BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH SÁU HỢP CHẤT ISOFLAVONE TRONG BÃ ĐẬU NÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC (2018)

LUẬN VĂN SIÊU CẤP CHANNEL

vectorstock.com/1593604

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection DẠY KÈM QUY NHƠN DISSERTATION PHÁT TRIỂN NỘI DUNG

BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH SÁU HỢP CHẤT ISOFLAVONE TRONG BÃ ĐẬU NÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC (2018) – VÕ THỊ THỦY HÀ HÓA PHÂN TÍCH – MÔI TRƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐÀ NẴNG PDF VERSION | 2018 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: BƯỚC

ĐẦU

XÁC

ĐỊNH

SÁU

HỢP

CHẤT

ISOFLAVONE TRONG BÃ ĐẬU NÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Sinh viên thực hiện

:

Võ Thị Thủy Hà

Lớp

:

14CHP

Chuyên ngành

:

Hóa phân tích – Môi trường

Khóa

:

2014

GVHD

:

TS. Bùi Xuân Vững

Đà Nẵng , ngày 19 tháng 4 năm 2018.

LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường được sự quan tâm và giúp đỡ của các thầy cô khoa Hóa Học, Trường Đại Học Sư Phạm Đà Nẵng, đặc biệt dưới sự hướng dẫn tận tình của TS Bùi Xuân Vững em đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.

Em xin trân trọng cảm ơn thầy đã luôn dành thời gian và tâm huyết của mình để truyền đạt nhiều kiến thức bổ ích, kinh nghiệm quý báu, luôn định hướng, góp ý sửa chữa những chỗ sai để từ đó giúp em biết nắm bắt kĩ lưỡng, chi tiết về nội dung, cũng như các vấn đề liên quan đến khóa luận và hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất.

Em cũng xin trân trọng cảm ơn đến các thầy cô giáo ở phòng thí nghiệm, thầy cô trong khoa Hóa cùng tất cả bạn bè và gia đình đã giúp đỡ, góp ý và chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian em thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp của mình.

Cuối cùng em xin cảm ơn các thầy cô trong hội đồng bảo vệ tốt nghiệp đã dành thời gian quý báu của mình để đọc và nhận xét cho đề tài tốt nghiệp của em.

Em xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, ngày

tháng

năm 2015

Sinh viên thực hiện:

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT HPLC

High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

OKR

Okara (bã đậu nành)

DMSO

Dimethyl sulfoxit

AOAC

Association of Official Analytical Chemists

MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 3 1.1. Giới thiệu về isoflavone ..................................................................................... 3 1.1.1. Nguồn gốc, đặc điểm, tính chất, cấu trúc và hoạt tính của isoflavone ............ 3 a) Nguồn gốc, đặc điểm .............................................................................................. 3 b) Tính chất, cấu trúc ................................................................................................. 3 1.1.2. Vai trò, ứng dụng của isoflavone ..................................................................... 6 a) Tác dụng trên chuyển hóa của xương .................................................................... 6 b) Tác dụng trên tim mạch.......................................................................................... 6 c) Tác dụng trên các chức năng nhận thức ................................................................ 7 d) Tác dụng trên các khối u phụ thuộc hormone ........................................................ 7 1.2. Giới thiệu về bã đậu nành ................................................................................. 7 1.2.1. Đặc điểm của bã đậu nành[11] ........................................................................ 8 1.2.2. Những nghiên cứu liên quan đến bã đậu nành trong công nghiệp thực phẩm 8 1.3 Tổng quan về các nghiên cứu chiết isoflavone từ bã đậu nành trong và ngoài nước............................................................................................................................ 9 1.3.1. Các nghiên cứu ngoài nước.............................................................................. 9 1.3.2. Các nghiên cứu trong nước ............................................................................ 10 1.4 Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC [8] .................... 11 1.4.1 Khái niệm ......................................................................................................... 11 a) Định nghĩa về sắc ký ............................................................................................ 11 b) Sắc ký lỏng hiệu nâng cao-HPLC ........................................................................ 11 1.4.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký...................................................................... 12

1.4.3. Những yếu tố ảnh hưởng đến sự lưu giữ các cấu tử chất tan ........................ 13 1.4.4 Đặc tính sắc kí của chất tan ........................................................................... 13 a) Tính chất lưu giữ .................................................................................................. 13 b) Hệ số phân bố K ................................................................................................... 14 c) Hệ số dung lượng k’ ............................................................................................. 14 d) Hệ số chọn lọc ...................................................................................................... 15 1.4.5 Hệ thống HPLC ............................................................................................... 16 a) Bình chứa dung môi ............................................................................................. 16 b) Áp suất trong cột tách .......................................................................................... 16 c) Hệ thống bơm ....................................................................................................... 17 d) Hệ thống tiêm mẫu ............................................................................................... 17 e) Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................................................................. 18 f) Detector ................................................................................................................. 18 g) Bộ phận ghi tín hiệu ............................................................................................. 20 h) Thiết bị in dữ liệu ................................................................................................. 20 1.4.6 Các bước tiến hành sắc ký ............................................................................... 21 a) Chuẩn bị dụng cụ và máy móc ............................................................................ 21 b) Chuẩn bị dung môi pha động .............................................................................. 21 c) Chuẩn bị mẫu đo HPLC ...................................................................................... 21 d) Cách vận hành thiết bị ........................................................................................ 21 1.5 Kết luận ............................................................................................................. 22 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 23 2.1. Nguyên liệu ....................................................................................................... 23 2.2 Hóa chất và thiết bị........................................................................................... 23 2.2.1 Hóa chất .......................................................................................................... 23

2.3 Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích ......................................................................... 25 2.4 Các phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 26 2.4.1 Khảo sát phương pháp trích ly isoflavone [3], [4] ......................................... 26 a) Quy trình công nghệ chiết isoflavone bằng phương pháp chiết lắc thông thường .................................................................................................................................. 26 b) Phương pháp trích ly isoflavone bằng phương pháp lắc có hỗ trợ siêu âm ........ 27 2.4.2 Phương pháp định tính, định lượng isoflavone bằng HPLC [1], [2], [6], [9] 28 a) Khảo sát các điều kiện tối ưu cho hệ thống HPLC để phân tích isoflavone ........ 28

•

Chọn bước sóng ................................................................................................ 28

•

Chọn tốc độ dòng .............................................................................................. 28

b) Khảo sát tỷ lệ thành phần pha động..................................................................... 29 c) Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính .................................................................... 31 d) Phân tích định tính isoflavone.............................................................................. 31 e) Phân tích định lượng isoflavone........................................................................... 31

•

Quy trình chuẩn bị mẫu đo HPLC.................................................................... 32

•

Xác định hàm lượng isoflavone ........................................................................ 32

2.4.3 Khảo sát độ lặp lại của phép đo [14] .............................................................. 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 34 3.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ thành phần pha động ................................................. 34 3.2 Kết quả khảo sát các mẫu đậu nành có isoflavone theo hệ 1. ..................... 36 3.3 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính. ............................................... 39 3.4 Khảo sát độ lặp lại của phép đo ...................................................................... 45 3.5 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) [14] ........................ 48 3.6 Kết quả định tính isoflavone trong mẫu dịch bã ........................................... 48 3.5 Kết quả đo mẫu thực ........................................................................................ 50

3.6 Áp dụng đường chuẩn trong tính toán hàm lượng isoflavone trong bã đậu nành.......................................................................................................................... 53 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 59 4.1. Kết luận ............................................................................................................ 59 4.2. Đề xuất .............................................................................................................. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 60

