Định lượng đồng thời acetaminophen, codein photphat trong thuốc actadol codein bằng HPLC & UV - VIS

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM –––––––––––––––––

TRẦN QUỐC CHÍNH

, CODEIN PHOTPHAT TRONG THUỐC ACTADOL CODEIN (HPLC) VÀ PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ (UV-VIS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT

THÁI NGUYÊN - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn/

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM –––––––––––––––––

TRẦN QUỐC CHÍNH

I ACETAMINOPHEN, CODEIN PHOTPHAT TRONG THUỐC ACTADOL CODEIN SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ (UV-VIS) Mã số: 60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. MAI XUÂN TRƢỜNG

THÁI NGUYÊN - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn/

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi cùng với sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Mai Xuân Trường. Các số liệu, kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là hoàn toàn trung thực. Nếu sai tôi chịu hoàn toàn trách nhiệm.

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2015

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Tác giả

Trần Quốc Chính

XÁC NHẬN CỦA KHOA HÓA HỌC

XÁC NHẬN CỦA CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

PGS.TS. NGUYỄN THỊ HIỀN LAN

PGS.TS. MAI XUÂN TRƢỜNG

i

LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tác giả đã nhận được nhiều sự quan tâm, động viên và giúp đỡ của các thầy giáo, cô giáo, bạn bè và gia đình.

Tác giả bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: Đào tạo -

-

Nguyên, các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã cung cấp những kiến thức giúp tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Đặc biệt tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS. Mai Xuân Trường người đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành luận văn.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè những

người đã luôn bên tôi, động viên và khuyến khích tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu của mình.

, chắc chắn luận văn không thể tránh khỏi những thiếu

sót. Tác giả rất mong nhận được các ý kiến đóng góp chân thành từ các thầy giáo, cô giáo và bạn đọc.

Xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2015 Tác giả

Trần Quốc Chính

ii

MỤC LỤC Lời cam đoan ........................................................................................................ i Lời cảm ơn ........................................................................................................... ii Mục lục ...............................................................................................................iii Danh mục các từ viết tắt của luận văn ................................................................ iv Danh mục các bảng của luận văn ........................................................................ v Danh mục các hình của luận văn ........................................................................ vi

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 2 1.1. Tổng quan về acetaminophen, codein phot phat .......................................... 2 1.1.1. Acetaminophen .......................................................................................... 2 1.1.1.1. Giới thiệu chung ..................................................................................... 2 1.1.1.2. Tính chất ................................................................................................. 2 1.1.1.3. Dược lý cơ chế tác dụng ......................................................................... 4 1.1.1.4. Dạng thuốc .............................................................................................. 5 1.1.2. Codein photphat ......................................................................................... 6 1.1.2.1. Giới thiệu chung ..................................................................................... 6 1.1.2.2. Tính chất ................................................................................................. 7 1.1.2.3. Tổng hợp ................................................................................................. 7 1.1.2.4. Dược lý và cơ chế tác dụng .................................................................... 7 1.1.2.5. Dạng thuốc .............................................................................................. 8 1.2. Các định luật cơ sở của sự hấp thụ ánh sáng ................................................ 8 1.2.1. Định luật Bughe - Lămbe – Bia................................................................. 8 1.2.2. Định luật cộng tính .................................................................................... 8 1.2.3. Những nguyên nhân làm cho sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch không tuân theo định luật Bughe – Lămbe – Bia ................................................ 9 1.3. Một số phương pháp xác định đồng thời các cấu tử .................................. 10 1.3.1. Phương pháp Vierordt ............................................................................. 10 iii

1.3.2. Phương pháp phổ đạo hàm ...................................................................... 12 1.3.3. Phương pháp lọc Kalman ........................................................................ 14 1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ...................................... 15 1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp HPLC ....................................................... 15 1.4.1.1. Pha tĩnh ................................................................................................. 16 1.4.1.2. Pha động ............................................................................................... 17 1.4.2. Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc kí .......................................... 18

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1.4.2.1. Thời gian lưu và thể tích lưu ................................................................ 18 1.4.2.2. Hệ số phân bố ....................................................................................... 19 1.4.2.3. Hệ số chọn lọc ...................................................................................... 19 1.4.2.4. Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết ........................................... 19 1.4.2.5. Độ phân giải ( R S ) ................................................................................. 20 1.4.3. Hệ thống máy HPLC ............................................................................... 21 1.4.4. Kết quả xác định một số chất theo phương pháp HPLC ......................... 21 Chƣơng 2: THỰC NGHIỆM .......................................................................... 23 2.1. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 23 2.1.1. Phương pháp HPLC ................................................................................. 23 2.1.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử ................................................ 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 24 .......................................................... 24

....................................................................... 24

2.2.2.1. Phương pháp HPLC .............................................................................. 24 2.2.2.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử ............................................. 24 ........................................................... 24 2.3. Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích ............................................... 25 2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD) ....................................................................... 25 2.3.2. Giới hạn định lượng (LOQ) ..................................................................... 25 2.3.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp ..................................................... 25 iv

2.3.4. Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê ...................................... 26 2.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ...................................................................... 27 2.4.1. Thiết bị ..................................................................................................... 27 2.4.2. Dụng cụ .................................................................................................... 27 2.4.3. Hóa chất ................................................................................................... 27 2.4.4. Chế phẩm actadol codeine ....................................................................... 28 ...................................................... 28

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 30 3.1. Phương pháp HPLC .................................................................................... 30 3.1.1. Xây dựng điều kiện để xác định đồng thời 2 chất ACT và CĐI ............. 30 3.1.1.1. Khảo sát lựa chọn pha động ................................................................. 30 3.1.1.2. Lựa chọn bước sóng ............................................................................. 30 3.1.1.3. Lựa chọn tốc độ dòng ........................................................................... 31 3.1.2. Đánh giá phương pháp định lượng .......................................................... 33 3.1.2.1. Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp chuẩn ...................................................... 33 3.1.2.2. Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống ................................................... 33 3.1.2.3. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp ............................................. 34 3.1.2.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp sắc ký ........................................ 36 3.1.3. Xác định ACT và CĐI trong thuốc Actadol codein ................................ 37 3.1.4. Khảo sát độ đúng của phép xác định ACT và CĐI theo phương pháp thêm chuẩn ......................................................................................................... 38 3.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử ................................................... 39 3.2.1 Khảo sát phổ hấp thụ phân tử của ACT và CĐI ....................................... 39 3.2.2. Kiểm tra sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACT và CĐI vào pH........ 40 3.2.3. Kiểm tra sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACT và CĐI theo thời gian ... 40 3.2.4. Kiểm tra sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACT và CĐI theo nhiệt độ..... 41 3.2.5. Khảo sát khoảng tuyến tính tuân theo định luật Bughe – Lambe – Bia của ACT và CĐI. Xác định chỉ số LOD và LOQ ................................................ 42 v

.................................................. 42 3.

......................................................... 43

3.2.5.3. Khảo sát khoảng tuyến tính của CĐI .................................................... 44 .......................................................... 45 3.2.6. Khảo sát và đánh giá độ tin cậy của phương pháp nghiên cứu trên các mẫu tự pha ......................................................................................................... 46 ..................... 46

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

3.2.7. Xác định hàm lượng ACT và CĐI trong thuốc Actadol codein .............. 48 3.2.8. Đ

.... 49

KẾT LUẬN....................................................................................................... 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 53

vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN Tiếng việt

Tiếng Anh

Viết tắt

Acetaminophen

ACT

Côđêin phốt phát

Codein phosphat

CĐI

Giới hạn phát hiện

Limit Of Detection

LOD

Giới hạn định lượng

Limit Of Quantity

LOQ

Sai số tương đối

Relative Error

Độ lệch chuẩn

Standard Deviation

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu

High

năng cao

Chromatography

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Acetaminophen

iv

Performance

Liquid

RE S hay SD HPLC

DANH MỤC CÁC BẢNG CỦA LUẬN VĂN Bảng 3.1. Giá trị các đại lượng đặc trưng.......................................................... 33 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thời gian lưu .......................................................... 34 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát diện tích pic ........................................................... 34 Bảng 3.4. Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của ACT và CĐI .... 35 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại ................................................................ 36 Bảng 3.6. Kết quả phân tích thuốc Actadol codein ........................................... 37

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ đúng .................................................................. 38 ........................ 40 ..... 41

theo nhiệt độ .... 41

Bảng 3.

......... 43

....................................... 44 ............... 45

Bảng 3.14. Kết quả tính LOD và LOQ của CĐI ............................................... 46 ................................. 46 ........ 47

Bảng 3.17. Kết quả tính nồng độ, sai số ACT và CĐI trong mẫu thuốc Actadol codein ................................................................................... 48

Bảng 3.18. Hàm lượng các chất chuẩn ACT và CĐI thêm vào mẫu thuốc Actadol codein ................................................................................... 49

Bảng 3.19. Kết quả xác định độ thu hồi của ACT và CĐI trong mẫu thuốc Actadol codein ................................................................................... 50

v

DANH MỤC CÁC HÌNH CỦA LUẬN VĂN 1.1. Mô hình hoạt động của bộ lọc Kalman ............................................. 15 Hình 1.2. Thời gian lưu của cấu tử phân tích ................................................... 19 Hình 1.3. Hình ảnh máy HPLC ......................................................................... 21 Hình 2.1. Chế phẩm thuốc Actadol codein........................................................ 28 Hình 3.1. Sắc kí đồ của ACT (500 µg/mL) ...................................................... 31 Hình 3.2. Sắc kí đồ của CĐI (8 µg/mL)............................................................ 31

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 3.3. Sắc kí đồ của ACT (1) và CĐI (2).................................................... 32 Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của ACT................................................................................ 35

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của CĐI ................................................................................. 36

3.6. Phổ hấp thụ của các dung dịch chuẩn ACT và CĐI ......................... 39

Hình 3.7. Phổ hấp thụ quang của ACT ở các nồng độ 0,2

40,0 g/mL ......... 42

3.8.

........................................................ 43

Hình 3.9. Phổ hấp thụ quang của CĐI ở các nồng độ 0,2

40 g/mL ............ 44

Hình 3.10. Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng độ CĐI ......................................................... 45

vi

MỞ ĐẦU Khi xã hội càng phát triển thì vấn đề bảo vệ sức khỏe của con người ngày càng được quan tâm, vì vậy ngành dược phẩm cũng phát triển không ngừng, hiện nay các nhà dược phẩm đã sản xuất ra rất nhiều loại thuốc như cảm cúm, giảm đau, hạ sốt, nhức đầu, ho… được bán rộng rãi với những tên gọi và thành phần rất khác nhau. Việc định lượng các chất trong thuốc này theo tiêu

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

chuẩn nhà sản xuất là rất cần thiết trong công tác kiểm nghiệm dược.

Hiện nay trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu áp

dụng nhiều phương pháp định lượng khác nhau trong đó có phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử, những phương pháp này có độ lặp và độ chính xác cao, ngoài ra sử dụng phương pháp trắc quang dùng phổ toàn phần kết hợp với kĩ thuật tính toán và ứng dụng phần mềm máy tính đã bước đầu được nghiên cứu và cho nhiều ưu điểm như độ nhạy, độ lặp, độ chính xác, độ tin cậy của phép phân tích, phân tích nhanh, tiện lợi :

acetaminophen, codeine phosphate trong thuốc Actadol codeine bằng

phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử”.

1

Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về acetaminophen, codein phot phat 1.1.1. Acetaminophen 1.1.1.1. Giới thiệu chung - Tên quốc tế: Pracetamol.

- Tên khác: Acetaminophen.

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

- Mã giải phẫu - điều trị - hóa học: NO2B EO1.

- Biệt dược: Panadol, Pradon, Efferalgan, Pandol...

- Công thức phân tử: C8H9O2N.

- Khối lượng mol phân tử: 151,17g/mol.

