DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN ĐẠI CƯƠNG GS.TS. NGUYỄN MINH ĐỨC ĐẠI HỌC Y-DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

DÖÔÏC LIEÄU CHÖÙA SAPONIN Ñaïi cöông GS.TS. NGUYEÃN MINH ÑÖÙC Boä moân Döôïc lieäu ÑAÏI HOÏC Y-DÖÔÏC TP. HOÀ CHÍ MINH

MỤC LỤC I. KHAÙI NIEÄM II. DANH PHAÙP-PHAÂN LOAÏI III. PHAÂN BOÁ TRONG TÖÏ NHIEÂN IV. SINH NGUYEÂN V. CAÁU TRUÙC HOAÙ HOÏC VI. TÍNH CHAÁT SAPONIN – ÖÙNG DUÏNG VAØO ÑÒNH TÍNH ÑÒNH LÖÔÏNG VII. CHIEÁT XUAÁT SAPONIN VIII. TAÙC DUÏNG SINH HOÏC VAØ COÂNG DUÏNG

???

Saponin?

Saponin?

Saponin?

Vài dược liệu chứa nhiều saponin thường gặp

Bồ kết (Bồ kếp) (Gleditschia spp.) -Caesalpiniaceae

Vài dược liệu chứa nhiều saponin thường gặp Quả Bồ hòn (Soap nut)

Bồ hòn (Sapindus mukorossi Gaertn.) - Sapidaceae

I. KHÁI NIỆM Saponin coøn goïi laø saponoside (sapo = xaø phoøng) laø moät nhoùm glycoside gaëp roäng raõi trong thöïc vaät, ñoâi khi trong ñoäng vaät (Haûi saâm, Caù sao) vaø theå hieän caùc tính chaát chung sau: + Taïo boït beàn khi laéc vôùi nöôùc. + Coù tính phaù huyeát (laøm vôõ hoàng caàu). + Ñoäc vôùi caù vaø caùc ñoäng vaät coù maùu laïnh. + Coù theå taïo phöùc vôùi cholesterol vaø caùc daãn chaát 3-b-hydroxy steroid khaùc. + Coù tính kích öùng, gaây haét hôi, ñoû maét.

I. KHÁI NIỆM

Ngoaïi leä: moät soá saponin khoâng theå hieän ñaày ñuû caùc tính chaát treân. Ví duï: Sarsaparilloside trong caùc loaøi Smilax khoâng coù tính phaù huyeát vaø taïo phöùc vôùi cholesterol.

Löu yù moät soá hôïp chaát khaùc nhö glycoside tim, protein động & thöïc vaät, các terpene glycoside … cuõng có thể taïo boït.

II. DANH PHÁP & PHÂN LOẠI 1. DANH PHAÙP - Saponin: Thöôøng duøng caùch ñaët teân chung cuûa caùc heùteùrosid goác (töø teân gioáng hoaëc loaøi) + tieáp vó ngöõ OSIDE. Ví duï : Caùc araloside töø Aralia manshurica Caùc ginsenoside töø Panax ginseng Asiaticoside từ Centella asiatica - Aglycone (coøn goïi laø sapogenin): duøng caùc tieáp vó ngöõ nhö – GENIN,- IDIN …

Ví duï: diosgenin coù trong caùc loaøi Dioscorea, tomatidin coù trong Caø chua (tomato-Solanum lycopersicum) Ngoaøi ra, coøn nhöõng teân thoâng duïng hoaëc ñaët teân döïa theo moät lyù do ñaëc bieät naøo ñoù. Ví duï : glycyrrhizin töø Cam thaûo (Glycyrrhiza uralensis), caùc vina-ginsenoside töø Saâm Vieät Nam (Panax vietnamensis).

II. DANH PHÁP & PHÂN LOẠI 2. PHAÂN LOAÏI Tröôùc kia saponin ñöôïc phaân loaïi saponin trung tính vaø saponin acid.

Hieän nay, ngöôøi ta phaân loaïi saponin döïa vaøo caáu truùc cuûa phaàn aglycone: - Saponin triterpene (triterpenoid saponin) - Saponin steroid (steroid saponin, spirostanol saponin) - Saponin alcaloid steroid (glycoalcaloid, basic steroid saponin, azasteroid). Coù theå xeáp vaøo nhoùm saponin steroid.

Moät soá taùc giaû coøn xeáp saponin alcaloid steroid vaøo nhoùm alcaloid.

III. PHÂN BỐ Trong thiên nhiên, saponin phaân boá roäng raõi trong hôn 90 hoï thöïc vaät: - Saponin steroid gaëp trong caùc hoï thuoäc nhóm Một lá mầm nhö Liliaceae (caùc loaøi Smilax, Muscari…), Dioscoreaceae (Dioscorea spp.), Amaryllidaceae (Agave spp.)…

- Ít gaëp trong Hai lá mầm. Ví duï: Scrophulariaceae (Digitalis spp.), Solanaceae (Capsicum annum)…

- Saponin alcaloid steroid ñaëc bieät gaëp trong caùc caây thuoäc chi Solanum (Solanaceae).

III. PHÂN BỐ - Saponin triterpene raát phoå bieán trong caùc caây thuoäc Song töû dieäp. Caùc hoï chöùa nhieàu saponin triterpene laø Fabaceae, Araliaceae, Sapindaceae, Cucurbitaceae, Caryo-phyllaceae, Polygalaceae, Rosaceae…

- Saponin coøn gaëp trong moät soá ít ñoäng vaät nhö caùc loaøi Haûi saâm (sea cucumber: Holothuria spp.), Sao biển (Caù sao: starfish).

Haûi saâm

Sao biển

III. PHÂN BỐ Saponin thöôøng ñöôïc chöùa trong caùc khoâng baøo vaø coù theå tìm thaáy trong taát caû caùc boä phaän cuûa caây: - Reã, thöôøng chöùa nhieàu saponin (Nhaân saâm, Tam thaát, Cam thaûo, Caùt caùnh, Vieãn chí..).

- Thaân (Nguõ gia bì chaân chim..).

- Laù (Rau maù …).

- Quaû (Boà hoøn, Boà keát…).

- Haït (Taùo, Aesculus hippocastanum…).

Haøm löôïng saponin trong döôïc lieäu coù theå raát cao. Ví duï : caùc loaøi saâm chöùa 5-20% saponin, Boà keát 10%, Cam thaûo 8-10%...

IV. SINH NGUYÊN Baèng phöông phaùp duøng carbon ñaùnh daáu (C*), ngöôøi ta xaùc ñònh saponin ñöôïc taïo thaønh töø ñôn vò cô baûn laø acid acetic (xem sô ñoà trong sách Baøi giaûng Döôïc lieäu): Acid acetic (2C)  acid mevalonic (6C)  isopentyl pyrophosphate (5C)  geranyl pyrophosphate (10C)  farnesyl pyrophosphate (15C)  squalene (30C).

Töø squalene (30C) saponin triterpene (30C), saponin steroid (27C) vaø cholesterol (27C) ñöôïc taïo thaønh.

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC Nhö caùc glycoside khaùc, caáu taïo cuûa saponin goàm 2 phaàn: - Phaàn khoâng ñöôøng = phaàn aglycone (coøn goïi laø genin hay sapogenin).

- Phaàn ñöôøng (glycone).

Phaàn ñöôøng SAPONIN

Phaàn aglycone (coù theå coù 30C hay 27C)

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC Söï phaân loaïi saponin thöôøng döïa vaøo caáu truùc cuûa phaàn aglycon (coøn goïi laø genin hay sapogenin) SAPONIN

SAPONIN TRITERPENE (30C) 5 VÒNG Oleane Ursane Lupane Hopane …

SAPONIN STEROID (27C)

SAPONIN ALCALOID STEROID (27C)

4 VÒNG Dammarane Lanostane Cucurbitane Cycloartane …

Spirostane Furostane …

Spirosolane Solanidane Aminofurostane …

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC 1. Caáu truùc phaàn aglycon 1.1. Saponin triterpene Phaàn aglycone coù 30 carbon, caáu taïo bôûi 6 nhoùm hemiterpene (isoprene C5H8).

1.1.1. Saponin triterpene naêm voøng: Loaïi naøy khaù phoå bieán trong thieân nhieân, aglycone goàm 5 voøng A,B,C,D,E vaø chöùa caùc nhoùm coù caáu truùc khung khaùc nhau: - Oleane - Ursane - Lupane - Hopane . . .

