ĐỊNH TÍNH – ĐỊNH LƯỢNG – CHIẾT TÁCH VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA HỢP CHẤT ALKALOID...

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỊNH TÍNH – ĐỊNH LƯỢNG – CHIẾT TÁCH VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA HỢP CHẤT ALKALOID TRONG CÂY THUỐC THƯỢNG (Phaeanthus vietnamensis Ban)

Giảng viên hướng dẫn: PGS-TS. TRẦN CÔNG LUẬN Họ và tên sinh viên: VÕ DUY LÊ SƠN Ngành: Công nghệ Hóa học Niên khóa: 2008-2012

Tháng 8/2012

ĐỊNH TÍNH – ĐỊNH LƯỢNG – CHIẾT TÁCH VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA HỢP CHẤT ALKALOID TRONG CÂY THUỐC THƯỢNG (Phaeanthus vietnamensis Ban)

Tác giả

VÕ DUY LÊ SƠN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành Công nghệ Hóa học

Giảng viên hướng dẫn: PGS-TS. TRẦN CÔNG LUẬN

Tháng 8/2012 i

LỜI CẢM ƠN Lời cảm ơn đầu tiên con xin chân thành gửi đến ba mẹ và dì Yến đã tạo mọi điều kiện từ tinh thần đến vật chất, là chỗ dựa thật vững chắc để con yên tâm học tập và hoàn thành khóa luận.

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM đã tạo điều kiện cho em học

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

tập trong suốt 4 năm qua.

Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Hóa học cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy em trong suốt quá trình học tập.

Em xin chân thành cảm ơn thầy PGS-TS. Trần Công Luận, giám đốc Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM cùng các thầy cô trong trung tâm đã tạo điều kiện và tận tình huớng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh, chị trong Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kinh nghiệm cho em.

Cảm ơn bạn Tôn Nữ Thanh Trà, anh Bùi Thanh Phong cùng tất cả các anh, chị và các bạn sinh viên thực hiện đề tài tại Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM đã giúp đỡ, khuyến khích, động viên, cùng tôi vượt qua những lúc khó khăn trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

Sinh viên thực hiện

VÕ DUY LÊ SƠN

ii

TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “Định tính – định lượng – chiết tách và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất alkaloid trong cây Thuốc thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban)” được tiến hành tại trung tâm Sâm và Dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 01/2012 đến tháng 8/2012.

Giảng viên hướng dẫn:

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

PGS-TS. TRẦN CÔNG LUẬN Ngày nay, chúng ta không thể phủ nhận được tầm quan trọng của việc điều trị bằng dược phẩm tây y nhưng bên cạnh hiệu quả điều trị, các dược phẩm này thường để lại tác dụng phụ. Vì thế, xu hướng hiện nay trên thế giới là quay lại nghiên cứu nguồn thuốc chữa bệnh có nguồn gốc từ thực vật.

Cây Thuốc thượng được phát hiện ở núi Bà Nà – Đà Nẵng thường được người dân dùng để trị các bệnh lý nhiễm trùng nhưng chưa được nghiên cứu rộng rãi. Để bảo tồn và phát triển dược liệu này thì việc định danh và nghiên cứu một cách khoa học và có hệ thống là một trong những công tác cần thiết.

Đề tài đã áp dụng các phương pháp hóa học, kĩ thuật sắc kí lớp mỏng, kĩ thuật chiết tách lỏng – lỏng và lỏng – rắn để định tính – định lượng – chiết tách hợp chất alkaloid trong cây Thuốc thượng (Phaeanthus vietnamsis Ban). Hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất alkaloid được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.

Những kết quả đã đạt được như sau:

- Định tính bằng phản ứng hóa học và sắc kí lớp mỏng đều cho thấy cây Thuốc thượng có hợp chất chính là alkaloid.

- Định lượng alkaloid bằng phương pháp cân cho thấy hàm lượng alkaloid tổng trong mẫu nghiên cứu là 3,925%.

- Hoạt tính kháng khuẩn của cao alkaloid tổng trên các chủng Gram dương và Gram âm mạnh hơn cao nước và cao n-butanol.

iii

ABSTRACT Research of “Qualitative analyse – quantification analyse – extract and explore antibacterial activities compounds of alkaloid in Phaeanthus vietnamensis Ban” was conducted at HCMC Research Center of Ginseng and Medicinal Materials from 01/2012 to 8/2012.

Instructor: PhD. Tran Cong Luan

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Nowadays, we can not deny the importance of drugs therapy, besides the treatment effect, drugs are usually left side-effect. Thus, current trends in the world is back to research sources of medicines derived from plants.

Phaeanthus vietnamensis Ban found at Mount Ba Na – Da Nang has been commonly used to treat many infectious diseases but it has not been widely researched. To preserve and develop this medicinal plant, the present research is established.

The study applied phytochemical methods, thin layer chromatography techniques, liquid – liquid and liquid – solid extraction techniques in order to qualitative analyse – quantification analyse – extract alkaloid fractions. The antibacterial activity of alkaloid fractions were determined by petridish distribution method

The results revealed that:

- Qualitative analyse by chemical reactions and thin layer chromatography showed that the main compound of Phaeanthus vietnamensis Ban is alkaloid.

- Quantification analyse by means of weight showed that the total alkaloid content in research prototype is 3.925%.

- The antibacterial activity of total alkaloid extract is stronger than the aqueous extract and n-butanol extract.

iv

MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................... ii TÓM TẮT .................................................................................................................... iii MỤC LỤC ......................................................................................................................v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ ix

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

DANH SÁCH CÁC BẢNG ...........................................................................................x DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................... xi Chương 1 ........................................................................................................................1 MỞ ĐẦU.........................................................................................................................1 1.1.Đặt vấn đề ..............................................................................................................1 1.2.Mục đích và phạm vi đề tài ...................................................................................1 1.3.Ý nghĩa của đề tài ..................................................................................................1 Chương 2 ........................................................................................................................2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................................................2 2.1.Tổng quan về cây Thuốc thượng (Hội đồng dược điển Việt Nam, 2002) ............2 2.2.Tổng quan về alkaloid ...........................................................................................3 2.2.1.Khái niệm về alkaloid .....................................................................................3 2.2.2.Phân bố alkaloid trong thiên nhiên .................................................................4 2.2.3.Danh pháp .......................................................................................................5 2.2.4.Tính chất chung của alkaloid ..........................................................................6 2.2.4.1.Lý tính .....................................................................................................6 2.2.4.2.Hóa tính ...................................................................................................7 2.2.5.Chiết xuất, tinh chế và phân lập alkaloid .......................................................9 2.2.5.1.Chiết xuất.................................................................................................9 v

2.2.5.2.Tinh chế và phân lập (Nguyễn Kim Phi Phụng. 2007. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM) ..................................11 2.2.6.Định tính và định lượng alkaloid (Trần Hùng. 2006. Phương pháp nghiên cứu dược liệu. Bộ môn Dược liệu, khoa Dược, Đại học Y Dược, Tp.HCM.) ......14 2.2.6.1.Định tính alkaloid ..................................................................................14 2.2.6.2.Định lượng alkaloid ...............................................................................14 2.2.7.Cấu tạo hóa học và phân loại alkaloid ..........................................................17

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

2.3.Phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc của hợp chất hữu cơ (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2005)..............................................................................................................19 2.4.Các phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn (Bộ môn vi sinh. Giáo trình thực tập vi sinh học. Khoa Dược, Đại học Y Dược, Tp.HCM, 2002) ......................19 2.4.1.Phương pháp khếch tán trên đĩa thạch..........................................................19 2.4.2.Phương pháp pha loãng ................................................................................20 2.5.Vi khuẩn thử nghiệm ...........................................................................................20 2.5.1.Escherichia coli (E. coli) ..............................................................................20 2.5.2.Staphylococcus aureus (MSSA) ....................................................................21 2.5.3.Pseudomonas aeruginosa (P.aeruginosa) ....................................................22 Chương 3 ......................................................................................................................23 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................23 3.1.Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm ........................................................23 3.2.Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................24 3.3.Vật liệu thí nghệm ...............................................................................................24 3.3.1.Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................24 3.3.2.Trang thiết bị thí nghiệm ..............................................................................24 3.3.3.Hóa chất, dung môi.......................................................................................24 3.4.Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................25 vi

3.4.1.Định tính alkaloid (Trần Hùng, Giáo trình thực tập dược liệu. Bộ môn dược liệu, khoa Dược, Đại học Y Dược, Tp.HCM, 2007) .............................................25 3.4.1.1.Định tính alkaloid bằng phản ứng hóa học............................................25 3.4.1.2. Định tính bằng sắc kí lớp mỏng ...........................................................26 3.4.2.Định lượng alkaloid bằng phương pháp cân (Phương pháp nghiên cứu dược liệu. Bộ môn Dược liệu, trường Đại học Y Dược Tp.HCM, 2007) ......................26 3.4.2.1.Xác định độ mất khối lượng do làm khô ...............................................26

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

3.4.2.2.Định lượng alkaloid bằng phương pháp cân .........................................27 3.4.3.Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc alkaloid (Nguyễn Kim Phi Phụng.

Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM, 2007) .28 3.4.3.1.Chiết xuất alkaloid (theo bài giảng dược liệu, Bộ môn Dược Liệu, trường đại học dược Hà Nội, 2002; Trần Hùng, 2006) .....................................28 3.5. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cây Thuốc thượng và hợp chất alkaloid trên một số chủng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch ............28 Chương 4 ......................................................................................................................29 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................................................29 4.1.Kết quả.................................................................................................................30 4.1.1.Định tính alkaloid bằng phản ứng hóa học...................................................30 4.1.2.Định tính alkaloid bằng SKLM ....................................................................30 4.1.3.Định lượng alkaloid bằng phương pháp cân ................................................31 4.1.3.1. Độ ẩm nguyên liệu................................................................................31 4.1.3.2. Hàm lượng alkaloid toàn phần có trong dược liệu ...............................31 4.1.4.Chiết xuất, phân lập alkaloid ........................................................................31 4.1.4.1.Phân lập alkaloid bằng SKC pha thuận .................................................32 4.1.5. Kết quả xác định khả năng tạo thành vòng kháng khuẩn trên một số cao chiết bằng phương pháp đục lỗ..............................................................................35 4.2.Thảo luận .............................................................................................................38 vii

4.2.1.Định tính alkaloid .........................................................................................38 4.2.2.Định lượng alkaloid bằng phương pháp cân ................................................38 4.2.2.1.Độ ẩm nguyên liệu.................................................................................38 4.2.2.2.Hàm lượng alkaloid toàn phần có trong dược liệu ................................38 4.2.3.Chiết xuất, phân lập alkaloid ........................................................................38 4.2.4. Xác định khả năng tạo thành vòng kháng khuẩn trên một số cao chiết bằng phương pháp khuếch tán trên thạch .......................................................................39

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Chương 5 ......................................................................................................................39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................................................39 5.1.Kết luận................................................................................................................39 5.2.Đề nghị ................................................................................................................40 TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................40 PHỤ LỤC .....................................................................................................................42

viii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Butanol

CHCl3

Chroloform

COSY

Correlation Spectroscopy

HCl

Acid Clohydric

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

HSQC

Heteronuclear Multiple Quantum Correlation

H2SO4 Me MeOH Na2SO4 NH4OH NMR OMe SKC SKDC SKLM

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

BuOH

Acid Sulfuric

Methyl (-CH3)

Methanol

Natri Sulfate

Amoniac

Nuclear Magnetic Resonance

Methoxy (-OMe)

Sắc kí cột

Reparative thin layer chromatography (Sắc kí điều chế)

Thin layer chromatography (Sắc kí lớp mỏng)

Tp.HCM

Thành phố Hồ Chí Minh

TP

Toàn phần

TT UV

Thuốc thử

Ultra Violet

ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Độ kiềm của các alkaloid .............................................................................. 9 Bảng 4.1: Độ ẩm của nguyên liệu ................................................................................ 31 Bảng 4.2: Hàm lượng alkaloid toàn phần .................................................................... 32 Bảng 4.3: Các phân đoạn cột sắc kí I ........................................................................... 34 Bảng 4.4: Các phân đoạn cột sắc kí II .......................................................................... 35

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Bảng 4.5: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn của cao tổng ..................................... 36 Bảng 4.6: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn của cao alkaloid ............................... 36 Bảng 4.7: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn của cao chloroform .......................... 36 Bảng 4.8: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn của cao n-butanol ............................. 37 Bảng 4.9: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn của cao nước .................................... 37 Bảng 4.10: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn trung bình của các cao kháng khuẩn37

x

DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Mẫu dược liệu ban đầu .................................................................................. 3 Hình 3.1: Quy trình phản ứng định tính alkaloid bằng phản ứng hóa học và SKLM . 25 Hình 4.1: Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học ................................................... 30 Hình 4.2: Kết quả định tình bằng SKLM ..................................................................... 31 Hình 4.3: Sắc kí lớp mỏng các phân đoạn lắc (tổng – ete – CHCl3 – alkaloid tổng – n-

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

BuOH – nước) ............................................................................................................... 33 Hình 4.4: Sắc kí lớp mỏng các phân đoạn cột I (alkaloid tổng – I – II – III – IV – V – VI – VII) ....................................................................................................................... 34 Hình 4.5: Sắc kí lớp mỏng các phân đoạn cột II (I4 – I4-1 – I4-2 – I4-3 – I4-4 – I4-5) ....... 35

xi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề

Việt Nam là nơi có nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng phong phú và đa dạng

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

cộng với vốn kiến thức của người dân bản địa đã được tích lũy từ bao đời nay thì việc tìm kiếm, nghiên cứu và phát huy việc sử dụng dược liệu có nguồn gốc thực vật là việc làm cần thiết.