- Công thức cấu tạo:

- Tên IUPAC: N-(4-hydroxyphenyl) acetamit hoặc p-hydroxy acetanilit

hoặc 4-hydroxy acetanilit.

- Tên gọi acetaminophen được lấy từ tên hóa học của hợp chất para-

acetyl aminophenol [1-4].

1.1.1.2. Tính chất Tính chất vật lý - ACT là chất bột kết tinh màu trắng, không mùi, vị đắng nhẹ.

- Khối lượng riêng: 1,263 g/cm 3 .

- Nhiệt độ nóng chảy: 169 0 C.

2

- Độ tan trong nước: 0,1÷0,5g/100mL nước tại 22 0 C. Ngoài ra còn có khả năng tan trong etanol, dung dịch kiềm, dung dịch axit...

- Chế phẩm tan ít trong nước, tan nhiều hơn trong nước sôi, khó tan trong clorofom, ete, etanol và các dung dịch kiềm... dung dịch bão hòa trong nước có pH khoảng 5,3÷5,6; pKa=9,51.

Tính chất hóa học -OH, nhóm chức

acetaminophen (ACT) d

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

acetamit và tính chất của nhân thơm quyết định.

Sự có mặt của 2 nhóm hydroxyl và acetamit làm cho nhân benzen được

hoạt hóa có thể phản ứng được với các hợp chất thơm có ái lực electron. Sự liên kết giữa nhóm acetamit, hydroxyl với vòng benzen làm giảm tính bazơ của nhóm amit và làm tăng tính axit của nhóm hydroxyl.

-

muối sắt (III) cho màu tím.

, thêm nước thì không có

kết tủa vì p-aminophenol tạo thành tan trong axit. Thêm thuốc thử kali dicromat thì có kết tủa màu tím khác với phenacetin là không chuyển sang đỏ.

Quá trình xảy ra chủ yếu là:

HO

NHCOCH3

HCl O

t

HO

NH2

K2Cr2O7 [O]

O

NH

ACT. Tổng hợp Năm 1878 Harmon Northrop Morse lần đầu tiên đã tổng hợp được acetaminophen từ con đường giáng hóa p-nitrophenol cùng với thiếc trong giấm đóng băng. Tuy nhiên, acetaminophen không được sử dụng trong suốt 15 năm sau đó. Năm 1893, acetaminophen được tìm thấy trong nước tiểu của người uống phenacetin, và được cô đặc thành một chất kết tinh màu trắng có vị

3

đắng. Năm 1948, Brodie và Axelrod đã nghiên cứu việc sử dụng thuốc acetanilide và họ phát hiện ra rằng, tác dụng giảm đau của acetanilide là do acetaminophen – một chất chuyển hóa của acetanilide và họ chủ trương tổng hợp và sử dụng như một thuốc giảm đau hạ sốt. Sau này, acetaminophen trở thành thuốc giảm đau hạ sốt được sử dụng rộng rãi nhất với rất nhiều tên biệt dược được lưu hành.

Acetaminophen được tổng hợp theo 4 bước từ nguyên liệu đầu là phenol:

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

- Phenol được nitro hóa bởi axit sunfuric và natri nitrit tạo ra hỗn hợp 2 đồng phân o, p-nitro phenol.

- Đồng phân para được tách ra khỏi đồng phân ortho bằng phản ứng

thủy phân.

- Khử para-nitro phenol bằng NaBH4

para-aminophenol.

- Para-aminophenol phản ứng với anhidrit axetic cho ra acetaminophen.

Đem kết tinh acetaminophen lại trong hỗn hợp etanol-nước.

1.1.1.3. Dược lý cơ chế tác dụng Acetaminophen là chất chuyển hóa có hoạt tính của phenacetin, thuộc nhóm thuốc giảm đau hạ sốt. Acetaminophen làm giảm đau bằng cách làm tǎng ngưỡng đau. Thuốc làm hạ sốt thông qua tác động trên trung khu điều nhiệt của não.

4

Acetaminophen được dùng để làm giảm tạm thời sốt, nhức và đau do cảm lạnh thông thường và các nhiễm virus khác. Thuốc cũng được dùng để giảm đau đầu, đau lưng, đau rǎng, nhức cơ ... Acetaminophen làm giảm đau trong viêm khớp nhẹ nhưng không có tác dụng trên tình trạng viêm, đỏ và sưng khớp. Gần đây thuốc được cho là có hiệu quả ngang với thuốc chống viêm không teroit trong làm giảm đau khớp gối do viêm xương khớp.

Cách dùng: Có thể uống cùng hoặc không cùng đồ ǎn. Acetaminophen được chuyển hóa ở gan và cần giảm liều ở bệnh nhân rối loạn chức nǎng gan thận.

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Nói chung acetaminophen được dung nạp tốt với ít tác dụng phụ. Khi

dùng quá liều acetaminophen có thể gây ra ngộ độc gan, suy gan và thậm chí tử vong. Bệnh nhân bị quá liều acetaminophen cần đi khám cấp cứu ngay. Điều trị sớm bằng acetylcystein có thể ngǎn ngừa hủy hoại gan hoặc tử vong. Các dấu hiệu và triệu chứng ngộ độc gan có thể không rõ trong 2-3 ngày sau khi dùng quá liều. Những người thường xuyên uống quá nhiều rượu thường bị ngộ độc gan ở liều acetaminophen thấp hơn. Những người hay phải uống acetaminophen không nên uống rượu vì tǎng nguy cơ tổn thương gan. Bệnh nhân bị bệnh gan và thận cũng cần thận trọng khi uống acetaminophen để tránh ngộ độc.

Acetaminophen không gây quen thuốc.

Tác dụng phụ: Khi dùng đúng, tác dụng phụ hiếm gặp. Các tác dụng

phụ bao gồm vàng da hoặc mắt, phát ban, ngứa, xuất huyết, sốt, đau họng và thiểu niệu.

1.1.1.4. Dạng thuốc

- Chế phẩm viên nén: Acetaminophen, Panadol, Donodol…

- Chế phẩm viên đạn: Efferalgan, Panadol…

- Chế phẩm viên sủi: Efferalgan, Donodol, Panadol…

- Chế phẩm gói bột Efferalgan.

- Chế phẩm dạng bột tiêm: Pro-Dafalgan 2g pro acetaminophen.

- Chế phẩm dạng dung dịch uống.

- Các chế phẩm kết hợp với các thuốc khác.

5

1.1.2. Codein photphat 1.1.2.1. Giới thiệu chung - Tên quốc tế: Codeine phosphate.

- Loại thuốc: Giảm đau gây ngủ và giảm ho.

- Mã giải phẫu - điều trị - hóa học: R05D A04 - Biệt dược: Codeine phosphate - Công thức phân tử: 1 H2O (hemihydrat) 2

khối lượng mol phân tử:

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

+ C18H21NO3. H3PO4.

406,4 g/mol

+ C18H21NO3. H3PO4.

3 H2O (sesquihydrat) khối lượng mol phân tử : 2

424,4 g/mol

- Công thức cấu tạo

CH 3

H

N

H

H3PO4 .

H3CO

O

H OH

1 3 H2O (hay H2O) 2 2

H

- Tên IUPAC:

+ C18H21NO3. H3PO4.

1 H2O : 4,5 a-epoxy-3-methoxy-17-methyl-7,82

- didehydromorphinan - 6a-ol phosphat hemihydrat . hoặc: 3 2

+ C18H21NO3. H3PO4. H2O: sesquihydrat, phải chứa từ 98,5 đến 101,0% C18H21NO3. H3PO4, tính theo chế phẩm đã làm khô.

6

1.1.2.2. Tính chất - Tinh thể nhỏ không màu hoặc bột kết tinh trắng, không mùi.

- Dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol 96% - Khối lượng riêng: 1,32g/cm3 - Nhiêt độ nóng chảy: 154- 1560C. - Độ tan trong nước: 400mg/mL ở nhiệt độ thường 1.1.2.3. Tổng hợp

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Codein có nhiều trong cây thuốc phiện nên nó được tổng hợp thông qua quá trình chiết xuất từ cây thuốc phiện 1.1.2.4. Dược lý và cơ chế tác dụng

Codein là một chất hóa học tự nhiên thuộc nhóm thuốc phiện. Trong y

học nó được sử dụng chủ yếu như một chất giảm đau và giảm ho khi kết hợp với acetaminophen

Codein là methylmorphin, nhóm methyl thay thế vị trí của hydro ở nhóm

hydroxyl liên kết với nhân thơm trong phân tử morphin, do vậy codein có tác dụng dược lý tương tự morphin, tức là có tác dụng giảm đau và giảm ho. Tuy nhiên codein được hấp thu tốt hơn ở dạng uống, ít gây co thắt mật hơn so với morphin. Ở liều điều trị, ít gây ức chế hô hấp (60% thấp hơn so với morphin) và ít gây nghiện hơn morphin.

Codein có tác dụng giảm đau trong trường hợp đau nhẹ và vừa (tác dụng

giảm đau của codein có thể là do sự biến đổi khoảng 10 % liều sử dụng thành morphin), vì vậy nên dùng codein kết hợp với các thuốc chống viêm, giảm đau không steroit để tăng tác dụng giảm đau .

Codein có tác dụng giảm ho do tác dụng trực tiếp lên trung tâm gây ho ở hành não; codein làm khô dịch tiết đường hô hấp và làm tăng độ quánh của dịch tiết phế quản. Codein không đủ hiệu lực để giảm ho nặng. Codein là thuốc trấn ho trong trường hợp ho khan.

Sau khi uống, chu kỳ bán phân hủy là 2 - 4 giờ, tác dụng giảm ho xuất hiện trong vòng 1 - 2 giờ và có thể kéo dài 4 - 6 giờ. Codein được chuyển hóa ở 7

gan và thải trừ ở thận dưới dạng tự do hoặc kết hợp với acid glucuronic. Codein hoặc sản phẩm chuyển hóa bài tiết qua đường tiêu hóa rất ít. Codein qua được nhau thai và một lượng nhỏ qua được hàng rào máu - não.

1.1.2.5. Dạng thuốc Viên nén: 15 mg, 30 mg, 60 mg. Siro 25 mg/mL. Thuốc nước: 3 mg, 15 mg/5 mL. ống tiêm:15 mg, 30 mg, 60 mg/mL. 1.2. Các định luật cơ sở của sự hấp thụ ánh sáng

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1.2.1. Định luật Bughe - Lămbe – Bia

và bề dày lớp dung dịch mà ánh sáng truyền qua.

Phương trình toán học biểu diễn định luật Bughe - Lămbe - Bia A =

. b. C

Trong đó :

A : độ hấp thụ quang của dung dịch ở bước sóng

(A không có

thứ nguyên).

: hệ số hấp thụ mol phân tử của cấu tử tại bước sóng .

b: bề dày lớp dung dịch (cm).

C: nồng độ của cấu tử trong dung dịch (mol/lít).

Định luật Bughe – Lămbe – Bia là sự tổ hợp của hai định luật thứ nhất và

thứ hai của sự hấp thụ ánh sáng.

1.2.2. Định luật cộng tính

Định luật cộng tính là một sự bổ sung quan trọng cho các định luật hấp thụ ánh sáng. Định luật cộng tính là cơ sở định lượng cho việc xác định nồng độ của hệ trắc quang nhiều cấu tử.

Bản chất của định luật cộng tính là sự độc lập của đại lượng độ hấp thụ quang của một chất riêng biệt khi có mặt của các chất khác có sự hấp thụ ánh sáng riêng.

8

Biểu diễn tính cộng tính về độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp chứa n cấu tử tại bước sóng

bằng phương trình toán học: n

A λ =A1,λ +A 2,λ +...+A i,λ +...+A n,λ =

A i,λ i=1

Trong đó : A : độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch hỗn hợp chứa n cấu tử ở bước sóng .

