Kiểm Nghiệm Hóa Thực Phẩm - PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Mai

Kiểm Nghiệm Hóa Thực Phẩm Người trình bày: PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Mai

1

Chương Mở đầu 1.Giới thiệu chung 1.1. Ý nghĩa và mục đích của công tác kiểm nghiệm lương thực, thực phẩm 1.2. Hệ thống kiểm nghiệm và quản lí chất lượng lương thực và thực phẩm.

2.Nguyên tắc lấy mẫu, gửi mẫu và chuẩn bị mẫu 2.1.Lấy mẫu 2.2.Chuẩn bị mẫu và xử lý mẫu 2

1.Giới thiệu chung 1.1. Ý nghĩa và mục đích của công tác kiểm nghiệm lương thực, thực phẩm • Có vai trò rất quan trọng đối với cuộc sống của con người ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe tuổi thọ và môi trường sống.

• Sử dụng thực phẩm có nhiều mục đích khác nhau,chủ yếu là đáp ứng nhu cầu về dinh dưỡng để tạo ra sức lao động.

Ngoài ra, còn có nhu cầu chữa bệnh và giải trí.

• Thực phẩm tốt và có chất lượng được hiểu rằng nó phải bảo đảm các yêu cầu chủ yếu sau: - Tính an toàn và vệ sinh thực phẩm - Tính bổ dưỡng - Tính đặc thù - Tính hấp dẫn 3

• Để bảo đảm chất lượng thực phẩm ở bất cứ quốc gia nào cũng đều có những quy định luật pháp và văn bản hướng dẫn thực hiện (nhà quản lí, người sản xuất kinh doanh, người tiêu dùng) phải tuân theo để bảo đảm an toàn cho cá thể từng người và an toàn cho toàn cộng đồng, giữ gìn sự kinh doanh lành mạnh.

• Nhằm quản lí được chất lượng lương thực thực phẩm góp phần bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng ,ổn định trật tự xã hội đó chính là ý nghĩa và mục đích của công tác kiểm nghiệm.

• Công tác kiểm tra chất lượng và an toàn vệ sinh thực phẩm gồm: - Kiểm nghiệm các chỉ tiêu lý hóa.

- Kiểm nghiệm vi sinh.

- Kiểm nghiệm bằng phép cảm quan Để đánh giá toàn diện về chất lượng của TP thì phải kết hợp cả ba khâu trên. Như vậy KNTP các chỉ tiêu lý hóa chỉ là một trong các khâu mà thôi 4

1.2. Hệ thống kiểm nghiệm và quản lí chất lượng lương thực và thực phẩm • Việc kiểm nghiệm và quản lí chất lượng lương thực, thực phẩm liên quan đến nhiều bộ ngành.

-Bộ y tế bao gồm cả thú y -Bộ công thương -Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn -Bộ thủy hải sản -Bộ khoa học công nghệ và môi trường • Việc quản lí và kiểm tra chất lượng hiện được tách thành hai bộ phận hoạt động độc lập: - Việc kiểm nghiệm có thể thực hiện ở các viện, các trung tâm phân tích bao gồm cả cac công ty nước ngoài, các cục, các chi cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng. Ở nhà máy còn có các phòng thí nghiệm kiểm tra chất lượng sản phẩm gọi tăt là.

5

- Về mặt quản lí nhà nước theo pháp quy văn bản của từng bộ hoặc liên bộ theo. TCVN hoàc QCVN để quản lí chất lượng thực phẩm thường thực hiện theo các hệ thống sau: • CAC (codex alimentarius commission), hội đồng luật thực phẩm thế giới • JECFA (Joint FAO/ WHO expert commission on food additives), hội đồng chuyên gia phối hợp của FAO/ WHO về PGTP • HACCP (Hazard analysis and critical control point) hệ thống kiểm soát toàn diện của tp dựa trên hệ thống giám sát chất lượng ISO • GMP (Good Manufacturing Practice) qui phạm trong sản xuất • GAP (Good Agricultural Practice) • Các tiêu chuẩn nước ngoài như: • ISO (International Standard organization) • AOAC (association of official analytical chemist) • NF (norme francaise homologuee) • DIN (Deutsch International Normen) 6

2.Nguyên tắc lấy mẫu, gửi mẫu và chuẩn bị mẫu 2.1.Lấy mẫu • Xác định phẩm chất bằng cảm quan và phân tích trong PTN là khâu đầu tiên và rất quan trọng. Việc lấy mẫu đúng qui cách sẽ góp phần chính xác cho kết quả kiểm nghiệm và xử lý xác thực về sau.

• Yêu cầu về lấy mẫu: - Mẫu phải có đủ tính chất đại diện cho một lô hàng thực phẩm đồng nhất.

- Đồng nhất là những sản phẩm cùng tên gọi, cùng một loại phẩm chất đựng trong cùng bao bì có một kiểu, kích cỡ như nhau được sản xuất trong cùng một ngày hoặc nhiều ngày theo cùng một quy trình công nghệ.

7

- Mẫu trung bình phải có đủ tính chất đồng nhất. Mẫu trung bình được lấy ở đều các góc ở phía trên phía dưới ở giữa và được trộn đều. Tỉ lệ lấy mẫu từ 0.5 -1%, không được ít hơn số lượng cần để thử nghiệm.

- Cách lấy mẫu trung bình: ✓Thực phẩm lỏng đồng nhất nước mắm, nước chấm, rượu bia, nước ngọt.... ✓Thực phẩm ở dạng nguyên liệu ở thể rắn như gạo, bột, trà, cà phê, thuốc lá,... ✓Thực phẩm đóng gói dưới dạng đơn vị như hộp, chai, lọ....

Lấy giữ nguyên bao bì -Sau khi lấy mẫu trung bình thì cần phải trộn đều.

8

-Lượng thực phẩm tối thiểu cần thiết để kiểm nghiệm hóa học • • • • • • • • • • • • •

Thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt Cá, tôm, cua Trứng Nước mắm, nước chấm, dấm chua Sữa tươi Dầu mỡ Rượu các loại Bia Gạo, bột và các sản phẩm chế biến Bánh, mứt, kẹo Gia vị, muối Phẩm màu Đồ hộp, nước giải khát đóng chai

250 – 500 g 250 – 500 g 5 – 10 quả 500 - 750 mL 500 - 750 mL 400 – 750 mL 750 – 1000 mL 500 – 750 mL 250 – 500 g 250 – 500 g 50 – 100 g 50 g 5 – 10 hộp/chai

Tùy theo yêu cầu kiểm nghiệm có thể lấy nhiều hay ít hơn.

9

PHỤ LỤC I LƯỢNG LẤY MẪU PHỤC VỤ KIỂM NGHIÊM Ban hành kèm theo TT số 14/2011/TT-BYT ngày 01 tháng 04 năm 2011

PHỤ LỤC I (Tiếp theo)

Ghi chú: Lượng mẫu tối thiếu là lượng mẫu đủ để kiểm nghiệm cho một chỉ tiêu của sản phẩm. Tùy thuộc vào mục đích kiểm nghiểm của thanh tra, kiểm tra chất lượng mẫu lấy có tăng hay giảm và sản phẩm không có trong danh mục trên, có thể lấy theo quyết định của Đoàn thanh tra.

PHỤ LỤC II PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU Ban hành kèm theo TT số 14/2011/TT-BYT ngày 01 tháng 04 năm 2011

PHỤ LỤC II (Tiếp theo) TCVN về lấy mẫu

Trên đây là số lượng cần thiết để kiểm nghiệm hóa học. Trường hợpkiểm nghiệm cả vi sinh thì phải lấy mẫu riêng, bảo đảm vô trùng và đựng trong những chai lọ thủy tinh sạch có nút nhám.

• Trên nhản cần ghi rõ: người lấy mẫu, ngày lấy mẫu, địa điểm lấy và các thông tin về mẩu đã lấy.

• Trường hợp thực phẩm phải gửi đi xa để kiểm nghiệm hoặc có nghi vấn tranh chấp cần phải đóng gói kỹ, niêm phong.

• Mẫu tự kiểm nghiệm hoặc gửi đi xa phải thực hiện trong thời gian mẫu còn tốt.

• Mẫu lấy kiểm nghiệm phải giữ lại bốn mươi phần trăm để làm đối chiếu khi có khiếu nại. Thời gian lưu mẫu từ một tuần đến ba tháng. Những mẫu thực phẩm dễ hư hỏng như thịt tươi, cá tươi, sữa tươi không cần lưu mẫu.

14

2.2.Chuẩn bị mẫu và xử lý mẫu 2.2.1 Phân loại mẫu 2.2.2. Chuẩn bị mẫu -Mẫu thực phẩm đồng nhất ở dạng đặc hoặc lỏng.

-Thực phẩm đặc hoặc lỏng không đồng nhất.

-Thực phẩm đặc và lỏng riêng biệt 2.2.3. Xử lý mẫu - Phương pháp ướt: Dùng các loại acid vô cơ, acid hữu cơ và các dung môi thích hợp để hòa tan và chiết xuất. Ngoài acid, người ta còn sử dụng thêm các chất oxy hóa như H2O2, KMnO4, K2Cr2O7…

- Phương pháp khô: Nung mẫu ở nhiệt độ cao có tẩm vài giọt acid hoặc nung mẫu với kiềm như Na2CO3 hoặc NaHCO3 và KHCO3 15

Chương 2: Kiểm nghiệm các chỉ tiêu chung và thành phần khoáng của thực phẩm 1. Độ ẩm 1.1 Định nghĩa: là lượng nước tự do có trong TP Biết được độ ẩm là điều quan trọng để đánh giá chất lượng dinh dưỡng và chế độ bảo quản.

• Về mặt dinh dưỡng: độ ẩm càng cao, giá trị dinh dưỡng càng thấp • Về mặt chất lượng: độ ẩm càng cao, chất lượng giảm do độ ẩm là môi trường thuận lợi để vi sinh vật và nấm mốc phát triển làm TP biến chất (do phản ứng có nước tham gia như thủy phân tinh bột làm TP mau chua) • Mỗi loại thực phẩm đều chứa một lượng nước ở mức giới hạn cho phép mà quá giới hạn này thì thực phẩm sẽ mau hư hỏng.

16

1.2 Phương pháp kiểm nghiệm 1.2.1 Phương pháp sấy khô 1.2.1.1 Nguyên lý: dùng sức nóng làm bay hết hơi nước trong TP, cân lượng TP trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong TP 1.2.1.2 Dụng cụ - Hóa chất: • Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ (đến 100 – 105oC hoặc130oC) • Cân phân tích, chính xác đến 0.0001gS • Nồi cách thủy • Bình hút ẩm, phía dưới chứa chất hút ẩm (H2SO4 đậm đặc, P2O5, silicagel, CaCl2 khan...)

Bình hút ẩm • Na2SO4 khan hoặc cát sạch 17

18

Ưu và nhược điểm: • Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện • Nhược điểm: ❖ Cho kết quả sai khi mẫu có chứa chất dễ bay hơi (tinh dầu, cồn, axit bay hơi, amoniac...) hoặc phân hủy thành fufurol ở các hợp chất chứa nhiều đường. ❖ Dễ bị oxy hóa khi gặp nhiệt độ cao ở các thực phẩm chứa nhiều chất béo → thực phẩm biến chất

19

Sấy khô bằng tia hồng ngoại, cân độ ẩm

20

21

1.2.2 Phương pháp chưng cất với dung môi Phạm vi áp dụng: xác định độ ẩm trong thực phẩm có chứa nhiều chất dễ bay hơi hoặc ở dạng hydrat.

1.2.2.1 Nguyên lý: dùng một dung môi hữu cơ có 3 đặc điểm sau để chưng cất: ❖ có độ sôi cao hơn nước một ít ❖ nhẹ hơn nước ❖ không trộn lẫn với nước Dung môi được trộn lẫn với TP, khi đun sôi dung môi bốc hơi và kéo theo nước của TP. Dung môi và nước gặp lạnh ngưng đọng lại ở ống đong có khắc độ chia thành 2 lớp riêng biệt (hình 1). Đọc thể tích nước lắng ở phần dưới từ đó tính ra phần trăm nước có trong TP. Dung môi thường dùng: Toluen (đs 110oC) Xylen (đs 136oC) 22

1.2.2.2 Dụng cụ - Hóa chất Bộ dụng cụ chưng cất (hình 1) gồm: Bình A: đựng dung môi hữu cơ và TP B: ống đo có khắc độ C: ống sinh hàn

23

24

1.2.3 Phương pháp Karl Fischer (1935) 1.2.3.1 Nguyên lý: ở nhiệt độ thường, iod kết hợp với nước và SO2 khan hình thành HI không màu theo phản ứng: I2 + SO2 + 2H2O ↔ 2HI + H2SO4 từ sự mất màu của iod tính ra phần trăm nước trong TP • Phản ứng trên là phản ứng thuận nghịch, muốn phản ứng diễn ra theo một chiều, ông Fischer tiến hành ở môi trường kiềm sử dụng pyridin SO2 + RN + CH3OH → RNH+SO3CH3H2O + I2 + RNH+SO3CH3- + 2RN → RNH+SO4CH3- + 2 RNH+IRN: pyridin CH3OH: dung môi 25

Ưu và nhược điểm của phương pháp Karl Fischer • Ưu điểm: 1. Thời gian xác định ngắn, có thể ghép nối với các thiết bị tự động nên có thể xác định hàng loạt 2. Xác định được nhiều đối tượng, đặc biệt những mẫu có chứa chất dễ bay hơi và nước nằm sâu bên trong 3. Có thể định lượng được từ lượng vết (~ ppm) đến 100% • Nhược điểm: Pyridin là một chất độc và có mùi khó chịu.

Cải tiến phương pháp Karl Fischer: Scholz (1980) đã thay pyridin bằng diethanolamin và sau đó là imidazol (1986). Ưu điểm của thuốc thử Scholz là: 1. Không có mùi khó chịu, không độc 2. Sự chuẩn độ cho kết quả lặp lại tốt, ổn định 3. Sản phẩm cuối bền 26

Trong phương pháp Karl Fischer xác định điểm cuối dựa vào lượng dư iod do đó có thể thực hiện bằng: - Phương pháp chuẩn độ (quan sát bằng mắt) - Phương pháp so màu - Phương pháp ampere Phương pháp chuẩn độ ampere Ở phương pháp này, người ta sử dụng cặp điện cực Pt (mỗi điện cực ~ 5mm2 x 2.5 cm) và một dòng điện phân cực ~ 100μA ở điện thế hiệu dụng ~ 200 mV. Khi phản ứng xảy ra hoàn toàn thì có sự thay đổi về tính chất điện hóa của dung dịch được nhận biết bởi điện cực. Khi đó xảy ra độ lệch của micro ampere kế hoặc bằng bộ cảm ứng dòng điện hoặc cảm ứng điện thế. Với các máy chuẩn độ tự động, sự thay đổi bất ngờ của dòng điện hoặc điện thế tại điểm cuối làm đóng van điều khiển lượng chất chuẩn sử dụng Tại điểm cuối khi dư I2 phản ứng điện cực sẽ là: Ở catod: I2 + 2e → 2IỞ anod: 2I- → I2 + 2e 27

Hình 2: Thiết bị chuẩn độ độ ẩm theo phương pháp Karl Fischer 28

• Mẫu có thể được chuẩn độ trực tiếp với thuốc thử hoặc chuẩn độ ngược lượng thuốc thử dư. Phương pháp chuẩn độ lượng thuốc thử dư được áp dụng rộng rãi và tránh được những khó khăn không lường được trước ở phép chuẩn độ trực tiếp khi trong mẫu có lượng nước gắn quá chặt hoặc nằm sâu bên trong TP.

• Sự chính xác của phương pháp phụ thuộc rất lớn vào việc loại bỏ nước trong không khí khỏi hệ thống chuẩn độ. Dung môi để hòa tan mẫu thường sử dụng là MeOH và chú ý loại bỏ nước trong MeOH để dung môi thật sự khan.

29

1.2.3.2 Hóa chất – Dụng cụ Dung dịch Karl Fischer: – Dung dịch I : I2 + MeOH – Dung dịch II : pyridin + SO2 + MeOH

Cách điều chế: •Trong bình tam giác chứa hỗn hợp gồm 670 mL MeOH + 170 mL pyridin + 125 g I2 , đậy nắp bình lại và làm nguội (dd I) •Dùng bình khắc độ 250 mL có chứa 100 mL pyridin, thổi một lượng SO2 khô vào bình cho tới thể tích 200 mL, bình được làm lạnh bằng nước đá (dd II).

•Thêm từ từ II vào I và lắc đều cho đến khi iod tan hoàn toàn dung dịch có màu vàng nâu, chuyển hỗn hợp vào buret tự động có gắn bộ phận hút ẩm chứa P2O5 hoặc CaCl2 khan.

30

• Để yên dung dịch trong 24h, trước khi sử dụng phải định chuẩn lại nồng độ của thuốc thử, 1mL thuốc thử mới pha tương đương khoảng 5mg nước.

• Dung dịch sẽ giảm dần nồng độ, do đó phải định chuẩn lại 1h trước khi sử dụng.

• Dung dịch cần tránh ánh sáng và bảo quản trong bình có màu tối.

• Thuốc thử Karl Fischer bán trên thị trường sẵn sàng để dùng, ổn định, hữu hiệu hơn là pha dung dịch như đã chỉ dẫn.

31

32

33

C. Xác định độ ẩm của mẫu 1. Chuẩn độ trực tiếp • Cho vào bình chuẩn độ ~ 35 – 40 mL MeOH, chuẩn độ với thuốc thử KF cho tới điểm cuối, không cần biết thể tích sử dụng (giai đoạn loại bỏ nước trong MeOH và trong hệ thống).

• Nhanh chóng chuyển một lượng mẫu đã được cân chính xác đến ± 0.1 mg có chứa từ 10 – 50 mg H2O vào bình chuẩn độ. Khuấy mạnh và chuẩn độ tiếp bằng thuốc thử đến điểm cuối • . Lượng nước của mẫu được tính:

VxFx100 VxF H 2 O(%) = = Wx1000 Wx10 • V,F : là thể tích và độ chuẩn của thuốc thử Karl Fischer

34

2. Chuẩn độ lượng dư • Giai đoạn loại nước giống như trên • Nhanh chóng chuyển một lượng mẫu đã được cân chính xác chứa từ 10 – 50 mg H2O, thêm vào chính xác một lượng thừa thuốc thử. Khuấy đều để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Chuẩn lượng thuốc thử dư bằng dung dịch H2O – MeOH đến điểm cuối.

• Trong đó

(VxF − V' xF' ) H 2 O(%) = Wx10

• V’,F’: là thể tích và độ chuẩn của thuốc thử H 2O-MeOH • V,F : là thể tích và độ chuẩn của thuốc thử Karl Fischer 35

2. Tro 2.1 Định nghĩa: Tro là thành phần còn lại của thực phẩm sau khi đã nung cháy hết các chất hữu cơ. Tro thật sự chỉ bao gồm các muối khoáng có trong thực phẩm → là tổng số muối khoáng (~ 50 nguyên tố: Ca, P, K, Cl, Na, Mg, Fe ~ 99.5%, 0.5% còn lại là Co, Ni, Al, Si, Zn, As, Mo, F, I, Mn…)

• Trong trường hợp thực phẩm nhiễm bẩn bởi cát đá, muốn có tro thật sự phải loại trừ chúng • Đối với thực phẩm có chứa đường, độ tro còn được biểu thị tro sulfat. Muốn có độ tro thật sự (tổng lượng muối khoáng) ta lấy tro sulfat nhân với hệ số 0.9 36

37

2.2.2 Hàm lượng tro không tan trong acid clohydric 2.2.2.1 Nguyên lý: Những chất bẩn (đất, đá, cát) lẫn vào TP hoặc những chất không tan trong acid như SiO2. Sau khi lọc phần không tan trong HCl rửa sạch, nung và cân.

2.2.2.2 Cách thực hiện: • Hòa tan tro toàn phần vào 10 mL HCl 10% (~ 4N). Để nóng ở nồi cách thủy đang sôi trong 10 – 15 phút. Thành phần không tan được lọc trên giấy lọc không tro, rửa kỹ bằng nước cất cho đến khi hết ion Cl-.

• Cho giấy lọc chứa phần không tan vào chén sứ khô, sạch đã biết trước khối lượng. Sấy ở nhiệt độ 100 – 105oC rồi nung ở 550 ± 25oC trong 30 phút. Làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Tính ra % tro không tan trong HCl. • Vậy tổng lượng muối khoáng = Lượng tro toàn phần – Lượng tro không tan trong HCl 38

39

3. MUỐI ĂN 3.1 Giới thiệu: Muối ăn có chứa dạng tự nhiên trong thức ăn hoặc được thêm vào với mục đích gia vị hay bảo quản. Dù ở thể nào thì muối ăn cũng là một thành phần khoáng của TP tức là một thành phần trong tro.

• Ở nồng độ thấp < 1% muối ăn được sử dụng làm gia vị.

