Page 1

ENZYME VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM


Tiến sỹ: Đỗ Lê Hữu Nam


NHỮNG CHỦ ĐỀ CỦA HỌC PHẦN  Ch.đề

1. Tổng quan protein, enzyme  Ch.đề 2. Tách chiết và tinh sạch protein, enzyme  Ch.đề 3. Định tính, định lượng protein và xác định hoạt độ enzyme  Ch.đề 4. Sản xuất protein, enzyme  Ch.đề 5. Ứng dụng Protein, Enzyme


CHỦ ĐỀ 1: TỔNG QUAN PROTEIN, ENZYME

1. PROTEIN 2. AMINO ACID 3. PEPTIDE 4. ENZYME

4


1. PROTEIN 1.1 Khái quát chung về protein - Những đặc trưng chung của nhóm chất protein

- Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của nhóm chất protein 1.2 Phân loại protein - Protein đơn giản - Protein phức tạp 5


1.1 Proteins là gì?

Proteins là những phân tử

sinh học có vai trò tối quan trọng đối với hoạt động của cơ thể sống

Thực hiện nhiều chức năng khác nhau

4


Proteins cấu trúc: Những đơn vị cơ bản xây dựng cơ thể, vd: collagen, móng, tóc, da, cơ v.v Enzymes: được ví như ‘động cơ sinh học’, xúc tác cho hàng loạt các phản ứng hóa sinh trong cơ thể.

Protein vận chuyển qua màng (transmembrance): là những ‘ người gác cổng’của tế bào, ví dụ. Bằng cách điều chỉnh kích cỡ TB, chất dinh dưỡng và gradien ion từ môi trường ngoại bào có thể đi vào bên trong nội bào ( vd Na/K)

27th November 2008, University of Warwick

5


DỰA VÀO CHỨC NĂNG SINH HỌC

Structural proteins: collagen, elastin, keratin, fibroin of silk and webs  Transport proteins: hemoglobin, myoglobin, lipoproteins  Protective proteins: immunoglobulins, fibrinogen, thrombin, snake venoms, bacterial toxins  Contractile proteins: actin, myosin, tubulin  Catalytic proteins: enzymes  Regulatory proteins: hormones  Storage proteins: ferritin, hemosiderin, gluten, casein, ovalbumin  Reception of Stimuli: rhodopsin, membrane receptor proteins, acethylcholine, insulin  Germicidal proteins: Polymyxin B1, Gramicidin S 


PROTEIN MIỄN DỊCH 

Kháng thể

9


Cấu trúc Protein  Đa dạng: kích cỡ, hình dạng, tổ chức Cấu trúc quyết định hoạt động sinh học  “ Robots tự nhiên”  Nắm được cấu trúc protein là Chìa khóa để hiểu chức năng và hoạt động

6


Cấu tử của Proteins- Acid amin

27th November 2008, University of Warwick

8


AMINO ACIDS CÓ TRONG PROTEINS Amino acids Alanine Arginine Asparagine Aspartic acid Cysteine Glutamine Glutamic acid Glycine Histidine

Viết tắt 1 chữ cái A R N D C Q E G H

Viết tắt 3 chữ cái Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His


AMINO ACIDS CÓ TRONG PROTEINS Isoleucine

Leucine Lysine Methionine Phenylalanine Proline Serine Threonine Tryptophan Tyrosine Valine

I

Ile

L K M F P S T W Y V

Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val


CHỨC NĂNG SINH HỌC MỘT SỐ Protein

No. of AA

PROTEIN

Function

Insulin

51

Cytochrome C

104

Enzyme for sugar metabolism Enzyme for cell respiration

Growth hormone

191

Used as anti-aging treatment

Hemoglobin

574

Oxygen transport in blood

Hexokinase

730

Enzyme for glycolysis

Gamma globulin

1320

Myosin

6100

Part of immune system in blood Muscle action


BLOOD PROTEINS Albumins Immunoglobulins

Create osmotic pressure and transport other molecules Participate in immune system

Fibrinogens

Blood coagulation

Alpha-1-Antitrypsin Neutralize trypsin that has leaked from the digestive system Regulatory proteins Regulation of gene expression


Xác định cấu trúc Protein

Xác định cấu trúc Protein là quá trình khó khăn, phức tạp

 Xác định trình tự protein

không phức tạp liên quan đến trình tự gene (Genomics)

 So sánh dữ liệu Genbank Thomas Splettstoesser

27th November 2008, University of Warwick

10


1.2 PHÂN LOẠI PROTEIN - CÁC PROTEIN ĐƠN GIẢN TP phân tử chỉ bao gồm các amino acid * ALBUMIN &GLOBULIN Lưu ý các tiểu phần albumin và globulin huyết thanh – Albumin là nguồn V/C cơ bản t/g xây dựng hầu hết mọi loại cấu trúc của tế bào, mô bào, chúng được tổng hợp từ gan. - Chức năng : giữ áp lực keo của máu, - Điều hòa TĐC giữa máu và dịch bào, - Vận chuyển các chất dinh dưỡng (khoáng, acid béo, một số vitamin …)

24


GLOBULIN α-Glo : α1& α2, có trong lipoprotein, glucoprotein, t/gchuyển hóa glucid, lipid. -Glo :t/g vận chuyển và chuyển hóa kim loại : transferrin (sắt), seruloplasmin (đồng) … -Glo : l/q lớp globulin miễn dịch - immunoglobulin (Ig) IgA (α) IgM() IgG () IgD () IgE () 25


*SCLEROPROTEIN Là các protein dạng sợi, biến tính tự nhiên, không bị thủy phân bởi enzyme tiêu hóa protein. Các đại diện điển hình : collagen, elastin; keratin (trong tóc, lông); fibroin (trong tơ tằm ) …

26


CẼu trúc collagen (A) va elastin (B) 27


Collagen : chiếm khỏang ¼ lượng protein cơ thể , là thành phần chính của các mô liên kết, gân, dây chằng, sụn, xương và răng, có khả năng đàn hồi và chịu lực cao; • Collagen + elastin tạo thành cấu trúc chính của da, khi collagen trong cơ thể bị thoái hóa ( mỗi năm mất khoảng 1,5% khối lượng) thì quá trình lão hóa cùng các nếp nhăn gia tăng. Col. Đảm nhận sự săn chắc còn elastin làm cho mô cơ thể linh hoạt. Hai thành phần này tạo nên tính dẻo dai của gân cơ, mạch máu, da, giúp cơ thể vận động dẻo dai, làn da săn chắc khỏe mạnh. 28


LÃO HÓA DA

29


1.2 CÁC PROTEIN PHỨC TẠP TP phân tử : ngoài các amino acid còn có các nhóm Ngoại. Tuỳ theo bản chất hóa học của nhóm Ngoại, người ta phân protein phức tạp thành 5 nhóm chính. *Phosphoprotein : protein + các gốc –P *Glucoprotein : protein + glucid *Lipoprotein : protein + lipid *Chromoprotein : protein + h/c hemin + kim loại có màu *Nucleoprotein : protein + nucleic acid 30


*PHOSPHOPROTEIN Chuỗi polypeptide LK với H3PO4 qua nhóm OH của Ser. Liên quan nhiều với các chất dinh dưỡng của động vật non : caseinogen trong sữa, ovovitelin trong lòng đỏ trứng, ictulin trong trứng cá … *GLYCOPROTEIN - Nhóm ghép là glucid (các hexose hoặc hexosamine …)tên chung mucopolysaccharide ; có thể gặp ở trạng thái tự do như a.hyaluronic, a.chondroitinsulfuric … - Chức năng : chất ciment gắn kết tế bào, mô bào; chất nhầy giảm ma sát trong niêm dịch, dịch bao khớp: osteomucoid (xương), mucine (nước bọt), ovomucoid (trứng) … 31


32


* LIPOPROTEIN + Nhóm ghép là lipid hay dẫn xuất của lipid (lecithin, cholesterol, acid phosphatidic …). + Chức năng : tham gia cấu tạo vách tế bào và các loại màng sinh học. T/p cấu trúc màng quyết định tính bán thấm và tính hấp phụ đặc hiệu của màng; Đóng vai trò quan trọng trong dẫn truyền xung động thần kinh.

33


*CHROMOPROTEIN Chroma = màu sắc Là lớp protein có màu sắc vì trong TP nhóm ghép có các nguyên tử kim loại. Chúng liên quan đến các quá trình hô hấp trao đổi khí : - Hemoglobin trong máu : v/c và trao đổi O2 và CO2 giữa phổi và mô bào; - Myoglobin : dự trữ O2 trong cơ; - Chlorophill chất diệp lục, t/g quang hợp ở thực vật; - Các enzyme : các flavoprotein (FP)

34


*HEMOGLOBIN (Hb) • Hb = Globin + HEME Globin : 4 chuỗi polypeptide : 2 chuỗi α (2 x 141 AA) 2 chuỗi  (2 x 146 AA) Mỗi chuỗi kết hợp với một HEME để v/c 1 O2. Người ta xác định nhiều loại Hb khác nhau : - HbF (fetal Hb) : Hb của bào thai; - HbA (adult Hb) : Hb của người trưởng thành; - HbS : Hb của bệnh nhân thiếu màu hồng cầu lưỡi liềm (Glu ở vị trí 6 của chuỗi  thế bởi Val); - HbC : Hb của bệnh nhân thiếu màu hồng cầu hình bia (Glu ở vị trí 6 của chuỗi  thế bởi Lys).

35


Cấu trúc bậc bốn tetramers của hemoglobin A 36


37


38


39


40


41


CẤU TẠO NHÓM HEME : 1,3,5,8 TETRAMETHYL 2,4 DI VINYL ; 6,7 DIPROPIONYL

42


2.AMINO ACID Thành phần và tính chất lý-hoá của amino acid

43


Thành phần và tính chất lý-hoá của amino acid  2.1. Thành phần và cấu tạo amino acid  2.2. Phân loại amino acid  2.3. Màu sắc và mùi vị của amino acid  2.4. Tính tan của amino acid  2.5. Biểu hiện tính quang học của amino acid  2.6. Tính lưỡng tính của amino acid  2.7. Các phản ứng hoá học của amino acid

44


2.1 THÀNH PHẦN VÀ CẤU TẠO AMINO ACID H

H2N nhóm amino

C

-carbon

COOH

R Nhóm chức

nhóm carboxyl 45


L-amino acids tạo nên proteins Gương phẳng

H HOOC

C

H

NH2

H2N

R D-amino acid

C

COOH

R L- amino acid 46

Đối hình


2.2 PHÂN LOẠI AMINO ACID CÓ NHIỀU QUAN ĐIỂM PHÂN LOẠI TUY NHIÊN ĐỀU DỰA TRÊN CẤU TẠO HÓA HỌC HOẶC MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA GỐC R

47


Nhóm chức (R ) qu.định tính chất AA KỴ NƯỚC-HYDROPHOBIC, R- không phân cực (non-polar) H

CH3

Glycine Alanine (G) (A)

CH

CH2

CH3 CH3

CH

Valine (V)

CH3

CH3

Leucine (L)

VÀ: Isoleucine (I), methionine (M), proline (P)

48


Kỵ nước và có vòng thơm, R không phân cực

CH2

CH2

C CH NH

Phenylalanine (F)

Tryptophan (W) 49

VÀ: Tyrosin (Y)


ƯA NƯỚC và tích điện, R -phân cực

O

CH2

CH2

CH2

C

CH2

CH2

C

CH2

O

Aspartate (D)

O

O

Glutamate (E)

VÀ Arginine (R ) and histidine (H)

CH2 +

NH3

Lysine 50 (K)


Ưa nước - trung tính, R phân cực CH2

CH2

CH2

C

CH2

OH

O NH2

Asparagine (N)

C

Serine (S)

O NH2

Glutamine (Q)

VÀ Threonine (T) and Cysteine (C)

51


axit amin thiết yếu ở người gồm isoleucine, leucine, lysine, methionine, ph enylalanine, threonine, tryptophan, valine, và histidine.

 Các

Arginine, cysteine (hay các axit amin chứa lưu huỳnh), và tyrosine (hay các axit amin vòng thơm), thì cần thiết cho trẻ sơ sinh và trẻ đang phát triển. Các axit amin thiết yếu không hẳn là quan trọng hơn so với các axit amin khác mà chúng thiết yếu là do cơ thể không tự tổng hợp được mà phải lấy từ thức ăn

52


2.3. MÀU SẮC VÀ MÙI VỊ CỦA AMINO ACID

53


2.4. TÍNH TAN CỦA AMINO ACID

54


2.5. BIỂU HIỆN TÍNH QUANG HỌC CỦA AMINO ACID

Khả năng làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực sang phải hoặc sang trái. Quay phải được ký hiệu bằng dấu (+), quay trái được ký hiệu bằng dấu (-). Góc quay đặc hiệu của amino acid phụ thuộc vào pH của môi

trường.

