ ngọt...................................................................................3

2.1.1.

Giới thiệu cây cỏ ngọt ............................................................................3

2.1.2.

Các hợp chất có trong cây cỏ ngọt ..........................................................5

2.1.3.

Tình hình sử dụng cỏ ngọt trong nước ..................................................12

2.1.4.

Tình hình sử dụng cỏ ngọt trên thế giới ................................................13

2.2.

Các công trình nghiên cứu về cây cỏ ngọt....................................................14

2.2.1.

Các nghiên cứu về các thành phần các chất có trong cây cỏ ngọt..........14

2.2.2.

Các nghiên cứu về chiết tách các hợp chất trong cây cỏ ngọt................15

2.2.3.

Các nghiên cứu về độc tố trong cỏ ngọt................................................21

2.2.4.

Các hướng nghiên cứu mới về cây cỏ ngọt ...........................................22

2.3.

Định tính và định lượng các thành phần có trong cỏ ngọt ............................23

2.3.1.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC .........................................................23

2.3.2.

Sắc ký lớp mỏng TLC ..........................................................................24

2.4.

Ứng dụng của cỏ ngọt..................................................................................24

2.4.1.

Ứng dụng trong đời sống......................................................................25

2.4.2.

Các sản phẩm thương mại có nguồn gốc từ cỏ ngọt ..............................25 iv

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM ........................................................................ 27 3.1.

Thiết bị và hóa chất .....................................................................................27

3.1.1.

Thiết bị.................................................................................................27

3.1.2.

Hóa chất...............................................................................................27

3.2.

Nguyên liệu .................................................................................................27

3.2.1.

Khảo sát độ tro .....................................................................................28

3.2.2.

Khảo sát độ ẩm.....................................................................................29

3.4.

Qui trình công nghệ thực hiện .....................................................................30

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

3.3.

Phương pháp thí nghiệm..............................................................................35

3.4.1.

Cơ sở khảo sát......................................................................................35

3.4.2.

Bố trí thí nghiệm ..................................................................................35

3.5.

3.6.

Phương pháp đo đạc ....................................................................................37 Xử lý số liệu................................................................................................37

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................... 38 4.1.

Kết quả khảo sát nguyên liệu .......................................................................38

4.1.1.

Độ tro...................................................................................................38

4.1.2.

Độ ẩm ..................................................................................................38

4.2.

Kết quả khảo sát điều kiện chiết ..................................................................38

4.2.1.

Kết quả phân tích ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến lượng cao tổng .............................................................................................................41

4.2.2.

Kết quả phân tích ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến lượng cao

BuOH...................................................................................................45

4.2.3.

Nhận xét chung ....................................................................................48

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................... 50 5.1.

Kết luận.......................................................................................................50

5.2.

Đề nghị........................................................................................................50

TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................51 PHỤ LỤC........................................................................................................55 Phụ lục 1................................................................................................................... 55 Phụ lục 2................................................................................................................... 59 Phụ lục 3 ...................................................................................................................62 v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Acceptable Daily Intake

ns

not stated in original publication

CC

Column Chromatography

HPLC

High Pressure Liquid Chromatography

TLC

Thin Layer Chromatography

TJPR

Tropical Journal of Pharmaceutical Research

EtOAc

Ethyl acetate

BuOH

Butanol

DM/NL

dung môi /nguyên liệu

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

ADI

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG Thành phần dinh dưỡng của cỏ ngọt.......................................................5

Bảng 2.2.

Tỉ lệ các hợp chất gây ngọt có trong lá khô.............................................7

Bảng 2.3.

Thành phần và cấu trúc của các hợp chất gây ngọt ................................7

Bảng 2.4.

Hàm lượng stevioside và rebaudioside A ở 1 số quốc gia .......................8

Bảng 2.5.

Cường độ gây ngọt của stevioside và rebaudioside A trong nước .........10

Bảng 2.6.

Cường độ gây ngọt của Marumilon 50 trong các loại dung dịch ...........10

Bảng 2.7.

Độ tan trong nước của các hợp chất gây ngọt .......................................11

Bảng 2.8.

Các nghiên cứu về khả năng gây độc chủ yếu của hỗn hợp chất ngọt

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Bảng 2.1.

stevia từ Nhật Bản ................................................................................21

Bảng 2.9.

Hàm lượng tối đa các chất gây ngọt từ cỏ ngọt trong thực phẩm...........22

Bảng 3.1.

Mã hóa các yếu tố khảo sát...................................................................36

Bảng 3.2.

Bố trí thực nghiệm các điều kiện khảo sát ............................................36

Bảng 4.1.

Kết quả khảo sát độ tro của cỏ ngọt ......................................................38

Bảng 4.2.

Kết quả khảo sát độ ẩm của cỏ ngọt......................................................38

Bảng 4.3.

Kết quả khảo sát các điều kiện chiết tách (Thực nghiệm LẦN 1) ...........39

Bảng 4.4.

Kết quả khảo sát các điều kiện chiết tách (Thực nghiệm LẦN 2) ...........40

Bảng 4.5.

Tác động của các yếu tố khảo sát lên đáp ứng cao tổng ........................42

Bảng 4.6.

Tác động của các yếu tố khảo sát lên đáp ứng cao BuOH .....................46

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH – SƠ ĐỒ Cây cỏ ngọt ............................................................................................3

Hình 2.2.

Hạt giống cỏ ngọt...................................................................................4

Hình 2.3.

Hoa cỏ ngọt............................................................................................4

Hình 2.4.

Cỏ ngọt khô............................................................................................5

Hình 2.5.

Công thức cấu tạo của steviol .................................................................6

Hình 2.6.

Mô hình đánh giá sự tương quan hậu vị..................................................9

Hình 2.7.

Cỏ ngọt được trồng theo mùa vụ ở Paraguay ........................................13

Hình 2.8.

Các sản phẩm thương mại có nguồn gốc từ cỏ ngọt ..............................26

Hình 3.1.

Mẫu cỏ ngọt trước và sau xử lý ............................................................28

Hình 3.2.

Bảo quản cỏ ngọt..................................................................................28

Hình 3.3.

Cỏ ngọt được đun hồi lưu với dung môi chiết.......................................32

Hình 3.4.

Hỗn hợp chiết được lọc chân không loại phần bã rắn............................32

Hình 3.5.

Cô quay chân không loại dung môi ......................................................32

Hình 3.6.

Cao tổng...............................................................................................33

Hình 3.7.

Lắc với EtOAc .....................................................................................33

Hình 3.8.

Lọc và tách lấy pha lỏng.......................................................................33

Hình 3.9.

Cô quay chân không loại EtOAc ..........................................................34

Hình 3.10.

Lắc với BuOH bão hòa nước ................................................................34

Hình 3.11.

Cô quay chân không loại BuOH ...........................................................34

Hình 4.1.

Mô hình thể hiện tính tương thích của các yếu tố lên cao tổng..............41

Hình 4.2.

Mô hình bề mặt đáp ứng của cao tổng được biểu diễn theo thời gian

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 2.1.

chiết, nhiệt độ chiết và hệ dung môi .....................................................42 Hình 4.3.

Tương tác giữa các yếu tố lên lượng cao tổng.......................................43

Hình 4.4.

Mô hình thể hiện tính tương thích của các yếu tố lên cao BuOH ..........45

Hình 4.5.

Mô hình bề mặt đáp ứng của cao BuOH được biểu diễn theo các thông số khảo sát điều kiện chiết....................................................................46

Hình 4.6.

Tương tác giữa các yếu tố lên lượng cao BuOH ...................................47

viii

Hình 4.7.

Ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát lên đáp ứng cao tổng và cao BuOH ... .............................................................................................................49 Tối ưu hóa các yếu tố khảo sát lên đáp ứng cao tổng và cao BuOH ......49

Sơ đồ 2.1.

Qui trình tách chiết chất ngọt từ cỏ ngọt ở Nhật Bản ............................17

Sơ đồ 2.2.

Qui trình tách chiết hỗn hợp chất ngọt từ cỏ ngọt ở Paraguay ...............18

Sơ đồ 2.3.

Qui trình tách chiết stevioside từ cỏ ngọt ở Việt Nam...........................19

Sơ đồ 2.4.

Qui trình tách chiết stevioside từ cỏ ngọt làm chất chuẩn ở Việt Nam ..20

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 4.8.

Sơ đồ 3.1.

Qui trình khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện chiết.................31

ix

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1.

Đặt vấn đề

Chất ngọt từ xưa đã là một trong những loại gia vị không thể thiếu được của loài người. Đường (sucrose) hay còn gọi là đường mía là loại chất ngọt đã được biết đến và sử dụng rộng rãi hơn 4000 năm nay. Tuy nhiên, việc sử dụng một lượng đường lớn hằng ngày có thể là nguyên nhân dẫn đến những vấn đề dinh dưỡng và bệnh lý như

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

béo phì, tiểu đường, cao huyết áp, nhồi máu cơ tim, các bệnh về răng miệng…. Hàng loạt những hợp chất gây ngọt tổng hợp đã xuất hiện và được sử dụng trên nhiều quốc gia như saccharin, cyclamate, aspartame, acesulfame-K, alimate và sucralose[20].

Nhưng việc sử dụng chúng cũng đã bị hạn chế và ngăn cấm ở nhiều quốc gia cũng như chống chỉ định đối với một số loại bệnh.

Do đó, xu hướng tìm kiếm những hợp chất gây ngọt không chứa năng lượng (no calori) có nguồn gốc từ thiên nhiên là một trong những hướng nghiên cứu mới hiện nay. Hơn 75 chất ngọt trên 20 họ thực vật đã được tìm thấy và sử dụng ở nhiều nước trên thế giới như: glycyrrhizin (Nhật Bản), mogroside V (Nhật Bản), phyllodulcin (Nhật Bản), thaumatine (Nhật Bản, Anh), và đặc biệt là stevioside từ cây cỏ ngọt Stevia rebaudiana Bertoni (Nhật Bản, Brazil, Hàn Quốc….) [11].

Cỏ ngọt có chứa hàm lượng lớn các chất có vị ngọt thuộc họ diterpen glycoside, ngọt khoảng 300 lần so với đường sucrose và đặc biệt là tạo ra vị ngọt nhưng không tạo ra hoặc tạo ra rất ít năng lượng[35]. Đặc tính quan trọng của các glucosides này là có thể làm ngọt cho các loại thức ăn và đồ uống mà không gây độc hại cho người, không đòi hỏi kỹ thuật sản xuất phức tạp, công nghệ thu hái chế biến đơn giản nhưng vẫn đạt năng suất cao[34][35]. Ở Việt Nam, khả năng phát triển loại cây này là khá tốt ở nhiều vùng sinh thái khác nhau trên đất nước ta mà không đòi hỏi khắt khe lắm về điều kiện thổ nhưỡng như Đà Lạt, Hải Hưng, Cao Bằng….. Tuy nhiên, hiện nay ở nước ta việc nghiên cứu về loại cây này vẫn còn khá hạn chế dù những tiềm năng thiết thực mà cây cỏ ngọt mang lại là vô cùng to lớn .Do đó, đề tài này nhằm mục đích khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình tách chiết hoạt chất gây ngọt từ cây cỏ ngọt để có thể áp dụng trên qui mô công nghiệp.

1

Với những nhận định như trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT GLYCOSIDES TỪ CÂY CỎ NGỌT Stevia Rebaudiana Bertoni (Bert.)” dưới sự hướng dẫn của Th.s Nguyễn Hữu Anh Tuấn.

1.2.

Mục đích đề tài (i).

Lựa chọn qui trình chiết tách hoạt chất gây ngọt từ cây cỏ ngọt

(ii). Khảo sát các điều kiện chiết tách các hoạt chất glycosides từ cây cỏ ngọt 1.3.

Nội dung đề tài

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Tổng quan về các quá trình nghiên cứu và sử dụng cỏ ngọt trên thế giới và Việt Nam hiện nay.

Sử dụng nguồn nguyên liệu cỏ ngọt từ Hải Hưng (Việt Nam), chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết tách các hoạt chất gây ngọt như sau: (i).

Hệ dung môi chiết

(ii).

Nhiệt độ chiết

(iii).

Thời gian chiết

(iv).

Tỉ lệ giữa dung môi chiết và nguyên liệu chiết

Ảnh hưởng của các yếu tố trên được đánh giá theo hiệu suất chiết trên hai thông số:

1.4.

(i).

Khối lượng cao tổng

(ii).

Khối lượng cao BuOH

Yêu cầu

Từ kết quả khảo sát, kiến nghị qui trình và điều kiện chiết tách thích hợp cho nguồn cỏ ngọt Hải Hưng, Việt Nam.

2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.

Tổng quan cây cỏ ngọt

2.1.1. Giới thiệu cây cỏ ngọt Cỏ ngọt còn có tên khoa học là Stevia Rebaudiana Bertoni (Bert.), thuộc giới Plantae, lớp Magnoliopsida, loài Asterales và chi Stevia. Chi Stevia có hơn 150 loài; nhưng chỉ tìm thấy chất ngọt trong 18 loài. Và Stevia rebaudiana Bertoni (Bert.) là

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

loài chứa hàm lượng chất gây ngọt cao nhất[38].

Hình 2.1. Cây cỏ ngọt (http://www.henriettesherbal.com)

Cỏ ngọt hay còn gọi là cỏ mật, cỏ đường, trạch lan hay cúc ngọt. Cỏ ngọt còn có các tên gọi khác như: candy leaf, sugar leaf (Anh), sweet honey leaf (Úc), sweet herb, ka´a he´ê (Paraguay), estevia (Tây Ban Nha)….Những tên này đều có nghĩa là cỏ ngọt (sweet herb) hay còn gọi là cây thay thế đường (Sweetener Sugar Substitute). a). Nguồn gốc của cây: Cỏ ngọt có nguồn gốc tự nhiên ở vùng Đông Bắc Paraguay, được biết đến như một loại gia vị ngọt đa năng từ thế kỷ thứ XVII[11]. Cỏ ngọt được sử dụng trong trà để tăng vị, thay đường, bổ sung vào các loại thuốc dược thảo. Năm 1988, cỏ ngọt được biết đến như 1 cây trồng mùa vụ ở Nam Mỹ. b). Đặc điểm thực vật học của cây: [34], [1], [36] Cỏ ngọt sinh sản hữu tính (gieo hạt) và vô tính (giâm cành).

Tuy nhiên hiệu suất của quá trình gieo hạt không cao, khoảng 25%.

3

Hình 2.2. Hạt giống cỏ ngọt

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Cỏ ngọt có thân rễ khỏe, mọc cạn đến 30cm (tùy vào độ phì nhiêu, tơi xốp, và mực nước ngầm của đất), ít phân nhánh; sống từ 3 đến 5 năm, là 1 loại cây ưa ẩm, ưa sáng nhưng sợ úng và chết khi ngập nước.