• Từ 3% trở lên muối ăn có khả năng bảo quản chống lại sự phát triển của vi sinh vật dựa trên khả năng thẩm thấu. Hàm lượng muối càng cao khả năng bảo quản càng tăng, nhưng vì mất nước nên TP kém ngon.

• Khả năng ức chế vi sinh vật của muối ăn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như pH, nhiệt độ, nồng độ NaCl, chủng loài và số lượng vi sinh vật.

40

3.2 Phương pháp kiểm nghiệm 3.2.1 Phương pháp Mohr 3.2.1.1 Nguyên lý: Định lượng muối ăn qua ion Cl- bằng chất chuẩn AgNO3, chỉ thị K2CrO4 Phản ứng chuẩn độ: NaCl + AgNO3 → AgCltrắng↓ + Na+ + NO3Phản ứng chỉ thị: K2CrO4 + 2 AgNO3 → Ag2CrO4 đỏ gạch ↓ + 2K+ + NO3-

Từ lượng AgNO3 tiêu tốn tính ra lượng NaCl trong 100 g TP Điều kiện thực hiện: pH nằm trong 6 – 8 Dùng NaCH3COO 20% hay NaHCO3 10% để điều chỉnh, pH khi dung dịch có tính acid, hoặc dung CH3COOH 2N để điều chỉnh khi môi trường quá kiềm.

41

3.2.1.2 Cách thực hiện - Chuẩn bị mẫu: Tùy theo loại mẫu mà ta có cách xử lý khác nhau. ❖Mẫu lỏng: chỉ cần pha loãng, trước khi pha loãng cần lắc đều. Kết quả tính ra g/L. ❖Mẫu rắn, đặc: cắt nhỏ, hoặc xay nhỏ, lắc với nước ấm trong khoảng 12h. Lọc và chuẩn độ kết quả tính NaCl theo g/100g mẫu. ❖Đối với mẫu khó chiết xuất (nhiều đạm, nhiều béo) có thể nung thành tro trắng, nhiệt độ nung cần thấp hơn 600oC, vì cao hơn nhiệt độ này các muối Clorid của các kim loại kiềm có thể thất thoát do bay hơi.

Sau đó hòa tan tro vào nước cất và chuẩn độ. ❖Với mẫu chứa ít béo (< 5%). Lắc 5g mẫu đã nghiền nát với 200mL HNO3 4% ấm trong 10 phút. Trung hòa bằng KOH 1N đến trung tính, khử tạp bằng hỗn hợp 5 mL dung dịch K4[Fe(CN)6] 15% và 5 mL Zn(CH3COO)2 30%, thêm nước cất đến thể tích chính xác 250 mL. Lắc đều và lọc qua giấy lọc, bỏ nước lọc đầu, lấy nước lọc các lần sau để định lượng Cl42

43

44

3.2.2 Phép chuẩn độ ngược (Charpetier Volhard) 3.2.2.1 Nguyên lý: Dựa trên hai phản ứng liên tiếp nhau Sử dụng một lượng dư AgNO3 NaCl + AgNO3 → AgCltrắng↓ + Na+ + NO3KSCN + AgNO3 dư → AgSCN trắng ↓ + K+ + NO3Khi có dư một giọt KSCN sẽ kết hợp với ion Fe3+ trong muối phèn sắt làm chỉ thị thành Fe(SCN)3 có màu đỏ.

Phương pháp này được sử dụng ở mẫu có độ acid cao (pH ≤ 2) khi không áp dụng được phương pháp Mohr.

3.2.2.2 Cách thực hiện: (cho mẫu có nhiều chất béo > 5%) • Cho vào bình nón một lượng mẫu 5 – 10g (chứa ~ 250 – 500 mg NaCl) them một thể tích KOH 1N ~ 20 mL. Đun sôi trên nồi cách thủy ~ 1h30 cho đến khi chất béo được xà phòng hóa hoàn toàn. Chuyển dung dịch vào bình định mức 100 mL, rửa bình nón nhiều lần bằng nước nóng, rồi cho tất cả nước rửa vào bình định mức, làm nguội và cho nước cất vào đến 100 mL. Trộn đều 45 dung dịch, lọc, bỏ nước lọc đầu tiên.

46

47

Tùy vào hàm lượng của phosphor cao hay thấp mà có thể sử dụng các kỹ thuật phân tích khác nhau: • Hàm lượng nhỏ dung phương pháp so màu 50 µg – 1 mg, xác định ở dạng phức vanadomolipdophosphat • 1µg – 100µg xác định ở dạng phức dị đa xanh molipden • Hàm lượng lớn dung phương pháp khối lượng hoặc chuẩn độ.

4.2 Định lượng phosphat 4.2.1 Phương pháp khối lượng 4.2.1.1 Nguyên lý: Kết tủa ion PO43- dưới dạng ammonium magnesium phosphate bằng hỗn hợp dung dịch muối MgCl2 và NH4Cl. Lọc lấy kết tủa. Đốt rồi nung để kết tủa chuyển thành dạng magnesium pyrophosphat bền vững theo phản ứng tO 2 MgNH4PO4 → Mg2P2O7 + 2 NH3 + H2O 48 Cân sản phẩm và từ đó suy ra lượng P có trong 100 g mẫu

49

4.2.2 Phương pháp trắc quang (so màu) 4.2.2.1 Nguyên lý: Phosphat phản ứng với thuốc thử molybdate khi có mặt vanadat sẽ tạo ra dạng phức dị đa vanadomolybdophosphat có màu vàng theo phản ứng: PO43- + 10 MoO42- + 2VO3- + 25H+ → H5[P(Mo10V2O40)] + 10 H2O

có thể đo Abs. ở λ từ 420 – 440 nm để giảm ảnh hưởng của thuốc thử dư Phosphor là thành phần khoáng trong tro. Khi nung mẫu thành tro để hạn chế mất P cần thêm Mg(CH3COO)2 vào mẫu để nung mẫu.

4.2.2.2 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất - Máy quang phổ - Lò nung - Dụng cụ thông thường: pipet, bình định mức 100 mL 50

- Dung dịch Mg(CH3COO)2 15%: 150g Mg(CH3COO)2.4H2O pha trong nước cất thành 1000 mL - Dung dịch acid HNO3 (a): 1 V HNO3 65% với 2V nước cất - Dung dịch NH4VO3 (b): 2.5 g NH4VO3 hòa tan ~ 500 mL nước, đun vài phút rồi cho vào bình định mức 1L, làm nguội thêm 20 mL HNO3 65%, thêm nước cất đến vạch (1000mL)

- Dung dịch hỗn hợp thuốc thử gồm a, b, c theo tỉ lệ thể tích 1: 1: 1.

Dung dịch này phải trong và có màu vàng lợt.

- Dung dịch chuẩn gốc phosphat (C = 100 mg/L). Cân 437.5 mg KH2PO4, hòa tan trong bình định mức 1L. - Pha chế dung dịch chuẩn trung gian: lấy lần lượt các thể tích 10, 20, 30, 40, 50, 60 mL dung dịch chuẩn gốc vào các bình định mức 100 mL, thêm 10 mL HNO3 1:2 vào các bình này, rồi thêm nước tới vạch mức. Dãy chuẩn trên có nồng độ là 1, 2, 3, 4, 5, 6 mg/L. 51

4.2.2.3 Cách tiến hành - Chuẩn bị mẫu: Cân ~ 5 g mẫu đã nghiền mịn vào một nắp thạch anh, trộn với 5 mL dd Mg(CH3COO)2 15%. Làm bay hơi, than hóa, tro hóa ở 550oC trong lò nung thành tro trắng.

Hòa tan tro trong 10 mL HNO3 loãng. Đun nhẹ trên nồi cách thủy hoặc giữ trong tủ sấy ở 105oC trong 1h. Chuyển dd của tro vào bình định mức 100 mL, tráng dụng cụ bằng nước cất. Gộp nước rửa vào bình định mức 100 mL, làm nguội dd rồi thêm nước cất tới vạch mức (ddA).

- Tạo phản ứng màu: Tùy thuộc vào hàm lượng phosphat lấy x mL (5 đến 20 ml ddA) vào bình định mức 100 mL, thêm 30 mL thuốc thử hỗn hợp. Sau 30 phút đo Abs. cuvet 2 cm ở bước song 430 nm, so với dung dịch so sánh.

Dung dịch so sánh gồm: 0.5 mL HNO3 1:2 + 30 mL thuốc thử hỗn hợp, pha loãng bằng nước cất đến 100 mL. 52

- Đường chuẩn phosphor: lấy 20 mL mỗi dd dãy chuẩn, cho vào bình định mức 100 mL, thêm vào mỗi bình 30 mL hỗn hợp thuốc thử, rồi thêm nước cất tới vạch mức.Thực hiện phép đo giống như dung dịch xác định. Nồng độ của các dd chuẩn là 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 và 1.2 mgP/ 100 mL dd đo.

- Tính kết quả: với: C: nồng độ xác định được trên đường chuẩn (mg) X: thể tích mẫu đem đo (mL) 100: thể tích mẫu ban đầu (mL) W: khối lượng mẫu (g) 53

5. Kali và Natri 5.1 Giới thiệu: Kali và Natri là hai nguyên tố có hàm lượng lớn trong tro của TP. K có hàm lượng lớn hơn Na (Trong tro của nước cam ép K ~ 46 – 49%, Na ~ 10 mg/L, trong nước táo thì K ~ 48%, Na < 20 mg/L) 5.2 Phương pháp kiểm nghiệm: 5.2.1 Nguyên lý: dùng phương pháp quang kế ngọn lửa, xác định K và Na trong mẫu nước ép không cần qua xử lý mẫu. Để tránh sự ion hóa một phần mẫu, cần thêm vào dd đo một lượng muối CsCl. 5.2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất - Quang kế ngọn lửa - Các dụng cụ thông dụng: bình định mức 100 mL, 1000 mL và pipet các loại 54

- NaCl và KCl (p.a) sấy 2h ở 150oC - CsCl - Dung dịch chuẩn Na+ (C=1000 mg/L): 2.542 g NaCl/ 1000 mL. - Dung dịch chuẩn K+ (C=1000 mg/L): 1.907 g KCl/ 1000 mL - Dung dịch CsCl (C= 40 mg/L): 40g CsCl/ 1000 mL 5.2.3 Cách tiến hành • Dung dịch mẫu thử: lấy Vm nước ép hoa quả vào bình định mức 100 mL, thêm ~ 2.5 – 10 mL (100 – 400 mg) CsCl, thêm nước cất đến vạch mức.

• Xây dựng đường chuẩn: – Cho Na (0 – 390 mg/L) – Cho K (0 – 160 mg/L) Thêm một lượng CsCl như trên, thêm nước cất đến vạch 100 mL, trộn đều dung dịch.

• Dung dịch so sánh: lấy ~ 2.5 – 10 mL dd CsCl pha thành 100 mL dung dịch 55

â&#x20AC;˘ Ä?ocĆ°áť?ngÄ&#x2018;áť&#x2122;cᝧacĂĄc dung dáť&#x2039;ch: â&#x20AC;&#x201C; Cháť&#x2030;nhÄ&#x2018;iáť&#x192;m â&#x20AC;&#x153;0â&#x20AC;? cᝧamĂĄybáşąng dung dáť&#x2039;ch so sĂĄnh â&#x20AC;&#x201C; BĆ°áť&#x203A;csĂłngÄ&#x2018;o: â&#x20AC;˘ Cho Na áť&#x; 589 nm â&#x20AC;˘ Cho K áť&#x; 766 hoạc 770nm

â&#x20AC;˘ CĂ´ngthᝊctĂ­nh:

TrongÄ&#x2018;Ăł: a: káşżtquảxĂĄcÄ&#x2018;áť&#x2039;nhtrĂŞnÄ&#x2018;áť&#x201C;tháť&#x2039; (mg/L) Vm: tháť&#x192;tĂ­chmẍu (mL) 100: tháť&#x192;tĂ­chcᝧabĂŹnhÄ&#x2018;áť&#x2039;nhmᝊc (mL) F: Háť&#x2021;sáť&#x2018;phaloĂŁngđ??š =

100 đ?&#x2018;&#x2030;đ?&#x2018;&#x161;

56

6. Calcium và Magnesium 6.1 Giới thiệu: Ca và Mg cũng là hai nguyên tố chính có trong khoáng của TP, chúng có ít hơn K và Na một chút. Chúng có trong hoa quả ở một mức độ xác định giống như là kim loại kiềm.

Trong nước cam ép, hàm lượng Ca dao động tương đối mạnh, khi hàm lượng > 250 mg/L có thể coi như đã sử dụng phụ gia.

Mg chứa ít hơn và cũng dao động ít hơn. Trong nước táo ép thì hàm lượng ~ 40 mg/L. 6.2 Phương pháp kiểm nghiệm: 6.2.1 Nguyên lý: Xác định Ca và Mg trong mẫu nước hoa quả ép chỉ cần pha loãng không cần qua bước xử lý mẫu khi sử dụng kỹ thuật đo bằng phổ hấp thu nguyên tử (AAS). Để ngăn ngừa sự ion hóa, người ta thêm vào mẫu dd muối Lantan 57

6.2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất - Máy quang phổ hấp thu nguyên tử và các đèn cần sử dụng - CaCl2 khan - MgCl2. 6H2O đã sấy khô - La2O3 - Dung dịch chuẩn Ca2+ (C=1000 mg/L): 2.769 g CaCl2/ 1000 mL. - Dung dịch chuẩn Mg2+ (C=1000 mg/L): 2.362 g MgCl2. 6H2O / 1000 mL - Dung dịch La (C= 50 g/L): 58.6 g La2O3, thêm nước cất để làm ẩm mẫu, rồi them 100 mL HCl 37% cho đến khi La2O3 tan hoàn toàn, pha loãng bằng nước tới 1000 mL (cũng có thể sử dụng 134 g muối LaCl3. 7 H2O hòa tan đến 1000 mL)

58

6.2.3 CĂĄchtiáşżnhĂ nh -

Dung dáť&#x2039;chmẍutháť­: LẼyVmnĆ°áť&#x203A;cĂŠphoaquảvĂ obĂŹnhÄ&#x2018;áť&#x2039;nhmᝊc 100mL. ThĂŞmmáť&#x2122;tlưᝣng dung dáť&#x2039;chLantancĂłchᝊa 100 â&#x20AC;&#x201C; 500 mg, thĂŞmnĆ°áť&#x203A;ctáť&#x203A;ivấchmᝊc.

XâydáťąngÄ&#x2018;Ć°áť?ngchuẊn: - Cho Ca (100 â&#x20AC;&#x201C; 400mg) - Cho Mg (10 â&#x20AC;&#x201C; 40mg) - ThĂŞmmáť&#x2122;tlưᝣngmuáť&#x2018;iLantan: 100 â&#x20AC;&#x201C; 500 mg (~ 2 â&#x20AC;&#x201C; 10 mL), thĂŞmnĆ°áť&#x203A;ccẼtÄ&#x2018;áşżnvấchmᝊc, tráť&#x2122;nÄ&#x2018;áť u dung dáť&#x2039;ch.

- Ä?o Abs cᝧacĂĄc dung dáť&#x2039;ch: - Cháť&#x2030;nhÄ&#x2018;iáť&#x192;m â&#x20AC;&#x153;0â&#x20AC;? cᝧamĂĄybáşąng dung dáť&#x2039;ch so sĂĄnh - BĆ°áť&#x203A;c song Ä&#x2018;o: - Cho Ca: Îť = 423 nm báşąngngáť?nláť­a acetylene + KK - Cho Mg: Îť = 285 nm báşąngngáť?nláť­a acetylene + KK

- Côngthᝊctính:

100 đ??ś (đ?&#x2018;&#x161;đ?&#x2018;&#x201D;Τđ??ż) = đ?&#x2018;&#x17D; Ă&#x2014; = đ?&#x2018;&#x17D;Ă&#x2014;đ??š đ?&#x2018;&#x2030;đ?&#x2018;&#x161;

Trong Ä&#x2018;Ăł: a: káşżtquảxĂĄcÄ&#x2018;áť&#x2039;nhtrĂŞnÄ&#x2018;áť&#x201C;tháť&#x2039; (mg/L) Vm: tháť&#x192;tĂ­chmẍu (mL) 100: tháť&#x192;tĂ­chcᝧabĂŹnhÄ&#x2018;áť&#x2039;nhmᝊc (mL) 100 F: Háť&#x2021;sáť&#x2018;phaloĂŁngđ??š = đ?&#x2018;&#x2030;đ?&#x2018;&#x161;

59

7. Sắt 7.1 Giới thiệu: • Sắt cũng là một trong những thành phần khoáng vô cơ trong cơ thể người và động vật, sắt không được liệt vào nguyên tố vi lượng. Ở người lớn chứa ~ 5 – 8 g Fe là thành phần của hem trong hemoglobin (hồng cầu).

• Ở hàm lượng nhỏ, nó có tác dụng như một enzym trong quá trình trao đổi chất của cơ thể.

• Để tạo ra hồng cầu, cơ thể người mỗi ngày cần 5 – 20 mg Fe chưa tìm thấy tác dụng độc của Fe. • Hầu hết các loại thực phẩm từ động vật, thực vật đều có chứa Fe. • Trong nước, Fe tồn tại nhiều dạng khác nhau: ion(Fe2+,Fe3+) keo tan, lơ lửng và các hợp chất ít tan. Hàm lượng Fe2+ ≥ 0.3 mg/L xuất hiện mùi tanh khó chịu của kim loại. Khi bị oxy hóa bởi oxy không khí hay do hoạt động của vi sinh vật, Fe2+ biến thành Fe3+ tạo ra kết tủa keo, tốc độ oxy hóa tăng nhanh ở pH > 6.

• Hàm lượng Fe trong thực phẩm cao sẽ gây kém chất lượng về mặt cảm quan (vị tanh hoặc đục) • QCVN 01:2009/BYT: Hàm lượng sắt trong nước uống ,nước sinh hoạt và nước cho chế biến thực phẩm là 0.3 mg/L (không thay đổi so với TCVN 1991).

60

7.2 Phương pháp kiểm nghiệm Định lượng Fe bằng phương pháp trắc quang với thuốc thử o o’ – phenantrolin 7.2.1 Nguyên lý: Sắt (II) tạo phức màu đỏ cam với o o’ – phenantrolin λ= 508 nm

Để xác định tổng lượng Fe cần khử Fe3+ về Fe2+ bằng các chất khử như: hydroxylamine, hydrazine, acid ascorbic 61

7.2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất - Máy quang phổ hấp thu - Dung dịch chuẩn gốc Fe2+ 1000 mg/L (1000 ppm) - Hòa tan 7.0215g (NH4)2Fe(SO4)2. 6H2O + 30 mL hydroxylamine 10% + 2 – 3 mL acid H2SO4 96%, hòa tan bằng nước cất chính xác đến 1000 mL. Dung dịch này sử dụng được trong 6 tháng.

- Dung dịch 100 ppm và 10 ppm pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc.

- Dung dịch hydroxylamin 10% pha trong nước (sử dụng được 1 tuần) - Dung dịch o o’ – phenantrolin 0.5% trong nước (đựng dung dịch trong chai tối màu, sử dụng trong 1 tuần) - Dung dịch đệm: 40 g NH4CH3COO + 50 mL CH3COOH 96%, rồi pha loãng bằng nước cất đến 100 mL. 62

7.2.3 Cách tiến hành ❖Trong mẫu nước (xác định Fe2+ và Fe3+) a) Xác định hàm lượng Fe2+ hòa tan • Lấy 50 mL nước cần xác định cho vào bình định mức 100 mL, thêm 5 mL đệm, pH của dung dịch này cần ~ 3.4 – 5.5.

• Trộn đều dung dịch, thêm 2 mL thuốc thử, thêm nước cất đến vạch mức. Lắc đều. Sau 15 phút, đo Abs. của dung dịch ở λ = 510 nm, cuvette 1 cm so với dung dịch so sánh.

• Dung dịch so sánh: thay 50 mL nước cất cho 50 mL mẫu, và thực hiện như trên b) Xác định tổng hàm lượng Fe hòa tan • Lấy 50 mL nước cần xác định cho vào bình định mức 100 mL, + 5 mL đệm + 2 mL hydroxylamine 10%, pH của dung dịch này cần ~ 3.4 – 5.5, thêm nước tới vạch mức.

• Thực hiện phép đo giống như trên 63

64

65

HÌNH 21: SƠ ĐỒ CỦA QUANG KẾ NGỌN LỬA

66

HÌNH 22 : Đèn catod rỗng và bộ phận hóa hơi trong AAS

67

HÌNH 23: SƠ ĐỒ QUANG HỌC CỦA MÁY QUANG PHỔ AAS

68

HÌNH 24: SƠ ĐỒ QUANG HỌC CỦA THIẾT BỊ AAS LÒ NHIỆT

69

Chương 3: Thành phần dinh dưỡng hữu cơ ĐẠM (protide) 1. Giới thiệu Đạm gồm amino acid, peptide và proteine.