DANH MᝤC HĂŒNH ẢNH HĂŹnh 1.1 CẼu trĂşc hĂła háť?c cᝧa isoflavone ......................................................................3 HĂŹnh 1.1 CẼu trĂşc hĂła háť?c cᝧa Isoflavone[9]................................................................. 3 HĂŹnh 1.2: CẼu trĂşc hĂła háť?c cᝧa cĂĄc aglucones .............................................................. 4 HĂŹnh 1.3: CẼu trĂşc hĂła háť?c cᝧa cĂĄc đ?›˝- Glucozit ............................................................4 HĂŹnh 1.4: QuĂĄ trĂŹnh tĂĄch sắc kĂ­ trĂŞn cáť™t cᝧa hai chẼt A vĂ B .......................................13 HĂŹnh 1.5: SĆĄ Ä‘áť“ mĂĄy HPLC. ..........................................................................................16 HĂŹnh 2.1 BĂŁ Ä‘áş­u nĂ nh tĆ°ĆĄi, bĂŁ khĂ´ vĂ báť™t bĂŁ. .............................................................. 23 HĂŹnh 2.2 Thiáşżt báť‹ khuẼy vĂ thiáşżt báť‹ li tâm. .....................................................................24 HĂŹnh 2.3 Thiáşżt báť‹ láť?c chân khĂ´ng vĂ thiáşżt báť‹ cĂ´ quay chân khĂ´ng ................................ 24 HĂŹnh 2.4 MĂĄy lắc vĂ thiáşżt báť‹ sẼy ....................................................................................25 HĂŹnh 2.5 Tᝧ lấnh vĂ thiáşżt báť‹ cẼt nĆ°áť›c ............................................................................25 HĂŹnh 2.6 Thiáşżt báť‹ HPLC.................................................................................................25 HĂŹnh 2.7 Quy trĂŹnh chiáşżt isoflavone trong phòng thĂ­ nghiᝇm. .......................................26 HĂŹnh 2.8 Quy trĂŹnh chiáşżt isoflavone báşąng phĆ°ĆĄng phĂĄp khuẼy cĂł háť— trᝣ siĂŞu âm trong phòng thĂ­ nghiᝇm. ..........................................................................................................27 HĂŹnh 3.1 Sắc kĂ˝ Ä‘áť“ mẍu chuẊn isoflavone theo hᝇ 1 .....................................................34 .......................................................................................................................................35 HĂŹnh 3.2 Sắc kĂ˝ Ä‘áť“ mẍu chuẊn isoflavone theo hᝇ 2. ....................................................35 HĂŹnh 3.3 Sắc kĂ˝ Ä‘áť“ mẍu chuẊn isoflavone theo hᝇ 3. ....................................................35 HĂŹnh 3.4 Ä?áť“ tháť‹ biáťƒu diáť…n sáťą thay Ä‘áť•i cᝧa thĂ nh phần pha Ä‘áť™ng theo hᝇ 1. .................36 HĂŹnh 3.5 Sắc kĂ˝ Ä‘áť“ mẍu cao hất Ä‘áş­u nĂ nh. ...................................................................36 HĂŹnh 3.6 Sắc kĂ˝ Ä‘áť“ mẍu dáť‹ch hất Ä‘áş­u nĂ nh chiáşżt báşąng cáť“n 80% ..................................37 HĂŹnh 3.7 Sắc kĂ˝ Ä‘áť“ mẍu hất khĂ´. ...................................................................................37 HĂŹnh 3.8 Sắc kĂ˝ Ä‘áť“ mẍu cao bĂŁ Ä‘áş­u nĂ nh .....................................................................38

Hình 3.9 : Sắc ký đồ mẫu dịch bã đậu nành. .................................................................38 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc dện tích peak vào nồng độ Daizdin..............41 Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào glycitin. ..........................42 Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào genistin...........................42 Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của Daidzein. ...............................................43 Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ glycitein. ..........43 Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ genistein. ..........44 Hình 3.18 Sắc ký đồ mẫu dịch bã chiết bằng etanol. ....................................................51 Hình 3.19 Sắc ký đồ mẫu bã khô chiết theo AOAC với thao tác lắc. ............................ 52 Hình 3.20 Sắc ký đồ mẫu bã khô chiết theo AOAC bằng siêu âm kết hợp lắc. .............53

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Danh sách của các isoflavones[9], [3]. .......................................................... 5 Bảng 2.1. Nồng độ các chất chuẩn làm việc (µg/ml). ................................................... 31 Bảng 3.1. Kết quả đo chuẩn STD OKR1 ....................................................................... 39 Bảng 3.2. Kết quả đo chuẩn STD OKR2 ....................................................................... 39 Bảng 3.3. Kết quả đo chuẩn STD OKR3 ....................................................................... 40 Bảng 3.4. Kết quả đo chuẩn STD OKR4 ....................................................................... 40 Bảng 3.5. Kết quả đo chuẩn STD OKR5 ....................................................................... 41 Bảng 3.7. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Daidzin. ......................................... 45 Bảng 3.8. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Glycitin.......................................... 45 Bảng 3.9. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Genistin. ........................................ 46 Bảng 3.10. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Daidzein ...................................... 46 Bảng 3.11. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Glycitein. ..................................... 47 Bảng 3.12. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Genistein. .................................... 47 Bảng 3.13. Kết quả LOD và LOQ ................................................................................. 48 Bảng 3.14. Kết quả đo dịch bã chiết bằng cồn 80% ..................................................... 51 Bảng 3.15. Kết quả đo mẫu bã khô chiết theo AOAC với thao tác lắc ......................... 52 Bảng 3.15. Kết quả đo mẫu bã khô chiết theo AOAC bằng siêu âm kết hợp lắc. ......... 53 Bảng 3.16. Nồng độ các hợp chất isoflavone tính theo phương trình hồi quy .............. 54 Bảng 3.17. Hàm lượng isoflavone ................................................................................. 55 Bảng 3.18. Nồng độ các hợp chất isoflavone tính theo phương trình hồi quy .............. 56 Bảng 3.19. Hàm lượng isoflavone trong 1 g bã khô ..................................................... 56 Bảng 3.20. Nồng độ các hợp chất isoflavone tính theo phương trình hồi quy .............. 57

Bảng 3.21. Hàm lượng isoflavone trong 1g bã khô ...................................................... 58

LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong nhiều thập kỷ trước, việc sử dụng các loại thực phẩm từ đậu nành đã được cho là có liên quan đến một số lợi ích đối với sức khoẻ của con người như: chống ung thư, giảm nguy cơ của chứng loãng xương và hạ thấp mức cholesterol huyết tương…Một trong những hoạt chất quý góp phần tạo nên các khả năng phòng bệnh, chữa bệnh của đậu nành là các phytoestrogen.

Phytoestrogen là thành phần có thể gặp với hàm lượng tương đối cao ở nhiều thực phẩm quen thuộc, đặc biệt là trong đậu nành và các thực phẩm được chế biến từ đậu nành. Phytoestrogen trong đậu nành là isoflavones có cấu trúc hóa học rất gần với estrogen, một nội tiết tố nữ có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ xương, bằng cách làm giảm tỷ lệ tiêu hao xương và kích hoạt hình thành các tế bào tạo xương.

Trong tự nhiên, nguồn nguyên liệu để sản xuất isoflavone rất phong phú như: củ sắn dây, quả thạch lựu, đậu nành và đặc biệt nguồn nguyên liệu rẻ tiền từ phụ phế phẩm của ngành công nghiệp chế biến đậu nành, bột đậu nành, đậu khuôn,…rất phong phú.

Sữa đậu nành Vinasoy, Vinamilk, Tribeco… hàng năm thải ra một lượng bã rất lớn.

Riêng nhà máy Vinasoy-Quảng Ngãi mỗi ngày thải ra gần 30 tấn bã đậu nành nhưng hướng giải quyết chủ yếu là bán cho người dân làm thức ăn gia súc. Tuy nhiên, lượng bã này vẫn còn chứa một lượng các chất dinh dưỡng đáng kể: protein, hàm lượng xơ, gluxid,… và đặc biệt là hoạt chất isoflavone. Việc thu nhận isoflavone từ nguồn phụ phẩm bã đậu nành có một ý nghĩa to lớn, vừa góp phần giải quyết vấn đề môi trường và hơn hết là mang đến rất nhiều lợi ích cho con người.

Mặc dù trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về bã đậu nành (okara), nhưng tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học trong bã đậu nành (đặc biệt là các isoflavone), cũng như ứng dụng bã đậu nành trong công nghiệp thực phẩm. Hơn nữa, nguồn phế liệu là bã đậu nành thì lại rất dồi dào. Từ những lý do trên, tôi chọn đề tài: “Bước đầu xác định sáu hợp chất isoflavone trong bã đậu nành bằng phương pháp HPLC” để nghiên cứu cho đề tài tốt nghiệp của mình. Công trình nghiên cứu bã đậu nành như là một món quà nhỏ góp phần vào kho tàng tư liệu nước nhà.

1 | Page

2. Mục đích của đề tài ➢ Xây dựng phương pháp xác định isoflavone trong đậu nành bao gồm: -

Khảo sát các điều kiện trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

-

Khảo sát các quy trình xử lý mẫu.

-

Thẩm định phương pháp đã xây dựng.

➢ Áp dụng phương pháp xác định sáu hợp chất isoflavone trong bã đậu nành được thu nhận tại 5 cơ sở chế biến đậu phụ và sữa đậu nành trên địa bàn Thành phố Đà Nẵng.