Ngày nay, chúng ta không thể phủ nhận được tầm quan trọng của việc điều trị bằng dược phẩm tây y nhưng bên cạnh hiệu quả điều trị, các dược phẩm này thường để lại tác dụng phụ. Vì thế, xu hướng hiện nay trên thế giới là quay lại nghiên cứu nguồn thuốc chữa bệnh có nguồn gốc từ thực vật.

Cây Thuốc thượng được phát hiện ở núi Bà Nà – Đà Nẵng thường được người dân dùng để trị các bệnh lý nhiễm trùng nhưng chưa được nghiên cứu rộng rãi. Để bảo tồn và phát triển dược liệu này thì việc định danh và nghiên cứu một cách khoa học và có hệ thống là một trong những công tác cần thiết.

1.2.Mục đích và phạm vi đề tài

Định tính – định lượng – chiết tách và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất alkaloid trong cây Thuốc thượng (Phaeanthus vietnamsis Ban).

1.3.Ý nghĩa của đề tài

Nguyên liệu và dược liệu còn khá mới, làm tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn về hóa và hoạt tính sinh học.

1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Tổng quan về cây Thuốc thượng (Hội đồng dược điển Việt Nam, 2002)

Đối tượng nghiên cứu là cây Thuốc thượng ở núi Bà Nà – Đà Nẵng, theo tìm hiểu thì cây Thuốc thượng được sử dụng để trị thương trong thời kỳ chiến tranh và

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

hiện nay chưa được nghiên cứu.

Tên thông dụng: Thuốc thượng, thuốc Mọi, Da xà lắc, thuốc dấu cà doong.

Tên khoa học: Phaeanthus vietnamensis Ban. Thuộc:

- Giới: Thực vật

- Ngành: Magnoliophyta - Lớp: Magnoliopsida - Bộ: Magnoliales

- Họ: Annonaceae (Na) - Chi: Phaeanthus

Mô tả: Cây gỗ nhỏ hoặc cây bụi, cao 2-10m. Cành non gần như không lông. Lá thuôn hoặc gần hình mác, dài 9-16cm, rộng 3-6,5cm, đầu có mũi dài và mọn, gốc hình nêm hơi lệch, không lông; gân bên 9-11 đôi; cuống dài 5-6mm; hoa mọc so le với lá, thường thành xim 2 hoa. Hoa có cuống dài 1,5-3cm, mang 4-6 lá bắc nhỏ; lá đài và cánh hoa ngoài rất giống nhau, dài trên 1mm; nhị nhiều, lá xoăn nhiều. Thân quả hình trái xoan, cỡ 12-15 x 6-7mm, không có lông, khi chín màu vàng sau chuyển thành màu mận chín; cuống dài 13-15mm, vỏ quả rất mỏng.

Ra hoa tháng 5-12, có quả tháng 6-1.

Bộ phận dùng: Lá, vỏ và vỏ rễ.

Nơi sống và thu hái: thấy ở trung bộ Việt Nam: Thừa Thiên – Huế (Phú Lộc), Quảng Nam – Đà Nẵng (Đại Lộc, Quế Sơn, Núi Thành, Duy Xuyên, Tiên Phước, Phước Sơn).

2

Công dụng: Dân gian dùng lá non hấp chín trên nồi cơm, lấy nước nhỏ mắt chữa đau mắt đỏ. Vỏ rễ, vỏ thân và lá đem nấu cao dán chỗ mụn nhọt sưng tấy. Cây còn có tác dụng chữa đau bụng, tiêu chảy, kiết lị, tác dụng cầm máu vết thương ngoài da.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Là loài hiếm gặp, bị khai thác thường xuyên nên cần bảo vệ giữ giống.

Hình 2.1: Mẫu dược liệu ban đầu

2.2.Tổng quan về alkaloid

2.2.1.Khái niệm về alkaloid

Đã từ lâu, các nhà khoa học tìm thấy trong cây các hợp chất hữu cơ, những hợp chất này thường là những chất trung tính hoặc acid. Đến năm 1806, dược sĩ Friedrich Wilhelm Serturner phân lập được 1 chất từ nhựa thuốc phiện có tính kiềm và gây ngủ mạnh đã đặt tên là “Morphin”. Năm 1810, Gomes chiết được chất kết tinh từ vỏ Canhkina đặt tên là “Cinchonino”. Sau này Pelletier P. J và Caventon J. B xác định cinchonino là hỗn hợp 2 chất quinin và cinchonin. Năm 1818, Pelletier và Caventon lại phân lập được 2 chất có tính kiềm từ một loài Strychnos đặt tên “Strychnin và Brucin”.

Như vậy từ cây cỏ các nhà khoa học đã phân lập được một số chất có tính kiềm. Đến năm 1819, dược sĩ Wilhelm Messner đề nghị xếp các chất có tính kiềm lấy từ thực vật ra thành một nhóm riêng, ông đề nghị gọi tên là alkaloid, và đưa ra định nghĩa: “Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, có phản ứng kiềm và lấy từ thực 3

vật”.

Sau này, các nhà khoa học đã chiết được nhiều hợp chất có tính kiềm từ thực vật: [Piperin (1819), cafein (1819), colchicin (1820), coniin (1826), codein (1832), narcein (1832), papaverin (1848), …] đồng thời cũng tìm thấy trong động vật như: Samandarin, samannin lấy từ tuyến da của loài Salamandra maculosa và Salamandra altra; bufotenin, bufotenidin, erotonin là những chất độc lấy từ loài cóc Bufo; batrachotoxin có trong tuyến da loài ếch độc vùng Trung Mỹ Phyllosbates aurotaenia.

Ngoài tính kiềm, alkaloid còn có một số đặc tính khác như hoạt tính sinh học

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mạnh và phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid. Sau này, Polonopski đã đưa ra định nghĩa: “Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi trong động vật, thường có hoạt tính sinh học mạnh và cho phản ứng hóa học với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid” (Theo Bài giảng dược liệu, Bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội, 2002; Thực tập hợp chất tự nhiên, Bộ môn Sinh hóa, trường Đại học KHTN, 2005; Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Viện Dược Liệu, 2005).

2.2.2.Phân bố alkaloid trong thiên nhiên

Alkaloid có phổ biến trong thực vật. Ngày nay đã biết trên khoảng 16000 alkaloid từ hơn 5000 loài, hầu hết ở thực vật bậc cao chiếm khoảng 15-20% tổng số các loài cây. Có những họ có trên 50% loài cây chứa alkaloid như Ranunculaceae, Berberidaceae, Papaveraceae, Buxaceae, Cactaceae.

Ở nấm, alkaloid có trong nấm Cựa khỏa mạch Claviceps purpurea, nấm Amanita phalloides. Ở động vật cũng đã tìm thấy alkaloid ngày càng tăng: Samandarin, samandaridin, samanin có trong tuyến da của loài kì nhông Salamandra maculosa và Salamandra altra; bufotenin, bufotenidin, dehydrobufotenin lấy từ nhựa cóc Bufo bufo gagorizans, Bufobufo asiaticus, Bufo melansiticus; batrachotoxin có trong tuyến da loài ếch độc Phyllobates aurotaenia.

Trong cây, alkaloid thường tập trung ở một số bộ phận nhất định. Ví dụ: Ở hạt như Mã tiền, Tỏi độc, Cà phê, ...; ở quả như Ớt, Hồ tiêu, Thuốc phiện, …; ở lá như Coca, Thuốc lá, Chè, ...; ở hoa như Cà độc dược, ...; ở thân như Ma hoàng, ...; ở vỏ 4

như Canhkina, Hoàng bá, ...; ở rễ như Ba gạc, Lựu, …; ở củ như Ô đầu, Bình vôi, Bách bộ, ....

Rất ít trường hợp trong cây chỉ có một alkaloid duy nhất mà thường là hỗn hợp của nhiều alkaloid, trong đó alkaloid có hàm lượng cao được gọi là alkaloid chính, còn những alkaloid khác hàm lượng thấp hơn được gọi là alkaloid phụ.

Những alkaloid trong cùng một cây thường có công thức cấu tạo tương tự nhau, nghĩa là chúng có cùng một nhân cơ bản chung. Ví dụ: Isopelletierin và methylisopelletierin từ vỏ rễ lựu đều có nhân piperidin; các chất tropin, hyoscyamin,

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

atropine trong lá Benladon đều có nhân tropan.

Các alkaloid ở những cây thuộc cùng một họ thực vật cũng thường có cấu tạo rất gần nhau.

Hàm lượng alkaloid trong cây thường rất thấp, trừ một số trường hợp như Canhkina hàm lượng alkaloid đạt khoảng 6-10%, trong nhựa Thuốc phiện là 20-30%.

Một dược liệu chứa 1-3% alkaloid đã được coi là có hàm lượng khá cao.

Hàm lượng alkaloid trong cây phụ thuộc vào nhiều yếu tố như khí hậu, ánh sáng, phân bón, chất đất, giống cây, bộ phận thu hái và thời kì thu hái. Vì vậy, đối với mỗi dược liệu cần biết được cách trồng trọt, thu hái và bảo quản để thu được lượng alkaloid cao.

Trong cây, alkaloid ít khi ở trạng thái tự do (Alkaloid base) mà thường ở dạng muối của các acid hữu cơ như citrate, tartrate, malate, oxalate, acetate, ... (đôi khi có ở dạng muối của acid vô cơ) tan trong dịch tế bào, ở một số cây, alkaloid kết hợp với tannin hoặc kết hợp với acid đặc biệt của chính cây đó như acid meconic trong Thuốc phiện, acid tropic trong cây họ Cà, acid aconitic có trong cây Ô đầu. Có một số ít trường hợp alkaloid kết hợp với đường tạo ra dạng glycoalkaloid như solasonin và solamacgin trong cây Cà lá xẻ Solanum laciniatum (Theo Bài giảng dược liệu, Bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội, 2002).

2.2.3.Danh pháp

Các alkaloid trong dược liệu thường có cấu tạo phức tạp nên người ta không gọi tên theo danh pháp hoá học mà thường gọi chúng theo một tên riêng. Tên của các alkaloid luôn có đuôi in và xuất phát từ: - Tên chi hoặc tên loài của cây + in 5

Ví dụ: Papaverin từ Papaver somniferin Strychninin từ Strychnos nux – vomica Ephedrin

từ Ephedra sinica

Palmatin

từ Jatrorrhiza palmata

Cocain

từ Erythroxylum coca

- Đôi khi dựa vào tác dụng của alkaloid đó: Ví dụ: Emetin do từ emetos có nghĩa là gây nôn, morphin do từ morpheus là gây

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

ngủ.

- Có thể xuất phát từ tên người:

Ví dụ: Pelletierin do tên Pelletier, nicotin do tên Nicot.

Những alkaloid trong cùng 1 cây nhưng tìm ra sau hoặc có cấu trúc tương tự thường được gọi tên bằng cách thêm tiếp đầu ngữ hoặc biến đổi vĩ ngữ của alkaloid chính (Biến đổi in → idin, amin, alin, imin, …).

Alkaloid có tiếp đầu ngữ nor diễn tả 1 chất đã mất 1 nhóm methyl. Ví dụ: Ephedrin (C10H15ON) → nor - ephedrin (C9H13ON). Các đồng phân thường có tiếp đầu ngữ: Pseudo, iso, epi, neo, allo, …

Có thể biến đổi vần của alkaloid chính. Ví dụ: Narcotin → cotarnin, tarconin (theo Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Viện Dược Liệu, 2005).

2.2.4.Tính chất chung của alkaloid 2.2.4.1.Lý tính

Thể chất: - Phần lớn alkaloid trong công thức cấu tạo có oxy thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường.

Ví dụ: morphin (C17H19NO3), codein (C18H21NO3), strychnin (C21H22N2O2), quinin (C20H24N2O2), reserpin (C33H40O9N2), …

- Những alkaloid trong công thức cấu tạo không có oxy thường ở thể lỏng.

Ví dụ: coniin (C8H17N), nicotin (C10H14N2), spartein (C15H26N2).

- Tuy nhiên trong thiên nhiên cũng có một số alkaloid trong công thức cấu tạo có oxy vẫn ở thể lỏng như arecolin (C8H13NO2), pilocarpidin (C10H14N2O2) và một vài 6

chất không có oxy vẫn ở thể rắn như sempervirin (C19H16N2), conessin (C24H40N2).

- Các alkaloid ở thể rắn thường kết tinh được và có điểm chảy rõ ràng, nhưng cũng có một số alkaloid không có điểm chảy vì bị phân hủy ở nhiệt độ trước khi chảy.

- Những alkaloid ở thể lỏng bay hơi được và thường vững bền, không bị phân hủy ở nhiệt độ sôi nên cất kéo được bằng hơi nước để lấy ra khỏi dược liệu.

Mùi vị: đa số alkaloid không có mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay như capsaicin, piperin, chavicin, …

Màu sắc: hầu hết các alkaloid đều không màu, trừ một vài alkaloid có màu vàng

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

như berberin, palmatin, chelidonin. Độ tan:

- Nói chung các alkaloid ở dạng base thường không tan trong nước mà thường tan tốt trong dung môi hữu cơ như ether, chloroform, benzen, methanol, … Trái lại, các alkaloid ở dạng muối thường dễ tan trong nước và hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ ít phân cực.