Toàn thân cây có vị ngọt, nhiều nhất là ở lá, lá già ở dưới thấp chứa nhiều chất ngọt hơn lá non ở trên cao. Hàm lượng chất ngọt trong cỏ ngọt đạt cao nhất ở thời kỳ trước khi nở hoa, tức là nên thu hoạch ở giai đoạn hình thành nụ, không nên để cây ra hoa mới thu hái. Hàm lượng chất ngọt có thể thay đổi từ 4 đến 20% trọng lượng lá khô, tùy điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu cũng như điều kiện chăm sóc nhưng cũng chỉ dao động trên dưới 10%. Stevioside và rebaudioside A là hai chất có hàm lượng nhiều nhất trong cây, kế đó là rebaudioside B, dulcoside A và rebaudioside C[35]

Hoa cỏ ngọt màu trắng ngà, thuộc loại hoa có đầu phức hợp, nhỏ, mọc ở đầu cành hay kẽ lá. Phấn hoa có nhiều gai lông nên dễ gây dị ứng.

Hình 2.3. Hoa cỏ ngọt Trong quá trình phơi sấy bảo quản, tuyệt đối không để bị ướt vì thành phần ngọt trong lá sẽ bị tan chảy ra ngoài, giảm chất lượng sản phẩm. Lá khô sau khi thu hái và sấy khô (hàm lượng nước phải dưới 10%) phải được bảo quản trong túi ni lông, tránh hút ẩm….[36] thì các thành phần dinh dưỡng của cỏ ngọt mới được đảm bảo.

4

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 2.4. Cỏ ngọt khô

Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng của cỏ ngọt (tính trên 100mg khối lượng khô) [13] Thành phần dinh dưỡng

Trên 100mg

Hàm lượng xấp xỉ

Hàm lượng ẩm (g)

7,0

Năng lượng (kcal)

270,0

Chất đạm (g)

10,0

Chất béo (g) Chất bột đường (g) Chất tro (g)

3,0 52,0 11,0

Chất xơ thô (g)

18,0

Khoáng chất

Canxi (mg)

464,4

Photpho (mg)

11,4

Sắt (mg) Natri (mg) Kali (mg)

55,3 190,0 1800,0

Anti-Nutritional Factors

Acid Oxalic (mg)

2295,0

Tannins (mg)

0,0

2.1.2. Các hợp chất có trong cây cỏ ngọt Từ thập niên 1970, việc nghiên cứu các thành phần gây ngọt trong cỏ ngọt mới được chú ý và phát triển mạnh với sự đóng góp quan trọng của ông Tanaka và các cộng sự ở trường đại học Hiroshima. Cỏ ngọt chứa hỗn hợp các thành phần: labdane diterpenes, triterpenes, stigmasterol, tannins, tinh dầu, và các hợp chất gây ngọt diterpenes glycosides… đã có hơn 100 hợp chất được tìm thấy trong cây cỏ ngọt[11].

5

2.1.2.1.

Các hợp chất gây ngọt

Bao gồm 8 loại hợp chất: stevioside, steviobioside, dulcoside, và rebaudioside A,B,C,D,E. Theo đó, 8 loại hợp chất gây ngọt glycosides từ cỏ ngọt đều chứa chung 1 aglycon là steviol (13- hydroxyl- ent kaur -16- en-19-oic acid) và chỉ khác nhau về thành phần glycosid ở C13 và C19 [11]. Trong đó hợp chất chứa hàm lượng nhiều nhất

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

là stevioside và rebaudioside A.

Hình 2.5. Công thức cấu tạo của steviol

a). Tỉ lệ các hợp chất gây ngọt trong cây cỏ ngọt

Theo Tanaka (1977), từ dịch chiết methanolic của lá cây cỏ ngọt; thu được rebaudioside A là 1,4% khối lượng so với lá cỏ khô (w/w) chiếm khoảng 25-51% khối lượng stevioside ; rebaudioside C là 0,4%; rebaudioside D là 0,03%; rebaudioside E là 0,03% …còn rebaudioside B có được do sự thủy phân 1 phần rebaudioside A trong quá trình chiết. Rebaudioside A cũng được tìm thấy trong hoa cỏ ngọt với hàm lượng thấp, khoảng 0,15% khối lượng[11]. Thông thường trong cao chiết BuOH, stevioside chiếm hàm lượng lớn nhất trong tổng chất ngọt khoảng 60-70%; rebaudioside A chiếm khoảng 30-40% tổng chất ngọt[35]

Lượng stevioside từ lá cỏ ngọt khô có thể biến đổi rất lớn, vào khoảng 5-22% khối lượng của lá khô tùy vào điều kiện thổ nhưỡng và chăm bón. Stevioside cũng được tìm thấy trong hoa của cỏ ngọt với hàm lượng thấp, khoảng 0,9% khối lượng của lá khô (w/w) [11]

6

Bảng 2.2. Tỉ lệ các hợp chất gây ngọt có trong lá khô (w/w)[11] Thành phần Dulcoside A Rebaudioside A

Tỉ lệ % theo khối lượnglá khô (w/w)

Lá Thân Lá Hoa Lá Lá Lá Lá Lá Lá Thân

0,03 ns 1,43 0,15 0,44 0,4 0,03 0,03 0,04 2,18 0,92

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Rebaudioside B Rebaudioside C Rebaudioside D Rebaudioside E Steviolbioside Stevioside

Bộ phận của cây

b). Cấu trúc của các hợp chất diterpenes glycosides

Bảng 2.3. Thành phần và cấu trúc của các hợp chất gây ngọt[8]



glc, β-D-glucopyranosyl; rhm, α-L-rhamnopyranosyl



Sweening potency: độ ngọt so với đường sucrose

7

c). Hậu vị của các hợp chất gây ngọt Trong các hợp chất gây ngọt thì stevioside và rebaudioside A là hai hợp chất quan trọng và được chú ý nhất bởi độ gây ngọt và hàm lượng của chúng trong cây.

Tỉ lệ rebaudiosideA/stevioside được xem như là 1 tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng của cỏ ngọt. Tỉ lệ rebaudioside A/stevioside lớn hay nhỏ tùy thuộc vào điều kiện khí hậu, đất đai và phân bón. Nếu hỗn hợp có lượng rebaudioside A/stevioside lớn hơn hoặc bằng 1 thì hỗn hợp gần như không có vị hậu. Hiện đã có nhiều nghiên cứu

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

phương pháp gieo trồng và bón phân nhằm làm tăng tỉ lệ này[35] Bảng 2.4. Hàm lượng stevioside và rebaudioside A ở 1 số quốc gia :[18] Quốc gia

Tỉ lệ tính trên 100g lá khô

Stevioside/Rebaudioside A

Russia Ukraine

5,8/1,2 4,8/1,3

South Korea

5,5/2,5

China

6,6/3,7

Paraguay

9,1/3,8

Japan

7,7/1,9

Canada

5,0/0,3

Vietnam

15,5/3,8

Rebaudioside A: là một trong số những diterpene glycoside có độ ngọt mạnh nhất và có vị giống sucrose nhất. Do đó, việc sử dụng rebaudioside A rất phù hợp trong thực phẩm và đồ uống…[11]

Stevioside: có lợi thế là đa tính năng như không độc, không chứa calori, ổn định bởi tác động của nhiệt, không lên men, 100% chất tự nhiên, không có tác nhân gây ung thư, không gây nghiện, nhất là đối với trẻ con. Stevioside không được hấp thu trong đường ruột, vì vậy nó cũng không tham gia trao đổi chất bởi enzyme trong ống tiêu hóa[1], chính vì lý do này mà stevioside rất phù hợp cho những bệnh nhân tiểu đường, béo phì, tim mạch….

Stevioside ngọt hơn sucrose từ 150300 lần , có vị hậu. Rebaudioside A ngọt hơn sucrose 250450 lần và không có hậu vị. Ta có thể đánh giá hậu vị của stevioside và rebaudioside A theo mô hình sau:

8

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 2.6. Mô hình đánh giá sự tương quan hậu vị[33]

d). Đặc tính của các hợp chất gây ngọt [11]

Đặc điểm khiến cỏ ngọt trong vòng 20 năm qua (1908-1988) từ một loại cây dại du nhập đã trở thành cây trồng mùa vụ với năng suất ngày càng tăng ở nhiều quốc gia trên thế giới là bởi những đặc trưng riêng biệt của hỗn hợp chất ngọt trong cây so với đường sucrose.

 Về căn bản không sinh năng lượng

 Ổn định ở nhiệt độ cao và trong khoảng pH rộng

 Độ ngọt cao hơn nhiều so với sucrose; có vị dịu ngọt và dễ chịu  Tính ngọt được làm mạnh và cải thiện hơn nếu phối hợp với muối, đường và các acid hữu cơ

(i).

Cường độ gây ngọt

Cường độ gây ngọt của 1 chất ngọt biến đổi theo độ tinh khiết, nhiệt độ, pH, tỷ lệ tồn tại, sự hiện diện của các thành phần thực phẩm khác và nồng độ của dung dịch đường có thể so sánh được. Thông thường, nhiều hợp chất gây ngọt có độ ngọt cao tồn tại trong giới hạn khoảng 2 đến 6% sucrose trong dung dịch nước

9

Bảng 2.5. Cường độ gây ngọt của stevioside và rebaudioside A trong dung dịch nước Độ ngọt tương đối ( sucrose =1)

Nồng độ Sucrose so sánh (%)

Stevioside

Rebaudioside A

2

267

385

4

160

308

6

133

261

8

118

250

10

111

208

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Độ ngọt tương đối so với dung dịch Sucrose 4% được đánh giá bởi hội đồng cảm quan ở Maruzen Pharmaceuticals Co.Ltd, stevioside và rebaudioside A đã được xác định có độ ngọt gấp 160 lần và 308 lần.

Bằng cách trộn với muối hoặc acid hữu cơ như acid lactic, acid citric, acid acetic, acid malic và acid tartaric; độ ngọt của các hợp chất gây ngọt Stevia được làm mạnh thêm trong khi hậu vị của chúng giảm đi. Ví dụ: chất ngọt có tên thương mại Marumilon 50 (Maruzen Pharmaceuticals.Co.Ltd) gồm có 60% cao chiết “Stevia extract”và 40% dextrin – khi so sánh với nồng độ sucrose 4%, độ ngọt của chúng gấp 308 lần trong dung dịch muối 5% và ngọt gấp 111 lần trong dung dịch nước. Tác dụng này đã tạo được một cơ sở lập luận rằng: khi trộn với muối hoặc acid hữu cơ thì cường độ gây ngọt của hợp chất stevia tăng lên có mức độ đáng kể trong khi cường độ gây ngọt của sucrose giảm xuống.

Bảng 2.6. Cường độ gây ngọt của Marumilon 50 trong các loại dung dịch Nồng độ Sucrose so sánh (%) 2 4 6 8 10

(ii).

Độ ngọt tương đối ( sucrose =1) của Marumilon 50 Stevioside 143 111 90 60 50

Rebaudioside A 333 308 273 200 125

Tính chất gây ngọt

Khi đưa vào miệng, stevioside gây một cảm giác ngọt dịu nhẹ có dư vị; và stevioside có vị gần giống sucrose hơn so với các chất gây ngọt triterpen glycoside,

10

glycyrhizin cũng như tính gây ngọt của stevioside cao hơn sucrose về độ dịu nhẹ và độ sảng khoái.

Khi chất ngọt stevia được sử dụng trong thực phẩm, đặc biệt là những thực phẩm không chứa muối như mứt kẹo, đồ uống…. thì chúng phần lớn đều được phối hợp với các loại hợp chất gây ngọt khác như sucrose, glucose, fructose…..khi đó quan sát ta thấy đặc tính gây ngọt của stevioside được cải thiện, có vị gần giống sucrose hơn đồng thời hậu vị của nó cũng giảm đi. Nhưng có vẻ như không có 1 tỉ lệ nào tối ưu nhất cho

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

việc phối chế stevia với các loại đường trên; đặc biệt nếu phối chế với “sugar alcohol” thì những tác động trên hầu như không có ý nghĩa. (iii).

Tính hòa tan

Độ hoà tan không ảnh hưởng nhiều đến việc sử dụng các hợp chất gây ngọt này vì độ ngọt cao của nó. Ở điều kiện nhiệt độ bình thường (khoảng 30oC) thì 2g hợp chất có thể hoà tan trong 100ml nước

Bảng 2.7. Độ tan trong nước của các hợp chất gây ngọt Diterpen Glycosides

Độ tan trong nước (%)

Stevioside Rebaudioside A Rebaudioside B Rebaudioside C Rebaudioside D Rebaudioside E Steviol bioside Dulcoside A

(iv).

0,13 0,8 0,1 0,21 1 1,7 0,03 0,58

Tính ổn định

 Ổn định với nhiệt

Đây là một nhân tố quan trọng vì phần lớn việc sử dụng các chất ngọt stevia đều ở trong điều kiện xử lý nhiệt như nấu nướng. Đặc tính gây ngọt trong dung dịch nước của stevioside không thay đổi khi gia nhiệt đến 95oC trong 2 giờ. Khi giữ nhiệt ở 95oC trong 8 giờ thì vị ngọt giảm nhẹ. Điều này đã giúp chất ngọt stevia không bị phân hủy khi được ứng dụng trong thực tiễn.[11]  Ổn định trong dung dịch có tính acid và tính kiềm Một dung dịch acid có chứa 0,02% stevioside ở pH ≥ 3 giữ ở 95oC trong 1giờ thì đặc tính của stevioside không thay đổi; nhưng với dung dịch chứa 12% stevioside ở 11

pH = 2 dưới những điều kiện trên thì bị phân huỷ. Theo Fujita và Edahiro (1979), stevioside ổn định ở khoảng pH từ 3 ÷ 9 ở 100oC trong 1 giờ.

Ta có thể thấy rằng các chất gây ngọt chính stevioside và rebaudioside A của “Stevia extracts” phân hủy tương ứng thành steviol bioside và rebaudioside B trong dung dịch kiềm mạnh; làm cường độ gây ngọt giảm đi. Tuy nhiên, việc sử dụng các chất ngọt stevia thường không được dùng dưới những điều kiện như trên.

2.1.2.2.

Các hợp chất không gây ngọt

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Ngoài các hợp chất gây ngọt diterpen glycosides, cỏ ngọt còn chứa các thành phần khác như sterol, labdane diterpenes, triterpenes, stigmasterol, tannins, tinh dầu…..và một số thành phần vi lượng như phosphorus, sắt, canxi, kali, magie, kẽm, vitamin A, protein, xơ.....cũng được tìm thấy trong cỏ ngọt với hàm lượng thấp.