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

A i, : độ hấp thụ ánh sáng của cấu tử thứ i ở bước sóng

cấu tử hấp thụ ánh sáng có trong hỗn hợp ; với i = 1 Vì A =

; n là số

n.

.b.C nên ta có:

A λ = ε1,λ .b.C1 +ε 2,λ .b.C2 +...+ε n,λ .b.Cn =

n

ε i,λ .b.Ci

i=1

Định luật cộng tính được phát biểu như sau: “Ở một bước sóng đã cho độ

hấp thụ quang của một hỗn hợp các cấu tử không tương tác hóa học với nhau và bằng tổng độ hấp thụ quang của các cấu tử riêng biệt ở cùng bước sóng này”.

1.2.3. Những nguyên nhân làm cho sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch không tuân theo định luật Bughe – Lămbe – Bia

Xuất phát từ biểu thức của định luật Bughe – Lămbe – Bia A= f( , b, C)

nghĩa là độ hấp thụ quang A là hàm số của ba biến:

). Do đó

mọi sự sai lệch của các tham số này đều có thể đưa đến làm sai lệch quy luật hấp thụ quang, gây

, bao gồm:

-

.

- Các điều kiện đo quang như: bề dày cuvet, độ trong suốt của bề mặt cuvet không thật đồng nhất, bề mặt cuvet gây các hiện tượng quang học phụ như tán xạ, hấp thụ...

9

- Sự có mặt của các chất điện giải lạ trong dung dịch màu làm biến dạng các phần tử hoặc các ion phức màu làm ảnh hưởng đến sự hấp thụ ánh sáng của các tiểu phân hấp thụ ánh sáng.

- Hiệu ứng solvat hóa: sự solvat hóa (hay hydrat hóa) làm giảm nồng độ các phần tử dung môi tự do, do đó làm thay đổi nồng độ của dung dịch màu và làm ảnh hưởng đến sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu.

- Hiệu ứng liên hợp: trong một số trường hợp có sự tương tác của

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

chính các tiểu phân hấp thụ ánh sáng để tạo ra các tiểu phân polime làm thay đổi nồng độ hợp chất màu.

- Ảnh hưởng pH của dung dịch: sự thay đổi nồng độ của ion H+ (tức thay đổi

pH) của dung dịch sẽ ảnh hưởng đến sự tuân theo định luật Bughe – Lămbe – Bia theo các trường hợp sau:

+ Thuốc thử có đặc tính axit: sự thay đổi nồng độ ion H+ làm chuyển

dịch cân bằng tạo thành chất màu.

+ Thay đổi pH kéo theo sự thay đổi thành phần hợp chất màu. + Khi tăng pH phức màu có thể bị phân hủy do sự tạo thành phức hydroxo. + Dưới ảnh hưởng của ion H+ trạng thái tồn tại và màu của dung dịch

cũng thay đổi.

- Ảnh hưởng của sự pha loãng dung dịch phức màu: khi pha loãng các

dung dịch phức màu sẽ gây ra sự lệch khỏi định luật Bughe – Lămbe – Bia. - Nhiệt độ môi trường và dung dịch đo phổ trong cuvet là không hằng

định suốt trong thời gian đo. Vì trong một mức độ nhất định độ hấp thụ quang A phụ thuộc vào nhiệt độ.

1.3. Một số phƣơng pháp xác định đồng thời các cấu tử 1.3.1. Phương pháp Vierordt Để xác định nồng độ của các cấu tử trong hỗn hợp, lần đầu tiên Vierordt đã đo độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp ở các bước sóng khác nhau, sau đó

10

thiết lập hệ phương trình bậc nhất mà số phương trình bằng số ẩn số (số cấu tử trong hỗn hợp), giải hệ phương trình này sẽ tính được nồng độ của các cấu tử. Điều kiện để áp dụng phương pháp này là các cấu tử trong hỗn hợp phải tuân theo định luật Bughe - Lămbe - Bia và thỏa mãn tính cộng tính của độ hấp thụ quang.

Với hỗn hợp chứa n cấu tử ta cần phải lập hệ n phương trình n ẩn. Hệ phương trình này được thiết lập bằng cách đo độ hấp thụ quang của hỗn hợp ở n bước sóng khác nhau.

1)

=

11C1b

+

21C2b

+... +

i1Cib

+...+

n1Cnb

A(

2)

=

12C1b

+

22C2b

+... +

i2Cib

+...+

n2Cnb

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

A(

...

A(

...

n)

=

...

1nC1b

+

...

2nC2b

...

...

+ ... +

...

inCib

...

+... +

...

nnCnb

Trong đó : A( 1), A( 2),..., A( n): độ hấp thụ quang của hỗn hợp ở bước

sóng

1,

bước sóng

in :

2,

. . ., và bước sóng

n.

hệ số hấp thụ mol phân tử của cấu tử i tại bước sóng

n

(được xác

định bằng cách đo độ hấp thụ quang của dung dịch chỉ chứa cấu tử i ở bước sóng

n

).

b: bề dày lớp dung dịch (cm).

Ci: nồng độ của cấu tử thứ i trong hỗn hợp (mol/lít). Với i, j = 1 n.

Giải hệ n phương trình với n ẩn số là C1, C2 . . . Cn sẽ tìm được nồng độ

của các cấu tử. Khi số cấu tử trong hỗn hợp ít thì việc giải hệ n phương trình tuyến tính khá đơn giản. Tuy nhiên khi số cấu tử lớn thì việc giải hệ phương trình phức tạp hơn.

Phương pháp Vierordt chủ yếu được vận dụng để tìm cách giải hệ phương trình như: giải bằng đồ thị, giải bằng phép ma trận vuông, phương pháp khử Gauss, . . . để xác định nồng độ của mỗi cấu tử.

Một số tác giả sử dụng phương pháp Vierordt để xác định đồng thời Acetaminophen và clopheninamin maleat trong thuốc viên nén bằng cách đo độ

11

hấp thụ quang ở các bước sóng 242 và 264 nm, còn một số tác giả khác đã xác định đồng thời axit salixylic và chloramphenilcol bằng cách đo độ hấp thụ quang ở các bước sóng 278nm và 297 nm.[17] Phương pháp Vierordt đơn giản, dễ thực hiện nhưng chỉ áp dụng được khi số cấu tử trong dung dịch hỗn hợp ít, phổ hấp thụ quang phân tử xen phủ nhau không nhiều, tính chất cộng tính độ hấp thụ quang được thoả mãn nghiêm ngặt, thiết bị đo quang tốt thì phương pháp cho kết quả khá chính xác. Đối với

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

hệ nhiều cấu tử, đặc biệt là khi phổ của các cấu tử xen phủ nhau nhiều, tính chất cộng tính độ hấp thụ quang không được thoả mãn nghiêm ngặt, thiết bị đo có độ chính xác không cao thì phương pháp không chính xác và có sai số lớn [17]. Bởi vậy mặc dù phương pháp Vierordt tuy ra đời đã lâu, nhưng ứng dụng trong thực tế còn rất ít. Tuy nhiên đây là cơ sở lý thuyết cơ bản nhất, đặt nền móng cho các nhà khoa học sau này phát triển, cải tiến để xây dựng nên các phương pháp mới.

1.3.2. Phương pháp phổ đạo hàm

Độ hấp thụ quang của các cấu tử là hàm của độ dài bước sóng của ánh

sáng tới A = f( ). Phổ đạo hàm của độ hấp thụ quang theo bước sóng biểu diễn bằng phương trình toán học:

Đạo hàm bậc 1 của độ hấp thụ quang: A 1λ =

dA = f, λ dλ

Đạo hàm bậc 2 của độ hấp thụ quang: A 2λ =

d2A = f ,, λ dλ 2

...

...

...

...

...

...

...

...

Và đạo hàm bậc n của độ hấp thụ quang: A

n λ

...

dn A = n = f (n) λ dλ

Theo định luật Bughe - Lămbe - Bia thì: A 0λ = A = .C.b Với C và b là hằng số, không phụ thuộc vào bước sóng

12

nên:

được

A 1λ =

dA dε = C.b. dλ dλ

Aλ =

d2A d 2ε = C.b. dλ 2 dλ 2

...

...

2

A

n λ

...

dn A dnε = n = C.b. n dλ dλ

Độ hấp thụ quang của dung dịch có tính cộng tính nên: n

n

hon hop

=Aλ

n

Cau tu 1

+Aλ

n

Cau tu 2

+ ... +A λ

Cau tu n

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Aλ

Để tính đạo hàm tại bước sóng

người ta chọn một cửa sổ

n điểm số

liệu từ phổ bậc 0 và một đa thức hồi quy được tính bằng phương pháp bình phương tối thiểu. Đa thức này có dạng: A = a0 + a1. + a2.

2

+ . . . + ak.

k

Các hệ số a0, a1 . . . ak tại mỗi bước sóng tương ứng là các giá trị đạo hàm

bậc 0, 1, 2 . . . k. Để có phổ đạo hàm đối với tập số liệu phổ bậc không, đầu tiên ta phải sử dụng phương pháp hồi quy bình phương tối thiểu để tìm được hàm hồi quy là đa thức bậc cao. Sau đó lấy đạo hàm của hàm này ta sẽ được các phổ đạo hàm.

Đối với phổ đạo hàm bậc 0, 1 . . . n ta thấy có những đặc điểm như sau:

đỉnh của phổ đạo hàm bậc n là điểm uốn của phổ đạo hàm bậc (n - 1), còn tại đỉnh của phổ đạo hàm bậc (n-1) thì phổ đạo hàm bậc n có giá trị bằng 0. Số đỉnh của phổ đạo hàm bậc n nhiều hơn số đỉnh của phổ đạo hàm bậc (n - 1).

Như vậy, dùng phương pháp phổ đạo hàm ta có thể tách phổ gần trùng nhau thành những phổ mới và khi đó ta có thể chọn được những bước sóng mà tại đó chỉ có duy nhất 1 cấu tử hấp thụ quang còn các cấu tử khác không hấp thụ, nhờ đó mà có thể xác định được từng chất trong hỗn hợp. Bằng toán học, người ta xây dựng được phần mềm khi đo phổ của dung dịch hỗn hợp có thể ghi ngay được phổ đạo hàm các bậc của phổ đó. Căn cứ vào các giá trị phổ đạo hàm ta lựa chọn được bước sóng xác định đối với từng cấu tử.

13

Ở nước ta, một số tác giả đã sử dụng phương pháp phổ đạo hàm xác định đồng thời các vitamin tan trong nước cũng như xác định đồng thời các chế phẩm dược dụng khác.

Các kết quả thu được có sai số trong khoảng 1,7

5% [19, 17, 7].

Trên thế giới, phương pháp phổ đạo hàm được ứng dụng để phân tích các chế phẩm dược dụng cũng như hỗn hợp các chất vô cơ, hữu cơ. Hầu hết các kết quả đều cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao. Tuy nhiên phương pháp phổ

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

đạo hàm chỉ được áp dụng khi số cấu tử trong dung dịch ít và phổ hấp thụ quang phân tử của chúng không trùng nhau. [9,12] 1.3.3. Phương pháp lọc Kalman

Thuật toán lọc Kalman đầu tiên được nghiên cứu trong vật lý vô tuyến

nhằm loại bỏ các tín hiệu "nhiễu" và sau đó được ứng dụng vào hoá học trắc quang. Thuật toán lọc Kalman hoạt động trên cơ sở các file dữ liệu phổ ghi được của từng cấu tử riêng rẽ và của hỗn hợp các cấu tử, xác định sự đóng góp về phổ của từng cấu tử trong hỗn hợp tại các bước sóng. Khi chương trình chạy, những kết quả tính toán liên tiếp sẽ càng tiến gần đến giá trị thực. Trong thực tế, người ta sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu để giảm sai số giữa phổ của hỗn hợp với phổ nhân tạo được dự đoán bởi phương pháp lọc Kalman. Kết quả tính toán là lý tưởng khi phổ của hỗn hợp trừ đi phổ nhân tạo được tính bởi lọc Kalman sẽ tạo ra một đường thẳng có độ lệch không đáng kể. Độ đúng của phép xác định phụ thuộc vào độ nhiễu của nền, vào việc tách các đỉnh phổ hấp thụ của các cấu tử và sự tương tác giữa các cấu tử. Hỗn hợp có càng ít cấu tử, các đỉnh hấp thụ càng cách xa nhau thì sai số của phép tính toán sẽ càng nhỏ.