- Có một số trường hợp ngoại lệ, alkaloid dạng base lại tan tốt trong nước như coniin, nicotin, spartein, colchicin, cafein (cafein tan 1/80 trong nước lạnh và ½ trong nước sôi), alkaloid dạng muối lại ít tan trong nước như berberin nitrat, … Một số alkaloid có chức phenol như morphin, cephelin tan trong dung dịch kiềm.

- Dựa vào độ tan khác nhau của alkaloid dạng base và dạng muối người ta sử dụng dung môi thích hợp để chiết xuất, phân lập và tinh chế alkaloid.

2.2.4.2.Hóa tính

Alkaloid nói chung có tính kiềm yếu là do trong phân tử có nitơ. Người ta có thể tính được độ kiềm của các chất. Người ta xếp: - Alkaloid có độ kiềm mạnh thì giá trị pKB < 3.

- Alkaloid có độ kiềm trung bình thì pKB: 3-7 (alkaloid trong họ Cà, alkaloid trong thuốc phiện, …).

- Alkaloid có độ kiềm yếu thì pKB: 7-10 (alkaloid trong vỏ Canhkina).

- Alkaloid có độ kiềm rất yếu thì pKB: 10-12 (alkaloid có nhân purin).

- Ngoại lệ: có alkaloid không còn tính kiềm như: ricinin, colchicin, theobromin.

Tác dụng với acid, alkaloid tạo ra các muối tương ứng.

7

Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pb, …) tạo ra các muối phức.

Các alkaloid có phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid. Những phản ứng chung này được chia làm hai loại: - Phản ứng tạo tủa: có hai nhóm thuốc thử tạo tủa với alkaloid.  Nhóm thứ nhất: Thuốc thử Mayer (K2HgI4 – Kalitetraiodomercurat).

Thuốc thử Bouchardat (I2/KI).

Thuốc thử Dragendorff (KbiI4 – Kalitetraiodobismutat).

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Muối Reinecke [NH4<Cr(SCN)4(NH3)2>.H2O] - amoni tetrasulfucyanua diamin cromat III.

Thuốc thử Scheibler [H3P(W3O10)4].

Thuốc thử Godeffroy [H3Si(W3O10)4].

Thuốc thử Sonnenschein [H3P(Mo3O10)4].

 Nhóm thứ hai: tạo tủa dạng tinh thể với alkaloid.

Dung dịch vàng clorid.

Dung dịch plantin clorid.

Acid picrolonic.

Acid styphnic.

Dung dịch acid picric.

- Phản ứng tạo màu: Sử dụng các thuốc thử.

Acid H2SO4 đậm đặc (d = 1,84).

Acid HNO3 đậm đặc (d = 1,4).

Thuốc thử Frohde (Acid sulfomolypdic).

Thuốc thử Marquis (Sulfofocmol).

Thuốc thử Mandelin (Acid sulfovanadic).

Thuốc thử Erdmann (Acid sulfonitric).

Thuốc thử Merke (Acid sulfoselenic).

Thuốc thử Wasicky (p.dimethylaminobenzaldehyd hòa trong H2SO4) (theo Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Viện Dược Liệu, 2005).

Bảng 2.1: Độ kiềm của các alkaloid 8

Độ kiềm

Độ kiềm

pkB

pkB Quinolin

Piperidin

N

9,2

2,8

H

N-methyl N

Isoquinolin

9,5 N

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

piperidin

3,9

CH3

Pyrrolidin

2,9

NH2

Anilin

9,4

N H

Benzylamin

Pyridin

CH2

8,8

NH2

4,6

N

Codein

6,1

Coniin

3,1

N

H

Narcotin

7,8

Papaverin

8,1

Viện Dược Liệu(2005)

2.2.5.Chiết xuất, tinh chế và phân lập alkaloid 2.2.5.1.Chiết xuất

Việc chiết xuất alkaloid dựa vào tính chất chung sau: - Alkaloid nói chung là những base yếu, thường tồn tại trong cây dưới dạng muối của acid hữu cơ hoặc vô cơ, đôi khi ở dạng kết hợp với tannin. Nên phải tán nhỏ dược liệu để dễ thấm với dịch chiết và giải phóng alkaloid khỏi muối của nó bằng những kiềm trung bình hoặc kiềm mạnh.

9

- Hầu hết các alkaloid base không tan trong nước nhưng lại dễ tan trong dung môi hữu cơ ít phân cực (hydrocacbon thơm, CHCl3, ether). Trái lại, các muối alkaloid thường tan trong nước, cồn và không tan trong các dung môi ít phân cực. Mặt khác còn tùy theo tính chất của alkaloid như loại bay hơi hoặc không bay hơi mà dùng phương pháp chiết xuất cho thích hợp.

- Đối với những alkaloid bay hơi được như coniin (trong cây Conium maculatum), nicotin (trong cây Thuốc lá), … có thể cất kéo được bằng hơi nước thì sau khi sấy khô dược liệu, tán nhỏ, cho kiềm vào để đẩy alkaloid dạng muối ra base rồi lấy alkaloid ra

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

khỏi dược liệu theo phương pháp cất kéo bằng hơi nước, người ta thường hứng dịch cất được vào trong dung dịch acid và từ đó thu được muối alkaloid.

- Đối với những alkaloid không bay hơi người ta sử dụng những phương pháp sau:  Chiết xuất bằng dung môi hữu cơ ở môi trường kiềm:

Tán nhỏ dược liệu rồi tẩm bột dược liệu với dung dịch kiềm trong nước.

Thường dùng amoni hydroxyt, cũng có thể dùng cacbonat kiềm nhưng chỉ thích hợp với những alkaloid có tính base mạnh. Vôi, natri hydroxyt chỉ dùng khi cần thiết để đẩy các base mạnh, đặc biệt đối với những alkaloid tồn tại trong cây ở dạng kết hợp với tannin: Hoặc dùng để biến các alkaloid có nhóm chức phenol thành phenat tan trong nước, không tan trong các dung môi hữu cơ. Người ta sử dụng tính chất này để lấy riêng morphin trong phương pháp định lượng morphin ở nhựa thuốc phiện.

Chiết bột dược liệu sau khi đã kiềm hóa như trên bằng dung môi hữu cơ không phân cực thích hợp, dung môi này hòa tan các alkaloid base vừa được giải phóng. Ở phòng thí nghiệm thường benzene, CHCl3. Trong sản xuất công nghiệp người ta phải chú ý dùng dung môi rẻ tiền, ít độc, khó cháy. Có thể chiết nguội trong bình ngấm kiệt hoặc chiết nóng trong các dụng cụ kiểu Soxhlet.

Cất thu hồi dung môi hữu cơ dưới áp lực giảm rồi lắc dịch chiết cô đặc với dung dịch acid loãng (2% - 5%) (thường dùng acid HCl hay acid H2SO4). Các alkaloid được chuyển sang dạng muối tan trong nước, còn mỡ, sắc tố, sterol, …ở lại dung môi hữu cơ. Trong phòng thí nghiệm người ta lắc trong bình gạn, trong công nghiệp phải có thiết bị thích hợp.

Gộp các dịch chiết muối alkaloid lại rồi kiềm hoá để chuyển alkaloid sang dạng base, lắc với dung môi hữu cơ thích hợp nhiều lần để lấy kiệt alkaloid base. Việc 10

chiết bằng dung môi hữu cơ có thể dùng bình gạn hoặc các dụng cụ chiết chất lỏng theo kiểu bình ngấm kiệt.

Sau khi lấy riêng lớp dung môi hữu cơ chứa alkaloid base, người ta thường loại nước bằng muối trung tính khan nước (Na2SO4 khan) rồi cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi sẽ thu cắn alkaloid thô.  Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước (Phương pháp Stas - Otto) Thấm ẩm bột dược liệu bằng dung môi chiết xuất.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Chiết bột dược liệu bằng dung môi chiết xuất. Các alkaloid trong dược liệu sẽ chuyển sang dạng muối và tan trong dung môi trên.

Cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi dưới áp lực giảm, dùng ether rửa dịch chiết đậm đặc còn lại. Ở môi trường acid, ether thường hòa tan một số tạp chất chứ không hòa tan các alkaloid.

Sau khi tách lớp ether, kiềm hóa dung dịch nước rồi lấy alkaloid base được giải phóng ra bằng một dung môi hữu cơ thích hợp, (dung môi này phải không trộn lẫn với nước), thường dùng CHCl3, ether, benzene, …Cất thu hồi dung môi hữu cơ rồi bốc hơi tới khô sẽ thu được cặn alkaloid thô.  Chiết bằng cồn

Có một số alkaloid trong dược liệu tồn tại dưới dạng muối tan tốt trong cồn ở môi trường trung tính do đó sau khi tán nhỏ dược liệu ở kích thước thích hợp đem thấm ẩm và chiết bằng cồn ethylic cho tới kiệt alkaloid. Quá trình tiếp theo được thực hiện tương tự như trên.

Trong quá trình chiết xuất người ta dùng thuốc thử tạo tủa để kiểm tra xem các alkaloid đã lấy kiệt chưa.  Các phương pháp chung đã nêu ở trên có kết quả tốt đối với phần lớn các alkaloid trong dược liệu, nhưng có một số alkaloid ở dạng base lại tan nhiều trong nước hoặc ở dạng muối ít tan trong nước thì người ta phải có cách chiết riêng cho thích hợp (Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, 2001; Trần Hùng, 2006).

2.2.5.2.Tinh chế và phân lập (Nguyễn Kim Phi Phụng. 2007. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM)

Sau khi chiết xuất ít khi thu được một alkaloid tinh khiết mà thường là một hỗn 11

hợp các alkaloid còn lẫn tạp chất.

Nếu chỉ có một alkaloid thô thì có thể tinh chế bằng cách chuyển nó nhiều lần từ dung môi hữu cơ sang dung môi nước và ngược lại, cuối cùng làm bốc hơi dung môi ta được một alkaloid tinh khiết.

Nếu là hỗn hợp nhiều alkaloid, để tinh chế và phân lập riêng từng alkaloid trước đây thường dùng phương pháp kết tinh phân đoạn bằng các dung môi, ngày nay người ta sử dụng thêm một số phương pháp khác: Phương pháp trao đổi ion, phương pháp sắc kí cột, sắc kí điều chế, …

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

- Phương pháp trao đổi ion

Phương pháp trao đổi ion dựa vào sự trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong dung dịch muối alkaloid và các ion đã bị hấp phụ trên chất mang (Nhựa trao đổi ion).

Các nhựa trao đổi ion được dùng là các cationit (Những cao phân tử rắn mang nhóm acid có khả năng hấp phụ các cation) và các anionit (Những cao phân tử rắn mang nhóm base có khả năng hấp phụ các anion). Các nhựa trao đổi này không tan trong nước và các dung môi hữu cơ.

Muối alkaloid hòa tan trong nước tạo ra các cation lớn: B.HCl ↔ [BH]+ + Cl-

Quá trình trao đổi của dung dịch muối alkaloid với nhựa trao đổi ion xảy ra như sau:

 Nếu sử dụng cationit

Cat -.H+ + [BH]+.Cl - ↔ Cat -.[BH]+ + H+ + Cl - .

Nhựa cationit hấp phụ alkaloid tạo ra dạng muối alkaloid, alkaloid này sẽ được đẩy ra khi có dung dịch kiềm hoặc amoniac, theo phương trình sau: Cat -.[BH]+ + [NH4]+.OH- ↔ Cat -.[NH4]+ + B + H2O. Alkaloid base không hòa tan trong nước được giữ lại trong cột và sau đó được chiết ra bằng dung môi hữu cơ hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp.  Nếu sử dụng anionit Ani+.OH - + [BH]+.Cl - ↔ Ani+.Cl - + B + H2O. Khi cho dung dịch muối alkaloid qua cột anionit ở dạng OH -, gốc acid được trao đổi với OH -, alkaloid được giải phóng dạng base và sau đó được chiết ra bằng dung môi hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp.

12

Các alkaloid trong hỗn hợp thường có độ kiềm khác nhau, do đó khi cho qua cột trao đổi ion có sự hấp phụ khác nhau và trong lớp ionit xảy ra sự trao đổi kép nối tiếp nhau, chất có độ kiềm lớn bị giữ lại ở trên và chất có độ kiềm nhỏ chuyển sâu vào cột ionit do đó người ta có thể lấy tách riêng các alkaloid ra.

Ngoài ra, trong một số trường hợp người ta dùng các ionit lưỡng tính chứa các nhóm acid lẫn base.

- Phương pháp sắc kí cột Dựa trên nguyên tắc các thành phần trong hỗn hợp alkaloid có độ hấp phụ khác

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

nhau trên chất hấp phụ đã nạp trong cột. Chất hấp phụ thường dùng là oxyt nhôm, silicagel dùng cho sắc kí cột, bột cellulose, …Khi cho dịch chiết alkaloid qua cột, các alkaloid sẽ phân bố lần lượt trong cột, ở phần trên của cột sẽ tập trung chất bị hấp phụ mạnh nhất, còn ở phần dưới của cột tập trung chất bị hấp phụ kém nhất. Tuy nhiên các miền chưa được phân thành ranh giới rõ rệt, nghĩa là chưa phân chia rõ rệt các chất trong cột. Do đó để tách hoàn toàn các alkaloid trong cột người ta phải dùng một dung môi hay một hệ dung môi chạy qua cột để rửa giải các alkaloid đã hấp phụ trong cột.