2 | Page

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về isoflavone 1.1.1. Nguồn gốc, đặc điểm, tính chất, cấu trúc và hoạt tính của isoflavone a) Nguồn gốc, đặc điểm Isoflavone là phytoestrogen có nhiều trong các thành phần của thực vật tự nhiên.

Hơn 300 loài thực vật, bao gồm cả rễ và đặc biệt là hạt của chúng có chứa isoflavone.

Các nguồn chứa isoflavone nhiều hơn cả ở cây họ đậu, bông cải xanh, súp lơ, lúa mạch…và đậu nành là nguồn chính chứa isoflavone. Ngoài ra, chất chiết xuất từ rượu vang đỏ chứa một lượng nhỏ isoflavone và thực vật tự nhiên như: cỏ ba lá đỏ, mầm cỏ linh lăng, và hạt lanh đều chứa isoflavone. Trong số các nguồn trên thì đậu nành và các sản phẩm từ đậu nành là một trong những nguồn giàu isoflavone nhất[12]. b) Tính chất, cấu trúc Isoflavone là các chất hữu cơ thuộc nhóm polyphenol (các chất có nhiều vòng phenyl) có liên quan với các flavonoid (isoflavone và flavonoid khác nhau ở vị trí gắn của vòng benzen) (Kaufman và cs. 1997) [12].

Các isoflavone có hoạt tính chống oxy hóa và được coi là các chất ứng dụng trong điều trị ung thư (Salakka và cs. 2006).

Cấu trúc cơ bản của isoflavone gồm 2 vòng benzen: Avà B nối với dị vòng pyron C [9].

B

A

C

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của isoflavone Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của Isoflavone[9].

3 | Page

Isoflavone cĂł Ä‘áşżn 12 Ä‘áť“ng phân đưᝣc phân láş­p tᝍ Ä‘áş­u nĂ nh và đưᝣc xáşżp vĂ o 4 nhĂłm chĂ­nh c᝼ tháťƒ nhĆ° sau: â?– Aglycones (daidzein, genistein, glycitein).

HÏnh 1.2: CẼu trúc hóa h�c cᝧa cåc aglucones � B-glucosides (daidzin, genistin, glycitin).

HÏnh 1.3: CẼu trúc hóa h�c cᝧa cåc �- Glucozit � Malonyl-glucosides (malonyl-daidzin, malonyl-genistin, malonyl- glycitin).

4 | Page

❖ Acetyl-glucosides (acetyl-daidzin, acetyl-genistin, acetyl-glycitin).

Cấu trúc hóa học của các isoflavone của 4 nhóm trên được cho ở bảng 1.1 bởi tác giả Mortensen cùng các cộng sự.

Trong đó, hai hợp chất isoflavone quan trọng nhất là daidzein và genistein.

Bảng 1.1. Danh sách của các isoflavones[9], [3].

Tên

R1

R2

R3

Daidzein

H

H

H

Glycitein

H

OCH3

H

Genistein

OH

H

H

Daidzin

H

H

Glucosyl

Glycitin

H

OCH3

Glucosyl

Genistin

OH

H

Glucosyl

H

H

H

OCH3

OH

H

Acetyl hoặc Manolyl daidzin Acetyl hoặc Manolyl glycitin Acetyl hoặc Manolyl genistin

Glucosyl-COCH3 hoặc Glucosyl-COCH2COOH Glucosyl-COCH3 hoặc Glucosyl-COCH2COOH Glucosyl-COCH3 hoặc Glucosyl-COCH2COOH

Các hoạt chất có tác dụng “phytoestrogen” chủ yếu là daidzin và genistin.

Daidzin và genistin là những phân tử lớn, tan tốt trong nước, tính phân cực cao nên khó hấp thu qua ống tiêu hóa. Muốn cho dễ hấp thu và có giá trị sinh học, phải thủy phân chúng thành các aglycone, tức làm mất thành phần glycozit trong phân tử. Muốn vậy, cần có xúc tác enzyme đặc hiệu là glycosidase. Ống tiêu hóa của người không tạo ra được glycosidase, nên cơ thể không thể thủy phân được isoflavone. Do đó, isoflavone

5 | Page

chưa có giá trị sinh học. Ngược lại, một số tạp khuẩn định cư trong ruột sẽ tạo ra được enzyme glycosidase cần cho quá trình thủy phân nêu trên, giúp cho isoflavone được hấp thụ. Các aglycone sẽ được hấp thu ở ruột non. Lactobacillus sporogenes là vi khuẩn chính sản xuất glycosidase, giúp cân bằng tạp khuẩn ruột, xúc tác cho thủy phân daidzin và genistin sang daidzein và genistein có hoạt tính phytoestrogen [10] .

Các phytoestrogen có nhiều tác dụng sinh học khác nhau. Một trong những tác dụng quan trọng là gắn thuốc chỉ vào các thụ thể estrogen đặc hiệu, sau đó kích thích thụ thể tạo nên “tác dụng estrogen”.

1.1.2. Vai trò, ứng dụng của isoflavone a) Tác dụng trên chuyển hóa của xương Nhiều nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ gãy xương do loãng xương ở phụ nữ Châu Á thấp hơn hẳn so với các nước ở phương Tây. Sự khác biệt này có liên quan tới sử dụng nhiều thức ăn chế biến từ đậu nành. Hiệu lực của isoflavone từ đậu nành trên quá trình dinh dưỡng của xương ở phụ nữ sau mãn kinh đã cho thấy tăng có ý nghĩa về mật độ khoáng ở xương (BMD) tới các đốt sống L2-L4 khi so sánh với phụ nữ theo chế độ ăn nghèo đậu nành.

Hiệu lực của isoflavone đậu nành trên chuyển hóa của xương cũng được khẳng định trong các nghiên cứu lâm sàng khác và còn được xác minh qua các nghiên cứu trên chuột cống cắt bỏ buồng trứng. Isoflavone còn làm giảm nguy cơ loãng xương nhờ ức chế được hoạt tính của hủy cốt bào, nên có tác dụng hiệp đồng chống tiêu xương nhờ hoạt tính estrogen của thuốc này[10]. b) Tác dụng trên tim mạch Chế độ dinh dưỡng giàu đậu nành sẽ làm giảm nguy cơ bệnh động mạch vành (CHD). Isoflavone đậu nành có những tác động khác nhau chống rối loạn lipit-máu ở người mãn kinh, có thể cắt giảm được nguy cơ co tim mạch. Đậu nành và các chất chiết xuất của đậu nành cũng có những tác dụng khác có lợi cho tim mạch, đã được sơ kết bởi nhóm các chuyên gia Hội Mãn kinh Bắc Mỹ [7], [10]:  Làm giảm huyết áp tâm trương.

6 | Page

 Làm giảm cholestreron toàn phần, giảm cholestreron “xấu” (tức LDL – cholestreron), giảm triglyxerid, tăng HDL – C, giảm tỷ số cholestreron toàn phần/HDL – C, giảm tỷ số LDL – C/ HDL – C.  Chống tiểu cầu.  Ngăn chặn sự tiến triển của các mảng xơ vữa.  Cải thiện tính đàn hồi động mạch.  Chống oxy hóa, loại bỏ các gốc tự do, đối kháng với tác hại của sự lipoperoxy hóa của lecithin và của LDL – cholesterol sản sinh ra các sản phẩm cuối cùng có hại, vì các sản phẩm này có ái lực rất cao với thành động mạch và gây ra những mảng xơ vữa. c) Tác dụng trên các chức năng nhận thức Liệu pháp thay thế hormon (HRT) đã chứng tỏ có tác dụng thuận lợi trong điều trị sự suy giảm nhận thức và sa sút trí tuệ ở phụ nữ cao tuổi. Vì vậy, có thể suy ra là phytoestrogen cũng có thể có các lợi ích tương tự [10]. d) Tác dụng trên các khối u phụ thuộc hormone Tỷ lệ một số loại u phụ thuộc hormone (như u ở màng trong tử cung, ở vú, buồng trứng) thay đổi rất rõ rệt, nhưng tỷ lệ này rất thấp ở phụ nữ châu Á. Nhận xét này về dịch tễ cho thấy có liên quan đến chế độ dinh dưỡng giàu đậu nành ở dân cư châu Á.

Các nghiên cứu về thực nghiệm và lâm sàng đã chứng minh hiệu lực của phytoestrogen làm giảm nguy cơ ung thư ở màng trong tử cung, ở vú và buồng trứng.