55


PHỔ HẤP THỤ ÁNH SÁNG CỰC TÍM CỦA TRIPTOPHAN VÀ TYROSINE

56


3. PEPTIDE 3.1 Cấu tạo của peptide

3.2 Cách gọi tên và phân loại peptide 3.3 Các phản ứng đặc trưng của peptide

57


3.1 CẤU TẠO CỦA PEPTIDE

R1

R2

NH2 CH COOH + R1 O H2N CH C

NH2 CH COOH R2

NH CH COOH

+ H 2O

Liên kết Peptide Dipeptide

58


Các phân tử C, O, N, H nằm trên 1 mặt phẳng Và không xảy ra sự quay tự do xung quanh liên kết C-N nếu không có thêm năng lượng

R1

R2

O

H2N CH C N

CH COOH

H Peptide unit

Quay tự do

59


3.2 CÁCH GỌI TÊN VÀ PHÂN LOẠI PEPTIDE

Dipeptide

tripeptide

polypeptide

CHUỖI POLYPEPTIDE R1 O

R2

O

R3

O

NH2 CH C NH

CH

C NH

CH

C NH CH COOH

Đầu N, +

R4

Kết C, -

Chuỗi Protein từ amino tới carboxyl N C

60


CẤU TẠO VÀ CÁCH GỌI TÊN CỦA MỘT PENTAPEPTIDE SERYL-GLYCYL-TYROSYL-ALNYL-LEUCINE 61

(SER-GLY-TYR-ALA-LEU HOẶC SGYAL)


3.3 CÁC PHẢN ỨNG ĐẶC TRƯNG CỦA PEPTIDE

62


Phản ứng màu biure Trong môi trường kiềm, peptit có 2 liên kết peptit trở lên tác dụng với Cu(OH)2 cho hợp chất màu tím (phức giữa peptit đó với ion đồng).

Thí nghiệm màu biure

Hợp chất phức giữa peptit với ion Cu2+


Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng protein: I. Thành phần các acid amin tiêu hóa trong protein Chất lượng protein thể hiện qua hai chỉ tiêu: - Tỷ lệ tiêu hóa hấp thu cao hay thấp? - Tỷ lệ giữa các acid amin thiết yếu trong protein so với nhu cầu? Acid amin thiết yếu trên người: 1. Histidine 2. Isoleucine 3. Leucine 4. Lysine (tiêu điểm) 5. Methionine 6. Phenylalanine 7. Threonine 8. Tryptophan 9. Valine (chuột)

A. amin thiết yếu trên heo và trên các loài cá: 1. Arginine 2. Histidine 3. Isoleucine 4. Leucine 5. Lysine (tiêu điểm) 6. Methionine 7. Phenylalanine 8. Threonine 9. Tryptophan 10. Valine

A. amin thiết yếu trên gi.c: 1. Arginin 2. Glycin 3. Histidine 4. Isoleucine 5. Leucine 6. Lysine (tiêu điểm) 7. Methionine 8. Phenylalanine 9. Prolin 10. Threonine 11. Tryptophan 12. Valine


Ảnh hưởng của môi trường xử lý lên chất lượng protein – Tổn thất chức năng sinh học: Immunoprotein, enzyme-protein. – Tổn thất chất lượng về acid amin trong protein: phản ứng Maillard làm hư hại gốc amin tự do trong protein. – Tăng nguy cơ độc tính do sự phân giải protein ra một số acid amin và biến đổi thành các amin độc hại. – Thay đổi mùi, vị của thức ăn làm cho protein trở nên khó tiêu, kém hấp dẫn, giảm tính ngon miệng với thức ăn.


Protein và các yếu tố ảnh hưởng lên chất lượng protein

– Nhiệt độ – pH. – Ánh sáng. – Các tác nhân oxy hóa.


Yếu tố vật lý, hóa học môi trường làm thay đổi cấu trúc hóa học của protein ① Nhiệt độ thay đổi vị trí hình học phẳng của các acid amin trong chuổi. Những acid amin dễ bị hư hại như: Lysine, Arginine, Cystine, Threonine, Serine, và Cysteine. Trong đó Lysine, Threonine, Methionine rất nhạy cảm với nhiệt độ và các tia xạ. ② Môi trường kiềm làm cho Glutamine và Asparagine dễ bị khử nhóm amin. ③ Môi trường Acid, Tryptophan nhanh chóng bị hư hỏng; Serine và Threonine cũng bị hư hại nhưng chậm hơn. ④ Tia cực tím làm hư hại Tryptophan, Tyrosine và phenylalanine ⑤ Những sản phẩm của sự oxyhóa lipid, những chất tẩy trắng hay những tác nhân oxyhóa khác cũng dễ làm hư hỏng acid amin chứa lưu huỳnh.


Sự hóa nâu không enzyme / PƯ Maillard Phản ứng phổ phổ biến nhất làm hư hỏng protein trong quá trình xử lý, chế biến là phản ứng Maillard – Là phản ứng có ý nghĩa quan trọng trong dinh dưỡng protein (phản ứng gây biến tính protein có ảnh hưởng rất lớn đến chức năng protein) – Phản ứng xảy ra trên căn bản giữa giữa nhóm -amin của Lysine với nhóm aldehyd (đường khử, hoặc peroxid ) – Sau phản ứng này, lysine trở nên khó tiêu hóa và trở thành lysine bất hoạt (unavailable lysine). – Phản ứng Maillard còn tạo liên kết với protein làm cho: • Thay đổi khả năng hòa tan của protein làm cho nó trở nên khó tiêu • Màu sắc protein cũng thay đổi, trở nên sậm màu bởi sự hình thành sắc tố melanoidin từ thyrosine.


Phản ứng Maillard giữa protein với nhóm aldehyd của đường khử làm hư hại lysine

Đường khử.

R – CHO + H2N – R – Polypeptid

Aldehyd

Peroxid Oxygen oxyhóa chất béo

R – CH = N – R – Polypeptid làm biến đổi màu protein


Ảnh hưởng của sự hóa nâu không enzyme PƯ Maillard đến chất lượng protein – Phản ứng Maillard xảy ra chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố: • Sự tồn trử, bảo quản protein lâu ngày trong môi trường có nhiều oxy và các gốc tự do, nhất là các peroxyd của lipid. • Sự xử lý protein ở nhiệt độ cao. Phản ứng này xảy ra chậm chạp khi ở nhiệt độ phòng ( 20oC) và tăng lên rất nhanh khi nhiệt độ tăng cao.

– Phản ứng này gây tổn thất acid amin thiết yếu, chủ yếu là lysine và một vài acid amin có 2 nhóm amin, những có chứa lưu huỳnh.


Ảnh hưởng nhiệt độ lên chất lượng protein


Ảnh hưởng của nhiệt khi xử lý đến chất lượng protein – Lysine và cystein rất nhạy cảm với nhiệt độ cao. – Lysine và Arginine có nhóm amin tự do rất dễ phản ứng với gốc acid tự do của acid glutamic và aspartic hoặc với các amide để tạo liên kết chéo gây trở ngại cho tiêu hóa hấp thu và có ảnh hưởng xấu đến chức năng của protein enzyme. – Cystine tương đối nhạy cảm với nhiệt độ cao, nó biến đổi thành dimethyl- sulfide và một số dẫn xuất độc hại khác khi xử lý ở nhiệt độ cao khỏang 115°C


Ảnh hưởng của nhiệt đến khả năng hòa tan của protein – Khi nhiệt độ lên cao thì làm cho protein biến tính, kết khối làm giảm khả năng hòa tan. – Sự biến tính bởi nhiệt độ của protein xảy ra khi mạch nối hydrogen bị hư hỏng qua quá trình gia nhiệt trong xử lý. – Khi gia nhiệt thì cấu trúc bậc 1, 2, 3, 4 của protein sẽ bị thay đổi, protein trở nên khó hòa tan khó tiếp xúc với men tiêu hóa protease, nên khó tiêu hóa.


Ảnh hưởng của nhiệt lên các nhóm chức năng của protein – Nhiệt có thể làm thay đổi các nhóm chức năng trong protein, nhất là protein enzyme, protein kháng thể. Sự tương tác giửa các nhóm chức năng của protein, thường thấy nhất là các nhóm chức năng sau đây: • Sulfhydryl (-SH) • Dislufide (-S-S-) • Tyrosyl – Sự biến đổi này có thể tạo ra một phức chất làm kết tủa protein. – Nhiệt có thể làm tăng tính phân cực của nước, từ đó làm cho khả năng phản ứng với protein tăng lên, làm cho protein dễ biến tính hơn. http://www.pentech.ac.za/clients/biosci/Module5.ppt


Ảnh hưởng của nhiệt lên sự phân hủy protein tạo ra các gốc độc hại – Các gốc tự do sẽ được hình thành khi xử lý protein hoặc lysine ở nhiệt độ 200°C trong 22 phút. – Những gốc tự do này ổn định trong nước và trong dịch tiêu hóa, tiếp tục tác động lên protein. – Hậu quả của sự phân hủy protein ở nhiệt độ cao có thể tạo ra các sản phẩm độc hại cho cơ thể như: • Cá và thịt bò nướng sinh ra chất độc có thể gây đột biến gen. Trong đó 2 chất độc sinh ra do tryptophan bị phân hủy bởi nhiệt, có thể gây đột biến gen. Kết nối với acrylamide


– Các hợp chất độc hại gen có nguồn gốc từ sự phân hủy protein được hình thành phải có nhiệt độ cao trên 300°C. – Ở nhiệt độ cao Asparagin trong thức ăn dễ dàng phản ứng với đường khử biến thành chất độc acrylamide. – Từ đây cảnh báo nguy cơ ung thư cao cho những người thường hay ăn thịt chiên, nướng ở nhiêt độ cao.


Ảnh hưởng ánh sáng lên chất lượng protein


Ảnh hưởng của phản ứng oxyhóa quang học đến các acid amin trong protein. – Sự hư hỏng protein từ sóng ngắn có những đặc tính sau đây: • Bước sóng ánh sáng • Cường độ chiếu sáng • Trạng thái phản ứng • Acid amin riêng lẻ bị chiếu sáng dễ bị hư hơn trong cấu trúc protein. – Acid amin chứa lưu huỳnh bị ánh sáng phân hủy nhiều hơn các acid amin aliphatic. Các acid amin chứa lưu huỳnh rất nhạy cảm với ánh sáng. – Những acid amin có nhân thơm bị tác động như là chất nhạy cảm quang học (photosensitizers) trong protein.


Các kiểu phản ứng Oxyhóa quang học Protein – KIỂU THỨ NHẤT: • Chất nhạy cảm quang học bị kích thích bởi ánh sáng có bước sóng thích hợp. • Chất nhạy cảm quang học đã được kích thích oxyhóa ở một phía trên chuổi protein, trở thành gốc tự do. • Tiếp theo là gốc tự do phá hủy acid amin trong protein.

– KIỂU THỨ HAI: • Chất nhạy cảm quang học đã bị kích thích sẽ kích hoạt oxygen, phản ứng xảy ra mạnh với oxygen có điện tử lẽ (gốc tự do Free Radical). • Oxygen tự do tấn công lipids hoặc phản ứng một phía của chuổi acid amin tạo ra nhiều gốc tự do khác.


Ảnh hưởng chất oxy hóa khác lên chất lượng protein


Tác động của các chất oxyhóa khác đến chất lượng protein • Chlorine, hợp chất oxyhóa sử dụng để khử trùng nước. – Chlorine làm hư hại chất lượng protein. – Chlorine tấn công nhóm sulfur của methionine, quá trình phản ứng diễn ra như sau: • Phản ứng này đầu tiên tạo ra hợp chất chlorosulfonium • Bước tiếp theo tạo ra chất trung gian carbonium ion và sau đó tách carbon khỏi liên kết sulfur. • Tiếp theo tạo ra sản phẩm trichloroamino acid. – Gây tổn hại dinh dưỡng protein, làm giảm giá trị sinh học của một protein. Vì vậy những chất này không được dùng trong chế biến thực phẩm hoặc gián tiếp qua nước khử trùng chlorine, được sử dụng trong chế biến thực phẩm.


Ảnh hưởng pH lên chất lượng protein


Ảnh hưởng của pH, môi trường kiềm dễ gây thương tổn lên chất lượng protein. Protein trong môi trường kiềm sẽ xảy ra một chùm phản ứng hóa học gọi là Racemation: • Racemization: – Quan sát được khi protein xử lý trong môi trường kiềm. – Phản ứng này lấy đi hydro của α-methine hydrogen để: • Tạo thành chất trung gian carbanion. • Carbanion nhanh chóng phản ứng với proton (+) để cân bằng điện tích proton • Sau đó nó tạo ra dạng L hoặc dạng D của acid amin • Ảnh hưởng sinh học của racemization: - Làm giảm khả năng tiêu hóa protein. - Casein xử lý kiềm sẽ đề kháng với sự thủy phân của enzyme tiêu hóa.


Sự tiêu hóa hấp thu protein, acid amin


Sự tiêu hóa protein trên các vị trí khác nhau của ống tiêu hóa • Protein được tiêu hóa trong dạ dày và ruột non nhờ hệ thống enzyme protease. • Sự hấp thu acid amin xảy ra trong ruột non. • Không hấp thu acid amin ở ruột già: – Protein không tiêu hóa ở ruột non sẽ được VSV tiêu hóa hấp thu và biến đổi thành protein VSV.


Sự hấp thu không giống với sự tiêu hóa • Sự hấp thu là một khái nhiệm được định nghĩa là sự đi vào bên trong tế bào niêm mạc ruột, (không dễ dàng gì để đo lường). • Sự tiêu hóa chính là sự thủy phân hay sự biến đổi các cơ chất dinh dưỡng trong đường tiêu hóa.


Ảnh hưởng của protein trao đổi trong ruột • Những acid amin do tế bào niêm mạc bong tróc, do mật tiết ra, do chất nhầy tiết ra, do men tiêu hóa tiết ra Tất cả đều có nguồn gốc từ cơ thể thải ra, có thể làm sai lệch tính toán hệ số tiêu hóa acid amin. • Với nguồn protein, acid amin trao đổi tiết ra càng nhiều, càng làm giảm thấp hệ số tiêu hóa thật. • Để có hiệu chỉnh tiêu hóa protein, tiêu hóa acid amin chính xác, cần trừ đi những yếu tố này.