- Sắc kí điều chế

Dựa theo nguyên tắc của sắc kí lớp mỏng, dịch chiết đậm đặc alkaloid được chấm lên những tấm kính đã tráng chất hấp phụ tương đối dày thành một đường thẳng.

Sau khi khai triển bằng một hệ dung môi thích hợp, các chất khác nhau có tốc độ di chuyển khác nhau nên được tách ra ở những vị trí khác nhau. Để xác định vị trí các alkaloid đã tách ra một cách dễ dàng dưới ánh sáng tử ngoại người ta thường dùng chất hấp phụ có trộn thêm chất phát quang. Ví dụ silicagel GF 254, oxyt nhôm GF254 của hãng Merck. Nếu chất hấp phụ không có chất phát quang thì người ta dùng tấm kính khác phủ lên tấm sắc kí, phun thuốc thử lên một phần nhỏ ở bên phải và bên trái tấm sắc kí, trên cở sở ấy đánh dấu từng dải chứa alkaloid. Sau đó cạo lấy riêng từng phần chất hấp phụ có chứa các alkaloid riêng biệt, rồi chiết riêng lấy từng chất bằng dung môi thích hợp, sau khi cho bốc hơi sẽ thu được từng alkaloid riêng biệt (Theo Bài giảng dược liệu, Bộ môn Dược Liệu, trường đại học dược Hà Nội, 2002; Trần Hùng, 2006).

13

2.2.6.Định tính và định lượng alkaloid (Trần Hùng. 2006. Phương pháp nghiên cứu dược liệu. Bộ môn Dược liệu, khoa Dược, Đại học Y Dược, Tp.HCM.) 2.2.6.1.Định tính alkaloid

Muốn định tính alkaloid phải chiết alkaloid và loại những chất kèm theo gây trở ngại cho các phản ứng. Sau đó làm phản ứng tạo tủa để xác định xem có alkaloid hay không. Muốn xác định xem đó là alkaloid gì thì làm phản ứng màu đặc hiệu, ngày nay thường kết hợp với phương pháp sắc kí nhất là sắc kí lớp mỏng có alkaloid tinh khiết làm chất chuẩn so sánh.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Trong sắc kí lớp mỏng có thể dùng chất hấp phụ là silicagel, nhôm oxyt, bột cellulose, …Tuỳ theo cấu tạo alkaloid mà người ta chọn hệ dung môi cho thích hợp.

Thuốc thử phun hiện màu hay dùng nhất là thuốc thử Dragendorff (Cho vết da cam hoặc đỏ nâu). Ngoài ra có thể dùng thuốc thử để phun hiện màu khác như iodo-iodid, iodoplatinat. Tùy theo cấu tạo alkaloid có thể dùng những thuốc thử phun hiện màu riêng.

- Đối với các alkaloid của Ba gạc có thể phát hiện bằng hỗn hợp acid percloric và FeCl3.

- Alkaloid vỏ Canhkina có thể phát hiện bằng acid formic (Vết có huỳnh quang xanh đậm dưới ánh sáng tử ngoại).

- Các alkaloid là dẫn chất phenylalkylamin được hiện màu bằng thuốc thử ninhydrin.

- Alkaloid có nhân indol có thể phun hiện màu bằng hỗn hợp thuốc thử aldehyt cinnamic và HCl.

- Thuốc thử Van-Urk dùng phun hiện màu alkaloid của Cựa khỏa mạch.

- Các alkaloid có nhân purin có thể phun hiện màu bằng dung dịch iod và acid sulfuaric (Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, 2001; Trần Hùng, 2006).

2.2.6.2.Định lượng alkaloid

Có thể định lượng toàn bộ hoặc chỉ định lượng một alkaloid là hoạt chất trong dược liệu, có nhiều phương pháp định lượng, nói chung các phương pháp đều có hai giai đoạn chính: - Chiết xuất lấy riêng alkaloid ra khỏi dược liệu, có thể sử dụng một trong ba phương pháp chiết xuất alkaloid nhưng việc chiết xuất phải có tính chất định lượng, 14

nghĩa là lượng dược liệu đem chiết phải cân chính xác, có trừ độ ẩm dược liệu và ở từng giai đoạn chiết phải hoàn toàn xong.

- Tiến hành định lượng: Tùy theo tính chất và điều kiện mà lựa chọn phương pháp định lượng cho thích hợp.  Phương pháp cân Để định lượng alkaloid bằng phương pháp cân, cần phải chiết được alkaloid tinh khiết nghĩa là đã loại được hoàn toàn những tạp chất kèm theo. Do đó phương pháp này tương đối lâu và người ta chỉ sử dụng khi không sử dụng được những

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

phương pháp định lượng khác.

Phạm vi sử dụng của nó là những alkaloid có tính base rất yếu, vì những alkaloid này không chuẩn độ được bằng phương pháp acid - base, do hằng số điện ly quá bé sẽ không có bước nhảy trên đường cong chuẩn độ nên không quan sát được sự chuyển màu của rõ rệt của chỉ thị. Ngoài ra phương pháp cân còn được dùng trong trường hợp định lượng những alkaloid chưa xác định rõ cấu trúc hóa học hoặc hỗn hợp nhiều alkaloid có phân tử lượng rất khác nhau.

Khi định lượng, người ta phải chiết được alkaloid tinh khiết bằng một dung môi thích hợp, đem bốc hơi dung môi, sấy cặn tới khối lượng không đổi rồi đem cân.

Nếu hàm lượng alkaloid trong dược liệu rất thấp thì định lượng bằng phương pháp cân trực tiếp khó chính xác, do đó có thể tạo ra các dẫn chất có khối lượng phân tử lớn bằng cách cho alkaloid tác dụng với thuốc thử tạo tủa như acid silicovonframic, acid picrolonic, …Một hệ số được xác định bằng phương pháp thực nghiệm đối với mỗi alkaloid nguyên chất cho phép tính ra hàm lượng alkaloid base trong dược liệu.  Phương pháp trung hoà Mặc dù alkaloid chiết xuất ra đã được tinh chế nhưng định lượng bằng phương pháp cân thường có sai số thừa vì các tạp chất cũng bị lôi cuốn theo lẫn với cặn alkaloid. Do đó định lượng alkaloid bằng phương pháp trung hòa được dùng nhiều hơn, nhất là những alkaloid ở họ Cà.

Muốn định lượng bằng phương pháp này thì alkaloid phải chiết ra ở dạng base. Dung dịch alkaloid base phải trong, vì có vẩn đục hay lẫn phần nhỏ nhũ dịch sẽ gây ra hiện tượng hấp phụ các chất kiềm làm cho kết quả định lượng sai số thừa.

Ngoài ra nếu lẫn các chất kiềm như amoniac, các amin cũng như chất béo và chất màu 15

sẽ ảnh hưởng đến kết quả khi định lượng bằng phương pháp trung hòa có dùng chỉ thị màu. Nếu có amoniac và các amin sẽ gây sai số thừa, còn nếu lẫn chất màu và chất béo thì khi chuẩn độ khó quan sát vùng chuyển màu của chỉ thị. Để loại amoniac và các amin người ta lợi dụng tính dễ bay hơi của nó. Sau khi bốc hơi dung môi, cặn còn lại cho thêm vài ml ether hoặc ethanol rồi cho bốc hơi hết.

Chất béo nói chung được loại trong quá trình tinh chế alkaloid bằng cách lắc với acid loãng sau đó kiềm hóa rồi chiết bằng dung môi hữu cơ nhiều lần, đôi khi béo.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

người ta cho thêm ether dầu hỏa vào khi chuẩn độ để ngăn cản ảnh hưởng của chất Các chất màu thường được loại trong quá trình chuyển alkaloid từ dung môi này sang dung môi khác hoặc có thể dùng các chất hấp phụ màu.

Sau khi đã có dịch chiết alkaloid base có thể tiến hành định lượng bằng cách lắc alkaloid trong dung môi hữu cơ với lượng acid chuẩn độ dư, sau đó định lượng acid thừa bằng kiềm tương ứng, hay làm bốc hơi dung môi hữu cơ, cặn alkaloid còn lại được định lượng trực tiếp hay gián tiếp bằng acid chuẩn độ.

Người ta thường dùng HCl hoặc H2SO4 có nồng độ 0,01-0,1 N để chuẩn độ, chỉ thị màu dùng trong định lượng alkaloid phần lớn là methyl đỏ. Vì theo lý thuyết cũng như thực tế pH của hầu hết các muối alkaloid đều có vùng chuyển màu của chỉ thị này (pH 4,2-6,3).

Vài alkaloid có điểm tương đương trên đường cong chuẩn độ ở khoảng pH 4, trong trường hợp này người ta dùng methyl vàng cam làm chỉ thị màu.

Một số trường hợp dùng hỗn hợp chỉ thị để quan sát rõ vùng chuỷển màu hơn là dùng một chỉ thị màu (ví dụ định lượng alkaloid trong vỏ Canhkina người ta đã dùng hỗn hợp methyl đỏ và xanh methylen để làm chỉ thị).

Khi tính kết quả, nếu trong dược liệu có nhiều alkaloid mà chúng đều định lượng được bằng phép chuẩn độ sẽ tính theo một hệ số là khối lượng phân tử trung bình của các alkaloid có trong dược liệu, nhưng kết quả này không được chính xác vì tỉ lệ alkaloid thường khác nhau. Do đó người ta thường tính theo một alkaloid chính trong dược liệu; ví dụ định lượng alkaloid toàn phần trong lá Benladon thì tính theo hyosxyamin, trong Ma hoàng tính theo ephedrin.

16

Định lượng alkaloid trong môi trường khan: Những alkaloid có tính base rất yếu thì chuẩn độ trong môi trường dung dịch nước không chính xác. Tuy vậy, nếu hòa tan alkaloid vào trong dung môi không phải là nước, thường dùng acid acetic khan (gọi là môi trường khan) thì người ta có thể định lượng được những alkaloid có tính base rất yếu này. Thường dùng acid percloric 0,1 N để định lượng và chỉ thị màu là tím tinh thể.  Phương pháp so màu Phương pháp so màu chỉ cần một lượng nhỏ alkaloid, lại có độ nhạy và có kết

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

quả nhanh, do đó cũng là phương pháp hay dùng để định lượng alkaloid. Hầu hết các alkaloid không có màu nhưng có thể định lượng bằng phương pháp so màu theo nguyên tắc: Dựa vào phản ứng tạo màu của alkaloid, dùng dung dịch có màu đó để định lượng.

Những alkaloid không thể tạo thành dung dịch có màu để định lượng trực tiếp người ta cho alkaloid tác dụng với thuốc thử tạo tủa có màu, sau đó tách riêng tủa và hòa tan trong dung môi thích hợp sẽ được dung dịch có màu để định lượng. Ví dụ: Có thể định lượng alkaloid vỏ Canhkina bằng cách cho tác dụng với thuốc thử Reinecke để tạo ra tủa có màu, lấy riêng tủa Reineckat alkaloid hòa tan trong aceton tạo ra dung dịch có màu để định lượng. Biến đổi alkaloid thành một dẫn chất có màu. Ví dụ biến đổi morphin thành nitrosomorphin có màu đỏ đậm trong môi trường kiềm. Hoặc dùng phản ứng giáng phân alkaloid thành những phần nhỏ, lấy riêng phần cần thiết rồi cho tác dụng với thuốc thử tạo ra dung dịch có màu để định lượng. Ví dụ: physostigmin tác dụng với kiềm tạo thành eserolin, cacbonat kiềm và methylamin; có thể lấy riêng methylamin bằng cách cất kéo hơi nước, sau cho tác dụng với thuốc thử ninhydrin tạo ra hợp chất có màu. Định lượng phần methylamin suy ra được lượng physostigmin (Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, 2001; Trần Hùng, 2006).

2.2.7.Cấu tạo hóa học và phân loại alkaloid

Theo cuốn Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Viện Dược Liệu, 2005, alkaloid là những base bậc 1, bậc 2, hay bậc 3 đôi khi là các amoni hydrat bậc 4. Hầu hết các alkaloid có nitơ tham gia vào nhân dị vòng, nhưng cũng có alkaloid mà nitơ ở ngoài vòng.

Alkaloid thường được phân loại theo cấu trúc của nhân: 17

- Alkaloid không có nhân dị vòng: Những alkaloid thuộc nhóm này có nitơ nằm ở mạch thẳng. (ví dụ như capsaicin trong Ớt) O CH 3O

N H

HO Capsaicin

- Alkaloid có nhân dị vòng: Các alkaloid loại này có thể có một vòng hay có nhiều vòng. Có các nhóm chính:

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

 Những alkaloid là dẫn xuất của nhân pyrrol hoặc pyrrolidin: (ví dụ: Hygrin (C8H15NO) trong lá Coca (Erythroxylum coca))

N

N

H

H

Pyrrol

pyrrolidin

CH CO 2

N

CH3

CH3 Hygrin

 Những alkaloid là dẫn xuất của nhân quinolin: (ví dụ: Quinine (C20H24N2O2) trong vỏ Canhkina, cinchonin (C19H22N2O2) trong vỏ Canhkina)

N Quinolin

 Alkaloid có khung aporphine: roemerin trong củ bình vôi.

O N O

18

CH 3

2.3.Phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc của hợp chất hữu cơ (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2005)

Việc xác định cấu trúc của một hợp chất như thế được dựa vào các phương pháp hóa lí như điểm chảy, năng lực triền quang, MS, IR, NMR, UV… rất cần thiết rong quá trình trích li cô lập các hợp chất mới từ dược liệu.

