ĐẶC TÍNH VÀ ỨNG DỤNG ENZYME LIPASE, CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

B

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME

10 00

GVHD:Th.S Trương Phước :

Nguyễn Thái Trần Thị Kim Nguyễn Thị Yến Bùi Phương Đặng Ngọc

TP. Hồ Chí Minh – 2017

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

NHÓM SVTH

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

TR ẦN

ĐẶC TÍNH VÀ ỨNG DỤNG ENZYME LIPASE,CÁC

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

G

BÁO CÁO CÔNG NGHỆ ENZYME

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

N

H

Ơ

N

~~~~~~*~~~~~~

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Y

N

H

Ơ

Sự phát triển nhanh chóng của công nghệ enzyme đã mang lại sự quan tâm đáng kể đến việc ứng dụng enzyme lipase trong ngành công nghiệp dầu béo. Các phản ứng sử dụng enzyme lipase mang lại nhiều lợi ích hơn các phản ứng hóa học thông thường. Lipase có thể sử dụng một cách hiệu quả và kinh tế trong điều kiện ôn hòa. Đây là đặc điểm quan trọng, bởi vì điều kiện khắc nghiệt sẽ gây ra các phản ứng trùng hợp chất béo và sinh ra nhiều sản phẩm phụ. Do đó việc sử dụng lipase sẽ làm giảm nhu cầu loại bỏ các hợp chất màu và sản phẩm phụ bằng phương pháp tốn kém năng lượng.

N

LỜI NÓI ĐẦU

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP Đ ẠO

Tổng quan về lipase Sản xuất lipase Phương pháp cố định lipase Phương pháp xác định hoạt tính Ứng dụng lipase trong đời sống và sản xuất

N

1.

2.

3.

4.

5.

G

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Do đó nhóm chúng tôi xin giới thiệu đến các bạn về loại enzyme vẫn được xem là “chất xúc tác linh động nhất” này thông qua các phần sau đây:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

N

H

Ơ

N

MỤC LỤC I. Tổng quan về Lipase ..................................................................................................... 1 1. Tên enzyme............................................................................................................... 1 2. Cấu trúc enzyme Lipase ........................................................................................... 2 3. Cơ chế sinh tổng hợp lipase. .................................................................................... 3 4. Phân loại enzyme ..................................................................................................... 4 5. Thông số : nhiệt độ, pH, cofactor, coenzyme. .......................................................... 5 II. Sản xuất enzyme Lipase: ............................................................................................ 8 1. Quy trình tổng quát thu nhận enzyme ngoại bào từ VSV: ................................ 8 2. Quy trình cơ bản thu nhận enzyme từ nguồn động vật,thực vật: ..................... 9 3. Quy trình cơ bản thu nhận enzyme lipase ngoại bào từ VSV:........................... 9 4. Quy trình sản xuất Lipase ngoại bào từ Cadida rugosa: ................................. 10 5. . Tinh sạch enzyme bằng sắc kí cột: ...................................................................... 10 III. Phương pháp cố định enzyme lipase:..................................................................... 11 IV. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase .................................................... 11 1. Các phương pháp hoá lý : ................................................................................... 15 2. Phương pháp đĩa Wilhelmy: .................................................................................. 16 3. Sự xuất hiện những sản phẩm của phản ứng thủy phân: ................................... 19 V. Ứng dụng .................................................................................................................... 21 1. Ứng dụng của Lipase trong công nghiệp.............................................................. 21 2. Ứng dụng lipase trong công nghiệp tẩy rửa .......................................................... 22 3. Ứng dụng lipase trong công nghiệp thuộc da, dệt, giấy ......................................... 22 4. Ứng dụng lipase trong công nghiệp hóa chất ........................................................ 23 5. Ứng dụng lipase trong hóa sinh dược và y tế......................................................... 23 6. Ứng dụng lipase trong mỹ phẩm và công nghiệp nước hoa .................................. 23 7. Ứng dụng lipase trong sản xuất biodiesel ............................................................. 23 8. Ứng dụng lipase trong biosensor (cảm biến sinh học)........................................... 24 VI.Tài liệu tham khảo .................................................................................................... 26

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

I.

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Tổng quan về Lipase

1. Tên enzyme Lipase (EC 3.1.1.3) còn có tên khác là Triacylglycerol lipase.

Ơ

N

Thuộc nhóm enzyme hydrolase, cắt đặc hiệu các liên kết ester.

10 00

B

EC 3.1.1.3

triacylglycerol lipase

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

➢ Là enzyme tan trong nước xúc tác phản ứng thủy phân triacylglycerol không tan trong nước tạo thành các glyceril và các acid béo tương ứng nhờ hoạt động của nó trên bề mặt phân pha dầu-nước. ➢ Lipase xúc tác phản ứng thủy phân cắt đứt lần lượt các liên kết α-ester chứ không cắt cùng một lúc 3 liên kết. Quá trình xúc tác thường chậm hơn so với các enzyme khác như protease, amylase…

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

TR ẦN

H Ư

EC 3.1.1. Carboxylic ester hydrolases

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

G

Đ ẠO

EC 3.1. Acting onester bonds

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

N

H

EC 3. Hydrolase Nomenclature

1

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

2. Cấu trúc enzyme Lipase Tâm hoạt động của lipase là bộ ba: Serine, Histidine và Aspartate/Glutamate.

Phía trên trung tâm hoạt động có vùng kỵ nước được hình thành sau khi lipase được hoạt hóa. Ngoại trừ các điểm chung về khả năng xúc tác thông dụng thì lipase từ những nguồn khác nhau có rất ít điểm chung ở cấp độ amino acid. Do đó, sự hiện diện của serine ở tâm hoạt động được xem là có tính bảo tồn cao và thường xuất hiện trong chuỗi pentapeptide Gly – Xaa – Ser – Xaa – Gly.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

G

Phản ứng thủy phân triacylglycerol thành glycerol và các acid béo

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

N

H

Ơ

N

➢ Hoạt động mạnh trong hệ nhũ hóa, đặc biệt là hệ nhũ đảo. Tại bề mặt phân cách giữa pha nước với các pha không hòa tan chứa cơ chất.

2

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

N

H

Ơ

3. Cơ chế sinh tổng hợp lipase.

Giống như sự tổng hợp protein, lipase sẽ được hình thành khi trải qua các quá trình phiên mã, dịch mã và sau dịch mã. Tất cả các quá trình thực hiện bên trong tb chất của VSV. Đầu tiên là sự phiên mã. Quá trình chỉ xảy ra khi đoạn gen tổng hợp nên lipase phải được hoạt hóa trước bằng chất cảm ứng. Chất này sẽ giúp giải phóng enzyme RNA polymerase thoát khỏi sự kìm hãm của chất ức chế bằng cách kết hợp với chính chất ức chế đó. Bản chất của chất cảm ứng chính là cơ chất chịu sự xsuc tác của lipase.

Kết thúc quá trình phiên mã diễn ra trong nhân tế bào sản phẩm sẽ là phân tử mRNA, nhưng phân tử này rất dễ bị thuỷ phân trong môi trường tế bào chất. Bên cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy phân tử siRNA (short interference RNA) được hình thành trong quá trình phiên mã có tác động kìm hãm sự dịch mã hoặc thúc đẩy sự phân hủy những phân tử mRNA. Vì vậy số lượng enzyme được tổng hợp sẽ giảm đi đáng kể.

Tiếp theo, quá trình dịch mã sẽ sử dụng thông tin mã hóa trong mRNA để tạo thành mạch protein có thứ tự acid amin chính xác. Tuy nhiên, chuỗi polypeptide này rất dễ bị thủy phân bởi enzyme peptidase. Quá trình này cần một loại protein “chuyển giao” để tái sử dụng các acid amin của protein có cấu trúc gấp khúc (folded protein) mà không còn sử dụng được nữa.

Khi những polypeptide enzyme đã được tổng hơp khá nhiều thì những polypeptide ở gần nhau sẽ tương tác với nhau tạo thành cấu trúc gấp khúc làm cho khối enzyme trở nên không tan. Điều này đã làm cho enzyme mất đi hoạt tính sinh học.