Thành phần và cấu trúc của các hợp chất không gây ngọt: xem Phụ lục 1: 2.1.3. Tình hình sử dụng cỏ ngọt trong nước

Cây cỏ ngọt được nhập vào Việt Nam từ tháng 8/1988 từ Achentina[36][35]. Năm 1990, Công ty Dược Liệu Trung Ương 2 nhập cây cỏ ngọt từ Viện nghiên cứu củ cải đường của Liên xô…Sau đó, Việt Nam nhận được hạt giống từ Viện nghiên cứu cây trồng toàn liên bang Nga (VIR) cung cấp[36][35]. Cây cỏ ngọt khá thích nghi với điều kiện thổ nhưỡng ở nước ta và có thể đạt năng suất từ 2 đến 3 tấn lá khô/ha/năm. Dù vậy nhưng ở nước ta phần lớn mới chỉ trồng cỏ ngọt trên quy mô nhỏ ở các vùng núi cao [35]…như ở Cao Bằng, Hà Giang, Hòa Bình, Vĩnh Phú, Hải Hưng, Hà Nội, Hà Tây, Lâm Đồng, Đaklak…

Tuy nhiên, việc thu hái và chế biến ở nước ta chủ yếu chỉ ở dạng thô; chưa khai thác hết tiềm năng của nguồn dược liệu này. Lá sau khi thu hái, phơi, sấy làm trà đơn hoặc phối hợp với các dược liệu khác như artiso, sâm, quy, nhân trần hoặc chiết xuất ở dạng cao thô còn lẫn nhiều tạp chất, mùi và vị chưa được đặc trưng. Năm 1997, Viện Dược liệu đã thành công trong việc phân lập stevioside tinh khiết trên quy mô phòng thí nghiệm, nhưng chủ yếu để làm chất chuẩn phục vụ công việc định lượng hàm lượng stevioside trong các mẫu cỏ ngọt trồng ở Văn Điển (Hà Nội), Lâm Đồng, Thái Nguyên….

12

2.1.4. Tình hình sử dụng cỏ ngọt trên thế giới Việc sử dụng cỏ ngọt ở các quốc gia tùy thuộc vào luật lệ và truyền thống của mỗi nước. Đối với hầu hết các quốc gia ở Châu Á và Nam Mỹ thì chất ngọt của cỏ ngọt đã được công nhận và được sử dụng như là 1 chất ngọt phổ biến từ nhiều năm nay bởi ít tạo năng lượng và không gây ảnh hưởng phụ[5]. Ngược lại ở các quốc gia phương Tây vẫn chỉ xem cỏ ngọt như là một loại thực phẩm bổ sung.

Ngay từ những năm đầu của thế kỷ 20, người dân Paraguay đã biết sử dụng cỏ ngọt

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

như một loại nước giải khát; đến những năm 1970 cỏ ngọt đã bắt đầu được sử dụng rộng rãi ở Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Hàn Quốc, và nhiều nước ở Đông Nam Á.

Hình 2.7. Cỏ ngọt được trồng theo mùa vụ ở Paraguay

Ở Paraguay, cỏ ngọt được ghi vào danh sách những chất được sử dụng cho đồ uống ngọt. Dịch chiết nước của lá cỏ ngọt được sử dụng như là một tác nhân ngừa thai và cho việc điều trị bệnh tăng glucose huyết; nó còn được dùng làm thuốc bổ, trị đau bao tử , giảm huyết áp và điều trị bệnh béo phì.[2] Ở Brazil, cỏ ngọt được sử dụng làm chất ngọt. Hai chế phẩm, trà cỏ ngọt và viên nang cỏ ngọt đã được cho phép bán chính thức kể từ năm 1980. Ở Mỹ nó đã bị cấm vào năm 1990, nhưng sau đó được phép sử dụng trở lại vào năm 1995. Nguyên nhân chính chủ yếu là do quá trình tinh sạch sản phẩm khi sử dụng hóa chất để chiết tách chất ngọt này.

13

Ở Châu Âu, cỏ ngọt bắt đầu được sử dụng từ năm 1986. Nhưng từ năm 1997 có sự cân nhắc đối với những loại sản phẩm mới nên đã cấm sử dụng trong năm 2001 để chờ những kết quả kiểm tra và ý kiến của Hội đồng khoa học Châu Âu về loại chất ngọt này. Lý do mà EU chưa cho phép sử dụng stevioside là steviol, 1 loại aglycone của stevioside có thể gây độc[16]..

Nhật là quốc gia tiêu thụ cỏ ngọt nhiều nhất trên thế giới. Theo ước tính thì có khoảng 200 tấn chất ngọt stevia đã được sử dụng mỗi năm tại Nhật (1996). Con số này

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

tương đương với khoảng 2000 tấn lá khô được sử dụng cho việc chiết tách sản phẩm chất ngọt stevia. Giá trị thương mại của các sản phẩm chất ngọt stevia ở Nhật Bản được ước tính khoảng 2  3 triệu yên/năm.[11]

Từ năm 1991, các nước phát triển dự kiến giảm 30% đường có năng lượng cao bằng các loại chất ngọt thay thế đường (sweetener-sugar substitute) có năng lượng thấp và đáp ứng nhu cầu phòng ngừa và điều trị bệnh đái tháo đường, cao huyết áp, béo phì….[36][35]. Và chất ngọt trong cỏ ngọt vẫn được cân nhắc ít nhiều, dù các quốc gia vẫn chưa thống nhất được quan điểm với nhau. Chính điều này làm cho các nghiên cứu về cây cỏ ngọt được quan tâm và phát triển.

2.2.

Các công trình nghiên cứu về cây cỏ ngọt

2.2.1. Các nghiên cứu về các thành phần các chất có trong cây cỏ ngọt Đã có hơn 100 hợp chất được nhận diện trong cây cỏ ngọt[11] .

Năm 1900, Ovidio Rebaudi đã thành công trong việc cô lập 2 loại hợp chất từ cỏ ngọt: chất có vị ngọt và chất có vị đắng (hậu vị)[7].

Tiếp đó, hai nhà khoa học Reseback (1908) và Dieterich(1909) đã chiết xuất được glucoside từ lá cỏ ngọt.[11] Đến năm 1931, Bridel và Lavieille mới xác định và tinh chế được tinh thể stevioside.

Pasquel et al. (1999) đã khảo sát bằng phương pháp trích ly siêu tới hạn (SCFE) các hợp chất không chứa gốc đường (non-glycoside) trong lá cỏ ngọt. Các chất được nhận danh lần lượt qua phương pháp này trong dịch chiết là: spathulenol; decanoic acid; 8,11,14-ecosatrienoic

acid;

2-methyl

octadecane;

pentacosane;

octacosane;

stigmasterol; β- sitosterol; α- and β-amyrine; lupeol; β-amyrin acetate; and pentacyclic triterpene [7].

14

Các nghiên cứu sâu hơn về các thành phần trong cỏ ngọt phần lớn là ở Nhật Bản (ví dụ như Abe và Sonobe (1977), Morita (1977), Tanaka (1987), Yoshihira et al.

(1987)[11]. Soejarto (1983) tin rằng sesquiterpene lactones có liên quan mật thiết đến hậu vị đắng trong cỏ ngọt (aftertaste).Tsanava et al. (1991) đề nghị thừa nhận là caryophyllene và spathulenol góp phần quyết định hậu vị. Tuy nhiên, Phillips (1987) đã chỉ ra rằng stevioside và rebaudioside A quyết định đến hậu vị trong cỏ ngọt[1] 2.2.2. Các nghiên cứu về chiết tách các hợp chất trong cây cỏ ngọt

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hiện đã có rất nhiều các qui trình chiết tách các hợp chất từ cây cỏ ngọt, chủ yếu là tách hỗn hợp chất ngọt, stevioside, rebaudioside A. Mỗi qui trình đều có những điều kiện và những yêu cầu đặc trưng riêng. Các quốc gia cũng có những qui trình tách chiết khác nhau như: Nhật Bản, Paraguay, Hàn Quốc……Ở Việt Nam mới chỉ đưa ra qui trình chiết và cô lập stevioside trong phòng thí nghiệm, chưa ứng dụng được vào sản xuất.

a). Phương pháp chiết tách cổ điển

Theo Alvarez và Couto(1984) và Goto(1997) [7]

Cho 50g lá cỏ ngọt vào vừa đủ một lít nước; đun sôi ở nhiệt độ phòng (25÷30 oC) trong vòng 1 giờ dung dịch chiết được lọc chân không, trong phễu phân tách dịch chiết hòa thêm isobutyl alcohol giữ ở tỉ lệ thể tích 40:60 Để yên đến khi các pha được phân ly hoàn toàn  dịch chiết butanolic được đem ly tâm với tốc độ 3500 vòng/phút trong thời gian 15 phút  sau đó gia nhiệt dịch chiết đến 80oC và lọc qua than hoạt tính (1g than hoạt tính cho mỗi 100ml dịch chiết)  dịch chiết tiếp tục được cô đặc l bằng máy cô quay và để trong 24 giờ để các tinh thể glycoside kết tinh hoàn toàn  tinh thể được hòa tan lại với methanol và sấy trong lò tuần hoàn không khí.

Nước cái của sự kết tinh được cô đặc và trích ly bằng acetone. Tinh thể được rửa bằng acetone khan và sấy trong lò tuần hoàn không khí. b). Phương pháp trích ly mới : Phương pháp trích ly sử dụng dung môi CO2 siêu tới hạn SFE (Supercritical Fluid Extraction) [7][15]  Nguyên tắc: lợi dụng tính chất khí CO2 có thể hóa lỏng, dùng CO2 lỏng để chiết tách chất ra khỏi nguyên liệu.

15

 Hai giai đoạn chính: - Giai đoạn tiền xử lý bằng CO2 nhằm tách 1 phần chất ngọt có trong cỏ ngọt - Giai đoạn tách chiết chất ngọt bằng hỗn hợp CO2 siêu tới hạn và dung môi.

Dung môi dùng cho quá trình chiếm khoảng 9,5% trong tổng khối lượng hỗn hợp.

Các hỗn hợp có thể sử dụng: CO2 + nước; CO2 + ethanol; CO2 + nước + ethanol. Theo Pasquel et al. (1999); điều kiện tiền xử lý nên được cài đặt ở nhiệt độ 30 0C và áp suất 200 bar. Ở giai đoạn tách chiết chính, các glycosides phần lớn thu được ở 120bar và

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

200bar ở nhiệt độ 160C, 30 0C và 450C. Theo một nghiên cứu của Hàn Quốc (2002) thì phương pháp chiết siêu tới hạn sử dụng hỗn hợp dung môi (CO2:methanol:nước) với tỉ lệ (80:16:4) thì lượng chất ngọt chiết được bằng 150% so với phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ. Theo đó thì nhiệt độ và áp suất phù hợp là 20,4 Mpa và 34 Mpa ở nhiệt độ 400C, 600C và 800C [15].

c). Các qui trình chiết tách ở các nước

(i). Qui trình tách chiết hỗn hợp chất ngọt ở Nhật Bản:[6]

Qui trình được xây dựng trên cơ sở hạn chế tối đa việc sử dụng dung môi nhằm “tự nhiên hoá” sản phẩm

Qui trình sản xuất trên mang lại sản phẩm chứa đến 80 - 88% 4 loại hợp chất gây ngọt (stevioside, rebaudioside A, rebaudioside C and ducloside A). Những steviol glycosides khác và saccharides chiếm khoảng 5 - 10%

16

Lá khô Đun hồi lưu với nước (2-3 lần) Lọc

Bã

Dịch qua lọc Tạo kết tủa với Ca(OH)2 hoặc Al2(SO4)3

Bã

Dịch qua lọc

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Resin

Hấp phụ

Giải hấp phụ bằng alcohol

Resin

Pha alcohol

Pha nước

Chưng loại alcohol

Pha nước

Đệm trao đổi ion

Chưng cất lọai bớt nước

Vi lọc, khử trùng, sấy phun

Hỗn hợp chất ngọt

Sơ đồ 2.1. Qui trình tách chiết chất ngọt từ cỏ ngọt ở Nhật Bản

Các bước của qui trình

Các điều kiện phù hợp

Sấy khô lá cỏ ngọt

Thu hoạch; tách lá ra khỏi thân cây

Chiết

Chiết nước 2 ÷ 3 lần ở nhiệt độ 50 ÷ 60o C

Kết bông

Thêm vào Ca(OH)2 hay Al2(SO4)3 để tủa các thành phần vô cơ và tạp lơ lửng

Lọc

Lọc dưới áp suất kém

Hấp phụ trên resin

Các steviol glycosides được hấp phụ và giải ly bằng alcohol

Chưng cất

Alcohol bay hơi

Trao đổi ion

Đệm trao đổi ion loại các ion tạp

Cô cạn

Nước bốc hơi dưới áp suất thấp

Vi lọc

1 µm

Tiệt trùng

120o C, 1 phút

Sấy phun

Sấy

17

(ii). Qui trình tách chiết hỗn hợp chất ngọt ở Paraguay:[6]

Nguyên liệu cỏ ngọt từ Nam Mỹ chứa hơn 95% tổng hàm lượng carbonhydrate, trong đó stevioside chiếm khoảng 70%, rebaudioside A xấp xỉ 20% và các steviol glycosides khác chiếm không quá 5% tổng khối lượng.

Qui trình chiết tách ở Paraguay vẫn được thực hiện theo qui trình truyền thống; quá trình loại tạp, tách lấy chất ngọt và tinh chế chất ngọt dùng dung môi là chủ yếu.

Lá khô

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Ngâm nước nóng 20-30 phút

Lọc nóng

Bã

Dịch qua lọc

Để nguội đến nhiệt độ phòng Lắng hoặc ly tâm

Dịch

Chiết với dung môi kém phân cực

(benzene, chloroform, hexane)

Pha hữu cơ

Pha nước

Chiết với dung môi phân cực (n-butanol hoặc isobutanol)

Pha nước

Pha BuOH

Loại hết dung môi

Rắn Hòa tan trong MeOH nóng Làm lạnh, kết tinh

Tinh thể thô Rửa nhiều lần với MeOH lạnh Kết tinh lại trong hệ MeOH/H2O

Tinh thể sạch

Hỗn hợp Steviol Glycosides (97-98%)

Sơ đồ 2.2. Qui trình tách chiết hỗn hợp chất ngọt từ cỏ ngọt ở Paraguay 18

(iii). Qui trình tách chiết ở Việt Nam

Tham khảo theo qui trình của Tạp chí dược học[37], qui trình thu được stevioside dưới dạng tinh thể

Cỏ ngọt

Đun hồi lưu

Dịch chiết

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Bã cỏ ngọt

Cô chân không

Cắn

Thêm nước tỉ lệ 1:10

Cao chiết

Lắc với BuOH bão hòa nước

Cô chân không

Cắn BuOH

Hoà vừa đủ tan với cồn

Cao BuOH

Cho vào than hoạt tính Lọc, cô chân không

Hỗn hợp sệt

Để lạnh qua đêm

Lọc lấy tủa Hòa tan lại với cồn; đun sôi

Tinh thể Stevioside

Sơ đồ 2.3. Qui trình tách chiết stevioside từ cỏ ngọt ở Việt Nam

19

Tham khảo theo 1 báo cáo tách chiết stevioside của ĐH Bách Khoa:[35]

Lá và cành khô Đun hồi lưu Lọc

Bã cỏ ngọt

Dịch chiết

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Loại dung môi

Cao tổng W

Thêm ít nước

Khuấy, lắc EtOAc

Pha EtOAc

Pha nước

Loại bớt dung môi

Hỗn hợp sệt

Lắc với BuOH bão hòa nước

Pha BuOH

Pha BuOH

Cô kiệt

Cao BuOH

Chạy sắc ký cột

Phân đoạn phù hợp Cho than hoạt tính vào Lọc, cô chân không Rửa và kết tinh nhiều lần trong MeOH lạnh

Stevioside

Sơ đồ 2.4. Qui trình tách chiết stevioside từ cỏ ngọt làm chất chuẩn ở Việt Nam

20

2.2.3. Các nghiên cứu về độc tố trong cỏ ngọt Theo sách “An toàn cây thuốc” của Hiệp Hội Dược Thảo Hoa Kỳ, cây cỏ ngọt được xếp vào nhóm I (Class I), có nghĩa là an toàn nếu dùng một cách đúng đắn.[1] Đã có nhiều thí nghiệm chứng minh rằng stevioside sử dụng làm chất ngọt thay thế đường tuyệt đối an toàn, đặc biệt đối với những bệnh nhân tiểu đường, béo phì… vì nó không ảnh hưởng trên các chỉ tiêu sinh hóa máu cũng như hàm lượng đường huyết trong cơ thể[27] [26] [10].