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC 1.1.1. Saponin triterpene naêm voøng: NHOÙM OLEANE: coù khung cô baûn laø oleanane 30

29 19

1 2 3 23

25 10

4

5 24

11 9

6

12 26 8 7

13

18

14 27

20 17 16

15

ñuoâi ñaàu

21

ñaàu

E

22 28

ñuoâi

C

D ñuoâi

ñaàu

A

ñuoâi

Khung oleanane

B

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM OLEANE: raát phoå bieán trong thieân nhieân.

Phaàn lôùn saponin triterpene naêm voøng trong thieân nhieân thuoäc nhoùm naøy vaø thöôøng laø daãn chaát cuûa bamyrin (3b-hydroxy olean–12-en), gaëp ôû traïng thaùi thieân nhieân trong nhöïa Manila elemi.

30

29 19

1 2

HO

25 10

3 23

4

5

11 9

6

12 26 8 7

13

18

14 27

20

21

17

22

16

28

15

24

b-Amyrin (3b-hydroxy olean–12-en)

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC 1.1.1. Saponin triterpene naêm voøng: NHOÙM OLEANE: cấu trúc lập thể

E D

D/E cis

A/B, B/C, C/D: trans

Khung oleanane

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM OLEANE: sapogenin nhoùm oleane thöôøng gaëp: 12

COOH

COOH

28

9

28

9

27

27

HO

HO CH2OH

Acid oleanolic

Hederagenin

COOH 28

9

COOH

27

HO

CH CHO 2OH

Gypsogenin

28

9

COOH HO

27

Acid cincholic

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM OLEANE: vài saponin thường gặp

R Chikusetsusaponin IVa: - GlcA Chikusetsusaponin IV : - GlcA4 – Ara(f) Chikusetsusaponin V : - GlcA2 – Glc (= Ginsenoside-Ro)

R Sapidosid A: - Ara(p)2 - Rha Sapindosid B: - Ara(p)2 – Rha3 - Xyl

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC 1.1.1. Saponin triterpene naêm voøng (tt): NHOÙM URSANE: khaù phoå bieán, caùc sapogenin thöôøng laø daãn chaát a-amyrin (3b-hydroxy ursan-12-en). Trong töï nhieân coù khi ñi keøm vôùi nhoùm oleane.

29 30

1 2 3 23

25

A 10 4

5 24

11 9

12

13

26

18

C 14 D

B 8

6

19

7

27

20

21

17

22

E

16

12

28

15

Khung ursan

HO

3

a-Amyrin (3b-hydroxy ursan-12-en)

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC 1.1.1. Saponin triterpene naêm voøng (tt): NHOÙM URSANE: cấu trúc lập thể

C D

E

D/E cis

A B A/B, B/C, C/D: trans

Khung ursane

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM URSANE: vaøi saponin thöôøng gaëp

C OOH

COOH

28

28

COOH

27

27

HO

HO

Acid quinovic

Acid ursolic

29

29

30

30

HO

2

HO

3

COOH 28

4

5

6

CH2OH

Acid asiatic

HO

2

HO

3

COOH 28

4

5

6

OH CH2OH

Acid madecassic

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM URSANE: vaøi saponin thường gặp

Asiaticosid Madecassosid

R1

R2

-H -OH

-Glc6-Glc4-Rha -Glc6-Glc4-Rha

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC 1.1.1. Saponin triterpene naêm voøng (tt): NHOÙM LUPANE: caùc sapogenin thöôøng laø daãn chaát cuûa 3b-hydroxy lupan-20(29)-en, có voøng E 5 caïnh.

Trong thieân nhieân lupeol gaëp trong hoät Lipidus luteus.

30 20 19

29 12 25

11

1 2

A

3

10 5

4

24

9

C 26

13

18

14

21

E 17

D

22 28

16

B

8

6

7

15

3

27

23

Khung lupane

HO

Lupeol

(3b-hydroxy lupan-20(29)-en)

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC 1.1.1. Saponin triterpene naêm voøng (tt): NHOÙM LUPANE: cấu hình lập thể

A/B; B/C; C/D; D/E: trans E C A

D

B

Khung lupane

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM LUPANE: ít gaëp trong töï nhieân CH2OH 3

HO CH2OH

23-hydroxy betulin

CH2OH

HO

COOH

Betulin HO

Acid betulinic

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC 1.1.1. Saponin triterpene naêm voøng (tt): NHOÙM HOPANE: voøng E 5 caïnh, ít phoå bieán trong thieân nhieân.

19 28 12 25

11

E

30

17 21

26

1

OH

22

14

2 3

18 13

20

10 5

4

9 6

16 8 7

3

15 27

OH

29

HO OH

24

23

Khung hopane

Mollugogenol A (coù trong Mollugo hirta)

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC 1.1.1. Saponin triterpene naêm voøng (tt): NHOÙM HOPANE: cấu hình lập thể A/B; B/C; C/D; D/E: trans E C A

D

B

Khung hopane

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC 1.1.2. Saponin triterpene boán voøng: NHOÙM DAMMARANE: ñaùng chuù yù nhaát. Tieâu bieåu cho saponin nhoùm naøy laø saponin trong caùc loaøi saâm (Panax spp).

22 24 21

26

20 12 19

11

A

3

4

29

C

18

1 2

13 17

10 5

9

14

B

8

6

7

D

25

23 16

27

15

30

28

Khung dammarane

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC 1.1.2. Saponin triterpene boán voøng: NHOÙM DAMMARANE: A/B; B/C; C/D: trans

C A

D

B

Khung dammarane

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM DAMMARANE: Tieâu bieåu laø caùc sapogenin thaät protopanaxadiol vaø protopanaxatriol cuûa caùc saponin Nhaân saâm (Panax ginseng CA Meyer) thu ñöôïc khi thuûy phaân chuùng baèng enzyme.

Crude hesperidinase

Caùc ginsenoside

Protopanaxadiol: R = -H Protopanaxatriol: R = -OH

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM DAMMARANE: Neáu thuyû phaân caùc ginsenoside baèng acid seõ cho caùc genin giaû laø panaxadiol vaø panaxatriol.

O 20(S)

H+ (HCl) O 20(R)

Panaxadiol: R = -H Panaxatriol: R = -OH

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM DAMMARANE (tt): saponin dammarane thöôøng gaëp trong caùc caây thuoäc chi Panax. Ngoaøi ra, coøn gaëp trong haït Taùo (Ziziphus jujuba), Gynostemma pentaphyllum, Hedera rhombea, Actinostemma lobatum …

RO HO OH 20(S) 20(S) O HO Dammarenediol II

HO

(coù trong nhöïa Dammar, sapogenin cuûa vina-ginsenoside-R3)

CH2 O Jujubogenin

(coù trong haït Taùo)

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM DAMMARANE: một số saponin R3O

20(S)

R1O R2 R1 Ginsenoside-Rb1 Ginsenoside-Rc Ginsenoside-Rd Ginsenoside-Re Ginsenoside-Rg1

-Glc2-Glc -Glc2-Glc -Glc2-Glc -H -H

R2

R3

-H -Glc6-Glc -H -Glc6-Ara(f) -H -Glc -O-Glc2-Rha -Glc -O-Glc -Glc

Glc-: b-D-glucospyranosyl; Rha: a-L-rhamnopyranosyl; Ara(f): a-L-rhamnofuranosyl

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM OCOTILLOL: Tuy có 5 vòng, nhưng có thể được xem là một dạng biến đổi của khung dammarane. Tiêu biểu là các saponin khung ocotillol trong Sâm Việt Nam (P. vietnamensis) R 20(S),24(R)-Epoxy-dammar3β,6α,12β,25-tetraol -H Majonoside-R2

-Glc2-Xyl

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM LANOSTANE: gaëp trong ñoäng vaät nhö Haûi saâm (Holothuria vagabunda, H. polii…), Stichopus japonicus ... Caùc saponin coù nguoàn goác ñoäng vaät naøy coù tính phaù huyeát maïnh hôn caùc saponin coù nguoàn goác thöïc vaät, coù giaû thieát cho raèng chuùng laø vuõ khí töï veä cuûa caùc loaøi naøy.

21 25 26 A/B; B/C; C/D: trans 12

18

19

20

17

27

9

5

3 29

28

C 30

A

B

Khung lanostane

D

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM LANOSTANE

O Acid eburicoic

O O

3 HO

Stichopogenin A4 (coù trong Stichopus japonicus)

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM CYCLOARTANE (9,19-cyclo(9b)lanostan): nhö caùc astragaloside trong moät soá loaøi Astragalus, acid molic trong Combretum molle …

21 12

18

19

26

25 20 17

OH

27

9 5

3 29

30

28

Khung cycloartane

HO

3

COOH

Acid mollic (coù trong Combretum molle)

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM CUCURBITANE: Caùc sapogenin nhoùm naøy thöôøng gaëp trong caùc caây thuoäc hoï Baàu bí (Cucurbitaceae), phaàn lôùn ôû daïng töï do, moät ít ôû döôùi daïng glycoside.