Phổ MS cung cấp các thông tin về kích thước, công thức nguyên của phân tử.

Phổ IR cung cấp thông tin về các nhóm định chức. Phổ NMR giúp thấy rõ hơn về khung sườn carbon - hydrogen của hợp chất cần khảo sát. Phổ UV - Vis chỉ được sử dụng khi phân tử chứa một hệ nhiều nối đôi liên hợp và được ứng dụng rộng rãi để

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

phân tích định lượng… Mẫu phải đạt được từ 95% trở lên về độ tinh khiết thì mới đủ tiêu chuẩn đo phổ.

2.4.Các phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn (Bộ môn vi sinh. Giáo trình thực tập vi sinh học. Khoa Dược, Đại học Y Dược, Tp.HCM, 2002)

2.4.1.Phương pháp khếch tán trên đĩa thạch

Phương pháp này có 3 cách tiến hành -

Phương pháp đặt đĩa giấy: các đĩa giấy được tẩm thuốc thử hay hóa chất rồi đặt

lên mặt thạch đã cấy sẵn vi sinh vật. Tính kháng khuẩn được thể hiện bằng vòng vô khuẩn. Phương pháp này thường áp dụng đối với kháng sinh có tác dụng trên vi khuẩn (còn gọi là phương pháp kháng sinh đồ - đây là thử nghiệm đi trước thử nghiệm tìm MIC – nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật). Nhược điểm của phương pháp này là nếu thuốc thử và hóa chất khó khuếch tán vào bản thạch sẽ làm sai lệch kết quả và phải tính toán phức tạp.

-

Phương pháp đục lỗ: sự phát triển của vi khuẩn sẽ bị ức chế do sự khuếch tán của

chất kháng khuẩn từ một lỗ đục trên mặt thạch vào môi trường xung quanh. Tính kháng khuẩn của dung dịch thử nghiệm được biểu hiện bằng một vòng kháng khuẩn.

Với phương pháp này cần phải thăm dò để tìm ra một dung dịch đệm và môi trường chất để thử nghiệm khuếch tán tốt. Ưu điểm của phương pháp này là dễ làm, nhanh chóng. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là nếu chất thử khó khuếch tán vào trong bản thạch sẽ làm kết quả không ổn định. Mặc khác chưa có tiêu chuẩn đánh giá thống nhất đường kính vòng vô khuẩn nên kết quả nhận được chỉ mang tính tương đối.

19

-

Phương pháp ống trụ: kháng sinh được đặt trong ống hình trụ rồi đặt vào bản

thạch. Kháng sinh sẽ khuếch tán vào trong thạch và ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn tạo thành vùng ức chế xung quanh nơi đặt kháng sinh.

2.4.2.Phương pháp pha loãng

- Pha loãng trong môi trường lỏng: trong một dãy các ống nghiệm có chứa môi trường đã được pha sẵn chất thử nghiệm ở những nồng độ khác nhau, dùng pipet vô trùng để đưa vi khuẩn thử nghiệm vào. Đem ủ ở nhiệt độ thích hợp trong 18-24 giờ.

Nếu có tác dụng kháng khuẩn, chất thử sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn trong môi

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

trường lỏng. Phương pháp này nhanh, gọn, dễ thực hiện nhưng chỉ áp dụng được với những chất dễ tan trong nước.

- Pha loãng trên thạch: chất thử nghiệm được pha loãng ở các nồng độ khác nhau trong môi trường nuôi cấy có chứa thạch đã được hấp tiệt trùng, đổ vào hộp petri, chờ cho thạch đông. Dùng dây cấy thẳng vi khuẩn lên bản thạch ở những vị trí đã được đánh dấu sẵn. Đem ủ ở nhiệt độ thích hợp trong 18-24 giờ. Nếu có tác dụng kháng khuẩn, chất thử sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn trên bản thạch. Phương pháp này thích hợp với những chất khó tan trong nước.

- Trong giai đoạn khảo sát MIC của vi khuẩn thường áp dụng phương pháp này theo cách cải tiến hơn là sử dụng đĩa 96 giếng (phương pháp MICRODILUTION).

Phương pháp Microdilution có nhiều ưu điểm nổi trội hơn so với những phương cách củ. Cụ thể là: 

Chất thử được pha trực tiếp trên giếng



Lượng mẫu sử dụng ít



Dễ thực hiện, thao tác nhanh



Làm nhiều mẫu trong cùng một lúc nên cho kết quả chính xác

2.5.Vi khuẩn thử nghiệm 2.5.1.Escherichia coli (E. coli)

E.coli là loài vi sinh vật thuộc nhóm Coliform phân, hình que, Gram âm, di động, hiếu khí hoặc kị khí tùy ý.

20

E.coli có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 27oC trong 24-48 giờ, có khả năng sinh indol ở 44oC và 37oC, có phản ứng VogesnProkauer âm tính, không có khả năng sử dụng citrate như nguồn Cacbon duy nhất.

E.coli hiện diện thường xuyên trong ruột người và động vật. Hầu hết các dòng E.coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong đường tiêu hóa, chúng đóng vai trò quan trọng trong ổn định sinh lý đường tiêu hóa. Tuy nhiên, khi xâm nhiễm một liều lượng lớn vào trong cơ thể người và động vật, E.coli là loài phổ biến nhất gây viêm nhiễm đường tiểu, thỉnh thoảng có thể tìm thấy chúng gây lở loét và tạo mủ,

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

nhiễm trùng máu và có thể tìm thấy vi sinh vật này gây viêm não.

Cho đến nay các nhà khoa học đã tìm được ít nhất 4 loài gây bệnh đường ruột cho người. Theo phân loại của Gorbach chúng được chia thành: Enteropathogenic E.coli ( EPEC) Enterotocigenic E.coli ( ETEC) Enteroinvassive E.coli ( EIEC)

Enterohaemorrhagic E.coli ( EHEC)/ verocytocin E.coli (VTEC) hay E.coli 0157:H7 2.5.2.Staphylococcus aureus (MSSA)

Staphylococcus aureus (S.aureus) là vi khuẩn hình cầu Gram dương, hiếu khí hay kị khí tùy ý, không sinh bào tử, không di động, đứng thành chum đôi hoặc chuỗi, ít khi riêng lẻ.

S.aureus có thử nghiệm coagluase, phản ứng DNAse, photphatease dương tính, có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose.

Tất cả các dòng S.aureus đều mẫn cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl. Một số dòng có khả năng làm tan máu trên môi trường thạch máu.

Hầu hết các dòng S.aureus có thể sản sinh ra một loại độc tố bền nhiệt, chúng không bị phân hủy khi đun ở 100oC trong khoảng 30 phút. Lượng độc tố nhiều nhất khi S.aureus tăng trưởng ở 35-37oC. Khi vi khuẩn xâm nhiễm vào trong thực phẩm, chúng tiết độc tố vào trong sản phẩm và gây độc. Khi con người tiêu thụ loại thực phẩm có chứa độc tố này, sau 4-6 giờ ủ bệnh sẽ bộc phát các triệu chứng lâm sang như tiêu chảy, nôn mửa, các triệu chứng này kéo dài từ 6-8 giờ. Các loại thực phẩm chứa hàm lượng muối cao thường có 21

nguy cơ nhiễm vi sinh vật này như jambon, kem tổng hợp, nước soup… vì các loại thực phẩm này ít khi được xử lý ở nhiệt độ cao hơn 40oC. Các loại thủy sản hay thực phẩm đóng hộp cũng thường hay bị nhiễm loài vi sinh vật này. Các nguồn lây nhiễm vào thực phẩm là từ nhà bếp, quá trình chế biến. Sự hiện diện với mật độ cao của S.aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến.

S.aureus phân bố khắp nơi, nhưng chủ yếu được phân lập từ da, màng nhầy,

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

long, tóc của người và động vật máu nóng.

2.5.3.Pseudomonas aeruginosa (P.aeruginosa)

P.aeruginosa là trực khuẩn Gram âm, tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc tạo chuỗi ngắn, có khả năng di động với tiêm mao đơn cực.

Là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, nhưng P.aeruginosa có thể phát triển trong môi trường kị khí nếu có gốc nitrate làm chất nhận điện tử, nhiệt độ phát triển tối ưu ở 37oC. Loài này tăng trưởng được trên môi trường nghèo dinh dưỡng chỉ gồm khoáng và một nguồn cacbon thích hợp duy nhất như acetate, pyruvate, succinate, glucose, 2 – ketogluconate, L – valine, β – alanine, DL – arginine.

Một số đặc điểm sinh hóa chính của P.aeruginosa là: có khả năng thủy giải gelatin, tinh bột, có phản ứng nitrate, oxidase, ADC dương tính, sử dụng citrate và malonate dương tính.

P.aeruginosa hiện diện phổ biến trong đất, nước, bề mặt động thực vật, là loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên người. Sự nhiễm bệnh bắt đầu từ khi có những biến đổi làm suy yếu hệ bảo vệ của tế bào chủ. P.aeruginosa có thể gây nhiều bệnh khác khác nhau: gây viêm màng trong tim, viêm đường hô hấp, viêm phổi, nhiễm trùng đường máu, đường tiết niệu, viêm màng não mủ, viêm tủy xương, viêm tai, gây bệnh hóa sừng ở mắt, gây nhiễm trùng da, mô mền…

Loài này còn là vi khuẩn kháng thuốc phổ biến đối với nhiều loại kháng sinh.

Chỉ có một số ít kháng sinh có hiệu nghiệm với P.aeruginosa là fluoroquinolone, gentamicine và imipenem.

22

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm

Thời gian: đề tài được thực hiện từ tháng 01/2012 đến tháng 8/2012. Địa điểm: bộ môn Hóa – Chế phẩm, trung tâm Sâm & Dược liệu TP Hồ Chí Minh.

23

3.2.Nội dung nghiên cứu

Định tính, định lượng, chiết tách và xác định cấu trúc của hợp chất alkaloid trong cây Thuốc thượng.

3.3.Vật liệu thí nghệm 3.3.1.Đối tượng nghiên cứu

Cây Thuốc thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban) được thu hái ở núi Bà Nà – Đà Nẵng.

3.3.2.Trang thiết bị thí nghiệm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

- Bình hút ẩm

- Bồn chiết siêu âm ELMA LC60H (Đức) - Bếp đun cách thủy MEMMERT (Đức)

- Cân phân tích METLER TOLEDO AB-204 (Thụy Sĩ) - Tủ sấy SANYO MOV-112 (Nhật)

- Đèn soi UV-VIS DESAGA SARSTEDT GRUPPE - Máy cô quay BUCHI R-114 (Thụy Sĩ) - Máy chụp ảnh KTS SAMSUNG

- Cột sắc kí kích thước : 6 cm x 60 cm; 3 cm x 60 cm - Bình triển khai sắc kí lớp mỏng

- Bản mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 (Merck) 3.3.3.Hóa chất, dung môi

Dung môi: chloroform (Trung Quốc), methanol (Merck, Trung Quốc), methanol công nghiệp, n-butanol, nước cất 2 lần, dimethylamine.

Hóa chất: Na2SO4 khan. Silica gel G 0,04-0,06 mm (Merck).

Thuốc thử: Dragendorff, Bouchardat.

24

3.4.Phương pháp nghiên cứu 3.4.1.Định tính alkaloid (Trần Hùng, Giáo trình thực tập dược liệu. Bộ môn dược liệu, khoa Dược, Đại học Y

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Dược, Tp.HCM, 2007)

Hình 3.1: Quy trình phản ứng định tính alkaloid bằng phản ứng hóa học và SKLM

3.4.1.1.Định tính alkaloid bằng phản ứng hóa học

Cân khoảng 5 g bột dược liệu cho vào bình nón nút mài 250 ml, làm ẩm bằng một lượng vừa đủ NH4OH 10% trong 15 phút. Cho vào bình 50 ml CHCl3, đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút, lọc thu dịch CHCl3, chiết tiếp bằng cách đun hồi lưu trên bếp cách thủy 15 phút với 30, 30 ml, … CHCl3 Gộp chung các dịch lọc CHCl3 vào bình lắng gạn 250 ml. Chiết alkaloid bằng H2SO4 2% (20, 10, 10 ml, ...). Ta được dịch chiết nước acid. Cô đặc dịch chiết nước acid cho tới khoảng 10 ml.

25

Định tính bằng thuốc thử tạo tủa - Chuẩn bị 3 ống nghiệm:  Ống 1: Thuốc thử  Ống 2: Mẫu thử  Ống 3: Dịch chiết nước acid - Với ống 2 và ống 3 cho vào mỗi ống nghiệm 2 ml dịch chiết nước acid.

- Nhỏ vào ống 2 vài giọt thuốc thử, quan sát hiện tượng.  Thuốc thử Dragendorff: Cho tủa màu đỏ cam với alkaloid.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

 Thuốc thử Bouchardat: Cho tủa màu đỏ nâu với alkaloid.

3.4.1.2. Định tính bằng sắc kí lớp mỏng

- Chuẩn bị mẫu thử:

Cân khoảng 1 g bột dược liệu cho vào becher, làm ẩm bằng một lượng vừa đủ NH4OH 10% trong 15 phút. Cho vào becher 10 ml CHCl3, bịt kín chiết siêu âm 10 phút, lọc thu dịch CHCl3, chiết tiếp 10 phút với 5, 5 ml, … CHCl3 Gộp chung các dịch lọc CHCl3 vào bình lắng gạn 125 ml. Chiết alkaloid bằng H2SO4 2% (10, 5, 5 ml, ...) được dịch chiết nước acid.