Việc tính toán sẽ được thực hiện trên toàn bộ khoảng bước sóng được chọn. Nếu kết thúc quá trình tính toán, độ lệch chuẩn tương đối của giá trị nồng độ các cấu tử trong hỗn hợp vẫn lớn hơn giá trị sai số cho phép thì nồng độ của cấu tử đó sẽ phải xác định lại. Khi đó, cần phải tăng giá trị sai số mặc định hoặc giảm số giá trị nồng độ mặc định để tính giá trị nồng độ trung bình.

14

Bộ phận tiếp nhận tín hiệu

Tín hiệu cần đo

Các nguồn nhiễu

Bộ lọc

Giá trị đo được

1.1. Mô hình hoạt động của bộ lọc Kalman

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Một số tác giả đã sử dụng thuật toán lọc Kalman để xác định các cấu tử trong hỗn hợp bằng phương pháp trắc quang. Kết quả cho thấy sai số của phép xác định với hỗn hợp 2 cấu tử nhỏ hơn 1%, với hỗn hợp 3 cấu tử có sai số nhỏ hơn 2% [6, 18, 19].

1.4. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải

tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích. Nó áp dụng rất nhiều trong các ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc, máy phân tích HPLC là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.

1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp tách một hỗn hợp chất lỏng dựa trên sự phân bố chúng giữa hai pha, một pha đứng yên gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển gọi là pha động. Do ái lực hấp thụ và giải hấp thụ khác nhau của các hợp phần có trong mẫu phân tích với pha tĩnh và pha động mà chúng di chuyển dọc theo pha tĩnh (cột sắc ký) tốc độ khác nhau nên lần lượt đi ra khỏi cột.

15

1.4.1.1. Pha tĩnh Khái niệm: Pha tĩnh là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách 1 hỗn hợp chất phân tích.

Nó là những chất rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ hạt từ 310 m, diện tích bề mặt thường từ 50-500 m 2 /g.

Phân loại: - Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử.

Tương ứng với loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc kí riêng trong kĩ thuật HPLC.

- Căn cứ theo trạng thái rắn lỏng của pha tĩnh, người ta chia nó thành hai

loại, nếu pha tĩnh là chất rắn ta có sắc kí lỏng rắn (LSC), nếu pha tĩnh là chất lỏng ta có sắc kí lỏng-lỏng (LLC).

- Căn cứ theo độ phân cực của pha tĩnh và pha động, có các loại: sắc ký

pha thuận (pha tĩnh phân cực còn pha động ít phân cực), sắc kí pha đảo (pha tĩnh ít phân cực còn pha động thì phân cực), sắc kí pha đảo tạo cặp ion và sắc kí trao đổi ion.

- Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, người ta chia nó

thành 2 loại là xốp toàn phần hạt và xốp bề mặt hạt (xốp chỉ lớp vỏ ngoài) Điều kiện đối với một pha tĩnh:

- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc kí.

- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc kí nhất định.

- Tính chất bề mặt phải ổn định (đặc biệt là đặc trưng xốp của nó).

- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.

- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất 16

1.4.1.2. Pha động Khái niệm: Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất tan (chất cần phân tích) ra khỏi cột tách để thực hiện quá trình sắc ký. Đây là một yếu tố rất linh động và dễ dàng thay đổi. Nó có thể là một dung môi hoặc hỗn hợp nhiều dung môi trộn lẫn với nhau theo những tỉ lệ nhất định. Nó có thể là dung dịch hoặc các muối có chứa các chất đệm, chất tạo phức... Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

dung môi rửa giải riêng để có được hiệu quả phân tách tốt nhất.

Quá trình rửa giải :

- Rửa giải đẳng dòng: Pha động không thay đổi trong suốt quá trình

rửa giải.

- Rửa giải gradient: pha động liên tục thay đổi (do tỉ lệ tạo nên các thành

phần pha động thay đổi) trong suốt quá trình rửa giải. Lúc này độ phân cực của pha động cũng sẽ bị biến đổi và thường là tăng hiệu quả tách.

Các yếu tố chính cần chú ý trong lựa chọn pha động : - Bản chất của dung môi lựa chọn làm pha động - Thành phần các chất tạo ra pha động

- Tốc độ dòng pha động

- pH của pha động (đặc biệt chú ý ở sắc ký trao đổi ion và sắc ký cặp ion) Điều kiện đối với một pha động : - Phải trơ đối với pha tĩnh.

- Hòa tan được chất cần phân tích.

- Bền vững theo thời gian.

- Có độ tinh khiết cao.

- Phải nhanh đạt các cân bằng trong sắc ký.

- Phù hợp với các loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích.

- Có tính kinh tế và không khan hiếm.

17

Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc kí của một hỗn hợp mẫu. Nó quyết định thời gian lưu giữ các chất mẫu và hiệu quả sự tách sắc ký.

Pha động có thể ảnh hưởng đến: - Độ chọn lọc của hệ pha.

- Thời gian lưu giữ của chất tan.

- Hiệu lực của cột tách.

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

- Độ phân giải các chất trong một pha tĩnh.

- Độ rộng và sự cân đối của pic sắc ký.

Tất cả các dung môi dùng trong HPLC (kể cả pha động) đều được đuổi

khí bằng cách đun nóng, hút chân không, lắc siêu âm... Vì không khí hòa tan trong dung môi sẽ tạo bọt khí trong detector và gây nhiễu tín hiệu.

1.4.2. Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc kí 1.4.2.1. Thời gian lưu và thể tích lưu

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến

khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị nồng độ cực đại và cho ra pic trên sắc kí đồ.

Nếu gọi

t R là thời gian lưu trữ của một chất thì:

t R, = t R - t 0

Trong đó:

t R, : là thời gian lưu thực (thời gian lưu hiệu chỉnh). to : là thời gian chết ( thời gian không lưu trữ).

Trong cùng một điều kiện sắc kí đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu khác nhau tùy thuộc vào bản chất, cấu tạo vào tính chất của chất đó. Vì vậy thời gian lưu là đại lượng định tính các chất.

18

Hình 1.2. Thời gian lưu của cấu tử phân tích

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không đổi thì thời gian lưu có

thể thay thế bằng thể tích lưu. Thể tích lưu là thể tích pha động thu được sau cột trong khoảng thời gian tương ứng với thời gian lưu.

1.4.2.2. Hệ số phân bố

Trong quá trình sắc kí luôn có sự phân bố của chất tan giữa pha động và

pha tĩnh. Sự phân bố này đặc trưng bởi cân bằng phân bố với hệ số phân bố được tính theo công thức sau:

K=

Trong đó :

là nồng độ của chất phân tích tương ứng trong pha tĩnh

và pha động ở thời điểm cân bằng.

1.4.2.3. Hệ số chọn lọc

Hai chất chỉ được tách ra khi chúng có giá trị k' khác nhau, hệ số chọn

lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc kí. α=

=

=

=

Ở đây ta quy ước chất B bị lưu giữ mạnh hơn chất A như vậy hơn 1,

luôn lớn

càng lớn thì khả năng tách của 2 chất càng rõ. Thường phân tích trong

điều kiện

trong khoảng 1,5 đến 2.

1.4.2.4. Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết Hiệu lực cột thường biểu thị qua hai thông số: Số đĩa lý thuyết (N) hoặc chiều cao đĩa lý thuyết (H). Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ở mỗi

19

tầng sự phân bố chất tan vào 2 pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới. Mỗi tầng được giả định như một lớp pha tĩnh có chiều cao H. Đĩa lý thuyết được định nghĩa như một khu vực của hệ thống phân tách mà trong đó thiết lập một cân bằng nhiệt động giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động.

Số đĩa lý thuyết N được tính theo các công thức: hoặc 5,54×

N = 16×

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Trong đó: W là chiều rộng pic ở đáy pic

là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic

Chiều cao của đĩa lý thuyết được tính theo công thức: H=

L N

Trong đó: L là chiều cao cột sắc kí.

Với một điều kiện sắc kí nhất định, chiều cao đĩa lý thuyết (H) và số đĩa

lý thuyết (N) là hằng định đối với mỗi chất phân tích.

1.4.2.5. Độ phân giải ( R S )

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trong

điều kiện sắc kí đã cho. Độ phân giải của hai pic cạnh tranh được tính theo 1 trong 3 công thức sau:

=

hoặc

×

Trong đó: ,

: thời gian lưu tương ứng của chất A, chất B. ,

,

: Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic của chất A, chất B.

: Chiều rộng pic ở đáy pic.

α: Hệ số chọn lọc.

20

1.4.3. Hệ thống máy HPLC Hệ thống máy HPLC có các bộ phận chính sau: - Bình chứa dung môi (pha động).

- Bộ khử khí.

- Bơm cao áp: đẩy pha động qua cột sắc kí.

- Bộ tiêm mẫu: tiêm vào cột một thể tích mẫu nhất định.

- Cột tách (pha tĩnh).

- Detector.

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

- Máy ghi tín hiệu hoặc máy vi tính.

- Máy in.

Hình 1.3. Hình ảnh máy HPLC

1.4.4. Kết quả xác định một số chất theo phương pháp HPLC Ở nước ta, phương pháp HPLC được ứng dụng nhiều trong phân tích các chế phẩm về dược cũng như hỗn hợp các chất vô cơ, hữu cơ. Các kết quả đều cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao.

Phương pháp định lượng đồng thời acetaminophen và axit mefenamic: phương pháp có độ chính xác cao (sai số tương đối 0,51% – 1,42%), độ đúng tốt (tỷ lệ thu hồi 98,16% – 99,16%) [17].

21

Phương pháp định tính và định lượng đồng thời acetaminophen và ibuprofen: phương pháp có độ lặp lại tốt (sai số tương đối 0,81% - 1,03%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 98,0% – 98,4%). [2, 17] Phương pháp định lượng đồng thời acetaminophen và cafein: phương pháp có độ lặp lại tốt (sai số tương đối 0,54% – 1,07%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 98,9% – 99,5%). [2] Phương pháp định lượng đồng thời acetaminophen, phenylpropanolamin

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

hidroclorit và clorphenylamin maleat: phương pháp có độ lặp lại cao (sai số tương đối của acetaminophen là 0,47%; phenylpropanolamin hidroclorid là 0,67% và clorphenylamin maleat là 1,19%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 99,61% – 100,65%). [17]

22

Chƣơng 2 THỰC NGHIỆM 2.1. Nội dung nghiên cứu Áp dụng phương pháp HPLC và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử để xây dựng quy trình xác định đồng thời acetaminophen, codein phosphat trong thuốc actadol codein trên thị trường.

2.1.1. Phương pháp HPLC

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Lựa chọn các thông số của máy HPLC: - Thể tích bơm mẫu.

- Cột tách.

- Nhiệt độ.

Khảo sát để lựa chọn các điều kiện sắc ký:

- Bước sóng thích hợp để phát hiện đồng thời 2 chất.

- Pha động: thành phần, tỷ lệ pha động, tốc độ dòng...

Đánh giá quy trình sắc ký đã xây dựng được:

- Khảo sát tính thích hợp của hệ thống.

- Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất.

- Khảo sát độ chính xác của phương pháp.

- Khảo sát độ đúng của phương pháp.

Xác định đồng thời ACT và CĐI trong thuốc Actadol codein theo

phương pháp HPLC. 2.1.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử - Tiến hành quét phổ từ 200 nm đến 900 nm để xác định kiểm tra lại bước sóng hấp thụ quang cực đại của

ACT và CĐI.