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Nghiên cứu độc tố của stevioside (steviol, một loại aglycone có thể gây độc của cỏ ngọt) là vấn đề được các nhà khoa học quan tâm hàng đầu, thường được tiến hành thử nghiệm trên thỏ, chuột và tình nguyện viên[10]. Những nghiên cứu về khả năng hấp thu cho thấy stevioside và rebaudiana A không hấp thu trên đoạn ruột non, nhưng vì một lý do gì đó steviol đã hấp thu dễ dàng[1]

Bảng 2.8. Các nghiên cứu về khả năng gây độc chủ yếu của hỗn hợp chất ngọt stevia từ Nhật Bản[11] Tính độc

Những thử nghiệm

Tính độc nghiêm trọng

Cao chiết cỏ ngọt (stevioside 20,4%)

LD50>17,073 g/kg thể trọng (chuột DDY-N)

Cao chiết cỏ ngọt (stevioside 41,4%)

LD50>42 g/kg thể trọng (chuột DDY-N)

Stevioside (93,5%)

LD50>15 g/kg thể trọng (chuột ICR-SCRC)

Stevioside

LD50>8,2 g/kg thể trọng (chuột ICR, chuột lang Wister)

Stevia được chuyển hóa bằng enzym

LD50>60 g/kg thể trọng (chuột)

Tính độc cấp tính

Cao chiết cỏ ngọt (stevioside 53,1%)

Không gây độc (chuột lang SLC-Wister, cho 7%/khẩu phần

hay

5,6g/kg/ngày trong 13 tuần)

Stevioside

Không gây độc (chuột lang Wister,cho 2500mg/kg/ngày trong 1 tháng)

Stevioside (95,6%)

Không gây độc (chuột lang F334, cho 5%/khẩu phần trong 13 tháng)

Stevia được chuyển hóa bằng enzym

Không gây độc (chuột, 5%/khẩu phần trong 13 tuần)

Tính độc mãn tính

Cao chiết cỏ ngọt (stevioside 74,54%;

Không

rebaudioside A 16,27%)

550mg/kg/ngày trong 22 đến 24 tháng

gây

độc

(chuột

Stevioside (95,6%)

Không gây độc (chuột lang F334, cho 5%/khẩu phần hay 1997±617 mg/kg/ngày trong 104 tuần)

Tính đột biến gen

Cao chiết cỏ ngọt (stevioside 15,8%)

Phủ nhận

Cao chiết cỏ ngọt (stevioside 55%)

Phủ nhận

Stevioside (95±98%)

Phủ nhận

Stevia đã được chuyển hóa bằng

Phủ nhận

enzym

21

lang

F334,

cho

1%/khẩu

phần

hay

Theo tài liệu của Terai (2002) thì ảnh hưởng gây đột biến gen của steviol và 15oxo-steviol rất yếu (bằng 1/3000 hoạt động của 3,4-benzopyrene và bằng 1/24500 furylfuramide)[1]. Nhưng những nghiên cứu lâm sàng nhận thấy stevioside không làm tăng sự hình thành khối ung thư. Không những thế, một nghiên cứu tại Brazil (1996) trên thú vật đã công nhận tính chất giảm đường huyết, hạ huyết áp, và lợi tiểu của cỏ ngọt[10]. Một nhóm nghiên cứu khác của Brazil đã chứng minh cao cỏ ngọt hạ đường trong máu và tăng mức dung nạp glucose trong khi thử nghiệm và sau khi nhịn đói qua

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

đêm[24]. Ở Bỉ tiêu thụ đường saccharose khoảng 135g cho 1 người/ngày; với nhu cầu này người ta chỉ cần tiêu thụ 450 mg stevioside là đủ , với liều ADI là 7,9mg/kg thể trọng.

Các nhà khoa học Châu Âu đã cân nhắc và đưa ra liều ADI trên 20mg/kg thể trọng đã được đánh giá; nó có thể thay thế cho đường sucrose trong thực phẩm[1] với một liều lượng cho phép.

Bảng 2.9. Hàm lượng tối đa các chất gây ngọt từ cỏ ngọt trong thực phẩm[6] Loại thực phẩm

Hàm lượng tối đa

cho phép (mg/kg)

Đồ uống

500

Món tráng miệng

500

Yagurt

500

Mứt, bánh kẹo

1000

Nước sốt

1000

Hoa quả giầm

200

Rượu ngô

160

Bánh mì

300

Bánh qui

250

Trà

250

2.2.4. Các hướng nghiên cứu mới về cây cỏ ngọt Các công trình nghiên cứu gần đây đã đưa ra được hoàn chỉnh việc tách riêng các hợp chất có hiệu quả cao và đặc biệt đã được ứng dụng trong thương mại như stevioside, rebaudioside A. Bên cạnh đó, qui trình cô lập và tách riêng rebaudioside A cũng đã được phát triển [32]; cũng như việc tinh chế rebaudioside A đạt độ tinh khiết 95 - 99% từ các chế phẩm rebaudioside A thương mại cũng đã được nghiên cứu và ứng dụng ở qui mô công nghiệp[31].

22

TJPR đã đưa ra kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết cỏ ngọt đối với 1 vài chủng vi sinh vật. Theo đó thì các thành phần có trong dịch chiết cỏ ngọt từ MeOH và Chloroform như acid phenolic, acid caffeic và chlorogenic acid có khả năng chống viêm. Ngoài ra, dịch chiết từ hexan có các thành phần có khả năng kháng mạnh đối với nhiều chủng vi sinh vật nhất như: Bacillus Subtilis, Staphylococcus aureus, P.valgaris, nấm men, Aspergillus niger,….trong khi dịch chiết nước chỉ ức chế được hai chủng vi sinh vật B.subtilis, S.aureus….[22]

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Tanaka và Yamasaki đã thành công trong việc dùng enzyme cyclomaltodextringlucanotransferase (CGTase) và tinh bột hòa tan để gắn đường α-glucose của tinh bột vào vị trí số 4 ở đơn vị đường glucose của các glucoside chiết xuất từ cỏ ngọt. Kết quả này đã làm tăng độ ngọt và chất lượng vị của các glycoside trong cỏ ngọt[35],….

2.3.

Định tính và định lượng các thành phần có trong cỏ ngọt

Hiện đã có nhiều phương pháp được sử dụng để định tính và định lượng các thành phần stevioside, rebaudioside A trong cỏ ngọt như CC,TLC, HPLC, NMR, LC-MS, enzyme…..đặc biệt là phương pháp nhanh chóng và trực tiếp xác định hàm lượng stevioside có trong lá cỏ ngọt NIRS (Near Infared Reflectance Spectroscopy)[25] và phương pháp SERS (Surface Enhanced Raman Spectroscopy) theo dõi hàm lượng chất ngọt trong lá cỏ ngọt bằng micro-Raman và kỹ thuật làm tăng bề mặt [28] 2.3.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Theo Voluntary Specification of Non-Chemically Synthesized Food Additives (1993), thì định

lượng tổng các thành phần steviol glycoside trong dịch trích ly stevia được thực hiện bằng phương pháp HPLC trên cột NH2 (pha thường-pha tĩnh) [11] Điều kiện chạy HPLC:  Đầu dò: UV với bước sóng 210nm  Pha tĩnh: NH2 (aminopropyl - có thể thay bằng silicagel…)  Pha động: acetonitrile-water (80ml:20ml)

23

Theo Ludmila Bovanova và các cộng sự (Slovakia) đã sử dụng HPLC để xác định

stevioside gây vị ngọt STS (sweet - tasting stevioside) trong lá cỏ ngọt khô, trong trà và trong nước cam. Các mẫu được chiết bằng nước sôi và sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn SPE (Solid Phase Extraction). Kết quả: hàm lượng STS trong dịch chiết từ lá và trà là 5 g/ml và trong nước cam là 8 g/ml.

Các điều kiện được sử dụng: [14]  Sử dụng: cột pha ngược C18

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

 Pha động: (methanol:deionized water) (68:32)  Đầu dò: UV với bước sóng 210nm

2.3.2. Sắc ký lớp mỏng TLC

Theo một báo cáo của trường Bách Khoa [35]:

 Pha tĩnh: sắc ký lớp mỏng tráng sẵn

 Pha động: Hệ dung môi giải ly được lựa chọn theo hướng tăng dần độ phân cực (etyl acetat:nước:acid acetic:AF)

 Thuốc thử nhận danh là H2SO4:ethanol = 1:1

Theo Pasquel (2000), [7]

 Pha tĩnh: bản mỏng tráng sẵn bằng silicagel

 Pha động: (chloroform:methanol:nước) = (30:20:4)

 Thuốc thử nhận danh: (methanol:acid sulfuric) = (1:1)

Theo Antonio S.Dacome et al [9]:

 Pha tĩnh: bản mỏng tráng sẵn bằng silicagel

 Pha động: (isopropanol:ethyl acetate:acetone:nước) = (30:53:2:15)  Thuốc thử nhận danh: orcinol 0,5g % methanol:acid sulphuric (95:5) và được giữ ở nhiệt độ 5 ÷ 10oC trong 2 ÷ 4 phút.

2.4.

Ứng dụng của cỏ ngọt

Khi sử dụng hỗn hợp chất ngọt từ cỏ ngọt cho nhiều sản phẩm đa dạng rộng rãi khác nhau; yếu tố tất yếu đầu tiên là phải gắn liền với mục đích sử dụng những loại chất ngọt này; như là một hợp chất gây ngọt, một vị bổ sung, một chất khử đường hay để làm giảm năng lượng…...trước khi quyết định loại và liều lượng sử dụng.

24

2.4.1. Ứng dụng trong đời sống Cỏ ngọt đã được ứng dụng rộng rãi trong đời sống, trong các lĩnh vực như thực phẩm, y học, mỹ phẩm……[6] [34] [41]. a). Trong y học:

 sử dụng như một loại trà dành cho người bị bệnh tiểu đường, cao huyết áp, phòng chống xơ vữa động mạch  thực phẩm ăn kiêng, giảm cân  kem đánh răng, nước sát trùng răng miệng

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

 thuốc sát trùng

 thuốc hạ huyết áp

b). Trong công nghệ thực phẩm:

 làm chất phụ gia để sản xuất bánh kẹo, rượu, nước giải khát…..  đường thẻ dùng cho cà phê và trà

 kem, yaghurt, nước trái cây có gas  nước chấm, đồ chua  thực phẩm biển

c). Trong công nghệ mỹ phẩm:

 kem làm mềm da

 sữa làm mượt tóc….

2.4.2. Các sản phẩm thương mại có nguồn gốc từ cỏ ngọt

Đã có hơn 100 sản phẩm thương mại có nguồn gốc từ cỏ ngọt[11], tồn tại dưới 4 dạng cơ bản[39][40].

 SteviaPlus: dạng gói nhỏ tiện lợi hay dạng bột  SteviaClear: dạng lỏng, dùng phù hợp cho các lọai nước giải khát và nấu nướng  SteviaTabs: dạng viên dễ tan trong nước nóng hoặc lạnh  Liquid Stevia Flavors: dạng lỏng, chứa các hương tự nhiên sử dụng cho việc tự pha chế trà, cà phê, ya-ua, ….

25

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

SteviaPlus:

SteviaClear

SteviaTabs

Liquid Stevia Flavors

Hình 2.8. Các sản phẩm thương mại có nguồn gốc từ cỏ ngọt 26

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1. Thời gian Đề tài được thực hiện từ tháng 15/06/ 2008 đến 01/10/ 2008 3.1.2. Địa điểm Phòng Thí Nghiệm I4 thuộc Bộ môn Công nghệ hóa học, Trường Đại học Nông

3.2.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.

Thiết bị và hóa chất

3.2.1. Thiết bị (i).

Máy cô quay chân không ROTAVAPOR RE300B

(ii).

Bếp khuấy từ HEIDOLPH

(iii).

Bình cầu 2 cổ

(iv).

Sinh hàn

(v).

Máy lọc hút chân không

(vi).

Cân định lượng SARTORIUS TE412

(vii).

Nhiệt kế

(viii).

Tủ sấy MEMMERT UNB 400

3.2.2. Hóa chất

3.3.

(i).

Ethyl acetat, CHEMSOL, Việt Nam

(ii).

Buthanol, CHEMSOL, Việt Nam

(iii).

Ethanol, CHEMSOL, Việt Nam

(iv).

Cồn 96 o, công nghiệp

Nguyên liệu

a). Nguồn gốc: cỏ ngọt Hải Hưng; được thu hái tháng 8 (trước khi nở hoa) b). Thành phần: lá và cành nhỏ của cỏ ngọt đã được sấy khô c). Xử lý sơ bộ: lá cỏ ngọt được tách lấy để khảo sát

27

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 3.1. Mẫu cỏ ngọt trước và sau xử lý d). Bảo quản: cỏ ngọt sau khi xử lý sơ bộ được đóng gói chân không

Hình 3.2. Bảo quản cỏ ngọt

3.3.1. Khảo sát độ tro

a). Dụng cụ: chén nung, lò nung b). Phương pháp:

Độ tro của cỏ ngọt được lấy theo sai số của 3 lần đo Chén nung được nung nóng trong 2 giờ, sau đó đem cân bằng ẩm trong bình hút ẩm 30 phút, cân và ghi nhận khối lượng m0 Cân khoảng 2 g mẫu cỏ ngọt cho vào chén nung, cân và ghi nhận khối lượng m1 Chén nung được nung ở 800oC trong 2 giờ, sau đó đem cân bằng ẩm,cân và ghi nhận khối lượng m2

28

Độ tro của cỏ ngọt được xác định theo công thức:

mt 

md m  m0 100  1 100 ms m2  m0

Với  Khối lượng của cỏ ngọt trước khi nung là: md = m1 - m0  Khối lượng của cỏ ngọt sau khi nung là: ms = m2 – m0 3.3.2. Khảo sát độ ẩm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

a). Dụng cụ: chén nhôm, tủ sấy b). Phương pháp:

Chén nhôm được sấy khô trong tủ sấy, sau đó được cân bằng ẩm trong bình hút ẩm khoảng 30 phút; đem cân và ghi nhận khối lượng m 0

Cân 1 lượng khoảng 2g cỏ khô cho mỗi chén nhôm; cân và ghi nhận khối lượng m1 Đưa vào tủ sấy (cài đặt nhiệt độ tủ sấy là 1050C)

Sau 3h, lấy chén nhôm cho vào bình hút ẩm khoảng 30 phút, cân và ghi nhận khối lượng m2

Tiếp tục đưa chén nhôm vào tủ sấy, sau đó 1h cho vào bình hút ẩm, đem cân và ghi nhận khối lượng….quá trình này được làm liên tục đến khi nào khối lượng cân 3 lần liên tiếp là không đổi (khoảng cách lưu mẫu trong tủ sấy trung bình khoảng 1h).Theo đó ta có khối lượng không đổi là mc.