21 12

18

19

5

29

30

26

20 17

9 3

25

HO O

27

O

OH

OAc

HO O

3

28

Cucurbitacin E Khung cucurbitane (coù trong Combretum molle)

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC 1.2. Saponin steroid: Aglycone caùc saponin nhoùm naøy coù caáu truùc steroid (10,13-dimetyl cyclopentanoperhydrophenantrene), khung thöôøng goàm 27C. NHOÙM SPIROSTANE (16,22:22,26-diepoxycholestane) 26 21

12 19

18

25

26

21

20 17

27 2

5

3

H

3

Cholestane

1

18 12 17 11 19 13 D

C

9

A 4

20 22

5B

H

6

8

14

EO 16

O F

25

27

23 24

15

7

Khung spirostane

Caáu taïo gioáng cholestane nhöng maïch nhaùnh töø C20-C27 taïo thaønh 2 dò voøng coù oxy laø voøng E (hydrofurane) vaø voøng F (hydropyrane), noái vôùi nhau qua 1 caàu carbon chung ôû C22, taïo thaønh maïch nhaùnh spiroacetal.

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM SPIROSTANE: coù nhieàu C* nhöng do chöôùng ngaïi laäp theå neân soá ñoàng phaân giaûm nhieàu. Coù 2 loaïi ñoàng phaân chính: - Ñoàng phaân cis-trans (do caùch dung hôïp 2 voøng A/B) - Ñoàng phaân caáu hình tuyeät ñoái ôû vò trí C25 21 20 22

E

A HO

5

H

Cis

O23

27

24

CH3 22

HO

F

26 25

D

B

H

5

O

5

HO

O

O

H

25(S)

H

22

O

O

H

Trans

25(S)

25(R)

25(R)

CH3

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM SPIROSTANE: Moät vaøi sapogenin steroid coù caáu truùc spirostane thöôøng gaëp trong töï nhieân.

Sapogenin

R1

R2

A/B

C25

Xuaát xöù

Sarsasapogenin Similagenin

-H -H

-H -H

cis cis

S R

Coù trong reã caùc loaøi Smilax

Tigogenin Gitogenin Digitogenin

-H - OH - OH

-H -H -OH

trans trans trans

R R R

Coù trong Digitalis spp.

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM SPIROSTANE: (C/D trans khaùc vôùi glycoside tim) CH3

CH3

CH3 H HO

CH3

O

CH3 CH3

O H

CH3 CH3

Smilagenin H O

O H

OH H

O

H

HO

CH3

H

O

H

Sarsasapogenin

CH3

Tigogenin

CH3

CH3

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM SPIROSTANE: Caùc saponin thuoäc nhoùm naøy ñöôïc duøng laøm nguyeân lieäu baùn toång hôïp caùc thuoác steroid.

Hai nguyeân lieäu quan troïng nhaát laø: + Diosgenin (chieát töø caùc loaøi Dioscorea, Mía doø…). + Hecogenin (chieát töø caùc loaøi Agave).

Ngoaøi ra, tigogenin, smilagenin… cuõng ñöôïc duøng.

O CH3

22

O

O

O

HO

H

Diosgenin

O

HO

H

Hecogenin

CH3

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM FUROSTANE:(16:22-epoxicholestane, furostanol saponin): Coù caáu truùc aglycone töông töï nhoùm spirostane nhöng coù voøng F môû. Döôùi taùc duïng cuûa enzyme, phaàn ñöôøng ôû maïch nhaùnh seõ bò caét ñöùt vaø sau ñoù ñoùng voøng ñeå taïo thaønh voøng F saùu caïnh nhö nhoùm spirostane. Saponin nhoùm naøy thöôøng coù maët trong caùc döôïc lieäu chöùa saponin nhoùm spirostane lôïi duïng tính chaát naøy ñeå laøm giaøu nguyeân lieäu khi chieát xuaát saponin nhoùm spirostane. Ví duï chiết sarsaparilloside trong loaøi Smilax aristolochiaefolia…

OH

CH2O-Glc CH3

O

Ose

Enzym

H

Sarsaparilloside

Parillin

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC NHOÙM FUROSTANE: Moät tröôøng hôïp khaùc, voøng F chæ coù 5 caïnh do söï ñoùng voøng 22-25 epoxy nhö avenacoside trong luùa yeán maïch, coù 2 maïch ñöôøng, khi thuyû phaân caét ñöôøng glucose ôû C26 thì noù cuøng bò chuyeån thaønh daãn chaát spirostane.

OH O CH3

H+

O

H

OH

Isonuatigenin Avenacoside Ngoaøi caùc nhoùm treân, coøn gaëp caùc saponin coù caáu truùc maïch nhaùnh nhö a-spinasterol glycoside trong caây cheø (Thea sinensis), polypodosaponin, oslandin töø Polypodium vulgare L. …

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC 1.3. Saponin alcaloid steroid (Glycoalcaloid) Laø caùc saponin steroid coù chöùa nitô trong phaân töû.

Caùc saponin nhoùm naøy thöôøng gaëp trong caùc caây thuoäc chi Solanum, hoï Caø (Solanaceae).

NHOÙM AMINOFUROSTAN:

H+ H2N

Jurubin (Coù trong Solanum paniculatum)

Jurubidin

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC 1.3. Saponin alcaloid steroid (tt) NHOÙM SPIROSOLANE: Khaùc nhoùm spirostane ôû choã nguyeân töû oxy treân voøng F ñöôïc thay baèng nhoùm NH. H N

H CH3

O

Ose

Solasonin 22a, 25R (Coù trong Caø laù xeû Solanum laciniatum)

Tomatin 22b, 25S (Coù trong Caø chua)

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC 1.3. Saponin alcaloid steroid (tt) NHOÙM SOLANIDANE: voøng E vaø voøng F coù chung 1 C vaø 1 N N

Ose

H

Solanin (trong maàm Khoai taây) Moät soá saponin alcaloid steroid ñöôïc öùng duïng vaøo vieäc baùn toång hôïp caùc hôïp chaát steroid.

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC 2. Phaàn ñöôøng Caùc ñöôøng ñôn (monosacharide) thöôøng tham gia taïo thaønh phaàn ñöôøng cuûa saponin : D-glucose (DGlc), D-galactose (D-Gal), D-glucuronic acid (D-GlcA), D-ribose (D-Rib), D-xylose (D-Xyl), D-arabinose (DArab), L-fucose (L-Fuc), L-rhamnose (L-Rha), 3metylglucose, quinovose vaø apiose. Các hexose có thể ở dạng vòng 6 cạnh (pyranose) hay vòng 5 cạnh (furanose).

Phaàn ñöôøng coù theå chæ goàm coù moät phaân töû ñöôøng hay goàm nhieàu phaân töû ñöôøng lieân keát nhau taïo thaønh moät chuoãi ñöôøng thaúng hay phaân nhaùnh.

Nhieàu saponin coù caáu taïp chuoãi ñöôøng raát phöùc taïp.

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC 2. Phaàn ñöôøng Veà danh phaùp theo soá chuoãi ñöôøng, saponin coù moät, hai, ba chuoãi ñöôøng ñöôïc laàn löôït goïi laø monodesmoside, bidesmoside, vaø tridesmoside. Ña soá caùc saponin thuoäc nhoùm monodesmoside. Ña soá tröôøng hôïp, phaàn ñöôøng lieân keát vôùi aglycone theo daây noái O-glycoside. Trong taát caû caùc nhoùm, chuoãi ñöôøng thöôøng gaén vaøo nhoùm hydroxyl ôû vò trí C-3. Daây noái glycoside deã bò thuûy phaân baèng acid voâ cô loaõng (HCl, H2SO4) vaø enzyme. Caùc acid höõu cô nhö acid acetic coù theå thuûy phaân baèng moät phaàn saponin trong nhöõng ñieàu kieän nhaát ñònh.