Phẩu thuật làm ống thoát ở van hồi manh tràng (Hình TS. Lê văn Thọ)


Ống lỗ dò, heo sau phẩu thuật đặt ống dò

Nghiên cứu tiêu hóa acid amin qua lỗ dò ở hồi tràng


Lỗ dò ở cuối hồi tràng trên heo


Sự trao đổi chất của Một số acid amin đặc biệt Những bệnh tật do rối loạn

chuyển hóa acid amin


Vai trò sinh học đặc biệt và sự chuyển hóa các acid amin có chứa lưu huỳnh Từ acid amin có chứa S, chuyển hóa ra thành các hoạt chất sinh học quan trọng trong cơ thể để chống lại stress oxyhóa, đồng thời cũng hình thành các phân tử Biomarker báo hiệu tình trạng sức khỏe (J. James, PhD. 2003)


Sự chuyển hóa Acid amin có chứa lưu huỳnh Methionine Synthase (Vit. B12-dep.)

NH3+ CH 3SCH 2CH 2CHCO 2 + FH4

NH3+ HSCH 2CH 2CHCO 2 + 5-Methyl

FH4

L-Homocysteine

Methionine (Essential)

CO 2 -

Cystathionine -synthase (PLP-dep.)

NH3+

OH -

CH 3CHCH 2CO 2

-Hydroxybutyrate

+

H C NH3 +

Serine

CH2 OH

NH3 + Cystathionine lyase SCH 2CH 2CHCO 2 -

HSCH 2CHCO 2

Cysteine (Non-essential)

CH2 CHCO2 NH3 +

Cystathionine


Homocysteine Homocysteinuria

• Ít thấy; gây ra thiếu hụt cystathionine -synthase • Hư hỏng thủy tinh thể • Chậm phát triển trí não • Gây chứng loãng xương • Gây bệnh tim mạch Tử vong

Homocystein với bệnh tim mạch Mức homocysteine cao trong máu có liên quan với bệnh tim mạch • Có thể có liên quan đến sự thiếu hụt folate (B9) • Folate làm tăng sự chuyển hóa homocysteine thành methionine


Chức năng chống oxyhóa của GLUTATHIONE

Major intracellular antioxidant: H2O2, superoxide, (active) (inactive) hydroxyl radical, peroxynitrite, membrane lipid peroxidation


Cysteine tạo ra các hợp chất giải độc Methionine Homocysteine Cystathionine

CYSTEINE Glutathione

Sulfate

Metallothionein Coenzyme A

Alpha Lipoic Acid Taurine


Quá trình Methyl hóa • Methyl hóa ADN là quá trình thêm nhóm methyl vào phân tử ADN. • Sự methyl hóa làm thay đổi chức năng của ADN, điển hình là ngăn cản quá trình phiên mã. • Methyl hóa ADN cần thiết cho sự phát triển bình thường, gắn liền với một số quá trình quan trọng như in dấu gen, bất hoạt nhiễm sắc thể X, ức chế các yếu tố lặp và di truyền ung thư.


Ảnh hưởng của quá trình methyl hóa DNA đến sự phòng ngừa ung thư Sửa chữa DNA

Chuyển hóa chất gây ung thư

Điều hòa Hormonal DNA Methylation

Sự biệt hóa tế bào

Chu kỳ tế bào Apoptosis (Lập trình cho cái chết tế bào)


LTR Hypermethylated

LTR Hypomethylated

Chuột màu nâu được bổ sung với

Yellow Mouse Nguy cơ cao với: ung thư, tiểu đường, béo phì & giảm thấp tuổi thọ. Cooney J. Nutr. 2002 (In Press)

Zinc, methionine, Betaine, choline, Folate, B12

Agouti Mouse Nguy cơ rất thấp với: ung thư, tiểu đường, béo phì và kéo dài tuổi thọ

http://www.cancer.gov/prevention/nutrition/rfa03016.ppt


Những nhân tố gây ra stress oxyhóa trong những đứa trẻ mắc bệnh tự kỷ Sự viêm nhiểm

Gene

Bệnh tâm thần

Môi trường

Hormone

Thời gian

Viêm nhiểm ruột, Viêm nảo, thần kinh Hư hại chức năng kháng thể

Jill James, PhD http://www.actagainstautism.org.uk/presentations/15th/neubrander.ppt


Các yếu tố có liên quan đến bệnh tâm thần tự kỷ.

Bệnh tự kỷ

Hình thái di Sai lệch quá trình truyền Methylation

Phơi nhiểm kim loại nặng

Richard Deth, PhD

Sưng, viêm + Stress oxyhóa

http://www.actagainstautism.org.uk/presentations/15th/neubrander.ppt


Homocysteine và bệnh Xơ vữa động mạch • Thí nghiệm trên động vật và những nghiên cứu trên người cho thấy homocysteine làm: – – – – –

Tăng stress oxyhóa. Gây bất thường màng giữa và tổn thương mạch máu. Tăng phản ứng viêm. Tăng nhanh tế bào cơ trơn. Nâng cao sợi huyết (thrombogenicity) dễ gây tắc nghẽn mạch máu.


Một số acid amin có vai trò đặc biệt, có tác dụng tăng cường khả năng phòng chống bệnh tật • Dimethylglycine (DMG) là dẫn xuất của acid amin đơn giản glycine đã được methyl hóa. Cấu trúc của glycine

H

Cấu trúc của N,N-Dimethylglycine (DMG)

N-CH2-C=O H

OH

http://www.nationalautismconference.org/presentations05/kendall.ppt

CH3

N-CH2-C=O

CH3

OH


Hiệu quả của việc bổ sung DMG • Tạo sự methyl hóa (Methylation Pathway) • Hiệu quả lên hệ thống kháng thể (Immune System)

• Hiệu quả lên hệ thần kinh (Neurological Pathways) • Có vai trò khử độc tố (Detoxification) http://www.nationalautismconference.org/presentations05/kendall.ppt


Sự suy yếu Methyl hóa có liên hệ đến chứng ASD (Atrial Septal Defect) (ASD =Khiếm khuyết vách ngăn tâm nhĩ)

• Chất bổ sung giúp cho quá trình methyl hóa có tác dụng cải thiện chứng bệnh ASD • Sự không bình thường của quá trình Methyl hóa có thể ảnh hưởng đến hoạt động thần kinh có liên quan đến nhận thức và khả năng học tập, có thể rơi vào tình trạng bệnh tâm thần.


Phenylalanine and Tyrosine


Bệnh rối loạn chuyển hóa phenylalanine và tyrosine

 Phenylketonuria – phenylalanine hydroxylase/BH4 synthesis (Bệnh tk PKU bẩm sinh)

 Tyrosinemia type II (Richner-Hanhart) - tyrosine aminotransferase (tủa Tyr. ở da, mắt)  Tyrosinemia type III tyrosine không chuyển hóa được lắng đọng trong nhiều cơ quan)  Tyrosinemia type I (Thiếu enzyme fumarylacetoacetichy drolase, gây viêm xơ gan.

 Alkaptonuria – homogentisate oxidase (enzyme homogentisate 1,2-dioxygenase), viêm khớ

 Albinism - tyrosine hydroxylase {tyrosinase}Bệnh bẩm sinh thiếu sắt tố trên da, tóc, mắt… do rối loạn chuyển hóa tyrosine

http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc801/power/lec23.ppt


Bệnh Phenylketonuria (PKU) • Thiếu men Phenylhydroxylase nên không chuyển hóa được phenylalanine • Tỷ lệ người mắc bệnh 1/16.000 người sinh ra ở U.S. • PKU làm chậm phát triển tinh thần, gây hại não bộ • Xử lý: Giới hạn thức ăn có chứa nhiều phenylalanine. • Test sàng lọc tất cả những trẻ sơ sinh để có lời khuyên chế độ dinh dưỡng thích hợp.

Tyr Phe Transamination

O

Phenylpyruvate (urine)

CH2 CCO2-


Cơ chế sinh bệnh Phenylketonuria (PKU) • • • •

Rối loạn di truyền do nghèo phenylalanine hydroxylase Làm tăng hàm lượng phenylalanine trong cơ thể Điều này gây ra ức chế hấp thu tryptophan và tyrosine. Như thế, rất ít tyrosine đi vào trong não, gây ra thiếu hụt tyrosine. • Tyrosine là chất tiền khởi của catecholamines, như thế sẽ rất ít dopamine, norepinephrine và epinephrine được sản xuất ra. • Điều này sẽ dẫn đến sự chậm trể phát triển trí não. • PKU có thể được kiểm soát bởi khẩu phần giảm thấp phenylananine.


Bệnh Alkaptonuria • Do thiếu enzyme “homogentisate dioxygenase” • Nước tiểu sẩm màu so với bình thường • Sự oxyhóa acid homogentisic • Không có triệu chứng bệnh giai đoạn ấu thơ

• Xu hướng gây ra viêm khớp khi đến tuổi trưởng thành. http://wiz2.pharm.wayne.edu/biochem/aametabolism.ppt


Bệnh Phenylketonuria Là bệnh bẩm sinh thường gặp nhất, khiếm khuyết trao đổi chất của acid amin. Hàm lượng phenylalanine huyết cao, tổn thương thần kinh.

Các hợp chất đáng chú ý như: phenylpyruvate, phenyllactate, phenylacetate, chất tạo ngọt Aspartame có thể gây hại cơ thể.

Tính độc hại não bộ: làm giảm sự hấp thu những acid amin có nhân thơm khác mà cơ thể rất cần. Gây ra sự thiếu hụt Tyrosine từ đó gây ra thiếu sắc tố melanin (hypopigmentation). Hậu quả của bệnh này có thể gây ra có tật nguyền.


Đứa trẻ với bệnh phenylketonuria – Khẩu phần không thích hợp có thể làm chậm trể sự phát triển cơ thể.

http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc801/power/lec23.ppt


Bệnh Alkaptonuria Đây cũng là bệnh bẩm sinh, được phát hiện rất sớm từ năm 1900

Homogentisate xuất hiện trong nước tiểu Sụn và lỗ tai biến đổi  chuyển sang màu đen Ochronosis mắt trong bệnh nhân alkaptonuric

Polymerized homogentisate Trong sụn lỗ tai


Bệnh bạch tạng (Albinism) Dạng lông mi, lông mài trắng hoặc không có sắc tố da

Do thiếu hụt tyrosinase (tyrosine hydroxylase) kinh niên

Sources: www.lowvision.org/albinism.htm http://home.clara.net/knowlton/family/Albinism/bianca.htm


Sự hình thành Melanin HO Tyr. hydroxylase

NH3+ CH2 CHCO2 -

HO NH3+

O2

Tyrosine

CH2 CHCO2-

HO

DOPA

Tyrosinase O

Melanin (Black polymer)

Highly colored polymeric intermediates

O

Melanin hình thành trên da (melanocytes), mắt, và tóc Melanin trên da có tác dụng bảo vệ chống tia sáng mặt trời Albinism: Một số người thiếu enzyme tyrosinase do di truyền

CH2CHCO2+ NH3

Dopaquinone


Vai trò sinh học của tryptophan Tryptophan có vai trò quan trọng: Tạo ra serotonin trong hoạt động thần kinh Tạo ra Melatonin Tổng hợp Acid Nicotinic

http://wiz2.pharm.wayne.edu/biochem/aametabolism.ppt


L-Tryptophan • Là chất bổ sung thực phẩm để xúc tiến tạo serotonin • Thiếu L-Tryptophan là điều bất hạnh (1989): • Hội chứng đau cơ Eosinophilia (EMS) • Đôi khi đau cơ chổ khớp • Tình trạng yếu đuối • Sưng tấy cách tay và chân • Sốt • Phát ban da • Thiếu tryptophan có thể gây thiếu vitamin PP • Hàng trăm trường hợp; đôi khi tử vong • Phát hiện dấu vết nhiểm

http://wiz2.pharm.wayne.edu/biochem/aametabolism.ppt


Vai trò của Serotonin • Serotonin được tạo ra trong: • Não (vận chuyển thần kinh; điều hòa giấc ngủ, tâm trạng, sự ngon miệng) • Tiểu huyết cầu (sự tập hợp tiểu huyết cầu, sự co mạch) • Cơ trơn (co thắt) • Ống tiêu hóa (tế bào enterochromaffin – nơi cất giữ quan trọng)

• Là thuốc được sử dụng để xử lý: • Bệnh trầm cảm •Serotonin- ức chế tái hấp thu có chọn lựa (SSRI) • Chứng đau nửa đầu • Bệnh tâm thần phân liệt • Rối loạn do ám ảnh • Hóa trị liệu – buồn nôn •

Một vài chất gây ảo giác (e.g., LSD) như là chất đối kháng serotonin


Trao đổi chất của Serotonin: Melatonin (N-Acetyl-5-methoxytryptamine) CH2 CH2 NH2 HO

2 Steps N H

Serotonin

CH2 CH2 NHCOCH3

H3 CO N H

Melatonin

Melatonin: • Chủ yếu được tạo ra trong tuyến yên • Sự tổng hợp được kiểm soát bởi áng sáng và nhân tố khác • Gây co thắt dạ con trước khi sinh • Triệt chức năng tuyến sinh dục. • Có thể sử dụng trường hợp rối loạn giấc ngủ


Vai trò điều tiết tính ngon miệng của tryptophan


4. ENZYME 4.1 SƠ LƯỢC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN 4.2 CÁCH GỌI TÊN ENZYME 4.3 CÁCH PHÂN LOẠI ENZYME 4.4 ĐỘNG HỌC PHẢN ỨNG ENZYME

121


4.1 SƠ LƯỢC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN

Enzyme Enzyme là các chất xúc tác của hệ thống sinh học. Chúng có khả năng xúc tác đặc biệt, mạnh hơn nhiều so với các chất xúc tác tổng hợp. Tác dụng xúc tác của chúng mang tính đặc hiệu cao với cơ chất, phản ứng xảy ra ở điều kiện nhiệt độ và pH êm dịu.