Độ ẩm được xác định theo công thức:

x

mvl  mk ( m  m0 )  ( mc  m0 )  100  1  100 mvl ( m1  m0 )

Với  Khối lượng ban đầu của cỏ ngọt trước khi sấy : mvl = m1 - m0  Khối lượng khô tuyệt đối của cỏ ngọt: mk = mc - m0

29

3.4.

Qui trình công nghệ thực hiện

Từ kết quả tổng quan tài liệu cho thấy các phương pháp tách chiết hợp chất gây ngọt từ cỏ ngọt ở các quốc gia khác nhau đều có những điểm đặc trưng chung như sau:  Dung môi chiết: H2O hoặc Cồn hoặc MeOH  Loại tạp: sử dụng các dung môi kém phân cực như EtOAc, chloroform, hexan, ether dầu hỏa, benzene….hoặc dùng các resin hấp phụ  Chiết lấy chất ngọt: sử dụng dung môi n-BuOH hoặc iso-BuOH hoặc nhựa trao

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

đổi ion.  Kết tinh stevioside: MeOH lạnh

Từ các nhận định và tham khảo trên, chúng tôi chọn qui trình để tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện tách chiết như sau:

30

QUI TRÌNH Lá cỏ khô Đun hồi lưu (2 lần) với dung môi chiết Lọc

Bã cỏ ngọt

Dịch chiết Cô quay chân không loại dung môi

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Cao tổng W Thêm ít nước

Khuấy, lắc EtOAc

Pha EtOAc

Pha lỏng

Cô quay chân không loại dung môi

Hỗn hợp sệt

Lắc với BuOH bão hòa nước (n-butanol: H2O=9,1:100)

Pha BuOH

Pha BuOH

Cô quay chân không loại dung môi

Cao BuOH WB

Sơ đồ 3.1. Qui trình khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện chiết

THUYẾT MINH QUI TRÌNH Nguyên liệu cỏ ngọt sau khi được xử lý sơ bộ, được đem đun hồi lưu 2 lần với hệ dung môi chiết. Tỉ lệ DM/NL, nhiệt độ và thời gian đun tùy từng nghiệm thức.

Hỗn hợp chiết được cho qua thiết bị lọc hút chân không để loại phần bã rắn, thu được dịch màu vàng nâu. Tiến hành cô quay dưới áp suất thấp để loại dung môi, thu được dạng cao tổng màu nâu. Cao tổng được lắc với EtOAc trong 10 phút. Tách lấy pha lỏng, đem cô quay dưới áp suất thấp loại hết dung môi. Sau đó lắc tiếp với BuOH bão hòa nước. Tiếp tục cô quay chân không loại BuOH, ta thu được cao BuOH. 31

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 3.3. Cỏ ngọt được đun hồi lưu với dung môi chiết

Hình 3.4. Hỗn hợp chiết được lọc chân không loại phần bã rắn

Hình 3.5. Cô quay chân không loại dung môi 32

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 3.6. Cao tổng

Hình 3.7. Lắc với EtOAc

Hình 3.8. Lọc và tách lấy pha lỏng 33

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 3.9. Cô quay chân không loại EtOAc

Hình 3.10. Lắc với BuOH bão hòa nước

Hình 3.11. Cô quay chân không loại BuOH

34

3.5.

Phương pháp thí nghiệm

3.5.1. Cơ sở khảo sát Các thông số khảo sát được lựa chọn dựa trên kết quả tổng quan tài liệuPhụ lục 4: Thực nghiệm được bố trí theo phương pháp yếu tố toàn phần sử dụng phần mềm JMP 4.0.

3.5.2. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm khảo sát 4 yếu tố được bố trí theo phương pháp bề mặt đáp ứng

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

(Response Surface Methodology) và sử dụng phần mềm JMP 4.0. Phương án thực nghiệm là kiểu phương án quay bậc hai có tâm (Central Composite Rotable Design CCRD)

a). Các yếu tố khảo sát

(i). Hệ dung môi chiết (cồn, nước): tiến hành khảo sát hệ cồn 5%, 10%, 15%. (ii). Thời gian chiết: khảo sát trong khoảng thời gian: 20 phút, 30 phút, 40 phút (iii). Nhiệt độ chiết: khảo sát trong khoảng nhiệt độ: 65 oC, 70 oC, 75 oC (iv). Tỉ lệ DM/ NL chiết: khảo sát trong khoảng tỉ lệ: 65; 75; 85 b). Thông số đáp ứng

Kết quả các nghiệm thức được đánh giá dựa trên hai thông số: (i). Khối lượng cao tổng

(ii). Khối lượng cao BuOH

Đường biểu diễn cho mối tương quan giữa các yếu tố và các thông số khảo sát là mặt cong thể hiện giữa sự đáp ứng và yếu tố, gọi là bề mặt đáp ứng (Response Surface). Mặt đáp ứng này có dạng tổng quát là Y = f (X1, X2, …).

Đối với thực nghiệm 4 yếu tố, phương trình tổng quát của mặt cong này có dạng: Y = ao + a1X1 + a2X2 + a3X3 +a4X4 + b 1X1X2 + b 2X1X3 + b3X1X4 + b 4X2X3 + b 5X2X4 + +b 6X3X4 + c1X12 + c2X22 + c3X32 + c4X42

Các yếu tố khảo sát được mã hoá trong hệ toạ độ không thứ nguyên với tọa độ của tâm phương án bằng 0, trùng với gốc hệ trục tọa độ. Các yếu tố mã hóa Zi nhận hai giá -1 và +1 tương ứng với mức trên và mức dưới của yếu tố thật.(Bảng 3.1) Ma trận thực nghiệm thu được như sau (Bảng 3.2)

35

Bảng 3.1. Mã hóa các yếu tố khảo sát Yếu tố

X1 X2 X3 X4

Khoảng biến thiên

Các mức

Hệ dung môi (cồn, nước) Thời gian chiết (phút) Nhiệt độ chiết (oC) Tỉ lệ DM/NL

Mức dưới -1

Mức cơ sở 0

Mức trên+1

5 20 65 65

10 30 70 75

15 40 75 85

5 10 5 10

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Bảng 3.2. Bố trí thực nghiệm các điều kiện khảo sát Bố trí

Thí nghiệm tại nhân

Thí nghiệm tại điểm sao

Thí nghiệm tại tâm

Các yếu tố theo tỉ lệ xích tự nhiên

Mã NT

Các yếu tố trong hệ mã hoá

X1

X2

X3

X4

Z1

Z2

Z3

Z4

------+ --+--++ -+--+-+ -++-+++ +--+--+ +-++-++ ++-++-+ +++++++ a000 A000 0a00 0A00 00a0 00A0 000a 000A

5 5 5 5 5 5 5 5 15 15 15 15 15 15 15 15 0 20 10 10 10 10 10 10

65 65 75 75 65 65 75 75 65 65 75 75 65 65 75 75 70 70 70 70 60 80 70 70

20 20 20 20 40 40 40 40 20 20 20 20 40 40 40 40 30 30 10 50 30 30 30 30

65 85 65 85 65 85 65 85 65 85 65 85 65 85 65 85 75 75 75 75 75 75 55 95

-1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 1 1 1 1 -2 2 0 0 0 0 0 0

-1 -1 1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 0 0 0 0 -2 2 0 0

-1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 0 0 -2 2 0 0 0 0

-1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 0 0 0 0 0 0 -2 2

0000 0000 0000

10 10 10

70 70 70

30 30 30

75 75 75

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

36

3.6.

Phương pháp đo đạc

Phương pháp cân định lượng 3.7.

Xử lý số liệu

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Dùng phần mềm JMP Software 4.0

37

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1.

Kết quả khảo sát nguyên liệu

4.1.1. Độ tro Bảng 4.1. Kết quả khảo sát độ tro của cỏ ngọt Mẫu HẢI HƯNG

Khối lượng (g)

1 53,09

53,43

3 50,48

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

m0

2

m1

55,27

55,44

52,45

m2 Độ tro (%) Độ tro TB (%)

53,32 10,55

53,64 10,45 10,38

50,68 10,15

NHẬN XÉT: Nguồn nguyên liệu khảo sát có thành phần vô cơ chiếm 10,38% nhiều hơn so với nguồn nguyên liệu Cao Bằng (7,53%) và Mộc Hóa (6.02%)[35].

4.1.2. Độ ẩm

Bảng 4.2. Kết quả khảo sát độ ẩm của cỏ ngọt

Mẫu HẢI HƯNG

Khối lượng (g)

m0 m1 m3 m4 m5 m6 Độ ẩm (%) Độ ẩm TB (%)

1 5,36 7,22 7,15 7,12 7,12 7,12 5,37

2 6,13 7,96 7,91 7,86 7,86 7,86 5,46 5,41

3 5,96 7,81 7,78 7,71 7,71 7,71 5,38

NHẬN XÉT: Theo điều kiện bảo quản dược liệu (xem 2.1.1) thì độ ẩm phải nhỏ hơn 10%. Vậy nguồn nguyên liệu khảo sát đạt yêu cầu.

4.2.

Kết quả khảo sát điều kiện chiết (qui hoạch thực nghiệm)

Kết quả khảo sát các điều kiện chiết tách của bố trí thí nghiệm được trình bày trong hai bảng sau: Bảng 4.3 và Bảng 4.4 Kết quả xử lý số liệu sơ bộ bằng phần mềm JMP 4.0 được trình bày trong Phụ lục 3: 38

Bảng 4.3. Kết quả khảo sát các điều kiện chiết tách (Thực nghiệm LẦN 1)

-+++ +--+--+ +-++-++ ++--

Z1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 1

Z2 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 1

Z3 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 -1

Z4 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1

++-+ +++++++ a000 A000

1 1 1 -2 2

1 1 1 0 0

-1 1 1 0 0

1 -1 1 0 0

1,77 1,74 1,73 1,73 1,75

0,12 0,11 0,10 0,13 0,12

0a00 0A00 00a0 00A0 000a 000A

0 0 0 0 0 0

-2 2 0 0 0 0

0 0 -2 2 0 0

0 0 0 0 -2 2

1,73 1,72 1,7 1,74 1,74 1,75

0,11 0,08 0,08 0,15 0,13 0,11

0000 0000

0 0

0 0

0 0

0 0

1,73 1,74

0,12 0,11

0000

0

0

0

0

1,72

0,10

Mã NT ------+ --+--++ -+--+-+ -++-

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Bố Trí

Cao tổng(g) 1,72 1,73 1,81 1,73 1,69 1,76 1,74 1,73 1,74 1,75 1,81 1,74 1,72

Thí nghiệm tại nhân

Thí nghiệm tại điểm sao

Thí nghiệm tại tâm

39

Cao BuOH(g) 0,10 0,11 0,17 0,13 0,10 0,12 0,17 0,11 0,12 0,11 0,17 0,11 0,10

Bảng 4.4. Kết quả khảo sát các điều kiện chiết tách (Thực nghiệm LẦN 2)

Mã NT ------+ --+--++ -+--+-+ -++-+++ +--+--+ +-++-++ ++-++-+ +++++++ a000 A000 0a00 0A00 00a0 00A0 000a 000A

Z1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 1 1 1 1 -2 2 0 0 0 0 0 0

Z2 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 0 0 -2 2 0 0 0 0

Z3 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 0 0 0 0 -2 2 0 0

Z4 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 0 0 0 0 0 0 -2 2

Cao tổng(g) 1,71 1,74 1,78 1,75 1,70 1,75 1,73 1,75 1,75 1,73 1,79 1,73 1,73 1,79 1,75 1,74 1,74 1,76 1,74 1,70 1,71 1,73 1,75 1,74

0000

0

0

0

0

1,72

0,11

0000

0

0

0

0

1,74

0,12

0000

0

0

0

0

1,73

0,11

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Bố Trí

Thí nghiệm tại nhân

Thí nghiệm tại điểm sao

Thí nghiệm tại tâm

40

Cao BuOH(g) 0,12 0,10 0,19 0,11 0,11 0,11 0,13 0,12 0,11 0,10 0,15 0,14 0,09 0,11 0,12 0,11 0,14 0,11 0,11 0,11 0,09 0,13 0,14 0,12

4.2.1. Kết quả phân tích ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến lượng cao tổng Mô hình thể hiện tính tương thích giữa các yếu tố tác động lên cao tổng được thể hiện trong Hình 4.1 bên dưới cho thấy rằng sự tương quan giữa các yếu tố tác động lên đáp ứng cao tổng là có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% (Phụ lục 3.1:). Sự tương thích này khá chặt chẽ được thể hiện thông qua hệ số R2 = 0,86.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

cao tong Actual

1.8

1.76

1.72

1.68 1.68

1.70

1.72

1.74

1.76

1.78

1.80

1.82

cao tong Predicted P<.0001 RSq=0.86 RMSE=0.0108

Hình 4.1. Mô hình thể hiện tính tương thích của các yếu tố lên cao tổng

Phương trình bề mặt đáp ứng đối với cao tổng được thiết lập như sau: Y = 4,73372 + 0,039019X1 - 0,15069X2 + 0,04594X3 - 0,00132825X1X3

+ 0,00211X2X3 + 0,006719X2X4 + 0,000797X3X4 + 0,0014192X12 + 0,0056771X42 Trong đó: X1 là hệ dung môi (cồn, nước) X2 là nhiệt độ chiết (oC) X3 là thời gian chiết (phút) X4 là tỉ lệ DM/NL

41

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Bảng 4.5. Tác động của các yếu tố khảo sát lên đáp ứng cao tổng

Kết quả phân tích tác động của các yếu tố lên đáp ứng cao tổng được thể hiện ở Bảng 4.5 đã cho thấy ảnh hưởng của các thông số khảo sát lên cao tổng là có ý nghĩa (p<0,05). Theo đó thì ảnh hưởng của 3 yếu tố hệ dung môi, nhiệt độ chiết, thời gian chiết ảnh hưởng có ý nghĩa lên đáp ứng cao tổng với độ tin cậy 95%; yếu tố tỉ lệ DM/NL ảnh hưởng không có ý nghĩa lên lượng cao tổng (p>0,05)

Trong ba thông số khảo sát ảnh hưởng có ý nghĩa thì yếu tố thời gian chiết (β3=0,008125) có ảnh hưởng mạnh nhất đến lượng cao tổng, sau đó là nhiệt độ chiết (β2 = 0,0096042) và cuối cùng là hệ dung môi (β1 = 0.005625). Ta có thể thấy rõ điều này qua mô hình bề mặt đáp ứng của khối lượng cao tổng được biểu diễn theo thời gian chiết, nhiệt độ chiết và hệ dung môi (Hình 4.2)

cao tong

nhiet do chiet(65,75) 0

cao tong

thoi gian chiet(20,40)

cao tong

thoi gian chiet(20,40)

0 he dung moi(5,15)

0 he dung moi(5,15)

nhiet do chiet(65,75)

Hình 4.2. Mô hình bề mặt đáp ứng của cao tổng được biểu diễn theo thời gian chiết, nhiệt độ chiết và hệ dung môi

42

Ảnh hưởng của các thông số khảo sát lên sự thay đổi khối lượng cao tổng còn được thể hiện khá rõ theo như Hình 4.7. Điều dễ nhận thấy ở đây là khối lượng cao tổng càng tăng khi thời gian chiết càng tăng và nhiệt độ chiết càng giảm trong khoảng nhiệt độ và thời gian khảo sát. Có thể nói rằng ở khoảng nhiệt độ phù hợp tức quá trình dung môi thấm qua màng tế bào diễn ra bình thường, nếu thời gian chiết tăng đến giới hạn, quá trình hòa tan chất càng nhanh thì quá trình thẩm thấu càng đạt đến cân bằng dẫn đến khối lượng cao tổng cũng tăng theo. Bên cạnh đó, hệ dung môi cũng có tác động

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

đến lượng cao tổng ít nhiều, cụ thể như lượng cao tổng giảm nhẹ khi hệ biến đổi từ 5% đến 10%; nhưng khi hệ > 10% thì lượng cao tổng lại tăng mạnh hơn lượng đã giảm.