- Khảo sát sự ổn định độ hấp thụ quang của ACT, CĐI theo môi trường nền, pH, thời gian, nhiệt độ để lựa chọn khoảng thời gian, nhiệt độ và pH .

23

- Khảo sát khoảng tuyến tính của ACT, CĐI từ đó xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).

ACT và CĐI

-

ACT: CĐI

.

- Xây dựng quy trình phân tích mẫu thuốc Actadol codein,

.

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

- Định lượng đồng thời ACT và CĐI trong mẫu thuốc Actadol codein [5, 8, 10, 14, 16].

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

ACT, CĐI

ACT và CĐI

[3, 4, 20, 22, 23].

2.2.2.1. Phương pháp HPLC -

ACT, CĐI và hỗn hợp dung dịch

.

- Tiến hành chạy sắc kí theo các nội dung đã trình bày ở mục 2.1.1 - Xác định đồng thời các cấu tử trong hỗn hợp và trong mẫu thuốc

Actadol codein

2.2.2.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử -

ACT, CĐI

- Xác định

ACT và CĐI.

-

.

.

2

Actadol codein.

giá độ tin cậy của quá trình phân tích,

-

để tính toán các kết quả thí nghiệm của luận văn 24

2.3. Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích 2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD) LOD được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích cho tín : LOD =

3.SD B

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Trong đó: SD: độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đường chuẩn.

B: độ dốc của đường chuẩn chính là độ nhạy của phương pháp trắc quang.

2.3.2. Giới hạn định lượng (LOQ)

với tín hiệu nền và đạt độ tin cậy tối thiểu

95%, thông thường người ta sử

dụng công thức:

LOQ =

10.SD B

2.3.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp

ACT và CĐI

-

tự pha chế thông qua sai số tương đối RE. Sai số tươ

: RE% =

CTinh toan - C0 C0

.100%

Trong đó: RE% là sai số tương đối của phép xác định nồng độ các cấu tử.

CTinh toan (µg/mL)

.

ACT và CĐI trong hỗn hợp.

C0 (µg/mL)

25

thông qua độ thu : Re v =

C T - Ca .100% a

Trong đó: CT: nồng độ (µg/mL

CĐI xác định

ACT

được trong mẫu sau khi thêm chuẩn; Ca: nồng độ (µg/mL

CĐI

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

ACT ho

.

a: nồng độ (µg/mL

ACT

CĐI thêm vào mẫu

(đã biết).

-

(RSD).

n

Ci -μ

S=

i=1

k

RSD =

n

2

=

Ci -C

2

i=1

k

S .100 (%) C

Trong đó: Ci

(µg/mL)

ACT

CĐI

tính được lần thứ i;

là giá trị nồng độ thực của mẫu;

C là giá trị nồng độ trung bình tính được sau n lần xác định;

k là số bậc tự do.

2.3.4. Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê Khoảng tin cậy của phép xác định nồng độ được tính theo công thức:

X ±ε=X ±

t P,k .S n

Với tP, k là hệ số phân bố chuẩn Student ứng với xác suất P và bậc tự do k được tra trong bảng (t0,95; 3 = 3,18; t0,95; 4 = 2,78; t0,95; 5 = 2,57 ); X

26

; S là độ lệch chuẩn, n là số

trung b phép đo.

2.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 2.4.1. Thiết bị

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi L-2000 với detector UV-VIS thuộc

-

– Đại học Thái Nguyên.

–

-

thuộc

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

– Đại học Thái Nguyên, có khả năng quét phổ trong khoảng bước sóng 190nm – 900 nm, có kết nối máy tính.

- Bộ cuvet thạch anh.

- Cân điện tử có độ chính xác 0,0001g.

- Bếp cách thủy.

- Máy rung siêu âm.

- Máy đo pH.

2.4.2. Dụng cụ

- Pipet các loại: 1 mL; 2 mL; 5 mL; 10 mL; 20 mL; 25 mL.

- Bình định mức dung dịch: 10 mL; 25 mL; 50 mL; 100 mL; 250 mL;

500 mL; 1000 mL.

- Cốc thủy tinh, phễu thủy tinh, ống nghiệm...

- Chương trình lọc Kalman tính toán đồng thời nồng độ các cấu tử [18,19].

2.4.3. Hóa chất

- HCl, H2SO4, HNO3, H3PO4, KH2PO4,... dùng để pha chế các dung dịch

đều thuộc loại tinh khiết của Merck.

- Nước cất 2 lần - Chất chuẩn acetaminophen và codein phot phat nguyên chất do viện kiểm nghiệm dược sản xuất.

- Thuốc viên Actadol codeine sản xuất bởi Công ty TNHH một thành viên dược phẩm và sinh học y tế Quận Tân Phú, TP. Hồ Chí Minh; Số lô: III18; Ngày sản xuất: 08/3/2014; Hạn sử dụng: 08/3/2017.

27

2.4.4. Chế phẩm actadol codeine Thành Phần: Mỗi viên nén chứa: Acetaminophen : 500mg Codein phosphat: 8mg

Hình 2.1. Chế phẩm thuốc Actadol codein

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

2.5. Chuẩn bị các dung

, chúng tôi đã sử dụng các dung môi sau:

- Dung dịch đệm KH2PO4 .

- Dung dịch pha động.

- Dung dịch HCl 10-1M; 10-2M; 10-3M.

- Dung dịch H2SO4 5.10-2M; 5.10-3M; 5. 10-4M.

- Dung dịch HNO3 10-1M; 10-2M; 10-3M.

Dung dịch đệm KH2PO4 được chuẩn bị bằng cách Hòa tan 2,04 g kali

dihydrophosphat trong 950 mL nước cất 2 lần. Thêm 1mL triethylamin, điều chỉnh về pH = 2,5 bằng axit phosphoric pha loãng với nước cất 2 lần định mức thành 1000 mL và trộn đều.

Dung dịch pha động chuẩn bị bằng cách lấy dung dich đệm KH2PO4 có

lẫn triethylamin và acetonitrile ở các tỷ lệ về thể tích từ 85:15 đến 95:5.

Lấy 41,8 mL 500 mL thu được dung dịch HCl 0,001M. Lấy 5,5 mL dung dịch H2SO4 97% 100 mL thu được dung dịch H2SO4 H2SO4 0,05M; H2SO4

2SO4

0,0005M.

28

Lấy 7 mL dung dịch HNO3 100 mL thu được dung dịch HNO3

3

0,001M..

Các dung dịch đã được kiểm tra lại pH bằng phương pháp chuẩn độ

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

axit- Bazơ

29

Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phƣơng pháp HPLC 3.1.1. Xây dựng điều kiện để xác định đồng thời 2 chất ACT và CĐI Qua việc nghiên cứu tính chất lý hóa của 2 chất ACT và CĐI kết hợp với tài liệu tham khảo và điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn kiểu sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC), sử dụng cột silica C18, thể tích

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

bơm mẫu là 20 µL, nhiệt độ 30oC.

3.1.1.1. Khảo sát lựa chọn pha động

Để chọn được pha động thích hợp, chúng tôi đã tiến hành khảo sát tỉ lệ thành

phần pha động là hỗn hợp đệm KH2PO4 có lẫn triethylamin : acetonitrile ở các tỷ lệ về thể tích lần lượt là: 85:15 cho đến 95:5 với tốc độ dòng là 1,5 mL/phút. Các dung dịch được lọc qua màng lọc 0,45 µm sau đó rung siêu âm để khử bọt khí.

Sự thay đổi tỉ lệ thành phần pha động làm thay đổi đáng kể kết quả sắc

ký. Tuy nhiên tỷ lệ hỗn hợp đệm KH2PO4 có lẫn triethylamin : acetonitrile 93:7 cho kết quả tốt nhất với thời gian lưu của ACT là 8,243 giây CĐI là 9.237 giây Vì vậy, chúng tôi chọn pha động để xác định đồng thời 2 chất là hỗn hợp

đệm KH2PO4 có lẫn triethylamin : acetonitrile với tỷ lệ thể tích là 93:7.

3.1.1.2. Lựa chọn bước sóng

Việc lựa chọn bước sóng dựa trên cơ sở các tài liệu tham khảo kết hợp

với khảo sát thực nghiệm tại 2 bước sóng λ = 243 nm và λ = 214 nm.

Tại λ = 243 nm: là bước sóng tại đó ACT có độ hấp thụ quang cực đại,

CĐI có độ hấp thụ quang trung bình. Tuy nhiên kết quả thực nghiệm cho thấy các pic của ACT và CĐI hầu như không xuất hiện.

Tại λ = 214 nm: là bước sóng ACT có độ hấp thụ quang cực tiểu, CĐI có độ hấp thụ quang trung bình. Kết quả thực nghiệm cho thấy đường nền thẳng, xuất hiện cả 2 pic với thời gian lưu phù hợp. Kết quả được thể hiện ở các hình 3.1, 3.2.

30

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T Hình 3.1. Sắc kí đồ của ACT (500 µg/mL)

Hình 3.2. Sắc kí đồ của CĐI (8 µg/mL)

Vì vậy, chúng tôi lựa chọn bước sóng λ = 214 nm để tiến hành phân tích.

3.1.1.3. Lựa chọn tốc độ dòng

Để lựa chọn được tốc độ dòng thích hợp, chúng tôi tiến hành sắc ký với

các điều kiện ở trên nhưng với các tốc độ dòng là 1 mL/phút, 1,5 mL/phút và 2 mL/phút.

Với tốc độ dòng 1 mL/phút, đỉnh của các pic bị tù.

Với tốc độ dòng 1,5 mL/phút, kết quả tách tốt, các pic tách rời nhau và thời gian chạy sắc ký phù hợp.

Với tốc độ dòng 2 mL/phút, các pic có đỉnh nhọn, thời gian lưu ngắn và chân pic hẹp.

31

Vì vậy, chúng tôi lựa chọn tốc độ dòng là 1,5 mL/phút để tiến hành phân tích sắc ký.

Kết luận chung: Từ các kết quả trên, chúng tôi lựa chọn điều kiện tối ưu cho phương pháp xác định đồng thời ACT và CĐI là: Pha động: hỗn hợp đệm KH2PO4 có lẫn triethylamin : acetonitrile với tỷ lệ thể tích là 93:7.

Detector UV-VIS: λ = 214 nm.

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Cột: sử dụng cột C18 (250mm x 4,6).

Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút.

Thể tích bơm mẫu: 20 µL. Nhiệt độ phân tích: 30oC.

Với các điều kiện trên, chúng tôi đã tiến hành phân tích và kết quả sắc ký

được thể hiện ở hình 3.3.

Hình 3.3. Sắc kí đồ của ACT (1) và CĐI (2) Kết quả phổ ở hình 3.3 cho thấy 2 pic đều được tách ra hoàn toàn, các pic gọn và cân đối, thời gian lưu của 2 chất là hợp lý với thời gian lưu của ACT là 8,243 phút, CĐI là 9,237 phút.