Lịch sử phát triển enzyme • Cuối thế kỷ 18 đầu thế kỷ 19, sự phân giải các chất nhờ enzyme đã được ghi nhận nhưng cơ chế vẫn chưa biết. • Thế kỷ 19, Louis Pasteur phát hiện một chất có khả năng xúc tác trong quá trình lên men chuyển hóa đường thành rượu gọi là ferment có trong tế bào nấm men. • 1877, Wilhelm Kuhne, sinh lý học người Đức đầu tiên dùng thuật ngữ enzyme. • Thế chiến thứ 1, Weitzman sản xuất aceton ở Anh.


Lịch sử phát triển enzyme • 1897, Eduard Buchner phát hiên khả năng lên men của dịch chiết nấm men. 1907, ông nhận nobel prize cho phát minh “cell free fermentation”. • 1926, James B. Sumner kết tinh enzyme urease và 1937 cho enzyme catalase. • 1930, Northrop và Staley kết tinh enzyme pepsin. • Thế chiến thứ 2, sản xuất kháng sinh theo qui mô công nghiệp.


Lịch sử phát triển enzyme • Lysozyme laø enzyme ñöôïc xaùc ñònh caáu truùc ñaàu tieân vaø naêm 1965.  • 1969, xaây döïng qui trình coâng nghieäp saûn xuaát amino acid söû duïng enzyme.  • 1972, Boyer et al. aùp duïng kyõ thuaät di truyeàn trong coâng ngheä enzyme.  • 1973, saûn xuaát aspartic acid baèng leân men coá ñònh teá baøo.  • 1984 ñeán nay, phaùt hieän haøng traêm loaïi enzyme khaùc nhau vaø öùng duïng roäng raõi. 


4.2 Cách gọi tên Enzyme

Trong thời gian đầu khi ngành enzyme học chưa phát triển, người ta thường gọi tên enzyme một cách tùy tiện, tùy theo tác giả. Ví dụ như các tên pepsin, trypsin, chimotrypsin hiện nay vẫn được dùng gọi là tên thường dùng. Sau đó, người ta thường gọi tên enzyme bằng cách lấy tên cơ chất đặc hiệu của enzyme cộng thêm đuôi từ “ase”

Ví dụ: urease là enzyme tác dụng vào ure, proteinase là enzyme tác dụng vào protein, lipase là enzyme tác dụng vào lipid, amylase là enzyme tác dụng vào tinh bột (amidon). 1


Cách gọi tên enzyme Đối với các nhóm enzyme cùng xúc tác một loại phản ứng, người ta lấy tên của phản ứng enzyme thêm đuổi từ “ase”, ví dụ những enzyme xúc tác sự oxy hóa được gọi là oxydase, những enzyme khử hydrogen được gọi là dehydrogenase ...

Tên gọi đầy đủ, chính xác theo quy ước quốc tế tên gọi hệ thống của enzyme được gọi theo tên cơ chất đặc hiệu của nó cùng với tên của kiểu phản ứng mà nó xúc tác, cộng thêm đuôi “ase”. 2


Cách gọi tên enzyme ví dụ: enzyme xúc tác cho sự thủy phân ure (carbamid): H2N - CO - NH2 + H2O  CO2 +2NH3 có tên hệ thống là Carbamid - amidohydrodase (Tên thường dùng là urease)

3


4.3 Phân loại Enzyme Mục đích của phân loại enzyme là để nhấn mạnh một cách chính xác và tổng quát, mối quan hệ và những điểm giống nhau của một loại enzyme. 4.3.1 Phân loại theo lớp Enzyme

4.3.2 Phân loại theo cấu tạo

4


4.3.1 Phân loại theo lớp Enzyme

Các lớp enzyme Tiểu ban về enzyme (The enzyme Commission. EC) được tổ chức bởi Hội hóa sinh quốc tế (The internationl Union of Biochemistry, IUB)đã đưa ra cách phân loại thống nhất dựa trên các loại phản ứng và cơ chế phản ứng. Theo cách phân loại này thì enzyme được chia ra làm sáu lớp lớn đánh số từ 1 đến 6. Các số thứ tự này là cố định cho mỗi lớp.

5


Các lớp enzyme 1.

Oxydoreductase:

Các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử. Trong nhóm này có tất cả các enzyme có các tên thông thường đã biết như dehydrogenase, oxydase, cytochromreductase và peroxydase. Trong các phản ứng do chúng xúc tác xảy ta sự vận chuyển hydrogen, sự chuyển electron, sự oxy hóa bởi oxy phân tử, bởi hydrogen peroxide hoặc bởi các chất oxy hóa khác. 6


Các lớp enzyme 2. Transferase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị. Các transferase do bản chất của những gốc mà chúng vận chuyển có thể tham gia vào các quá trình trao đổi chất rất khác nhau.

7


Các lớp enzyme 3. Hydrolase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân. Trong lớp này có các enzyme phân giải este (ví dụ lipid), glucozid, amid, peptid, protein.

8


Các lớp enzyme 4. Lyase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nước, loại nước tạo thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử nước vào nối đôi. Thuộc vào lớp này có các enzyme được gọi là hydratase, aldolase, decarboxylase cũng như một số desaminase. 9


Các lớp enzyme 5. Isomerase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa. Chúng xúc tác cho những phản ứng chuyển các nhóm khác nhau bên trong phân tử. Trong lớp này có những enzyme chuyển hóa các đồng phân hình học và đồng phân quang học (như alaninracemase).

10


Các lớp enzyme 6. Ligase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu năng lượng ATP. v.v... Ở đây cần chú ý thêm là các enzyme phân cắt được phân loại với tên “lyase”. Nếu cân bằng chuyển dịch về phía tổng hợp thì enzyme đó cũng có thể được gọi là “synthase”.

11


Các lớp enzyme Mỗi lớp (class) lại được chia thành nhiều lớp phụ (sub-class) và phân lớp phụ (sub-sub-class), rồi sau đó thứ tự của enzyme trong phân lớp phụ (cũng có tài liệu phân chia theo: loại (lớp), tổ, nhóm và thứ tự enzyme).

12


Các lớp enzyme Ví dụ: enzyme xúc tác cho phản ứng: Ethanol + NAD+ acetaldehyde + NADH + H+ có tên gọi là alcohol dehydrogenase (ADH), tên quốc tế theo khóa phân loại là: Alcohol: NAD oxydoreductase, EC 1.1.1.1

13


Các lớp enzyme Như vậy, trong cách gọi hệ thống của enzyme ADH trên có tên của cơ chất và của coenzyme cũng như tên của quá trình chuyển hóa hóa học được xúc tác với tận cùng “ase”. Sau tên của enzyme là số của nó theo danh sách các enzyme do tiểu ban về enzyme đề ra (enzyme commission, EC). 14


4.3.2 Phân loại theo cấu tạo Enzyme đơn giản (một thành phần), phức tạp (hai thành phần-holoenzyme)  Holoenzyme gồm apoenzyme và coenzyme 

Apoenzyme hay apoprotein: chỉ có protein trong thành phần cấu tạo của nó.

Coenzyme: enzyme có protein kết hợp với phân tử kim loại tạo thành phức hữu cơ – kim loại.

Các đồng yếu tố được gọi là nhóm ngoại prosthetic.

140


- Những enzyme xúc tác cùng một phản ứng hóa học và có cùng tính đặc hiệu cơ chất nhưng có nguồn gốc khác nhau nên thể hiện nhiều tính chất khác nhau: Vd: Aldolase có nguồn gốc từ nấm men có nhiều tính chất khác với aldolase của mô động vật; pepsin, trypsin, chymotrypsin, xanthin oxydase và lysozyme cũng có những dạng phân tử khác nhau.

141


-Nhiều enzyme tương tự nhau thu được từ cùng một loại mô nhưng của những loài khác nhau cũng có những tính chất khác biệt nhau:  α - amylase của dịch nước bọt và dịch tụy của người giống nhau, nhưng chúng khác với α - amylase thu được từ tụy lợn về độ hòa tan, về pH thích hợp và một số tính chất khác 142


kiến nghị chính thức của ủy ban thường trực về enzyme của Hội Hóa sinh Quốc tế, danh từ isoenzyme được dùng để chỉ những dạng phân tử khác nhau của một enzyme tồn tại trong một loài; ngoài danh từ này, danh từ isozyme cũng được quen dùng.

 Theo

143


4.4 ĐỘNG HỌC PHẢN ỨNG ENZYME 4.4.1 TRUNG TÂM HOẠT ĐỘNG 4.4.2 TÍNH ĐẶC HIỆU 4.4.3 NĂNG LƯỢNG HOẠT HÓA 4.4.4 PHƯƠNG TRÌNH MICHAELIS-MENTEN VỀ ĐỘNG HỌC PHẢN ỨNG ENZYME 4.4.5 CÁC KIỂM KÌM HÃM PHẢN ỨNG ENZYME

144


4.4.1 TRUNG TÂM HOẠT ĐỘNG Enzyme (E)  Active site: trung tâm hoạt động  Substrate (S) : cơ chất (chất nền)  Product (P): sản phẩm phản ứng  Denature: biến tính 

145


Trung tâm hoạt động: nhóm hóa học tiếp xúc trực

tiếp cơ chất; nhóm hóa học không tiếp xúc cơ chất nhưng tác dụng trực tiếp đến quá trình xúc tác .

Có tính đặc hiệu lớn cho những cơ chất nhất định và xúc tác cho sự chuyển hóa chúng thành những sản phẩm đặc biệt. 

Gồm các amino acid có nhóm hoá học hoạt động mạnh; ion kim loại; nhóm chức của coenzyme.

Enzyme thể có một, hai, thậm chí 4 trung tâm hoạt động.

146


Ở

các enzyme một thành phần, trung tâm hoạt động thường bao gồm một tổ hợp các nhóm chức năng của amino acid không tham gia tạo thành trục chính của sợi polypeptide. dụ nhóm - SH của cysteine, - OH của serine, threonine và tyrosine, - NH2 của lysine, COOH của glutamic acid, aspartic, vòng imidazol của histidine, indol của tryptophan, nhóm guanidin của arginine.

 Ví

148


nhóm này có thể ở xa nhau trong mạch polypeptide nhưng lại gần nhau trong không gian, được định hướng xác định trong không gian cách nhau những khoảng cách nhất định sao cho chúng có thể tương tác với nhau trong quá trình xúc tác.

 Các

tâm hoạt động của các enzyme hai thành phần thường bao gồm nhóm ngoại (vitamin, ion kim loại ...) và các nhóm chức năng của các amino acid ở phần apoenzyme.

 Trung

149


 Giữa

cơ chất và trung tâm hoạt động tạo thành nhiều tương tác yếu, do đó có thể dễ dàng bị cắt đứt trong quá trình phản ứng để giải phóng enzyme và sản phẩm phản ứng.

tâm hoạt động của các enzyme có cấu trúc bậc 4 có thể nằm trên một phần dưới đơn vị hoặc bao gồm các nhóm chức năng thuộc các phần dưới đơn vị khác nhau.

 Trung

150


4.4.2 TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA ENZYME Do cấu trúc lý hóa đặc biệt của phân tử enzyme và đặc biệt là của trung tâm hoạt động mà enzyme có tính đặc hiệu rất cao so với những chất xúc tác thông thường khác.

152


- Đặc hiệu phản ứng - Đặc hiệu cơ chất: -Đặc hiệu tuyệt đối

- Đặc hiệu tương đối - Đặc hiệu nhóm

- Đặc hiệu đồng phân quang học 153


- ĐẶC HIỆU KIỂU PHẢN ỨNG  Phần

nhiều mỗi enzyme đều có tính đặc hiệu với một loại phản ứng nhất định. Những chất có khả năng xảy ra nhiều loại phản ứng hoá học thì mỗi loại phản ứng ấy phải do một enzyme đặc hiệu xúc tác.

154


155


- ĐẶC HIỆU TUYỆT ĐỐI  Một

số enzyme hầu như chỉ xúc tác cho phản ứng chuyển hóa một cơ chất xác định và chỉ xúc tác cho phản ứng ấy mà thôi.

156


157


- ĐẶC HIỆU NHÓM TUYỆT ĐỐI  Các

enzyme này chỉ tác dụng lên những chất có cùng một kiểu cấu trúc phân tử, một kiểu liên kết và có những yêu cầu xác định đối với nhóm nguyên tử ở phần liên kết chịu tác dụng.