▪ Peptide là những hợp chất do một số giới hạn các amino acid kết hợp với nhau bởi dây nối peptide –CONH▪ Proteine là những hợp chất cao phân tử được hình thành từ dạng cấu trúc L của các α-amino acid, chia thành hai nhóm: ➢ Holoprotein (proteine): khi thủy phân → các amino acid ➢ Heteroprotein (proteide): khi thủy phân → amino acid + những chất không phải là protide như: lipoproteide, glycoproteide, chromoproteide, phosphoproteide, metallproteide…

▪ ▪

▪

Protide là một hợp phần dinh dưỡng chính cung cấp năng lượng cho sự sống (1g = 4.1 Kcal = 17.2 kJ) Về thành phần hóa học, protide chứa các nguyên tố chính: C, H, O, N. Bên cạnh còn có P, S, Fe, Cu, Cl, I, Br Để đánh giá chất lượng của thực phẩm chứa đạm, ngoài các thành phần chính như protein thô, amino acid còn để ý đến các thành phần phân hủy từ đạm bởi enzyme như: NH3, H2S, amine, indol, scatol, ure, phenol,… độc có mùi khó chịu 70

Myosin Keratin Proteine dạng sợi

Elastin Collagen Fibrinogen Seidenfibroin

Proteine đơn giản (Holoproteine)

Albumine Globuline Proteine dạng cầu

Protide

Prolamine Histone

Proteide (Heteroproteine)

Nucleoproteine Lipoproteine

Protamine Glutenine

Glycoproteine Chromoproteine Phosphoproteine Metallproteine 71

2. Phương pháp kiểm nghiệm 2.1 Phản ứng nhận danh 2.1.1 Phản ứng Biurét Trong môi trường kiềm, các polypeptide mạch ngắn ~ 3 dây peptide hoặc các amino acid kết hợp với Cu2+ cho ra phức màu xanh tím.

O R C -

CH

OC - HC - N

R

NH - CO - CH - NH Cu

- HN-CH-OC-NR

HC R

N - CH - CO C R O

72

2.1.2 Phản ứng với ninhydrin để nhận biết các amino acid

với prolin và hydroxyprolin cho màu cam

2.1.3 Phản ứng tạo chì sulfur •

•

Dung dịch chứa amino acid trong môi trường kiềm khi thêm dung dịch Pb(CH3COO)2 nếu xuất hiện kết tủa màu đen thì có amino acid chứa lưu huỳnh chẳng hạn như methionine.

-S- + Pb(CH3COO)2 → PbS↓đen + 2CH3COONhận biết H2S hoặc S2- trong các sản phẩm từ thịt. ➢ Cách thực hiện: Đặt vào nắp hộp hay đĩa petri ~ 10 – 20 g thịt đã băm nhuyễn, trải thành một lớp mỏng. Đặt lên bề mặt thịt băm một tờ giấy Pb(CH3COO)2 đã tẩm ướt. Nhỏ vào đó vài giọt H3PO4 5%. Đậy nắp lại, để yên 30 phút. Nếu có 73 màu đen xuất hiện là mẫu có H2S → Thực phẩm đã ôi.

2.1.4 Phản ứng Eber (định tính NH3) ▪ Nguyên lý: Nếu trong mẫu thịt hoặc thịt cá có NH3 tự do thì trong môi trường HCl đậm đặc, NH3 sẽ kết hợp với HCl theo phản ứng: NH3 + HCl → NH4Cl NH4Cl hình thành một lớp sương mù trắng xung quanh miếng thịt ▪ Cách thực hiện: Thuốc thử Eber: HCl đậm đặc 1V Pha chế khi o Cồn 96 3V sử dụng Eter 3V

Có thể quan sát xung quanh miếng thịt trên nền đen

74

2.2 Định lượng 2.2.1 Proteine thô Về nguyên tắc, proteine thô trong thực phẩm được xác định bằng cách định lượng N toàn phần và lấy kết quả nhân với 6.25, như thế có nghĩa là xem protein chứa khoảng 16% N (thực tế từ 14 – 20%) – Ở động vật, giá trị này lớn hơn 16% còn ở thực vật thì lại thấp hơn – Giá trị chuyển đổi protein thô do FAO/WHO 1973: • • • • • • •

Bột mì toàn phần Gạo Đại, tiểu mạch, ngô Đậu nành Đậu phộng Thịt và các sản phẩm có nguồn gốc động vật Sữa và sản phẩm chế biến từ sữa

5.85 5.95 5.83 5.71 5.41 6.25 6.38

75

Để xác định đạm toàn phần, người ta thường dùng phương pháp Kjeldahl đơn giản và chính xác.

Nguyên lý • Vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc có xúc tác. Dùng kiềm mạnh đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 vừa vô cơ hóa. Định lượng NH3 bằng acid.

CnHmOlNd=a+b+c + (2n + m/2 – l – 1.5a+2.5b )O_ nCO2 + (m/2 – 1.5a – 0.5b) H2O + aNH3 + bHNO3 + c/2 N2 Khi vô cơ hóa các sản phẩm chứa đạm trong môi trường H2SO4 chủ yếu tạo ra (NH4)2SO4, lượng HNO3 và N2 tồn tại dạng không đáng kể.

• Trong thực phẩm không chỉ chứa protein và các amino acid tự do, mà còn có các hợp chất vòng thơm chứa N như pyrazine, cyclopentapyrazine, pyrole và các vitamin như B1, B2, B6… nhưng vì chúng rất nhỏ dưới 0.1% do vậy tổng hàm lượng N của các hợp chất chứa N được xem là tổng hàm lượng protein. 76

• Có hai cách xác định tổng hàm lượng N: – Phương pháp chuẩn độ trực tiếp – Phương pháp chuẩn độ ngược

A- Chuẩn độ trực tiếp Hứng hơi NH3 bay ra vào một bình hấp thu chứa dung dịch acid boric. Chuẩn lượng NH3 bằng HCl hoặc HNO3 có nồng độ chính xác.

NH3 + H2O = NH4OH NH4OH + HCl → NH4Cl + H2O Phản ứng trên được viết khi có H3BO3 làm môi trường hấp thu NH3 + H3BO3 = NH4+ + BO2.H2O(a) BO2.H2O- + HCl → H3BO3 + Cl(b) Lượng H3BO3 phản ứng với NH3 (a) được hoàn trả lại ở phản ứng (b). Lượng NH4+ tạo thành tương đương với lượng HCl dung cho phản ứng. Phản ứng này kết thúc ở pH 5.1, chỉ thị Tashiro chuyển 77 sang tím.

Dụng cụ, hóa chất * Bộ cất đạm Parnas gồm: (1) (2) (3) (4) (5) (6)

Bình phát hơi nước Bình chứa mẫu thử đã vô cơ hóa Phễu cho thuốc thử đã vô cơ hóa và hóa chất vào bình 2 Hệ thống làm lạnh Erlen hứng mẫu Hệ thống bảo hiểm

Hệ thống cất đạm

78

Bộ vô cơ hóa mẫu

Bình Kjehdal 79

Hóa chất: H2SO4 đậm đặc 98% Dung dịch NaOH đậm đặc 50% (d=1.33 g/ml) không chứa CO2 Xúc tác: 50 g 100 g 1 K2SO4 2 K2SO4 CuSO4. 5H2O 3.5 g CuSO4. 5H2O 10 g Selen bột 1g - Chỉ thị: metyl đỏ 0.1% hoặc alizarin sulfonate - Chỉ thị hỗn hợp: Tashiro (metyl đỏ + metylen xanh) theo tỉ lệ 1:1 ❖ Metyl đỏ 0.1 g trong cồn 95o vừa đủ 100 mL ❖ 4 mL metylen xanh 0.1% trong nước thêm cồn 95o vừa đủ 100 mL - Chỉ thị Tashiro ở pH > 5.5 có màu xanh lục pH < 5.4 có màu tím 5.4 < pH < 5.5 cho màu xám -

80

Hóa chất: - Dung dịch chuẩn HCl 0.1N - Dung dịch hấp thụ (dung dịch acid boric bão hòa có pH = 5.4 5.5) Hòa tan 40 g H3BO3 trong một ít nước nóng. Sau khi nguội thêm nước cất đến 1000 mL. Điều chỉnh dung dịch trên về khoảng pH 5.4 – 5.5 bằng NaOH 0.1N (khoảng 13 mL) với chỉ thị Tashiro đến màu xám.

Cách tiến hành: •

•

Cân chính xác ~ 1g mẫu TP đã nghiền nhỏ cho vào bình Kjeldahl + 10g H2SO4 đậm đặc + 5g xúc tác. Đặt nghiên bình trên bếp và đun từ từ cho đến khi mẫu chuyển sang màu vàng nhạt hoặc màu xanh lơ của chỉ thị.

Chuyển dung dịch đã vô cơ hóa mẫu vào bình cất. Rửa bình Kjeldahl vài lần bằng nước cất. Gộp nước rửa vào bình chưng cất. Trung hòa lượng acid trong mẫu bằng NaOH 50%. Có thể dung phenolphatelin hoặc Tashiro làm chỉ thị. Sau đó thêm dư 5mL NaOH 50%. Cất kéo hơi nước, hứng hơi NH3 bay ra vào 81 bình hứng chứa sẵn dung dịch hấp thu.

82

83

2.2.2 Đạm formol Bao gồm các acid amin và NH3, NH4+ 2.2.2.1 Nguyên lý: Khi có mặt formaldehyde R

H C

COO-

+

HCHO

R

H C

COOH

+

H2O

(1)

N=CH2

NH3

Acid amin

4NH4+ + Ammonium

6HCHO.H2O

(CH2)6N4

Urotropin

+

4H+ +

12 H2O

(2)

Chuẩn lượng H+ sinh ra từ phản ứng (1) và (2) bằng NaOH dùng chỉ thị là phenolphthalein

2.2.2.2 Hóa chất, dụng cụ -

Dung dịch NaOH 0.2 N Chỉ thị phenolphthalein (pp)1% pha trong cồn Formaldehyde trung tính: pha loãng formaldehyde 36% hai lần bằng nước cất. Trung hòa acid formic bằng NaOH 0.2 N đến pH (9 – 9.5) 84

85

2.2.3 Phương pháp Pope Stevens (tổng acid amin) 2.2.3.1 Nguyên lý: Trong môi trường đệm borate (pH ~ 9.2) hoặc

đệm phosphate, các acid amin kết hợp với muối đồng thành phức amin đồng hòa tan theo phản ứng.

Định lượng đồng trong phức theo phản ứng iod – thiosulfate Cu2+ + 4KI → 2CuI ↓ + I2 + 4K+ I2 + 2Na2S2O3 → 2NaI + Na2S4O6

2.2.3.2 Hóa chất:

- Hỗn hợp đồng phosphate gồm 3 dung dịch, khi dùng pha với nhau: ▪ Dung dịch A: CuCl2 . 2H2O 27.3 g →1L ▪ Dung dịch B: Na2HPO4. 12H2O 64.5 g + 7.2 g NaOH → 2 L ▪ Dung dịch C: Na2HPO4. 12H2O 64.5 g → 1 L Dung dịch đồng phosphate gồm A : B : C = 1V : 1V : 4 V, chuẩn bị 2 ngày trước khi dung.

86

Acid acetic đậm đặc (98%) Muối KI tinh thể Dung dịch NaOH 1N Dung dịch Na2S2O3 0.01N, pha trước vài ngày và được định chuẩn bằng dung dịch iod tiêu chuẩn - Hồ tinh bột 1% -

2.2.3.3 Tiến hành thử: • Cho 5 mL mẫu thử vào bình định mức 100 mL, sau đó thêm 4 giọt thymolphthalein. Nhỏ từng giọt NaOH 1N cho đến khi dung dịch có màu xanh nhạt. Thêm 30 mL dung dịch đồng phosphate (đủ dư với amino acid), thêm nước cất vừa đủ đến 100 mL lắc đều, để yên 5 phút, lọc.

• Cho vào bình nón 100 mL lần lượt: – Dịch lọc – Acid acetic đậm đặc – KI tinh thể

10 mL 0.5 mL 0.5 – 1g

87

88

2.2.4 Xác định đạm amoniac (đạm thối) 2.2.4.1 Nguyên lý: • Đạm NH3 cũng xác định theo phương pháp Kjeldahl giống như đạm tổng số. Cũng thực hiện chưng cất khi dùng một base mạnh hơn NH3 để đẩy NH3 ra khỏi muối. Sau đó, chuẩn lượng NH3 bay ra bằng một acid.

• Điều khác biệt so với quy trình xác định đạm tổng số ở chỗ: – Không cần giai đoạn vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc – Không sử dụng NaOH để đẩy NH3 vì NaOH là một kiềm mạnh có thể phân hủy được các amin để tạo ra NH3 gây sai số, mà chỉ sử dụng base mạnh hơn NH3 như Mg(OH)2 để chưng cất.

• Quy trình xác định NH3, NH4 trong nước mắm: Lấy 10 mL nước mắm đã loại bỏ cặn pha loãng bằng nước cất chính xác đến thể tích 100 mL. Trộn đều rồi lấy 10 mL đem chưng cất. Dùng 0.5 mL chỉ thị Tashiro hoặc phenolphthalein để theo dõi quá trình trung hòa. Cho dung dịch chứa MgO vào bình chưng cất cho tới khi có phản ứng kiềm rõ rệt. Để tránh hiện tượng sủi bọt, cần cho vào vài giọt dầu parafin hoặc cồn octylic. Đun sôi, hơi nước bốc lên ở bình 1, rồi qua bình đưng mẫu kéo NH3 vào bình hứng 5 có chứa sẵn một lượng chính xác dung dịch H2SO4 0.1N có chứa chỉ thị màu. 89

90

• 2.2.5 Histamin • Histamin là một amin sinh học có nguồn gốc từ amino acid tự nhiên (histadin) thông qua quá trình tách nhóm carboxyl. Histamin tự do có nhiều ở các loại cá sông, cá biển ... Trong quá trình ương thối dưới tác dụng của các vi sinh vật sẽ phân giải histadin thành thành histamin

• Ở nhiệt độ ~ 0oC và thấp hơn sẽ hạn chế sự hình thành histamin vì vậy hàm lượng histamin trong cá và các thực phầm khác là chỉ số quan trọng về mức độ ô nhiễm bởi vi khuẩn.

• Histamin có tác dụng sinh lý mạnh mẽ. Ở hàm lượng nhỏ nó là một chất cần thiết cho cơ thể có vai trò quan trọng trọng hoạt động của não bộ và tham gia vào việc điều chỉnh các chức năng quan trọng khác như trung hòa bớt acid ở dạ dạy. Với hàm lượng cao là một chất độc, gây nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng, ngứa ngáy, đau đầu, nặng hơn sẽ là tê liệt chân tay, tê liệt toàn thân, hạ đường huyết, tím da, khó thở, trụy tim và có thể tử vong.

• Mức độ ngộ độc nặng nhẹ tùy vào liều lượng và sự mẫn cảm của từng người. Các triệu chứng thường xuất hiện sau 30mm ăn phải thực phẩm nhiễm histamin, với những người mẫn cảm chỉ sau vài phút.

• Hàm lượng tối đa cho phép histamin theo EU là 100ppm, ở Mỹ là 50 ppm 91

• Xác định Histamin bằng phổ huỳnh quang • Nguyên lý • Chiết xuất Histamin trong mẫu hải sản bằng tricloroacetic acid (TCA). Làm sạch qua cột cationit. Tạo phản ứng với OPA trong môi trường kiềm. Đo cường độ huỳnh quang của mẫu và chuẩn trong cùng điều kiện ở λex = 336 nm và λem = 450nm. Tính hàm lượng Histamin có trong mẫu, theo dung dịch chuẩn.

92

Quy trình phân tích Histamin a)Chiết xuất mẫu : 10 g mẫu + 80 mL TCA 10% xay bằng Ultraturrax tốc độ 10000 vòng/phút trong 2 phút → 100 mL (DD A). b)Làm sạch dịch chiết Lấy 1 mL dịch chiết dội lên cột cationit Amberlit CG-50 Rửa cột bằng đệm acetat pH: 4 – 6 (~ 120 mL) Rửa giải Histamin bằng HCl 0.2 M → 50 mL (DD B)

c)Đo cường độ huỳnh quang Mẫu: 2 mL DD B + 1mL NaOH 0.5M + 0.1 mL OPA 1%,trộn đều. Để yên trong ~ 3.5, thêm 2 mL HCl 0.2 M, trộn đều.

Chuẩn: 2 mL mỗi dung dịch chuẩn B thực hiện giống mẫu.Dãy chuẩn có C = 1, 3, 5, 7 và 10 μg trong 2mL. Dung dịch so sánh: Thực hiện tương tự, thay 2mL mẫu bằng 2mL nước cất.

Giá trị của dung dịch so sánh tại điểm “O” của trục tung. λex = 336nm và λem = 450nm 93

CĂ´ng thᝊc tĂ­nh â&#x20AC;˘ HĂ m lưᝣngHistamintĂ­nhra mg trĂŞn 100g mẍu H (mg/100g) =

â&#x201E;&#x17D;.đ??š.100 đ?&#x2018;&#x160;.1000

TrongÄ&#x2018;Ăł: h : tĂ­nhÄ&#x2018;ưᝣc tᝍÄ&#x2018;Ć°áť?ngchuẊn (Îźg) W: kháť&#x2018;i lưᝣngcân (g) F: háť&#x2021;sáť&#x2018;phaloĂŁng 1000: háť&#x2021;sáť&#x2018;chuyáť&#x192;nÄ&#x2018;áť&#x2022;itᝍđ?&#x153;&#x2021;đ?&#x2018;&#x201D; sang mg

94

Chương 4: Thành phần dinh dưỡng hữu cơ Chất béo (Lipide) 1. Giới thiệu • Lipide là tất cả các ester của glycerin với acid béo. Các acid béo có thể no và không no. Lipide còn được xem là những amide của acid béo vì tính chất lý học và sinh học của nó cũng giống các ester của acid béo. Có rất nhiều thực phẩm chứa chất béo như: dầu mỡ, bơ, phomat, magarin, sữa... Dầu mỡ gọi chung là chất béo hay lipide tự do chiết suất từ động vật và thực vật, còn bơ là chất béo của sữa.

• Người ta thường quan niệm rằng dầu là chất béo thực vật ở dạng lỏng, mỡ là chất béo động vật ở dạng rắn. Nhưng trên thực tế chưa có ranh giới rõ rệt về các dạng trên.

• Về mặt cấu trúc hóa học, dầu mỡ đều là ester của glycerin với acid béo. Trừ những trường hợp đặc biệt các acid béo thường là mạch thẳng có số carbon chẵn từ C4 → C24 trong thiên nhiên loại acid béo C16 → C18 có nhiều nhất, no hoặc không no có ít hay nhiều nối đôi.

95

• Glycerin có ba nhóm –OH, có thể bị ester hóa 1, 2 hoặc cả 3 nhóm bởi các acid béo có thể giống hoặc khác nhau, nên được gọi là mono-, di- hoặc triglycerid. Trong thiên nhiên chất béo có thể ăn được thuộc loại triglycerid, trong đó ở 3 nhóm được ester hóa là những loại acid béo khác nhau.

• Về mặt dinh dưỡng các loại acid béo không no có những dây nối đôi cách xa nhau như acid linoleic C18H32O2 (Δ9,10 và Δ12,13), acid linolenic C18H30O2 (Δ9,10 , Δ12,13 và Δ15,16), acid arachidonic C20H32O2 (Δ6,7 , Δ9,10 , Δ12,13 và Δ15,16) có 4 dây nối đôi cách xa nhau có tính chất dinh dưỡng ví dụ như vitamin F có tính chất phòng chữa xơ cứng động mạch rất cần thiết mà cơ thể lại không tự tổng hợp được phải lấy từ thức ăn ngoài vào.

• Một số acid béo không no có 3 nối đôi liên hợp không phải là acid cần thiết cho cơ thể nhưng lại quan trọng trong công nghiệp, đó là thành phần của loại dầu thô.

• Trong số các chất dinh dưỡng, chất béo là loại cung cấp năng lượng cao nhất (1g béo cho 9.3 Kcal = 38.9 KJ).

96

• Để đánh giá chất lượng dầu mỡ và các sản phẩm chứa dầu mỡ, ta thường quan tâm đến: • Xác định tính chất đặc hiệu của dầu mỡ với các chỉ tiêu: ✓ tỷ trọng ✓chỉ số xà phòng hóa và không xà phòng hóa ✓chỉ số acid ✓chỉ số ester ✓chỉ số iod • Xác định tình trạng hư hỏng của dầu mỡ ✓độ chua ✓chỉ số peroxide • Ngoài ra còn lưu ý đến: ✓phụ gia thực phẩm (PG bảo quản, PG chống oxy hóa) ✓Aflatoxin ✓kim loại nặng 97

2. Phương pháp kiểm nghiệm 2.1 Định lượng chất béo 2.1.1 Định lượng chất béo tự do bằng phương pháp chiết Soxhlet

2.1.1.1 Nguyên lý: Dùng ete nóng hoặc ete dầu hỏa để hòa tan chất béo từ mẫu thử bằng bộ Soxhlet, sau đó đun đuổi dung môi. Cân cặn còn lại và tính ra lượng chất béo trong 100g thực phẩm.