Chỉnh pH của dịch chiết nước acid cho tới 10 bằng NH4OH 10%, chiết tiếp bằng 10, 5, 5 ml CHCl3. Tiến hành định tính bằng alkaloid.

- Pha tĩnh: Bản mỏng phủ silicagel 60 F254 (Merck).

- Kích thước bản mỏng 1,5 cm x 10 cm.

- Thăm dò và xác định alkaloid trên hệ dung môi triển khai CHCl3: MeOH: NH3 (15:1:0.2).

- Để phát hiện vết alkaloid trên bản sắc kí người ta thường phun (Hoặc nhúng) với thuốc thử Dragendorff. Các alkaloid sẽ cho các vết đỏ cam trên nền vàng cam.

- Tính giá trị Rf. 3.4.2.Định lượng alkaloid bằng phương pháp cân (Phương pháp nghiên cứu dược liệu. Bộ môn Dược liệu, trường Đại học Y Dược Tp.HCM, 2007) 3.4.2.1.Xác định độ mất khối lượng do làm khô

Đĩa nhôm đựng mẫu được sấy khô đến khối lượng không đổi ở 105oC. Cân chính xác khoảng 1 g dược liệu trên đĩa nhôm, đem sấy ở 105oC khoảng 4 26

giờ. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm khoảng 15 phút. Cân và ghi kết quả.

Tiếp tục sấy và cân cho đến khi kết quả ở 2 lần liên tiếp không đổi hoặc chênh lệch nhau không quá 5 mg.

Thực hiện trên 3 mẫu và lấy giá trị trung bình. Độ ẩm được xác định theo công thức:

A a b

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Với:

:

tỉ lệ độ ẩm của dược liệu (%)

:

khối lượng dược liệu trước khi sấy (g)

:

khối lượng dược liệu sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g).

3.4.2.2.Định lượng alkaloid bằng phương pháp cân

Cân chính xác khoảng 5 g bột dược liệu cho vào bình nón nút mài 250 ml, làm ẩm bằng một lượng vừa đủ NH4OH 10% trong 15 phút. Cho vào bình 100 ml CHCl3, đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút, lọc thu dịch CHCl3, chiết tiếp bằng cách đun hồi lưu trên bếp cách thủy 15 phút với 50, 50 ml, … CHCl3 cho tới khi dịch chiết CHCl3 cuối không còn alkaloid nữa (Thử bằng SKLM).

Gộp chung các dịch lọc CHCl3 vào bình lắng gạn 250 ml. Chiết alkaloid bằng H2SO4 2% (20, 10, 10 ml, ...) cho tới khi phần CHCl3 không còn alkaloid nữa (Thử bằng SKLM). Ta được dịch chiết nước acid.

Gộp chung dịch chiết nước acid vào bình lắng gạn 250 ml, kiềm hóa bằng NH4OH 10% cho tới pH 10, chiết alkaloid base bằng CHCl3 (20, 10, 10 ml, ...) cho tới khi dịch chiết nước acid không còn alkaloid nữa (Thử bằng SKLM).

Gộp chung dịch chiết CHCl3 vào bình lắng gạn 250 ml, rửa dịch CHCl3 bằng nước cất (10, 10 ml, ...). Gạn lớp CHCl3 vào 1 becher khô và làm khan bằng Na2SO4 khan.

Gạn dịch chiết đã làm khan vào một becher khô đã cân bì. Rửa lớp Na2SO4 hai lần bằng 5 ml CHCl3 và gộp chung vào dịch chiết CHCl3. Bốc hơi dung môi trên bếp cách thủy cho tới cắn trên bếp cách thủy, sấy cắn ở 110oC cho tới khối lượng không đổi. Cân cắn với khối lượng P (g).

27

Thực hiện 3 lần với 3 mẫu.

H: hàm lượng alkaloid toàn phần trong 100 g mẫu (g) P: khối lượng cắn alkaloid (g) m: khối lượng dược liệu đem định lượng (g) A: độ ẩm của mẫu (%).

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

3.4.3.Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc alkaloid (Nguyễn Kim Phi Phụng. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM, 2007)

3.4.3.1.Chiết xuất alkaloid (theo bài giảng dược liệu, Bộ môn Dược Liệu, trường đại học dược Hà Nội, 2002; Trần Hùng, 2006)

3.5. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cây Thuốc thượng và hợp chất alkaloid trên một số chủng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch

Nguyên tắc: Chất cần định tính kháng khuẩn được cho vào giếng 100 µm đục trên đĩa petri thạch đã cấy sẵn vi khuẩn. Chất kháng khuẩn sẽ khuếch tán vào trong bản thạch, ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn nhạy cảm tạo thành vòng vô khuẩn. Đo đường kính vòng vô khuẩn giúp xác định tính kháng khuẩn.

Cách thực hiện: -

Chuẩn bị vi khuẩn: Vi khuẩn (E. coli, Staphylococus aureus, P. aeruginosa)

được hoạt hóa bằng cách phân lập trên một bản thạch rồi ủ ở 37oC trong 24 giờ. Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào môi trường lỏng, ủ ở 37oC trong 6 giờ.

-

Pha môi trường NA theo hướng dẫn của nhà sản xuất, kiểm tra pH và cho vào

ống nghiệm mỗi ống 20 ml. Hấp tiệt trùng rồi phân phối cho vào các đĩa petri.

-

Chất thử được hòa tan trong nước cất với tỉ lệ thích hợp.

-

Đĩa petri hấp tiệt trùng và sấy khô. Trải môi trường thạch vào đĩa petri và chờ

thạch nguội.

-

Cho 0,2 ml huyền trọc đã được hoạt hóa, trải đều trên mặt thạch. Ủ khô mặt

thạch ở 37oC trong 15 phút. Đục theo tỉ lệ 6 lỗ/đĩa và các lỗ cách đều nhau.

-

Dùng micropipette hút 100 µm dịch thử cho vào các lỗ đã đục.

-

Ủ ở 37oC trong 24 giờ.

28

-

Đọc kết quả: Đặt thước kẻ ở đáy hộp để đo đường kính vòng vô khuẩn. Ranh giới

vòng vô khuẩn là nơi ức chế hoàn toàn sự tăng trưởng của vi khuẩn, được xác định bằng mắt trần, không kể đến sự mọc yếu ớt hay những khóm li ti chỉ có thể thấy được

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

khi quan sát thật tỉ mỉ.

Chương 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

29

4.1.Kết quả

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

4.1.1.Định tính alkaloid bằng phản ứng hóa học

Thuốc thử Dragendorff

Thuốc thử Bouchardat

Hình 4.1: Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học

Ống 1: Thuốc thử, ống 2: Mẫu thử, ống 3: Ống chứng

Nhận xét: Mẫu thử dương tính với các thuốc thử alkaloid. Với Dragendorff thấy tủa cam, với Bouchardat thấy tủa nâu.

4.1.2.Định tính alkaloid bằng SKLM

Hình 4.2: Kết quả định tính bằng SKLM Nhận xét: Kết quả SKLM xuất hiện các vết tắt quang tại UV 254 nm, phát quang tại UV 366 nm. Khi phun Dragendorff xuất hiện vết cam với Rf = 0,29 và 0,59.

Kết luận: Qua định tính bằng SKLM và phản ứng hóa học có thể kết luận trong mẫu có alkaloid.

30

4.1.3.Định lượng alkaloid bằng phương pháp cân 4.1.3.1. Độ ẩm nguyên liệu

Bảng 4.1: Độ ẩm của nguyên liệu Lần 1

Lần 2

Lần 3

Trung bình

(%)

(%)

(%)

(%)

5,5

5,4

5,6

5,5

Nguyên liệu

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Lá Thuốc thượng

Nhận xét: độ ẩm của nguyên liệu là 5,5% (< 13%) phù hợp với độ ẩm của đa số dược liệu.

4.1.3.2. Hàm lượng alkaloid toàn phần có trong dược liệu

Bảng 4.2: Hàm lượng alkaloid toàn phần

Khối lượng mẫu (g) Mẫu

Lần 1 Lá

Lần 2

Lần 3

Cắn alkaloid (g)

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Alkaloid toàn phần (%)

Lần 1

Lần 2

Kết quả trung

Lần 3

2,0110 2,0914 2,0864 0,0753 0,0768 0,0801 3,9627 3,8864 3,9247

bình (%) 3,9246

4.1.4.Chiết xuất, phân lập alkaloid

Lắc phân đoạn Qua thăm dò, cho thấy dung môi cồn 96% cho hiệu suất chiết cao và rẻ tiền.Từ 400 g bột dược liệu chiết bằng cồn 96% theo phương pháp ngấm kiệt, thu được dịch chiết cồn. Cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn. Thêm vào cắn khoảng 100 ml nước và chiết phân bố lần lượt với diethyl ete, CHCl3, n-BuOH bão hòa nước.

Chiết phân đoạn diethyl ete Dịch nước được lắc nhiều lần với diethyl ete, mỗi lần lắc dùng 100 ml diethyl ete. Ngừng lắc khi thấy dịch diethyl ete trong. Cô thu hồi diethyl ete dưới áp suất giảm 31

thu được 7,358 g cao diethyl ete.

Chiết phân đoạn với CHCl3 Dịch nước sau khi lắc với diethyl ete được lắc nhiều lần với CHCl3, mỗi lần lắc dùng 100 ml CHCl3. Ngừng lắc khi thấy dịch CHCl3 trong. Cô thu hồi CHCl3 dưới áp suất giảm thu được 5,1694 g cao CHCl3.

Chiết phân đoạn n-BuOH bão hòa nước Dịch nước sau khi lắc với CHCl3 được lắc nhiều lần với n-BuOH bão hòa nước.

Mỗi lần dùng 100 ml n-BuOH bão hòa nước. Ngừng lắc khi thấy dịch BuOH trong. Cô

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

thu hồi dưới áp suất giảm thu được 4,8 g cao n-BuOH.

Dịch nước còn lại đem cô thu hồi dung môi thu được 2,109 g cao nước.

Chiết alkaloid tổng

Hòa 5,1694 g cao CHCl3 vào nước, sau đó lấy dịch nước lắc với dung dịch HCl loãng để loại tạp hữu cơ. Ta tiến hành kiềm hóa dịch HCl đã lắc bằng dung dịch NH4OH 10% đến pH 10 và lắc lại với CHCl3 để loại tạp vô cơ. Cô thu hồi dịch CHCl3 dưới áp suất giảm ta thu được 1,5535 g cao alkaloid tổng.

SKLM, hệ dung môi CHCl3: MeOH: NH3 (8:2:0,2)

UV 254 nm UV 365 nm Dragendorff Hình 4.3: Sắc kí lớp mỏng các phân đoạn lắc (tổng – ete – CHCl3 – alkaloid tổng – n-BuOH – nước) 4.1.4.1.Phân lập alkaloid bằng SKC pha thuận

Từ bản sắc kí các phân đoạn lắc, ta thấy trong mẫu nguyên liệu có cả alkaloid phân cực và không phân cực. Ta tiến hành chạy cột cao alkaloid tổng (đã loại tạp) bằng hệ dung môi từ phân cực yếu đến phân cực mạnh.

32

Các hệ dung môi khai triển là ether dầu hỏa (60:90) – aceton, aceton, aceton – methanol.

Sử dụng cột sắc kí với các thông số sau (Cột I): - Chất hấp phụ: Silica gel 60 F254 - Quy cách cột: 3 cm x 60 cm - Chiều cao cột silica gel: 30 cm - Khối lượng mẫu: 1,5535 g - Tốc độ dòng: 40 giọt/phút

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

- Thể tích mỗi bình hứng: 25 ml - Tổng số phân đoạn: 7

Phân đoạn I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7

Bình hứng 1 → 45 46 → 99 100 → 134 135 → 299 300 → 373 374 → 468 469 → 600

Cột sắc kí I Dung môi rửa giải Thể tích(ml) Khối lượng(g) ether dầu - acetone (7:3) 1125 0,0770 ether dầu - acetone (5:5) 1350 0,0508 aceton 100% 875 0,2101 aceton - methanol (9:1) 4125 0,6810 aceton - methanol (7:3) 1850 0,2781 aceton - methanol (5:5) 2375 0,1804 methanol 100% 3300 0,0654 Bảng 4.3: Các phân đoạn cột sắc kí I

Để kiểm tra thành phần tách của các bình hứng trong quá trình chiết tách, dùng SKLM, khai triển với hệ dung môi: CHCl3: MeOH: NH3 (8:2:0,2), thuốc thử phát hiện là Dragendorff.

SKLM, hệ dung môi CHCl3: MeOH: NH3 (8:2:0,2)

33

UV 365 nm Dragendorff Hình 4.4: Sắc kí lớp mỏng các phân đoạn cột I

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

UV 254 nm

(alkaloid tổng – I – II – III – IV – V – VI – VII)

Phân đoạn I4 ta được 0,6810 g cao với một số vệt alkaloid khá đẹp. Tiến hành chạy cột I4 để thu nhận các alkaloid.

Sử dụng cột sắc kí với các thông số sau: - Chất hấp phụ: Silica gel 60 F254 - Quy cách cột: 3 cm x 60 cm.

- Chiều cao cột silica gel: 20 cm.

- Tốc độ dòng: 25 giọt/phút.