158


- ĐẶC HIỆU NHÓM TƯƠNG ĐỐI  Mức

độ đặc hiệu của các enzyme thuộc nhóm này kém hơn nhóm trên. Enzyme có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hoá học nhất định trong phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các phần tham gia tạo thành mối liên kết đó. Ví dụ: lipase co khả năng thủy phân được tất cả các mối liên kết este. Aminopeptidase có thể xúc tác thủy phân nhiều peptid 159


160


161


ĐẶC HIỆU QUANG HỌC (ĐẶC HIỆU LẬP THỂ)  Hầu

như tất cả các enzyme đều có tính đặc hiệu không gian rất chặt chẽ, nghĩa là enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân không gian của cơ chất.  Enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân quang học của các chất. Ví dụ phản ứng khử nước của malic acid để tạo thành fumaric acid dưới tác dụng của fumarathydratase chỉ xảy ra đối với L - malic acid mà không tác dụng lên D - malic acid 162


163


MÔ HÌNH KHÓA VÀ CHÌA -LOCK AND KEY MODEL (E. FISHER, 1890)

Sự tương ứng về cấu trúc của TTHĐ của E và S là sẵn có và giữ cố định trong qt E kết hợp với S

Mô hình cảm ứng Induced-Fit model (D.E. Koshland, 1958)

S đã cảm ứng sự thay đổi vị trí của các nhóm chức TTHĐ E để tạo thành một cấu trúc vừa với S


4.4.3 NĂNG LƯỢNG HOẠT HÓA 

Động học nghiên cứu về bậc (vận tốc) của các phản ứng hóa học Động học phản ứng chỉ ra một phản ứng hóa học xảy ra nhanh hay chậm Các phản ứng hóa sinh xảy ra trong cơ thể sống, tế bào v.v diễn ra với tốc độ cao là nhờ vào sự xúc tác của enzyme mà không ảnh hưởng đến cân bằng phản ứng 165


ĐỊNH LUẬT CƠ BẢN CỦA NHIỆT ĐỘNG HỌC 

Định luật bảo toàn năng lượng, tổng năng lượng hệ kín là không đổi Một hệ lớn và không trao đổi năng lượng với môi trường sẽ có entropy luôn tăng hoặc không đổi theo thời gian


NĂNG LƯỢNG HOẠT HÓA

Các phân tử va chạm với nhau phải có đủ năng lượng để vượt qua rào cản năng lượng gọi là năng lương hoạt hóa


ENZYME VÀ NĂNG LƯỢNG HOẠT HÓA Enzymes giảm năng lượng hoạt hóa cần cho một phản ứng hóa học xảy ra  NLHH là sự sai khác giữa trạng thái cơ bản và trạng thái chuyển tiếp 


MICHAELIS

AND

MENTEN

Năm 1913, Michaelis và Menten đề ra cơ chế phản ứng vận tốc phản ứng có sự xúc tác enzyme như sau

S+E

k1

ES

k2

P+E

k-1

Phức trung gian.

Không có chiều nghịch -> không k-2

Sản phẩm


E = nồng độ enzyme.

S = nồng độ cơ chất. ES = nồng độ phức Enzyme-cơ chất (không hóa trị)

P = nồng độ sản phẩm. k1 = hằng số vận tốc cho sự chuyển hóa ES từ E và S.

k-1 = hằng số vận tốc phân ly ES thành E và S. k2 = hằng số vận tốc phân ly ES thành E và P.

170


MICHAELIS-MENTEN KINETICS

Ý nghĩa của KM ? KM = (k-1 + k2) / k1

 Nồng độ của cơ chất mà vận tốc phản ứng bằng ½ Vmax. Điều này có nghĩa KM càng nhỏ ám chỉ rằng enzyme đạt hiệu quả xúc tác cực đại ở [S] thấp.


MICHAELIS-MENTEN KINETICS


MICHAELIS-MENTEN KINETICS Ý nghĩa của Vmax?

 Vmax

đưa ra ý tưởng phản ứng xảy ra nhanh như thế nào trong điều kiện lý tưởng.  Nếu biết [E0] , Vmax có Ý nghĩa để tính SỐ NGHỊCH ĐẢO Vmax=k2[Eo] hoặc k2=Vmax/[Eo] k2 còn được gọi kcat hoặc số NGHỊCH ĐẢO (turn-over number)


MICHAELIS-MENTEN KINETICS


CHỈ SỐ KCAT/KM : CÁCH ĐO HIỆU NĂNG

XÚC TÁC (CATALYTIC EFFICIENCY)

 ->

kcat/KM là hằng số tương tác giữa E và S là thước đo hiệu quả xúc tác -> độ mạnh tương tác enzyme/cơ chất


CHỈ SỐ KCAT/KM : ĐỂ CHỈ TÍNH ”ĐẶC

HIỆU” CỦA CHYMOTRYPSIN

kcat/Km cao nhất -> cơ chất tốt nhất -> đặc hiệu cao nhất đối với cơ chất đó


ENZYMES 

Ở ”KINETIC PERFECTION”

Giới hạn cơ bản của kcat/Km thiết lập bởi k1, bậc chuyển hóa của ES Bậc này không thể nhanh hơn khuếch tán điều khiển giữa Enzyme và Sản phẩm (108 to 109 s-1 M-1)


PHẢN ỨNG

NHIỀU CƠ CHẤT A + B  P + Q

Trình tự thay thế: Tất cả các cơ chất phải liên kết với enzyme trước khi sản phẩm được tạo ra -> theo thứ tự (cơ chất liên kết vơi E theo một trình tự nhất định) hoặc ngẫu nhiên A + B + E  EAB  E + P + Q


PHẢN ỨNG

NHIỀU CƠ CHẤT A + B  P + Q

Thay thế kép (Ping-Pong) Một hoặc nhiều sản phẩm được tạo ra trước khi tất cả cơ chất liên kết -> một enzyme thay thế tồn tại trung gian A + B + E  EA + B  E + P + B  EB  E + Q


Kìm hãm enzyme (Enzyme Inhibition) -> Thuận nghịch Kìm hãm cạnh tranhChất kìm hãm nối vào trung tâm hoạt động của E-> ngăn không cho cơ chất kết nối -> cấu trúc tương đồng

Kìm hãm phi cạnh tranhkết nối chỉ với ES complex

Kìm hãm không cạnh tranh- Chất kìm hãm KHÔNG ngăn180 cản cơ ch -> cả hai có thể kết nối cùng một lúc -> giảm số nghịch đảo- turnover number


CHỦ ĐỀ 2: ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME 2.1 Định tính, định lượng Protein  2.2 Xác định hoạt độ Enzyme  2.3 Xác định cấu trúc Protein, Enzyme 

181


2.1 ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN 2.1.1 Định tính, định lượng Amino Acid  2.2.2 Định tính, định lượng Protein 

182


2.1.1 ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG AMINO ACID

183


TÍNH LƯỠNG TÍNH CỦA AMINO ACID 

Trong phân tử amino acid có nhóm carboxyl -COOH nên có khả năng nhường proton (H+) thể hiện tính acid, mặt khác có nhóm amin- NH2 nên có khả năng nhận proton nên thể hiện tính base. Vì vậy amino acid có tính chất

lưỡng tính.

184


CÁC PHẢN ỨNG HOÁ HỌC CỦA AMINO ACID Các amino acid đều có nhóm NH2 và COOH liên kết với C , vì vậy chúng có những tính chất hoá học chung. Mặt khác các amino acid khác nhau bởi gốc R, vì vậy chúng có những phản ứng riêng biệt.  Người ta chia các phản ứng hoá học của amino acid thành 3 nhóm: a) Phản ứng của gốc R. b) Phản ứng chung. c) Phản ứng riêng biệt 

185


Dụng cụ

Cốc đong

Bình định mức

Bình nón

Bếp điện lót lưới amian

Pippet có bầu và pippet thường

Burret


Các phương pháp định tính acid amin 1. Phản ứng tạo phức với kim loại nặng

Phản ứng này dùng để nhận biết sự hiện diện của acid amin và được thực hiện khi đun sôi


Các phương pháp định tính acid amin 2. Phản Ứng Ninhydrin  Phản ứng này dùng để nhận biết các acid amin do tất cả các acid amin đều phản ứng với ninhydrin tạo thành hợp chất màu xanh O O tím H R

C

COOH

OH

O

+

NH

NH3

+

CO2

+

RCHO

OH

O

O

O

N O

O

O

OH O

O

O

+

O

Aminodixetohidrinden Hợp chất màu xanh tím


Các phương pháp định tính acid amin • Riêng prolin khi tạo phức chất với nynhidrin tạo dung dịch màu vàng • Đây là phản ứng nhận biết prolin Dung dịch màu vàng


Các phương pháp định tính acid amin 3. Phản ứng Xantoprotein Phản ứng để nhận biết các acid amin trong các protein mạch vòng • Khi đun nóng protein với HNO3 đậm đặc tạo thành dẫn xuất nitơ màu vàng H H2N C COOH

H H2N C COOH

CH2

CH2

O

+ 2 HNO2

O NO2

O2N OH

+

H2 O

OH

Dinitrotyrozin (màu vàng)


Các phương pháp định tính acid amin

Khi thêm dung dịch kiềm sẽ tạo Quinoit màu cam, ngược lại protein không chứa mạch vòng không sinh phản ứng H H2N C

H H2N C

COOH

CH2

CH2

+ NO2

O2N O

COOH

O

NaOH O2N

N OH

ONa

+

H2 O

O

Dinitrotyrozin (màu cam)


Các phương pháp định tính acid amin 4. Phản ứng Millon ( nhận biết tyrozin) • Khi thuốc thử millon tác dụng với vòng phenol có trong tyrozin sẽ tạo thành hợp chất nitrotyrozin có màu đỏ OH

OHg

O

O

+

O2N

C H

NH 2

O

+

CH 2 HOOC

N

HgNO3

CH 2 HOOC

C H

NH 2

Nitrotyrozin (màu đỏ)

H2 O


Các phương pháp định tính acid amin 5. Phản ứng Adamkievic ( nhận biết Tryptophan) • Trong môi trường acid, tryptophan phản ứng với các aldehyt tạo màu đỏ tím đặc trưng COOH H2 N

H2 N

CH CH2

2

O

+

COOH

CH

CH

CH2

CH2

H2SO4

C H

COOH

H

NH2

CH2

- H2 O N

N

H

H

Bis – 2-tryptophanalilmetan


Các phương pháp định tính acid amin 6. Phản ứng sakagichi ( nhận biết arginin ) • Khi arginin tác dụng với NaBrO và -naphton sẽ tạo sản phẩm màu đỏ cam H 2N

H C

HO

COOH NaBrO

(CH 2)3

alpha naphtol

NH C NH NH 2

H 2N

H C

COOH

(CH 2)3 NH

NH 3

+

NaBrO

N2

+

NaBr + H 2 O

NaBr

HN C N

Naphtoquinoimin (màu đỏ cam )

O


Các phương pháp định lượng acid amin NH2 R CH

H +

COOH Aminoaxit

C O H Focmol

N R

CH2

CH

+

H2O

COOH Metyl-aminoaxit

Phương pháp chuẩn độ formol Các aminoaxit có thể phản ứng với focmol trung tính để tạo thành metyl - aminoaxit. Focmol đã khoá nhóm amin (NH2) mang tính kiềm nên có thể chuẩn độ nhóm cacboxyl trong phân tử aminoaxit bằng kiềm. Dựa vào lượng kiềm đã dùng để chuẩn độ sẽ tính được lượng Nitơ của aminoaxit


Các phương pháp định lượng acid amin Phương pháp formol  Cách tiến hành: cho vào erlen - 20ml dung dịch amino acid

- Dd NaOH 0,1N  xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt - Thêm 20ml dd formol 30% đã trung hòa sau 5 phút dd mất màu - Chuẩn độ bằng NaOH đến khi màu vàng xuất hiện trở lại


Các phương pháp định lượng acid amin Phương pháp formol • Tính kết quả: - 1ml dd NaOH tương đương với 1,4mg nitơ - Số mg nitơ của dung dịch được tính theo công thức

N = (A – B) x 1,4

(mg)

• Trong đó - A : số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm - B : số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra


2.1.2 ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN

199


Các phương pháp định tính protein • 1. Phương pháp Biure - Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptide (CO-NH-) - Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptide trở lên có thể phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, tím đỏ hay đỏ. - Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide Đo ở bước sóng:


Các phương pháp định tính protein 1. Phương pháp Biure  Cách tiến hành - ống nghiệm 1: cho vào 1 ít Biure và 1ml NaOH 10% và 1-2 giọt CuSO4 1% - ống nghiệm 2 : cho vào 3ml lòng trắng trứng gà 1% và 1ml NaOH 10% và 1-2 giọt CuSO4 1%

 Kết quả - ống 1: Dung dịch tím đỏ - ống 2: Dung dịch màu tím


Các phương pháp định tính protein 2. Kết tủa thuận nghịch bằng muối trung tính - Các muối của kim loại kiềm và kiềm thổ (thường dùng là (NH4)2SO4 , Na2SO4, NaCl, MgSO4) gây kết tủa thuận nghịch protein. Sau đó nếu loại bỏ nhanh các yếu tố gây kết tủa ,protein trở về trạng thái dung dịch keo bền. - Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với các nồng độ muối khác nhau.


Các phương pháp định tính protein 2. Kết tủa thuận nghịch bằng muối trung tính  Cách tiến hành - ống nghiệm 1: kết tủa globulin+ 3ml nước cất - ống nghiệm 2 : kết tủa albumin+ 3ml nước cất Kết quả - ống 1: kết tủa tan từ từ trong nước cất . - ống 2: kết tủa tan ngay trong nước cất.