2.1.1.2 Hoá chất và dụng cụ • Bộ chiết Soxhlet (DIN 21116) với ống giấy ép đựng mẫu, nếu không có thay bằng giấy lọc.

• Các bộ phận chính của thiết bị Soxhlet: • Bình cầu đựng dung môi • Ống chiết (nơi đựng mẫu) • Ống sinh hàn xoắn

Hình 4.1: Thiết bị chiết theo Soxhlet 98

• Bếp cách thủy chạy điện (không dùng bếp đốt có ngọn lửa) • Dietyl ete (ete etylic) không chứa peroxide, có nhiệt độ sôi từ 34 – 35oC • Ete dầu hỏa, nhiệt độ sôi từ 40 – 60oC • Cho ete tác dụng với dung dịch kiềm Kalipermanganat trong bình lắng gạn (phiễu chiết) – Ete etylic 500 mL – Dung dịch NaOH hay KOH 40% 5 mL – Dung dịch KMnO4 50 mL để yên 24h, thỉnh thoảng lắc. Rửa bằng nước cất. Tách loại bỏ nước.

Thêm 50g Na2SO4 khan, để 24h để loại nước. Cuối cùng đem cất trên bếp cách thủy để có ete, không peroxit, nước và rượu. Bảo quản trong chai tối màu.

• Na2SO4 khan hoặc cát sạch • Bông không dính mỡ

99

100

2.1.2 Định lượng chất béo toàn phần (Weibull – Stoldt)

2.1.2.1 Nguyên lý: Giải phóng lipide từ các hợp chất với protein và hydrat carbon bằng cách thủy phân với acid hydrocloric. Sau đó chiết lipide bằng phương pháp Soxhlet.

Lượng mẫu đem phân tích có thể dựa vào bảng 4.1 Phần trăm chất béo

Lượng cân (g)

<1

100

1–5

50 – 20

5 – 20

20 – 10

> 20

5–3

2.1.2.2 Hoá chất và dụng cụ • Bộ chiết Soxhlet (DIN 21116) với ống giấy ép đựng mẫu, nếu không có thay bằng giấy lọc.

• HCl p.a, dung dịch 25% d20 = 1.22 – 1.24 g/mol • AgNO3, dung dịch 0.1 mol/L 101

2.1.2.3 Cách tiến hành • Cân một lượng mẫu đã làm đồng nhất theo bảng 4.1 với độ chính xác ± 1mg.

Cho vào cốc thủy tinh 400 mL + 100mL nước cất + 100 mL HCl và vài viên đá bọt hoặc bi thủy tinh. Đun cách thủy ~ 15 phút, cho đến sôi, đậy bằng nắp kính đồng hồ và giữ sôi trong ~ 30 – 60 phút.

• Khi tất cả albumin đều đã hòa tan, tráng mặt kính đồng hồ bằng nước nóng.

Lọc qua giấy lọc đã được tẩm ướt bằng nước. Tráng rửa cốc cũng bằng nước nóng và chuyển hết lên giấy lọc.

• Rửa kết tủa và giấy lọc bằng nước cất cho đến khi hết ion Cl- (thử bằng dung dịch AgNO3).

• Lọc xong để giấy lọc và cặn ráo nước, đem trải lên mặt kính đồng hồ, hoặc đĩa thủy tinh, rồi sấy khô trong tủ sấy ở 103 ± 2oC trong khoảng từ 2 – 3h.

Cuộn cặn và giấy lọc đặt vào ống chiết của bộ Soxhlet và thực hiện như xác định chất béo tự do.

102 • Tính kết quả cũng giống như trên.

2.1.3 Định lượng chất béo của sữa

2.1.3.1 Nguyên lý: Phần đạm của sữa được hòa tan vào acid sulfuric nóng. Ly tâm với sự có mặt của rượu amylic, lipide sẽ tách thành một lớp. Xác định trực tiếp bằng cách đọc trên thang của butyrometer.

2.1.3.2 Hoá chất và dụng cụ • • • • • •

Butyrometer phù hợp theo tiêu chuẩn DIN 12836 Máy ly tâm Pipet khắc vạch 1mL, 10 mL Pipet 1 vạch 10.75 mL H2SO4 d20 = 1.818 ± 0.003 g/ml Pentanol 98% d20 = 0.811 ± 0.002 g/ml, sôi giữa 128 – 132oC ở 1 bar Hình 4.2: Thiết bị Butyrometer

103

2.1.3.3 Cách tiến hành - Chuẩn bị • Mẫu ở dạng đồng nhất: Sữa được đưa về 20oC. • Trong điều kiện không đồng nhất thì chuyển mẫu lên 35 – 40oC bằng cách đun nhẹ.

Dùng pipet lấy mẫu và lại đưa mẫu về 20oC •

Để butyrometer lên giá. Cho vào butyrometer lần lượt 10 mL H2SO4. Hút sữa bằng pipet đặc biệt (10.75 mL) thật nhẹ, 1 mL pentanol. Đóng nút cẩn thận và lắc cho đến khi casein (đạm của sữa) tan hết. Để butyrometer đứng theo vị trí ban đầu. Khi dung dịch dồn hết xuống phía dưới thì đảo ngược lại, lặp lại sáu lần.

• Nhiệt độ khoảng 80oC (do có sự tiếp xúc giữa H2SO4 và sữa) thì đặt butyrometer vào nồi cách thủy 80oC trong 5 phút.

• Ly tâm ngay tức khắc để tránh nhiệt độ giảm xuống. Nếu trường hợp nhiệt độ giảm, thì đặt lại vào nồi cách thủy 80oC trong 5 phút. Ly tâm 1000 – 1200 vòng/phút trong 5 phút.

• Sau đó cho butyrometer vào trong nồi cách thủy theo hướng thẳng đứng. Điều chỉnh nút ở phía dưới sao cho dung dịch lipide ở vào vị trí có chia vạch của butyrometer. Để nhiệt độ 65 ± 2oC trong 5 phút. Lấy ra đọc ngay kết quả.

• Số thể tích của vạch ứng với số gram lipide có trong sữa.

G.C: Butyrometer chia vạch theo g lipide trong một lít sữa, thể tích của mỗi vạch là 12.45 mm3 có nút bằng cao su thật kín.

104

2.2 Xác định các tính chất đặc trưng của dầu mỡ 2.2.1 Chỉ số xà phòng hoá Định nghĩa: Chỉ số xà phòng hóa là số mg KOH cần thiết để trung hòa

các acid tự do và xà phòng hóa các ester chứa trong 1g mẫu thử.

2.2.1.1 Nguyên lý: Cho chất cần thử kết hợp với một lượng KOH đủ dư để thủy phân ester (xà phòng hóa). Chuẩn lượng KOH còn dư bằng acid hydrocloric.

Ghi chú: Bản chất rượu dùng để điều chế dung dịch rượu của kiềm có ảnh hưởng quyết định đối với quá trình xà phòng hóa. Trong số các loại rượu mạch ngắn thì propanol có nhiều ưu điểm nhất. Trong thực tế người ta thường dùng etanol 90% hay 96%.

2.2.1.2 Hoá chất, dụng cụ • Etanol 96% • Dung dịch KOH 0.5N trong ethanol • Dung dịch HCl 0.5N trong nước • Dung dịch phenolphthalein 1% trong ethanol (pp) • Bộ chưng cất 105

106

2.2.2 Chỉ số acid Định nghĩa: Chỉ số acid là số mg KOH cần thiết để trung hòa các acid tự do chứa trong 1g mẫu thử.

2.2.2.1 Nguyên lý: Dùng dung dịch KOH 0.1N hay NaOH 0.1N để trung hoà acid tự do trong mẫu cần xác định với chỉ thị phenolphthalein.

2.2.2.2 Hoá chất, dụng cụ • Dụng cụ thông thường • Etanol trung tính 95o • Dung dịch KOH hay NaOH 0.1N. Pha chế gần đúng khoảng 0.1N. Xác định lại nồng độ NaOH bằng dung dịch H2C2O4 tiêu chuẩn.

2.2.2.3 Cách tiến hành • Cân chính xác khoảng 5g dầu mỡ, hòa tan trong 50 mL hỗn hợp gồm 25 mL etanol trung tính và 25 mL ete trung tính. Chuẩn độ bằng KOH 0.1N hoặc NaOH 0.1N cho đến khi chỉ thị phenolphthalein chuyển sang màu hồng bền trong 30 giây.

• Những chất có chỉ số acid dưới 1 chuẩn độ bằng microburet và có thể dùng nồng độ kiềm loãng hơn.

107

108

2.2.4 Chỉ số iod ❖ Là đại lượng biểu thị tính chất không no của dầu mỡ. Chỉ số iod càng cao thì số nối đôi càng nhiều trên một đơn vị chất béo. ❖ Mỗi loại chất béo chứa số nối đôi khác nhau nên có chỉ số iod khác nhau, chẳng hạn dầu dừa (9), bơ (31), mỡ heo (58), dầu phộng (90), dầu mè (111), dầu hướng dương (132) ❖ Iod một mình không cộng hợp được vào nối đôi, nhưng khi ở dạng liên kết với các halogen khác như ICl (monocloroiodide), IBr (monobromoiodide) thì nó có thể cộng hợp tốt vào nối đôi. Do đó, chỉ số iod xác định tổng các acid béo không no của chất béo, và được định nghĩa: Chỉ số iod (CI) là lượng halogen tính theo số g iod cộng hợp vào 100g chất béo hoặc acid béo.

109

❖Có nhiều thuốc thử có khả năng cộng hợp vào nối đôi, với thuốc thử khác nhau sẽ cho tên gọi khác nhau. ✓ ✓ ✓ ✓

Phương pháp Wijis dùng thuốc thử ICl (monocloroiodide) Phương pháp Hanus dùng thuốc thử IBr (monobromoiodide) Phương pháp Kaufmann dùng dung dịch Brom trong metanol Phương pháp Hübl dùng iod với xúc tác là Hg2Cl2

2.2.4.1 Nguyên lý: Cho chất béo hoà tan trong dung môi khác nước, tiếp xúc với thuốc thử ở nơi tối. Phần thuốc thử dư cho phản ứng với KI để sinh ra iod tự do. Định lượng iod tự do bằng thiosulfate tiêu chuẩn.

Các phản ứng xảy ra theo phương pháp Kaufmann Br2 + R1 – CH = CH – R2 → R1 – CHBr – CHBr – R2 Br2 + 2 I– → I2 + 2 Br – I2 + 2 S2O32– → 2 I– + S4O62–

• Tất cả các thuốc thử trên đều có cùng bản chất, để phản ứng xảy ra tốt, cần tôn trọng 3 điều kiện: - Tiến hành nơi tối, tránh ánh sáng mặt trời - Đủ thời gian cần thiết cho thuốc thử tiếp xúc với chất béo - Thuốc thử cần thừa, lượng thừa nên gần bằng nửa lượng thuốc thử dùng ban đầu.

110

Thuốc thử thường được lấy cố định khoảng 25 mL 0.1 mol/L . Do đó cần tính lượng chất béo sao cho tương đương với thuốc thử, nghĩa là tùy vào chỉ số iod nhiều hay ít mà cân một lượng chất béo thích hợp. Có thể chọn lựa lượng cân theo bảng 4.2 Chỉ số iod

Lượng cân (g)

0 – 20

1.0 – 0.5

20 – 60

0.5 – 0.3

60 – 120

0.3 – 0.2

120 – 200

0.1

2.2.4.2 Dụng cụ, hoá chất • Dụng cụ, hóa chất • CHCl3 • Dung dịch Brom trong metanol. Hòa tan 5.2 mL Br 2 vào 1000 mL metanol đã bão hòa NaBr (được sấy ở 130oC). Dung dịch này có nồng độ khoảng 0.1 mol/l.

• Dung dịch KI 10% • Dung dịch Na2S2O3 0.1 mol/L (0.1N) • Dung dịch hồ tinh bột 1% 111

112

2.3 Xác định tình trạng hư hỏng của dầu mỡ • Dầu mỡ có thể hư hỏng do bị chua hoặc bị ôi khét. Dầu mỡ bị chua là do chất béo bị thủy phân và cho ra các acid béo tự do và glycerin. Dầu mỡ bị ôi khét do bị oxy hóa bởi oxy của không khí, oxy kết hợp với mạch carbon không bão hòa trong dầu mỡ tạo ra các peroxide không bền vững, dễ phân hủy thành các chất tạo nên mùi ôi khét.

• Muốn đánh giá tình trạng hư hỏng của dầu mỡ, ta cần xác định độ chua, chỉ số peroxide, phản ứng Kreiss •

Tiêu chuẩn đánh giá: ❑ Dầu mỡ ăn được phải: 1.

2.

Màu sắc bình thường, trong suốt, không có vị khác lạ, không có vẫn đục rõ rệt Về mặt vệ sinh, dầu mỡ tốt nếu: ✓ Trạng thái cảm quan bình thường ✓ Độ chua, dầu chưa tinh luyện CA < 10 ✓ Dầu tinh luyện CA < 0.2 ✓ Chỉ số peroxide ✓ Phản ứng Kreiss: âm tính

❑ Dầu mỡ biến chất: ✓ Trạng thái cảm quan biến đổi, tuy chỉ tiêu khác bình thường ✓ Trạng thái cảm quan bình thường, nhưng ✓ Độ chua > 10 ✓ Chỉ số peroxide > 10 ✓ Phản ứng Kreiss: dương tính

113

2.3.1 Phản ứng Kreiss Trong môi trường acid epialdehid kết hợp với floroglucin thành hợp chất màu đỏ theo phản ứng sau: H2C O

OH

H2C

OH

HC

OH

O HC 2

HO

+

OH

C O

C

+ 2 H 2 O + 2 H+

H HO

O

O

Hợp chất màu đỏ

Thuốc thử gồm có: - HCl đậm đặc d = 1.19 - Dung dịch floroglucin 1% trong ete Tiến hành thử: Cho vào ống nghiệm 5g mẫu thử, thêm 10 mL HCl, đậy nắp hoặc bịt kín, lắc mạnh trong 30 giây. Thêm tiếp 10 mL dung dịch floroglucin 1%, lắc mạnh.

Nếu có epialdehid thì lớp clohidric ở phía dưới có màu hồng đến đỏ. Phản ứng Kreiss dương tính. Còn phía dưới không màu, ta nói phản ứng Kreiss âm tính.

114

115

2.3.3 Chỉ số peroxide • Về mặt dinh dưỡng, sự oxy hóa đã làm biến chất các chất béo, chúng vốn là nguyên liệu cần trong dinh dưỡng và cấu tạo tế bào, làm hư hỏng các vitamin tan trong chất béo (Vit. A).

• Về mặt vệ sinh các sản phẩm do sự oxy hóa: gốc tự do, peroxide,... là những chất không chỉ nghi ngờ có tác hại cho sức khỏe, mà còn là nhân tố gây ung thư, đột biến gen.

• Định nghĩa: Chỉ số peroxde (CPO) được tính trên số oxy hoạt động theo số mili đương lượng trong một kg mẫu chứa dầu mỡ hoặc biểu diễn theo số mg oxy hoạt động/ 1Kg dầu mỡ bằng cách lấy số mili đương lượng x 8.

• Nếu dầu mỡ còn tốt PO < 6 (bình thường 0 – 3), khi CPO > 10 là có dấu hiệu hư hỏng. Dầu oliu là trường hợp ngoại lệ, khi còm mới thì chỉ số peroxide cũng đã cao.

• Cơ chế của sự oxy hóa và biện pháp ngăn ngừa: • Sự oxy hóa đề cập ở đây là hiện tượng “tự oxy hóa” (autoxydation) của các chất béo trong thực phẩm dưới tác dụng của các vi sinh vật, ánh sáng và sự tham dự của oxy từ môi trường. Người ta cho rằng cơ chế của quá trình tự oxy hóa xảy ra theo cơ chế “gốc tự do”. Theo thuyết này thì quá trình oxy 116 hóa diễn ra theo 3 giai đoạn: mở đầu (khơi màu), lan truyền và kết thúc.

▪ Như vậy có thể thấy rằng, nếu có đủ năng lượng (ánh sáng, nhiệt độ), áp suất oxy khí quyển cao, và nếu không có tác nhân ngăn cản, thì một chuỗi phản ứng dẫn đến nhanh chóng tạo thành peroxide trong dầu mỡ.

▪ Các peroxide không bền, tiếp tục phân huỷ bởi các phản ứng hoá học phức tạp tạo thành aldehid, keton. Chính các hợp chất này tác động lên giác quan tạo ra vị gắt 117 lạ đắng và mùi ôi khét khó chịu cho thực phẩm.

Hình 4.3: Đường biểu diễn chỉ số peroxide theo thời gian 1.Giai đoạn mở đầu 2.Giai đoạn lan truyền 3.Giai đoạn kết thúc

118

• Từ cơ chế trên đây cho thấy nguyên nhân của quá trình tự oxy hoá phụ thuộc nhiều yếu tố đan xen nhau, nhìn chung có thể nêu ra: ❑Mức độ chưa no của acid béo: acid béo càng chưa no, càng dễ cho việc oxy hoá xảy ra ❑Áp suất của oxy: Khi áp suất càng cao thì tốc độ oxy hoá càng tăng ❑Nhiệt độ cao làm tăng tốc độ oxy hoá ❑Ánh sáng, nhất là ánh sáng tử ngoại và các tia ion hoá là tác nhân kích thích tạo ra gốc tự do ở giai đoạn khởi động của quá trình oxy hoá. ❑Sự hiện diện của vết kim loại nặng, đặc biệt là đồng và sắt làm xúc tác cho quá trình tạo peroxide xảy ra nhanh chóng hơn, ở nồng độ 1 mg/kg sẽ làm giảm nghiêm trọng tính ổn định của chất béo. ❑Phẩm màu và enzyme như chlorophyl, cytochrome lipase, lipoxyenase, myoglobine, hemoglobine, hemine là các xúc tác tốt cho quá trình oxy hoá.

119

•

Biện pháp ngăn ngừa (giảm thiểu): Để ngăn ngừa hiện tượng oxy hoá sản

phẩm thực phẩm chứa chất béo, người ta chú trọng đến 2 giải pháp chủ yếu sau: 1. Hạn chế các yếu tố tạo thuận lợi cho việc thúc đẩy phản ứng tạo peroxide như: •

làm giảm áp suất oxy (tạo chân không)

•

hạ thấp nhiệt độ (bảo quản lạnh)

•

tránh ánh sáng

•

loại trừ nhân tố xúc tác chẳng hạn với kim loại Cu và Fe thì dùng acid citric, để đưa chúng vào phức bền không màu. Trong dầu ăn mức cho phép tối đa của Cu(II) là 0.01 ppm, và Fe (II, III) là 0.1 ppm.

2. Đưa vào một chất “xúc tác âm” tức là chất có tác dụng làm giảm tốc độ của quá trình oxy hoá hoặc can thiệp vào chuỗi phản ứng tự oxy hoá làm chậm 120

2.3.3.1 Nguyên lý Hoà tan mẫu thử vào hỗn hợp Cloroform và acid acetic, thêm một lượng KI, chất này phản ứng với peroxide giải phóng một lượng iod tự do. Chuẩn độ lượng iod sinh ra bằng thiosulfate tiêu chuẩn.

OH

OOH

R1

CH

R2

+ 2 I- + 2H+

R1

CH

R2

+ H2O + I2

I2 + 2S2O32- → 2I- + S4O62-

2.3.3.2 Dụng cụ, hoá chất • Dung cụ bình thường trong phòng thí nghiệm, erlen có nút mài • CHCl3 • CH3COOH 96% • Hỗn hợp dung môi: CH3COOH và CHCl3 với tỉ lệ v/v 3:2 • Dung dịch KI bão hoà • Dung dịch chuẩn Na2S2O3 0.1 hoặc 0.01N (= 0.1 hoặc 0.01 mol/L) • Dung dịch hồ tinh bột 1% Lưu ý: Các dụng cụ thuỷ tinh phải thật sạch, không được có vết dầu hoặc vết 121 kim loại nặng bám trên bề mặt dụng cụ.

122

Chương 5: Thành phần dinh dưỡng hữu cơ Hydratcarbon (Glucid) 1. Giới thiệu • Hydratcarbon Cn(H2O)n là những hợp chất hữu cơ trong phân tử có C, H, O kết hợp với nhau, trong đó có nhiều nhóm hydroxyl và một nhóm aldehid hay keton tự do (đó là glucose, fructose, galactose…) hoặc một hay nhiều nhóm aldehid hay keton kết hợp với các nhóm chức khác (saccharose, tinh bột,…)

• Về phương diện hoá học, hydratcarbon được chia thành các nhóm: – Các monosaccharid (monose) gồm các loại đường có tính khử, vì trong phân tử còn có các nhóm aldehid hay keton tự do.

– Các oligosaccharid – Các polysaccharid (polyose) không trực tiếp khử oxy vì các nhóm aldehid hay keton ở dạng liên kết với các nhóm chức khác. Khi thuỷ phân cho ra nhiều monosaccharid cùng loại (holozit) hoặc khi thuỷ phân ngoài các ose còn có các chất không phải là ose (heterozit), ví dụ như là glucozid không có giá trị dinh dưỡng, nhưng một số glycozit có tính chất dược lý.