V. CẤU TRÚC HÓA HỌC 2. Phaàn ñöôøng Caùc nhoùm carboxyl (-COOH) cuûa sapogenin coù theå taïo thaønh noái ester ñeå cho caùc noái pseudo-glycoside. Ví duï: asiaticoside trong Rau maù vaø moät soá saponin cuûa voû thaân Nguõ gia bì chaân chim. Khi thuûy phaân kieàm caùc saponin, ngöôøi ta coøn thu ñöôïc caùc acid höõu cô nhö acid acetic, acid formic, acid butyric, acid angelic, acid ferulic… caùc acid naøy ester hoaù caùc nhoùm hydroxyl cuûa sapogenin. Ví duï: Aescin trong Aesculus hippocastanum. Caùc saponin coù daây noái ester ñöôïc goïi laø caùc ester saponin.

Phaàn aglycone coù taùc duïng quyeát ñònh caùc tính chaát lyù hoaù, sinh hoïc cuûa saponin nhöng phaàn ñöôøng cuõng ñoùng moät vai troø quan troïng. Ví du:ï caùc monodesmoside coù tính phaù huyeát cao trong khi caùc bisdesmoside coù tính phaù huyeát thấp hoaëc khoâng coù.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 1. TÍNH CHAÁT - Saponin thöôøng coù vò ñaéng, muøi noàng, gaây haét hôi.

- Ña soá saponin ôû döôùi daïng voâ ñònh hình, tan trong nöôùc vaø khoù keát tinh. Tan nhieàu trong coàn loaõng, ít tan trong nhöõng dung moâi höõu cô khoâng phaân cöïc nhö hexane, benzene, ether… Ngöôïc laïi, sapogenin vaø caùc daãn chaát acetyl cuûa noù deã keát tinh, coù tính hoøa tan ngöôïc laïi vôùi saponin.

- Saponin thöôøng coù khoái löôïng phaân töû lôùn, khoù bò thaåm tích qua maøng baùn thaám, ña soá saponin coù khaû naêng quay cöïc.

- Ñieåm chaûy cuûa saponin thöôøng cao (200-300 oC), ñoâi khi keøm theo söï phaân huyû (decomposition).

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 1. TÍNH CHAÁT (tt) - Hấp thụ: Saponin bò haáp thuï bôûi kaolin, magnesium oxide, tinh boät, polyamide, than ñoäng vaät… ngöôøi ta lôïi duïng tính chaát naøy ñeå tinh cheá saponin.

- Thủy phaân: + Saponin bò thuûy phaân hoaøn toaøn khi ñun vôùi acid voâ cô 2-4 N (HCl, H2SO4, acid perchloric…). + Thuûy phaân acid maïnh meõ coù theå taïo thaønh caùc sapogenin giaû (artefacts). Ñeå thu ñöôïc genuin sapogenin, duøng caùc phöông phaùp thuyû phaân choïn loïc nhö thuûy phaân baèng enzyme (hesperidinase thoâ, b-glucosidase…), PP quang giaûi baèng tia UV…

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 1. TÍNH CHAÁT (tt) - Tính taïo boït : + Saponin taïo boït beàn khi laéc vôùi nöôùc (tính chaát dieän hoaït).

Thaân nöôùc

Ñöôøng

Aglycon

Thaân daàu

+ Tính taïo boït maïnh, yeáu tuøy thuoäc vaøo caáu taïo saponin. + Khoâng coù söï lieân quan roõ raøng giöõa tính taïo boït vaø tính phaù huyeát. Ví duï: saponin cuûa Castanopernum australe coù tính taïo boït yeáu nhöng tính phaù huyeát cuûa noù raát maïnh, ôû ñoä pha loaõng 1/20.000 vaãn theå hieän tính phaù huyeát.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 1. TÍNH CHAÁT (tt) - Tính phaù huyeát: + Saponin laøm vôõ hoàng caàu (coù theå do chuùng keát hôïp vôùi cholesterol maøng hoàng caàu  taïo phöùc chaát, maát/giaûm tính ñaøn hoài, keùm beàn vöõng  vôõ). + Khoâng coù töông quan roõ reät giöõa tính phaù huyeát vaø taïo phöùc vôùi cholesterol.

Ví duï : aescin trong Aesculus hippocastanum coù tính phaù huyeát maïnh tính taïo phöùc vôùi cholesterol yeáu. + Hoàng caàu cuûa moãi ñoäng vaät nhaïy caûm khaùc nhau.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 1. TÍNH CHAÁT (tt) - Tính phaù huyeát (tt): + Khoâng coù söï khaùc bieät veà tính phaù huyeát giöõa saponin triterpene vaø saponin steroid. + Tuy nhieân, caáu truùc aûnh höôûng ñeán tính phaù huyeát: * saponin triterpene coù nhoùm –OH ôû C16 coù tính phaù huyeát maïnh (Ví du: saponin Caùt caùnh Platicodon grandiflorum). * ester hoùa caùc nhoùm –COOH hay –OH laøm taêng tính phaù huyeát…

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 1. TÍNH CHAÁT (tt) + Caáu taïo cuûa phaàn ñöôøng aûnh höôûng ñeán tính phaù huyeát: chuoãi ñöôøng phaân nhaùnh coù theå laøm taêng tính phaù huyeát, monodesmoside cuûa saponin triterpene phaù huyeát maïnh hôn bisdesmoside töông öùng… + Tính phaù huyeát ñöôïc duøng ñeå ñònh tính, ñaùnh giaù saponin. + Caàn löu yù tính phaù huyeát khi baøo cheá döôïc phaåm.

- Tính ñoäc ñoái vôùi caù vaø caùc ñoäng vaät coù maùu laïnh: Người ta cho rằng saponin laøm taêng tính thaám cuûa bieåu moâ hoâ haáp, laøm caù maát chaát ñieän giaûi. Ñoä nhaïy caûm cuûa moãi loaïi caù ñoái vôùi saponin thay ñoåi  Tính chaát naøy duøng ñeå ñònh tính, ñaùnh giaù saponin. + Moät soá DL chöùa saponin ñöôïc duøng ñeå thuoác caù.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 1. TÍNH CHAÁT (tt) - Tính taïo phöùc vôùi cholesterol vaø caùc daãn chaát 3b-hydroxy steroid: + Tính taïo phöùc vôùi cholesterol cuûa saponin steroid noùi chung maïnh hôn saponin triterpen. + Monodesmoside coù tính taïo phöùc maïnh hôn bisdesmoside. + Tính chaát naøy ñöôïc öùng duïng ñeå tinh khieát hoùa saponin, ñònh löôïng cholesterol trong sinh hoùa, söû duïng saponin laøm thuoác trò beänh xô vöõa ñoäng maïch…

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 2. ÖÙNG DUÏNG VAØO ÑÒNH TÍNH & ÑÒNH LÖÔÏNG 2.1. Ñònh tính vaø ñaùnh giaù saponin 2.1.1. Phaûn öùng taïo boït vaø chæ soá boït (xem taøi lieäu TT) Chæ soá boït: chæ soá boït laø ñoä pha loaõng caàn thieát cho 1 g döôïc lieäu ñeå coù moät dung dòch cho moät lôùp boït cao 1cm sau khi ngöøng laéc 15 phuùt vaø tieán haønh trong ñieàu kieän quy ñònh.

2.1.2. Phaûn öùng phaù huyeát vaø chæ soá phaù huyeát (xem taøi lieäu TT) Chæ soá phaù huyeát: laø ñoä pha loaõng caàn thieát tính baèng ml dung dòch ñeäm duøng ñeå pha loaõng hay chieát 1g döôïc lieäu coù noàng ñoä vöøa ñuû gaây neân hieän töôïng phaù huyeát ñaàu tieân vaø hoaøn toaøn ñoái vôùi moät thöù maùu ñaõ choïn vaø tieán haønh trong ñieàu kieän quy ñònh.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 2. ÖÙNG DUÏNG VAØO ÑÒNH TÍNH & ÑÒNH LÖÔÏNG 2.1.3. Phaûn öùng ñoäc ñoái vôùi caù vaø chæ soá caù: taùc ñoäng laøm caù say, cheát ñeå ñònh tính vaø ñaùnh giaù saponin (hieän nay ít duøng) Chæ soá caù: chæ soá caù laø chæ ñoä pha loaõng caàn thieát 1 g döôïc lieäu coù noàng ñoä vöøa ñuû laøm cho ña soá caù trong loâ thöû nghieäm cheát ñoái vôùi moät loaïi caù nhaát ñònh vaø tieán haønh trong ñieàu kieän quy ñònh.

2.1.4. Phaûn öùng ñoái vôùi cholesterol:  ñònh tính saponin döïa vaøo tính taïo phöùc khoâng tan vôùi cholesterol.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 2.1.5. Caùc phaûn öùng maøu cuûa saponin (khoâng ñaëc hieäu) - Phaûn öùng Salkowski (+ H2SO4 hay H3PO4 ): maøu vaøng, hoàng, ñoû tím. Theâm moät ít acid seùleùnieux seõ coù maøu ñoû maän.