Quá trình này được điều khiển bởi chaperone, là một đoạn polypeptide có chức năng làm gấp khúc các enzyme trong nội bào trước khi những enzyme này được vận chuyển qua màng mmebrane. Đối với pro-pro-enzyme ngoại bào, là enzyme tổng hợp trong tế bào chất nhưng chưa có cấu trúc hoàn thiện, cấu trúc phân tử không được gấp khúc trogn suốt quá trình vận chuyển qua màng membrane. Do đó, một số protein khác đã hỗ trợ enzyme ngoại bào này chống lại sự gấp khúc trong tế bào chất để không hình thành khối protein không tan và chống lại thủy phân nội bào.

Hoạt tính của enzyme còn phụ thuộc vào cofactor là những ion kim loại. Sự cung cấp không đủ những ion này trong tế bào chất sẽ làm giảm đi hoạt tính của enzyme. Vì vậy phải đảm bảo nồng độ bão hòa của các ion đối với enzyme phải thấp hơn nồng độ các ion đó trong tế bào chất. Đối với pro-pro-enzyme, khi không đủ cofactor để đảm bảo hoạt tính cũng như sự vận chuyển qua màng membrane thì một lượng enzyme này bị giữ lại trong tế bào chất làm ảnh hưởng hiệu suất sinh tổng hợp enzyme.

Sau khi được vận chuyển qua màng membrane, enzyme ngoại bào vẫn có thể bị phân hủy bởi enzyme peptidase trong không gian chu chất. Trong giai đoạn này proenzyme, là enzyme ngoại bào trong không gian chu chất chưa có cấu trúc hoàn thiện, vẫn tiếp tục hoàn thiện cấu trúc của nó nhờ những phân ứng thủy phân.

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

3

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

10 00

nhận từ vi sinh vật có giá trị thương mại.

Lipase từ thực vật như ngũ cốc trong giai đoạn nảy mầm. Lipase từ nguồn thu

-H

Ó

A

nhậnnày hạn chế về hoạt tính lẫn khả năng bền nhiệt, đồng thời nồng độ enzyme là không cao.

-L

Ý

Nguồn lipase từ động vật quan trọng nhất là từ tụy tạng của bò, cừu và lợn.

ÁN

Lipase từ tụy tạng lợn là một trong những lipase được biết đến sớm nhất và khá

TO

thông dụng. Hạn chế của lipase từ tụy tạng là chúng chứa những hợp chất có mùi và vị khó chịu như trypsine, tạo vị đắng nên không được ưa chuộng. Bên cạnh đó, nguồn

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

B

động vật và lipase từ vi sinh vật, đặc biệt là từ vi khuẩn và nấm, đã có một vài lipase thu

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

Lipase được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau : lipase từ thực vật, lipase từ

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TR ẦN

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

N

H

Ơ

N

4. Phân loại enzyme

D

IỄ N

Đ

ÀN

lipase này còn có khả năng lây truyền virus từ động vật sang người nên hiện nay xu hướng sử dụng lipase từ vi sinh vật đang được ưa chuộng do đặc tính đa dạng, dễ tách chiết và nguyên liệu vô hạn . ➢ Đặc hiệu vị trí: o Những enzyme không đặc hiệu với vị trí hoặc cấu trúc gốc acyl trên mạch triglyceride (C.rugosa).

4

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

o Xúc tác đặc hiệu vị trí 1,3 trên phân tử triacylglycerol (A.niger). o Chỉ xúc tác đặc hiệu 1 số acid béo nhất định (Geotrichum candidum). ➢ Đặc hiệu cơ chất: cơ chất có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzyme và bị chuyển hóa dưới tác dụng của enzyme. (C.rugosa, A.niger,

N

M.miehei …)

N

H

Ơ

5. Thông số : nhiệt độ, pH, cofactor, coenzyme. a. Nhiệt độ, pH tối ưu

D

IỄ N

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

Đ

ÀN

TO

ÁN

b. Cofactor Enzyme lipase hoạt động không cần cofactor, tuy nhiên sự hiện diện của một số các cation kim loại như Ca2+, Na+ sẽ làm tăng hoạt tính của lipase. Hoạt tính của lipase bị bất hoạt bởi Co2+, Ni2+, Hg2+ và Sn2+, bị kìm hãm nhẹ bởi Zn2+ và EDTA: Đối với Bacillus sp • Mg2+ làm tăng hoạt tính enzyme.

• Ca2+ tăng tiết enzyme ngoại bào, tăng hoạt tính enzyme. Đối với Geotrichum sp: • Ca2+ 1mM có tác dụng làm tăng 6% hoạt tính enzyme.

• Hoạt tính lipase mất gần hết với Pb2+ 10mM. • Tween 20 làm tăng 10% hoạt tính lipase.

• Chất tẩy rửa SDS kiềm hãm lipase hoàn toàn.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

Lipase chiết xuất từ tụy tạng bị mất hoạt tính ở 400C, nhưng một số lipase ở vi sinh vật lại có tính bền nhiệt.

5

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

N

c. Cơ chế xúc tác Hoạt tính đạt cực đại khi nó được phân tán vào giữa bề mặt phân pha dầu-nước => quá trình hoạt hóa phân pha.

Lipase xúc tác cho nhiều phản ứng khác nhau bao gồm: phản ứng thủy phân, phản ứng tổng hợp ester, phản ứng chuyển ester và phản ứng amin hóa (aminolysis) .

Các phản ứng do lipase xúc tác đều là các phản ứng thuận nghịch và chiều hướng của phản ứng phụ thuộc vào lượng nước tham gia vào phản ứng.

N

H

Ví dụ về cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân:

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

6.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

✓ Enzyme kết hợp với cơ chất hình thành phức chất hoạt động ✓ Nhóm chức hoạt động –OH của Serine tấn công vào gốc acyl của cơ chất tạo liên kết đồng hóa trị hình thành hợp chất trung gian.Giai đoạn này được hỗ trợ bởi hoạt tính xúc tác basơ của His trong bộ ba xúc tác. ✓ Tạo thành acyl enzyme và tách khỏi phản ứng oxh của liên kết ester (R1OH) ✓ Tách gốc acyl còn lại ra khỏi trung tâm hoạt động bởi nhóm chức hoạt động của His, có sự tham gia của phân tử nước và hình thành hợp chất trung gian có cấu trúc tứ diện. ✓ Giải phóng acid carboxylic (R2COOH).

D

IỄ N

Do lipase chỉ hoạt động ở bề mặt phân cách giữa hai pha dầu – nước nên lượng dầu tồn tại ở mặt phân cách sẽ quyết định hoạt tính của lipase. => đó là hoạt tính bề mặt của enzyme.

Do đó, cần áp dụng phương pháp nhũ hóa thích hợp để làm tăng diện tích tiếp xúc của các tế bào nhũ hóa.

6

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Several filamentous fungi

10 00

B

Wheat bran

Candida rugosa Candida sp.

Wheat bran Rice bran

A.niger C.rugosa

-L

Ý

-H

Ó

A

Coconut oil cake Rice bran, wheat bran

ÁN

e. Môi trường nuôi cấy tối ưu sinh tổng hợp Lipase:

TO

Môi trường nuôi cấy Cadida rugosa

D

IỄ N

Đ

ÀN

KH2PO4: 15 g; K2HPO4:5,5 g;(NH4)2SO4:4g; MgSO4:1g; FeCl3:10m g; inositon: 0,004mg; biotin: 0,008mg; Thiamine.HCl: 0,2mg; dầu oliu: 1%; axit palmitic: 1.2 g;H2O: 1000ml.

Số tế bào nấm men cấy ban đầu 2,6x10-6 cfu/ml môi trường nuôi cấy. Thời gian nuối cấy 40 giờ.

Môi trường nuôi cấy Bacillus sp

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

Organisms Neurospora sitophita, R.oligosporus

TR ẦN

Natural Substrates Peanut press cake

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

H Ư

d. Cơ chất tự nhiên

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

N

http://daykemquynhon.ucoz.com

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

N

H

Ơ

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Môi trường BMGY với thanh phần: 1% (w/v) cao nấm men, 2% (w/v) bactopeptone, 100mM kali phosphat, pH 7.0, 4x10-5% (w/v) biotin và 1% (v/v) Methanol.

7

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

II.

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Sản xuất enzyme Lipase: 1. Quy trình tổng quát thu nhận enzyme ngoại bào từ VSV: Chủng VSV

Chuyển sang môi trường đã tiệt trùng

N

Môi trường bán rắn

H

Ơ

Môi trường lỏng

Lên men(1-7 ngày;t°:25-45°C)

Y

N

Lên men(1-5 ngày;t°:25-40°C)

Đưa ra khỏi phòng ủ

chất bảo quản

Nghiền,sàng

G

Loại cặn bã

N

Enzyme thô

TR ẦN

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

Sấy khô

Enzyme đã tách chiết trong nước

B

Cô đặc chân không

Ly tâm(lọc)

Ó Ý

-H

đậm đặc

Enzyme dạng bột thô

-L ÁN TO

Nghiền,sàng

Bổ sung (NH4)2SO4

Bổ sung dung môi

Na2SO4

hữu cơ

D

IỄ N

Đ

ÀN

Enzyme dạng rắn

Enzyme lỏng

A

Enzyme lỏng

Bổ sung chất trợ tủa

10 00

Bổ sung chất bảo quản

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

Đ ẠO

Tách chiết bằng nước chứa

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

Gạn,ly tâm hoặc lọc

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U

.Q

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Thêm chất bảo quản,chất trợ lọc

Thu kết tủa Sấy khô Nghiền,sàng 8 Chế phẩm enzyme thô

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

2. Quy trình cơ bản thu nhận enzyme từ nguồn động vật,thực vật: Nghiền bằng phương pháp thích hợp

Trích ly với dung môi

Ó -H Ý -L

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

Tủa protein bằng Amonisunfat

Enzyme

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

TR ẦN

Ly tâm (4000 rpm /15 min) thu dịch trong

A

10 00

B

3. Quy trình cơ bản thu nhận enzyme lipase ngoại bào từ VSV:

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

G N

Lọc thu tủa

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

Tinh sạch enzyme theo mục đích sử dụng

Đ ẠO

TP

Enzyme

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

.Q

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