- Khối lượng mẫu: 0,6810 g

- Thể tích mỗi phân đoạn: 15 ml.

- Tổng số phân đoạn: 5

Cột sắc kí II Phân đoạn Bình hứng Dung môi rửa giải Thể tích(ml) Khối lượng(g) I4-1 1 → 33 CHCl3 100% 660 0,0549 I4-2 34 → 59 CHCl3 – CH3OH (95:5) 520 0,2423 I4-3 60 → 107 CHCl3 – CH3OH (90:10) 960 0,1650 I4-4 108 →121 CHCl3 – CH3OH (80:20) 280 0,1311 I4-5 122 → CH3OH 100% 260 0,0723 Bảng 4.4: Các phân đoạn cột sắc kí II Để kiểm tra thành phần tách của các bình hứng trong quá trình chiết tách, dùng SKLM, khai triển với hệ dung môi: CHCl3: MeOH: NH3 (8:2:0,2), thuốc thử phát hiện là Dragendorff.

SKLM, hệ dung môi CHCl3: MeOH: NH3 (8:2:0,2) 34

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

UV 254 nm UV 365 nm Dragendorff Hình 4.5: Sắc kí lớp mỏng các phân đoạn cột II (I4 – I4-1 – I4-2 – I4-3 – I4-4 – I4-5)

Từ bản sắc kí các phân đoạn lắc, ta thấy trong mẫu nguyên liệu có cả alkaloid phân cực và không phân cực. Ta tiến hành sử dụng cao alkaloid tổng (hay còn gọi là alkaloid toàn phần) để chạy cột sắc kí I.

Ở cột I, các phân đoạn được tách ra theo các vệt từ kém phân cực đến phân cực mạnh (các tạp kém phân cực và phân cực mạnh, tạp màu cũng được loại bớt). Dựa trên kết quả SKLM, ở phân đoạn I4 có một vết alkaloid nằm riêng biệt và có khối lượng tương đối nhiều hơn so với các phân đoạn khác nên tiến hành chọn phân đoạn I4 để chạy cột sắc kí II. Ở cột II, phân đoạn I4-5 có vết alkaloid khá sạch.

4.1.5. Kết quả xác định khả năng tạo thành vòng kháng khuẩn trên một số cao chiết bằng phương pháp đục lỗ

Do không đủ thời gian để tiến hành tiếp, ta lấy các phân đoạn thu được thử hoạt tính kháng khuẩn.

E.coli ATCC 25922 P.aeruginosa ATCC 27853 Sta.aureus ATCC 25953 (MSSA) Sta.aureus ATCC 43300 (MRSA)

Cao tổng (1:4) Lần Lần Lần 1 2 3 17 16 17 16 17 17

Lần 4 18 16

Lần 5 17 16

Lần 6 16 17

Trung Bình 16,83 16,5

15

16

15

14

15

16

15,17

16

17

17

17

17

17

16,83

Bảng 4.5: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn của cao tổng

35

E.coli ATCC 25922 P.aeruginosa ATCC 27853 Sta.aureus ATCC 25953 (MSSA) Sta.aureus ATCC 43300 (MRSA)

Cao alkaloid (1:4) Lần Lần Lần 1 2 3 26 26 26 24 25 24

Lần 4 27 24

Lần 5 26 24

Lần 6 27 25

Trung Bình 26,33 24,33

28

28

26

28

27

28

27,5

28

28

26

28

28

28

27,67

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Bảng 4.6: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn của cao alkaloid

E.coli ATCC 25922 P.aeruginosa ATCC 27853 Sta.aureus ATCC 25953 (MSSA) Sta.aureus ATCC 43300 (MRSA)

Cao chloroform (1:4) Lần Lần Lần 1 2 3 18 17 17 15 15 14

Lần 4 17 16

Lần 5 18 16

Lần 6 18 15

Trung Bình 17,5 15,17

20

18

18

18

18

19

18,5

14

15

16

16

14

15

15

Bảng 4.7: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn của cao chloroform

E.coli ATCC 25922 P.aeruginosa ATCC 27853 Sta.aureus ATCC 25953 (MSSA) Sta.aureus ATCC 43300 (MRSA)

Cao n-butanol (1:4) Lần Lần Lần Lần 1 2 3 4 16 16 14 15 13 13 13 13

Lần 5 16 13

Lần 6 14 13

Trung Bình 15,17 13

13

14

13

13

13

13

13,17

10

10

10

10

10

10

10

Bảng 4.8: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn của cao n-butanol

E.coli ATCC 25922 P.aeruginosa ATCC 27853 Sta.aureus ATCC 25953

Cao nước (1:1) Lần Lần Lần 1 2 3 14 12 13 13 14 13 15 15 15 36

Lần 4 14 14 16

Lần 5 14 13 15

Lần 6 13 13 15

Trung Bình 13,33 13,33 15,17

(MSSA) Sta.aureus ATCC 43300 (MRSA)

13

13

14

12

12

13

12,83

Bảng 4.9: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn của cao nước

Cao alkaloid (1:4)

Cao CHCl3 (1:4)

Cao nbutanol (1:4)

Cao nước (1:1)

Chứng âm

Chứng dương

E.coli ATCC 25922

17

26

18

15

13

0

28

P.aeruginosa ATCC 27853

17

24

15

13

13

0

22

Sta.aureus ATCC 25953

15

28

19

13

15

0

36

Sta.aureus ATCC 43300

17

28

15

10

13

0

34

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Cao tổng (1:4)

Bảng 4.10: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn trung bình của các cao kháng khuẩn

Ghi chú:

- E.coli ATCC 25922, Sta.aureus ATCC 25953 (MSSA) và Sta.aureus ATCC 43300 (MRSA) sử dụng kháng sinh là Cephaclor ở nồng độ 30 µg/đĩa.

- P.aeruginosa ATCC 27853 sử dụng kháng sinh là Gentamicin ở nồng độ 10 µg/đĩa.

Nhận xét: Kết quả cho thấy cao alkaloid tổng kháng khuẩn mạnh nhất trên các mẫu vi khuẩn, điều này cho thấy khả năng kháng khuẩn chủ yếu tập trung vào alkaloid tổng. Cao chloroform và cao tổng kháng khuẩn mạnh để minh chứng cho khả năng của cây Thuốc thượng trong việc ức chế các vi khuẩn gây hại.

37

4.2.Thảo luận 4.2.1.Định tính alkaloid

Định tính alkaloid bằng phản ứng hóa học, dung dịch có chứa alkaloid sẽ có biến đổi màu sắc làm dung dịch có màu đậm lên hay đổi màu. Và khi đối chiếu với màu sắc giữa ống đối chứng với ống đã thêm thuốc thử, ta thấy có sự đổi màu từ không màu sang màu cam, chứng tỏ có alkaloid. Định tính bằng sắc kí lớp mỏng, mẫu đem chấm sắc kí và dùng thuốc thử

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Dragendorff đều cho các vệt màu cam, như vậy chứng tỏ có alkaloid.

4.2.2.Định lượng alkaloid bằng phương pháp cân 4.2.2.1.Độ ẩm nguyên liệu

Theo bảng kết quả độ ẩm, mẫu dược liệu có độ ẩm dưới 13%, phù hợp với độ ẩm của đa số dược liệu. Muốn bảo quản dược liệu tránh meo mốc, tránh biến đổi hoạt chất trong dược liệu thì độ ẩm trong dược liệu phải không được quá độ ẩm an toàn khoảng 13%. Như vậy. mẫu dược liệu trên đều đã được phơi, sấy khô và tránh meo mốc. Điều này giúp bảo quản được mẫu cho quá trình nghiên cứu được tốt hơn.

4.2.2.2.Hàm lượng alkaloid toàn phần có trong dược liệu

Kết quả hàm lượng alkaloid toàn phần có trong dược liệu là 3,9246 g là tương đối nhiều. Và đó cũng là cơ sở cho các bước thí nghiệm chiết tách về sau.

4.2.3.Chiết xuất, phân lập alkaloid

Quá trình lắc phân đoạn do nhiều nguyên nhân cơ học tác động bên ngoài nên khi quan sát bằng mắt thường sẽ không chính xác về độ trong của dịch lắc phân đoạn, từ đó dẫn đến việc lắc phân đoạn chưa triệt để.

Từ bản sắc kí các phân đoạn lắc, ta thấy trong mẫu nguyên liệu có cả alkaloid phân cực và không phân cực. Sau đó, tiến hành sử dung cao alkaloid tổng để chạy cột sắc kí.

Song song đó, ta mang các cao thu được sau khi lắc phân đoạn đi thử hoạt tính kháng khuẩn.

Cột được chạy qua các hệ dung môi khai triển là ether dầu hỏa (60:90): aceton, aceton , aceton: methanol.

38

Từ các phân đoạn của cột I, qua kết quả sắc kí ta tìm được phân đoạn thích hợp để nạp vào cột II. Do hiệu quả tách ở cột I chưa tốt nên sau khi đã khai triển thử nghiệm trên một số hệ dung môi, lần này ta thay đổi hệ dung môi sang chloroform: methanol để đạt hiệu quả tách tốt hơn Sau khi qua cột II do không đủ thời gian nên ta chỉ dừng lại ở giai đoạn thu được một số các phân đoạn.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

4.2.4. Xác định khả năng tạo thành vòng kháng khuẩn trên một số cao chiết bằng phương pháp khuếch tán trên thạch

Nhìn chung trên các loài này thì cao alkaloid tổng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh. Cao cho kết quả kháng khuẩn thấp nhất là cao nước và cao n-butanol. Sở dĩ cao nước và cao n-butanol có hoạt tính kháng khuẩn kém là do hầu hết các hợp chất kháng khuẩn (chủ yếu ở nhóm alkaloid) đã được thu nhận trong các phân đoạn cao trước đó.

Chương 5

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1.Kết luận

Sau khi thực hiện, đề tài có những kết luận như sau: - Định tính alkaloid bằng phản ứng hóa học và sắc kí lớp mỏng đều cho thấy cây Thuốc thượng có hợp chất chính là alkaloid.

- Định lượng alkaloid bằng phương pháp cân cho thấy hàm lượng alkaloid tổng trong mẫu nghiên cứu là 3,925%.

39

- Chiết ngấm kiệt 4 kg nguyên liệu với cồn 96%, lắc phân đoạn với diethyl ete, CHCl3, n-BuOH bão hòa nước thu được 1,5535 g alkaloid tổng để nạp cột.

- Phân lập alkaloid trong 1,5535 g cao alkaloid tổng bằng SKC thu được các phân đoạn, do thời gian không đủ để làm tiếp nên đề tài chỉ có thể xác định được các phân đoạn phân lập đều có chứa alkaloid và có hoạt tính kháng khuẩn thông qua việc xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên thạch.

- Cao alkaloid tổng có hoạt tính kháng khuẩn trên cả hai chủng Gram dương và

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Gram âm mạnh hơn cao nước và cao n-butanol.

5.2.Đề nghị

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn, một số nội dung nghiên cứu vẫn chưa được hoàn thiện. Đề tài xin được đề nghị nghiên cứu tiếp tục như sau: - Phân lập và xác định cấu trúc alkaloid từ các phân đoạn.

- Định lượng các alkaloid phân lập được có trong mẫu bằng kĩ thuật HPLC. - Thử hoạt tính kháng khuẩn của một số cao phân đoạn và hợp chất tinh khiết.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Bộ môn dược liệu, trường đại học Dược Hà Nội. 2002. Bài giảng dược liệu. Hà Nội.

2. Bộ môn sinh hóa, trường đại học KHTN. 2005. Thực tập hợp chất tự nhiên. Tp. HCM. 3. Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ. 2001. Bài giảng chiết xuất dược liệu. Đại học Y Dược Tp. HCM. 4. Hội đồng dược điển, 2002. Dược điển Việt Nam. Bộ Y tế.

5. Phạm Thị Như Hồng. 2006. Khảo sát thành phần hoá học của cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) thuộc họ Thanh thất, Luận văn cao học, đại học KHTN. 6. Trần Hùng. 2006. Phương pháp nghiên cứu dược liệu. Bộ môn dược liệu, khoa dược, đại học Y Dược, Tp. HCM. 40

7. Trần Hùng. 2007. Giáo trình thực tập dược liệu. Bộ môn dược liệu, khoa dược, đại học Y Dược, Tp. HCM. 8. Nguyễn Kim Phi Phụng. 2005. Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ. NXB đại học Quốc gia Tp. HCM. 9. Nguyễn Kim Phi Phụng. 2007. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. NXB đại học Quốc gia Tp. HCM. 10. Bộ môn vi sinh. Giáo trình thực tập vi sinh học. Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp HCM, 2002.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

11. Nguyễn Văn Thanh, Trần Cát Đông. Xây dựng mô hình đánh giá chất có tiềm năng kháng khuẩn. Bộ môn vi sinh. Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp HCM. Kỷ yếu công trình khoa học công nghệ dược, 433-438, 2001.

12. Trần Anh Tuấn, Trần Thu Hương, Trần Hồng Quang, Nguyễn Tiến Hùng, Phan Văn Kiệm, Châu Văn Minh. 2007. Nghiên cứu thành phần hoá học cây Bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack). Trong: Tạp chí dược học, trang 12-15.

13. Viện dược liệu. 2004. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. Tập II. NXB Khoa học kĩ thuật, Tp.HCM.

14. Viện dược liệu. 2005. Nghiên cứu thuốc từ thảo dược. NXB Khoa học kĩ thuật, Tp. HCM.

Tài liệu tiếng Anh

1. Choo C. Y., Chan K. L. 2001. HPLC analysis of Canthinone alkaloids from Eurycoma longifolia. Planta Medica 68: 382 - 384.