- Phaûn öùng Rosenthaler (+ vanilin 1% HCl): maøu töø luïc ñeán tím.

- Phaûn öùng Kahlenberg (saponin/chloroform+ SbCl3 20%/chloroform): seõ cho maøu hoàng hoaëc ñoû.

- Phaûn öùng Hirscholn (Rosenheim) (saponin/chloroform + acid trichloracetic 90% ñun noùng): maøu tím - xanh lô sau 20 phuùt (saponin triterpene).

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 2.1.5. Caùc phaûn öùng maøu cuûa saponin (khoâng ñaëc hieäu) - Phaûn öùng Tschugajew (saponin/chloroform+ thöøa acetyl chloride + ZnCl2 ñun noùng): maøu ñoû coù huyønh quang vaøng, xanh nhaït.

- Phaûn öùng Ruzicka (saponin/chloroform + tetranitro-methane/chloroform (coù theâm moät gioït nöôùc): seõ cho maøu vaøng.

- Phaûn öùng Noller, Smith, Harris, Walker (khaù ñaëc tröng cho triterpenoid, dd saponin+ TT thieác cloride): maøu ñaëc tröng vaø beàn vöõng trong 60 phuùt.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 2.1.5. Caùc phaûn öùng maøu cuûa saponin (khoâng ñaëc hieäu) (tt) - Phaûn öùng Molish (dd saponin/coàn + a-naphtol trong coàn+ nhoû doïc caån thaän theo thaønh oáng nghieäm 0,5 ml H2SO4 ñaäm ñaëc): xuaát hieän voøng ngaên caùch maøu tím (phaûn öùng cuûa phaàn ñöôøng).

- Phaûn öùng Tortelli – Jaffe (phaùt hieän noái ñoâi trong hôïp chaát steroid: dd saponin/chloroform + dd brom 0,2%/cloroform): neáu coù hôïp chaát steroid coù noái ñoâi (ví duï: diosgenin), seõ coù maøu luïc giöõa hai lôùp.

- Phaûn öùng Pasich: Saponin triterpene cho maøu ñaëc tröng vôùi acid phosphotungstic…

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 2.1.6. Phaûn öùng sô boä phaân bieät saponin triterpene vaø saponin steroid - Phaûn öùng taïo boït Fontan-Kaudel (xem taøi lieäu thöïc taäp): Cho caén dòch chieát coàn döôïc lieäu vaøo hai oáng nghieäm chöùa 5 ml dung dòch HCl 0,1 N (pH = 1) vaø 5 ml dung dòch NaOH 0,1 N (pH = 13). Bòt vaø laéc maïnh oáng nghieäm theo quy ñònh. Quan saùt söï taïo boït: + Boït trong hai oáng nghieäm töông ñöông nhau: saponin triterpene. + Boït trong oáng nghieäm pH = 13 > oáng pH= 1 nhieàu: saponin steroid.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 2.1.6. Phaûn öùng sô boä phaân bieät saponin triterpene vaø saponin steroid - Phaûn öùng Liebermann–Burchard (caén DL hoaø trong anhydride acetic + H2SO4 ññ): + Voøng ngaên caùch hoàng ñeán ñoû tím: saponin triterpene + Voøng ngaên caùch maøu xanh laù caây : saponin steroid.

- Phaûn öùng huyønh quang vôùi thuoác thöû SbCl3/ cloroform (caén coàn döôïc lieäu +TT SbCl3/chloroform): + Dung dòch phaùt huyønh quang xanh: saponin triterpene. + Dung dòch phaùt huyønh quang vaøng: saponin steroid. Ñeå coù phaûn öùng roõ raøng neân tinh cheá caùc saponin.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 2.1.7. Saéc kyù saponin vaø sapogenin: SKLM: Thöôøng duøng silca gel (ñ/v sapogenin thöôøng duøng baûn moûng taåm baïc nitrat 1-10% ñeå taùch toát hôn). Ñeå saéc kyù sapogenin: thuûy phaân saponin baèng acid voâ cô vaø duøng moät dung moâi höõu cô ñeå taùch rieâng sapogenin.

Caùc heä dung moâi SKLM thöôøng duøng: + Saponin triterpene: CHCl3 – MeOH – H2O (65:35:10, lôùp döôùi), (61:32:7)… n-BuOH – CH3COOH – H2O (4:1:5, lôùp treân), (4:1:1)… n-BuOH – EtOH – NH4OH(7:2:5); n-BuOH baõo hoøa H2O + Saponin steroid : C6H6 – nBuOH – H2O (10:4:5); CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10, lôùp döôùi)

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG SKLM (tt): + Saponin alcaloid steroid : CHCl3 – EtOH – NH4OH 1% trong H2O (2:2:1) + Dung moâi saéc kyù sapogenin: EtOH – Pyridin – H2O (3:13) CHCl3 – MeOH (19:1), (9:1) …, CHCl3 – Acetone (9:1), C6H6 – Etyl acetate (1:1), C6H6 – Acetone (9:1) C6H6 – MeOH (9:1), n-Hexane – Acetone (7:3), (4:1)…

Phaùt hieän: H2SO4 20%/coàn 50%, TT. Salkowski, TT. Liebermann - Burchard, TT ceric sulfate, TT. CarrPrice (phaùt hieän caùc daãn chaát coù noái ñoâi ôû vò trí C5 cuûa spirostane vaø caùc steroid alcaloid): daãn chaát coù noái ñoâi ôû C5 cho maøu ñoû ôû 20 oC vaø tím ñoû sau khi saáy ôû 105 oC.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG SKLM (tt): Ñeå phaùt hieän caùc daãn chaát spirostane, ngöôøi ta duøng thuoác thöû Sannieù. Phun dung dòch vanillin 1% trong coàn, saáy 120 oC trong 3 phuùt. Phun tieáp dung dòch anhydride acetic - H2SO4 (12:1), caùc daãn chaát spirostane coù maøu vaøng.

Ngoaøi ra, coù theå: - hô hôi iod - phun DD gelatin maùu - phun hoãn hôïp KMnO4 vaø Kali periodate, TT phosphomolybdic, TT Dragendoff (phaùt hieän caùc saponin alcaloid steroid  cho maøu vaøng cam)…

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG SKLM (tt) - Sapogenin coøn coù theå phaùt hieän baèng caùch phun nöôùc caát, seõ cho caùc veát maøu traéng ñuïc.

- Moät soá saponin vaø sapogenin coù nhoùm chromophore coù theå phaùt hieän baèng caùch soi U.V. Gaàn ñaây kyõ thuaät saéc kyù pha ñaûo (reversed-phase chromatography) söû duïng caùc silicagel pha ñaûo (reversed-phase silica gel) nhö RP8, RP18…. Raát höõu hieäu trong vieäc phaân laäp vaø phaùt hieän caùc saponin, nhaát laø caùc coù caáu taïo töông töï nhau vaø caùc ñoàng phaân … Dung moâi söû duïng thöôøng laø MeOH - H2O, acetonitril (CH3CN) - H2O vôùi tyû leä thay ñoåi.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG SKLM saponin trong các cây sâm Panax spp.

(N.M. Đức et al., 2010) Bản mỏng: Silica gel F254 (Merck).

Dung dịch sắc ký: - Các chất chuẩn G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, GRe, N-R1, M-R2 và các saponin toàn phần pha trong MeOH. - Cao toàn phần Nhân sâm (NS), Tam thất (TT), Sâm Mỹ (SM), Sâm Việt nam (SVN) Hệ dung môi: CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10, lớp dưới).

Thuốc thử hiện màu: H2SO4 20%/EtOH 50%, sấy 105 oC đến khi hiện màu.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG Saéc kyù loûng hieäu naêng cao (High performance liquid chromotagraphy – HPLC) Raát höõu ích trong vieäc chieát taùch, tinh cheá, ñònh tính, ñònh löôïng … saponin. Tuyø theo baûn chaát cuûa saponin vaø sapogenin caàn chieát taùch hoaëc xaùc ñònh, ngöôøi ta coù theå duøng caùc coät haáp phuï thoâng thöôøng nhö coät amino, silica gel, hydroxyapatite ….

Tuy nhieân, do saponin coù tính phaân cöïc cao,PP saéc kyù pha ñaûo vôùi silica gel; silicagel pha ñaûo RP8, RP18 … coù theå aùp duïng ñeå taùch hieäu quaû saponin.