U

Kết tủa

Y

N

H

Ơ

N

Nguyên liệu động vật,thực vật

D

Lọc thu kết tủa

9

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

4. Quy trình sản xuất Lipase ngoại bào từ Cadida rugosa: Cadida rugosa

Ơ

N

Nấm sợi

Y

N

H

PDA nghiêng

Sợi nấm

U

Tiền xử lí với HCL 2%

Thẩm tích tách muối

Lọc gel

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

Tủa với sodium sulfat

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

10 00

B

Thu lipase thô

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

G

TR ẦN

dung dịch trong

N

Lọc hoặc ly tâm

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Thu bào tử nấm

Đ ẠO

Lên men

Bảo quản trong điều kiện chống ẩm

http://daykemquynhon.ucoz.com

TP

Chất nền(sấy 60°C kích thước hạt mịn

H Ư

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

Erlen 250 ml

Cô đặc,tinh sạch enzyme

Enzyme 10

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

TR ẦN

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Tuy lipase có khả năng xúc tác nhiều phản ứng có giá trị trong thực phẩm, y học, môi trường, công nghiệp da… nhưng việc ứng dụng còn hạn chế bởi chi phí cao. Có thể khắc phục với pp cố định enzyme với mục đích thu hồi và sử dụng nhiều lần, không tốn chi phí cho quá trình tách bỏ enzyme sau khi thu hồi sản phẩm. Có 3 phương pháp được sử dụng:

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

❖ PP hấp phụ vật lý: Dẫn xuất enzyme lipase từ C.antarcrica B cố định trên OctadecylSepabead giữ được 100% hoạt tính sau khi ủ 200h/50°C/pH=7. Lipase được hấp phụ trên chất mang kị nước rất ổn định với nhiệt độ và sự vô hoạt của dung môi hữu cơ. Mặc dù phương pháp này đơn giản nhưng dẫn xuất của enzyme này có tính ổn định nhiệt hơn các phương pháp khác. ❖ PP liên kết cộng hóa trị: Lipase đã được cố định thành công nhất trên các chất mang là chitosan, agarose, …làm tác nhân hoạt hóa nhóm cacboxyl của chất mang khi cố định enzme lipase từ C.Rugosa. Ưu điểm của carbodiimide là khả năng hoạt hóa cao, độc tính với enzyme thấp. ❖ PP nhốt/bao gói: Dùng các polymer dạng hạt: chitosan(hiệu suất 50%), agarose, alginate…

IV. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase

TO

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

N

H

Ơ

N

5. . Tinh sạch enzyme bằng sắc kí cột: Do nguồn thu lipase từ động vật kém bền nhiệt, lại có mùi hôi, sản xuất mất nhiều công sức và tốn kém. Hơn nữa, việc lây nhiễm virus động vật là mối lo ngại hàng đầu.

Nên việc chủ động nuôi cấy và tách chiết lipase từ VSV ngày càng chiếm ưu thế.

Người ta sử dụng sắc ký ái lực cho độ tinh sạch cao nhất, nhưng phương pháp này tốn kém, do cột đắc tiền, lại không bền. Do nguyên nhân cột hoạt động trên nguyễn tắc sự bắt cặp giữa enzyme và cơ chất, tạo nên phức hợp E-S. Nhưng bản thân cơ chất của enzyme được nhồi vào cột là protein, đó là nguyên nhân mà cơ chất dễ bị biến tính và mất khả năng kết hợp với enzyme.

Từ đó, các nhà khoa học sử dụng DNA tái tổ hợp biểu hiện trong E.coli bằng cách thiết kế gen mã hóa tổng hợp lipase gắn thêm các trình tự mã hóa 6 gốc His ở đầu C (6His lk đặc hiệu với Ni++ trên cột sắc ký ái lực). Mà việc nhồi cột Ni++ tương đối dễ dàng, cột bền, sử dụng rất lâu. Từ đó mà thành enzyme giảm, tạo điều kiện cho việc ứng dụng lipase rộng rãi hơn. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu còn dùng phương pháp gây đột biến, làm tăng khả năng biểu hiện gen, nâng cao hoạt tính lipase.

III. Phương pháp cố định enzyme lipase:

D

IỄ N

Đ

ÀN

Mức độ hoạt động (hoạt độ) của enzyme dùng để: Đánh giá mức độ mạnh hay yếu (cường độ xúc tác) của enzyme: Là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa một lượng cơ chất nhất định trong thời gian nhất định ở điều kiện tiêu chuẩn (nhiệt độ, áp suất tối ưu). Xác định hoạt độ của enzyme thông qua xác định lượng cơ chất mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trước phản ứng.

Hoạt tính enzyme lipase được xác định dựa trên lượng acid béo tự do được giải phóng. Đối với lipase, 1 đơn vị hoạt độ U là lượng enzyme cần thiết để xúc tác tạo thành 1µmol acid béo trong 1 phút ở điều kiện xác định.

11

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

1. Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lương sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định.

10 00

B

2. Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm ứng với một nồng độ enzyme nhất định.

TO

2

Ý

Thời gian

Các thông số thay đổi Biến thiên của S hay P

Nồng độ enzym Lượng cơ chất mất đi (hay lượng sản phẩm tạo thành).

Thời gian

Nồng độ [E]

ÀN Đ

Các thông số cố định

-L

ÁN

1

-H

Ó

A

3. Chọn nồng độ enzyme cần thiết như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm.

Ba nhóm phương pháp này được tóm tắt trong bảng sau : Nhóm

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TR ẦN

Về nguyên tắc có thể chia ra 3 nhóm sau:

IỄ N D

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

N

H

Ơ

N

+Đánh giá mức độ tinh khiết của enzyme. Đơn vị của hoạt độ Enzyme a. Đơn vị Enzyme quốc tế (UI) là lượng Enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa được miccromol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn.

1 UI = 1mol cơ chất/giây b. Katal (kat) là lượng Enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn.

1 Kat = 1 mol cơ chất/giây.

1 UI = 16,67 nKat (nanoKatal ➢ Nguyên tắc: Khác với trong hóa học phân tích bình thường, trong enzyme học, người ta không định lượng enzyme một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thông qua xác định độ hoạt động (còn gọi là hoạt độ) của enzyme. Trong phản ứng có enzyme xúc tác, sự hoạt động của emzyme được biểu hiện bằng cách làm thay đổi tính chất vật lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của hỗn hợp phản ứng. Theo dõi những biến đổi đó có thể biết được chính xác mức độ hoạt động của enzyme thông qua xác định cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong quá trình phản ứng.

3

Nồng độ E

Thời gian Lượng S mất đi (hay P tạo thành)

Enzym thuỷ phân chất béo có nhiệm vụ phá vỡ cấu trúc chất béo bên trong các tế bào của những cơ quan khác nhau cũng như tạo điều kiện cho sự di chuyển của lipit từ cơ quan này sang cơ 12

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

quan khác. Một khía cạnh quan trọng của hệ enzyme thuỷ phân chất béo là chúng chỉ xúc tác cho các phản ứng lý hoá tại bề mặt tiếp xúc giữa hai pha béo-nước, nhờ cơ chế hấp phụ bề mặt (kiểu xúc tác sensu stricto).

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

Có nhiều phương pháp để đo hoạt tính thuỷ phân của enzym lipase. Những phương pháp này có thể được phân loại như sau :

TR ẦN

Phương pháp chuẩn độ ( Titrimetry ) Phương pháp quang phổ ( Spectroscopy ( photometry,fluorimetry )) Phương pháp sắc ký ( Chromatography ) Phương pháp phóng xạ ( Radioactivity ) Phương pháp sức căng bề mặt ( Interfacial tensionmetry ) Phương pháp đục kế ( Turbidimetry ) Phương pháp đo độ dẫn điện ( Conductimetry ) Phương pháp hoá học miễn dịch ( Immuno-chemistry ) 9) Phương pháp hiển vi ( microscopy )

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8)

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

G

Các enzym Lipase đã được định nghĩa bằng những thuật ngữ động học, được dựa trên hiện tượng “ hoạt động bề mặt giữa các pha “, nghĩa là sự gia tăng hoạt tính xuất hiện khi một phần cơ chất tan trong nước trở thành cơ chất không tan trong nước.

ÁN

-L

Những phương pháp thường sử dụng nhất được dựa vào sự chuẩn độ những axit béo tự do được giải phóng trong suốt thời gian thuỷ phân. Tuy nhiên, những phương pháp này yêu cầu có sự chuẩn bị của những hệ nhũ tương bền của những cơ chất và sự điều khiển pH trong thời gian thuỷ phân. Phương pháp đồng vị phóng xạ có độ nhạy lớn hơn, nhưng yêu cầu các cơ chất phải được đánh dấu. Phương pháp so màu (colorimetric) dựa trên sự thuỷ phân những ester của pnitrophenol hoặc thioesters có sẵn. Các cơ chất huỳnh quang đã được sử dụng để phân tích Protease, phosphatase, glycosidase, sulfatase và những hoạt tính của enzym lipase. Chẳng hạn như, rhodamine 6G thì hữu ích để đo hoạt tính của những enzym lipase và những ester của C6NBD{ [(7-nitro-2,1,3-benzoxandiazol-4-yl)amino]-caproyl } thì thích hợp để đo hoạt tính của những enzym phospholipase.Một dẫn xuất coumarin (C9H8O2 : anhydrit của axit ocumarin,lacton kết tinh màu trắng, độc tìm thấy ở nhiều loại cây và chế tạo tổng hợp, được dùng trong sản xuất nước hoa và xà phòng, còn gọi là 1,2-benzopyrone) cũng đã được sử dụng để phân tích hoạt tính lipase.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