Sự tương tác giữa các yếu tố khảo sát lên cao tổng được thể hiện rõ hơn qua mặt cắt ngang qua các bề mặt đáp ứng (Hình 4.3). Theo như Bảng 4.5 thì chỉ có 4 tương tác giữa các yếu tố là có ý nghĩa (p<0,05). Đó là hệ dung môi và thời gian chiết; nhiệt độ chiết và thời gian chiết; nhiệt độ chiết và tỉ lệ NL/ DM; thời gian chiết và tỉ lệ DM/NL. Trong 4 tương tác giữa các yếu tố trên thì tương tác giữa hệ dung môi và thời gian chiết là có ảnh hưởng ít nhất.

Hình 4.3. Tương tác giữa các yếu tố lên lượng cao tổng

43

Tương tác giữa thông số nhiệt độ chiết và thời gian chiết là ảnh hưởng có ý nghĩa nhất đến lượng cao tổng. Ở nhiệt độ thấp (60 oC), khi thời gian chiết tăng thì lượng cao tổng tăng nhưng ở nhiệt độ chiết cao ( 80oC), khi thời gian chiết tăng thì lượng cao tổng lại giảm. Điều này giải thích rằng khi nhiệt độ chiết tăng đến một khoảng giá trị xác định (cụ thể ở đây là 80oC) thì một số thành phần trong dịch chiết bị phân hủy bởi nhiệt độ hoặc phản ứng với dung môi tạo ra các hợp chất kém phân cực làm giảm lượng cao tổng. Ngoài ra ở nhiệt độ cao trong thời gian chiết dài sẽ dẫn đến hàm lượng

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

tạp cao và có thể làm giảm hàm lượng cao BuOH (phù hợp với kết quả phân tích đối với khối lượng cao BuOH). Đối với tương tác giữa nhiệt độ chiết và tỉ lệ DM/NL hoặc giữa thời gian chiết và tỉ lệ DM/NL, nhiệt độ chiết (hay thời gian chiết ) càng tăng, tỉ lệ DM/NL càng tăng thì lượng cao tổng càng tăng. Điều này phù hợp với quá trình thẩm thấu trong quá trình chiết, nếu dung môi thẩm thấu qua màng tế bào càng nhiều thì các chất được hòa tan càng nhiều nhưng khi thẩm thấu đạt đến cân bằng (chiết kiệt) thì hiệu suất chiết coi như ổn định lúc này nếu nhiệt độ chiết vẫn giữ ở nhiệt độ cao hoặc thời gian chiết kéo dài sẽ ảnh hưởng đến lượng cao tổng tồn tại trong dịch chiết.

Bề mặt đáp ứng cho ra giải pháp để thu được lượng cao tổng cao nhất ở điều kiện chiết với hệ dung môi (cồn, nước) 9,39%, thời gian chiết 33,03 phút, nhiệt độ chiết 67,59 oC, tỉ lệ DM/NL 78; khi đó khối lượng cao tổng theo dự đoán là 1,73g (Phụ lục 3.1:)

44

4.2.2. Kết quả phân tích ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến lượng cao BuOH Mô hình thể hiện tính tương thích giữa các yếu tố tác động lên cao BuOH được thể hiện trong Hình 4.4 bên dưới cho thấy rằng sự tương quan giữa các yếu tố tác động lên đáp ứng cao BuOH là có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% (Phụ lục 3.2:). Sự tương thích này tương đối chặt chẽ được thể hiện thông qua hệ số R2 = 0,82

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

cao BuOH Actual

0.2

0.16

0.12

0.08

.08

.10

.12

.14

.16

.18

.20

cao BuOH Predicted P<.0001 RSq=0.82 RMSE=0.0107

Hình 4.4. Mô hình thể hiện tính tương thích của các yếu tố lên cao BuOH

Phương trình bề mặt đáp ứng đối với cao BuOH được thiết lập như sau: Y = 9,59838 - 0,04333X1 - 0,101085X2 + 0,05109X3 - 0,2431075X4 - 0,0014842X2X3 + 0,002969X2X4 - 0,004844X3X4 + 0,00102865X12 + 0,0041146X42 Trong đó: X1 là hệ dung môi (cồn, nước) X2 là nhiệt độ chiết (oC) X3 là thời gian chiết (phút) X4 là tỉ lệ DM/NL

45

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Bảng 4.6. Tác động của các yếu tố khảo sát lên đáp ứng cao BuOH

Kết quả phân tích tác động của các yếu tố lên đáp ứng cao BuOH được thể hiện ở Bảng 4.6 đã cho thấy ảnh hưởng của các thông số khảo sát lên cao BuOH là có ý nghĩa (p<0,05). Theo đó thì 4 yếu tố khảo sát đều ảnh hưởng có ý nghĩa lên đáp ứng cao BuOH với mức ý nghĩa 95%

Thông qua hệ số ước lượng tác động của các yếu tố đến đáp ứng cao BuOH cho thấy: trong 4 thông số khảo sát ảnh hưởng có ý nghĩa thì thời gian chiết (β3 =0.013125) và tỉ lệ DM/NL (β4 = 0.006785) có ảnh hưởng mạnh nhất đến lượng cao BuOH, sau đó là nhiệt độ chiết (β2 = 0.005625) và cuối cùng là hệ dung môi (β1 =0.004375). Ta có thể thấy rõ điều này qua mô hình đáp ứng của cao BuOH được biểu diễn theo thời gian chiết, nhiệt độ chiết, hệ dung môi và tỉ lệ DM/NL (Hình 4.5)

0 he dung moi(5,15)

0 he dung moi(5,15)

0

cao BuOH

thoi gian chiet(20,40) 0

ti le NL/DM(1.65,1.85)

thoi gian chiet(20,40)

nhiet do chiet(65,75)

cao BuOH

cao BuOH

cao BuOH

he dung moi(5,15) cao BuOH

cao BuOH

ti le NL/DM(1.65,1.85)

ti le NL/DM(1.65,1.85)

0 nhiet do chiet(65,75)

0 nhiet do chiet(65,75)

thoi gian chiet(20,40)

Hình 4.5. Mô hình bề mặt đáp ứng của cao BuOH được biểu diễn theo các thông số khảo sát điều kiện chiết 46

Ảnh hưởng của các thông số khảo sát lên sự thay đổi khối lượng cao BuOH còn được thể hiện khá rõ theo như Hình 4.7. Giải thích cho sự biến đổi này tương tự như lượng cao tổng; tức nhiệt độ chiết và thời gian chiết vẫn là hai yếu tố ảnh hưởng mạnh nhất đến đáp ứng này.

Sự tương tác giữa các yếu tố khảo sát lên cao BuOH được thể hiện rõ hơn qua mặt cắt ngang qua các bề mặt đáp ứng (Hình 4.6). Theo như Bảng 4.6 thì chỉ có 3 tương tác đôi giữa các yếu tố là có ý nghĩa (p<0,05).Đó là nhiệt độ chiết và thời gian chiết;

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

nhiệt độ chiết và tỉ lệ DM/NL; thời gian chiết và tỉ lệ DM/NL.

Hình 4.6. Tương tác giữa các yếu tố lên lượng cao BuOH

Trong các tương tác đôi kể trên thì tương tác giữa yếu tố thời gian chiết và tỉ lệ DM/NL ảnh hưởng lên cao BuOH là nhiều nhất (β34 =0.009687; p<0,0001). Khi thời gian chiết càng tăng, tỉ lệ DM/NL càng giảm thì lượng cao BuOH càng tăng; nhưng khi thời gian chiết càng giảm, tỉ lệ DM/NL càng tăng thì lượng cao BuOH càng tăng nhưng không nhiều. Điều này có thể được giải thích rằng khi nhiệt độ chiết ổn định, nếu thời gian chiết tăng đến giới hạn thì quá trình thẩm thấu đạt cân bằng lúc này quá trình chiết kiệt đã kết thúc nhưng lượng cao lại thay đổi; gỉa thiết được đặt ra là có thể đã xảy ra phản ứng hóa học hay phân hủy chất khi thời gian chiết tăng thêm gây ra sự biến đổi về lượng cao. Tương tự cho tương tác giữa nhiệt độ chiết và thời gian chiết,

47

nhiệt độ chiết và tỉ lệ DM/NL có ảnh hưởng đến lượng cao BuOH gần như nhau (p=0,0033).

Bề mặt đáp ứng cho ra giải pháp để thu được lượng cao BuOH cao nhất ở điều kiện chiết với hệ dung môi 9,48 %, thời gian chiết 35,31 phút, nhiệt độ chiết 69,10oC, tỉ lệ DM/NL 82; khi đó khối lượng cao BuOH theo dự đoán là 0,11g.(Phụ lục 3.2:) 4.2.3. Nhận xét chung Quá trình chiết là quá trình thuận nghịch và nhiều giai đoạn. Khi cho dung môi tiến

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

vào nguyên liệu chiết đầu tiên, dung môi sẽ thấm qua màng tế bào và hòa tan chất. Khi đó xảy ra quá trình thẩm thấu giữa dịch chiết trong thành tế bào và dung môi bên ngoài. Quá trình thẩm thấu này kết thúc khi có sự cân bằng về nồng độ của chất bên trong và bên ngoài thành tế bào.Có thể nói, quá trình chiết bao gồm ba giai đoạn liên tiếp nhau: dung môi thấm qua màng tế bào, hòa tan chất và thẩm thấu đến khi đạt cân bằng. Chiết dược liệu là quá trình chiết hỗn hợp nhiều chất, nhưng hiệu quả quá trình chiết đối với một hợp chất xác định chỉ đạt cực đại tại một điều kiện chiết nhất định.

Tác động của các thông số khảo sát (hệ dung môi chiết, nhiệt độ chiết và thời gian chiết) là ảnh hưởng có ý nghĩa lên các đáp ứng Y (cao tổng và cao BuOH) (p<0,05).Và trong đó chỉ có 3 tương tác giữa các yếu tố là có giá trị thống kê với mức ý nghĩa 95%; đó là nhiệt độ chiết và thời gian chiết; nhiệt độ chiết và tỉ lệ DM/NL; thời gian chiết và tỉ lệ DM/NL. Như vậy tương tác đơn của tỉ lệ DM/NL không có ý nghĩa trong khoảng giới hạn của yếu tố khảo sát.

Từ kết quả phân tích ảnh hưởng của 4 yếu tố khảo sát điều kiện chiết lên đáp ứng cao tổng và cao BuOH (Hình 4.7); các thông số tối ưu được thiết lập dựa trên giản đồ tối ưu (Prediction Profiler - Phụ lục 3.3:) với cơ sở là làm cực đại các đáp ứng lượng cao tổng và cao BuOH (Hình 4.8). Theo đó thì các điều kiện chiết thích hợp nhất cho nguồn dược liệu Hải Hưng sẽ ở hệ dung môi(cồn, nước) 6,51%, nhiệt độ chiết 64,03oC, thời gian chiết 44,45 phút với tỉ lệ DM/NL là 55; khi đó thì lượng cao tổng và cao BuOH thu được lần lượt là 1,84g và 0,22g. Với điều kiện chiết như vậy thì các đáp ứng đạt được là tương đối phù hợp.

Từ phương trình bề mặt đáp ứng của cao tổng; ta có thể biểu diễn bằng công thức : y = ys + λiYi = 0,0003986 + 0,00005643Y12 – 0,00013586Y22 – 0,00010886Y32 + 0.0004689Y42 .Từ đây ta có thể kết luận đây là điểm saddle point. Tương tự đối với 48

cao BuOH. Vậy, giá trị cực đại mà phần mềm JMP có thể là cực đại cục bộ, chưa hẳn là cực đại toàn cục. Đối với điều kiện sản xuất thực tế, dựa trên kết quả bề mặt đáp ứng từ các phương trình hồi qui trên có thể xác định điều kiện sản xuất cụ thể để đạt được kết quả mong muốn bằng cách sử dụng giản đồ đường đồng mức (Contour Profiler. – Phụ lục 3.4:)

1.73

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

cao tong

1.81

1.69

cao BuOH

0.19

0.111667

he dung moi(5,15)

nhiet do chiet(65,75)

thoi gian chiet(20,40)

1.95

1.55

30

50

70

10

80

10

60

0

20

0.0776

1.75

ti le NL/DM(1.65,1.85)

Hình 4.7. Ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát lên đáp ứng cao tổng và cao BuOH

cao tong

1.933

1.835762

1.6407

cao BuOH

0.283

0.218024 0.0614

1

he dung moi(-1,1)

nhiet do chiet(-1,1)

1.44541

thoi gian chiet(-1,1)

1

0

2

-2

2

2

-0.5938

-2

-0.6976

-2

2

0 -2

Desirability

1

-2 ti le(-1,1)

Desirability

Hình 4.8. Tối ưu hóa các yếu tố khảo sát lên đáp ứng cao tổng và cao BuOH 49

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1.

Kết luận

Qui hoạch thực nghiệm các yếu tố khảo sát đến hiệu suất chiết tách các hợp chất gây ngọt đã cho thấy ảnh hưởng của các thông số khảo sát lên các đáp ứng là có ý nghĩa (p<0,05). Bên cạnh đó cũng đã xây dựng được các mô hình bề mặt của từng đáp ứng thể hiện theo từng cặp thông số khảo sát, và thiết lập phương trình bề mặt của

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

từng đáp ứng. Từ kết quả phân tích ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát lên các đáp ứng, các thông số tối ưu đã được thiết lập dựa trên giản đồ tối ưu với cơ sở là làm cực đại các đáp ứng.