Kết quả chưa hoàn toàn chắc chắn, cần các nguyên cứu tiếp theo để mang lại một kết luận rằng isoflavone từ đậu nành có thể ngăn ngừa hữu hiệu các loại u nêu trên. Nhưng chắc chắn rằng isoflavon từ đậu nành không làm tăng nguy cơ ung thư mặc dù isoflavone có tác dụng estrogen [10].

1.2. Giới thiệu về bã đậu nành Bã đậu nành (tên tiếng Nhật là okara) là một sản phẩm phụ được tạo ra trong quá trình sản xuất đậu phụ hoặc sữa đậu nành. Okara có nghĩa là phần cặn vỏ. Ở mỗi nước có cách gọi khác nhau như tại Trung Quốc, okara được biết đến rộng rãi nhất như douzha (cặn đậu nành), đậu phụ Zha (cặn đậu phụ) ngoài ra cũng được gọi là cặn đậu phụ Zha-

7 | Page

tsu. Đến nay thuật ngữ okara là từ chung để sử dụng cho bã đậu nành. Đây là phần bã và các chất dinh dưỡng khác không tan trong nước còn lại sau khi tách khỏi dịch các chất tan có màu trắng hay trắng ngà nằm trên mặt lưới sau khi lọc sữa (Shurtleff el al, 2004) [11].

Bã đậu nành được thu nhận thông qua quá trình ly tâm từ đậu nành sau sản xuất đậu phụ hoặc sữa đậu nành. Cứ khoảng 1,1÷1,2kg bã đậu nành tươi được tạo ra từ quá trình sản xuất 1kg đậu nành (Khare và cs., 1995).

Số lượng rất lớn của okara sản xuất hàng năm gây ra một vấn đề xử lý đáng kể.

Okara đôi khi được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi nhưng hầu hết là bán phá giá và bị đốt cháy như chất thải. Tuy nhiên, trong thành phần của okara chứa nhiều xơ và các chất khác: protein, lipit,… Các thành phần khác cũng có khả năng hiện diện trong okara bao gồm: isoflavone, lignans, phytosterol, coumestans, saponin và phytates. Hiện nay, các nghiên cứu cho thấy okara có chức năng ngăn ngừa: bệnh tiểu đường, tăng lipid máu, béo phì và có các hoạt động chống oxy hóa.

Vì vậy, okara có thể được sử dụng như một thành phần chức năng với các thuộc tính tăng cường sức khỏe. Đồng thời, việc nghiên cứu okara còn có một ý nghĩa to lớn trong việc giải quyết vấn đề về môi trường.

1.2.1. Đặc điểm của bã đậu nành[11] Okara bao gồm chủ yếu là các chất không hòa tan từ đậu tương. Do đó, nhiều celluloses và hemicelluloses, protein và chất béo.

Trong bã chứa một lượng lớn chất xơ như: cellulose, hemicellulose và lignin chiếm khoảng 50%, khoảng 25% protein, dầu 10÷15%, ít tinh bột và carbohydrate đơn giản, tro 3,5%.

1.2.2. Những nghiên cứu liên quan đến bã đậu nành trong công nghiệp thực phẩm Trong bã đậu nành ngoài thành phần có giá trị hòa tan và không hòa tan như: chất xơ, protein, chất béo,…thì trong thành phần còn chứa một hoạt chất rất quan trọng, đó là isoflavone. Isoflavones thuộc về một nhóm lớn các polyphenol, đóng một vai trò quan trọng trong sức khỏe con người. Những tên gọi như các thành phần hoạt tính sinh học thường hiện diện với lượng thấp trong thực phẩm, nhưng có một giá trị cao do chúng 8 | Page

ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Isoflavones có vai trò trong việc chữa bệnh ung thư vì có liên quan đến hormone, loãng xương, và hậu hội chứng mãn kinh. Isoflavones chiếm khoảng 0,1% vật chất khô của okara, mỗi năm nếu số lượng lớn các okara bỏ đi, thì đồng nghĩa với một lượng lớn isoflavones bị lãng phí. Chính vì thế, mà ngày càng có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt chất quý này trong và ngoài nước.

Hiện nay trên thế giới, các nghiên cứu cho thấy okara có chức năng ngăn ngừa bệnh tiểu đường, tăng lipid máu, béo phì và các hoạt động chống oxy hóa. Vì vậy, nó có thể được sử dụng như một thành phần chức năng với các thuộc tính tăng cường sức khỏe. Người ta tiến hành sấy okara tươi và nghiền ra thành bột nhằm thay thế một phần bột mì để sản xuất bún và bánh mì, cung cấp lợi ích cho người tiểu đường. Okara cũng có thể được sử dụng trực tiếp như là một sản phẩm thực phẩm, chẳng hạn như okara tempeh thường được sử dụng phổ biến ở Indonesia. Tuy nhiên, việc chấp nhận okara là sản phẩm thực phẩm cũng còn hạn chế chính vì thế mà đa phần chúng được sử dụng làm thức ăn gia súc hoặc bị bỏ đi.

Các tác giả khác khám phá việc sử dụng nó như là cơ chất cho quá trình lên men để sản xuất các thành phần có giá trị như axit xitric hoặc các kháng sinh lipopeptide iturin A. Ở Việt Nam bã đậu nành được tạo ra từ các nhà máy sản xuất sữa rất lớn. Cụ thể nhà máy sữa đậu nành Vinasoy-Bắc Ninh với công suất thiết kế 180 triệu lít/năm tương ứng với nhu cầu tiêu thụ 15 nghìn tấn đậu nành hạt/năm và tạo ra hơn 20 nghìn tấn bã đậu nành. Hai nhà máy nghiền đậu nành là nhà máy Bunge Việt Nam và nhà máy Quang Minh, hoạt động với tổng công suất tiêu thụ 4.000 tấn đậu nành một ngày, năm 2012 cung cấp cho thị trường 650.000 tấn bã đậu nành và 180.000 tấn khô dầu đậu nành.

Tuy nhiên hiện nay bã đậu nành chủ yếu làm thức ăn cho gia súc và làm phân bón vi sinh. Hầu như chưa có ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp.

1.3 Tổng quan về các nghiên cứu chiết isoflavone từ bã đậu nành trong và ngoài nước 1.3.1. Các nghiên cứu ngoài nước

9 | Page

Hiện nay, trên thế giới việc nghiên cứu chiết isoflavone từ đậu nành rất phổ biến và đang được quan tâm nhiều bởi những tác dụng tuyệt vời mà hợp chất này mang lại.

Tuy nhiên, gần đây việc nghiên cứu chiết isoflavone từ phụ phế phẩm của đậu nành là bã đậu nành đang là hướng đi mới cho nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới.

Theo Lena Jankowiak và các cộng sự (2014) trên tạp chí Food Chemistry đã sử dụng nước làm dung môi để chiết isoflavone từ okara. Tại một tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thấp là 20/1, nhiệt độ 200C, thì có đến 47% của isoflavone được chiết xuất từ ethanol 70%. Cũng với điều kiện này với thêm pH=10 khi tiến hành khai thác bằng nước thì cũng không có khác biệt mấy giữa isoflavone khai thác trong nước và trong ethanol 70%. Chính vì thế, họ đã sử dụng nước làm dung môi để chiết isoflavone từ okara [3].

Cũng từ tác giả Lena Jankowiak và các cộng sự (2014) nhưng trên tạp chí Journal of Food Engineering khi nghiên cứu về tiềm năng sản xuất isoflavone từ okara thô. Nước và ethanol là 2 dung môi được tác giả sử dụng để chiết isoflavone vì tính thân thiện với môi trường và không độc hại của chúng. Một loạt các nồng độ của ethanol đã được thử nghiệm (0÷90%) để khai thác ở nhiệt độ thường. Tác giả đã nhận thấy rằng có thể thu nhận isoflavone từ okara thô. Đồng thời, tác giả cũng đưa đến kết luận: nồng độ tối ưu của isoflavone trong chiết xuất đã đạt được với nồng độ ethanol giữa 50÷70%. Nồng độ ethanol trên 60% yêu cầu một tỷ lệ dung môi/nguyên liệu cao do độ ẩm cao trong okara.

Tăng nồng độ ethanol sẽ hạ thấp hàm lượng protein, tương ứng với sự gia tăng độ tinh khiết. Một hàm lượng nước cao trong dung môi kết hợp khai thác một số lượng lớn của các thành phần khác [3].

1.3.2. Các nghiên cứu trong nước So với thế giới thì việc tận dụng các nguồn phế phẩm từ công nghiệp thực phẩm ở trong nước để tiến hành nghiên cứu sản xuất ra sản phẩm mới vẫn còn nhiều hạn chế. Đặc biệt, việc nghiên cứu chiết tách isoflavone từ bã đậu nành vẫn chưa được quan tâm chú trọng khi mà hàng năm có rất nhiều nhà máy sản xuất sữa đậu nành đã thải ra hàng tấn phế phẩm này.