N

H

Ơ

N

Hầu hết enzym Lipase là enzyme hoà tan được trong nước hoạt động trên những cơ chất không tan trong nước. Đặc tính phức tạp của loại xúc tác này làm cho nó khó định lượng đươc chính xác cả về tỷ suất bề mặt cũng như những tham số tại bề mặt giao tiếp giữa hai pha (như lực căng bề mặt, tính nhớt bề mặt, điện thế bề mặt) và liên quan với chất lượng bề mặt của cơ chất mà quá trình phân ly chất béo phải phụ thuộc. Sự nhũ hoá giữa nước và các chất không tan trong nước sẽ cần đến sự tồn tại của các chất hoạt động bề mặt như: các chất tẩy rửa, các chất béo khác nhau, protein… ngay tại bề mặt giao tiếp giữa hai pha, vì vậy có thể ảnh hưởng một cách mạnh mẽ đến phương pháp đo hoạt tính của enzym Lipase mà sự kìm hãm không đặc hiệu của Lipase do sự xuất hiện của Protein tại bề mặt tiếp xúc của hai pha dầu-nước là một ví dụ điển hình.

13

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Khi xác định hoạt độ enzyme cần chú ý một số điểm sau: • Nồng độ cơ chất trong phản ứng phải ở trong một giới hạn thích hợp đủ thừa để bão hoà enzym nhưng không quá cao để đến mức kìm hãm enzyme.

• Với những enzim cần có chất hoạt hoá hoặc chất làm bền thì phải cho các chất này vào enzyme trước khi 14hoc ơ chất vào hỗn hợp phản ứng.

N

H

Ơ

N

• Xác định hoạt độ cần tiến hành ở pH thích hợp và cố định. Nhưng cần phải chú ý là pH thích hợp có thể thay đổi khá nhiều tùy thuộc vào cơ chất và thành phần dung dịch đệm, lực iôn của dung dịch đệm ( thường trong phạm vi từ 0,01 – 0,1 )

D

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Đ ẠO

G

N

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

• Thời gian xác định hoạt độ thường từ 5 đến 30 phút. Trong một số trường hợp có thể kéo dài 24 giờ nếu hoạt độ của enzyme quá thấp. Trong trường hợp đó cần phải cho thêm vào dung dịch các chất diệt vi sinh vật và tránh dùng những dung dịch đệm thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật. Đối với cơ chất dạng lỏng Ví dụ đã nhũ hóa bị phản ứng thủy phân do xúc tác của lipase tạo thành các acid béo (ở điều kiện pH, nhiệt độ, thời gian cụ thể cho các thử nghiệm xác định yếu tố cụ thể được đo trực tiếp) sau khi bất hoạt enzyme với ethanol 99,5° bằng phương pháp chuẩn độ acid-bazơ, sử dụng NaOH 0,1 N; chất chỉ thị là phenolphthalein 0,1%. Khi đó, hoạt tính (HT) và hoạt tính riêng (HTR) của lipase được tính theo công thức: HT = [(a-b)*1000*0,1] (U/mL) Trong đó: a: VNaOH 0,1 N chuẩn độ ở mẫu có enzyme (mL); b: VNaOH 0,1 N chuẩn độ ở mẫu trắng (mL).

HTR = ∑ ĐVHT/P Trong đó: ∑ ĐVHT: Tổng số đợn vi hoạt tính enzyme/g; P: Hàm lượng protein (mg/g). Đối với cơ chất dạng khô Hoạt tính xúc tác của Lipase là số đơn vị hoạt độ có trong 1g chất khô môi trường nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme. Môi trường sử dụng là bã dậu nành đã sấy khô, nên công thức hoạt tính Lipase được biểu diễn như sau: Hoạt tính Lpase ( IU/g) = (∆V * N * 1000 * v1)/(v2 * t *m) Trong đó: ∆V : hiệu số mL dung dịch NaOH chuẩn độ mãu so với mẫu trắng.

N: nồng độ đương lượng dung dịch NaOH 0.1N trong chuẩn độ.

1000: Hệ số quy đổi đơn vị. v1: số mL nước cất dùng để trích ly mẫu canh trường rắn. v2: số mL dịch enzyme thô đem phản ứng. t: thời gian phản ứng tính bằng phút.

M: số gram môi trường bả đậu nành đem nuôi cấy.

Enzyme Lipase bên trong bộ máy tiêu hoá đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong những chu trình cung cấp dinh dưỡng cho cơ thể con người và những động vật bậc cao. Lipase hiện nay được sử

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

• Nhiệt độ dùng để xác định hoạt độ phải thấp hơn nhiệt độ tối ưu của enzyme để đề phòng tác dụng kìm hãm enzyme do nhiệt độ cao

14

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

dụng rộng rãi như những chất xúc tác chọn lọc trong môi trường có nước ( hoặc ít nước ) và nhiều phân tử tổng hợp mà có thể được sử dụng như những cơ chất của Lipase. Trong quá trình này, chúng ta chỉ đề cập đến sự phân tích Lipase kéo theo sự thuỷ phân ester Carboxylic.

Y

FFA

TP

TAG = triacylglycerols

MAG = monoglycerols

a) Trong môi trường rắn :

G N H Ư

1. Các phương pháp hoá lý : 1.1. Sự biến mất của cơ chất : 1.1.1. Phương pháp đo độ đục :

TR ẦN

http://daykemquynhon.ucoz.com

FFA = free fatty acids.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

Đ ẠO

DAG = diacylglycerols

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

Phương pháp này sử dụng các chất chỉ thị màu trên đĩa thạch với các ester carboxylic được dùng làm cơ chất , bản chất là xác định đường kính của vùng khuyếch tán sản phẩm. Sự phân giải chất béo sẽ làm lan rộng vùng sáng màu trên đĩa thạch. Hiện tượng quang học này chỉ quan sát được khi các acid béo được giải phóng ra hoà tan một phần vào nước. Quá trình sáng màu này là kết quả của sự giảm kích thước của các hạt nhũ bị thuỷ phân có tác dụng làm giảm ánh sáng khuyếch tán.

-L

b) Trong môi trường lỏng:

TO

ÁN

Kỹ thuật này cũng có thể được áp dụng trong quá trình theo dõi sự thuỷ phân của Twees do các enzyme Lipase khác nhau xúc tác.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

FFA

Glycerol

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

FFA

MAG

U

DAG

.Q

TAG

N

H

Phản ứng thuỷ phân triacylglycerol được xúc tác bởi enzym Lipase có thể được viết :

Ơ

N

Những phản ứng này thường được thực hiện dưới điều kiện hoạt độ của nước thấp. Hơn nữa, người đọc được tham chiếu tới những điều lệ phổ biến mà liên quan đến enzyme Lipase trong phép phân tích lập thể chọn lọc.

D

IỄ N

Đ

ÀN

Phương pháp này theo dõi sự giảm độ hấp thụ của nhũ TAG theo thời gian. Kỹ thuật này rất nhạy với những hệ nhũ, nhưng đối với các hệ nhũ tự nhiên ví dụ như huyết tương chẳng hạn, thì sự có mặt của nhiều yếu tố khác có thể ảnh hưởng đến quá trình. Thêm vào đó, kết quả không hoàn toàn tuyệt đối là những giá trị hoạt động của enzym Lipase và thu được dữ liệu đáng tin cậy. Vì vậy, enzym Lipase thuần khiết được sử dụng để xây dựng một đường chuẩn. Bước chuẩn hoá này đã hạn chế sự khuyếch tán rộng của phương pháp nhạy cảm này.

Pháp phân tích esterase bằng phương pháp đo độ đục đã được phát triển, sử dụng một dung dịch Tween 20 với sự hiện diện của CaCl2, và sử dụng esterase từ Lysobacter enzymogenes 15

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

làm nguồn enzyme. Phản ứng được theo dõi bằng việc đo sự gia tăng mật độ quang ở bước sóng 500nm vì quá trình thuỷ phân giải phóng ra các acid béo từ Tween 20 và sự kết tủa của chúng dưới dạng muối Canxi.

N

Phương pháp phân tích đo độ đục này đã được sử dụng để xác định hoạt tính riêng của enzyme Lipase từ chủng Chromobacterium ( với liều lượng là 87 IU.mg-1) và chủng Candida cylindracea ( với liều lượng là 0.5 IU.mg-1).

N

H

Ơ

2. Phương pháp đĩa Wilhelmy: 2.1. Cơ chất là những màng film đơn phân tử thuần khiết:

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

Trong số các phương pháp xác định sức căng bề mặt thì kĩ thuật màng film đơn phân tử tại bề mặt tiếp xúc của không khí -nước đã được phát triển rộng và được nhóm nghiên cứu của Fréderic Beisson, Claude Rivìere cũng như nhóm của Brockman sử dụng. Kỹ thuật này về cơ bản gồm một lớp Teflon (lớp chống dính ) phủ trên máng, mà trên đó là một dung dịch. Một bản mỏng Pt nhúng trong bề mặt của pha nước được gắn liền với một electromicrobalance để đo áp suất bề mặt mà nó trực tiếp liên quan đến sức căng bề mặt.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

Một màng film đơn phân tử của chất béo có thể được phân bố tại bề mặt của pha nước, sử dung dung môi dễ bay hơi như chloroform để hoà tan chất béo. Dung dịch chất béo được áp dụng ở dạng những giọt nhỏ mà chúng có khả năng bay hơi được. Vùng bị chiếm giữ bởi lớp chất béo có thể là hàng rào được điều chỉnh bởi một lớp Teflon quét trên bề mặt của pha nước. Áp suất bề mặt có thể được duy trì bề mặt có thể được duy trì không đổi tự động bằng cách sử dụng sự thuyên chuyển của Teflon mà được kiểm soát và điều chỉnh phụ thuộc vào đầu ra của electromicrobalance.

Dung dịch chứa enzyme Lipase được tiêm vào bên dưới màng film chất béo, áp suất bề mặt sẽ giảm vì sự hoà tan của những sản phẩm phản ứng thuỷ phân chất béo. Khi lớp màng chắn này di chuyển có tác dụng duy trì hằng số áp suất bề mặt, động học của phản ứng có thể được theo dõi bằng cách ghi lại sự chuyểng động của lớp màng chắn này theo thời gian.

16