Điều kiện chiết tách kiến nghị cho nguồn nguyên liệu Hải Hưng là hệ dung môi (cồn, nước) 6,51%, nhiệt độ chiết 64,03 oC, thời gian chiết 44,45 phút với tỉ lệ DM/NL là 55; khi đó thu được lượng cao tổng là 1,84g và lượng cao BuOH là 0,22g.

5.2.

Đề nghị

Dựa trên những kết quả thu được, chúng tôi đề nghị một số hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm đạt được những kết quả có thể triển khai trong quy mô công nghiệp: (i). Khảo sát các vùng nguyên liệu ở Việt Nam, tiến hành khảo sát các điều kiện chiết tách phù hợp với từng vùng nguyên liệu.

(ii). Để tăng tính chính xác của thực nghiệm, nên dùng HPLC để kiểm tra hiệu suất chiết.

(iii). Khảo sát quy trình kết tinh hoạt chất từ dịch trích của cây cỏ ngọt. (iv). Tiến hành tiếp sắc ký cột để khảo sát và tinh chế các chất gây ngọt như stevioside, rebaudioside A…. (v). Thử nghiệm với các qui trình khác “sạch” hơn,có tính ứng dụng vào sản xuất cao hơn[33][31].

50

TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG ANH [1]. Jan.M.C.Genus, March 2001. Stevia rebaudiana - A sweetsimple story.

Kasteekpark Arenberg.

[2]. Sweetening agent: Stevioside. Food Standards Agency, London [3]. Scientific Committee on Food, 1999. Opinion on Stevioside as a sweetener.

[4]. Jan .M.C.Genus, 2003. Stevioside. Catholic University of Leuven, Belgium.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

[5]. Jaroslav Pol, Elena Varadova Ostra, Pavel Karasek Michal Roth, 2007.

Comparison of two different solvents employed for pressurised fluid extraction of stevioside from Stevia Rebaudiana: methanol vernus water. Institute of Analytical Chemical, Czech Republic.

[6]. Harriet Wallin, 2004. Steviol Glycosides. Chemical and Technical Assessment, FAO

[7]. A.Passquel, M.A.A Mereless, M.O.M. Marques, A.J.Peterate, 2000. Extraction of Stevia Glycosides, with CO2+water,CO2 +Ethanol, and CO2+water+Ethanol.

Braz.J.Chem.Eng.vol17.n.3.Sao Paulo Sept.

[8]. I.C.C Mantovaneli, E.C. Ferreti, M.R.Simoes, C.Ferreira da Silva, 2004. The effect of temperature and flow rate on the Clarification of the Aqueous Stevia extract in the fixed-bed column with Zeolites. Brazillian Journal of Chemical Engineering.

[9]. Antonio S.Dacome, Ceeuza .C.da Silva, Cecilia E.M. da Costa, Jose D.Fontana, Julinana Adelmann, Silvia Claudio da Costa, 2005. Sweet diterpenic glucosides balance of a new cultivar of Stevia Rebaudiana Bertoni: Isolation and quantitative distribution by Chromatographic, Spectroscopic and Electrophoretic methods.

Elsevier.

[10]. Andrew H.Rank, David J.Midmore, 2006. Stevia-An intense, natural sweetener.

Rural Industries Research and Development Corporation.

[11]. A.Douglas Kinghorn, 2002. The genus Stevia, vol.19.University of Illinois at Chicago, USA. [12]. S.M.Savita,

K.

Sheela,

Sharan

Sunanda,

A.G.Shankar

and

Parama

RamaKrishma, 2004. Stevia Rebaudiana - A Functional Component for Food Industry.Kamla –Raj. 51

[13]. Hitoshi Shibatam , Yoshihiro Sawa, Taka-aki Oka, Satoni Sonoke, Keun Ki Kim,

and

Masahara

Yoshioka,

1995.

Steviol

and

Steviol

Glycoside:

Glucosyltransferase Activities in Stevia Rebaudiana Bertoni-Purification and Partial Charaterization. Japan.

[14]. Ludmila Bovanova, Eva Brandsterterova, Stanislav Baxa, 1998. HPLC determination of stevioside in plant material and food samples. Slovakia.

[15]. Young Hae Choi, Inkyum Kim, Kee Dong Yoon, So Jin Hee, Chul Young Kim,

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Ki-Pung Yoo, Jinwoong Kim, 2002. Supercritical Fluid Extraction and Liquid Chromatographic-Electrospray Mass Spectrometric Analysis of Stevioside from Stevia rabaudiana Leaves. Korea.

[16]. Scientific Committee on Food, 1999. Opinion on Stevia Rebaudiana Bertoni plants and trees.

[17]. M.B.Tadhani, V.H. Patel, Rema Subhash, 2007. In vitro antioxidant activities of Stevia rebaudiana leaves and callus. Journal of food composition and analysis.

[18]. G.I. Kovylyaeva, G.A.Bakaleinik, I.Yu. Strobykina.et.al., 2007. Glycosides from Stevia rebaudiana. Chemistry of Natural Compounds.

[19]. Vikas Jaitak, A.P. Gupta, V.K.Kaul and P.S.Ahuja, 2007. Validated highperformance thin-layer chromatography method for steviol glycosides in Stevia rebaudiana. Institute of Himalayan Bioresoure Technology(CSIR), India.

[20]. Manfred Kroger, Kathleen Meister, and Ruth Kava, 2006. Low- calorie sweeteners and others sugar substitutes: A review of the safety issues.New York.

[21]. Jenny Hawke, March 2003. The Bittersweet Story of the Stevia Herb. Exploring Issues of Philosophy, Principle and Conscience in Contemporary Health Care, Australia.

[22]. Manish B. Tadhani and Rema Subhash, June 2006. Research Article : In Vitro Antimicrobial Activity of Stevia Rebaudiana Bertoni Leaves. Food Biotechnology Laboratory, Post Graduate Department of Home Science, Sardar Patel University, Vallabh Vidyanagar-388 120 Gujarat, India.

[23]. Giuseppina Paola Parpmello, Andrea Versari, Massimo Castellari and Sergio Galassi, June 8, 2000. Stevioside as a replacement of sucrose in peach juice: sensory evaluation. Italy.

52

[24]. S.M. Savita, K. Sheela, Sharan Sunanda, A.G. Shankar, Parama Ramakrishna and Srinivas Sakey, 2004. Health Implications of Stevia rebaudiana. India.

[25]. David J Midmore and Andrew H Rank, August 2002. A new rural industryStevia- replace imported chemical sweeteners. A report for the Rural Industries Research and Development Corporation. Rural Industries Research and Development Corporation.

[26]. Food standards Australia New Zealandc (FSANZ), 7 December 2005. Initial

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

assessment report application: Steviol glycosides as intense sweeteners.

[27]. N. W. Megeji, J. K. Kumar, Virendra Singh, V. K. Kaul* and P. S. Ahuja, March 2005. Introducing Stevia rebaudiana, a natural zero-calorie sweetener.

Institute of Himalayan Bioresource Technology, India.

[28]. S. Cîntă Pînzaru, N. Leopold, N. Peica and W. Kiefer, 2006. Monitoring the sweetener content in leaves of Stevia rebaudiana plant using raman and sers spectroscopy.

[29]. Varuzhan H. Abelyan, Negeri Sembilan, et al, 2006. Extraction, separation and modification of sweet glycosides from the Stevia rebaudiana plant. United States Patent.

[30]. Jim Brandle, Alex Richman, 2008. Compositions and methods for producing steviol and steviol glycosides. United States Patent Application Publication.

[31]. Jackson at al. High yield method of producing pure rebaudioside A. United States Patent, 4/2006

[32]. Morita et al, April 1978. Sweetening compound, method of recovery, and use thereof. United States Patent.

[33]. Magomet et al, April 2007. Process for manufacturing a sweetner and use thereof. United States Patent.

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [34]. Phạm Thị Thục. Cây cỏ ngọt hay sức khỏe hòang gia. Báo Sức khỏe và Đời sống, số 280 [35]. Lâm Thúy Huyền, 2008. Bước đầu xây dựng qui trình chiết xuất Stevioside từ cây cỏ ngọt. Luận văn tốt nghiệp ngành kỹ thuật hữu cơ, Đại học Bách Khoa, TP.Hồ Chí Minh.

53

[36]. Nguyễn Thanh Thảo, 2005.Khả năng trích ly các chất hòa tan từ cây cỏ ngọt.

Luận văn tốt nghiệp Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, ĐH Nông Lâm.

[37]. Đỗ Trung Đàm, Đỗ Thị Phương, Nguyễn Kim Cẩn, 2006. Chiết suất steviosid từ cỏ ngọt trồng ở Việt Nam. Tạp chí dược học, số 11.

TÀI LIỆU TỪ INTERNET [38]. http://en.wiki pedia.org/wiki/stevia [39]. http://www.healthyshopping.com/stores/cart.asp?itemnumber=SL_Special_1

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

[40]. http://www.healthyshopping.com/stores/cart.asp?itemnumber=STV_WP [41]. http://www.stevia.net/index.htm

[42]. http://www.kuleuven.ac.be/bio/biofys/index.htm [43]. http://www.jasmineCorp.net

[44]. http://www.henriettesherbal.com

54

PHỤ LỤC Phụ lục 1:

Thành phần các hợp chất không gây ngọt[11]

Loại hợp chất

Thành phần Austroinulin (12)

Bộ phận trên cây

Tỉ lệ % theo khối lượng lá khô (w/w)

Lá

0.0600

Hoa Lá 6-O- Acetylaustroinulin (13)

Hoa Hoa

7-O-Acetylaustroinulin (14) Jhanol (11)

0.1800 0.0800 0.0400

Sterebin A (15)

Lá

0.0010

Sterebin B (16)

Lá

0.0009

Sterebin C (17)

Lá

0.0003

Sterebin D (18)

Lá

0.0004

Lá

Sterebin E (19)

Sterol

0.0020

Sterebin F (20)

Lá

0.0030

Sterebin G (21)

Lá

0.0002

Sterebin H (22)

Lá

0.0002

Gibberellin A20

Lá/Thân

0.0000001

Lá

Apigenin 4'-O-glucoside (30)

Flavonoid

0.0060

Hoa

Labdane

Other

0.1500

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Lá

0.2100

0.0100

Apigenin 7-O-glucoside (cosmosiin) (37)

Lá

ns

Kaempferol 3-O-rhamnoside (31)

Lá

0.0080

Lutcolin 7-O-glucoside (32)

Lá

0.0090

Quercetin 3-O-arabinose (33)

Lá

ns

Quercetin 3-O-glucoside (34)

Lá

ns

Quercetin 3-O-rhamnoside (quercetrin) (35)

Lá

ns

Quercetin 3-O-rutinoside(rutin)(38)

culture

5,7,3'-Trihydroxy 3,6,4'trimethoxyflavone(centaureidin)(36)

Lá

Campesterol (27)

ns

ns

β-Sitosterol (25)

ns

ns

β-Sitosterol β-D-glucoside (28)

ns Lá

ns

Stigmasterol (26)

culture Lá

Stigmasterol β-D-glucoside (29)

55

0.0007 0.01

ns 0.001 ns

Thành phần các hợp chất không gây ngọt (tiếp theo) Bộ phận trên cây

Tỉ lệ % theo khối lượng lá khô (w/w) ns

Lupeol

Lá Lá

ns

Lupeol 3-palmitae (24)

ns

0.1

Lupeol esters

Lá

ns

β-Carotene

ns

ns

Chlorophyll A

ns

ns

Chlorophyll B

ns

ns

Citric acid

ns

0.5350

Formic acid

0.8710

Glucose

ns Lá

Indole-3-acetonitrile

Hạt

ns

Lactic acid

ns

0.2600

Maltic acid

ns

0.1880

Succinic acid

0.4000

Sucrose

ns Lá

Tannins

Lá

7.8000

Tartaric acid

ns

1.7150

Calcium

0.2100

Fluoride

ns Lá

Iron

ns

0.0850

Magnesium

ns

0.2890

Phosphorus

ns

0.0980

Potassium

ns

2.6000

Sodium

ns

0.0310

Loại hợp chất

Thành phần β-Amyrin acetate (23)

Triterpenoid

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Miscellaneous

Organic

Inoragic

Essential oil

ns

ns

0.0012

Zins ns 0.0026 Phần trăm khối lượng (w/w) của tinh dầu trong cây cỏ ngọt khô là 0.12 Phần trăm khối lượng (w/w) của tinh dầu trong hoa cỏ ngọt khô là 0.43 Phần trăm khối lượng (w/w) của tinh dầu trong lá cỏ ngọt khô là 0.025

56

Thành phần các hợp chất của tinh dầu (essential oil )[11] Loại hợp chất

Thành phần

Tỉ lệ % theo khối lượng (w/w) cỏ khô/hoa khô

Borneol

ns

Camphor

0.0017 [0.0017]

Carvacrol

ns 0.0008 [0.0009]

p-Cymene

0.0008 [0.002]

Geraniol

0.0016 [0.0009]

Limonene

0.0001 [0.003]

Linalool

0.0067 [0.0129]

cis-Linalool oxide

0.0026 [0.0004]

trans- Linalool oxide

0.0029 [0.0004]

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1,8-Cineole

Monoterpen

Sesquiterpene

Myrcene

ns

Myrtenal

ns

Myrtenol

ns

α-Pinene

0.0005 [0.0004]

β-Pinene

0.002 [0.007]

Pinocarveol

ns

Pinocarvone

ns

Sabinene

ns

γ-Terpinene

0.0002 [0.0009]

Terpinene-4-ol

0.0012 [0.0172]

α-Terpineol

0.0054 [0.0034]

Terpinolene

ns

trans-Verbenol

ns

α-Berganmotene

ns

Bisabolene

ns

β-Bourbonere

ns

γ-Cadinene

0.0034 [0.0082]

δ-Cadinene

0.0012 [0.0172]

α-Cadinol

0.0017 [0.0065]

tert-Cadinol

0.0028 [0.0060]

α-Calacorene

0.0024 [0.0004]

Calamenene

0.0018 [0.0004]

β-Caryophyllene

0.0013 [0.0149]

Caryophyllene oxide

0.0188 [0.0267]

α-Copaene

0.0001 [0.0026]

57

Thành phần các hợp chất của tinh dầu (essential oil )(tiếp theo) Loại hợp chất

Thành phần

Tỉ lệ % theo khối lượng (w/w) cỏ khô/hoa khô

α-Cubebene

0.0001 [0.0017]

β-Cubenene

ns

β-Elemene

0.0006 [0.0108]

γ-Elemene

ns

trans-β-Farnesene

0.0008 [0.0344]

Sesquiterpene Germaerene D

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

ns

α-Humulene

0.0029 [0.0262]

β-Ionone

ns

Epoxy-β-ionone

ns

Nerolidol

0.0088 [0.0331]

β-Selinene

0.0029 [0.0043]

Sparhulenol

ns

Torreyol

ns

Anethole

ns

Benzyl alcohol

0.0012 [0.0004]