32

3.1.2. Đánh giá phương pháp định lượng 3.1.2.1. Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp chuẩn Dung dịch ACT 1: Cân chính xác 100 mg ACT cho vào bình định mức 100 mL, bổ sung thêm 50 mL dung dịch pha động, sau đó đem rung siêu âm trong 10 phút rồi định mức tiếp đến vạch, thu được dung dịch ACT có nồng độ là 1000 µg/mL (gọi là dung dịch ACT 1). Pha loãng dung dịch ACT 1 bằng dung dịch pha động thu được các dung dịch ACT có nồng độ 900 µg/mL, 700 µg/mL, 500

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

µg/mL, 300 µg/mL và 100 µg/mL. Dung dịch CĐI 1: Cân chính xác 80 mg CĐI cho vào bình định mức 100

mL, hòa tan bằng 50mL dung dịch pha động sau đó đem rung siêu âm trong 10 phút rồi định mức tiếp đến vạch, thu được dung dịch CĐI có nồng độ 800 µg/mL, tiếp tục pha loãng bằng dung dịch pha động thu được dung dịch CĐI có nồng độ 80 µg/mL (gọi là dung dịch CĐI 1). Pha loãng dung dịch CĐI 1 bằng dung dịch pha động thu được các dung dịch CĐI có nồng độ 12 µg/mL, 10 µg/mL, 8 µg/mL, 6 µg/mL và 4 µg/mL

Dung dịch mẫu giả: lấy lần lượt 12,5 mL dung dịch ACT 1; 2,5 mL dung

dịch CĐI 1 cho vào bình định mức 25 mL và định mức bằng dung dịch pha động được dung dịch mẫu giả có nồng độ: ACT : CĐI = 500 : 8 (µg/mL).

Các dung dịch được lọc qua màng lọc 0,45 µm.

3.1.2.2. Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống

Để khảo sát tính thích hợp của hệ thống máy HPLC khi phân tích định

lượng ACT và CĐI. Chúng tôi tiến hành khảo sát các đại lượng đặc trưng như: số đĩa lý thuyết, độ phân giải, thời gian lưu, diện tích pic qua việc bơm lặp lại 4 lần dung dịch chuẩn để sắc ký. Kết quả được chỉ ra ở bảng 3.1; 3.2 và 3.3.

Bảng 3.1. Giá trị các đại lƣợng đặc trƣng Hoá chất

Số đĩa lý thuyết ( N )

CĐI

10533

ACT

3405

33

Độ phân giải ( RS ) 2,15

Kết quả ở bảng 3.1, 3.2 và 3.3 cho thấy: các thông số hệ thống như số đĩa lý thuyết và độ phân giải nằm trong giới hạn cho phép [17]. Chỉ số %RSD của diện tích pic và thời gian lưu được tìm thấy đều nhỏ hơn 2%. Vì vậy hệ thống sắc ký đảm bảo tính thích hợp với cả 2 chất phân tích.

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thời gian lƣu Lần bơm

CĐI Thời gian lưu (phút) 9,237

Số liệu thống kê

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1

ACT Thời gian lưu Số liệu thống (phút) kê 8,297 X = 8,257 8,243 S = 0,030 8,227 %RSD= 0,36 8,260

2 3 4

9,240 9,237

X = 9,235

S = 0,006

%RSD= 0,06

9,227

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát diện tích pic

Lần bơm 1 2 3 4

ACT Diện tích pic Số liệu thống kê (mAuxphút) 5467,3 X = 5465,5 5472,0 S = 8,34 5469,3 %RSD=0,15 5453,3

CĐI

Diện tích pic (mAuxphút) 157,2 157,5 156,4

Số liệu thống kê X = 157,2

S = 0,57

%RSD= 0,36

157,7

3.1.2.3. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp Độ tuyến tính được khảo sát trên dung dịch các chất chuẩn với các nồng độ khác nhau: Các dung dịch ACT có nồng độ từ 100 - 900 µg/mL, CĐI có nồng độ từ 4 - 12 µg/mL được pha loãng từ dung dịch ACT 1 và CĐI 1 bằng dung dịch pha động như ở mục 3.1.2.1

34

Tiến hành chạy sắc ký lần lượt từng dung dịch theo điều kiện sắc ký đã chọn ở trên. Xác định được sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan R2.

Kết quả khảo sát độ tuyến tính của 2 chất được trình bày ở bảng 3.4 Bảng 3.4. Mối tƣơng quan giữa nồng độ và diện tích pic của ACT và CĐI ACT 2 300

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Dung dịch 1 3 4 5 Nồng độ (µg/mL) 100 500 700 900 Diện tích 1114,7 3353,4 5467,2 7602,2 9647,7 (mAuxphút) Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 10,657x +108,34 với R2 = 0,9998 CĐI Dung dịch 1 2 3 4 5 Nồng độ (µg/mL) 4 6 8 10 12 Diện tích 78,64 118,2 157,0 197,9 241,0 (mAuxphút) Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 20,22x – 3,192 với R2 = 0,9996 Từ kết quả ở bảng 3.4. Biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic ACT và

CĐI theo nồng độ. Kết quả được thể hiện ở hình 3.4 và 3.5 .

Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của ACT

35

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của CĐI

Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.4 , hình 3.4 và hình 3.5 ta thấy diện tích

pic của ACT và CĐI phụ thuộc tuyến tính tốt theo nồng độ được thể hiện ở phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số R2

3.1.2.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp sắc ký Pha các dung dịch mẫu giả như ở mục 3.1.2.1

Đo các dung dịch mẫu giả trên trong điều kiện sắc ký đã chọn, so sánh

diện tích pic từ phương trình đường chuẩn và dung dịch mẫu giả trong cùng điều kiện. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.5.

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại

Mẫu

Chuẩn 1 2 3 4 Số liệu thống kê

ACT Diện tích pic Hàm lượng (mAuxphút) (µg/mL) 5436.8 500 5427,5 499,14 5426,3 499,03 5408,9 497,43 5440,2 500,31 X = 498,98 S = 1,18 %RSD = 0,24 µ = 498,98 1,88

36

CĐI

Diện tích pic (mAuxphút) 158,57 157,78 158,77 157,97 158,37

Hàm lượng (µg/mL) 8,00 7,96 8,01 7,97 7,99 X = 7,98 S = 0,02 %RSD = 0,28 µ = 7,98 0,04

Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.5 cho thấy độ lệch chuẩn tương đối %RSD của cả 2 chất phân tích đều nhỏ hơn 2% (ACT: 0,24%; CĐI: 0,28%) và sai số tương đối nhỏ. Như vậy, phương pháp sắc ký định lượng đồng thời cả 2 chất có độ lặp lại cao.

3.1.3. Xác định ACT và CĐI trong thuốc Actadol codein Cân chính xác 20 viên thuốc Actadol codein ( m = 0,5826g, mỗi viên có chứa 500 mg ACT và 8 mg CĐI), sau đó tính khối lượng trung bình của viên

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột thuốc tương đương với 100 mg ACT và 1,6 mg CĐI cho vào bình định mức 100 mL sau đó định mức bằng dung dịch pha động và rung siêu âm trong 15 phút ta được dung dịch chứa ACT 1000 µg/mL và CĐI 16 µg/mL. Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm.

Pha loãng 2 lần dung dịch bằng dung dịch pha động thu được dung dịch chứa ACT 500 µg/mL và CĐI 8 µg/mL.

Đo các dung dịch trên trong điều kiện sắc ký đã chọn, căn cứ vào diện

tích pic thu được, sử dung phương trình đường chuẩn để xác định hàm lượng ACT và CĐI.

Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.6.

Bảng 3.6. Kết quả phân tích thuốc Actadol codein CĐI

ACT

Lƣợng cân

Hàm lượng

Diện

Hàm lượng

(mg/viên)

tích pic

(mg/viên)

5420,6

498,51

158,17

7,98

115,9

5409,4

497,48

157,78

7,96

3

116,6

5443,6

500,62

158,77

8.01

4

116,1

5418,9

498,35

157,97

7,97

STT

(mg)

Diện tích pic

1

116,2

2

Số liệu thống kê

X = 498,74

X = 7,98

S = 1,15

S = 0,02

%RSD = 0,23

%RSD = 0,23

37

Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.6 cho thấy độ lệch chuẩn tương đối %RSD của cả 2 chất phân tích đều nhỏ hơn 2% (ACT: 0,23% ; CĐI: 0,23%) Điều đó chứng tỏ thuốc Actadol codein do công ty TNHH một thành viên dược phẩm và sinh học y tế Quận Tân Phú, TP. Hồ Chí Minh sản xuất đáp ứng được các yêu cầu chất lượng theo tiêu chuẩn dược phẩm Việt Nam. 3.1.4. Khảo sát độ đúng của phép xác định ACT và CĐI theo phương pháp thêm chuẩn Độ đúng của phương pháp được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn.

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Cân chính xác 0.5826 g thuốc bột Actadol codein (chứa 500 mg ACT và 8 mg CĐI), bổ sung thêm một lượng chất chuẩn ACT và một lượng chất chuẩn CĐI rồi trộn đều. Pha các dung dịch như ở mục 3.1.3

Đem các dung dịch sắc ký trong cùng điều kiện với dung dịch chuẩn, lặp

lại thực nghiệm với 4 lần cân khác nhau.

Dựa vào hàm lượng các chất đã biết trong mẫu thử, lượng các chất chuẩn

thêm vào và căn cứ diện tích pic của dung dịch thêm chuẩn và dung dịch thử, áp dụng phương trình đường chuẩn tính được lượng ACT và CĐI tìm thấy so với lượng thêm vào. Kết quả khảo sát được thể hiện ở bảng 3.7.

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ đúng

Chất chuẩn ACT

CĐI

Mẫu

CK (mg)

C (mg/)

CT (mg)

1 498,74 100,0 598,64 2 498,74 100,0 598,24 3 498,74 100,0 598,04 4 498,74 100,0 598,34 Số liệu thống kê: X = 99,6% ; S = 0,22 ; %RSD = 0,22% 1 7,98 1,00 8,960 2 7,98 1,00 8,966 3 7,98 1,00 8,973 4 7,98 1,00 8,979 Số liệu thống kê: X = 99,2% ; S = 0,44 ; %RSD = 0,45%

Rev(% ) 99,9 99,5 99,3 99,6 99,0 98,7 99,3 99,9

Trong đó: CK là hàm lượng chất chuẩn xác định được trước khi thêm chuẩn.

C là hàm lượng chất chuẩn thêm vào mẫu.

CT là hàm lượng chất xác định được sau khi thêm chuẩn.

Rev(%) là độ thu hồi.

38

Nhận xét : Từ kết quả ở bảng 3.7 cho thấy, độ thu hồi trung bình của ACT là 99,6% và CĐI là 99,2%. Độ lệch chuẩn tương đối của cả 2 chất đều nhỏ hơn 2%. Do đó phương pháp sắc ký đạt yêu cầu về độ đúng.

3.2. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử 3.2.1 Khảo sát phổ hấp thụ phân tử của ACT và CĐI Để xác định được ACT và CĐI bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử thì ACT và CĐI phải hấp thụ quang trong khoảng bước sóng khảo sát.

Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát phổ hấp thụ phân tử và bước sóng cực đại

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

của ACT và CĐI.

ACT

8 µg/mL, CĐI

10 µg/mL, t

900 nm.

của ACT, và CĐI ở bước sóng

205 -

3.6.

3.6. Phổ hấp thụ của các dung dịch chuẩn ACT(8µg/mL và CĐI(10 µg/mL) Từ kết quả thu được cho thấy ACT có độ hấp thụ quang cực đại tại λ = 243 nm, CĐI có độ hấp thụ quang cực đại tại λ = 210. trong khoảng bước sóng 290 - 900 nm nhận thấy ACT và CĐI gần như không 39

hấp thụ ánh sáng. Mặt khác ở 200 – 210 210 3.2.2. Kiểm tra sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACT và CĐI vào pH Chúng tôi kiểm tra sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào pH dựa theo các tài liệu của một số tác giả [1,4].

ACT có nồng độ 8 µg/mL, 9

Pha 2 mẫu dung dịch CĐI có nồng độ 10 µg/mL

HCl, H2SO4,

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

HNO3 có pH=1, pH=2, pH=3.

243 nm, của CĐI

ACT

ệt độ 300C.

210

ACT và CĐI

.