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Với kỹ thuật này, ta có thể đo và điều khiển những tham số bề mặt quan trọng như áp suất bề mặt ( năng lượng tự do của bề mặt tiếp xúc giữa các pha) và vùng phân tử của cơ chất. Phương pháp màng film đơn phân tử thích hợp để nghiên cứu những phản ứng enzym trên chất béo mà được phân bố tại bề nặt tiếp xúc không khí-nước.

Ơ

N

Phương pháp này có độ nhạy cao, và lương chất béo thấp đáp ứng yêu cầu để thực hiện những phép đo động học đáng tin cậy.

N

H

2.2. Màng film đơn phân tử được trộn lẫn với cơ chất:

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

TR ẦN

H Ư

Một ứng dụng mới của máng “ Zero-order ” được đề xướng bởi Píeroni và Verger [70] cho việc nghiên cứu sự thuỷ phân của lớp đơn phân tử hỗn hợp ở mật độ bề mặt không thay đổi và thành phần chất béo cố định như sơ đồ biểu diễn trong hình Fig 1A.

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

Màng chắn bằng teflon được đặt ngang qua kênh nhỏ của máng “ Zero-order “ để ngăn truyền thông bề mặt giữa màng chứa ( reservoir ) và bộ phận phản ứng (reaction compartment). Áp suất bề mặt được xác định rõ đầu tiên bằng cách đặt bản Pt vào trong bộ phận phản ứng , nơi mà hỗn hợp film được phân bố ở áp suất yêu cầu. Áp suất bề mặt được đo sau khi chuyển bản Pt tới màng chứa, nơi mà film cơ chất thuần khiết được phân bố tiếp sau.Áp suất bề mặt của màng chứa bằng với áp suất bề mặt của bộ phận phản ứng bằng việc di chuyển lớp màng chắn di động.

Màng chắn giữa 2 bộ phận được chuyển dịch cho phép những bề mặt tiếp xúc với nhau và enzyme được tiêm vào trong bộ phận phản ứng.

-L

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

Hầu hết những nghiên cứu động học về hoạt động của enzym thuỷ phân chất béo đã được thực hiện invitro, dùng những chất béo thuần khiết làm cơ chất. Thực tế, tất cả các mặt phân cách của sinh vật đều là sự pha trộn phức tạp của hỗn hợp gồm lipit và Protein. Kỹ thuật đơn lớp lý tưởng thích hợp cho việc nghiên cứu kiểu hoạt động của hệ enzym thuỷ phân chất béo tại mặt phân cách, sử dụng hỗn hợp chất béo đã được điều chỉnh. Có 2 phương pháp từ hỗn hợp chất béo tạo màng đơn lớp tại bề mặt phân pha khí-nước, hoặc bằng cách phân bố hỗn hợp chất béo không tan trong nước vào một dung môi hữu cơ dễ bay hơi, hoặc tiêm một dung dịch nhũ tương của chất tẩy rửa vào trong pha nước,được bao phủ bởi lớp đơn chất béo không tan.

ÁN

2.3. Liên kết bề mặt và sự phục hồi lớp:

ÀN

TO

Bằng cách sử dụng kỹ thuật lớp đơn phân tử, nhiều nhà nghiên cứu đã báo cáo rằng giá trị tối ưu xảy ra ở mối tương quan giữa vận tốc và áp suất bề mặt. Giá trị chính xác của điểm tối ưu biến đổi tuỳ theo sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất được sử dụng.

D

IỄ N

Đ

Một cách giải thích hợp lý đã được đưa ra để giải thích hiện tượng này là: • Sự định hướng phụ thuộc màng bao của cơ chất có lẽ là một trong những nhân tố điều hoà mà quá trình phân giải chất béo phụ thuộc. Sử dụng những enzyme đã được đánh dấu phóng xạ, Verger và Pattus đã thiết lập rằng giá trị cực đại được quan sát của sự tương quan giữa vận tốc và áp suất bề mặt sẽ biến mất tương quan với sự gia tăng tính hoạt động bề mặt của enzyme.

17

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

N

H

Ơ

N

Sự khác biệt chính giữa lớp đơn và khối lớn (bulk system) nằm ở khu vực bề mặt giao tiếp và tỉ lệ thể tích, chúng khác nhau bởi nhiều trật tự sắp xếp ở hệ thống đơn lớp, tỉ lệ này thường là 1 cm-1, phụ thuộc vào độ sâu của cái máng. Trong khi đó, ở khối lớn tỉ lệ này có thể cao khoảng 10-5 cm-1, phụ thuộc vào lượng lipit sử dụng và trạng thái của sự phân giải lipit. Kết quả là ở trường hợp của khối lớn sự hấp phụ hầu hết các enzyme xuất hiện tại bề mặt giao tiếp, trong khi ở lớp đơn chỉ có 1 phân tử enzyme trong hàng trăm các enzyme có thể xuất hiện tại bề mặt giao tiếp. Vì ở tình trạng này, một lượng nhỏ không xác định ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ thuỷ phân được hấp phụ trên lớp đơn.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

G

Đ ẠO

TP

Sau khi đo tốc độ, Momsen và Brockman [77] đã chuyển lớp đơn đến 1 mẩu giấy kỵ nước và những enzyme được hấp phụ sau đó được phân tích bằng phương pháp chuẩn độ. Sau khi so sánh với tốc độ của mẫu trắng và pha mang ( subphase ), số lượng của những enzyme được hấp phụ sẽ được tính toán từ vận tốc của mạng lưới và hoạt động của những enzyme đặc hiệu.

N

Trong bảng phân tích những enzyme hoạt động phóng xạ, màng film được hút ra bằng cách lồng những đáy của ống mao quản thuỷ tinh cong vào trong chất lỏng và nổi lên trên đỉnh của một phần thành Teflon. Khi những phân tử enzyme được đánh dấu phóng xạ tan trong pha mang sẽ bị hút ra cùng với những thành phần đi kèm với màng film. Kết quả sẽ được kiểm tra dựa trên sự hoạt động phóng xạ trong cùng một thể tích của pha mang được hút ra. Sự khác biệt giữa 2 giá trị thực sự đã phản ánh được hoạt động phóng xạ vượt mức tồn tại ở bề mặt tiếp xúc, được quy cho phân tử enzyme có liên kết với màng film. Bởi vì có thể sử dụng kỹ thuật lớp đơn để đo tốc độ phản ứng được thể hiện bằng đơn vị mol.cm-2.min-1 và sự vượt mức của enzym ở bề mặt bằng đơn vị mg.cm-2. Ta dễ dàng đạt được giá trị hoạt động đặc hiệu của enzyme thường được đo bằng đơn vị là mol.min-1.mg-1( IU.mg-1).

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

Ý

 Bằng cách kết hợp đồng thời 2 kĩ thuật ELISA và kĩ thuật lớp đơn phân tử, ta có thể đo được hoạt tính của enzyme Lipase trong đường ruột của người ( HGL-Human gastric lipase). Trên lớp màng 1,2 didecanoyl-sn-glycerol (lớp dicaprin) và cũng có thể xác định được sự vượt mức của enzyme bề mặt tương ứng. Một lượng HGL luân chuyển sẽ gia tăng một cách ổn định với màng bao lipit. Những hoạt tính đặc hiệu được xác định trên lớp dicaprin tại 35mN.m-1 đã được tìm thấy ở cùng một mức độ giá trị khi được đo dưới điều kiện phân tích khối lớn tối ưu, sử dụng cơ chất là chất nhũ hoá tributyrin (liều lượng là 1000IU cho 1mg enzym). Tại một nồng độ lipase cho trước trong pha mang nước, sự liên kết bề mặt của các HGL với lớp màng phosphatidylcholine ưa béo của lòng đỏ trứng đã được nhận ra rằng chậm hơn 10 lần so với trường hợp của lớp màng dicaprin.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

Để khắc phục sự giới hạn này thì nhiều phương pháp đã được đề ra để phục hồi và đo lượng enzyme đã được hấp phụ tại bề mặt giao tiếp.

2.4. Phương pháp hiển vi lực nguyên tử (Atomic force microscopy): Để theo dõi động học của sự thuỷ phân của màng phospholipids kép bằng phospholipase A2, Nielsen đã làm một thí nghiệm sử dụng phương pháp hiển vi lực nguyên tử (AFM) trong môi trường chất lỏng. Theo những nghiên cứu này thì sự thuỷ phân enzym của màng 18

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

acylglycerols/phospholipids kép bằng enzyme Humicola lanuginosa lipase (HLL) cũng đã được nghiên cứu bằng phương pháp AFM.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

2.5. Quang phổ học hồng ngoại:

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

Kết quả được sử dụng để làm mẫu cho động học của phản ứng enzyme tại bề mặt tiếp xúc giữa 2 pha béo-nước. Dữ liệu này cung cấp hình ảnh đầu tiên ở tầm Nano của động học quá trình phân giải lipit.

10 00

B

TR ẦN

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

G

Một phân tích liên tục để đo sự thủy phân của những TAG do Lipase xúc tác micell đảo ngược sử dụng Fourier thay đổi quang phổ học hồng ngoại (FTIR – Fourier transform infrared spectroscopy), được phát triển bởi Walde và Luisi [80]. Sự phân hủy chất béo có thể được theo dõi bằng việc ghi lại phổ FTIR của toàn bộ hỗn hợp phản ứng. Số lượng những ester axit béo và FFAs ( mà cực đại đỉnh tương ứng tại 1751cm-1 và tại 1715 cm-1 ) có thể dựa trên cơ sở của những hệ số tắt và định luật của Beer. Phương pháp này được ứng dụng để đo sự phân hủy chất béo của những cơ chất khác nhau ( như trioctanoyglycerol, các loại dầu thực vật ).

-H

Ó

A

3. Sự xuất hiện những sản phẩm của phản ứng thủy phân: 3.1. Sự giải phóng Proton như một phép phân tích gián tiếp: 3.1.1. Những chất chỉ thị màu:

Ý

a) Trong môi trường rắn: Khi dung dịch lipase được đặt trên một đĩa agar chứa ester carboxylic như một cơ chất, có thể theo dõi độ pH bằng việc quan sát sự thay đổi màu của những chất chỉ thị (do những axit béo được giải phóng trong phản ứng thủy phân gây ra) mà trước đó đã được kết hợp cùng với những cơ chất trong gel agar.Ở đây tồn tại một mối quan hệ tuyến tính giữa đường kính của đốm ( vị trí ) khuyếch tán axit béo và logarit của vùng phân bố enzym. Kỹ thuật này rất tiện lợi trong việc sàng lọc nhanh chóng những vi sinh vật phân hủy lipid phát triển trên những đĩa agar. Tuy nhiên một vài sai sót có thể là kết quả từ quá trình axit hóa của môi trường, vì sự phát sinh của những chất chuyển hóa axit khác với FFAs mà được giải phóng bởi những vi khuẩn lipase.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