Việc nghiên cứu chiết tách isoflavone ở trong nước cũng đã có một vài nghiên cứu nhưng người ta tiến hành khai thác hoạt chất quý này chủ yếu ở các loại thực vật: sắn dây, đậu nành, cỏ 3 lá,…Theo tác giả Đỗ Thị Hoa Viên (2004) đã tiến hành tách 10 | P a g e

chiết phytoestrogen (isoflavone) từ đậu tương và sắn dây, sau đó tiến hành định tính để nhận biết sự có mặt của isoflavone bằng sắc ký bản mỏng và định lượng từng cấu tử isoflavone nhờ HPLC. Kết quả, tác giả đã khẳng định được sự có mặt của isoflavone và định lượng được 2 cấu tử có trong isoflavone là: Genistein và Daidzein [7].

Có thể nói, tính cho đến thời điểm hiện nay thì vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào tiến hành khai thác isoflavone từ bã đậu nành.

1.4 Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC [8] 1.4.1 Khái niệm a) Định nghĩa về sắc ký Định nghĩa của Mikhail S. Tsvett (1906): Sắc kí là một phương pháp tách trong đó các cấu tử của một hỗn hợp được tách trên một cột hấp thụ đặt trong một hệ thống đang chảy. Định nghĩa của IUPAC (1993): Sắc ký là một phương pháp tách trong đó các cấu tử được tách được phân bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo một hướng xác định. b) Sắc ký lỏng hiệu nâng cao-HPLC Sắc kí lỏng cột là một trong những nhánh của phân tích công cụ phát triển nhanh nhất, được áp dụng cho nhiều loại mẫu hơn bất kì kỹ thuật tách nào và có khả năng phân tích những hỗn hợp mẫu cực kì phức tạp trong hóa học và trong sinh học.

Nghiên cứu kỹ thuật tách bằng LC là cần thiết vì nó sẽ tiếp tục đóng một vai trò quan trọng trong tất cả những lĩnh vực của phân tích hóa học, mặc dù có những tiến bộ hơn nữa trong các thuốc thử chọn lọc và những cải tiến trong các kỹ thuật vật lí đo lường.

Với sự phát triển trong suốt những thập niên qua về thiết bị và sự nhồi cột, sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) nổi lên như một phương pháp được ưa thích cho kỹ thuật tách và phân tích định lượng của rất nhiều loại mẫu.

11 | P a g e

Phân tích HPLC nhanh, hiệu quả và có thể dò tìm lượng mẫu nhỏ đến 200 pg.

Những cơ hội áp dụng HPLC hầu như không giới hạn do HPLC đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong khoa học và công nghiệp.

1.4.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký Sắc ký là một kỹ thuật tách trong đó các cấu tử cần tách trong một hỗn hợp mẫu được vận chuyển bởi pha động đi qua pha tĩnh. Mẫu đi vào tướng động được mang theo dọc hệ thống sắc kí (cột) có chứa pha tĩnh phân bố đều khắp.

Trong HPLC pha động là pha lỏng, pha tĩnh có thể là một lớp phim được phủ trên bề mặt của chất mang trơ hoặc một bề mặt rắn.

Sự tương tác xảy ra giữa các cấu tử với pha tĩnh nhờ đó các cấu tử sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh. Sự ái lực khác nhau của các chất tan trên pha tĩnh làm chúng di chuyển với những vận tốc khác nhau trong pha động của hệ thống sắc kí. Kết quả là chúng được tách thành những dải trong pha động và vào lúc cuối của quá trình các cấu tử lần lượt hiện ra theo trật tự tương tác với pha tĩnh.

Cấu tử di chuyển chậm (tương tác yếu) ra trước, cấu tử bị lưu giữ mạnh hơn ra sau dưới dạng các đỉnh (pic) tách riêng rẻ và được hiển thị dưới dạng sắc kí đồ.

Mẫu Pha động

Cột nh

Detector

Sắc kí

12 | P a g e

Hình 1.4: Quá trình tách sắc kí trên cột của hai chất A và B 1.4.3. Những yếu tố ảnh hưởng đến sự lưu giữ các cấu tử chất tan Tốc độ di chuyển của một dải chất tan qua một cột hay một đĩa sắc kí lớp mỏng phụ thuộc vào sự phân bố của các phân tử chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Những nhân tố ảnh hưởng đến sự phân bố hay sự lưu giữ là: • Thành phần và tính chất của pha động.

• Kiểu và tính chất của pha tĩnh.

• Các lực tương tác các phân tử giữa các cấu tử của pha động và pha tĩnh.

• Nhiệt độ • Hai yếu tố góp phần để tách tốt các hợp chất bởi sắc kí là: o Sự khác nhau về thời gian phân bố của chúng trong 2 pha: nếu sự khác nhau càng lớn thì sự tách chúng càng tốt. o Độ doãng rộng của các pic nếu càng rộng thì sự tách chúng càng kém.

1.4.4 Đặc tính sắc kí của chất tan a) Tính chất lưu giữ Tính chất lưu giữ phản ánh sự phân bố của chất tan giữa pha tĩnh và pha động và được biểu thị bằng các đại lượng thể tích lưu hay thời gian lưu, trong đó: ▪ Thể tích lưu VR là thể tích pha động cần thiết để vận chuyển chất tan i từ thời điểm đưa mẫu vào, đi qua cột và đến detectơ (trên sắc kí đồ là điểm cực đại của pic).

▪ Thời gian lưu tRi là thời gian từ lúc chất tan i được nạp vào cột tách ở bộ phận tiêm mẫu cho đến lúc chất ra khỏi cột ở thời điểm có nồng độ cực đại.

Thể tích lưu hiệu chỉnh V’R hoặc thời gian lưu hiệu chỉnh t’R được cho bởi: V’R = VR –VM hoặc t’R = tR – tM (thời gian không bị lưu giữ của chất tan gần đúng được xem như là thời gian lưu của pha động).

13 | P a g e

áťž đây tM lĂ tháť?i gian khĂ´ng báť‹ lĆ°u giᝯ cᝧa chẼt tan (tháť?i gian chẼt tan lĆ°u trong pha Ä‘áť™ng). Trong sắc kĂ­ khĂ­, tM đưᝣc lẼy báşąng tháť?i gian cần thiáşżt cho CH4 di chuyáťƒn Ä‘i qua cáť™t.

TĆ°ĆĄng ᝊng tM cĂł tháťƒ tĂ­ch VM biáťƒu tháť‹ tháťƒ tĂ­ch tráť‘ng cᝧa cáť™t (bao gáť“m cả tháťƒ tĂ­ch cᝧa báť™ pháş­n tiĂŞm mẍu (injector), tháťƒ tĂ­ch cĂĄc Ä‘oấn áť‘ng náť‘i, tháťƒ tĂ­ch ráť—ng cᝧa chĂ­nh cáť™t vĂ tháťƒ tĂ­ch detectĆĄ). b) Hᝇ sáť‘ phân báť‘ K Máť—i cẼu táť­ hoạc chẼt tan đưᝣc phân báť‘ giᝯa 2 pha váť›i máť™t cân báşąng đưᝣc thiáşżt láş­p vĂ tẼt cả cĂĄc quĂĄ trĂŹnh tĂĄch sắc kĂ­ đưᝣc dáťąa trĂŞn sáťą khĂĄc nhau váť khả năng phân báť‘ cᝧa chẼt tan giᝯa pha Ä‘áť™ng vĂ pha tÄŠnh.

Khi chẼt tan Ä‘i vĂ o hᝇ tháť‘ng sắc kĂ­, nĂł ngay láş­p tᝊc phân báť‘ giᝯa cĂĄc pha Ä‘áť™ng vĂ pha tÄŠnh. Giả thiáşżt náşżu pha Ä‘áť™ng dᝍng lấi vĂ o bẼt kĂŹ máť™t tháť?i gian nĂ o, chẼt tan cĂł máť™t sáťą phân báť‘ cân báşąng giᝯa hai pha, vĂ náť“ng Ä‘áť™ cᝧa chẼt tan áť&#x; trong máť—i pha đưᝣc cho báť&#x;i hᝇ sáť‘ phân báť‘ nhiᝇt Ä‘áť™ng: đ??ž=

đ??śđ?‘ đ??śđ?‘€

᝞ đây CS và CM là nᝓng đ᝙ chẼt tan trong pha tĊnh và pha đ᝙ng tưƥng ᝊng.