Bảng 3.8. Độ hấp thụ quang của ACT và CĐI

Môi trƣờng Mẫu

1

2

3

4

5

6

7

8

9

pH

1

2

3

1

2

3

1

2

3

HCl

H2SO4

HNO3

ACT 0,496 0,496 0,497 0,497 0,503 0,504 0,496 0,501 0,502

A

CĐI

0,559 0,558 0,557 0,558 0,558 0,560 0,561 0,555 0,562 : Từ kết quả thu được ở bả

ACT và CĐI

tương đối

:đ

ong môi trường axit. Kết

quả khảo sát phù hợp với các nghiên cứu trước đây [1, 4].

ACT và CĐI là dung dịch HCl 0,1M. 3.2.3. Kiểm tra sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACT và CĐI theo thời gian ACT và CĐI

ACT và CĐI .

40

Pha các dung

CĐI

ACT

lượt là 8 µg/mL; 10 µg/mL. Đ

ng . Lấy giá trị trung bình (3 lần đo) ở bước sóng cực

210 -

đại của ACT (243 nm) và CĐI (210

3.9.

ACT và CĐI theo thời gian

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0,496 0,497 0,497 0,498 0,497 0,497 0,498 0,497 0,497 0,558 0,558 0,559 0,559 0,558 0,559 0,557 0,557 0,557

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Thời gian (phút) ACT A CĐI Thời gian (phút) ACT A CĐI

50

55

60

65

70

75

80

85

90

0,498 0,498 0,499 0,499 0,498 0,497 0,498 0,498 0,498 0,558 0,558 0,559 0,559 0,558 0,558 0,559 0,559 0,559

Nhận xét:

gian 90 phút sau khi pha, độ hấp thụ quang của các dung dịch ACT và CĐI 5

2

. Như vậy, có thể nói các dung dịch ACT và

CĐI có độ hấp thụ quang ổn định trong khoảng thời

20 90 phút sau khi

pha. Kết quả khảo sát phù hợp với các nghiên cứu đã có [1,4].

20

4

.

3.2.4. Kiểm tra sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACT và CĐI theo nhiệt độ ACT và CĐI

210 –

8 µg/mL; 10 µg/mL

25-50 0 C. Độ hấp thụ quang trung bình

(3 lần đo) ở bước sóng cực đại của ACT (243nm) và CĐI (210 3.10.

ACT và CĐI theo nhiệt độ Nhiệt độ (0C) A

25

30

35

40

45

50

ACT

0,496

0,496

0,497

0,496

0,497

0,497

CĐI

0,558

0,559

0,558

0,558

0,559

0,559

41

Nhận xét:

3.10 25 đến 500C. Do đó chúng tôi lựa

ACT và CĐI

chọn nhiệt độ thích hợp để tiến hành thí nghiệm là ở nhiệt độ phòng (25 ÷ 350C).

0,1M;

20

(25 350C), khoảng bước sóng đo quang là 210 290 nm. Kết quả khảo sát phù hợp với các nghiên cứu đã có [1, 4].

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

3.2.5. Khảo sát khoảng tuyến tính tuân theo định luật Bughe – Lambe – Bia của ACT và CĐI. Xác định chỉ số LOD và LOQ ACT

ACT

0,2 40 µg/mL

210 - 290 nm, thời gian 30 phút sau khi pha tại nhiệt độ phòng. Kết quả đo quang (trung bình của 3 lần đo) của một số dung dịch được thể hiện ở hình 3.7.

Hình 3.7. Phổ hấp thụ quang của ACT ở các nồng độ 0,2

40,0 g/mL ACT ở các nồng

độ 0,2

40,0 ( g/mL) tại bước sóng cực đại là 243 3

.

42

Bảng 3.11.

ACT

CACT ( g/mL) A(

243nm)

CACT ( g/mL) A(

243nm)

0,2

0,6

1,0

2,0

5,0

0,017

0,057

0,071

0,119

0,297

8,0

10,0

20,0

30,0

40,0

0,496

0,623

1,268

1,857

2,454

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

ACT thu được hình 3.8.

3.8.

ACT

Nhận xét

3.11, hình 3.7 và 3.8 cho thấy: Khi nồng độ

ACT trong khoảng từ 0,2÷ 30 ( g/mL

ACT lớn hơn 30 g/mL ACT tuân theo định luật Bughe - Lămbe - Bia trong khoảng nồng độ 0,2

30 ( g/mL).

ACT 3.8 ACT 0,2 40,0 µg/mL

43

, tro

=0,9999

(B = 0,0054).

0,2 µg/mL đ

(A= 0,017 0,2 5µg/mL .

ACT

3.12.

ACT SD

LOD

LOQ

0,0054

1,7.10-4

0,094 ( g/mL)

0,315 ( g/mL)

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

B

:

ACT

0,1M là

0,2 40 µg/mL, giá trị LOD là 0,094 ( g/mL) và LOQ là 0,315 ( g/mL).

3.2.5.3. Khảo sát khoảng tuyến tính của CĐI

Pha một dãy dung dịch CĐI có nồng độ tăng dần từ 0,2 40 g/mL. Tiến

hành đo độ hấp thụ quang củ

210-290 n

hình 3.9.

Hình 3.9. Phổ hấp thụ quang của CĐI ở các nồng độ 0,2 Bảng 3.13

của dung dịch CĐI ở các nồng

độ 0,2 – 40 g/mL tại bước sóng cực đại là 210 nm 3.13

40 g/mL

3

.

44

CĐI theo nồng độ CCĐI( g/mL)

0,2

0,6

1,0

2,0

5,0

A(λ = 210 nm)

0,014

0,039

0,062

0,126

0,284

CCĐI( g/mL)

8,0

10,0

20,0

30,0

40,0

A(λ = 210 nm)

0,445

0,559

1,152

1,678

2,231

CĐI

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

3.10.

Hình 3.10. Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng độ CĐI

Nhận xét:

3.13, hình 3.10 cho th : Khi nồng

độ CĐI trong khoảng từ 0,2÷ 30 ( g/mL) thì độ hấp thụ quan 30 o định luật Bughe - Lămbe - Bia trong khoảng nồng độ 0,2

30 ( g/mL).

CĐI 3.10 0,2

CĐI

40,0 g/mL

45

(R2 = 0,9998);

(B = 0,0072

CĐI

0,2 g/mL

(A = 0,014 CĐI

từ 0,2

5,0 g/mL 3.14.

Bảng 3.14. Kết quả tính LOD và LOQ của CĐI SD

LOD

LOQ

0,0072

3,6.10-4

0,15 ( g/mL)

0,5 ( g/mL)

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

B

: Khoảng tuyến tính của CĐI trong môi trường HCl 0,1M là

0,2

40,0 g/mL, giá trị LOD là 0,15 ( g/mL) và LOQ là 0,5 ( g/mL).

3.2.6. Khảo sát và đánh giá độ tin cậy của phương pháp nghiên cứu trên các mẫu tự pha

ACT

CĐI

pha

ACT

CĐI

1/150, các thể tích VACT và VCĐI được lấy như bảng 3.15

CĐI /CACT

và định mức bằng dung dịch HCl 0,1M trong bình định mức 25 mL. 3.15. Pha

Mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9

CCĐI/CACT 1/1 1/5 1/10 1/15 1/20 1/40 1/60 1/100 1/150

CCĐI 8,0 2,0 0,8 0,4 0,4 0,2 0,1 0,1 0,1

ACT

CACT 8,0 10,0 8,0 6,0 8,0 8,0 6,0 10,0 15

46

CĐI

VCĐI(1)

VCĐI(2)

VCĐI(3)

VACT

(mL)

(mL)

(mL)

(mL)

5,0 2,5 2,5 2,5

8,0 4,0 4,0 -

8,0 2,0 -

8,0 10,0 8,0 6,0 8,0 8,0 6,0 10,0 15

: VCĐI(1), VCĐI(2), VCĐI(3), là thể tích (mL) dung dịch CĐI tương ứng với các nồng độ 1 µg/mL, 2,5 µg/mL, 25 µg/mL. VACT là thể tích (mL) dung dịch ACT

25 µg/mL. ỗn hợp trong khoảng bước

sóng 210 290 nm; cứ 0,5 nm lấy 1 giá trị. Từ số liệu đo quang tiến hành tính hàm lượng ACT, CĐI theo chương trình lọc Kalman [9].

CĐI được trình bày ở bảng 3.16.

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

ACT 3.16

ACT

CĐI

Mẫu

CCĐI/CACT

C0CĐI

C0ACT

CCĐI

CACT

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1/1 1/5 1/10 1/15 1/20 1/40 1/60 1/100 1/150

8,0 2,0 0,8 0,4 0,4 0,2 0,1 0,1 0,1

8,0 10,0 8,0 6,0 8,0 8,0 6,0 10,0 15

7,98 1,99 0,78 0,39 0,38 0,17 0,08 0,07 0,06

8,03 10,02 7,95 5,99 7,98 7,99 5,97 9,98 14,96

RE% CCĐI -0,25 -0,5 -1,5 -2,5 -5,0 -15 -20 -30 -40

RE% CACT 0,4 0,2 -0,6 -0,2 -0,3 -0,1 -0,5 -0,2 -0,3

:

C0ACT và C0CĐI (μg/mL) là hàm lượng ACT, CĐI

.

CACT và CCĐI (μg/mL) là hàm lượng ACT, CĐI xác định được theo

phương pháp lọc kalman.

RE% CCĐI và RE% CACT là sai số phép xác định hàm lượng ACT và CĐI. Nhận xét: Kết quả thu được ở bảng 3.16 cho thấy khi hàm lượng ACT lớn hơn CĐI (nhỏ hơn 1%). Vì vậy không xác định được hàm lượng của CĐI trong hỗn hợp ACT và CĐI khi hàm lượng ACT lớn hơn hàm lượng CĐI 40 lần

47

3.2.7. Xác định hàm lượng ACT và CĐI trong thuốc Actadol codein -

CĐI trong thuốc viên nén

ACT

Actadol codein sản xuất bởi công ty TNHH một thành viên dược phẩm và sinh học y tế Quận Tân Phú, TP. Hồ Chí Minh - Việt Nam; Số lô: III-18; Ngày sản xuất: 08/3/2014; Hạn sử dụng: 08/3/2017. Thành phần theo công bố là 500 mg ACT và 8 mg CĐI trong 1 viên.

- Xử lý mẫu thuốc: Cân 20 viên thuốc, tính khối lượng trung bình mỗi

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

viên ( m = 0,5826g). Đem nghiền nhỏ thành bột mịn rồi lấy chính xác một lượng bột tương đương 1/10 viên (chứa 50 mg ACT và 0,8 mg CĐI) cho vào bình định mức 100 mL, định mức bằng dung dịch HCl 0,1M sau đó rung siêu âm khoảng 15 phút. Đem lọc, bỏ khoảng 40 mL dung dịch đầu, lấy 5 mL dung dịch lọc đem định mức thành 100 mL thu được dung dịch chứa hàm lượng tương đương ACT là 25 g/mL và CĐI 0,4 g/mL gọi đó là dung dịch gốc.

Sau đó tiếp tục lấy các thể tích dung dịch gốc 10 mL, 9 mL, 8 mL, 7 mL,

6 mL pha loãng bằng dung dịch HCl 0,1M và định mức thành 25mL thu được dung dịch thuốc có tỉ lệ nồng độ ACT: CĐI như bảng 3.17.

thụ quang trên máy UV-VIS 1700

-

SHIMADZU trong khoảng bước sóng từ 210 - 290 nm,

.

-

quả ở bảng 3.17.