U

Y

N

H

Ơ

N

Màng lipit kép củng cố bởi Mica bị thuỷ phân bởi HLL và vì sản phẩm hoà tan trong dung dịch đệm, các khu vực bị khoét sâu của màng kép sẽ bị phát hiện ra bởi đỉnh AFM. Chúng ta sẽ có được những hình ảnh thời gian thực của sự thuỷ phân xuất hiện ở lớp màng kép và sẽ phân tích chúng bằng phần mềm đã được thiết lập sẵn. Những hình ảnh này sẽ chỉ ra được sự xuất hiện của vết lõm tại bề mặt ở mức xấp xỉ 10-9 một cách gia tăng dần. Thêm vào đó, sự gia tăng diện tích của lỗ hổng ở lớp màng kép lipit mà được ghi nhận như là chức năng thời gian và hoạt tính đặc hiệu của enzyme sẽ được đánh giá với điều kiện một phân tử lipase sẽ hoạt động trong 1 lỗ.

b) Trong môi trường chất lỏng: mặc dù đây là một phương pháp định tính, kỹ thuật này cung cấp một phương tiện đơn giản để phát hiện hoạt tính của lipase trong những phần nhỏ cột ghi sắc kí tại những giai đoạn làm sạch lipase khác nhau bằng việc quan sát những thay đổi màu sắc của những chất chỉ thị màu được trộn đều với những cơ chất ester.

19

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

Một phương pháp định tính đơn giản hơn mà dựa vào sự phát hiện những đặc trưng mạnh mẽ về mùi của axit butyric và axit caproic, chúng có mùi của những giọt sữa đã bị thủy phân mà được dùng như một cơ chất lipase.

3.1.2. Phép chuẩn độ:

Ơ

N

Phương pháp pH-stat. Đây là một kỹ thuật tiện lợi để mô tả đặc điểm và sự đặc biệt của Lipase cũng như hiện tượng kích hoạt bề mặt tiếp xúc giữa các pha.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

G

Đ ẠO

Phương pháp pH-stat được dùng để phát hiện ra hoạt tính của lipase trong dịch mô đồng thể thực vật, có mặt của deoxycholate,sử dụng triolein được nhũ hóa với keo arabic như cơ chất. Kỹ thuật pH-stat đã được dùng để xác định những hoạt tính Lipase trong huyết thanh, plasma và dịch tá tràng.

TR ẦN

H Ư

Phương pháp pH-stat là một phương pháp định lượng cho kết quả khá chính xác (nhạy) trong giới hạn 1mol axit béo được giải phóng trong 1 phút. Khi sử dụng NaOH 0.1M làm chất chuẩn độ thì phương pháp này không đáng tin cậy trong việc nhận biết được mức độ hoạt động nhỏ hơn 0.1 mol/phút.

10 00

B

Nhược điểm:

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

Ngoài tính nhạy thấp của nó, nhược điểm của phương pháp pH-stat là vùng phân bố hẹp của những giá trị pH mà có thể được nghiên cứu tìm hiểu. Đặc biệt hơn, sự phát hiện những Proton được giải phóng trong suốt thời gian phản ứng thủy phân mà được xúc tác bởi những enzyme Lipase thì cần có quá trình ion hóa một phần những axit béo được giải phóng. Bởi vậy, những giá trị pH của điểm cuối của môi trường phản ứng phải gần bằng nhau, hoặc cao hơn, thích hợp hơn giá trị pKa hiển thị của axit béo được giải phóng. Hơn nữa, nên chú ý rằng: khả năng ion hóa cũng như sự có mặt của những ion Canxi sẽ làm giảm đáng kể sự chính xác của những giá trị pKa hiển thị. Sự có mặt của những ion Ca2+ có ảnh hưởng tích cực đến hiệu quả ion hoá của những axit béo mạch dài. Hiện tượng kết tủa vi mô này điều khiển cân bằng hóa học bằng định luật hoạt động khối lượng.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

N

H

Với phương pháp pH-stat, hoạt động của Lipase được đo trên một máy khuấy trộn hệ nhũ tương của những TAGs tự nhiên hay chất tổng hợp bằng việc trung hòa FFAs được giải phóng theo thời gian bởi sự thêm vào chất chuẩn độ NaOH để duy trì độ pH tại một giá trị điểm cuối không đổi.

Thiết bị pH-stat có sẵn đã được sản xuất thương mại như bức xạ kế (Copenhagen,Denmark ) hoặc Metrohm Ltd (Herisau, Switzerland ).

20

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

V. Ứng dụng 1. Ứng dụng của Lipase trong công nghiệp

Loại các vết bẩn dầu từ vải

Tăng cường các chất mùi thơm trong sữa, phomat và bơ.

Thực phẩm sữa

Thủy phân chất béo của sữa, làm chín phomat, biến đổi chất béo của bơ.

Các loại bánh

Cải thiện mùi thơm

Kéo dài thời gian sử dụng

Nước giải khát

Cải tiến mùi hương

Các loại nước giải khát

Bao bì thực phẩm Thực phẩm chức năng

Cải tiến chất lượng

Mayonnaise, các loại bao bì và các loại chỉ khâu

Chuyển đổi sự ester hóa

Thực phẩm chức năng

H

N

Y

U

Chuyển đổi sự ester hóa, thủy phân

Ó

Các lipid đặc trưng, các chất trợ tiêu hóa

Tổng hợp

Chất nhũ tương hóa, chất tạo ẩm

Thủy phân

Các sản phẩm da

TO

A

Các khối kết tinh, hóa chất

Giấy

Thủy phân

Cải thiện chất lượng giấy

Chất làm trắng

Thủy phân

Loại bỏ chất béo

D

IỄ N

Đ

ÀN

Da

ÁN

Mỹ phẩm

-L

Ý

-H

Dược phẩm

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

Bơ cocoa, margarine, các acid béo, glycerol, các glyceride đơn, đôi

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

B

10 00

Chọn lọc đối kháng, tổng hợp

Hóa chất

Các sản phẩm thịt và cá, loại bỏ chất béo

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TR ẦN

Chuyển đổi sự ester hóa, thủy phân

Các chất béo và dầu

.Q

TP

Đ ẠO

G

N H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

Tăng cường hương vị

Thịt và cá

Ơ

Thủy phân chất béo

Chất tẩy

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sản phẩm/ứng dụng

N

Hoạt tính

Công nghiệp

21

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

D

IỄ N

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

Đ

ÀN

TO

ÁN

3. Ứng dụng lipase trong công nghiệp thuộc da, dệt, giấy Quá trình thuộc da là quá trình khá phức tạp gồm loại bỏ chất béo, rủ lông và làm mềm. Quá trình thuộc da thường sử dụng môi trường kiềm nên sử dụng các vi khuẩn kiềm sẽ đem lại hiệu quả cao. Dòng bacillus sp. có thể phát triển trong môi trường kiềm sinh tổng hợp lipase kiềm, vì thế chúng rất thích hợp cho quá trình thuộc da (Haalck và cs, 1992; Wang và cs, 1995).

Lợi thế của việc dùng lipase là màu sắc được giữ nguyên và sạch. Lipase cũng cải thiện tính không thấm nước của da và da không bị vết hoan ố như sử dụng dung môi và chất hoạt động bề mặt.

Trong công nghiệp giấy, sáp và triglyceride gây trở ngại cho sản xuất nên loại bỏ các chất này là điều cần thiết (Bajpai 1999). Công ty giấy công nghiệp Nippon (Nhật Bản) đã dùng lipase từ nấm Canada rugosa để loại 90% các chất này có trong gỗ.

Một số sản phẩm lipase được thương mại hóa dùng cho công nghệ thuộc da: Greasex®, NovoCor® ADL, dệt: Novozyme® 375, giấy: Resinase®.

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

N

H

Ơ

2. Ứng dụng lipase trong công nghiệp tẩy rửa Ứng dụng thương mại quan trọng của lipase là làm phụ gia trong công nghiệp chất tẩy rửa và bột giặt gia đình. Để tăng khả năng tẩy rửa, các chất tẩy hiện đại đều chứa một hoặc nhiều loại enzyme như protease, amylase, cellulose và lipase.

Việc loại bỏ dầu mỡ bằng lipase có triển vọng rất lớn trong công nghiệp chất tẩy rửa. Trong điều kiên bình thường của quá trình giặt tẩy, lipase hoạt động khá tốt. Lipase bổ sung vào chất tẩy rửa phải có đặc tính: chịu nhiệt, chịu kiềm (pH khoảng 7.5 đến 11) và chịu các tác động của các chất cấu tạo nên chất tẩy rửa (Jäeger và cs, 1994). Lipase kiềm chịu nhiêt đã được dùng trong công nghiệp tẩy rửa để loại bỏ các vết triglyceride từ người và các loại thức ăn, trước kia, việc loại bỏ các chất này trong điều kiện giặt ủi bình thường rất khó khăn.

Năm 1988, Lipase được cho vào chất tẩy rửa dưới tên thương mại là lipolase 100T thu từ Humicola lanuginose được sản xuất bởi Novo Nordisk Bioindustry (Jäeger và cs, 1994).

Lipase từ các chủng vi khuẩn P.medocina và Pseudomonas alcaligenes đã đươc sản xuất và bổ sung vào chất tầy rửa ở công ty Genecor international USA (Jäeger và cs, 1994; Reetz và Jäeger, 1998).

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

22

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

D

IỄ N

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

G

Đ ẠO

5. Ứng dụng lipase trong hóa sinh dược và y tế Lipase được sử dụng để xúc tác ester hóa tinh bột sắn làm chất mang dược chất và làm vật liệu trong điều trị gãy xương (Rajan và cs, 2008).

Lipase là một chất hoạt hóa yếu tố phá hủy tế bào ung thư, vì vậy có thể sử dụng trong điều trị ung thư. Lipase Candida rugosa đang được dùng để tổng hợp thuốc hạ cholesteron huyết thanh (Hasan và cs, 2006). Lipase còn được sử dụng là chất kích hoạt nhân tố hoại tử khối u và được dùng trong một số liệu pháp chữa trị các khối u ác tính.

Lipase có thể được cố định trên điện cực pH/oxygen kết hơp với glucose oxidase và có chức năng như là một lipid biosensor được dùng trong xác định cholesteron máu (Hasan và cs, 2006).