2. Mitsunaga K., Koike K., Tanaka T., Ohkawa Y., Kobayashi Y., Sawaguchi T. and Ohmoto T. 1994. Canthin-6-one alkaloids from Eurycoma longifolia. Phytochemistry vol 35: 799 - 802.

3. Kuo P. C., Damu A. G., Lee K. H. and Wu T. S. 2004. Cytotoxic and antimalarial constituents from the roots of Eurycoma longifolia. Bioorganic & Medicinal Chemistry 12: 537 - 544.

4. Kuo P. C., Shi L. S., Damu A. G., Su C. R., Huang C. H., Ke C. H., Wu J. B., Lin A. J., Bastow K. F., Lee K. H., Wu T. S. 2003. Cytotoxic and antimalarial β-carboline alkaloids from the roots of Eurycoma longifolia. Journal of Natural Products 66: 1324 - 1327.

41

5. Kardono B. S., Angerhofer C. K., Tsauri S., Padmawinata K., Pezzuto J. M. and Kinghorn D. 1991. Cytotoxic and antimalarial constituents of the roots of Eurycoma longifolia. Journal of Natural Products 54: 1360 - 1367.

6. Nurhanan M. Y., Azimahtol H. L. P., Mohd I. A., Mohd S. M. A. 2005. Cytotoxic effects of the root extracts of Eurycoma longifolia Jack Phytothepary Research 19: 994 - 996.

7. Tan S., Yuen K. H., Chan K. L. 2002. HPLC analysis of plasma 9-methoxycanthin6-one from Eurycoma longifolia and its appliacation in a Bioavailability/

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Pharmacokinetic studies. Planta Medica, 68: 355 - 358.

8. Thoi L. V. and Sương N. N. 1968. Constituents of Eurycoma longifolia Jack. The Journal of Organic Chemistry 35: 1104 - 1109.

PHỤ LỤC

Acid hydrocloric (acid hydrocloric đậm đặc) HCl = 36,46 Dùng loại tinh khiết phân tích Chất lỏng không màu, bốc khói Tỷ trọng ở 20°C: khoảng 1,18

Hàm lượng HCl: 35 – 38% (khối lượng/khối lượng), khoảng 11,5 M Bảo quản ở nhiệt độ không quá 30°C, trong bao bì bằng polyethylene hay vật liệu không phản ứng với acid hydrocloric Dung dịch acid hydrocloric 10% 42

Pha loãng 24 ml acid hydrocloric (thể tích) với nước vừa đủ 100 ml Acid sulfuric (acid sulfuric đậm đặc) H2SO4 = 98,08 Dùng loại tinh khiết phân tích Chất lỏng sáng, ăn mòn mạnh Khối lượng riêng: khoảng 1,84 g/ml Hàm lượng: khoảng 96% (khối lượng/khối lượng) Dung dịch acid sulfuric 10% (acid sulfuric loãng)

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Cho từ từ 6 ml acid sulfuric (thể tích) vào 50 ml nước, lắc liên tục. Làm nguội, thêm nước vừa đủ 100 ml

Dung dịch acid sulfuric 2%

Pha loãng gấp 5 lần dung dịch acid sulfuric 10% (thể tích) với nước Dung dịch acid sulfuric trong ethanol

Pha như các dung dịch acid sulfuric khác, nhưng thay nước bằng ethanol 96% (thể tích)

Nếu không ghi rõ nồng độ, dùng dung dịch sau: cẩn thận và làm lạnh liên tục, khuấy 20 ml acid sulfuric (thể tích) với 60 ml ethanol 96% (thể tích), để lạnh và pha loãng thành 100 ml với ethanol 96% (thể tích) Dung dịch chỉ pha khi dùng

Amoniac (amoniac đậm đặc) NH3 = 17,03

Dùng loại tinh khiết phân tích

Chất lỏng trong, không màu, mùi mạnh đặc biệt Tỷ trọng ở 20°C: khoảng 0,91 Hàm lượng: khoảng 25% (13,5 M) Dung dịch amoniac loãng (dung dịch amoniac 10%) Lấy 440 ml amoniac (thể tích) hòa vào nước và thêm nước vừa đủ 1000 ml Anhydrid acetic (CH3CO)2O = 102,09 Dùng loại tinh khiết phân tích Chất lỏng trong, không màu, mùi hắc. Dung dịch trong nước bị thủy phân nhanh và tỏa 43

mùi acid acetic Điểm sôi: 136 – 142 °C Hàm lượng: không được ít hơn 97,0% Butanol n-Butanol, Butan-1-ol CH3(CH2)2CH2OH = 74,12 Dùng loại tinh khiết phân tích Chất lỏng trong, không màu

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Tỷ trọng ở 20°C: khoảng 0,81 Điểm sôi: 116 – 119 °C Chloroform

Trichloromethan CHCl3 = 119,38

Dùng loại tinh khiết phân tích chứa 0,4 đến 1% (khối lượng/khối lượng) ethanol Chất lỏng trong, không màu, mùi đặc biệt Điểm sôi: khoảng 60°C

Tỷ trọng ở 20°C: 1,475 – 1,481 Ether

Ether ethylic; Diethylether C4H10O = 74,12

Dùng loại tinh khiết phân tích Chất lỏng không màu, trong suốt, dễ bắt lửa, dễ bay hơi, mùi đặc biệt Tỷ trọng ở 20°C: 0,713 - 0,715 Điểm sôi: 34 – 35 °C Chú ý: chỉ cất ether khi đạt phép thử sau: Peroxyd: cho 8 ml dung dịch hồ tinh bột có kali iodid (thể tích) vào ống nghiệm nút mài dung tích 12 ml, đường kính khoảng 1,5cm, đổ đầy ống nghiệm với ether cần thử. Đậy nút, lắc mạnh và để yên tránh ánh sáng trong 30’. Không được có màu tạo thành

44

Bào quản tránh ánh sáng, ở nhiệt độ không quá 15°C. Trên nhãn phải ghi tên và nồng độ chất bảo quản đưa vào Ether dầu hỏa Dùng loại tinh khiết phân tích Chất lỏng trong, không màu, dễ bay hơi, rất dễ bắt lửa, chứa hỗn hợp các dãy hydrocarbon parafin bậc thấp, chia thành các phân đoạn sau: Khoảng sôi 30 – 40 oC; khối lượng riêng: khoảng 0,63 g/ml Khoảng sôi 40 – 60 oC; khối lượng riêng: khoảng 0,64 g/ml

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Khoảng sôi 50 – 70 oC; khối lượng riêng: khoảng 0,66 g/ml Khoảng sôi 60 – 80 oC; khối lượng riêng: khoảng 0,67 g/ml

Khoảng sôi 80 – 100 oC; khối lượng riêng: khoảng 0,70 g/ml

Khoảng sôi 100 – 120 oC; khối lượng riêng: khoảng 0,72 g/ml

Khoảng sôi 120 – 160 oC; khối lượng riêng: khoảng 0,75 g/ml Ethyl acetat

CH3COOC2H5 = 88,11

Dùng loại tinh khiết phân tích

Chất lỏng không màu, mùi thơm hoa quả Tan trong nước, hòa lẫn với ethanol Tỷ trọng ở 20°C: 0,901 – 0,904 Điểm sôi: 76 – 78 °C Kali hydroxyd KOH = 56,11

Dùng loại tinh khiết phân tích, chứa không ít hơn 85% lượng kiềm tính theo KOH và không quá 2% K2CO3 Hạt, que hay phiến màu trắng, dễ chảy nước Dung dịch kali hydroxyd 5% Hòa tan 50 g kali hydroxyd (thể tích) trong nước vừa đủ 1000 ml Magnesi Mg = 24,31 45

Dùng loại tinh khiết hóa học Bột màu xám hay vỏ bào màu trắng bạc Methanol Alcol methylic CH3OH = 32,04 Dùng loại tinh khiết phân tích Chất lỏng trong, không màu, dễ bắt lửa. Trộn lẫn với nước và ethanol

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Tỷ trọng ở 20°C: 0,791 – 0,793 Điểm sôi: 64 – 65 °C Natri hydroxyd NaOH = 40,00

Dùng loại tinh khiết phân tích, chứa không ít hơn 97% lượng kiềm toàn phần tính theo NaOH và không quá 2% Na2CO3

Phiến hay hạt màu trắng, dễ hút ẩm. Dễ tan trong nước và ethanol Dung dịch natri hydroxyd 10%

Hòa tan 100 g natri hydroxyd (thể tích) trong nước, để nguội, pha loãng thành 1000 ml với nước. Để lắng và gạn lấy phần trong Natri sulfat khan NaSO4 = 142,0

Dùng loại tinh khiết phân tích

Bột kết tinh màu trắng, dễ hút ẩm. Tan trong nước, không tan trong ethanol Mất khối lượng khi sấy khô ở 130°C không được quá 0,5% Dung dịch sắt (III) clorid 5% Hòa tan 5 g sắt (III) clorid (thể tích) trong nước vừa đủ 100 ml Thuốc thử Dragendorff Dung dịch kali iodobismuthat Dung dịch 1: hòa tan 0,85 g bismuth nitrat base (thể tích) trong 40 ml nước và 10 ml acid acetic (thể tích) Dung dịch 2: hòa tan 8 g kali iodid (thể tích) trong 20 ml nước 46

Trộn đồng thể tích dung dịch 1 và dung dịch 2. Thêm 100 ml nước và 20 ml acid acetic (thể tích) vào mỗi 10 ml hỗn hợp thu được Thuốc thử Fehling Dung dịch A: hòa tan 34,66 g đồng sulfat (thể tích) trong nước đã acid hóa bằng 2 – 3 giọt acid sulfuric loãng (thể tích) vừa đủ 500 ml Dung dịch B: hòa tan 173 g natri kali tartrat (thể tích) và 50 g natri hydroxyd (thể tích) trong 400 ml nước, làm nguội, thêm nước vừa đủ 500 ml Khi dùng, trộn đồng thể tích dung dịch A và dung dịch B

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Pha loãng 5 ml thuốc thử Fehling với 5 ml nước và đun sôi, dung dịch phải trong, không được xuất hiện vết tủa Thuốc thử Mayer

Dung dịch kali iodomercurat

Hòa tan 1,358 g thủy ngân diclorid (thể tích) trong 60 ml nước, thêm 10 ml dung dịch kali iodid 50% và thêm nước vừa đủ 100 ml

Vanillin

4-Hydroxy-3-methoxy benzaldehyd C8H8O3 =152,2

Dùng loại tinh khiết phân tích

Bột kết tinh hay tinh thể hình kim trắng hoặc màu kem, có mùi thơm vani. Dễ tan trong ethanol, chloroform và ether, tan trong dầu và dung dịch natri hydroxyd Điểm chảy: khoảng 81°C, xác định bằng cách không sấy trước Dung dịch vanilin 1% trong acid sulfuric đậm đặc Hòa tan 1 g vanilin (thể tích) trong acid sulfuric đậm đặc (thể tích) vừa đủ 100 ml Dung dịch chỉ pha khi dùng Dung dịch vanilin 2% trong acid sulfuric Hòa tan 0,1 g vanilin (thể tích) trong 5 ml acid sulfuric (thể tích), pha dùng ngay Xanthydrol 9-Hydroxyxanthen; Xanthen-9-ol C13H10O2= 198,2 47

Dùng loại tinh khiết hóa học chứa không ít hơn 90,0% C13H10O2 Bột màu trắng hay vàng nhạt Điểm chảy: Khoảng 123°C Xanthydrol cũng là dung dịch trong methanol chứa 9,0 - 11.0% C13H10O2 Định lượng: Cân 0,3 g chế phẩm vào bình nón 250 ml, hay lấy 3 ml dung dịch. Thêm 50 ml acid acetic băng (thể tích) và từng giọt 25 ml dung dịchure 2%, lắc liên tục. Để yên 12 giờ, lọc lấy tủa qua phễu xốp thủy tinh (16 mm). Rửa tủa với 20 ml ethanol 96% (thể tích), sấy ở 100 – 105 °C và cân

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Mỗi g tủa tương ứng với 0,9429 g xanthydrol

Bảo quản tránh ánh sáng. Nếu sử dụng dung dịch trong methanol, bảo quản trong các ống nhỏ, hàn kín và lọc nếu cần trước khi sử dụng

Môi trường nuôi cấy và thử nghiệm là môi trường NA Pepton: 5 g/l Casein: 4 g/l

Yeast extract: 3 g/l Glucose: 1 g/l Agar: 15 g/l

Nước cất vừa đủ 1000 ml

Môi trường hoạt hóa vi khuẩn: Casein: 10 g/l

Nước cất vừa đủ 1000 ml

Bảng phụ lục thuốc thử dùng trong sắc kí

Hợp chất Alkaloid Anthraquinon

Thuốc thử hiện màu Dragendorff KOH/MeOH

Hợp chất Iridoid Không no

Coumarin Steroid Hữu cơ nói chung

Diazo-hoá Liebermann-Burchard H2SO4 20% (không đặc hiệu)

48

Thuốc thử hiện màu Trim-Hill Hơi Iod (không đặc hiệu) Polyphenol NaOH/MeOH, FeCl3 Saponin VS, AS, hỗn dịch máu Terpenoid VS, AS (không đặc hiệu)

49

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T