Các phương pháp định lượng protein 1. Phương pháp xác định đạm formol  Cách tiến hành Lấy 2 erlen và đánh dấu bình 1 và 2 - Bình 1 :dùng kiểm tra, - Cho 50ml dd formol ½ - 3 giọt phenolphtalein 3% - Dùng dd NaOH 0,1N để hiệu chỉnh màu trong bình cho đến khi chỉ còn màu hồng nhạt - Ta được formon ½ trung hòa


Các phương pháp định lượng protein 1. Phương pháp xác định đạm formol  Cách tiến hành - Bình 2 :Dùng làm bình thí nghiệm. - 10ml dịch mẫu (pha loãng từ 5 đến 20 lần ) - 10ml dd formol ½ đã trung hoà - 3 giọt phenolphtalein 3% - Sau đó chuẩn độ bằng dd NaOH 0,1N cho đến khi dd trong bình 2 có màu hồng (đậm hơn màu ở bình 1)


Các phương pháp định lượng protein 1. Phương pháp xác định đạm formol  Cách tiến hành thực hiện chuẩn độ 3 lần thật và 3 lần với nước cất Thử không

Thử thật

Lần 1

0,4

10,6

Lần 2

0,5

10,7

Lần 3

0,4

10,5

V1= 0,45ml = 0,00045 l

V2= 10,6ml = 0,0106 l

Trung bình


Các phương pháp định lượng protein 1. Phương pháp xác định đạm formol  Tính kết quả M(g/l) = 1,4 ( V2 – V1 )/a Trong đó : - V1 là thể tích NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử không - V2 là thể tích NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử thật - a là lượng mẫu (ml) ứng với 10ml dịch mẫu pha loãng x lần (a= 1 ml = 0,001 l).  M(g/l) = 1,4 (0,0 106 – 0,00045 )/0.001 = 14,21


Các phương pháp định lượng protein 2. Phương pháp KJELDAHL (ĐL Nitơ tổng số) Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số. Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein Đạm tổng số ( Protein tổng số) = Nitơ tổng số X hệ số chuyển đổi


MẪU  Nguồn gốc động vật  Hạt bông  Đậu phộng  Đậu nành  Hạt hướng dương  Cơm dừa  Hạt mè  Bắp  Gạo  Lúa mì 

HỆ SỐ CHUYỂN ĐỔI 6.25 5.30 5.46 5.71 5.3 5.3 5.3 6.25 5.95 5.83


Gồm 4 bước: - Vô cơ hóa mẫu - Chưng cất đạm - Chuẩn độ H2SO4 dư - Tính kết quả


Các phương pháp định lượng protein 2. Phương pháp KJELDAHL  Cách tiến hành - Hút 1ml (lỏng) hoặc cân 1g (rắn đã nghiền nhuyễn) cho vào bình Kjendanl ,cho thêm 10ml H2SO4 đậm đặc cho thêm 0,5g hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 : Se (100:10 :1) làm xúc tác, đun nhẹ cho hỗn hợp mất màu, đun mạnh khi dd hoàn toàn hóa lỏng, lắc nhẹ và đun tới khi dd hoàn toàn trắng


Các phương pháp định lượng protein 2. Phương pháp KJELDAHL  Cách tiến hành - Chuyển toàn bộ dd đã vô cơ hóa sang bình định mức 100ml ,thêm nước cất cho đến ngấn chia,lắc đều - Lấy vào bình tam giác 10ml H2SO4 0,1N ,thêm vài giọt chỉ thị phenolphthalein và lắp vào máy cất như mô hình


Các phương pháp định lượng protein 2. Phương pháp KJELDAHL  Cách tiến hành

Mô hình p.p KJELDAHL


Các phương pháp định lượng protein 2. Phương pháp KJELDAHL  Cách tiến hành - Đun sôi nước trong bình cầu tạo hơi nước ,mở nước vào ống sinh hàn .Sau đó qua phễu cho vào bình cất 10ml dd thí nghiệm từ bình định mức và tiếp đó 8-10ml dung dịch NaOH 40% .Tráng phễu bằng một lượng nhỏ nước cất .Hơi nước từ bình cầu sục qua bình phản ứng và kéo theo NH3 sang bình hấp phụ . Quá trình cất kết thúc sau 15 phút .Định lượng H2SO4 dư bằng dung dịch NaOH 0,1N.


Các phương pháp định lượng protein 2. Phương pháp KJELDAHL  Tính toán kết quả. - Hàm lượng nitơ được tính theo công thức

(a  b).0,0014.10000.100 X  10.V

Trong đó : - X: hàm lượng nitơ (g/l) - a: số mol H2SO4 0,1N đem hấp thụ NH3 - b: số mol NaOH 0,1N tiêu chuẩn tiêu tốn cho chuẩn độ - V: số ml phẩm vật đem vô cơ hóa - 0,0014: lượng g nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N


Các phương pháp định lượng protein 3. Phương pháp Lowry Phương pháp này là một sự kết hợp của phản ứng Biuret và phản ứng Folin-Ciocalteau

Bước 1: phản ứng Biuret, protein liên kết với ion đồng trong môi trường kiềm. Bước 2: phức chất đồng-protein (chủ yếu là protein chứa amino acid nhóm tryptophan và tyrosine) khử hỗn hợp phosphomolipden – phosphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất mầu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 660nm.


218


Các phương pháp định lượng protein 3. Phương pháp Bradford Giống với các phương pháp khác, Bradford cũng phụ thuộc vào thành phần axit amin của phân tử protein và ngưỡng nồng độ của protein có trong mẫu. Nguyên lý của phương pháp Bradford là dựa vào sự thay đổi giữa 3 trạng thái tồn tại của thuốc thử Coomassie Blue G: cation (màu đỏ), trung tính (màu xanh lá cây) và anion (màu xanh da trời) Độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch chứa hỗn hợp protein và thuốc thử được đo ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thụ ánh sáng tỉ lệ thuận với hàm lượng protein có trong mẫu.


220


2.2 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME 

Xác định lượng cơ chất mất đi hay lượng sản phẩm tạo thành sau một thời gian nhất định và lượng enzyme xác định (phương pháp phổ biến)

Xác định thời gian cần thiết để enzyme khảo sát biến đổi một lượng cơ chất mất đi hay thu được lượng sản phẩm nhất định.

Xác định nồng độ enzyme cần thiết trong một thời gian nhất định có thể tạo thành sản phẩm hoặc biến đổi một lương cơ chất nhất định. Lưu ý: Đảm bảo điều kiện pH, nhiệt độ, thời gian, chất hoạt hóa hoặc chất làm bền enzyme.

221


Đơn vị hoạt độ quốc tế (UI): lượng enzyme xúc tác được 1mol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn

Katal: Lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa

được một mol cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn. 

1 UI= 1mol /phút, 1 kat=1mol/giây, vậy: 1 kat=???UI

Hoạt độ riêng: Số đơn vị WI (katal) ứng với một ml dung dịch hoặc gram chế phẩm khô.

Hoạt độ riêng của phân tử: Số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử enzyme trong một đơn vị thời

gian.

222


CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME  -

-

Có 2 cách nguyên tắc đo hoạt độ E: Phân tích liên tục Phân tích gián đoạn

-Phân tích liên tục: đo cơ chất bị biến đổi, hay sản phẩm tạo thành một cách liên tục theo thời gian Nhược điểm: Thiết bị đo phải có bộ phận ổn nhiệt, khó có thể phân tích hoạt độ nhiều E cùng 1 lúc

223


-Phân tích gián đoạn: Cho dừng phản ứng, sau đó đo lượng sản phẩm tạo ra hay cơ chất còn lại. Được sử dụng phổ biến hơn. Để làm ngừng phản ứng: gây bất hoạt E bằng nhiệt độ cao, thay đổi pH, dùng chất tạo phức hay tách E ra khỏi hỗn hợp phản ứng.

224


CÁC PHƯƠNG PHÁP CHÍNH XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ -

-

-

Phương pháp đo độ nhớt Phương pháp phân cực kế Phương pháp đo áp suất hay áp kế Phương pháp quang phổ kế Phương pháp chuẩn độ Phương pháp sắc ký Phương pháp hóa học Phương pháp phóng xạ

225


Phương pháp đo độ nhớt: Sử dụng nhớt kết để đo sự biến đổi độ nhớt của dung dịch phản ứng. Được áp dụng với các E mà cơ chất có độ nhớt cao hơn hẳn so với sản phẩm: a.nucleic, protein, cellulose Phương pháp phân cực kế: sử dụng khi cơ chất và sản phẩm có khả năng quay mặt phẳng ánh sáng phân cực và có góc quay riêng khác nhau vd: ph.ứng phân giải sucrose bởi βfructofuranosidase. Độ quay mặt phẳng ánh sáng phân cực sucrose +65˚, glucose +52,5 ˚, fructose -92,4 ˚ 226


227


Phương pháp đo áp suất hay áp kế: Chỉ dùng với các ph.ứng E có sự tiêu hao hay sinh khí, vd: các ph.ứng oxy hóa, decarboxyl hóa, loại amin hóa. 

amilase

vd: H2O2

H 2O + O 2

228


229


-

Phương pháp quang phổ kế: Được sử dụng rất phổ biến, dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng ở các bước sóng xác định của cơ chất, hoặc sản phẩm phản ứng

230


231


Phương pháp chuẩn độ: Dùng cho các phản ứng E có sự hình thành acid hoặc base. Phương pháp yêu cầu giữ pH môi trường cố định,lượng kiềm hoặc acid dùng để chuẩn độ theo thời gian phản ánh hoạt độ E

232


233


Phương pháp sắc ký: Sử dụng sắc ký để phân tách sản phẩm phản ứng.  vd tách amino acid sau khi cho hai E aminotranspherase lên cơ chất hay protease tác dụng lên cơ chất và sau đó định lượng các axit amin thu được. Tốn thời gian nên ít sử dụng 

234


Phương pháp hóa học: Dùng các ph.ứng hóa học để định lượng cơ chất mất đi hay lượng sản phẩm tạo thành. amilase Ví dụ: Tinh bột Dextrin Để đo hoạt độ của amylase, có thể dùng I2 tác dụng với dung dịch tinh bột, sau đó đo cường độ màu xanh tím tạo thành để đánh giá lượng cơ chất còn lại. - Phương pháp phóng xạ: Dựa trên sự hình thành các bức xạ của các chất đồng vị phóng xạ gắn vào cơ chất tại nhóm chức thích hợp để có thể đo độ phóng xạ. Độ nhạy cao. - Phương pháp huỳnh quang: dựa trên sự phát quang của một số hợp chất dưới tác dụng của nguồn 235 sáng kích thích đặc trưng bằng huỳnh quang kế 


236


MỘT SỐ LƯU Ý KHI XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ HAY THỰC HIỆN PHẢN ỨNG ENZYME Cần chọn điều kiện pH và nhiệt độ phân tích ở vùng thích hợp  Bên cạnh pH và nhiệt độ, cũng cần lưu ý đến cơ chất, thành phần đệm, lực ion hay nồng độ muối, các chất làm bền  Phải thực hiện ở một giá trị pH ổn định  Cơ chất và sản phẩm, đệm đều phải đạt cùng nhiệt độ phân tích khi tiếp xúc với nhau để bắt đầu phản ứng  Có mẫu kiểm tra thích hợp để tránh sai số  Phải lựa chọn ph.pháp làm ngừng phản ứng thích hợp 

237


2.3 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC PROTEIN, ENZYME

238


Cấu trúc 3D của Protein, enzyme

PEPTIDES

POLYPEPTIDES

PROTEINS

Tăng độ phức tạp của cấu trúc

4 Bậc cấu trúc của enzyme

239


Nhóm chức Ưa nước - H liên kết với nước ở môi trường Bên ngoài protein Nhóm chức kỵ nước-Tương tác kỵ nước ở môi trường BÊN TRONG protein

240


PROTEIN TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC Ưa nước

Kỵ nước

241


Các bậc cấu trúc của phân tử protein : -Cấu trúc bậc I : biểu thị thứ tự AA trong chuỗi polypeptide (LK peptide). -Cấu trúc bậc II : biểu thị sự xoắn của chuỗi polypeptide. LK hydrogen là lực chủ yếu ổn định cấu trúc xoắn (α-helix & β sheet) - Cấu trúc bậc III : biểu thị sự xoắn và gập khúc của chuỗi polypeptide. LK disulfide đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc bậc III. - Cấu trúc bậc IV : biểu thị sự kết hợp của nhiều chuỗi polypeptide có cấu trúc bậc III trong p/t. 242


Cấu trúc bậc 1 Là cấu trúc của chuỗi polypeptide, trong đó các amino acid nối với nhau bằng LK peptide và chúng được sắp xếp theo một trình tự nhất định đặc trưng riêng cho từng loại phân tử protein. Chính trật tự amino acid quyết định tính đặc trưng sinh vật học của phân tử protein. - Gốc bên R : gốc alkyl của các amino acid tạo cấu trúc không gian phức tạp và tạo hoạt tính sinh học của phân tử protein. 243


244


Cấu trúc bậc 2 Xuất hiện liên kết cấu trúc chuỗi polypeptide Bằng Liên kết Hydro : Giữa oxy nhóm carbonyl và hyrdro nhóm amide

R1 O

NH2 CH C

R2

O

R3 O

R4 O

N CH C

N CH C N CH C

H

H

O

R7

O

C

CH N C H

H

R6 CH N

H

O

R5

C

CH N 245 H


246


2 dạng của cấu trúc bậc 2

1. Chuỗi Alpha (-helix)

keratin của lông cừu, tóc, móng, sừng Chuỗi peptide cuộn Những nhóm R hướng ra ngoài từ trục Liên kết H giữa CO và NH thường cách Nhau 4 C

247


Mô hình -helix Liên kết H CO HN

248


2. Phiến Beta ( Phiến ) Chuỗi Polypeptide được trải rộng Liên kết H giữa CO và NH trên các chuỗi polypeptide khác nhau

Những chuỗi có thể chạy cùng 1 hướng ( phiến  song song) hoặc theo các hướng ngược nhau (phiến  song song ngược ) 249


Mô hình phiến 

Song song ngược Fibroin của Tơ lụa - phiến  Cấu trúc bền vững

250


251


. Cả 2 dạng cấu trúc xen nhau : dạng α (biểu diễn bằng hình trụ) và dạng xếp lớp  (biểu diễn bằng hình mũi tên);

. Các protein dạng sợi chỉ có dạng xếp lớp , là các protein biến tính tự nhiên (không cho trạng thái keo, không chịu tác dụng thủy phân của enzyme tiêu hóa …).