123

• Là những chất có tính phân cực rất mạnh, ngoại trừ một vài polysaccharid → việc phân tích các chất này đều thực hiện trong môi trường nước.

• 1g hydratcarbon cung cấp 4.1 Kcal = 17.2 kJ Biose, Triose, Tetrose Aldose Monosaccharid

Deoxy-, Anhydro-, AminosaccharidCetose

Oligosaccharid

Pentose, Hexose, Heptose

Uronic acid Saccharid ester, -alcohol,-ether

Di, tri, tetra… → Heptasaccharid

Hydratcarbon Homopolysaccharid Polysaccharid Heteropolysaccharid

Glycozit

Tinh bột, Glycogen Cellulose Dextrine, Dextrane Inulin Pektin Hemicellulose Gumm Agar agar 124

Cấu trúc của một vài saccharid: ❑ Monosaccharid Là dạng phổ biến nhất. Trạng thái tự do có trong dịch quả, lá, hạt; ở động vật có trong máu, bạch huyết não, tuỷ, nước tiểu.

D-glucose C6H12O6

Là loại cetose duy nhất tạo thành trong thực vật. Có ở trạng thái tự do trong dịch quả, mật ong. Phổ biến ở dạng disaccharid.

ở trạng thái tự do có trong vài thứ quả. Thông thường là nhiều hợp phần của nhiều polysaccharid.

D-galactose C6H12O6

125

❑

Disaccharid Có trong củ quả nhiều nhất là ở trong dịch củ cải đường, dịch mía. Có cấu trúc acetal hoàn toàn → không có tính khử

Là sản phẩm trung gian khi thuỷ phân tinh bột. Trong thiên nhiên có ở lá, mầm khoai tây. Có cấu trúc bán acetal → có tính khử

Là disaccharid duy nhất có trong cơ thể động vật và cũng có trong thực vật. Có cấu trúc bán acetal → có tính khử 126

❑

Polysaccharid

Tinh bột gồm nhiều D-glucose (n = 300 – 600)

Cellulose gồm nhiều α- glucose (n = 300 – 5000)

127

2. Phương pháp kiểm nghiệm 2.1 Phản ứng định tính ❑ 1.

Nhận biết khả năng khử của nhóm carbonyl Thuốc thử Fehling: cho 0.5 mL thuốc thử Fehling vào ~ 500 mg đường, đun dung dịch cẩn thận sẽ thấy xuất hiện kết tủa đỏ nâu của Cu2O. Fehling A: 7% CuSO4.5H2O pha trong nước Fehling B: 35g KNaC4H4O6 + 10g NaOH thêm nước cho tới 100 mL Hỗn hợp thuốc thử gồm Fehl A : Fehl B = 1:1

Thuốc thử Benedict: 5mL thuốc thử + 1mL mẫu, đun cách thuỷ từ 5 – 50 phút.

Nếu có đường sẽ xuất hiện kết tủa vàng → xanh lá → đỏ, tt Benedict gồm CuSO4 , Na2CO3 , Natri citrat. ❑ Phân biệt hexose và pentose Các hexose và các disaccharid ban đầu cho ra hydroxymetyl fufural, chất này tiếp tục phân huỷ tạo ra aldehid, trong môi trường acid, phản ứng với acid chromotropic cho ra sản phẩm màu tím.

Cách thực hiện: cho 5 mL tt chromotropic vào 1 mL mẫu (~ 300 μg). Đun nóng trên bếp cách thuỷ đến sôi. Dung dịch xuất hiện màu tím chứng tỏ có hexose. Pentose không cho phản ứng này.

Thuốc thử chromotropic: 100 mg muối natri của acid chromotropic hoà tan trong 1 mL 128 nước, thêm H2SO4 15N đến thể tích 50 mL. Tt này chỉ sử dụng trong ngày.

2.

2.2 Định lượng đường • •

Định lượng saccharid bằng phương pháp hoá học đều dựa vào tính khử của nhóm aldehid hay keton tự do.

Muốn định lượng các polysaccharid không có tính khử thì cần phải thuỷ phân chúng thành các saccharid đơn giản. Protide, Lipide… đều có ảnh hưởng đến việc xác định saccharid → trong chuẩn bị mẫu có hai khâu kỹ thuật quan trọng cần lưu ý: – Cách thuỷ phân – Cách loại tạp a)

Cách thuỷ phân

Có thể thuỷ phân các polysaccharid bằng enzyme hoặc bằng hoá học.

Khi thuỷ phân bằng phương pháp hoá học thường dùng acid để chuyển đường không khử thành đường khử. Những acid mạnh ảnh hưởng rõ rệt đến một số loại đường nhất là ở nhiệt độ cao, như levulose có thể bị phá huỷ thành furfurol. Do đó, trong kỹ thuật thuỷ phân cần xác định nồng độ acid, nhiệt độ, thời gian thuỷ phân.

Những điều kiện quy định cho sự thuỷ phân: - Dung dịch đường phải loãng, thường ở nồng độ từ 4 – 10% tính theo glucose - Nồng độ acid ~ 1N thường dùng HCl Ví dụ: dung dịch đường 4 – 10% 50mL HCl tinh khiết d=1.19 5mL 129

a) Cách thuỷ phân - Thời gian và nhiệt độ tuỳ thuộc theo từng loại đường: + Với đường saccharose. Nồi cách thuỷ đặt ở 70 – 75oC, đun dung dịch trong 2 – 3 phút phải lên được 68oC. Giữ 5 phút ở 68– 70oC. + Tinh bột và dextrin, đun ở nồi cách thuỷ sôi trong 3h - Sau khi thuỷ phân làm nguội ngay dưới vòi nước chảy.

- Trung hoà dung dịch mới đầu bằng NaOH 20% hoặc 30% , sau bằng NaOH loãng 0.1M hay 1% theo chỉ thị phenolphthalein hoặc bromothymol xanh.

- Có thể xác định đường không khử sau khi đã thuỷ phân bằng phương pháp Bertrand, Luff Schoorl, Potterat- Eschmann,…

C12H22O11 + H2O → C6H12O6 + C6H12O6 Saccharose D-glucose D-fructose [α]D20 = +66.5o [α]D20 = -20.5o Sản phẩm thuỷ phân của đường saccharose gọi là đường nghịch chuyển.

Saccharose = đường nghịch chuyển x 0.95 Tinh bột, dextrin = lượng glucose x 0.90 130

b) Cách loại tạp - Khử tạp bằng hỗn hợp Carrez: Carrez I: 15 g K4Fe(CN)6 . 3H2O hoà tan bằng nước cất đến 100 mL dung dịch + Carrez I: 23g Zn(CH3COO)2. 2H2O hoà tan bằng nước cất đến 100 mL dung dịch Cách thực hiện: Dung dịch sau khi thuỷ phân cho vào bình định mức 100 mL, cho nước rửa cộng với nước đến thể tích 70 – 80 mL + 5mL Carrez I, lắc, để yên từ 3 – 4 phút + 5 mL Carrez II, thêm nước đến 100 mL, lắc, lọc qua giấy lọc băng đỏ.

Dịch lọc phải trong, dùng để xác định đường. +

- Khử tạp bằng dung dịch Pb(CH3COO)2 + Dịch thử sau khi đã thuỷ phân cho vào bình định mức 100mL + 1mL Pb(CH3COO)2 30%, lắc và để lắng 5 phút. Nếu thấy xuất hiện một lớp chất lỏng trong suốt ở trên lớp cặn thì coi việc khử tạp đã xong. Cho thêm 18 – 20 mL Na2HPO4 bão hoà để loại bỏ Pb dư, lắc đều, để lắng 10 phút, thêm nước cất đến 100 mL, lắc và lọc qua giấy lọc. + Cách loại tạp này dùng để xác định đường theo phép đo độ quay cực 131

2.2.1 Định lượng đường khử Có nhiều thuốc thử khác nhau để xác định đường khử như: • Phương pháp Bertrand sử dụng thuốc thử phức đồng-tartrat • Phương pháp Luff Schoorl sử dụng thuốc thử phức đồng-citrat • Phương pháp Potterat Eschmann sử dụng thuốc thử phức đồngEDTA

2.2.1.1 Phương pháp G . Bertrand • Nguyên lý: Các loại đường khử (glucose, lactose) có thể khử Cu (II) về Cu (I) trong môi trường kiềm với sự có mặt của Kalinatri tartrat. Cu2O sinh ra từ phản ứng này có tính khử, nó tác dụng với muối Fe (III) làm muối này chuyển thành muối Fe (II) trong môi trường acid. Lượng Fe (II) sinh ra được chuẩn độ với dung dịch KMnO4 0.1N trong môi trường acid. Từ số mL KMnO4 0.1N đã dùng, tra bảng để có số mg đường.

132

Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 → 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O 10FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 → 2MnSO4 + 5Fe2(SO4)3 + K2SO4 + 8H2O

• Dụng cụ, hoá chất: ✓ ✓ ✓ ✓

Bộ lọc chân không Phễu lọc thuỷ tinh (Gooch 4) Nhiệt kế 100oC Các dụng cụ thông thường: pipet, buret…

Hình 5.1: Bộ lọc chân không

133

✓ Thuốc thử Fehling A: CuSO4 tinh thể: 69.28g /1000 mL nước ✓ Thuốc thử Fehling B: KNaC4H4O6 346 g + NaOH 100g /1000mL nước ✓ Dung dịch muối Fe2(SO4)3: Fe2(SO4)3 50 g+H2SO4 đđ 200g /1000 mL dd ✓ Dung dịch KMnO4 0.1N: định chuẩn lại bằng acid oxalic tiêu chuẩn

• Cách thực hiện: ❖Lấy 10 mL dung dịch đã loại tạp, thêm hỗn hợp 10 mL dd Fehling A và 10 mL dd Fehling B, đun nhẹ trên bếp cách thuỷ đến sôi trong ~ 2 – 3 phút, giữ sôi đúng 2 phút, làm nguội dưới vòi nước. ❖Lọc gạn kết tủa bằng bộ lọc chân không (phễu lọc Gooch số 4) ❖Hoà tan Cu2O bằng dung dịch Fe 2(SO4) 3,tráng rửa bằng nước nóng cho hết lượng oxid. ❖Lấy bình lọc ra và chuẩn độ FeSO4 bằng dung dịch KMnO4 0.1N cho tới xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 15s. ❖Đọc số mL KMnO4 0.1N đã dùng. Tra bảng để có lượng đường khử tương ứng (glucose, lactose, fructose) ❖Muốn xác định đường không khử thì phải thuỷ phân, điều kiện thuỷ phân (xem 2.2). Dựa vào số mL KMnO4 0.1N, tra bảng đường nghịch chuyển.

134

2.2.1.2 Phương pháp Luff Schoorl • Nguyên lý: Trong môi trường kiềm nhẹ, đường khử dễ dàng bị khử bởi Cu(II) thành Cu2O. Có thể chuẩn lượng Cu (II) của thuốc thử còn lại hoặc lượng Cu2O hình thành từ đó tính ra hàm lượng đường khử có trong mẫu thử.

❑ Cách 1: Xác định Cu2O được tạo thành: cho Cu2O hoà tan trong dung dịch iod đủ dư trong môi trường acid. Chuẩn lượng iod còn dư bằng thiosulfate 0.1N tốn hết V2 mL. Cu2O + I2 + 4HCl → 2CuCl2 + 2HI + H2O I2 + 2Na2S2O3 → 2 NaI + Na2S4O6 - Làm mẫu trắng bằng cách chuẩn dung dịch I2 với thiosulfate 0.1N tốn hết V1 mL. - Hiệu số V1 – V2 = số mL tiêu tốn cho đường khử, tra bảng để có số mg đường 135

❑ Cách 2: Xác định theo lượng Cu(II) trong thuốc thử Luff Schoorl còn lại sau phản ứng. Phân huỷ thuốc thử Luff Schoorl bằng acid để được ion đồng (II) tự do. Cho ion Cu (II) phản ứng với I- để được I2 , chuẩn lượng I 2 sinh ra bằng dung dịch thiosulfate 0.1N tốn hết V2 mL 2Cu2+ + 4I- → 2CuI↓ + I2 I2 + 2Na2S2O3 → 2 NaI + Na2S4O6 Để I2 không bị hấp phụ trên CuI, người ta còn thêm vào KSCN Cu+ + SCN- → CuSCN ↓ -Thực hiện mẫu trắng bằng lượng thuốc thử Luff Schoorl ban đầu, phân huỷ thuốc thử bằng acid và cho phản ứng với dung dịch KI, chuẩn lượng iod sinh ra bằng thiosulfate 0.1N tốn hết V1 mL. -Hiệu số V1 – V2 = số mL tiêu tốn cho đường khử, tra bảng để có số mg đường 136

• Dụng cụ, hoá chất: ✓ Dụng cụ giống mục 2.2.1 ✓ Thuốc thử Luff Schoorl ❑ Dung dịch A: 50 g acid citric/ 50 mL nước cất (~ 40oC) ❑ Dung dịch B: 143.7 g natri carbonat/ 350 mL nước cất (~ 40oC) ❑ Dung dịch C: 25g đồng sulfate ngậm nước/ 100 mL nước cất ✓ Thuốc thử Luff Schoorl có công thức sau:

✓ KI tinh thể hoặc dung dịch KI 30% ✓ Dung dịch thiosulfate 0.1N 137

• Xác định đường khử bằng cách chuẩn độ Cu(II) trong thuốc thử còn lại. Từ đó tính ra lượng Cu(II) đã phản ứng • Cách thực hiện: ✓ Lấy chính xác 25 mL thuốc thử Luff Schoorl vào erlen + 25 mL mẫu đường đã khử tạp (< 50 mg) ✓ Lắp đứng ống sinh hàn vào erlen, cho nước vào sinh hàn. Đun dung dịch trên bếp đến sôi trong vòng 2 phút, giữ sôi 10 phút, sẽ có kết tủa Cu2O xuất hiện. ✓ Nếu dung dịch phía trên kết tủa không có màu xanh của thuốc thử dư thì phải lặp lại thí nghiệm với lượng mẫu ít hơn. ✓ Lấy bình ra, làm lạnh dưới vòi nước, thời gian ~ tối đa 5 phút. Phải chuẩn độ ngay dung dịch. ✓ Thêm vào dung dịch 3g KI hoặc 10 mL dung dịch KI 30% + 25 mL H2SO 4 25%, thận trọng, càng nhanh càng tốt. Thêm tiếp 10 mL KSCN 20%, lắc mạnh cho đến khi không còn sủi bọt. ✓ Chuẩn độ iod sinh ra bằng Na2S2O3 0.1N cho tới màu vàng lợt, them tiếp 1mL hồ tinh bột, chuẩn tiếp bằng Na2 S2O3 đến khi mất màu xanh của chỉ thị,được V2 mL 138

✓ Tiến hành chuẩn độ mẫu trắng với 25 mL thuốc thử + 25 mL nước cất trong cùng điều kiện để xác định thể tích Na2S2O 3 0.1N tương ứng với 25 mL thuốc thử Luff Schoorl,được V1 mL ✓ Số mL dung dịch Na2S2O3 0.1N tương ứng với lượng Cu tương ứng với đường khử là V1 – V2 , tra bảng để có hàm lượng đường khử. ✓ Đối với đường saccharose, sau khi thuỷ phân loại tạp và thực hiện tương tự, sẽ được đường nghịch chuyển.

• Xác định đường khử (hoặc đường nghịch chuyển) từ lượng Cu2O hình thành Cách thực hiện tương tự như Phương pháp Bertrand

139

2.2.2 Định lượng nhiều loại đường trong cùng mẫu thực phẩm 2.2.2.1 Định lượng đường khử và đường không khử cạnh nhau Thí dụ 1: Xác định đường lactose và saccharose trong sữa đặc

•

•

Nguyên lý: Đường lactose là đường khử có thể định lượng trực tiếp bằng phương pháp Bertrand. Đường saccharosre chỉ định lượng được bằng phương pháp Bertrand sau khi đã thuỷ phân để chuyển thành đường khử. Điều kiện để thuỷ phân là môi trường HCl 1N, nhiệt độ 68 – 70oC, thời gian tối đa là 7 phút. Lactose không bị ảnh hưởng còn saccharose sẽ chuyển thành glucose và fructose. Do đó, định lượng trước và sau khi thuỷ phân sẽ tính ra được lượng đường lactose và saccharose.

Dụng cụ, thuốc thử: giống như trong phương pháp Bertrand

140

25 g sữa

n mL KMnO4 0.1N

Nước nóng Loại tạp bằng thuốc thử Carrez 100 mL Lọc

10 mL

Dịch lọc

50 mL Thuỷ phân Trung hoà acid dư bằng NaOH

100 mL

Lấy 10 mL đem xác định lactose n mL KMnO4 0.1N

100 mL Lấy 10 mL pha loãng thành 100 mL Lấy 5 mL để định lượng tổng đường khử n’ mL KMnO4 0.1N 141

142

143

Thí dụ 2: Xác định đồng thời nhiều đường khử Phương pháp enzyme Phương pháp enzyme dùng xác định đường có một ý nghĩa lớn so với Phương pháp hoá học hoặc phương pháp đo độ quay cực vì có những ưu điểm sau: ❖ Có tính chọn lọc cao cho kết quả xác thực ❖ Nhanh, tốn ít mẫu, tiết kiệm thời gian Kỹ thuật xác định bằng enzyme thường gắn liền với phổ UV-VIS dựa trên phản ứng sau:

NADP + 2e + H+

bị khử

NADPH λ = 340 nm

NADP+/ NAD+: Nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate/ (dạng oxy hóa) NADPH/ NADH: Dihydronicotinamide-adenine dinucleotide phosphate (dạng khử) 144

Với Glucose Glucose-6-phosphate + NADP+ ↔ 6-phosphogluconolactone + NADPH Lượng NADPH hình thành tương ứng với hàm lượng glucose 2.2.2.2 Định lượng riêng lẻ nhiều đường khử trong mẫu Thí dụ: Phương pháp enzyme xác định đồng thời glucose, fructose và mannose Glucose, fructose, mannose là 3 monosaccharide, trong đó glucose và mannose là các aldose và fructose là ketose.

Phạm vi ứng dụng: • Thực phẩm lỏng: thức uống, nước ép trái cây • Trái cây và sản phẩm rau • Thực phẩm rắn: bánh 145

• Nguyên lý: – Glucose, fructose, mannose phản ứng với adenosine-5’triphosphate (ATP) trong sự có mặt của hexokinase (HK) sẽ chuyển thành glucose-6-phosphate (G-6-P), fructose thành fructose-6-phosphate (F-6-P), mannose thành mannose-6phosphate (M-6-P), còn ATP chuyển thành adenosine-5’diphosphate (ADP).

– G-6-P bị oxy hoá chọn lọc bởi nicotin-amide-phosphate (NADP+) dưới xúc tác của enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6P-DH) hình thành gluconate-6-phosphate, đồng thời tạo thành một lượng NADPH, lượng này tương ứng với lượng glucose ban đầu.

– F-6-P và M-6-P được chuyển thành G-6-P nhờ enzyme phosphoglucose isomerase (PGI) và phosphomannose isomerase 146 (PMI).

– Sự chuyển hoá này được mô tả theo sơ đồ sau:

Hình 5.2: Sơ đồ phản ứng xác định glucose, fructose và mannose bằng phương pháp enzyme

Từ giá trị đo độ hấp thu Abs (OD) lần đầu ở λ = 340 nm tính được hàm lượng glucose, lần 2 cho fructose và lần 3 cho mannose.

147

• Thiết bị và hoá chất: ✓ Máy quang phổ UV-VIS ✓ Dung dịch đệm: 14g trietanolamin hydrochlorid và 0.25g MgSO4.7H2O, hoà tan với ~ 80 mL nước cất 2 lần + ~ 5 mL NaOH 5 mol/L điều chỉnh đến pH khoảng 7.6 + nước cất đến 100 mL. ✓ Dung dịch nicotinamide diphosphate: hoà tan 60g Na 2NADP vào 6 mL nước cất 2 lần. ✓ Dung dịch adenosine triphosphate (ATP): hoà tan 300 mg ATP.Na2H2 và 300mg NaHCO3 vào 6 mL nước cất 2 lần. ✓ HK/G6P-DH: 2mg HK/mL, 1mg G6P-DH/mL ✓ PGI: 2mg/mL ✓ PMI: 10mg/mL ✓ Thời hạn sử dụng cho các dung dịch là 4 tuần lễ, các dung dịch cô đọng là 1 năm khi bảo quản ở 4 oC 148

• Quy trình thử ✓ Xử lý mẫu dạng lỏng (nước ép quả, rượu vang) ▪ Mẫu thử đục cần được lọc, nếu có màu thì cứ 10 mL mẫu thử thì thêm 0.1 g bột polyamide hoặc polyvinylpyrolidon, khuấy và lọc.

Tuỳ theo lượng đường mà có thể lấy thể tích phù hợp hoặc pha loãng.