Vì moät soá saponin khoâng mang caùc nhoùm haøm saéc (chromophore), detector UV (PDA) khoâng phaùt hieän ñöôïc  neân duøng detector RI phaùt hieän döïa vaøo trò soá khuùc xaï (refractive index), detector MS … hoaëc toát nhaát laø phoái hôïp caû hai loaïi.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG Saéc ñoà HPLC taùch HH saponin toaøn phaàn trong Nhaân saâm (Panax ginseng CA. Meyer – Araliaceae).

Ñieàu kieän: coät Ultron NH2 (Nhaât), kích thöôùc tieåu phaân 7 µm, kích thöôùc coä 4.6 x 150 mm, pha ñoäng (mobile phase): CH3CN -1,0%H3PO4 (83:17 v/v), toác ñoä: 1,0 ml/phuùt, phaùt hieân baèng UV (202 nm). Caùc pic: 1 (G-Rb1), 2 (G-Rb2), 3 (G-Rc), 4 (G-Rd), 5 (G-Rf), 8 (Malonyl G-Rb1), 9 (Malonyl G-Rb2), 10 (Malonyl G-Rd), 12ø (G-Ro)

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG HPLC định lượng asiaticoside trong cao Rau má

a

b

Sắc ký đồ HPLC của asiaticoside chuẩn (a) và cao Rau má (b) Cột Supelcosil LC 18 (250x4,6 mm), 5±0,3 µm; Detector: Photodiode Array (UV 203 nm); Pha động:CH3CN - MeOH - H2O (25 : 20 : 55); Tốc độ dòng: 0,55 ml/phút.; Thể tích bơm 20 µl, Nhiệt độ cột: 25 – 30 oC Nguyễn Minh Đức, Trần Thị Như Phượng (2011)

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG HPLC phaùt hieän glycyrrhizin trong Cam thaûo (Glycyrrhiza glabra).

(i) Saéc kyù ñoà glycyrrhizin chuaån. (1) pic glycyrrhizin. (ii) Saéc kyù ñoà dòch cao Cam thaûo. (1) pic glycyrrhizin.

Coät: Shim-pack CLC-ODS; Pha ñoäng: DD ñeäm natri phosphate 10 mM (pH 2,6) – natri perclorate 100 mM vaø acetonitril (3:2); Nhieät ñoä: 40 oC; Toác ñoä doøng: 15 ml/phuùt. Detector: UV, 250 nm.

1 1

(i)

(ii)

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG HPLC taùch G-Rg1 vaø M-R2 (NMDuc và cs., 1992) OH

Glc-O OH O OH

Majonoside-R2 HO O-Glc

Ginsenoside-Rg1

Detector RI

HO O-Glc2-Xyl

Detector UV (không phát hiện được MR2)

(i) SKÑ vôùi detector RI (phaùt hieän ñöôïc caû G-Rg1 vaø M-R2). (ii) SKÑ vôùi detector UV ôû 254 nm (M-R2 khoâng bò phaùt hieän).

Coät: ODS, 5 mm, 25 cm x 4,6 mm. Dung moâi: MeOH-H2O (60:40).

Toác ñoä doøng: 2 ml/phuùt. (NMDuc và cs., 1992)

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 2.1.8. Caùc phöông phaùp phoå (spectroscopy) - Phoå töû ngoaïi (UV) • Nhiều saponin khoâng coù nhoùm mang maøu (chromophore) neân khoâng coù phoå haáp thu UV. Caùc saponin coù mang chromophore thì coù phoå haáp thu UV töông öùng vôùi caáu taïo cuûa caùc nhoùm ñoù. Ví duï: caùc saponin coù noái ñoâi coù baêng haáp thu cöïc ñaïi trong vuøng 205-210 nm vôùi cöôøng ñoä taêng daàn theo soá noái ñoâi vaø soá nhaùnh alkyl…  Ñeå khaûo saùt phoå töû ngoaïi cuûa sapogenin, moät soá taùc giaû thöïc hieän phaûn öùng chuyeån hoùa baèng caùch hoøa sapogenin vaø H2SO4 ñaäm ñaëc roài ñem ño. Trong ñieàu kieän naøy caùc sapogenin triterpen seõ cho ñænh haáp thuï cöïc ñaïi chung ôû 310nm, trong khi caùc sapogenin steroid khoâng theå hieän.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 2.1.8. Caùc phöông phaùp phoå (tt) - Phoå hoàng ngoaïi (IR) Phoå IR cuûa saponin theå hieän caùc baêng haáp thuï ñaëc tröng töông öùng vôùi caùc nhoùm chöùc trong phaân töû.

Phoå hoàng ngoaïi cuûa saponin steroid nhoùm spirostan coù 4 baêng haáp thu ñaëc tröng cuûa maïch nhaùnh spiroacetal: + Baêng 1 ôû vaøo khoaûng 850 – 857cm-1 ñoái vôùi caùc chaát caáu hình 25S hoaëc ôû 860-866 cm-1 ñoái vôùi caùc chaát 25R. + Baêng 2 ôû ~ 900 cm-1 cho caû 2 loaïi ñoàng phaân. + Baêng 3 ôû ~ 915 cm-1 cho caû 2 loaïi ñoàng phaân. + Baêng 4 ôû ~ 980 cm-1 cho caû 2 loaïi ñoàng phaân.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 2.1.8. Caùc phöông phaùp phoå (tt) - Phoå hoàng ngoaïi (tt) Coù theå phaân bieät 2 ñoàng phaân 25S vaø 25R döïa vaøo cöôøng ñoä haáp thu baêng 2 vaø 3: + Ñoái vôùi ñoàng phaân 25R thì baêng 2 coù cöôøng ñoä haáp thu maïnh hôn baêng 3. + Ñoái vôùi ñoàng phaân 25S ngöôïc laïi. Neáu cöôøng ñoä caû 2 baêng ñeàu maïnh, hôïp chaát coù khaû naêng chöùa caû 2 loaïi ñoàng phaân.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 2.1.8. Caùc phöông phaùp phoå (tt) - Khoái phoå (mass spectroscopy) Khoái phoå cung caáp nhöõng thoâng tin veà khoái löôïng löôïng phaân töû vaø nhöõng phaân maûnh (fragments) taïo ra trong quaù trình baén phaù phaân töû. Treân cô sôû caùc döõ kieän thu ñöôïc coù theå ñoaùn bieát hoaëc xaùc ñònh caáu truùc töøng phaàn hoaëc toaøn phaàn.

Ví duï: caùc daãn chaát oleane vaø ursane coù noái ñoâi ôû 12 bò phaù vôõ ôû voøng C ñeå thaønh laäp moät ion coù noái ñoâi lieân hôïp (diene ion) chöùa voøng A vaø B theo cô cheá Diels Alder.

Thoâng tin quan troïng nhaát laø coâng thöùc phaân töû (M) döïa vaøo pic ion phaân töû (molecular ion peak). Khoái phoå coù ñoä phaân giaûi cao coøn cho ta bieát ñöôïc coâng thöùc nguyeân cuûa chaát caàn xaùc ñònh.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 2.1.8. Caùc phöông phaùp phoå (tt) - Phoå coäng höôûng töø haït nhaân (nuclear magnetic resonance spectroscopy-NMR): raát hieäu quaû trong vieäc nghieân cöùu caáu truùc caùc hôïp chaát töï nhieân.

- Phoå 1H-NMR: + Caùc nhoùm methyl tam caáp ñöôïc bieåu hieän baèng caùc ñænh ñôn (singlet), coù ñoä dôøi hoùa hoïc trong khoaûng 0.6 - 2.0 ppm. Nhoùm methyl cuûa –COO-CH3: 1.9 – 2.1 ppm. Caùc nhoùm methyl nhò caáp (secondary methyl) CH-CH3 theå hieän baèng moät ñænh ñoâi (doublet) … + Caùc nhoùm >CH-OH trong khoaûng 3 – 5.5 ppm + Noái ñoâi cho caùc tín hieäu trong khoaûng 4.8 – 5.6 ppm vôùi ñoä boäi (multiplicity) khaùc nhau tuøy theo caáu taïo cuûa noái ñoâi.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 2.1.8. Caùc phöông phaùp phoå (tt) Phoå coäng höôûng töø haït nhaân (nuclear magnetic resonance spectroscopy-NMR) (tt) + Proton anomer (anomeric proton) cuûa caùc monosacharide thöôøng theå hieän baèng moät ñænh ñoâi (doublet) trong khoaûng 4.3 – 5.9 ppm. Soá löôïng tín hieäu cuûa proton anomer cho bieát soá löôïng monosacharide trong saponin.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG

Phoå Phoå 1H-NMR cuûa vinaginsenoside-R7 (400 MHz,C5D5N).