Trư�ng hᝣp khi K = 1 thÏ chẼt tan đưᝣc phân bᝑ bẹng nhau giᝯa hai pha.

Hᝇ sáť‘ phân báť‘ xĂĄc Ä‘áť‹nh táť‘c Ä‘áť™ trung bĂŹnh cᝧa máť—i vĂšng chẼt tan (chĂ­nh xĂĄc lĂ tâm vĂšng) do pha Ä‘áť™ng váş­n chuyáťƒn khi nĂł Ä‘i qua cáť™t. c) Hᝇ sáť‘ dung lưᝣng k’ Hᝇ sáť‘ dung lưᝣng k’ lĂ thĂ´ng sáť‘ tháťąc nghiᝇm quan tráť?ng trong sắc kĂ­ cáť™t đưᝣc sáť­ d᝼ng ráť™ng rải Ä‘áťƒ mĂ´ tả cĂĄc táť‘c Ä‘áť™ dáť‹ch chuyáťƒn cᝧa cĂĄc chẼt tan trĂŞn cáť™t.

Cho máť™t chẼt tan, hᝇ sáť‘ dung lưᝣng k’ đưᝣc Ä‘áť‹nh nghÄŠa nhĆ° lĂ tᝉ sáť‘ mol chẼt tan trong pha tÄŠnh vĂ sáť‘ mol chẼt tan trong pha Ä‘áť™ng: đ?‘˜â€˛ =

đ??śđ?‘ . đ?‘‰đ?‘ đ?‘‰đ?‘ = đ??ž. đ??śđ?‘€ . đ?‘‰đ?‘€ đ?‘‰đ?‘€

Tᝉ sáť‘ VM/Vs đưᝣc gáť?i lĂ tᝉ sáť‘ tháťƒ tĂ­ch pha

14 | P a g e

Hᝇ sáť‘ dung lưᝣng còn đưᝣc Ä‘áť‹nh nghÄŠa lĂ tᝉ sáť‘ giᝯa tháť?i gian cᝧa chẼt tan lĆ°u lấi trĂŞn pha tÄŠnh vĂ tháť?i gian cần Ä‘áťƒ chẼt tan Ä‘Ăł di chuyáťƒn trong pha Ä‘áť™ng suáť‘t chiáť u dĂ i cᝧa cáť™t náşżu khĂ´ng báť‹ lĆ°u giᝯ tM. đ?‘˜â€˛ =

đ?‘Ąâ€˛đ?‘… đ?‘Ąđ?‘… − đ?‘Ąđ?‘€ đ?‘‰đ?‘… − đ?‘‰đ?‘€ = = đ?‘Ąđ?‘€ đ?‘Ąđ?‘€ đ?‘‰đ?‘€

Khi k’ cho máť™t chẼt tan nháť? hĆĄn 1 nhiáť u, sáťą ráť­a giải xảy ra rẼt nhanh nĂŞn viᝇc xĂĄc Ä‘áť‹nh tháť?i gian lĆ°u lĂ rẼt khĂł. Còn khi k’ khoảng 20 Ä‘áşżn 30 thĂŹ tháť?i gian ráť­a giải sáş˝ báť‹ kĂŠo dĂ i. VĂŹ váş­y cĂĄc phĂŠp tĂĄch nĂŞn đưᝣc tháťąc hiᝇn áť&#x; nhᝯng Ä‘iáť u kiᝇn mĂ cĂĄc k’ cᝧa cĂĄc chẼt tan náşąm trong khoảng giĂĄ tráť‹ tᝍ 1 Ä‘áşżn 5.

GiĂĄ tráť‹ k’ trong sắc kĂ­ khĂ­ cĂł tháťƒ đưᝣc thay Ä‘áť•i báť&#x;i viᝇc thay Ä‘áť•i nhiᝇt Ä‘áť™ vĂ cĂĄch nháť“i cáť™t. Còn trong sắc kĂ­ láť?ng, k’ thĆ°áť?ng đưᝣc Ä‘iáť u khiáťƒn Ä‘áťƒ cho phĂŠp tĂĄch táť‘t hĆĄn báť&#x;i thay Ä‘áť•i thĂ nh phần pha Ä‘áť™ng vĂ pha tÄŠnh. d) Hᝇ sáť‘ cháť?n láť?c Khả năng cᝧa máť™t pha tÄŠnh tĂĄch 2 cẼu táť­ A vĂ B (B lĂ cẼu táť­ báť‹ lĆ°u giᝯ mấnh hĆĄn) đưᝣc xĂĄc Ä‘áť‹nh báť&#x;i tᝉ sáť‘ phân báť‘ tĆ°ĆĄng Ä‘áť‘i cᝧa chĂşng vĂ cĹŠng lĂ nhᝯng hᝇ sáť‘ lĆ°u giᝯ cᝧa chĂşng Ä‘áť‘i váť›i máť™t pha tÄŠnh Ä‘ĂŁ cho.

Hᝇ sᝑ ch�n l�c ι là m᝙t hà m cᝧa s᝹ lưu giᝯ tưƥng đᝑi cᝧa m᝗i cẼu t᝭ trên pha tĊnh: �=

đ?‘Ąâ€˛đ?‘…2 đ?‘˜â€˛đ??ľ đ??žđ??ľ = = đ?‘Ąâ€˛đ?‘…1 đ?‘˜â€˛đ??´ đ??žđ??´

Hᝇ sáť‘ cháť?n láť?c cᝧa máť™t cạp dải (pic) gần nhau lĂ máť™t hĂ m ph᝼ thuáť™c vĂ o loấi pha tÄŠnh đưᝣc sáť­ d᝼ng, pha Ä‘áť™ng vĂ nhiᝇt Ä‘áť™ cᝧa cáť™t. Ä?áťƒ cho máť™t sáťą tĂĄch đưᝣc táť‘t thĂŹ Îą nĂŞn cĂł giĂĄ tráť‹ láť›n hĆĄn 1. Hai chẼt cần tĂĄch cĂ ng tĂĄch ra xa kháť?i nhau khi Îą cĂ ng láť›n nhĆ°ng náşżu quĂĄ láť›n thĂŹ tháť?i gian phân tĂ­ch cĂ ng kĂŠo dĂ i, Îą nĂŞn trong khoảng tᝍ 1,05 Ä‘áşżn 2,0.

15 | P a g e

1.4.5 Hệ thống HPLC Bình chứa dung môi

Cột tách

Van tiêm mẫu Computor

Sắc kí đồ

Lò ổn nhiệt

Hình 1.5: Sơ đồ máy HPLC. a) Bình chứa dung môi Bình chứa dung môi là bình thủy tinh 1 dm3 có nắp được khoan lỗ dẫn ống nhựa (Φ ≈ 1/8 inche) để dẫn dung môi từ bình đến bơm.

Dung môi bơm vào phải không được chứa bụi bẩn hoặc những vật lạ khác vì điều này có thể làm ảnh hưởng đến tuổi thọ của bơm hoặc làm kẹt các cột tách.Cần lọc dung môi qua giấy lọc 0.45µm trước khi sử dụng và để an toàn hơn ở đầu của ống nhựa trong bình chứa dung môi cần phải có đầu lọc.

Cần loại bỏ hoặc đuổi các không khí hòa tan hoặc các bọt không khí trong dung môi vì khí hòa tan có thể làm biến dạng các pic và sinh bọt khí làm nhiễu đường nền.

Loại bỏ bằng cách chạy siêu âm, hoặc sục khí trơ như heli…

Trong phương pháp rửa giải thường chỉ cần một bình dung môi. Trong phương pháp rửa giải gradient thường dùng 2, 3 hoặc 4 bình dung môi khác nhau và hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp của các loại dung môi trên được trộn với tỷ lệ biến đổi theo chương trình lập trước. b) Áp suất trong cột tách Áp suất trong cột tách có thể lớn hơn hai trăm lần áp suất khí quyển. Theo hệ

16 | P a g e

thống SI thì áp suất được tính bằng đơn vị Pascal (Pa). Áp suất của khí quyển khoảng 105 Pa. 1bar = 10 5 Pa nên 1 bar tương ứng bằng áp suất khí quyển (760 mm Hg hoặc 1 atm). Áp suất trong cột phụ thuộc vào chiều dài cột, kích thước hạt của pha tĩnh, độ nhớt và tốc độ dòng của pha động. c) Hệ thống bơm Chức năng chính của bơm là vận chuyển pha động đi qua cột tách với một tốc độ xác định. Bơm cần đáp ứng một số yêu cầu khá cao về tính năng như sau: ▪ Phía trong bơm không bị tấn công bởi bất kỳ loại dung môi nào được sử dụng.