252


253


254


Cấu trúc bậc 3 Tương tác của những nhóm chức R

Hầu hết là những tương tác yếu, không hóa trị nhưng làm bền cấu trúc

255


256


258


259


Cấu trúc 3D của myoglobin

260


Cấu trúc bậc 4 Phức của 2 hoặc nhiều chuỗi polypeptide (đã có cấu trúc bậc 3) Mỗi chuỗi polypeptide thành viên gọi là phần dưới đơn vị-subunits gắn với nhau nhờ liên kết hóa trị , phi hóa trị Được gọi là E oligomer 261


262


CẤU TRÚC DOMAIN

Là những vùng có cấu trúc tương đối hoàn chỉnh trong phân tử protein, là nơi thực hiện chức năng liên kết, chức năng lắp ráp các phân tử protein. Các domain tạo khả năng tương tác linh hoạt giữa các đại phân tử trong qúa trình hoạt động của chúng.

263


Tổng kết về cấu trúc Protein, Enzyme

1Y

3Y

2Y

4Y

264

Tetrameric protein


PHƯƠNG PHÁP THĂM DÒ VÀ PHÁT HIỆN CÁC NHÓM CHỨC NĂNG TRONG TRUNG TÂM HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME  Đây

là việc khó khăn và phức tạp, phải sử dụng hàng loạt phương pháp khác nhau.  Muốn thăm dò, phát hiện và xác định các nhóm chức năng của phân tử enzyme, người ta thường dùng các phương pháp vật lý, hóa học, xác định hằng số ion hóa của các nhóm chức năng và tốt nhất là kết hợp với việc nghiên cứu cấu trúc phân tử của enzyme và của trung tâm hoạt động.  Thông thường người ta khóa, phá huỷ, hoặc đánh dấu các nhóm chức năng đó bằng các thuốc thử hóa học như chất ức chế đặc hiệu, cơ chất hoặc coenzyme

265


Biến tính Protein-Enzyme

Đứt gãy các liên kết không tan Tác dụng nhiệt – đứt các liên kết yếu (vd lòng trắng trứng) pH -ảnh hưởng liên kết hydro và tương tác tĩnh điện Dung môi hữu cơ hay tẩy rửa(lk kỵ nước)

266


Tin sinh học Một số phần mềm tin sinh  DNA Club/primer3

    

Bioedit BLAST Cn3d/RASMOL Njplot/TreeView GeneDesigner


Tin sinh học Một số phần mềm liên quan đến protein  PDB

   

Cn3d Jmol pyMOL Swiss PDB view


MEMBER ORGANIZATIONS 

Act as Data deposition, Data processing and Distribution centers for PDB data.

Three are founding member organizations:

PDBe…Protein Data Bank in Europe. PDBj…Protein Data Bank in Japan. RCSB…Research Collaboratory for Structural Bioinformatics.

The Biological Magnetic Resonance Data Bank (BMRB) joined later in 2006.

Another organization Worldwide Protein Data Bank (wwPDB) oversees PDB. wwPDB reviews and annotates each submitted entry and then it is automatically checked for plausibility( the source code) for validation software is available.


2DN2


UMIN HAEMOGLOBIN


-National Center for Biotechnology

Information (NCBI)Cn3d -Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)

279


7. ỨNG DỤNG TRONG DỰ ĐOÁN CẤU TRÚC PROTEIN HIỂN THỊ CẤU TRÚC BẰNG CN3D


281


HIỂN THỊ CẤU TRÚC BẰNG RASMOL


283


CHỦ ĐỀ 3: TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH PROTEIN, ENZYME 3.1 THU NHẬN CHẾ PHẨM PROTEIN, ENZYME THÔ 3.2 TÁCH TỪNG PHẦN VÀ TINH SẠCH PROTEIN, ENZYME 3.3 PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA ĐỘ SẠCH CỦA CHẾ PHẨM ENZYME

284


Protein, Enzyme có thể được thu nhận từ thực vật, động vật, vi sinh vật hoặc nuôi cấy mô động ,thực vật.  Cần phân biệt 2 khái niệm enzyme và chế phẩm enzyme: + Enzyme: có mặt hầu hết ở trong các cơ thể sống từ thực vật, động vật cho đến vi sinh vật. +Chế phẩm enzyme: là hỗn hợp nhiều enzyme khác hoặc trong cùng một nhóm, có mức độ tinh sạch khác nhau và mục đích sử dụng khác nhau. 

285


NHỮNG BƯỚC CHÍNH THU NHẬN PROTEIN ENZYME

286


NHỮNG LƯU Ý KHI THU NHẬN, TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH PROTEIN, ENZYME - Chú ý nhiệt độ, pH -Chọn dung dịch chiết rút thích hợp, -Bổ sung chất ức chế của E proteolytic - Bổ sung các yếu tố hóa học làm bền

287


3.1 THU NHẬN CHẾ PHẨM PROTEIN, ENZYME THÔ

-PHÁ VỠ MÔ VÀ TẾ BÀO (DISRUPTION OF TISSUES AND CELLS) + PP Vật lý + PP Hóa học + PP Enzyme -CHIẾT RÚT PROTEIN ENZYME

288


PHÁ VỠ MÔ, TẾ BÀO BẰNG PHƯƠNG PHÁP VẬT LÝ : - Phương pháp đồng hóa bằng máy xay - Phương pháp đồng hóa bằng máy đồng hóa.

- Phá vỡ tế bào bằng máy ép - Phương pháp nghiền với alumina hay cát

- Phương pháp nghiền với bi thủy tinh - Phương pháp siêu âm 289


PHÁ VỠ TẾ BÀO BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC: dựa trên khả năng tạo áp suất thẩm thấu hoặc khả năng oxy hóa mạnh của chất hóa học  Không cần áp suất cao, ít chi phí nhưng thường bị lẫn hóa chất vào hỗn hợp.

290


PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC (PHƯƠNG PHÁP ENZYME):  Phương pháp tự phân: tạo điều kiên tối ưu cho một số enzyme phân giải thành phần thành tế bào.  Thủy phân cả những chất khác và enzyme  Phương pháp sử dụng enzyme từ ngoài tế bào: sử dụng enzyme hệ cellulase xử lý thành tế bào nấm men và tế bào thực vật, collagenase từ Clostridium histolyticum, trypsin, estalase…  tách dựa vào điện tích, antigenicity, kích thước, tỷ trọng.  Lưu ý: Huyền phù tế bào vi sinh vật phải được ly tâm, lọc để thu enzyme ngoại bào. 291


PHƯƠNG PHÁP ĐỒNG HÓA BẰNG MÁY XAY 

Thích hợp phá các mô mềm như gan, tim, cơ,…

Thực hiện nhanh trong 5 –10 phút ở nhiệt độ 4˚C.

Sau khi đồng hóa, dịch đồng hóa được li tâm ở 23000 g trong 1 giờ ở 4 ˚ C, thu dịch nổi.

292


MÁY ĐỒNG HÓA

293


294


PHÁ VỠ TẾ BÀO BẰNG MÁY ÉP 

Hòa trộn tế bào vào dung dịch buffer thích hợp và nạp vào máy.

Tế bào bên trong máy French press đang ở áp suất rất cao, nhanh chóng bị đẩy ra áp suất khí quyển.

 

Sự thay đổi áp suất đột ngột làm tế bào bị vỡ. Li tâm ở 23 000 g trong 1 h ở 4 ˚ C, thu dịch nổi.

295


296


297


298


299


PHƯƠNG PHÁP NGHIỀN VỚI ALUMINA HAY CÁT 

Dùng chày nghiền tế bào với cát thạch anh, hoặc cát nhôm (2 lần khối lượng tế bào).

Hòa hỗn hợp nghiền trên vào dung dịch buffer thích hợp. (3 – 4 lần thể tích tế bào)

Dịch trên được li tâm ở 23 000 g trong 1 giờ ở 4 ˚ C, thu dịch nổi. 300


301


PHƯƠNG PHÁP NGHIỀN VỚI BI THỦY TINH 

Thường dùng cho tế bào nấm men

Cho 0.1 – 3 g tế bào vào các ống polysterene.

Thêm vào 1 thể tích buffer phù hợp.

Thêm vào 1- 3 g bi thủy tinh lạnh/ 1 gam tế bào.

Vortex 5 lần trong 1 phút.

Li tâm ở 23 000 g trong 1 giờ ở 4 ˚ C, thu dịch nổi. 302


303


PHƯƠNG PHÁP PHÁ VỠ TẾ BÀO BẰNG MÁY SIÊU ÂM 

Sóng

siêu

vách

tế bào.

âm

tạo

rung động

mạnh

phá

Mô được cho vào 2 lần thể tích buffer.

Tiến hành siêu âm ở mức cao nhất trong 2 phút.

Li tâm 23 000 g trong 1 giờ ở 4 ˚ C thu dịch nổi.

304


305


PHÁ VỠ TẾ BÀO NẤM MEN +Vách tế bào +Nhiều proteinase +Tạo đột biến gây ra sự thiếu hụt một vài proteinase +Ngăn chặn sự tạo proteinase bằng cách nuôi trên môi trường không chứa cơ chất protein.

306


-

Phá vỡ tế bào nấm men

+Phương pháp 1: ủ bánh men trong toluene (6% (v/w)) và 2 – mercaptoethanol (0.2 % (v/w)) ở 37˚ C trong 1 h  tách thành phần vách tế bào  EDTA (15 mM) pH 7.0 chứa 5 mM 2 – mercaptoethanol, ủ qua đêm  phá vỡ vách tế bào  ly tâm 15 000 rpm trong 30 phút +Phương pháp 2: lắc với hạt thủy tinh (đường kính 1 mm)  1ml dịch được ly tâm 2500 rpm ở 10˚ C. 307


PHÁ VỠ TẾ BÀO VI KHUẨN

+Vách tế bào  Phương pháp cơ học thành phần của tế bào. 

thường

ảnh

hưởng

đến

các

Vi khuẩn gram dương (Bacillus, Micrococcus, Streptococcus) : dùng enzyme lysozyme phá hủy vách tế bào, ủ với lysozyme từ trứng gà (0.2 mg/ml) ở 37˚C trong 15 phút.

 Vi khuẩn gram âm (E. coli, Klebsiella spp., Pseudomonas spp.) : rửa tế bào với detergent (0.1% (v/v) Nlauroyl-sarcosine)  xử lý với với sucrose (0.7 M), Tris (0.2 M), EDTA (0.04 M) 308


PHÁ VỠ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 

Mô được cắt nhỏ (loại bỏ mỡ và mô liên kết)

Mô mềm đồng hóa trong thiết bị đồng hóa

Mô cứng cần được xay nhỏ trong máy xay trước khi cho vào thiết bị đồng hóa.

Ly tâm.

309


310


Phá vỡ tế bào thực vật  Thu nhận enzyme từ tế bào thực vật tương đối khó khăn do sự hiện diện vách tế bào, không bào (vacuole) và hợp chất phenolic.  Việc phá vỡ không bào  giải phóng proteinases, pH dịch chiết thấp.  Khi có oxygen, phenol oxidases xúc tác chuyển hợp chất phenolic thành dạng polymeric pigment có thể bất hoạt (inactivate) enzyme trong dịch chiết  Bổ sung chất khử 2 – mercaptoethanol  Bổ sung polyvinylpolypyrollidone giúp hấp thu hợp chất phenolic. 

311


312


3.2 TÁCH TỪNG PHẦN VÀ TINH SẠCH PROTEIN, ENZYME Để tách từng phần và tiến đến tinh sạch protein, enzyme người ta thường phải dùng nhiều phương pháp khác nhau. Tùy theo nguồn gốc, phân loại, mục đích sử dụng, điều kiện của phòng thí

nghiệm. Tách sản phẩm đích (protein, enzyme) từ dung

dịch nuôi cấy hay hỗn hợp phá hủy tế bào được tiến hành bằng ph.pháp kết tủa, kết tinh, ly

tâm, lắng lọc, điện di, sắc ký v.v.

313


PHƯƠNG PHÁP LY TÂM Tách vật rắn ra khỏi dung dịch, thực hiện trong điều kiện nhiệt độ thấp, trong công nghiệp người ta thường dùng máy ly tâm liên tục -Đặc trưng bởi số vòng quay trong một phút hoặc một lực ly tâm tương đối (relative centrifugal force, RCF) hoặc giá trị là bội số của lực hút trọng trường (xg) -Lực ly tâm tương đối (g) = 1,1118 x 10-5 x R x N2. Trong đó R là bán kính (cm) nắp ly tâm tính từ tâm của trục đến đáy ống ly tâm, N là số vòng quay trong một phút. -Nguyên tắc: cân bằng đối xứng khi ly tâm và thăng bằng máy ly tâm khi đặt máy.