(N. M. Duc et al, 1992)

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 2.1.8. Caùc phöông phaùp phoå (tt) - Phoå 13C-NMR Giuùp nhaän ñònh saponin moät caùch thuaän lôïi vì caùc tín hieäu phaân boá trong moät quaõng phoå roäng vaø ít bò choàng phuû.

- Caùc tín hieäu cuûa caùc carbon anomer phaân boá trong vuøng 90-112 ppm.

- Caùc tín hieäu C cuûa nhoùm –CH-OH vaø –CH2-O- cuûa ñöôøng phaân boá trong khoaûng 51-86 ppm….

- Tín hieäu cuûa carbon cuûa nhoùm methyl tam caáp thöôøng naèm trong khoaûng 12–30 ppm.

- Tín hieäu cuûa carbon coù noái ñoâi thöôøng trong khoaûng 110150 ppm.

Ngoaøi ra, caùc kyõ thuaät phoå coäng höôûng töø haït nhaân hai chieàu (2D-NMR spectroscopy) raát höõu ích trong vieäc xaùc ñònh caáu truùc cuûa saponin.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG

Phoå 13C-NMR cuûa vinaginsenoside-R7 (100 MHz,C5D5N).

(N. M. Duc et al, 1992)

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 2) Ñònh löôïng saponin - Phöông phaùp caân + Chieát xuaát döôïc lieäu baèng moät dung moâi thích hôïp (MeOH hay hoãn hôïp MeOH-H2O). + Tinh khieát hoùa (thöôøng duøng phöông phaùp tuûa trong eter hay aceton). + Loïc, thu laáy saponin. + Saáy ñeán khoái löôïng khoâng ñoåi. + Caân.

Phöông phaùp naøy cho keát quaû keùm chính xaùc, thöôøng chæ aùp cho nhöõng döôïc lieäu coù chöùa haøm löôïng saponin cao (hiện nay hầu như không còn dùng).

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 2. Ñònh löôïng saponin (tt): - Phöông phaùp ño quang + Chieát xuaát vaø tinh cheá saponin (hoaëc sapogenin). + Duøng caùc thuoác thöû thích hôïp ñeå taïo maøu (thöôøng duøng thuoác thöû vanillin/ H2SO4, Liebermann- Burchard, FeCl3…) + Ño quang ôû böôùc soùng thích hôïp ñeå suy ra haøm löôïng. + Ví duï: Duøng thuoác thöû vanillin/H2SO4 ñeå taïo maøu vaø ñònh löôïng caùc ginsenoside, acid glycyrhetic ôû  = 545nm.

Diosgenin ñöôïc ñònh löôïng baèng caùch taïo maøu vôùi FeCl3 trong moâi tröôøng H3PO4 + H2SO4 (10:1) vaø ño quang ôû  = 485 nm.

• Hiện nay ít dùng vì kém chính xác.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 2. Ñònh löôïng saponin (tt): -Phöông phaùp ñònh löôïng baèng phoå UV AÙp duïng cho nhöõng saponin hay caùc daãn chaát coù phoå haáp thu UV. Ví duï: ñònh löôïng acid glycyrizic döôùi daïng ammoni glycyrizate baèng caùch ño UV ôû  =285nm, ñònh löôïng solasodin ôû  =235nm.

Hieän nay ít aùp duïng vì khoâng chính xaùc - Phöông phaùp ñònh löôïng döïa vaøo saéc kyù Cho pheùp ñònh löôïng ñöôïc töøng saponin vaø sapogenin ñôn chaát. Raát hieäu quaû vaø thoâng duïng hieän nay. + Ño veát saéc kyù lôùp moûng (TLC densitometry). Döïa vaøo ñaäm ñoä vaø kích thöùc veát. Hieän nay ít duøng.

VI. TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG 2. Ñònh löôïng saponin (tt): - Phöông phaùp ñònh löôïng döïa vaøo saéc kyù (tt) + Saéc kyù loûng hieäu naêng cao (HPLC): raát hieäu quaû, phuø hôïp theo yeâu caàu cuûa GMP (xaùc ñònh hoaït chaát hoaëc chaát ñaùnh daáu trong döôïc lieäu vaø cheá phaåm). Thöôøng söû duïng coät pha ñaûo (RP-18), detector RI, UV + RI, MS …

- Ngoaøi ra, caùc saponin alcaloid steroid coù theå ñöôïc ñònh löôïng baèng phöông phaùp acid–base hay ñònh löôïng trong moâi tröôøng khan. Moät vaøi saponin triterpen acid cuõng coù theå ñònh löôïng baèng phöông phaùp naøy (Glycyrizin trong Cam thaûo).

VII. CHIEÁT XUAÁT SAPONIN 1. Chieát xuaát saponin - Ñoái vôùi saponin: dung moâi thöôøng duøng nhaát laø MeOH, EtOH 50-90%, nöôùc (neáu döôïc lieäu coù chöùa nhieàu chaát beùo, tröôùc ñoù coù theå loaïi boû baèng caùch chieát döôïc lieäu vôùi ether daàu hoûa, hexane…)

- Dòch chiết coàn thu ñöôïc ñem boác hôi döôùi aùp suaát giaûm ñeå thu hoài dung moâi. Phaàn dịch chiết nước đậm đặc thu ñöôïc coù theå tieáp tuïc loaïi chaát beùo baèng caùch laéc vôùi caùc dung moâi keùm phaân cöïc. Dịch nước được tiếp tục chieát phaân ñoaïn baèng n-BuOH baõo hoøa nöôùc (lắc nhiều lần đến khi chiết kiệt).

-Caát thu hoài n-BuOH döôùi aùp suaát giaûm ñeå ñöôïc saponin thoâ.

VII. CHIEÁT XUAÁT SAPONIN 1. Chieát xuaát saponin (tt) Ñeå tinh khieát hoùa caùc saponin, coù theå duøng caùc phöông phaùp sau: - Phöông phaùp tuûa: tuûa saponin trong moät löôïng lôùn ether, acetone, ether-acetone (4:1) ..

- Phöông phaùp keát tinh: keát tinh hoãn hôïp saponin töø tuûa thoâ baèng dung moâi thích hôïp. Phöông phaùp naøy khoù aùp duïng vì saponin khoù keát tinh.

- Phöông phaùp thaåm thaáu vaø ñieän thaåm thaáu: thích hôïp ñeå loaïi caùc muoái voâ cô.

- Phöông phaùp taïo boït: duøng khí trô suïc dung dòch nöôùc chöùa saponin ñeå taïo boït vaø taùch rieâng phaàn boït chöùa saponin tinh khieát hôn.

- Phöông phaùp taïo phöùc vôùi cholesterol.

VII. CHIEÁT XUAÁT SAPONIN 1. Chieát xuaát saponin (tt) - Phöông phaùp taïo daãn chaát: Ví duï: taïo daãn chaát acetyl coù theå keát tinh vaø taùch rieâng.

- Phöông phaùp taùch phaân ñoaïn baèng caùc saéc kyù coät vôùi caùc resin pha ñaûo (Ví duï: Diaion HP-20). Röûa coät chöùa hoãn hôïp saponin laàn löôït vôùi nöôùc, MeOH 10%, 50%, MeOH 100% vaø CH2Cl2, saponin chuû yeáu naèm trong phaân ñoaïn MeOH 100% vaø 50%.

- Phöông phaùp saéc kyù: ñöôïc aùp duïng nhieàu nhaát vì raát hieäu quaû. Ngoaøi vieäc tinh cheá, coøn giuùp taùch rieâng caùc saponin ñôn. Tuyø theo ñoái töôïng vaø muïc ñích coù theå duøng caùc kyõ thuaät khaùc nhau nhö saéc kyù lôùp moûng, saéc kyù coät, loïc gel (saéc kyù gel), saéc kyù loûng hieäu naêng cao…

VII. CHIEÁT XUAÁT SAPONIN 2. Chieát xuaát sapogenin Thöôøng aùp duïng trong saûn xuaát caùc sapogenin steroid, coù theå duøng acid vô cơ hoaëc enzyme, hoaëc phoái hôïp caû hai.

Thuyû phaân baèng enzyme: xay nhoû dược liệu, ngaâm nöôùc aám 37-40 oC. Thoâng thöôøng caùc enzyme coù saün trong döôïc lieäu seõ thuûy phaân saponin. Ñoâi khi ngöôøi ta cho theâm caùc enzyme ñeå giuùp söï thuûy phaân ñöôïc nhanh choùng vaø hoaøn toaøn. Thôøi gian caàn thieát cho söï thuûy phaân khoaûng 48-72 giôø.