▪ Mẫu mật ong (mẫu đặc sánh) hoặc bị kết tinh cho vào bình nón đun khoảng 10 phút ở 60 oC, làm nguội, lấy 1g cho vào bình định mức 100mL, thêm nước cất 2 lần đến vạch mức. Nếu mật ong lỏng không cần đun nóng mà chỉ cần pha loãng. ✓ Xử lý mẫu dạng rắn (bánh, rau quả và các sản phẩm chế biến từ sữa) ▪ Mẫu schocolade: xắt nhỏ, cân ~ 1g với độ chính xác 0.1mg cho vào bình định mức 100mL, thêm 70 mL nước cất, đun cách thuỷ ở 60oC, khi schocolade tan hoàn toàn, làm lạnh cho nước tới vạch mức. Để tách chất béo, làm lạnh 20 phút trong tủ lạnh. Lọc, bỏ nước lọc lần đầu. Lấy 10 mL dịch lọc pha loãng chính xác đến 50 149 mL.

Mẫu trắng (B) 1.00 mL 0.10 mL 0.10 mL 2.00 mL A1(B)

Mẫu thử (P) 1.00 mL 0.10 mL 0.10 mL a mL (2-a) mL A1(P)

HK (G6P-HD) Trộn đều, sau ~ 10 - 15 phút, đo Abs

0.02 mL A2(B)

0.02 mL A2(P)

PGI cô đọng Trộn đều, sau ~ 10 - 15 phút, đo Abs

0.02 mL A3(B)

0.02 mL A3(P)

PMI cô đọng Trộn đều, sau ~ 30 - 60 phút, đo Abs

0.02 mL A4(B)

0.02 mL A4(P)

Dung dịch đệm Dung dịch NADP Dung dịch ATP Mẫu thử Nước cất 2 lần Trộn đều đo Abs (OD) sau 3 phút

Thể tích mẫu: + ở nồng độ từ 0.03 g/L trong mẫu lỏng thì a lấy là 0.1 mL + ở nồng độ thấp hơn có thể lấy a đến 2mL

150

151

Bảng 5.1: Hệ số hấp thu

152

Phụ trang – Bảng 1: Đường glucose theo phương pháp Bertrand Glucose (mg) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Dung dịch KMnO4 0.1N (mL) 3.21 3.52 3.83 4.14 4.45 4.75 5.07 5.39 5.72 5.99 6.31 6.61 6.91 7.38 7.52 7.81 8.09 8.39 8.70 8.97 9.30 9.58 9.88 10.10 10.30 10.70 10.90 11.20 11.50 11.80 12.20

Glucose (mg) 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70

Dung dịch KMnO4 0.1N (mL) 12.4 12.7 13.0 13.3 13.6 13.8 14.1 14.1 14.7 15.0 15.2 15.5 15.9 16.1 16.4 16.6 16.9 17.2 17.5 17.7 18.0 18.3 18.6 18.8 19.1 19.4 19.6 19.9 20.2 20.4

Glucose (mg) 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100

Dung dịch KMnO4 0.1N (mL) 20.7 21.0 21.2 21.4 21.7 22.0 22.3 22.5 22.8 23.0 23.2 23.5 23.8 24.0 24.2 24.5 24.7 25.0 25.2 25.5 25.7 26.0 26.2 26.5 26.7 27.0 27.3 27.5 27.7 28.0

Phụ trang – Bảng 2: Đường nghịch chuyển theo phương pháp Bertrand Đường nghịch chuyển (mg) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Dung dịch KMnO4 0.1N (mL) 3.24 3.55 3.87 4.17 4.49 4.80 5.12 5.43 5.73 6.05 6.36 6.67 6.96 7.27 7.57 7.84 8.14 8.45 8.74 9.03 9.33 9.63 9.94 10.10 10.40 10.70 11.00 11.30 11.60 11.90 12.20

Đường nghịch chuyển (mg) 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70

Dung dịch KMnO4 0.1N (mL) 12.5 12.7 13.0 13.3 13.6 13.9 14.1 14.4 14.7 15.0 15.2 15.5 15.8 16.1 16.4 16.6 16.9 17.2 17.4 17.7 18.0 18.2 18.5 18.8 19.0 19.3 19.5 19.8 20.1 20.3

Đường nghịch chuyển (mg) 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100

Dung dịch KMnO4 0.1N (mL) 20.5 20.8 21.1 21.3 21.6 21.8 22.1 22.4 22.6 22.9 23.2 23.4 23.7 23.9 24.1 24.3 24.6 24.8 25.1 25.3 25.6 25.9 26.1 26.3 26.6 26.8 27.0 27.3 27.5 27.8

Phụ trang – Bảng 3: Đường lactose theo phương pháp Bertrand Đường lactose (mg) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Dung dịch KMnO4 0.1N (mL) 2.26 2.48 2.70 2.92 3.13 3.36 3.49 3.80 4.02 4.23 4.47 4.70 4.90 5.12 5.35 5.55 5.77 5.97 6.21 6.40 6.62 6.85 7.07 7.28 7.47 7.66 7.89 8.11 8.32 8.55 8.73

Đường lactose (mg) 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70

Dung dịch KMnO4 0.1N (mL) 8.94 9.14 9.35 9.54 9.74 9.98 10.10 10.30 10.50 10.80 11.00 11.10 11.30 11.60 11.80 11.90 12.10 12.30 12.60 12.80 13.00 13.20 13.30 13.60 13.80 14.00 14.20 14.40 14.60 14.80

Đường lactose (mg) 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100

Dung dịch KMnO4 0.1N (mL) 15.00 15.20 15.40 15.60 15.80 16.10 16.3 16.40 16.60 16.80 17.00 17.20 17.40 17.60 17.70 18.00 18.20 18.40 18.60 18.80 18.90 19.20 19.40 19.60 19.80 19.90 20.10 20.30 20.60 20.7

Phụ trang – Bảng 4: Xác định glucose, fructose, lactose, mantose theo Phương pháp Luff Schoorl đun trong vòng 10 phút

KIỂM NGHIỆM HÓA THỰC PHẨM PHẦN II – PHỤ GIA THỰC PHẨM PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Mai

Chương 1 Giới thiệu về phụ gia thực phẩm 1 Khái niệm và đặc điểm của phụ gia thực phẩm 2 Sử dụng phụ gia thực phẩm 3 Phân loại phụ gia thực phẩm 4 Quy định và kiểm tra chất lượng phụ gia thực phẩm

1. Khái niệm và đặc điểm của phụ gia thực phẩm (PGTP) (Food Additives) •

1.1 Sự ra đời của PGTP

-

Thời cổ xưa, hóa chất sử dụng để bảo quản thực phẩm là cấu phần của thực phẩm như: đường, muối ăn, dấm chua…

Cuối thế kỷ 19, khoa học phát triển sản xuất thực phẩm chuyển sang quy mô công nghiệp, sản xuất hàng loạt, dùng nhiều hóa chất trong chế biến và bảo quản thực phẩm Những hóa chất này phải có đặc thù riêng, cần được lưu ý đúng mức → khái niệm mới cho các chất này gọi chúng là phụ gia thực phẩm.

-

•

1.2 Định nghĩa về PGTP

Theo luật thực phẩm quốc tế CAC Theo Bộ Y Tế Việt Nam (867/1998/QĐ-BYT) - “PGTP là những chất không được coi là thực phẩm hay một thành phần chủ yếu của thực phẩm, có ít hay không có giá trị dinh dưỡng được chủ động cho vào thực phẩm với một lượng nhỏ, an toàn cho sức khỏe nhằm duy trì chất lượng, hình dáng, mùi vị, độ kiềm hay độ acid của thực phẩm hoặc nhằm đáp ứng cho yêu cầu về công nghệ trong sản xuất, chế biến, đóng gói, vận chuyển, bảo quản thực phẩm”.

- PGTP có thể có nguồn gốc động vật, thực vật hoặc những hóa chất được tổng hợp bằng những con đường khác nhau.

- Khái niệm trên không bao gồm chất ô nhiễm, chất bổ sung vào thực phẩm với mục đích duy trì hoặc gia tăng dinh dưỡng của thực phẩm

1.3 Phân biệt PGTP với các chất khác • Phụ gia kỹ thuật, chế biến (Processing aids) “Là những chất không phải có từ máy móc, vật chứa không có giá trị như một cấu phần của thực phẩm, được cố ý sử dụng trong chế biến nguyên liệu, thực phẩm hoặc cấu phần thực phẩm nhằm đạt được mục đích kỹ thuật trong quá trình xử lý hoặc chế biến. Chúng có thể có mặt ở dạng dư lượng hoặc dẫn xuất không tránh được trong thực phẩm dù không mong muốn”.

Những chất này cũng được coi là PGTP • Chất bổ sung dinh dưỡng (Nutritional Supplements) “Là những chất được bổ sung vào thực phẩm nhằm duy trì hoặc gia tăng giá trị dinh dưỡng của thực phẩm”.

• Chất tạp nhiễm (Contaiminants) “Là những chất không cố ý cho vào thực phẩm nhưng vẫn hiện diện do bị nhiễm từ quá trình sản xuất (trồng trọt, chăn nuôi, thu hoạch, xử lý, chế biến, đóng gói,…) hoặc do ô nhiễm từ môi trường”.

Thí dụ: - Kim loại nặng: Hg, Pb, As, Cd, Sb,…

- Độc tố vi nấm (mycotoxins): họ aflatoxin, họ orchratoxin, họ fumonisin…

- Thuốc bảo vệ thực vật: thuốc trừ sâu, trừ cỏ, diệt côn trùng - Thuốc kháng sinh - Thuốc tăng trọng

1.4 Lợi ích và rủi ro do các PGTP tạo ra Lợi ích: Bảo đảm dinh dưỡng lâu hơn Khả năng lựa chọn các loại thực phẩm cao hơn Gía cả thực phẩm sẽ rẻ hơn Rủi ro: Có thể làm thay đổi thành phần, thay đổi chất lượng của thực phẩm - Có thể tạo thành các độc tố hoặc gây độc do sử dụng không đúng quy định - Sử dụng chất sát khuẩn để che giấu thực phẩm đã biến chất hoặc hết hạn sử dụng • • -

1.5 Những tổ chức và thuật ngữ thường gặp • Hội đồng luật thực phẩm Thế giới (CAC - Codex Alimentarius Commission) • Hội đồng chuyên gia phối hợp của FAO/WHO về PGTP (JECFA – Joint FAO/WHO expert committee on food additives) • Hội tiêu chuẩn Quốc tế (ISO – International Standard Oganization) • Chương trình về nghiên cứu an toàn hóa học trên động vật (IPCS – International Programme on Chemical Safety) • Tổ chức quốc tế của Hội người tiêu dùng (TOCU – The International Organiration of Consumer Unions) • Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA - Food and Drug Administration) • Hệ thống phân tích mối nguy hại và giám sát an toàn thực phẩm (HACCP – Hazard Analysis and Critical Control Point) • Thực hành tốt sản xuất (GMP – Good Manufacturing Practice) • Thực hành tốt sản xuất nông nghiệp (GAP – Good Agriculturing Practice)

• Mỗi phụ gia có một mã số được đánh số theo: - Hệ thống Quốc tế - INS (International Numbering System) được CAC ký hiệu cho từng loại thực phẩm - Hệ thống Châu Âu – EEC - CAS (Chemical Abtract Service) - CI (Index Colour) cho phẩm màu Thí dụ: Mã số cho Chlorophyll có nguồn gốc từ thực vật INS: 140 EEC: E140 CAS No. Phaeophytin a, Magnesium Complex: 479-61-8 Phaeophytin b, Magnesium Complex: 519-62-0 CI (1975) No. 75810 CI (1975) Natural Green 3

• Liều chấp nhận hằng ngày – ADI (Acceptable Daily Intake) - Là liều xác định cho mỗi phụ gia thực phẩm mà người ta ăn vào hằng ngày thông qua thực phẩm hoặc nước uống mà không gây ảnh hưởng đến sức khỏe, được tính theo mg/kg thể trọng/ngày.

- ADI không giới hạn - NL (not limited) hoặc không cần thiết NS (not speciffied) phải quy định cụ thể cho chất phụ gia vì: + Có độ độc thấp + Không gây tác hại đến sức khỏe người tiêu dùng + Liều ADI tạm thời – TE-ADI (Temporary Acceptable Daily Intake) do chưa có đủ số liệu nghiên cứu về mọi khía cạnh ảnh hưởng của phụ gia này nhưng độc tính không cao hoặc chưa có bằng chứng về tác hại nên tạm thời được phép sử dụng - Trong quy định của BYT (3742/2001) liều ADI còn sử dụng ký hiệu CQĐ (chưa quy định), CXĐ (chưa xác định)

• Lượng tối đa ăn vào hằng ngày – MTDI (Maximum Tolerable Daily Intake) là lượng tối đa mà có thể chấp nhận thông qua thực phẩm được tính theo mg/kg thể trọng/ngày.

• Giới hạn tối đa trong thực phẩm – ML (Maximum Level) là mức tối đa được phép của phụ gia sử dụng trong quá trình sản xuất, chế biến, xử lý, bảo quản thực phẩm • Giới hạn dư lượng tối đa – MRL (Maximum Residue Level) • Thực hành sản xuất tốt – GMP (Good Manufacturing Practice) là việc đáp ứng các yêu cầu sử dụng phụ gia trong quá trình sản xuất, chế biến, xử lý, bảo quả, vận chuyển,… bao gồm - Hạn chế tới mức thấp nhất lượng phụ gia cần thiết phải sử dụng - Phụ gia có thể trở thành một thành phần của thực phẩm nhưng không ảnh hưởng đến tính chất lý hóa hay các giá trị khác của thực phẩm

2 Sử dụng PGTP

2.1 Nguyên tắc sử dụng

Đáp ứng nhu cầu về công nghệ và tuân thủ nguyên tắc về vệ sinh an toàn thực phẩm. Do vậy, PGTP được sử dụng phải đáp ứng yêu cầu về chất lượng trên hai mặt: ❖ Tính an toàn - Dùng đúng PGTP cho phép - Dùng đúng liều quy định (ADI, ML) ❖ Đáp ứng yêu cầu về công nghệ có hiệu quả kinh tế cao → bảo đảm các tính kỹ thuật sau - Tạo ra kết quả mong muốn - Tương thích với sản phẩm - Không gây chất lượng xấu - Luôn giữ kết quả tạo ra trong suốt tuổi thọ của thực phẩm - Không làm giá thành cao

2.2 Đặc tính chủ yếu của PGTP Một cách tổng quát, đặc tính của PGTP gồm các điểm sau: • Đặc tính về nhận diện, nhận danh - Tên gọi - Công thức - Mã số - Mô tả • Đặc tính về công dụng - Chức năng sử dụng - Liều lượng sử dụng: ADI, ML, GMP,…

• Độ tinh khiết - Hàm lượng tinh khiết của phụ gia cần đạt - Hàm lượng các dẫn xuất trung gian, dẫn xuất phụ, các kim loại nặng • Các phương pháp thử có liên quan

2.3 Phân loại phụ gia thực phẩm Theo công dụng và chức năng sử dụng PGTP được phân loại thành từng nhóm chất tùy từng Quốc gia, tổ chức 1.3.1 Sự phân loại trên Thế giới • Theo Pháp, phân thành 9 nhóm sau: A – Chất tạo màu B – Chất bảo quản C – Chất chống oxy hóa D – Chất nhủ hóa, ổn định, làm sệt, tạo gel E – Chất chống vón F – Chất tạo cấu trúc G – Chất tạo vị H – Chất tạo mùi I – Chất điều chỉnh và các chất linh tinh khác

• Theo EEC gồm 18 nhóm 1- Chất tạo màu 11- Chất chống vón 2- Chất bảo quản 12- Chất chống bọt 3- Chất chống oxy hóa 13- Bột nở 4- Chất nhủ hóa 14- Amodon biến tính 5- Chất làm sệt 15- Chất bao bọc 6- Chất tạo gel 16- Muối nền (dùng trong sx phomat) 7- Chất ổn định 17- Chất xử lý bột 8- Chất tạo vị 18- Hương liệu 9- Chất acid hóa 10- Chất điều chỉnh độ acid

• Theo CAC gồm 20 nhóm 1. Chất điều chỉnh độ chua 2. Chất chống vón 3. Chất chống oxy hóa 4. Chất chống bọt 5. Chất nhủ hóa 6. Chất ngọt nhân tạo 7. Chất tạo màu 8. Chất tạo nhủ 9. Các men (enzym) 10. Hương liệu

11. Chất tăng vị 12. Chất xử lý bột 13. Chất tạo băng 14. Tinh bột biến tính 15. Phosphat 16. Chất bảo quản 17. Chất phun xịt 18. Bột nở 19. Chất ổn định 20. Chất tạo sệt, tạo gel

2.3.1 Quá trình phát triển về việc sử dụng PGTP ở nước ta • • • • •

• • • •

Trước 1992 Năm 1992, BYT ban hành quyết định số 505BYT ngày 19/4/1992 quy định cho phép sử dụng 13 phẩm màu thực phẩm trong đó: Phẩm màu tự nhiên: 5 chất Phẩm màu tổng hợp: 8 chất Năm 1994, bổ sung quyết định 505BYT ban hành ngày 21/11/1994 cho phép sử dụng 10 nhóm PGTP gồm 81 chất Năm 1998, theo 867/1998/QĐ-BYT ngày 4/4/1998 gồm 16 nhóm với 240 chất Năm 2001, theo 3742/2001/QĐ-BYT ngày 31/8/2001 gồm 22 nhóm với 270 chất không kể nhóm hương liệu. Nhóm này gồm: 12 chất tự nhiên: vani, dầu hạnh nhân, dầu ớt, dầu bạc hà, dầu quế, anh đào, nguyệt quế,… và 51 chất tổng hợp Năm 2003, theo quyết định số 4021/2003/QD-BYT ngày 30/7/2003 của bộ Y Tế về quy định đánh giá vệ sinh an toàn cho 20 chất PGTP Năm 2010 ban hành QCVN 4-12: 2010/BYT dự thảo về QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA CHO PHỤ GIA THỰC PHẨM – CHẤT BẢO QUẢN) Năm 2012 ban hành thông tư số 27/2012/TT-BYT ngày 30/11/2012 về các PGTP được phép sử dụng gồm 400 chất Năm 2015 ban hành thêm thông tư số 08/2015/TT-BYT ngày 11/5/2015 bổ sung một số PGTP.

CHỨC NĂNG VÀ CÔNG DỤNG CỦA PGTP 1. Chất bảo quản (Preservatives): Cản trở sự phát triển của vi khuẩn làm chậm hay hư hại của thực phẩm 2. Chất chống đông vón (Anticaking agents): Đề phòng sự đông vón và tạo sự đồng nhất trong sản phẩm thực phẩm 3. Chất chống oxy hóa (Anti Oxydants): Đề phòng hay cản trở sự oxy hóa trong thực phẩm 4. Chất chống tạo bọt (Antifoaming agents): Làm mất khả năng tạo bọt trong thực phẩm 5. Chất điều chỉnh độ acid (Acidity regulators): Duy trì hay trung hòa độ acid (độ chua) của thực phẩm 6. Chất điều vị (Flavour enhancers): Làm tăng hay cải thiện vị của thực phẩm 7. Hương liệu (Flavours): Tạo mùi thơm cho thực phẩm (kể cả các gia vị đặc biệt) 8. Chất đông đặc và làm dày (Gelling agents and thicheners): Làm đông, tạo keo, làm kết dính, tăng khối lượng lớn, tạo cấu trúc, tăng độ dày của thực phẩm

9. Chất làm rắn chắc (Firming agents): Làm tăng độ rắn chắc tránh sự vỡ nát của thực phẩm 10. Các men (Enzyms): Xúc tác quá trình chuyển hóa trong chế biến thực phẩm 11. Chất nhủ hóa (Emulsiliers): Tạo hệ phân tán đồng nhất của sản phẩm 12. Chất ổn định (Stabiliers): Làm ổn định sự phân tán đồng nhất của thực phẩm 13. Phẩm màu (Colours): Tạo ra hoặc cải thiện màu sắc của thực phẩm 14. Chất tạo phức kim loại hòa tan (Sequestrants): tạo phức hòa tan với các kim loại đa hóa trị, cải thiện chất lượng và tính vững chắc của thực phẩm 15. Chất tạo ngọt nhân tạo (Antificial Sweetners): Tạo vị ngọt cho thực phẩm 16. Chế phẩm tinh bột (Modified Starches): Làm tăng độ dày, độ đông đặc, độ ổn định và tăng khối lượng của thực phẩm

DANH MỤC VÀ SỐ LƯỢNG PHỤ GIA THỰC PHẨM ĐƯỢC PHÉP THEO TCVN đến nay 1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

Các chất bảo quản: 36 chất Các chất chống oxi hóa: 21 chất Các chất chống vón: 20 chất Các chất chống tạo bọt: 2 chất Các chất điều chỉnh độ acid: 68 chất Các chất điều vị: 24 chất Các hương liệu: 63 chất ➢ tự nhiên: 12 chất ➢ tổng hợp: 51 chất Các chất đông đặc và làm dày: 23 chất Các chất làm rắn chắc: 6 chất Các men (enzym): 6 chất Các chất nhũ hóa: 38 chất

12. Các chất ổn định: 18 chất 13. Các phẩm màu: 50 chất ➢ tự nhiên: 34 chất ➢ tổng hợp: 16 chất 14. Các chất tạo phức kim loại: 17 chất 15. Các chất ngọt nhân tạo: 14 chất 16. Các chất độn: 8 chất 17. Các chất đẩy khí: 3 chất 18. Các chất làm bóng: 7 chất 19. Các chất làm ẩm: 2 chất 20. Các chất tạo xốp: 2 chất 21. Các chất xử lý bột: 21 chất 22. Các chất tạo bọt: 2 chất 23. Chất mang: 4 chất 24. Chất tẩy màu : 1 chất

Nhóm các chất bảo quản Acid Benzoic • Chỉ số INS: 210 ADI: 0-5 mg/kg thể trọng • Dùng trong: nước giải khát, rau củ, thịt gia cầm, thủy sản...