▪ Một khoảng rộng của tốc độ dòng có thể chọn lựa và dễ thay đổi tốc độ dòng.

▪ Dễ thay đổi từ việc sử dụng dung môi này đến loại dung môi khác.

▪ Dễ bảo dưỡng và sửa chữa. Một số loại bơm thông dụng như sau: o Bơm tốc độ dòng hằng định (constant flow pump). Đây là bơm kiểu syringe đẩy dung môi liên tục, khi hết dung môi trong ống bơm (khoảng 250 ml) thì dừng lại để nạp lại. o Bơm kiểu piston thì đẩy hút luân phiên. Loại này được dùng phổ biến vì có nhiều ưu điểm. d) Hệ thống tiêm mẫu Phương pháp tiêm mẫu đầu tiên mượn kỹ thuật tiêm mẫu trong GC, trong đó dùng syringe tiêm mẫu qua một đệm cao su tự hàn kín được đặt tại đầu của bộ tiêm mẫu ở đầu cột tách.

Một phương pháp nữa là người ta dừng bơm và dùng syringe tiêm mẫu vào cột tách thông qua một cái khóa.

Phương pháp phổ biến hiện nay là dùng van tiêm mẫu có một vòng mẫu có dung tích khác nhau từ 5 đến 500 µl. Phương pháp này rất dễ sử dụng, dễ tự động hóa và cho độ chính xác rất cao, mặc dầu tương đối đắt tiền. Với phương pháp này mẫu đầu tiên ở áp suất khí quyển được tiêm bằng xilanh vào vòng mẫu. Sau đó chuyển van từ vị trí nạp mẫu đến vị trí tiêm mẫu nối vòng mẫu vào vị trí của dòng chảy của pha động, ở đây lượng mẫu chính xác trong vòng mẫu sẽ được vận chuyển vào cột tách.

17 | P a g e

e) Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao Các cột sử dụng trong HPLC được làm bằng vật liệu thép không rỉ (thép Cr-NiMo) với mặt trong của cột được làm nhẵn.

Kích thước phổ biến của một cột là đường kính ngoài bằng 6.35 mm (1/4 in.), 4.6 mm đường kính trong, và chiều dài nhiều cỡ đến 25 cm.

Cột được nhồi các hạt có cỡ đường kính 3, 4, 5, 10 µm. Chất nhồi trong cột thường là silicagen hoặc silicagen có bọc hoặc gắn hóa học một màng mỏng chất hữu cơ. Bên cạnh silicagen người ta còn dùng Al2O3, hạt polime xốp, hạt chất trao đổi ion. ❖ Bộ lọc tiền cột / cột bảo vệ Sau bộ phận tiêm mẫu và trước cột tách cần phải lắp cột bảo vệ (hay bộ lọc tiền cột) giúp bảo vệ những cột đắt tiền khỏi sự xâm nhập của của các hạt bẩn nhỏ có thể có trong dung môi và trong mẫu tiêm vào.

Cột bảo vệ không làm thay đổi hiệu quả tách của cột. Nó được thiết kế với một thể tích tổng cộng tương đối nhỏ và thể tích chết nhỏ, nhờ vậy không làm doãng pic.

Cột bảo vệ được đổ đầy các hạt nhồi tráng phim mỏng hoặc có pha liên kết như trong cột phân tích.

Cột bảo vệ có một dung lượng xác định cho chất nhiễm bẩn. Số lần tiêm mẫu, sự suy giảm của hình dáng pic hoặc độ phân giải là dấu hiệu cần phải thay cột bảo vệ. f) Detector Chức năng của detector trong HPLC là giám sát pha động đi ra từ cột phân tích.

Tín hiệu ra của detector là tín hiệu điện tỉ lệ thuận với với một vài tính chất của pha động hoặc của chất tan trong mẫu.

Có khá nhiều thiết bị được ứng dụng làm detector trong HPLC. Những đặc trưng quan trọng của detector trong HPLC là: ▪ Nhạy ▪ Tuyến tính ▪ Đáp ứng (respond) chọn lọc hoặc thông dụng

18 | P a g e

▪ Đáp ứng không bị tác động bởi những thay đổi của các điều kiện ▪ Thể tích chết thấp ▪ Không dễ bị phá hủy ▪ Rẻ tiền, đáng tin cậy và dễ sử dụng Không có detector nào có thể sở hữu tất cả những đặc trưng trên và chúng không hoàn toàn độc lập với nhau nên cải thiện một đặc tính của nó có thể làm tồi thêm cái kia.

Bất kỳ một detector nào cũng chịu tiếng ồn của thiết bị, chủ yếu là phần điện, độ lớn của nó xác định lượng chất hòa tan nhỏ nhất có thể được dò tìm. Bởi vì khi ta giảm lượng chất phân tích đến một giá trị nào đó thì tín hiệu từ detector sẽ quá nhỏ để có thể phân biệt nó với tiếng ồn của detector. Độ nhạy của detector thường được xem như nồng độ tạo ra tín hiệu cở như tín hiệu tạo ra bởi tiếng ồn.

Một detector tuyến tính có tín hiệu tỷ lệ thuận với lượng hoặc nồng độ của chất tan. Khoảng tuyến tính của detector chính là khoảng nồng độ mà sự tuyến tính này tuân theo.

Giới hạn phát hiện cho biết lượng tối thiểu của cấu tử có thể được thấy một cách đáng tin cậy trên sắc ký đồ. Về mặt thực nghiệm giới hạn dò tìm của một chất là lượng chất đó cho một pic gấp vài lần tiếng ồn của nền (thường 3 lần).

Một detector vạn năng thì nhạy với mọi thứ có trong mẫu ví dụ detector khối phổ, còn một detector chọn lọc thì chỉ nhạy với một vài cấu tử nào đó như detector ECD nhạy với hợp chất chứa halogen.

Kiểu detector

Đáp ứng

Mức ồn

Giới hạn phát Thể tích hiện (g/cm3)

flowcell (μl)

UV-VIS

Chọn lọc

10-4 a.u

10-8

1-8

Huỳnh quang

Chọn lọc

10-7 a.u

10-12

8-25

Đo độ dẫn

Chọn lọc

10-2 μS/cm

10-7

1-5

Đo chỉ số khúc xạ

Phổ thông

10-7 r.i.u

10-6

5-15

19 | P a g e

Trong HPLC thÏ detector UV- VIS là ph᝕ biến nhẼt. Nguyên tắc cᝧa nó là cho pha đ᝙ng tᝍ c᝙t đưᝣc chảy qua m᝙t ᝑng đo nh� có m᝙t chÚm bᝊc xấ đƥn sắc UV/VIS chiếu qua.

Sáťą hẼp thu bᝊc xấ cᝧa chẼt tan lĂ máť™t hĂ m ph᝼ thuáť™c tuyáşżn tĂ­nh vĂ o náť“ng Ä‘áť™ C cᝧa nĂł theo Ä‘áť‹nh luáş­t Lambert-Beer: đ??ˇ = đ?œ€đ?‘™đ??ś Trong Ä‘Ăł: D là đấi lưᝣng máş­t Ä‘áť™ quang. l lĂ chiáť u dĂ i cᝧa cell. Îľ lĂ hᝇ sáť‘ hẼp thu phân táť­ vĂ lĂ háşąng sáť‘ cho máť™t chẼt tan vĂ bĆ°áť›c sĂłng. Ä?ĆĄn váť‹ cᝧa Îľ ph᝼ thuáť™c vĂ o thᝊ nguyĂŞn cᝧa l vĂ C. Trong hĂŞ SI thᝊ nguyĂŞn cᝧa C lĂ mol m-3, l lĂ mĂŠt nhĆ°ng trong tháťąc táşż C đưᝣc Ä‘o váť›i mol dm-3 còn l lĂ cm nĂŞn Îľ lĂ dm3 mol-1 cm-1. Ä?áť‹nh luáş­t Lambert –Beer chᝉ Ä‘Ăşng khi chĂšm sĂĄng báť‹ hẼp thu lĂ Ä‘ĆĄn sắc, nhĆ°ng hᝇ tháť‘ng detector thĆ°áť?ng khĂ´ng cung cẼp chĂšm tia đᝧ Ä‘ĆĄn sắc mĂ chᝉ máť™t dải háşšp cĂĄc chĂšm tia quanh giĂĄ tráť‹ bĆ°áť›c sĂłng đưᝣc cháť?n.