VII. CHIEÁT XUAÁT SAPONIN 2. Chieát xuaát sapogenin(tt) Thuyû phaân baèng acid: thöôøng duøng H2SO4 hoaëc HCl nồng độ từ 2-4 N vaø ñun noùng 4-8 giôø. Noàng ñoä vaø thôøi gian thuûy phaân tuøy töøng loaïi saponin.

Sau khi thuûy phaân, ñeå nguoäi. Gaïn loïc laáy tuûa, saáy khoâ.

Chieát hoãn hôïp sapogenin baèng moät dung moâi höõu cô nhö ether daàu hoûa, hexane, …

Tinh cheá vaø taùch rieâng caùc sapogenin baèng PP keát tinh phaân ñoaïn, saéc kyù …

VIII. TAÙC DUÏNG & COÂNG DUÏNG Saponin coù taùc duïng sinh hoïc roäng: 1. Taùc duïng choáng naám Khaù phoå bieán, giuùp baûo veä, choáng söï xaâm nhaäp cuûa naám moác. Caùc chaát choáng naám ñaùng chuù yù: holotoxin A, B, C cuûa loaøi haûi saâm, caùc hôïp chaát tomatin … Noùi chung, saponin steroid coù taùc duïng choáng naám maïnh hôn saponin triterpene. Caùc monodesmoside coù maïch ñöôøng goàm 4-5 ñôn vò ñöôøng coù taùc duïng maïnh hôn caùc chaát coù 2-3 ñôn vò ñöôøng …

2. Taùc duïng khaùng khuaån Moät soá saponin coù taùc duïng khaùng khuaån ñaùng keå. Ví duï: asiaticoside coù trong Rau maù (Centella asiatica) coù taùc duïng khaùng tröïc khuaån Koch vaø Hansen, tröôùc ñaây coù ñöôïc nghieân cöùu treân laâm saøng ñeå chöõa beänh huûi.

VIII. TAÙC DUÏNG & COÂNG DUÏNG Moät soá saponin ôû trong caây döôùi daïng tieàn chaát khoâng hoaït ñoäng (inactive precusors), nhöng döôùi taùc duïng cuûa caùc enzyme phoùng thích khi moâ caây bò toån thöông hay bò voø naùt seõ taïo thaønh nhöõng chaát coù taùc duïng khaùng khuaån.

3. Taùc duïng choáng vieâm Khaù phoå bieán cuûa saponin, nhaát laø saponin steroid. Ví duï: - Glycyrhizin trong Cam thaûo (taùc duïng treân thöïc nghieäm baèng 1/5 hydrocortisone) - Saponin cuûa moät soá döôïc lieäu coù chöùa acid oleanolic nhö Ngöu Taát, Coû xöôùc, Ñôn chaâu chaáu.

- Moät soá saponin steroid nhö solanin, hecogenin, tigogenin… Caùc chaát naøy ñaõ ñöôïc söû duïng laøm thuoác choáng vieâm daïng vieân, thuoác ñaïn, thuoác môõ.

VIII. TAÙC DUÏNG & COÂNG DUÏNG 4. Taùc duïng choáng khoái u - Moät soá saponin nhö aescin, cyclamin, primula saponin, a-hederin … coù taùc duïng choáng phaân baøo in vitro vaø in vivo.

- Ginsenoside-Rh2 trong Nhaân saâm cuõng ñöôïc chöùng minh coù taùc ñoäng choáng ung thö.

- Moät soá saponin steroid nhoùm spirostane coù treân 4 ñôn vò ñöôøng (agavoside D, E, yuccoside E, H…) trong phaân töû theå hieän tính choáng ung thö treân thöïc nghieäm.

5. Taùc duïng ñoäc ñoái vôùi caù vaø moät soá coân truøng - Hoãn hôïp boninsaponin trong Schima mertansiana. Caây naøy ñöôïc duøng ñeå thuoác caù.

- Moät soá saponin coù taùc duïng dieät loaøi thaân meàm (nhuyeãn theå), vd: acid primulic trong caùc loaøi Primula

VIII. TAÙC DUÏNG & COÂNG DUÏNG 6. Taùc duïng treân heä thaàn kinh trung öông - Araloside A, B, C töø Aralia manshurica coù taùc duïng kích thích - Saponin cuûa Rau maù (Centella asiatica) vaø haït taùo coù taùc duïng an thaàn.

- Taùc ñoäng treân heä thaàn kinh trung öông thay ñoåi tuøy theo loaïi saponin nhöng noùi chung coù taùc duïng kích thích ôû lieàu nhoû vaø öùc cheá ôû lieàu cao.

7. Taùc duïng treân boä maùy & hoaït ñoäng sinh duïc Moät soá saponin coù taùc duïng dieät tinh truøng cuûa ngöôøi vaø chuoät thí nghieäm. VD: samanin D coù trong Pithecolobium saman, saponin cuûa Schefflera capiata.

Ginsenoside toaøn phaàn töø Nhaân saâm (Panax ginseng) coù taùc duïng höôùng sinh duïc treân choät.

VIII. TAÙC DUÏNG & COÂNG DUÏNG COÂNG DUÏNG - Taùc duïng long ñôøm, chöõa ho, vieâm pheá quaûn…

Saponin laø hoaït chaát chính trong moät soá döôïc lieäu nhö Cam thaûo, Caùt caùnh, Vieãn chí, Laù taùo …

- Saponin laø thaønh phaàn chính cuûa moät soá döôïc lieäu coù taùc duïng boå, taêng löïc, ñaëc bieät laø caùc döôïc lieäu töø caùc caây thuoác thuoäc Nguõ gia bì (còn gọi họ Nhân sâm Araliaccae) nhö Nhaân saâm, Saâm Vieät Nam, Tam Thaát, Nguõ gia bì gai, Nguõ gia bì chaân chim…

- Moät soá döôïc lieäu chöùa saponin ñöôïc duøng laøm thuoác trò beänh tim maïch nhö ñieàu hoøa nhòp tim, haï cholesterol maùu, ñieàu hoøa huyeát aùp, baûo veä thaønh maïch… Ví duï: moät soá caùc caây thuoác hoï Nguõ gia bì, Ngöu taát … Lieân xoâ (cuõ) duøng saponin steroid töø moät loaøi Dioscorea ñeå phoøng vaø trò cao cholesterol maùu, xô vöõa ñoäng maïch.

VIII. TAÙC DUÏNG & COÂNG DUÏNG COÂNG DUÏNG (tt) - Tính khaùng khuaån, choáng naám cuûa moät soá saponin cuõng ñöôïc öùng duïng trong trò lieäu nhö asiaticoside, tomatin…

- Moät soá saponin vaø döôïc lieäu chöùa saponin coù coâng duïng lôïi tieåu, giaûi ñoäc, choáng vieâm, choáng phuø … Ví duï: solanin, aescin, acid glycyrthetic, Ngöu taát baéc, Coû xöôùc (Ngöu taát nam), Ñôn chaâu chaáu, Raâu meøo, Rau maù, Tyø giaûi…

VIII. TAÙC DUÏNG & COÂNG DUÏNG COÂNG DUÏNG (tt) - Saponin steroid vaø saponin alcaloid steroid ñöôïc duøng laøm nguyeân lieäu baùn toång hôïp caùc thuoác steroid (steroid hormone, corticoid). Caùc chaát ñöôïc söû duïng nhieàu laø diosgenin, hecogenin vaø solasodin.

- Ngoaøi ra, saponin coøn ñöôïc duøng laøm chaát phuï gia trong ngaønh Döôïc ñeå laøm taêng tính thaám.

- Do coù taùc duïng taïo boït vaø nhuõ hoùa, saponin coøn ñöôïc duøng trong nhieàu ngaønh khaùc nhö kyõ ngheä hoùa hoïc, phim aûnh, thöïc phaåm …

VIII. TAÙC DUÏNG & COÂNG DUÏNG COÂNG DUÏNG (tt) - Tính khaùng khuaån, choáng naám cuûa moät soá saponin cuõng ñöôïc öùng duïng trong trò lieäu nhö asiaticosid, tomatin…

- Moät soá saponin vaø döôïc lieäu chöùa saponin coù coâng duïng lôïi tieåu, giaûi ñoäc, choáng vieâm, choáng phuø … Ví duï: solanin, aescin, acid glycyrthetic, Ngöu taát baéc, Coû xöôùc (Ngöu taát nam), Ñôn chaâu chaáu, Raâu meøo, Rau maù, Tyø giaûi…