Bảng 3.17. Kết quả tính nồng độ, sai số ACT và CĐI trong mẫu thuốc Actadol codein Mẫu

m0ACT

m0CĐI

mACT

mCĐI

1 2 3 4 5

500 500 500 500 500

8,00 8,00 8,00 8,00 8,00

505,2 500,5 499,9 501,1 498,8

7,5 7,11 7,19 6,93 5,67

48

RE% CACT 1,04 0,10 -0,02 0,22 -0,24

RE% CCĐI -6,25 -11,13 -10,13 -13,38 -29,13

Trong đó: m0ACT, m0CĐI

là hàm lượng ACT(mg) và CĐI (mg) trong một viên thuốc

actadol codein mACT, mCĐI

là hàm lượng ACT(mg) và CĐI(mg) tính toán được theo

phương pháp lọc kalman; RE% là sai số phép xác định hàm lượng ACT và CĐI. Nhận xét: Qua bảng 3.17 nhận thấy có thể xác định được ACT trong hỗn

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

hợp tương đối chính xác vì ACT có hàm lượng lớn, còn sai số mắc phải trong phép xác định CĐI là quá lớn. Vì

CĐI

thuốc Actadol codein cần phải sử dụng phương pháp thêm chuẩn.

3.2.8. Đ

ACT và CĐI . Đo

CĐI

ACT và

.

Cân 20 viên thuốc, tính khối lượng trung bình mỗi viên ( m = 0,5826g).

Đem nghiền nhỏ thành bột mịn. Thêm vào mẫu thuốc một lượng chất chuẩn ACT và CĐI như bảng 3.18, rồi lấy chính xác một lượng bột tương đương 50mg ACT và 0,8mg CĐI , pha các dung dịch như ở muc 3.2.7 để được dung dịch chứa hàm lượng tương đương ACT là 10 g/mL và CĐI 0,16 g/mL. Bảng 3.18. Hàm lƣợng các chất chuẩn ACT và CĐI thêm vào mẫu thuốc Actadol codein

Mẫu 1 2 3 4 5 6

mACT(1) (mg) 500 500 500

mCĐI(1) (mg)

mACT(2) (mg) 20 40 60

8 8 8

mCĐI(2) (mg)

2,0 4,0 6,0

49

mACT(3) (mg) 520 540 560

mCĐI(3) (mg)

10 12 14

Trong đó: mACT(1), mCĐI(1) là hàm lượng ACT và CĐI trong mẫu thuốc trước khi thêm chuẩn. mACT(2), mCĐI(2) là hàm lượng ACT và CĐI thêm vào mẫu thuốc. mACT(3), mCĐI(3) là hàm lượng ACT và CĐI sau khi thêm chuẩn - Đo độ hấp thụ quang trong khoảng bước sóng từ 210 - 290 nm. quả ở bảng 3.19

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

tính toán,

Bảng 3.19. Kết quả xác định độ thu hồi của ACT và CĐI trong mẫu thuốc Actadol codein

Chất

chuẩn

ACT

CĐI

Mẫu

CK (mg)

C (mg/)

CT (mg)

Rev(% )

1

500

20

520,2

101,0

2

500

40

539,8

99,50

3

60

2,0

559,6 9,980

99,30

1

500 8,00

2

8,00

4,0

11,94

98,50

3

8,00

6,0

14,02

100,3

99,00

Trong đó:

CK(mg) là hàm lượng ACT và CĐI trong thuốc Actadol codein xác định

được trước khi thêm chuẩn.

C (mg) là hàm lượng ACT và CĐI thêm vào mẫu CT (mg) là hàm lượng ACT và CĐI xác định được sau khi thêm chuẩn.

Rev(%) là độ thu hồi của ACT và CĐI. Nhận xét: Qua bảng 3.19 cho thấy độ thu hồi của ACT từ 99,3% đến 101% và của CĐI là từ 98,5% đến 100,3%. Độ thu hồi của ACT và CĐI đều mắc sai số nhỏ (<5%). Vì vậy chúng tôi kết luận có thể dùng phương pháp thêm chuẩn để tính hàm lượng của ACT và CĐI trong mẫu thuốc Actadol codein.

50

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

ACT và CĐI

Actadol codein

quang phổ hấp thụ phân tử

.

51

KẾT LUẬN

quả như sau: + Đã khảo sát được điều kiện tối ưu cho phép xác định đồng thời hỗn hợp 2 thành phần ACT và CĐI theo phương pháp HPLC. - Cột sắc ký: sử dụng cột C18 (250mm x 4,6).

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

- Pha động: hỗn hợp đệm KH2PO4 có lẫn triethylamine : acetonitrile với tỷ lệ thể tích là 93:7; Detector UV-VIS: λ = 214 nm; Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút; Thể tích bơm mẫu: 20 µL; Nhiệt độ phân tích: 30oC.

Thời gian lưu của các chất lần lượt là: với ACT là 8,257 phút và CĐI là

9,235 phút.

+ Đã xác định được ACT và CĐI trong thuốc Actadol codein theo phương

pháp HPC với độ chính xác và độ thu hồi của ACT từ 99,3% đến 99,9% và CĐI từ 99,3% đến 99,9%. + Đã k

ACT và CĐI.

- Bước sóng có độ hấp thụ quang cực đại của ACT là 243 nm và CĐI là

210

0,1M.

- Thời gian đo quang là 30 -40 phút sau khi pha và - Kh

.

ACT là

0,2 μg/mL đến 30 μg/mL và CĐI là từ 0.2 μg/mL đến 30 μg/mL. + Sử dụng phương pháp thêm chuẩn xác định ACT và CĐI thuốc Actadol codein với độ thu hồi của ACT từ 99,3% đến 101% và của CĐI là từ 98,5% đến 100,3%.

Kết quả xác định ACT và CĐI trong thuốc Actadol codein theo phương pháp HPLC và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử sử dụng chương trình lọc Kalman là như nhau

52

TÀI LIỆU THAM KHẢO I. TIẾNG VIỆT 1. Trần Thúc Bình, (2002), Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời các chất có phổ hấp thụ xen phủ nhau sử dụng vi tính, Luận án tiến sĩ hóa học, Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.

2. Trần Thúc Bình, Trần Tứ Hiếu (2005), Định lượng đồng thời

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

acetaminophen và ibuprofen trong thuốc viên nén bằng phương pháp phân tích toàn phổ, Tuyển tập công trình khoa học - Hội nghị khoa học phân tích hoá, lý và sinh học Việt Nam lần thứ hai, tr. 80-85.

3. Bộ y tế (1998), Hóa dược tập 2, Hà Nội.

4.

, Hà Nội.

5. Nguyễn Xuân Chiến (2006), Nghiên cứu xác định đồng thời uran và thori bằng một số phương pháp phân tích hoá lý hiện đại, Luận án tiến sỹ hoá học, Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.

6. Nguyễn Thành Đạt, Trần thế Phương, Đỗ Thị Oanh, Thái Duy Thìn, Thái Phan Quỳnh Như (2001), Nghiên cứu định lượng một số thuốc đa thành phần có chứa Acetaminophen bằng phương pháp HPLC, Thông tin khoa học công nghệ dược- Trường Đại học Dược Hà Nội. Tr 76-81.

7. Trần Đức Thục Đoan, Vĩnh Định (2002), Áp dụng quang phổ đạo hàm phân tích thuốc đa thành phần: các hỗn hợp pseudoephedrine triprolidine; betamethasone-chlorpheniramin; metronidazola spiramycine, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh Tập 6(1), tr. 263-265.

-Vis, NXB

8. ĐHQG Hà Nội.

9. Trần Tứ Hiếu, Đặng Ứng Vận, Mai Xuân Trường (2006), Xác định đồng thời các cấu tử có phổ hấp thụ xen phủ nhau theo phương pháp lọc Kalman, Tạp chí Phân tích Hoá, Lý và Sinh học. Trang 15-19.

53

10. Trần Tứ Hiếu, Đặng Ứng Vận, Mai Xuân Trường, Xác định đồng thời các nguyên tố Zn(II), Co(II), Cd(II), Pb(II) và Hg(II) bằng phương pháp trắc quang theo phương pháp lọc Kalman, Tuyển tập công trình khoa học. Hội nghị khoa học phân tích hoá, lý và sinh học Việt Nam lần thứ hai. Hà Nội 12/2005. Trang 29-33.

11.Đặng Trần Phương Hồng, Trịnh Văn Quỳ (1998), Định lượng đồng thời vitamin B1 và vitamin B6 bằng phương pháp quang phổ đạo hàm, Thông

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

báo kiểm nghiệm, Viện kiểm nghiệm - Bộ Y tế.

12. Phạm Luận (1997), sổ tay pha chế hóa chất, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

13. Nguyễn Văn Ly, Nguyễn Tấn Sĩ (2005), Xác định đồng thời các vitamin B1, B6 và B12 trong hỗn hợp bằng phương pháp trắc quang dùng phổ đạo hàm, Tuyển tập công trình khoa học - Hội nghị khoa học phân tích hoá, lý và sinh học Việt Nam lần thứ hai, tr. 86-89.

14. Phạm Việt Nga (1996), Phân tích các vitamin tan trong nước của một số chế phẩm polyvitamin bằng quang phổ đạo hàm bậc nhất, Thông báo kiểm nghiệm, Viện kiểm nghiệm- Bộ y tế, tr. 21-27.

15.

- Quy Nhơn (2007).

16.

, NXB ĐHSP Hà Nội.

17. Thái Duy Thìn, Thái Phan Quỳnh Như, Trần Việt Hùng, Võ Thu Hà, Nguyễn Tuấn Anh, Hoàng Văn Đức (2005), “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và đo quang phổ UV-Vis để định tính, định lượng các hoạt chất trong thành phần một số thuốc có từ 2 đến 5 thành phần”, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp bộ - Trường Đại học Dược Hà Nội.

54

18. Mai Xuân Trường (2008), Nghiên cứu phương pháp hấp thụ quang phân tử xác định đồng thời các chất có phổ hấp thụ xen phủ nhau dựa trên thuật toán lọc Kalman, Luận án Tiến sĩ hóa học, Đại học KHTN–ĐHQG Hà Nội.

19. Mai Xuân Trường, Dương Thị Tú Anh (2006), Định lượng đồng thời các vitamin B1, B2 và B6 trong viên nén Narobex theo phương pháp lọc Kalman, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Đại học Thái Nguyên, số 2(38)

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

tập 2.

II. TIẾNG ANH

20. Alsalim, W.; Fadel, M, Oral methionine compared with intravenous nacetyl cysteine for Acetaminophen overdose,Emerg. Med. J. 2003. Vol. 20. pp. 366-367. Retrieved on August 17, 2007.

21. Anuradha S Jagtap, Savita S Yadav and Janhavi R Rao (2011), Simultaneous determination of Acetaminophen and

lornoxicam by RP-

HPLC in bulk and tablet fomulation, Pharmacie Globale international journal of comprehensive pharmacy, 9, pp 1 - 4.

22. Aronoff DM, Oates JA, Boutaud O (2006), New insights into the mechanism of action of acetaminophen: Its clinical pharmacologic characteristics reflect its inhibition of the two prostaglandin H2 synthases, Clin. Pharmacol. Ther.79 (1): 9–19.

23. Bertolini A, Ferrari A, Ottani A, Guerzoni S, Tacchi R, Leone S (2006), Acetaminophen: new vistas of an old drug, CNS drug reviews12 (3-4): PP 250–75.

24. Borne, Ronald F, Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs, in Principles of Medicinal Chemistry, Fourth Edition. Eds. Foye, William O.; Lemke, Thomas L.; Williams, David A. Published by Williams & Wilkins, 1995. p. 544-545.

55

25. Chandrasekharan NV, Dai H, Roos KL (2002), COX-3, a cyclooxygenase-1 variant inhibited by acetaminophen and other analgesic/antipyretic drugs: cloning, structure, and expression, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.99 (21): 13926–31.

26. Dhara J.Patel, Acetaminophen Chromatography

Vivek P.Patel (2010),

Simultaneous Determination of

and

Tablets

Lornoxicam in

Combined

by

Thin

Layer

with Densitometry, International Journal

D ẠY da K yk ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

of ChemTech Research, 2, pp 1929 - 1932.

27. Dong H, Haining RL, Thummel KE, Rettie AE, Nelson SD (2000), Involvement of human cytochrome P450 2D6 in the bioactivation of acetaminophen, Drug Metab Dispos 28 (12): 1397-400.

56