Cuminic aldehyde

ns

Eugenol

ns

n-Hexanal

Miscellaneous

0.001 [0.0004]

cis-Hex-3-en-1-ol

ns

trans-Hex-2-en-1-ol

ns

Hex-3-enyl acetate

ns

Hex-3-enyl-2-methyl-butanoate

ns

Hexan-1-ol

0.9

Methyleugenol

ns

Octa-2,3-dione

ns

Octan-3-ol

0.0004 [0.0009]

Oct-1-en-3-ol

0.0008 [0.0146]

Pentanoic acid

ns

2-Pentylfuran

ns

Phenylethyl valetate

ns

58

Phụ lục 2:

Cấu trúc của các hợp chất không gây ngọt[11]

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Phụ lục 2.1: Cấu trúc của các labdane-type diterpenes được cô lập từ cây cỏ ngọt

59

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Phụ lục 2.2: Cấu trúc của các triterpenes và sterols được cô lập từ cây cỏ ngọt

60

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Phụ lục 2.3: Cấu trúc của các flavonoids được cô lập từ cây cỏ ngọt

61

Phụ lục 3:

Kết quả xử lý số liệu bằng JMP 4.0

Phụ lục 3.1: Response Cao tong Least Square Fit Actual by Predicted Plot

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

cao tong Actual

1.8

1.76

1.72

1.68 1.68

1.70

1.72

1.74

1.76

1.78

1.80

cao tong Predicted P<.0001 RSq=0.86 RMSE=0.0108

Summary of Fit

RSquare RSquare Adj Root Mean Square Error Mean of Response Observations (or Sum Wgts)

0.856256 0.804655 0.010757 1.73963 54

Analysis of Variance Source Model Error C. Total

Sum of Squares 0.02688009 0.00451250 0.03139259

DF 14 39 53

Mean Square 0.001920 0.000116

F Ratio 16.5940 Prob > F <.0001

Lack Of Fit Source Lack Of Fit Pure Error Total Error

DF 10 29 39

Sum of Squares 0.00161250 0.00290000 0.00451250

Mean Square 0.000161 0.000100

62

F Ratio 1.6125 Prob > F 0.1525 Max RSq 0.9076

1.82

Parameter Estimates Estimate 1.73 0.005625 -0.006042 0.008125 0.0002083 0.0015625 -0.005313 -0.008438 -0.003438 0.0134375 -0.015938 0.0056771 0.0000521 -0.000573 0.0056771

Std Error 0.004391 0.001553 0.001553 0.001553 0.001553 0.001902 0.001902 0.001902 0.001902 0.001902 0.001902 0.001647 0.001647 0.001647 0.001647

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Term Intercept he dung moi(-1,1)&RS nhiet do chiet(-1,1)&RS thoi gian chiet(-1,1)&RS ti le(-1,1)&RS he dung moi(-1,1)*nhiet do chiet(-1,1) he dung moi(-1,1)*thoi gian chiet(-1,1) nhiet do chiet(-1,1)*thoi gian chiet(-1,1) he dung moi(-1,1)*ti le(-1,1) nhiet do chiet(-1,1)*ti le(-1,1) thoi gian chiet(-1,1)*ti le(-1,1) he dung moi(-1,1)*he dung moi(-1,1) nhiet do chiet(-1,1)*nhiet do chiet(-1,1) thoi gian chiet(-1,1)*thoi gian chiet(-1,1) ti le(-1,1)*ti le(-1,1)

t Ratio 393.95 3.62 -3.89 5.23 0.13 0.82 -2.79 -4.44 -1.81 7.07 -8.38 3.45 0.03 -0.35 3.45

Prob>|t| <.0001 0.0008 0.0004 <.0001 0.8939 0.4162 0.0080 <.0001 0.0784 <.0001 <.0001 0.0014 0.9749 0.7298 0.0014

Effect Tests

Source he dung moi(-1,1)&RS nhiet do chiet(-1,1)&RS thoi gian chiet(-1,1)&RS ti le(-1,1)&RS he dung moi(-1,1)*nhiet do chiet(-1,1) he dung moi(-1,1)*thoi gian chiet(-1,1) nhiet do chiet(-1,1)*thoi gian chiet(-1,1) he dung moi(-1,1)*ti le(-1,1) nhiet do chiet(-1,1)*ti le(-1,1) thoi gian chiet(-1,1)*ti le(-1,1) he dung moi(-1,1)*he dung moi(-1,1) nhiet do chiet(-1,1)*nhiet do chiet(-1,1) thoi gian chiet(-1,1)*thoi gian chiet(-1,1) ti le(-1,1)*ti le(-1,1)

Nparm 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

DF 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Sum of Squares 0.00151875 0.00175208 0.00316875 0.00000208 0.00007812 0.00090313 0.00227813 0.00037813 0.00577813 0.00812813 0.00137512 0.00000012 0.00001400 0.00137512

F Ratio 13.1260 15.1427 27.3864 0.0180 0.6752 7.8054 19.6891 3.2680 49.9384 70.2486 11.8847 0.0010 0.1210 11.8847

Prob > F 0.0008 0.0004 <.0001 0.8939 0.4162 0.0080 <.0001 0.0784 <.0001 <.0001 0.0014 0.9749 0.7298 0.0014

Response Surface Coef

he dung moi(-1,1) nhiet do chiet(-1,1) thoi gian chiet(-1,1) ti le(-1,1)

he dung moi(-1,1) 0.0056771 . . .

nhiet do chiet(1,1) 0.0015625 0.0000521 . .

Solution

Variable Critical Value he dung moi(-1,1) -0.121587 nhiet do chiet(-1,1) -0.24112 thoi gian chiet(-1,1) 0.3034646 ti le(-1,1) 0.6561671 Solution is a SaddlePoint Predicted Value at Solution 1.7316876

63

thoi gian chiet(-1,1) -0.005313 -0.008438 -0.000573 .

ti le(-1,1)

cao tong

-0.003438 0.0134375 -0.015938 0.0056771

0.005625 -0.006042 0.008125 0.0002083

Interaction Profiles

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Scaled Estimates

64

Phụ lục 3.2: Response Cao BuOH Least Square Fit Actual by Predicted Plot

0.16

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

cao BuOH Actual

0.2

0.12

0.08

.08

.10

.12

.14

.16

.18

cao BuOH Predicted P<.0001 RSq=0.82 RMSE=0.0107

Summary of Fit

RSquare RSquare Adj Root Mean Square Error Mean of Response Observations (or Sum Wgts)

0.823565 0.760229 0.010737 0.118519 54

Analysis of Variance Source Model Error C. Total

Sum of Squares 0.02098565 0.00449583 0.02548148

DF 14 39 53

Mean Square 0.001499 0.000115

F Ratio 13.0032 Prob > F <.0001

Lack Of Fit Source Lack Of Fit Pure Error Total Error

DF 10 29 39

Sum of Squares 0.00076250 0.00373333 0.00449583

Mean Square 0.000076 0.000129

65

F Ratio 0.5923 Prob > F 0.8069 Max RSq 0.8535

.20

Parameter Estimates Estimate 0.1116667 -0.004375 -0.005625 0.013125 -0.006875 -0.002812 -0.003437 -0.005937 0.0034375 0.0059375 -0.009687 0.0041146 -0.00151 0.0009896 0.0041146

Std Error 0.004383 0.00155 0.00155 0.00155 0.00155 0.001898 0.001898 0.001898 0.001898 0.001898 0.001898 0.001644 0.001644 0.001644 0.001644

t Ratio 25.48 -2.82 -3.63 8.47 -4.44 -1.48 -1.81 -3.13 1.81 3.13 -5.10 2.50 -0.92 0.60 2.50

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Term Intercept he dung moi(-1,1)&RS nhiet do chiet(-1,1)&RS thoi gian chiet(-1,1)&RS ti le(-1,1)&RS he dung moi(-1,1)*nhiet do chiet(-1,1) he dung moi(-1,1)*thoi gian chiet(-1,1) nhiet do chiet(-1,1)*thoi gian chiet(-1,1) he dung moi(-1,1)*ti le(-1,1) nhiet do chiet(-1,1)*ti le(-1,1) thoi gian chiet(-1,1)*ti le(-1,1) he dung moi(-1,1)*he dung moi(-1,1) nhiet do chiet(-1,1)*nhiet do chiet(-1,1) thoi gian chiet(-1,1)*thoi gian chiet(-1,1) ti le(-1,1)*ti le(-1,1)

Prob>|t| <.0001 0.0075 0.0008 <.0001 <.0001 0.1464 0.0778 0.0033 0.0778 0.0033 <.0001 0.0166 0.3638 0.5506 0.0166

Effect Tests

Source he dung moi(-1,1)&RS nhiet do chiet(-1,1)&RS thoi gian chiet(-1,1)&RS ti le(-1,1)&RS he dung moi(-1,1)*nhiet do chiet(-1,1) he dung moi(-1,1)*thoi gian chiet(-1,1) nhiet do chiet(-1,1)*thoi gian chiet(-1,1) he dung moi(-1,1)*ti le(-1,1) nhiet do chiet(-1,1)*ti le(-1,1) thoi gian chiet(-1,1)*ti le(-1,1) he dung moi(-1,1)*he dung moi(-1,1) nhiet do chiet(-1,1)*nhiet do chiet(-1,1) thoi gian chiet(-1,1)*thoi gian chiet(-1,1) ti le(-1,1)*ti le(-1,1)

Nparm 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

DF 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Sum of Squares 0.00091875 0.00151875 0.00826875 0.00226875 0.00025312 0.00037812 0.00112812 0.00037813 0.00112813 0.00300312 0.00072234 0.00009734 0.00004178 0.00072234

F Ratio 7.9699 13.1747 71.7289 19.6807 2.1958 3.2801 9.7861 3.2801 9.7861 26.0512 6.2661 0.8444 0.3624 6.2661

Prob > F 0.0075 0.0008 <.0001 <.0001 0.1464 0.0778 0.0033 0.0778 0.0033 <.0001 0.0166 0.3638 0.5506 0.0166

Response Surface Coef

he dung moi(-1,1) nhiet do chiet(-1,1) thoi gian chiet(-1,1) ti le(-1,1)

he dung moi(-1,1) 0.0041146 . . .

nhiet do chiet(-1,1) -0.002812 -0.00151 . .

Solution

Variable Critical Value he dung moi(-1,1) 0.1037762 nhiet do chiet(-1,1) -0.089744 thoi gian chiet(-1,1) 0.530544 ti le(-1,1) 1.4814102 Solution is a SaddlePoint Predicted Value at Solution 0.1100814

66

thoi gian chiet(-1,1) -0.003437 -0.005937 0.0009896 .

ti le(-1,1)

cao BuOH

0.0034375 0.0059375 -0.009687 0.0041146

-0.004375 -0.005625 0.013125 -0.006875

Interaction Profiles

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Scaled Estimates

67

Phụ lục 3.3: Prediction Profiler

Prediction Profiler

1.73

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

cao tong

1.81

1.69

0.111667

he dung moi(5,15)

nhiet do chiet(65,75)

68

thoi gian chiet(20,40)

1.75

1.95

1.55

30

50

70

10

80

60

10

20

0.0776

0

cao BuOH

0.19

ti le NL/DM(1.65,1.85)

Prediction Profiler (Maximize Desirability).

0.0614

1 0 -2

Desirability

1

-0.6976

-0.5938

1.44541

-2

he dung moi(-1,1)

nhiet do chiet(-1,1)

thoi gian chiet(-1,1)

ti le(-1,1)

69

1

0.218024

0

cao BuOH

0.283

2

1.6407

D ẠY -2 d ay KÈ ke M m Q qu UY yn N 2 ho H -2 nb ƠN us O in F es F s@ ICI 2 gm AL -2 ai ST l.c &G om T

1.835762

2

cao tong

1.933

Desirability

Phụ lục 3.4: Contour Profiler (i). Contour Profiler (Nhiệt độ chiết & Thời gian chiết) Horiz

Vert

Factor

Current X

he dung moi(-1,1) nhiet do chiet(-1,1) thoi gian chiet(-1,1) ti le(-1,1) Response

Current Y

Lo Limit

1.75 1.8357638 0.135 0.2180247

. .

Hi Limit . .

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

cao tong cao BuOH

Contour

-0.6976 -0.5938 1.44541 -2

2

cao tong

cao tong

thoi gian chiet(-1,1)

cao BuOH

thoi gian chiet(-1,1) 0

nhiet do chiet(-1,1)

-2

cao BuOH

-2

nhiet do chiet(-1,1)

2

thoi gian chiet(-1,1) 0

70

nhiet do chiet(-1,1)

(ii). Contour Profiler (Nhiệt độ chiết& Tỉ lệ ngliệu/dmôi) Horiz

Vert

Factor

Current X

he dung moi(-1,1) nhiet do chiet(-1,1) thoi gian chiet(-1,1) ti le(-1,1) Response

Current Y

Lo Limit

1.75 1.8357638 0.135 0.2180247

. .

Hi Limit . .

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

cao tong cao BuOH

Contour

-0.6976 -0.5938 1.44541 -2

ti le(-1,1)

2

cao tong

ti le(-1,1) 0

-2

cao BuOH

nhiet do chiet(-1,1)

cao BuOH

cao tong

-2

nhiet do chiet(-1,1)

2

ti le(-1,1) 0

71

nhiet do chiet(-1,1)

(iii).

Contour Profiler (Thời gian chiết & Tỉ lệ ngliệu/dmôi)

Horiz

Vert

Factor

Current X

he dung moi(-1,1) nhiet do chiet(-1,1) thoi gian chiet(-1,1) ti le(-1,1) Response

Current Y

Lo Limit

1.75 1.8357638 0.135 0.2180247

. .

Hi Limit . .

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

cao tong cao BuOH

Contour

-0.6976 -0.5938 1.44541 -2

2

cao tong

cao BuOH

ti le(-1,1)

cao tong

ti le(-1,1) 0

thoi gian chiet(-1,1)

-2

cao BuOH

-2

thoi gian chiet(-1,1)

2

ti le(-1,1) 0

72

thoi gian chiet(-1,1)

Phụ lục 4:

Tóm tắt “ Bước đầu xây dựng qui trình chiết xuất stevioside

từ cây cỏ ngọt” [35] Tác giả đã khảo sát qui trình chiết theo 5 yếu tố: loại dung môi chiết, hệ dung môi chiết, nhiệt độ chiết, thời gian chiết và tỉ lệ nguyên liệu/dung môi.

Các thông số đã được tác giả khảo sát:  Loại dung môi chiết: EtOAc, Me2CO, MeOH, Cồn 95o, H2O  Hệ dung môi chiết (cồn, nước): H2O, cồn 20, cồn 40, cồn 60 và cồn 80

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

 Nhiệt độ chiết: 50 oC, 60 oC, 70 oC ,80 oC  Thời gian chiết: 15 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút

 Tỉ lệ nguyên liệu chiết/ dung môi chiết: 1/60, 1/75,1/90, 1/105

Phần kết luận, tác giả đã chọn được điều kiện chiết tốt nhất trong phạm vi khảo sát :  Hệ dung môi chiết cồn 20  Nhiệt độ chiết 70 oC

 Thời gian chiết 15 phút

 Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/75

73