Lipase được sử dụng khá sớm trong các liệu pháp chữa trị chứng khó tiêu, đầy hơi, dị ứng bởi thức ăn,.... lipase từ thực vật được dùng để bào chết các loại thuốc hỗ trợ tiêu hóa như Similase, Vitaline Herbal Formulas được sản xuất bởi Health Care Professionals, Oregon, Hoa Kỳ.

Một số sản phẩm enzyme được thương mại hóa dùng xúc tác phản ứng sinh học: Novozyme® 388, Novozyme® 435, Novozyme® 525 F. 6. Ứng dụng lipase trong mỹ phẩm và công nghiệp nước hoa Monoacylglycerol và diacylglycerol là chất được tổng hợp bởi quá trình ester hóa glycerol bằng lipase, chúng là chất hoạt động bề mặt hiệu quả được ứng dụng trong mỹ phẩm (Pandey và cs, 1999; Kirk và cs, 2002). Việc tổng hợp monoacylglycerol bằng enzyme monoacylglycerol lipase lấy từ vi khuẩn Pseudomonas sp.

Izumi và cs (1997) đã chỉ ra rằng sự chuyển vị trong quá trình ester hóa 3,7dimethyl-4,7-octadien-1-ol bằng lipase từ nhiều chủng vi sinh vật khác nhau là nguồn hương hoa hồng nhân tạo rẻ tiền và hiệu quả cho công nghiệp nước hoa.

Ester của acid béo và các đường (lauryl manose) là những chất hoạt đông bề mặt được sử dụng để nhũ hóa trong thực phẩm, mỹ phẩm và công nghiệp dược (Wenbin và cs, 2009).

Lipase hỗ trợ quá trình tổng hợp hương liệu đã được nghiên cứu đặc biệt là (-) menthol.

7. Ứng dụng lipase trong sản xuất biodiesel Lipase cố định từ Pseudomonascepacia dùng trong phản ứng chuyển ester hóa giữa dầu nành với ethanol và methanol tạo ra alkyl ester (biodiesel).Lipase thương mại

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

N

H

Ơ

4. Ứng dụng lipase trong công nghiệp hóa chất Chất trung gian trong tổng hợp chất trị liệu, hóa nông và hương liệu thường dùng là các chiral. Các chất này khó tổng hợp bằng phương pháp hóa học. chỉ 1 trong 2 đồng phân của thuốc có dược tính, việc tổng hợp đồng phân thuần khiết là bước quan trọng trong công nghiệp dược.

Có 2 loại biến đổi sinh học có chọn lọc đồng phân chất hữu cơ được xúc tác bởi lipase: phản ứng các cơ chất tiền chiral và động học tan của các racemate (Kazlauskas và cs, 1998). Theo truyền thống, các chất tiền chiral hoặc chiral alcohol và ester của acid carboxylic được coi là 2 loại chất cơ bản nhưng nhiều năm qua phạm vi của các chất nhanh chóng được mở rộng sang cả các diol, các acid α và β, hydroxyl, cyanohydrin, chlorohydrin, diester, lactone, amine, diamine, amino-alcohol và dẫn xuất của α và β acid amine (Kazlauskas và cs, 1998). Loại lipase xúc tác cho các phản ứng này thu nhận từ vi khuẩn P.aeruginosa, P.flourescens và các loài Pseudomonas khác, B.cepacia, C.viscosum, B.subtillis (Chunyuan và cs, 2008), Achromobacter sp., Alcaligenes sp.và serratia marcescens.

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

23

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

H

Ơ

N

Novozyme 435 cũng dùng xúc tác phản ứng chuyển ester hóa của dầu nành để sản xuất biodiesel trong môi trường không dung môi.

8. Ứng dụng lipase trong biosensor (cảm biến sinh học) Môt lĩnh vực mới đầy tiềm năng trong ứng dụng của lipase vi sinh vật là biosensor.

Người ta sử dụng mẫu dò là enzyme được đánh dấu để tránh tình trạng không ổn định và các chất đồng vị nguy hiểm khi sử dụng mẫu dò là DNA được đánh dấu.

Phương pháp này cho phép chuẩn đoán nhanh và chính xác một số bệnh lien quan đến tim mạch như hàm lượng cholesteron trong máu. Các lipase không đặc hiệu, đặc biệt là lipase của Candida rugosa đã được phát triển thành mẫu dò.

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

N

❖ Quy trình ứng dụng của Lipase chuyển hóa Biodiesel từ dầu đậu nành

Enzym lipase cố định trên nano từ tính ứng dụng cho quá trình chuyển hóa biodiesel từ dầu đậu nành 24

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

IỄ N

D

ÀN

Đ

http://daykemquynhon.ucoz.com

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

A

Ó

-H B

10 00 TR ẦN G

N

H Ư

Đ ẠO

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

Ý

-L

TP

Y

U

.Q

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

ÁN

TO

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

N

Ơ

H

N

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

❖ Quy trình ứng dụng của Lipase trong sản xuất phô mai

Việc bổ sung lipase có tác dụng tăng vị béo và hương vị đặc trưng của phô mai

25

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

https://twitter.com/daykemquynhon plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon https://daykemquynhon.blogspot.com

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO)

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Ý

-H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

http://daykemquynhon.ucoz.com

N

G

Đ ẠO

TP

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

.Q

U

Y

N

H

Ơ

N

VI. Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Lê Sỹ Thanh, Quyền Đình Thi, Một số tính chất hóa lý của lipase ngoại bào chủng geotrichum sp.DTQ-26.3. tạp chí Công nghệ Sinh học 5 (1): 31-40, 2007.

2. Nguyễn Hồng Thanh, Phùng Thu Nguyệt, Biểu hiện gen mã hóa lipase từ chủng Bacillus subtilis FS2, tạp chí Công nghệ sinh học 5 (1): 41-46, 2007.

3. Trần Bích Lam, Cố định enzyme và ứng dụng.

4. Trần Thanh Trúc, Công nghệ chế biến dầu mỡ thực phẩm.

5. Lê Văn Việt Mẫn, Giáo trình công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa và thức uống pha chế tập 1, tr273.

6. Mai Xuân Lương, Phương pháp tách chiết enzyme.

7. Rohit Shama et.al, Production, purification, characterization and applications of lipase, Biotechnology adavances 19 (2001) 627-662.

8. Trần Bích Lam, phương pháp xác định hoạt tính enzyme.

9. Phạm Thị Hương, Ứng dụng enzyme ngoại bào trong công nghệ thực phẩm.

10. Phạm Xuân Núi, tổng hợp và đặc trưng xúc tác lipase cố định nano từ tính ứng dụng cho quá trình chuyển hóa biodiesel từ dầu đậu nành.

11. Trần Thị Bé Lan, so sánh một số tính chất của chế phẩm enzyme lipase từ cadida rugosa và porcine pancreas, tạp chí khoa học 2012:22b 210 220.

12. Trần Thị Bé Lan, nghiên cứu enzyme lipase từ candida rugosa và porcine pancreas xúc tác phản ứng transester hóa dầu dừa, tạp chí khoa học 2012: 23b 105-114.

26

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

Báo cáo ĐẶC TÍNH VÀ ỨNG DỤNG ENZYME LIPASE,CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME GVHD:Th.S Trương Phước

SVTH: 1/ ĐẶNG NGỌC 2/BÙI PHƯƠNG 3/TRẦN THỊ KIM 4/NGUYỄN THỊ YẾN 5/NGUYỄN THÁI

I. Tổng quan về enzyme Lipase 1. Tên enzyme Lipase ❖ Lipase (EC 3.1.1.3) còn có tên khác là Triacylglycerol lipase. ❖ Thuộc nhóm enzyme hydrolase, cắt đặc hiệu các liên kết ester. ❖ Lipase xúc tác phản ứng thủy phân cắt đứt lần lượt các liên kết α-ester chứ không cắt cùng một lúc 3 liên kết. Quá trình xúc tác thường chậm hơn so với các enzyme khác như protease, amylase…

I. Tổng quan về enzyme Lipase 2. Cấu trúc enzyme lipase ❖ Tâm hoạt động của lipase là bộ ba: Serine, Histidine và Aspartate/Glutamate. ❖ Loại gấp cuộn các protein và cơ chế xúc tác, hầu hết đều dựa vào sự gập cuộn alpha, beta hidrolase.

I. Tổng quan về enzyme Lipase 3. Cơ chế sinh tổng hợp lipase ❖ Giống như sự tổng hợp protein, lipase sẽ được hình thành khi trải qua các quá trình phiên mã, dịch mã và sau dịch mã. Tất cả các quá trình thực hiện bên trong tế bào chất của VSV. 4. Phân loại enzyme:

I. Tổng quan về enzyme Lipase 4. Phân loại enzyme: a)Nguồn gốc: ❖ Lipase từ thực vật như ngũ cốc trong giai đoạn nảy mầm. Lipase từ nguồn thu nhận này hạn chế về hoạt tính lẫn khả năng bền nhiệt, đồng thời nồng độ enzyme là không cao. ❖ Nguồn lipase từ động vật quan trọng nhất là từ tụy tạng của bò, cừu và lợn. ❖ Bên cạnh đó, nguồn lipase này còn có khả năng lây truyền virus từ động vật sang người nên hiện nay xu hướng sử dụng lipase từ vi sinh vật đang được ưa chuộng do đặc tính đa dạng, dễ tách chiết và nguyên liệu vô hạn .

I. Tổng quan về enzyme Lipase 4. Phân loại enzyme: b)Các loại enzyme lipase: ➢ Lipase có tính đặc hiệu vị trí: ❑C (cylindracae) rogusa ❑Corynebacterium ❑Staphylococus aureus ➢ Lipase có tính đặc hiệu cơ chất: ❑C. rugosa (C18:1 cis-9) ❑A. niger (C10 và C12 hoặc C18:1 cis-9) ❑M. miehei (C12) ❑G. Candidum ➢ Một số lipase từ chủng Pseudomonas như P. cepacia, P. glumae, P. flourensence

I. Tổng quan về enzyme Lipase 4. Phân loại enzyme: c)Tính chất: ❖ Đặc hiệu vị trí: Những enzyme không đặc hiệu với vị trí hoặc cấu trúc gốc acyl trên mạch triglyceride (C.rugosa). ❖ Đặc hiệu cơ chất: cơ chất có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzyme và bị chuyển hóa dưới tác dụng của enzyme.

(C.rugosa, A.niger, M.miehei …)