314


315


PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA Thêm vào dung dịch các chất trợ lắng, kết tủa theo tỷ lệ đương lượng  Kết tủa bằng muối (amonium sulphate; NaCl)  Dung môi hữu cơ (ethanol; acetone)  Dùng polymer  Kết tủa ở điểm đẳng điện

316


PHƯƠNG PHÁP THẨM TÍCH (DIALYSIS) Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất keo hòa tan (protein, một số các polysaccharid) nhưng thấm đối với các dạng dịch các tinh thể. Thẩm tích để loại muối (NH4)2 SO4 trong kết tủa protein, enzyme

317


VIDEO CLIP DIALYSIS

318


Protein, enzyme được cô đặc bằng các phương pháp: + Phương pháp nhiệt +Phương pháp thẩm tích +Phương pháp lọc và siêu lọc (ultrafiltration)

319


Phương pháp lọc: tách phần rắn ra khỏi dung dịch. + Lọc ép: dung dịch cần lọc có khối lượng nhỏ + Lọc chân không: sử dụng nhiều trong sản xuất và nghiên cứu + Lọc theo dòng chảy cắt ngang: nguyên liệu chảy song song vật liệu lọc. + Lọc thông thường

320


Phương pháp siêu lọc Sử dụng màng lọc với kích thước lỗ lọc siêu nhỏ, áp suất cao (nitrogen pressure) được sử dụng 100 – 500 Kpa, không dùng không khí nhằm tránh sự oxi hóa enzyme.  Áp dụng dòng chảy ngang cross – flow giúp tránh tắt nghẹt lỗ lọc.  Các phân tử enzyme quan tâm được giữ lại trong màng trong khí các phân tử kích thước nhỏ đi qua các lỗ trên màng.  Loại bỏ dung môi và phân tử kích thước nhỏ hơn kích thước enzyme. 

321


MÔ HÌNH LỌC A. DỌC (DEAD-END) , B. NGANG (CROSS-FLOW)

322


MỘT SỐ BỘ PHẬN LỌC A- ĐĨA VÀ KHUNG, B- SỢI , C- PHIẾN

323


SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION Có 2 loại gel trao đổi ion: anion (anionit) và cation (cationit). Gel = gắn nhóm chức tích điện dương (DEAE, QAE), nhóm chức tích điện âm (CM,SP) lên chất nền cellulose,sephadex.  Sắc ký trao đổi ion thường được dùng ở mức tinh sạch ban đầu, phân chia các protein khác nhau về độ tích điện  E được rửa (eluded) ra khỏi gel nhờ thay đổi nồng độ muối hay pH của môi trường=>lựa chọn pH để E cần tinh sạch gắn hay không gắn trên gel: nghệ thuật tinh sạch và thu nhỏ mẫu nghiên cứu 

324


325


SẮC KÝ LỌC GEL (SẮC KÝ LỌC RÂY PHÂN TỬ) Gel thường dùng là sephadex, sepharose. Ký hiệu G-10, G-15, G-25 hay sepharose 4B, 6B. Chỉ số càng nhỏ thì kích thước mắt lưới (lỗ) gel càng nhỏ.  Các phân tử mẫu khi đi qua hệ thống các hạt gel, nếu có kích thước nhỏ hơn lỗ gel có thể chui vào trong các hạt gel, do đó thời gian đi qua cột gel sẽ lâu hơn các phân tử có kích thước lớn hơn => Phân chia các đại phân tử khác nhau về khối lượng hay kích thước.  Áp dụng tinh sạch ban đầu, và thể tích mẫu nhỏ. 

326


327


328


SẮC KÝ ÁI LỰC Nguyên tắc dựa trên sự tương tác đặc hiệu sinh học. E tương tác đặc hiệu với cơ chất (hoặc tương đồng với cơ chất), cofactor, chất ức chế cạnh tranh.  Gắn với gel một chất có ái lực đặc hiệu với E  E được rửa (eluded) ra khỏi gel nhờ thay đổi nồng độ muối hay pH của môi trường 

329


330


PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA ĐỘ SẠCH CỦA CHẾ PHẨM ENZYM Điện di gel polyacrylamide (PAGE), đệm có chứa sodium dodecyl sulfate (SDS), protein sẽ duỗi thẳng tích điện âm di chuyển về phía cực dương trong điện trường  Kết hợp điện di với sắc ký lọc gel  Phân tích khối phổ: protein được cắt bằng protease đặc hiệu thành mảnh peptide nhỏ -> phân tích khối phổ ->phổ các đỉnh peptide được xác định , so sánh ngân hàng phổ peptide 

331


Phương pháp x.định hoạt độ riêng.

332


Gel electrophoresis

Bands


Hình thành công thức chế phẩm enzyme  Công việc mang tính bảo mật, thông tin công thức chế phẩm được giữ kín bởi nhà sản xuất.  Bí mật có thể được tiết lộ kèm theo nhiều điều kiện ràng buộc trên hợp đồng.  Là bước chính trong qui trình sản xuất enzyme.  Công thức chế phẩm bao gồm thành phần trong enzyme thành phẩm giúp bảo quản, duy trì hoạt tính enzyme, những chỉ dẫn và những qui định chặc chẽ về việc sử dụng chúng.  Qui định trên tùy thuộc vào mục đích sử dụng của enzyme. 334


335


336


337


CHỦ ĐỀ 4: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PROTEIN, ENZYME

338


CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PROTEIN, ENZYME TỪ VI SINH VẬT Theo Thomas D. Brock (1995), các sản phẩm vi sinh vật có ý nghĩa công nghiệp được phân thành 5 loại chính: - Bản thân các tế bào vi sinh vật (sinh khối) là các sản phẩm mong muốn. - Các enzyme do vi sinh vật tạo nên: amylase, protease, lipase... - Các dược phẩm: các chất kháng sinh và các alcaloit. - Các hoá chất đặc biệt và các chất điều vị thực phẩm: bột ngọt nhân tạo; acid glutamic, lysine và triptophan, một số vitamin. - Các hoá chất thông dụng được sản xuất bằng con đường vi sinh vật bao gồm ethanol, acid acetic, acidlactic và glycerine

339


- Sinh khối tế bào: Đó là các trường hợp của nấm men dùng cho mục đích dinh dưỡng và làm nở bột mỳ, trường hợp các nấm ăn dùng làm thức ăn. Các vi khuẩn và vi tảo cũng được nuôi cho mục đích dinh dưỡng, song cho đến nay chưa có ý nghĩa lớn về mặt thương mại. Ở đây cần phân biệt hai trường hợp:  + ''protein đơn bào'' (SCP) thường được dùng để chỉ các tế bào, các vi sinh vật như là các sản phẩm công nghiệp  + ''giống khởi động'' (starter culture) là các sản phẩm công nghiệp trong đó bản thân các tế bào vi sinh vật được dùng làm nguyên liệu cấy 

340


VIDEO CLIP VỀ TỔNG HỢP PROTEIN TRONG TB

341


NHỮNG BƯỚC CƠ BẢN TRONG SƠ ĐỒ SẢN XUẤT PROTEIN, ENZYME TỪ VI SINH VẬT 1. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật 2. Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng; 3. Nuôi cấy vi sinh vật (Quá trình lên men); 4. Tách và tinh sạch protein, enzyme

342


1. TUYỂN CHỌN, CẢI TẠO VÀ BẢO QUẢN GIỐNG VSV Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho năng suất protein, hoạt độ enzyme cao.  Người ta cần tiến hành gây đột biến bằng phương pháp sinh học, lý, hóa học…để tạo chủng có khả năng “siêu tổng hợp protein, enzyme” như:  Phương pháp gây đột biến; Phương pháp biến nạp; Phương pháp tiếp hợp gene; Phương pháp tải nạp. 

343


BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT 

Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian có thể tạo ra các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy chuyền và kiểm tra lại các đặc tính ban đầu:

Phương pháp cấy chuyền; dầu khoáng, đất cát, Phương pháp làm khô; Phương pháp đông khô; Phương pháp bảo quản lạnh sâu. 344


2 CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG

Nguồn cung cấp cacbon tốt nhất là gluxit (đường monoza, hoặc đisaccarit…) sau đó là chất béo, axit hữu cơ, rượu….Nguồn N đưa vào môi trường dạng muối nitrat, nitrit, muối amon, chất hữu cơ có nitơ….Nguồn P ở dạng muối photphat.  Đặc biệt lưu ý, để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường cho thêm vào môi trường nuôi “chất cảm ứng” tổng hợp enzyme, thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp. 

345


- Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme : Có thể chia làm 2 loại:  Môi trường tổng hợp: 

là môi trường bao gồm các chất với liều lượng xác định (qua tìm hiểu, nghiên cứu), chẳng hạn nguồn cacbon có thể là tinh bột, xenlulolaza, đường, axit, rượu, nguồn Nitơ vô cơ hoặc hữu cơ (axit amin, peptin...). Loại môi trường này được sử dụng cho mục đích nghiên cứu (có khi nó mang tên nhà nghiên cứu ra nó: Czêpk-Dobrovonxki, Hasen...).

346


Môi trường tự nhiên:

Thường dùng các lọai phế liệu, nguyên liệu (đa số trong

đó là thực phẩm) có chứa các nguồn cacbon, nitơ, khoáng (đa lượng, vi lượng), các yếu tố sinh tổng hợp. Mặt khác,

các nguyên liệu này lại có sẵn, rẻ tiền nên được sử dụng rất nhiều trong công nghiệp sản xuất các chế phẩm enzyme vi

sinh vật. 347


3. NUÔI CẤY VI SINH VẬT (QT LÊN MEN) Quá trình lên men có thể phân biệt theo: +Sự có mặt của không khí: ưa khí, kỵ khí +Số lượng bình phản ứng: một, hai, nhiều công đoạn +Sự có mặt của khuấy trộn: động hay tĩnh +Trạng thái của môi trường dinh dưỡng: bề mặt hay chìm + Phương pháp tác động: liên tục, gián đoạn, điều hòa 

348


phương pháp nuôi cấy bề mặt (còn gọi là phương pháp nổi) và phương pháp bề sâu (còn gọi là phương pháp nuôi cấy chìm), trong đó ở phương pháp bề sâu còn có

thể chia ra 2 phương pháp cụ thể hơn: là nuôi cấy chìm 1 bước (1pha) và nuôi cấy chìm 2 bước (2 pha).

349


-

Quy trình công nghệ nuôi cấy bề mặt:

350


Phương pháp nuôi cấy bề mặt có những ưu nhược điểm sau:  Nồng độ protein, enzym tạo thành cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi sinh vật. Trong công nghiệp rượu muốn đường hoá 100kg tinh bột chỉ cần 5kg chế phẩm nấm mốc bề mặt nhưng phải cần đến 100lít nấm mốc chìm đã lọc bã và tế bào vi sinh vật. 

Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzym, chế phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzym.

351


Tốn ít năng lượng (Điện, hơi nước, công nhân) thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện ở qui mô gia đình, trang trại cũng như ở qui mô lớn đến 20T/ngày.

Nuôi cấy trong điều kiện không cần vô trung tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy nếu có nhiễm trùng phần nào,

khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó. 

Tuy nhiên phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó

cơ khí hoá, tự động hoá, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều. 352


- Phương pháp nuôi cấy chìm (bề sâu): 

Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất chủ yếu trong đa số trường hợp là tinh bột, kết hợp

quá trình khuấy trộn và sục khí. 

Phương pháp nuôi cấy chìm đòi hỏi phải được vô trùng

tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng thiết bị, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy

, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy .

353


Phương pháp nuôi cấy bề sâu có những ưu nhược điểm sau:  Phương pháp nuôi cấy hiện đại (công nghệ cao) dễ cơ khí hoá, tự động hoá, năng suất cao, dễ tổ chức sản xuất tiết kiệm diện tích sản xuất.  Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh tổng hợp enzym cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy, enzym thu được tinh khiết hơn, đảm bảo điều kiện vệ sinh, vô trùng.  Tuy nhiên do thu được canh trường có nồng độ enzym thấp nên khi tách thu hồi enzym sẽ có giá thành cao (có đặt trước). Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thất lớn. 

354


MÔ HÌNH CHUỖI NUÔI CẤY VI SINH VẬT ĐIỂN HÌNH

355


*** BÌNH (NỒI) LÊN MEN: Ở quy mô công nghiệp sử dụng binh lên men lớn nhằm đảm bảo cung cấp kịp thời và đồng đều dinh dưỡng, oxi, khuấy trộn, nhiệt độ cũng như thu nhận sản phẩm qua thiết bị cảm biến hiện đại

356


CẤU TRÚC ĐIỂN HÌNH BÌNH LÊN MEN

357


250 M3 REACTOR (≈ 9000 T YEAR-1 PRODUCTION) IN NORWAY


NỒI LÊN MEN Ở ĐHQGHN

361


VIDEO CLIP BIOREACTOR ï‚¢

3 video clip

362


363


364


NHIỆM VỤ KHOA HỌC  

 

Cải biến các giống cũ Nghiên cứu lai tạo ra các chủng đột biến có năng suất chất lượng tốt Tìm kiếm phát hiện các giống mới ưu việt Tạo các chủng giống có năng suất chất lượng tốt đồng thời tạo được các sản phẩm phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng


CHỦ ĐỀ 5: ỨNG DỤNG CỦA PROTEIN, ENZYME (SEMINAR)

366


Bài giảng có tham khảo tài liệu, bài giảng của thầy Dương Thanh Liêm, Cao Đăng Nguyên, Nguyễn Phước Thuận và một số bài giảng khác.  Xin trân trọng cảm ơn! 

367

ENZYME VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - ĐỖ LÊ HỮU NAM  

https://app.box.com/s/rauvfh57r291hm0wp3uikffxl3wrzjre

ENZYME VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - ĐỖ LÊ HỮU NAM  

https://app.box.com/s/rauvfh57r291hm0wp3uikffxl3wrzjre

Advertisement