• Lượng tối đa cho phép: 100 – 2000 mg/kg Kali Nitrat • Chỉ số INS: 252 ADI: 0-3.7mg/kg thể trọng • Dùng trong: thịt hộp, thịt muối, lạp xưởng, jambon, phomat...

• Lượng tối đa cho phép: 37 – 1354 mg/kg tính theo NO3-

Nhóm chất chống oxi hóa Acid Ascorbic (L-) • Chỉ số INS: 300 ADI: CXĐ • Dùng trong: sữa bột, kem, rau củ, thịt, thủy sản, nước quả ép, thức ăn dành cho trẻ em...

• Lượng tối đa cho phép: 50 – 2000 mg/kg Alpha - Tocopherol • Chỉ số INS: 307 ADI: 0.15-2mg/kg thể trọng • Dùng trong: sữa, sữa lên men, kem...

• Lượng tối đa cho phép: 200 mg/kg

Butyl Hydroxy Anisol (BHA) • Chỉ số INS: 320 ADI: 0-0.5mg/kg thể trọng • Dùng trong: dầu, mỡ, margarin ...

• Lượng tối đa cho phép: 175-200 mg/kg

Nhóm phẩm màu Vàng Riboflavin (Lactoflavin) – phẩm màu tự nhiên • Nhóm chất màu: Iso alloxazin • Chỉ số INS: 101i ADI: 0-0.5mg/kg thể trọng • Dùng trong: đồ uống có sữa, bơ, margarin,cacao, mứt, kẹo, thức ăn cho trẻ em, nước ép quả đóng hộp...

• Lượng tối đa cho phép: GMP – 500 mg/kg Vàng sunset FCF (Sunset yellow FCF) – phẩm màu tổng hợp • Nhóm chất màu: Monoazo • Chỉ số INS: 110 ADI: 0-2.5mg/kg thể trọng CI 1975 NO 15985 CI food yellow 3 FD&C yellow 6, Crelberange S • Dùng trong: đồ uống, thực phẩm lỏng, kem, đồ hộp trái cây, mứt...

• Lượng tối đa cho phép: 30-300 mg/kg

Nhóm hương liệu Vani – hương liệu tự nhiên • Chỉ số INS: ADI: CQĐ • Dùng trong: mứt, thạch, kem, thức ăn trẻ em đóng hộp, sản phẩm ngũ cốc chế biến cho trẻ em dưới 1 tuổi...

• Lượng tối đa cho phép: GMP Etyl vanilin • Chỉ số INS:ADI: 0 -5mg/kg thể trọng • Dùng trong: thức ăn cho trẻ em đóng hộp và ngũ cốc chế biến cho trẻ em 70 mg/kg , kem GMP...

Isobutanol • Chỉ số INS: 321 ADI: 0-0.125mg/kg thể trọng • Dùng trong: dầu, mỡ, margarin ...

• Lượng tối đa cho phép: 75-100 mg/kg

Nhóm điều vị Acid glutamic [L(+)-] và các muối • Chỉ số INS: 620 ADI: CXĐ • Dùng trong: dầu trộn, gia vị (tương tự muối) • Lượng tối đa cho phép: GMP

Acid guanilic và các muối • Chỉ số INS: 626 ADI: CXD • Dùng trong: dầu trộn, gia vị (tương tự muối) • Lượng tối đa cho phép: GMP Acid inosinic và các muối • Chỉ số INS: 630 ADI: CXD • Dùng trong: dầu trộn, gia vị (tương tự muối) • Lượng tối đa cho phép: GMP

181

Nhóm chất tạo ngọt Aspartam • Chỉ số INS: 951 ADI: 0 – 40 mg/kg thể trọng • Chức năng khác: điều vị • Dùng trong: sữa chocola, sữa cacao, bia trứng, sữa chua, sữa đặc, mứt, hoa quả ngâm đường, bia, rượu vang,…

• Lượng tối đa cho phép: 600 – 10000 mg/kg Sacarin và các muối Na, K, Ca, của nó • Chỉ số INS: 594 ADI: 0 – 5 mg/kg thể trọng • Dùng trong: sữa lên men, mứt cô đặc, mứt hoa quả, kẹo cao su, bia, nước giải khát, nước quả cô đặc, nước rau cô đặc • Lượng tối đa cho phép: 50 – 300 mg/kg Isomalt • Chỉ số INS: 953 ADI: CXD • Chức năng khác: chống vón, độn, làm bóng • Dùng trong: sữa lên men (có xử lý nhiệt), thịt thuỷ sản, dầu trộn, thức ăn cho trẻ em dưới 1 tuổi, thức ăn bổ sung cho trẻ đang tăng trưởng.

182 • Lượng tối đa cho phép: GMP

1.4 Quy định về kiểm tra chất lượng PGTP • -

1.4.1 Yêu cầu chung về sử dụng PGTP PGTP đạt tiêu chuẩn độ tinh khiết dùng trong thực phẩm Sử dụng PGTP ghi rõ tên PGTP trên nhãn hàng Nhiệm vụ của công tác thử nghiệm: + Đối với PGTP: - Có được phép sử dụng hay không bằng phép định tính - Có đạt chất lượng tinh khiết dùng trong thực phẩm đối với các PGTP được phép sử dụng + Đối với các loại TP có dùng PGTP: - PGTP sử dụng có trong “Danh mục cho phép theo TCVN hay không”. Đối với thực phẩm có PG không có trong danh mục cho phép theo TCVN nhưng có trong danh mục theo các CAC sẽ được BYT xem xét sau.

- Nếu PGTP sử dụng có trong danh mục cho phép thì cần xác định định lượng để kiểm soát (theo giới hạn tối đa cho phép)

1.4.2 Những tiêu chí tổng quát cho các tiếu chuẩn, các phép kiểm nghiệm và khảo sát (theo JECFA) • Tên PGTP: là tên của PGTP hoặc nhóm PGTP theo quan điểm của JECFA, hầu như tương tự tên của chất đó • Các tên đồng nghĩa (Synonyms): là các tên, viết tắt. Hệ thống mã số quốc tế (INS) theo CAC, EEC hoặc USA FD & C (chất màu thực phẩm) • Định nghĩa: Xác định chất phụ gia. Tên hóa học, công thức, cấu trúc, khối lượng phân tử. Một số chất ghi thêm: nguồn gốc tự nhiên, hỗn hợp • Tên hóa học: theo IUPAC • Công thức hóa học và công thức cấu tạo: cho chất phụ gia hoặc có hoạt tính • Khối lượng phân tử: theo bảng “Khối lượng phân tử tương đối” của IUPAC 1987 • Thử (assay): yêu cầu một cách định lượng về lượng tối thiểu chấp nhận hoặc khoảng chấp nhận của các cấu tử cơ bản

• Mô tả: các đặc trưng lý tính hoặc các tính chất khác như độ bền, màu, mùi, vị. Cần phải nêu các điều kiện cho việc sử dụng, bảo quản, không cần nêu mức độ • Chức năng sử dụng: Cần chỉ rõ các kỹ thuật của phụ gia trong thực phẩm và trong quá trình chế biến thực phẩm • Những đặc trưng: - Thử nghiệm so sánh: chủ yếu để nhận danh theo một số thông số vật lý như độ tan, khối lượng riêng, chỉ số khúc xạ - Thử nghiệm độ tinh khiết các chất nhiễm bẩn dạng vết cũng như các thông số khác như các tính chất vật lý phục vụ quá trình sản xuất. Giới hạn các chất này theo GMP và ADI của JECFA • Thử nghiệm: nêu các quy trình và các điều kiện cho các phép thử định tính, thử độ tinh khiết • Phương pháp thử: Nêu phương pháp và nguyên lý của phương pháp, thống kê các thiết bị, thuốc thử, quy trình phân tích cụ thể và công thức tính kết quả

Chương 2 Chất bảo quản thực phẩm 1 Giới thiệu ❑ Định nghĩa ❑ Phân loại ❑ Sử dụng phụ gia 2 Phương pháp kiểm nghiệm ❑ Nhận danh ❑ Định lượng

1. Giới thiệu chung 1. 1 Định nghĩa: là chất thông thường không phải là một thành phần của TP được cố ý cho vào mà với sự hiện diện của nó hoặc dẫn xuất của nó có khả năng ngăn ngừa, hạn chế sự hư hỏng của TP do sự phát triển của vi sinh vật để nhằm kéo dài thời gian sử dụng của TP. Chúng không đóng vai trò là một chất sát khuẩn.

• Về mặt hoá học: tác dụng chống sự phát triển vi sinh vật được dựa vào các quá trình hấp phụ, khuyếch tán, giải hấp hoặc sự phân huỷ các nhánh tế bào • Ở tác dụng khác, dựa vào các phản ứng hoá học với các thành phần của tế bào như sự thay thế các nhóm có khả năng phản ứng của enzyme ví dụ: -SH, -CO, -NH2… tác dụng này phụ thuộc vào pH, nhiệt độ của mỗi loại vi sinh vật và số lượng mầm ban đầu.

1.2 Sử dụng chất bảo quản thực phẩm Lợi ích khi sử dụng phụ gia trong chế biến thực phẩm: ▪ Giảm bớt những xử lý về nhiệt ▪ Bảo quản ở nhiệt độ thông thường thay vì các điều kiện lạnh/đông ▪ Kéo dài thời gian xử dụng Có thể sử dụng riêng lẽ hoặc phối hợp nhiều chất bảo quản để tăng hoạt tính của chúng

• • •

1.3 Phân loại

Do sự tiện dụng và kinh tế, các hoá chất bảo quản thực phẩm được sử dụng rộng rãi phổ biến Các chất bảo quản có thể là các hợp chất hữu cơ hoặc là các hợp chất vô cơ.

Danh mục phụ gia bảo quản được phép sử dụng theo TCVN 2001/2012/2015.

Tên phụ gia

STT

INS

1

200

Acid sorbic

Sorbic acid

2

201

Natri sorbat

Sodium sorbate

3

202

Kali sorbat

Potassium sorbate

4

203

Calci sorbat

Calcium sorbate

5

210

Acid benzoic

Benzoic acid

6

211

Natri benzoat

Sodium benzoate

7

212

Kali benzoat

Potassium benzoate

8

213

Calci benzoat

Calcium benzoate

9

214

Etyl p-hydroxybenzoat

Ethyl p-hydroxybenzoate

10

216

Propyl p-hydroxybenzoat

Propyl p-hydroxybenzoate

11

218

Methyl p-hydroxybenzoat

Methyl p-hydroxybenzoate

12

220

Sulphua dioxyd

Sulfur dioxyde

Chất chống oxy hoá

13

221

Natri sulfit

Sodium sulfite

Chất chống oxy hoá, chất tẩy màu, chất xử lý bột

14

222

Natri hydro sulfit

Sodium hydrogensulfite

15

223

Natri metabisulfit

Sodium metabisulfite

Tiếng Việt

Tiếng Anh

Chức năng khác

Chất chống oxy hoá

Chất chống oxy hoá, chất tẩy màu, chất xử lý bột 189

Tên phụ gia

STT

INS

16

224

Kali metabisulfit

Potassium metabisulfite

17

225

Kali sulfit

Potassium sulfite

18

227

Calci hydrosulfit

Calcium hydrogensulfite

19

228

Kali bisulfit

Potassium bisulfite

20

231

Ortho-phenylphol

Ortho-phenylphol

21

232

Natri ortho-phenylphenol

Sodium ortho-phenylphenol

22

234

Nisin

Nisin

23

235

Natamycin

Natamycin

24

236

Acid formic

Formic acid

25

239

Hexa methylen tetramin

Hexa methylene tetramine

26

242

Dimethyl dicarbonat

Dimethyl dicarbonate

27

243

Lauric arginat ethyleste

Lauric arginate ethylester

28

249

Natri nitrit

Sodium nitrite

29

250

Kali nitrit

Potassium nitrite

30

251

Natri nitrat

Sodium nitrate

Chất giữ màu

31

252

Kali nitrat

Potassium nitrate

Chất giữ màu

32

280

Acid propionic

Propionic acid

33

281

Natri propionat

Sodium propionate

34

282

Calci propionat

Calcium propionate

35

283

Kali propionat

Potassium propionate

36

1105 Lysozym

Tiếng Việt

Tiếng Anh

Chức năng khác Chất chống oxy hoá, chất tẩy màu, chất xử lý bột

Chất chống oxy hoá, chất tạo phức kim loại Chất chống oxy hoá Chất chống vón

Lysozyme 190

❑Những chất sau đây bị cấm bởi tổ chức WHO-FAO – H3BO3 và Na2B4O7 (borat – hàn the): Do chất này gây ngộ độc tích luỹ, có nguy cơ gây ung thư nên WHO cấm sử dụng để bảo quản thực phẩm. Ở Việt Nam hiện nay, các chất này cũng bị cấm.

– Formol HCHO, Formalin là dung dịch 40% HCHO: • Về mặt dinh dưỡng, HCHO kết hợp với nhóm –NH2 của acid amin hình thành những dẫn xuất bền với các men tiêu hoá, ảnh hưởng xấu đến sự tiêu hoá, hấp thu và tổng hợp protein.

• Là một chất sát khuẩn có tác dụng khử mùi, che dấu tính hư hỏng, ôi thiu của TP làm ảnh hưởng đến công tác bài gian.

Formol còn có thể gây đột biến gene.

191

❑Những chất sau đây bị cấm bởi tổ chức WHO-FAO – Haxa methylen tetramin (CH2)6N4 (urotropin): Trong môi trường acid hoặc có protein chất này bị phân huỷ dần dần tạo ammoniac và formol. Do đó tính độc hại của nó cũng giống như ammoniac và formol.

– Acid salicylic C7H6O3 : Trước đây chất này được sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm trong các loại mứt nghiền (11g/1kg). Ngày nay, nó bị cấm do thử nghiệm trên động vật thấy có hiện tượng giãn mạch ngoại vi, hạ thấp tỉ lệ prothrombin trong máu, nổi mụn da, hoại tử gan, dễ bị xuất huyết dạ dày, ruột. Vì lẽ đó, WHO cấm không cho phép dùng chất này làm bảo quản TP. 192

2. Phương pháp kiểm nghiệm 2.1 Nhận danh qua phản ứng định tính 2.1.1 Phát hiện hàn the hoặc acid boric Để phát hiện thực phẩm có chứa acid boric hoặc hàn the hay không, người ta dùng giấy tẩm nghệ (giấy tẩm curcumin) được làm ướt, đậy lên mẫu TP. Nếu có hàn the thì tờ giấy nghệ chuyển từ vàng sang đỏ. Khi tờ giấy nghệ không thay đổi màu tức không có hàn the

Màu vàng

Màu cam đỏ

+ H3BO3

193

2.1.2 Phát hiện nhanh nitrit Phạm vi áp dụng: nước ăn uống, đồ uống, nước giải khát không màu Nguyên lý:Dựa trên phản ứng của nitrit với thuốc thử Griess ▪ Ở pH ~ 2 – 2.5, nitrit sẽ azo hoá acid sulfanilic, sau đó kết hợp với α-naptylamin cho ra hợp chất naptylamino azobenzen sulfonic có màu đỏ (bền ở 15 oC và không bền ở nhiệt độ cao) ▪ Phản ứng rất nhạy cho màu đỏ ngay tức thời ở nồng độ 10 -5 M và sau 5 phút ở nồng độ 10-8 M. Nếu phản ứng không xuất hiện màu đỏ, tức không có nitrit (khoảng sau 15 phút).

Hoá chất: 1.

2.

Thuốc thử Griess A: Hoà tan 0.5g acid sulfanilic vào 150 mL acid acetic 30%, khuấy đều, bảo quản trong chai tối màu.

Thuốc thử Griess B: : Hoà tan 0.1g α-naptylamin vào 20 mL nước cất, đun sôi, thêm vào dung dịch này 150 mL acid acetic 5%, trộn đều, bảo quản trong chai tối màu.

Tiến hành thử: Lấy 5 mL mẫu lỏng cho vào ống nghiệm, thêm 5 giọt thuốc thử Griess A, 5 giọt thuốc thử Griess B. Lắc đều và quan sát so sánh với ống nghiệm mẫu nước cất không có nitrit được thực hiện song song trong cùng điều kiện. Đánh giá: Nếu xuất hiện màu đỏ sau 10 – 15 phút, tức là có mặt của nitrit, vi phạm 194 giới hạn tối đa cho phép hiện hành theo quy định về nitrit trong đồ uống TP lỏng.

2.1.3 Nhận biết các chất bảo quản bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) ▪ Phương pháp này dùng nhận biết acid benzoic, acid sorbic, acid salicylic, acid p-hydroxybenzoic (pHB) cũng như là các pHB ester.

▪ Trong số các hợp chất đã nêu trên chỉ có acid benzoic, acid sorbic và pHB ester những chất khác đều bị cấm.

Phạm vi áp dụng: sản phẩm từ thịt, nước sốt mù tạt, nước quả ép, đồ hộp, dưa chuột muối chua, rau đóng hộp muối chua, sốt mayonnaise

Nguyên lý: Chiết các chất bảo quản bằng hỗn hợp diethylether – ether dầu hoả từ thực phẩm, tách các chất bằng SKLM trên chất mang polyamide phát hiện các chất dưới vệt tối trên nền huỳnh quang vàng lục dưới đèn UV.

Hoá chất, dụng cụ: 1.

2.

3.

Bảng mỏng polyamide/UV 254 bán sẵn 20x20 Dung môi pha động: Ether dầu hoả/ CCl4/ CHCl3/HCOOH/CH3COOH 50 40 20 28 2 (v/v) Các dung dịch chuẩn để so sánh: acid benzoic, acid sorbic, acid salicylic, acid pHB, pHB ester (methyl-, ethyl-, propyl-) mỗi chất 0.1 – 0.2% trong ethanol.

195

Tiến hành thử: ➢ Chuẩn bị mẫu thử A1) Chất lỏng: ✓ Lấy ~ 50 – 100 mL mẫu thử, acid hoá bằng 10 mL H 2SO4 20%, chiết 3 lần bằng hỗn hợp dung môi diethyl ether/ ether dầu hoả mỗi lần 25 mL, lắc 3 phút, tách lớp ether. Nếu đục cần thêm vài giọt ethanol. ✓ Rửa lớp ether bằng nước cất ~ 5 – 10 mL, làm khô bằng Na2SO4 khan ✓ Đem cô quay, đuổi bớt dung môi (30 – 35oC) cho đến cạn, hoà tan cặn trong 1mL ethanol A2) Chất rắn (hoà tan được trong nước): Hoà tan mẫu trong 50 – 100 mL nước cất, rồi thực hiện giống A1 A3) Chất rắn (không hoà tan được trong nước): Lấy ~ 20g mẫu, xắt nhỏ, nghiền mịn với cát. Cho vào erlen và chiết 3 lần, mỗi lần 25 mL diethyl ether/ ether dầu hoả, lắc ~ 3 phút, làm sạch lớp dung môi hữu cơ và thực hiện tiếp tục như A1 196

➢ Tách bằng sắc ký lớp mỏng ▪ Chấm 3 – 5 μL dung dịch mẫu đã chuẩn bị ở mục A và 2 μL dung dịch chuẩn lên bảng mỏng.

▪ Đặt bảng vào bình sắc ký đã chứa sẵn hỗn hợp dung môi pha động. Khi dung môi chạy được khoảng 13 cm, lấy bảng ra sấy khô ở 110oC, lặp lại động tác trên lần nữa. Làm khô và chiếu đèn UV 254 nm.

▪ Sắc ký đồ sẽ cho các vệt tối trên nền vàng lục.

▪ Acid salicylic cho màu xanh chàm huỳnh quang là chất bảo quản duy nhất quan sát được dưới ánh UV 366 nm ▪ Để phân biệt chính xác các acid carboxylic thì cần phải tạo dẫn xuất, ví dụ như acid sorbic, acid benzoic.