I. Tổng quan về enzyme Lipase 5. Thông số:nhiệt độ,pH, cofactor,coenzyme: a) Nhiệt độ, pH tối ưu ❖ Lipase chiết xuất từ tụy tạng bị mất hoạt tính ở 400°C, nhưng một số lipase ở vi sinh vật lại có tính bền nhiệt. b) Cofactor ❖ Enzyme lipase hoạt động không cần cofactor, tuy nhiên sự hiện diện của một số các cation kim loại như Ca2+, Na+ sẽ làm tăng hoạt tính của lipase. Hoạt tính của lipase bị bất hoạt bởi Co2+, Ni2+, Hg2+ và Sn2+, bị kìm hãm nhẹ bởi Zn2+ và EDTA:

I. Tổng quan về enzyme Lipase 5. Thông số:nhiệt độ,pH, cofactor,coenzyme: c) Cơ chế xúc tác: Ví dụ về cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân:

II. Sản xuất enzyme Lipase 1. Quy trình tổng quát thu nhận enzyme ngoại bào từ VSV(MT bán rắn)

II. Sản xuất enzyme Lipase 2. Tinh sạch enzyme bằng sắc kí cột

❖ Các nhà khoa học sử dụng DNA tái tổ hợp biểu hiện trong E.coli bằng cách thiết kế gen mã hóa tổng hợp lipase gắn thêm các trình tự mã hóa 6 gốc His ở đầu C (6His lk đặc hiệu với Ni++ trên cột sắc ký ái lực). ❖ Mà việc nhồi cột Ni++ tương đối dễ dàng, cột bền, sử dụng rất lâu. Từ đó mà thành enzyme giảm, tạo điều kiện cho việc ứng dụng lipase rộng rãi hơn. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu còn dùng phương pháp gây đột biến, làm tăng khả năng biểu hiện gen, nâng cao hoạt tính lipase.

II. Sản xuất enzyme Lipase 3. Sản phẩm cuối cùng:

IV. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme ❑ Mức độ hoạt động (hoạt độ) của enzyme dùng để: ❖ Đánh giá mức độ mạnh hay yếu (cường độ xúc tác) của enzyme: ❖ Là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa một lượng cơ chất nhất định trong thời gian nhất định ở điều kiện tiêu chuẩn (nhiệt độ, áp suất tối ưu). Xác định hoạt độ của enzyme thông qua xác định lượng cơ chất mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trước phản ứng. ❖ Đánh giá mức độ tinh khiết của enzyme.

IV. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme ❑ Khi xác định hoạt độ enzyme cần chú ý một số điểm sau: ❖ Nồng độ cơ chất trong phản ứng phải ở trong một giới hạn thích hợp đủ thừa để bão hoà enzym nhưng không quá cao để đến mức kìm hãm enzyme. ❖ Xác định hoạt độ cần tiến hành ở pH thích hợp và cố định. ❖ Nhiệt độ dùng để xác định hoạt độ phải thấp hơn nhiệt độ tối ưu của enzyme để đề phòng tác dụng kìm hãm enzyme do nhiệt độ cao ❖ Thời gian xác định hoạt độ thường từ 5 đến 30 phút.

IV. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 1 .Các phương pháp hoá lý ❑ Phương pháp đo độ đục: Trong môi trường rắn :Phương pháp này sử dụng các chất chỉ thị màu trên đĩa thạch với các ester carboxylic được dùng làm cơ chất , bản chất là xác định đường kính của vùng khuyếch tán sản phẩm.

Trong môi trường lỏng:Phương pháp này theo dõi sự giảm độ hấp thụ của nhũ TAG theo thời gian. Kỹ thuật này rất nhạy với những hệ nhũ, nhưng đối với các hệ nhũ tự nhiên ví dụ như huyết tương chẳng hạn, thì sự có mặt của nhiều yếu tố khác có thể ảnh hưởng đến quá trình.

IV. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 2 . Phương pháp đĩa Wilhelmy Màng film đơn phân tử được trộn lẫn với cơ chất: ❖ Có 2 phương pháp từ hỗn hợp chất béo tạo màng đơn lớp tại bề mặt phân pha khí-nước, hoặc bằng cách phân bố hỗn hợp chất béo không tan trong nước vào một dung môi hữu cơ dễ bay hơi, hoặc tiêm một dung dịch nhũ tương của chất tẩy rửa vào trong pha nước,được bao phủ bởi lớp đơn chất béo không tan. ❖ Một ứng dụng mới của máng “ Zero-order ” được đề xướng bởi Píeroni và Verger [70] cho việc nghiên cứu sự thuỷ phân của lớp đơn phân tử hỗn hợp ở mật độ bề mặt không thay đổi và thành phần chất béo cố định như sơ đồ biểu diễn trong hình

IV. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 3. Sự xuất hiện những sản phẩm của phản ứng thủy phân:

a)Sự giải phóng Proton như một phép phân tích gián tiếp: ❑ Những chất chỉ thị màu: ❖ Trong môi trường rắn:Khi dung dịch lipase được đặt trên một

đĩa agar chứa ester carboxylic như một cơ chất, có thể theo dõi độ pH bằng việc quan sát sự thay đổi màu của những chất chỉ thị (do những axit béo được giải phóng trong phản ứng thủy phân gây ra) mà trước đó đã được kết hợp cùng với những cơ chất trong gel agar. Kỹ thuật này rất tiện lợi trong việc sàng lọc nhanh chóng những vi sinh vật phân hủy lipid phát triển trên những đĩa agar ❖ Trong môi trường chất lỏng:mặc dù đây là một phương pháp định tính, kỹ thuật này cung cấp một phương tiện đơn giản để phát hiện hoạt tính của lipase trong những phần nhỏ cột ghi sắc kí tại những giai đoạn làm sạch lipase khác nhau bằng việc quan sát những thay đổi màu sắc của những chất chỉ thị màu được trộn đều với những cơ chất ester.

IV. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 3. Sự xuất hiện những sản phẩm của phản ứng thủy phân: b) Phép chuẩn độ: ❖ Phương pháp pH-stat được dùng để phát hiện ra hoạt tính của lipase trong dịch mô đồng thể thực vật, có mặt của deoxycholate,sử dụng triolein được nhũ hóa với keo arabic như cơ chất. Kỹ thuật pH-stat đã được dùng để xác định những hoạt tính Lipase trong huyết thanh, plasma và dịch tá tràng.

IV. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 3. Sự xuất hiện những sản phẩm của phản ứng thủy phân:

❑ Nhược điểm: ❖ Vùng phân bố hẹp của những giá trị pH mà có thể được nghiên cứu tìm hiểu. Đặc biệt hơn, sự phát hiện những Proton được giải phóng trong suốt thời gian phản ứng thủy phân mà được xúc tác bởi những enzyme Lipase thì cần có quá trình ion hóa một phần những axit béo được giải phóng. ❖ Khả năng ion hóa cũng như sự có mặt của những ion Canxi sẽ làm giảm đáng kể sự chính xác của những giá trị pKa hiển thị

V. Ứng dụng 1. Ứng dụng của Lipase trong công nghiệp

V. Ứng dụng 2. Ứng dụng lipase trong công nghiệp tẩy rửa - Việc loại bỏ dầu mỡ bằng lipase có triển vọng rất lớn trong công nghiệp chất tẩy rửa. Trong điều kiên bình thường của quá trình giặt tẩy, lipase hoạt động khá tốt.

V. Ứng dụng 3. Ứng dụng lipase trong công nghiệp thuộc da, dệt, giấy

❖ Quá trình thuộc da thường sử dụng môi trường kiềm nên sử dụng các vi khuẩn kiềm sẽ đem lại hiệu quả cao. Dòng bacillus sp. có thể phát triển trong môi trường kiềm sinh tổng hợp lipase kiềm, vì thế chúng rất thích hợp cho quá trình thuộc da. ❖ Lợi thế của việc dùng lipase là màu sắc được giữ nguyên và sạch.

Lipase cũng cải thiện tính không thấm nước của da và da không bị vết hoan ố như sử dụng dung môi và chất hoạt động bề mặt.

4. Ứng dụng lipase trong công nghiệp hóa chất 5. Ứng dụng lipase trong hóa sinh dược và y tế ❖ Lipase được sử dụng để xúc tác ester hóa tinh bột sắn làm chất mang dược chất và làm vật liệu trong điều trị gãy xương ❖ Lipase là một chất hoạt hóa yếu tố phá hủy tế bào ung thư, vì vậy có thể sử dụng trong điều trị ung thư

V. Ứng dụng 6. Ứng dụng lipase trong mỹ phẩm và công nghiệp nước hoa

❖ Monoacylglycerol và diacylglycerol là chất được tổng hợp bởi quá trình ester hóa glycerol bằng lipase, chúng là chất hoạt động bề mặt hiệu quả được ứng dụng trong mỹ phẩm. ❖ Lipase hỗ trợ quá trình tổng hợp hương liệu đã được nghiên cứu đặc biệt là menthol.

7. Ứng dụng lipase trong sản xuất biodiesel ❖ Lipase cố định từ Pseudomonas cepacia dùng trong phản ứng chuyển ester hóa giữa dầu nành với ethanol và methanol tạo ra alkyl ester (biodiesel).

Lipase thương mại.

VI. Tài liệu tham khảo 1) Nguyễn Lê Sỹ Thanh, Quyền Đình Thi, Một số tính chất hóa lý của lipase ngoại bào chủng geotrichum sp.DTQ-26.3. tạp chí Công nghệ Sinh học 5 (1): 31-40, 2007.

2) Nguyễn Hồng Thanh, Phùng Thu Nguyệt, Biểu hiện gen mã hóa lipase từ chủng Bacillus subtilis FS2, tạp chí Công nghệ sinh học 5 (1): 41-46, 2007.

3) Trần Bích Lam, Cố định enzyme và ứng dụng.

4) Trần Thanh Trúc, Công nghệ chế biến dầu mỡ thực phẩm.

5) Lê Văn Việt Mẫn, Giáo trình công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa và thức uống pha chế tập 1, tr273.

6) Mai Xuân Lương, Phương pháp tách chiết enzyme.

7) Rohit Shama et.al, Production, purification, characterization and applications of lipase, Biotechnology adavances 19 (2001) 627-662.

8) Trần Bích Lam, phương pháp xác định hoạt tính enzyme.

9) Phạm Thị Hương, Ứng dụng enzyme ngoại bào trong công nghệ thực phẩm.

10) Phạm Xuân Núi, tổng hợp và đặc trưng xúc tác lipase cố định nano từ tính ứng dụng cho quá trình chuyển hóa biodiesel từ dầu đậu nành.

11) Trần Thị Bé Lan, so sánh một số tính chất của chế phẩm enzyme lipase từ cadida rugosa và porcine pancreas, tạp chí khoa học 2012:22b 210 220.

12) Trần Thị Bé Lan, nghiên cứu enzyme lipase từ candida rugosa và porcine pancreas xúc tác phản ứng transester hóa dầu dừa, tạp chí khoa học 2012: 23b 105-114.