197

Tạo dẫn xuất để phân biệt acid benzoic và acid sorbic a) Nguyeân lyù: Caùc chaát baûo quaûn ôû daïng acid (benzoic, sorbic) chieát baèng ete etylic. Dòch chieát ñöôïc chaám leân baûng moûng. Cho caùc acid carbonyl phaûn öùng vôùi -brom-2 acetophenon trong söï coù maët cuûa liticarbonat laøm xuùc taùc ôû 60oC ñeå taïo ra daãn xuaát. Daãn xuaát este cuûa chuùng taùch ra vaø nhaän bieát qua söï phaùt huyønh quang.

HQ

b) Hoùa chaát, thieát bò vaø duïng cuï: •  brom- 2 acetophenon C10H7COCH2Br • Li2CO3; CaCl2.2H2O; HCl 4mo/l; KOH 4mol/l • Parafin loûng; aceton; 4-hexan; acetonitril (ACN); dietyl ete

Ñieàu cheá dung dòch: • -brom-2 acetophenon • 50mg -brom-2acetophenon trong 10 ml, acetonitril • (Pha môùi moãi tuaàn, baûo quaûn trong tuû laïnh) • Dung dòch liticarbonat : 0,3 Li2CO3 hoøa tan trong 100 ml nöôùc caát • Thuoác thöû trao ñoåi : Parafin loûng /n-hexan 1+2 (v/v) • Dung moâi ñoäng : Toluen/aceton 20+0,50 (v/v) • Dung dòch chaát chuaån : a benzoic, a.sorbic, a.propionic, a. salicylic, p-hydroxybenzoic, caùc este cuûa p.hydroxybenzoic (PHB) moãi thöù 200mg/100 ml ete • Duïng cuï: – Bình saéc kyù – Thieát bò coâ quay, ñeøn UV coù  = 254 nm vaø  = 366 nm – Caùc duïng cuï khaùc nhö pheåu chieát, pipet

c) Cách tiến hành ❑Chuẩn bị mẫu ▪ Cho ~ 1g mẫu vào erlen + HCl 4M cho tới phản ứng acid (pH <7) + 40 mL aceton, lắc mạnh trong một phút. Với mẫu có tính kiềm thì thêm ~ 2 mL HCl ▪ Đun hỗn hợp lên 60oC (chậm rãi). Làm nguội đến nhiệt độ phòng.

▪ Lọc khô, lấy 20 mL dung dịch qua lọc vào erlen 200 + 60 mL nước cất, kiềm hoá bằng NaOH 4M đến pH 10.

▪ Thêm tiếp 1g CaCl2, lắc mạnh, lọc mẫu vào phễu chiết 250 mL + 75 mL ete etylic, lắc mạnh trong 1 phút.

▪ Thu pha nước vào một erlen khác, bỏ lớp ete, acid hoá lại pha nước bằng HCl 4M xuống pH 2 rồi chiết hai lần, mỗi lần với 10 mL ete etylic.

▪ Gộp lớp ete lại, đem cô mẫu đến cạn. Hoà tan cặn bằng 1mL ete

❑Tạo dẫn xuất ▪ Chọn vị trí chấm mẫu và các chất chuẩn trên bản mỏng, thêm vào các vị trí đó 3μL dung dịch Li2CO3, làm khô bằng một luồng khí lạnh.

▪ Sau đó thêm vào các vị trí trên 10μL dung dịch tiêu chuẩn và mẫu thử, làm khô dưới luồng không khí lạnh. Cuối cùng chấm lên đó 5μL dung dịch α-bromo-2-acetophenon.

▪ Đặt bản mỏng vào tủ sấy ở 60oC, thời gian 45 phút ❑Tách sắc ký Bình sắc ký có diện tích đáy 20 x 10 thì cho vào ~ 100 mL dung môi pha động. Đậy nắp lại ~ 15 phút. Đặt bản sắc ký vào bình cho dung môi chạy được 13cm.

❑Phát hiện: Lấy bản sắc ký ra làm khô bằng dòng khí lạnh rồi đặt dưới đèn 254 và 366 nm để quan sát. Các dẫn xuất của chất bảo quản có huỳnh quang xanh lam. Acid sorbic cho vệt nổi bật còn acid propionic rất yếu. Riêng pHB chạy lên trên cùng và cho hai vệt.

2.2 Định lượng 2.2.1 Xác định acid sorbic và các muối bằng phương pháp so màu 2.2.1.1 Giới thiệu: Tên phụ gia Acid sorbic Natri sorbat Kali sorbat Calci sorbat

Công thức hoá học CH3-CH=CH-CH=CH-COOH C6H7COONa C6H7COOK (C6H7COO)2Ca

Mã số ADI INS (mg/kg thể trọng/ngày) 200 0 – 25 201 0 – 25 202 0 – 25 0 – 25 203

ML (mg/kg) 300 - 3000 300 - 3000 300 - 3000 300 - 3000

▪ Các chất này có tác dụng ức chế mạnh nấm mốc, nấm men và rất yếu đối với vi khuẩn khác nhau, vì vậy có thế sử dụng acid sorbic khi muốn giữ cho vi khuẩn lactic vẫn hoạt động tốt.

▪ Có khả năng ức chế tốt trong môi trường ở pH 5 – 6 ▪ Không độc với cơ thể người, không gây ra mùi khác lạ cho TP ▪ Dùng trong công nghiệp chế biến rau quả, chế biến rượu nho, chế biến sữa sữa chua, phomat, chế biến cá và các loại thịt nhồi xúc xích,…

▪ Trong các loại nước quả ép thường dung 0.1 – 0.2% (3742/2001/GD-BYT) ▪ Cũng như acid benzoic ở hàm lượng cao có thể sinh ra mùi vị làm giảm chất lượng 203 ▪ Chức năng khác: chất chống oxy hoá, chất ổn định

2.2.1.2 Quy trình xác định

Nguyên lý: Mẫu thực phẩm sau khi acid hoá, acid sorbic được chưng cất theo phương pháp lôi cuốn hơi nước. Oxy hoá acid sorbic đến maleic andehyd bằng K 2Cr2O7 cho phản ứng với acid 2-thiobarbituric cho ra một hợp chất màu đỏ có λmax = 532 nm, đo độ hấp thu của mẫu xác định.

Tương tự xây dựng một dãy chuẩn các chất chuẩn có nồng độ đã biết. Dựa vào đường chuẩn để xác định hàm lượng acid sorbic trong mẫu.

Hoá chất, thiết bị: 1.

2.

3.

màu đỏ

Máy quang phổ UV-VIS Dung dịch oxy hoá: K2Cr2O7 0.005 M và H2SO4 0.15 M, trộn theo tỉ lệ 1:1 Thuốc thử màu: 0.5g thiobarbituric (TBS) hoà tan với 20 mL nước, chuyển vào bình định mức 100, thêm 10 mL NaOH 1M, lắc đều, rồi thêm 11 mL HCl 1M. Thêm nước tới vạch mức, lắc đều. Dung dịch này chỉ sử dụng trong ngày 4. Dung dịch chuẩn: • Dung dịch chuẩn gốc (C=100mg/L): cân 134 mg Kali sorbat, hoà tan trong bình định mức 1000 • Dung dịch chuẩn trung gian (C=5mg/L): pha từ chuẩn gốc • Dung dịch chuẩn làm việc: Lấy vào 5 bình định mức 50 dung dịch chuẩn trung gian lần lượt các thể tích 10, 20, 30, 40, 50 mL thêm nước cất tới vạch. Nồng độ của các dung dịch chuẩn này là 50, 100, 150, 200, 250 μg acid sorbic trong 50 mL. 204

205

2.2.2 Acid benzoic và các dẫn xuất 2.2.2.1 Giới thiệu: Tên phụ gia Acid benzoic Natri benzoat Kali benzoat Calci benzoat Methyl paraben Ethyl paraben Propyl paraben ▪ ▪

▪

▪ ▪

Công thức hoá học C6H5COOH C6H5COONa C6H5COONa (C6H5COO)2Ca HO-C6H4-COOCH3 HO-C6H4-COOC2H5 HO-C6H4-COOC3H7

Mã số ADI ML INS (mg/kg thể trọng/ngày) (mg/kg) 210 0 -5 50 - 2000 211 0 -5 50 - 2000 212 0 -5 50 - 2000 213 0 -5 50 - 2000 218 0-10 GMP - 2000 214 0-10 GMP - 2000 216 0-10 GMP - 2000

Là chất sát trùng mạnh đối với nấm men, nấm mốc, có tác dụng yếu đối với vi khuẩn.

Tác dụng bảo quản ở môi trường acid (pH 2.5 - 4): ở điều kiện này, nồng độ của acid ~ 0.05% đã có khả năng kiềm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Hiệu quả bảo quản tốt khi nồng độ đạt tới 0.07 – 0.1%. Ở nồng độ này, không hại cho sức khoẻ -> nhiều quốc gia cho phép sử dụng ở nhiều loại thực phẩm khác nhau (nước táo, cà chua, nước hoa quả ép,…)

Một trở ngại lớn khi sử dụng benzoic và benzoat ở nồng độ bảo quản là đôi khi có thể nhận ra dư vị, làm giảm chất lượng của thực phẩm. Ở nước ta, sử dụng chất bảo quản này trong giới hạn 0.06 – 1%. Có thể sử dụng riêng lẻ hoặc phối hợp với các chất bảo quản khác như a. sorbic và các muối.

Người ta còn sử dụng các dẫn xuất p. hydroxybenzoic acid gọi là paraben, đó là các ester của p. hydroxybenzoic acid. Ưu điểm của các paraben là tác động mạnh đến nấm men, nấm mốc trên diện pH 206 rộng.

2.2.2.1 Nguyên lý: ▪ So màu theo tiêu chuẩn TCVN (4413 – 87)

λ = 532 nm

▪ Xác định acid benzoic và các benzoat theo phổ hấp thu UV: TCVN (6428 – 1998): ✓ Làm đồng nhất sản phẩm chiết xuất acid benzoic bằng ete etylic trong môi trường acid. Giải chiết bằng kiềm và tinh chế mẫu bằng K2Cr2O7 trong môi trường acid, đo phổ UV của acid benzoic tinh khiết trong ete etylic, dung môi so sánh là ete etylic. ✓ Phạm vi áp dụng: các loại rau quả và sản phẩm từ rau quả ✓ Ghi chú: Quy trình này không áp dụng được khi trong mẫu có clorobenzoic acid vì acid này không bị phân huỷ khi tinh chế bằng K2Cr2O7 và acid xinamic lại chuyển thành acid benzoic.

207

2.2.2.2 Cách thực hiện

208

2.2.3 Xác định nitrat, nitrit 2.2.3.1 Giới thiệu: Tên phụ gia Natri nitrat Kali nitrat Natri nitrit Kali nitrit Ghi chú:

Công thức hoá học NaNO3 KNO3 NaNO2 KNO2

Mã số ADI ML INS (mg/kg thể trọng/ngày) (mg/kg) 251 0 – 3.7 37 – 1354a 252 0 – 3.7 37 – 1354a 250 50 – 125 0 – 0.33b 249 50 – 125

a

tính theo NO3b tính theo NO - theo EPA 2 ,

▪ Ở dạng tự nhiên, nitrat tồn tại trong thực phẩm ở hàm lượng vô cùng nhỏ, chúng được thêm vào thực phẩm với chức năng là chất bảo quản trong các sản phẩm chứa đạm như: thịt heo, gà, vịt, lạp xưởng, jambong, thịt xông khói,…

▪ Nitrat và nitrit được sử dụng trong công nghệ chế biến ở nhiều quốc gia, ngoài việc ứng chế sự phát triển của vi sinh vật để kéo dài thời hạn sử dụng còn có thể làm thịt có màu đỏ hồng, tạo mùi cho thịt ướp.

▪ Về hoạt động chống vi khuẩn: ✓ Nitrat được sử dụng như một chất nhận điện tử của vi sinh vật khi đó chúng chuyển thành nitrit và chính nitrit có tác dụng ức chế vi sinh vật. ✓ Nitrit tan tốt trong nước, hoạt động tốt trong môi trường acid và điều kiện yếm khí (ức 209 chế vi khuẩn salmonella E coli), nitrit không ức chế các loại bào tử

▪ Về khả năng tạo màu: ✓ Nitrat dưới tác dụng của vi khuẩn khử biến thành nitrit. Trong môi trường acid, nitrit bị oxy hoá thành acid nitroic HONO. Chất này bị phân huỷ tạo ra NO, NO kết hợp với myoglobine (mb) tạo thành nitrosohemoglobin. Khi đun nóng, nitrosohemoglobin bị khử thành nitrosohemocromogen có màu đỏ hồng. ✓ Sự tạo màu đỏ của thịt được biểu diễn theo sơ đồ sau: vi khuẩn khử pH KNO3 HNO2 KNO2

Nitrosohem (màu đỏ hồng)

nhiệt độ

NOMb

+ mb

pH, vi khuẩn E. coli NO

▪ Bên cạnh lợi ích trên, nitrit biểu hiện độc tính như sau: khi vào máu, nó sẽ phản ứng với hemoglobine tạo thành methemoglobine làm mất khả năng vận chuyển oxy của máu gây ngộ độc.

▪ Triệu chứng ngộ độc cấp tính xuất hiện nhanh và đột ngột, khi ăn phải một lượng lớn nitrit sẽ xảy ra hiện tượng nhức đầu, chóng mặt, nôn mửa dữ dội, tiêu chảy và tiếp theo là tím tái (môi, mũi, tai, mặt và tứ chi), không điều trị kịp thời sẽ dẫn đến ngạt thở, hôn mê và chết (32 mg/kg thể trọng).

▪ NO2- còn tác dụng với amin tạo thành nitrosamine độc, có thể gây ung thư 210

2.2.3 Xác định nitrat, nitrit 2.2.3.2 Định lượng nitrit ▪ Chiết xuất nitrit và nitrat bằng nước nóng. Dịch trích ly sau khi đã loại protein thì xác định nitrit trực tiếp qua phản ứng azo hoá (acid sulfanilic và n-napthyl etylen diammonium dichloride) tạo nên một hợp chất màu tím đỏ có λmax = 540 nm.

NaNO2 + CH3COOH → NaCH3COO + HNO2

211

2.2.3 Xác định nitrat, nitrit 2.2.3.3 Định lượng nitrat ▪ Phản ứng azo tương tự như là nitrit sau khi đã khử nitrat về nitrit bằng Cd kim loại NO3- + 2e + 2H+ → NO2- + H20 ▪ Phản ứng nitro hoá: Nitrat kết hợp với phenoldisulfonic acid để tạo thành acid nitrophenoldisulfonic màu vàng. Màu sắc tăng lên khi kiềm hoá bằng dung dịch NH4OH. So sánh với dung dịch chuẩn, ta tính được hàm lượng nitrat.

▪ Ghi chú: ✓ Phản ứng phải thực hiện ở môi trường khan nước, nên cần phải làm khô mẫu thử để nitrat chuyển hoàn toàn sang acid nitric, tạo điều kiện tốt cho phản ứng nitro hoá. ✓ Nếu mẫu thử chứa nhiều Cl- (Cl- > 50 mg/L) thì phải loại bỏ bằng Ag2SO4 ✓ Nếu mẫu thử chứa nhiều NO2- thì phải phân huỷ NO2- bằng urea vì NO2- cũng phản ứng với thuốc thử trong môi trường acid cho sản phẩm màu vàng.

212

2.2.4 Quy trình xác định đồng thời nitrit và nitrat theo phản ứng azo hoá 2.2.4.1 Hoá chất và dụng cụ ▪ ▪

Dung dịch chuẩn gốc nitrit (C = 50 mg NO2- / 1L) Dung dịch chuẩn trung gian 5 10

▪

Dung dịch chuẩn gốc nitrat (C = 100 mg NO3- / 1L)

15

20

25 μg/10 mL

▪ Dung dịch đệm ammoniac 9.6 – 9.7 ▪ Dung dịch khử tạp Cares ▪ Dung dịch Borax bão hoà ▪ Hỗn hợp thuốc thử: ✓ Thuốc thử A: 6g acid sulfanilic pha thành 1000 mL dung dịch ✓ Thuốc thử B: 0.25 g N(1-naptyl)-etylendiamin ammoniumchloride hoà tan trong 250 mL, đựng trong chai tối màu, bảo quản và sử dụng không quá 1 tuần. ✓ Trước khi sử dụng, trộn thuốc thử A và B theo tỉ lệ 1:1

▪ Cột khử: điều chế Cd kim loại dạng bùn 213

2.2.4.2 Cách tiến hành a. Chuẩn bị mẫu: ▪

▪

Làm đồng nhất mẫu rồi cân ~ 10g với độ chính xác 1mg trong một becher 250mL, thêm 10 mL dung dịch Borax bão hoà, thêm tiếp khoảng 100 mL nước cất, rồi đặt lên bếp cách thuỷ, đun ~ 15 phút.

Làm nguội, chuẩn mẫu vào bình định mức 200mL, tráng rửa dụng cụ với ~ 30 mL nước cất, thêm tiếp 2mL dung dịch Cares I, 2mL dung dịch Cares II, thêm nước tới vạch 200 mL. Lắc đều, để yên 30 phút, lọc, bỏ nước lọc đầu tiên. Dung dịch qua lọc gọi là dung dịch A1.

b. Xác định tổng nitrit và nitrat 1. Tổng nitrit và nitrat ▪ ▪

▪

▪

Lấy 20 mL dung dịch lọc A1, thêm 5 mL dung dịch đệm ammoniac rồi cho lên cột khử một cách định lượng.

Hứng dịch chảy ra vào một bình định mức 100 mL, rửa cột hai lần x 15 mL nước cất. Có thể rửa cho tới gần vạch mức, thêm nước cho tới vạch 100 mL. Lắc đều được dung dịch B1.

Lấy 10 mL dung dịch B1 vào một becher 100 mL, thêm 10 mL hỗn hợp thuốc thử. Trộn đều, để yên nơi tối trong 30 phút. Đo OD ở λ = 540 nm, cuvette 1 cm, so với dung dịch so sánh.

Dung dịch so sánh: thực hiện như dung dịch xác định nhưng thay 10 mL dung dịch xác 214 định bằng 10 mL nước cất.

b. XĂĄcÄ&#x2018;áť&#x2039;nhtáť&#x2022;ngnitritvĂ nitrat 2. Nitrit â&#x2013;Ş â&#x2013;Ş

â&#x2013;Ş

LẼy 10 mL dung dáť&#x2039;chláť?c A1, thĂŞm 10 mL háť&#x2014;nhᝣpthuáť&#x2018;ctháť­. Tráť&#x2122;nÄ&#x2018;áť u, Ä&#x2018;áť&#x192;yĂŞnnĆĄitáť&#x2018;itrong 30 phĂşt. Ä?o OD áť&#x; Îť = 540 nm, cuvette 1 cm, so váť&#x203A;i dung dáť&#x2039;ch so sĂĄnh. Ä?Ć°áť?ngchuẊn: LẼyvĂ ocĂĄcbecher, máť&#x2014;icáť&#x2018;c 10 mL dung dáť&#x2039;chchuẊn NO2- , thĂŞm 10 mL háť&#x2014;nhᝣpthuáť&#x2018;ctháť­. Ä?Ć°áť?ngchuẊntrĂŞncĂłcĂĄcnáť&#x201C;ngÄ&#x2018;áť&#x2122;nitrit: 5, 10, 15, 20, 25 Îźg/10 mL dung dáť&#x2039;ch.

Cho táť&#x2022;ngnitritvĂ nitrat:

đ?&#x2018;&#x161;1 Ă&#x2014; 100 Ă&#x2014; 200 đ?&#x2018;&#x161;1 Ă&#x2014; đ??š đ?&#x2018;&#x2021;đ?&#x2018; đ?&#x2018; (đ?&#x2018;&#x161;đ?&#x2018;&#x201D;Τđ?&#x2018;&#x2DC;đ?&#x2018;&#x201D;) = = 10 Ă&#x2014; 20 Ă&#x2014; đ?&#x2018;&#x160; đ?&#x2018;&#x160;

m1 : sáť&#x2018;Îźg nitritxĂĄcÄ&#x2018;áť&#x2039;nhÄ&#x2018;ưᝣctrĂŞnÄ&#x2018;Ć°áť?ngchuẊntrong 10 mL dung dáť&#x2039;chÄ&#x2018;ĂŁkháť­ F : Háť&#x2021;sáť&#x2018;phaloĂŁng (F=100) W : Lưᝣngcân (g)

â&#x2013;Ş Cho nitrit:

đ?&#x2018;&#x161;2 Ă&#x2014; 200 đ?&#x2018;&#x161;2 Ă&#x2014; đ??š đ?&#x2018; (đ?&#x2018;&#x161;đ?&#x2018;&#x201D;Τđ?&#x2018;&#x2DC;đ?&#x2018;&#x201D;) = = 10 Ă&#x2014; đ?&#x2018;&#x160; đ?&#x2018;&#x160;

m2: sáť&#x2018;Îźg nitritxĂĄcÄ&#x2018;áť&#x2039;nhÄ&#x2018;ưᝣctrĂŞnÄ&#x2018;Ć°áť?ngchuẊntrong 10 mL dung dáť&#x2039;chkhĂ´ng qua kháť­ F : Háť&#x2021;sáť&#x2018;phaloĂŁng (F=20) W : Lưᝣngcân (g)

215