Máť™t áť‘ng Ä‘o (flow cell) trong UV detector cĂł Ä‘Ć°áť?ng kĂ­nh trong khoảng 1 mm vĂ chiáť u dĂ i ĂĄnh sĂĄng Ä‘i qua khoảng 10 mm, nhĆ° váş­y tháťƒ tĂ­ch chᝊa khoảng dĆ°áť›i 8 Âľl. g) Báť™ pháş­n ghi tĂ­n hiᝇu Chᝊc năng: ghi tĂ­n hiᝇu phĂĄt hiᝇn do detector truyáť n sang. + Trong cĂĄc mĂĄy tháşż hᝇ cĹŠ thĂŹ sáť­ d᝼ng mĂĄy ghi Ä‘ĆĄn giản cĂł tháťƒ váş˝ sắc kĂ˝ Ä‘áť“, tháť?i gian lĆ°u, diᝇn tĂ­ch cᝧa peak, chiáť u cao‌. + CĂĄc mĂĄy tháşż hᝇ máť›i Ä‘áť u dĂšng phần máť m chấy trĂŞn mĂĄy tĂ­nh nĂł cĂł tháťƒ lĆ°u tẼt cả cĂĄc thĂ´ng sáť‘, pháť• Ä‘áť“ vĂ cĂĄc thĂ´ng sáť‘ cᝧa peak nhĆ° tĂ­nh Ä‘áť‘i xᝊng, hᝇ sáť‘ phân giải... trong quĂĄ trĂŹnh phân tĂ­ch Ä‘áť“ng tháť?i xáť­ lĂ˝, tĂ­nh toĂĄn cĂĄc thĂ´ng sáť‘ theo yĂŞu cầu cᝧa ngĆ°áť?i sáť­ d᝼ng nhĆ°: náť“ng Ä‘áť™, RSD‌. h) Thiáşżt báť‹ in dᝯ liᝇu

20 | P a g e

1.4.6 Các bước tiến hành sắc ký a) Chuẩn bị dụng cụ và máy móc Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt, cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi, tốc đô dòng, năng lượng đèn UV… đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra. Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về khả năng tách và rửa đúng quy định sau mỗi lần chạy sắc ký Tỷ lệ ACN hay methanol : Nước là 50 : 50 v/v cho sạch hết các chất còn đọng lại trong cột đồng thời để bảo vệ cột không bị mốc khi để lâu. Tuyệt đối tránh tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau đó để cột một thời gian không sử dụng chắc chắn cột sẽ bị mốc, hỏng không thể dùng được. Lưu ý: nếu rửa cột không tốt thì kết quả chạy sắc ký sẽ không thể đáp ứng được các yêu cầu phân tích. b) Chuẩn bị dung môi pha động Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết dành cho HPLC. Các hóa chất dùng phải là loại tinh khiết phân tích. Pha dung môi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ, để ổn định dung môi đúng thời gian theo chuyên luận đã yêu cầu. Lọc dung môi qua màng lọc 0,2 – 0,45 μm. c) Chuẩn bị mẫu đo HPLC ▪ Mẫu thử: o Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động, trong nhiều trường hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu. o Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được bằng cách lọc hay chiết … o Phải lọc và ly tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0,2 – 0,45 μm. o Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột. Có thể gây ra nghẽn cột. d) Cách vận hành thiết bị

21 | P a g e

Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất, phần mềm điều khiển hệ thống sắc ký HPLC. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc sau: ▪ Chạy máy với dung môi pha động để đuổi hết bọt khí có trong hệ thống ống dẫn trước khi cho vào cột.

▪ Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như : o Cấu hình máy o Tỷ lệ các dung môi pha động o Bước sóng, thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích yêu cầu.

1.5 Kết luận Với đề tài nghiên cứu xác định isoflavone từ nguyên liệu từ đậu nành thì trên thế giới cũng đã có khá nhiều nghiên cứu về hoạt chất quý này. Nhưng tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học trong bã đậu nành (đặc biệt là các isoflavone), cũng như ứng dụng bã đậu nành trong công nghiệp thực phẩm. Hơn nữa, nguồn phế liệu là bã đậu nành thì lại rất dồi dào. Từ những lý do trên, tôi chọn đề tài: “Bước đầu xác định sáu hợp chất Isoflavone trong bã đậu nành bằng phương pháp HPLC”

22 | P a g e

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu Mẫu bã đậu nành dùng để nghiên cứu được thu nhận ngay sau quá trình chế biến tại 5 cơ sở chế biến đậu phụ và sữa đậu nành trên địa bàn Thành phố Đà Nẵng. Nguyên liệu sau khi mang về phòng thí nghiệm được mang đi sấy trong tủ sấy 600C đến độ ẩm không đổi, nhằm hạn chế tác động xấu từ nấm mốc, tăng thời gian bảo quản. Sau đó, phối trộn các mẫu đã được sấy khô để đồng nhất, mẫu sau sấy được thu nhận bảo quản trong các lọ nhựa, bảo quản lạnh đông ở -200C, phục vụ cho quá trình nghiên cứu.

Hình 2.1 Bã đậu nành tươi, bã khô và bột bã.

2.2 Hóa chất và thiết bị 2.2.1 Hóa chất ❖ Hóa chất chiết: ▪ Ethanol tuyệt đối ≥ 99,7% của công ty cổ phần Bột giặt và Hóa chất Đức Giang Lào Cai (Việt Nam). ❖ Hóa chất phân tích HPLC ▪ Các chất chuẩn genistin, daidzin, genistein, daidzein dùng cho HPLC được mua từ hãng Sigma Mỹ.

23 | P a g e

▪

Acetone nitril (ACN) 99,8%, acid photphoric 0.05%, nước cất đề ion được lọc qua giấy lọc PTFE 0,45µm theo tiêu chuẩn HPLC.

2.2.2 Thiết bị -

Hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC Agilent 1200 ở trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng.

Đề tài sử dụng các dụng cụ tại phòng thí nghiệm gồm máy ly tâm, thiết bị siêu âm, thiết bị khuấy, máy lắc ngang, máy lọc chân không, thiết bị cô quay chân không, cân phân tích và dụng cụ thủy tinh.

Hình 2.2 Thiết bị khuấy và thiết bị li tâm.

Hình 2.3 Thiết bị lọc chân không và thiết bị cô quay chân không

24 | P a g e

Hình 2.4 Máy lắc và thiết bị sấy

Hình 2.5 Tủ lạnh và thiết bị cất nước

Hình 2.6 Thiết bị HPLC 2.3 Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích

25 | P a g e

Đề tài triển khai áp dụng một số phương pháp đã công bố trên thế giới, khảo sát và chọn lựa các điều kiện phân tích phù hợp nhất với phòng thí nghiệm. Phương pháp được lựa chọn sẽ được thẩm định và đưa ra quy trình phân tích trên mẫu thực.

2.4 Các phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Khảo sát phương pháp trích ly isoflavone [3], [4] a) Quy trình công nghệ chiết isoflavone bằng phương pháp chiết lắc thông thường

Bã đậu nành

Chiết isofalvone bằng phương pháp khuấy

Ly tâm (5000 vòng, 5

phút)

Lọc chân không

Dịch chiết

Đo HPLC

Hình 2.7 Quy trình chiết isoflavone trong phòng thí nghiệm. ❖ Thuyết minh quy trình Ở mỗi thí nghiệm, cân lượng nguyên liệu tính theo chất khô tùy thuộc độ ẩm bã đậu nành cho vào cốc 250ml. Thêm dung môi đạt tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi thích hợp.

Tiến hành chiết isoflavone bằng phương pháp khuấy thông thường ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp. Đem hỗn hợp trên đi ly tâm với tốc độ 5000 vòng trong thời

26 | P a g e

gian 5 phút để tách bớt lượng bã trong dịch chiết, sau đó lọc chân không để tách hoàn toàn bã thu được dịch lọc rồi tiến hành đo hàm lượng isoflavone bằng HPLC. b) Phương pháp trích ly isoflavone bằng phương pháp lắc có hỗ trợ siêu âm Bã đậu nành

Chiết isofalvone bằng

phương pháp khuấy có hỗ trợ siêu âm

Ly tâm (5000 vòng, 5 phút)

Lọc chân không

Dịch chiết

Đo HPLC

Hình 2.8 Quy trình chiết isoflavone bằng phương pháp khuấy có hỗ trợ siêu âm trong phòng thí nghiệm. ❖ Thuyết minh quy trình Ở mỗi thí nghiệm, cân khối lượng nguyên liệu tính theo chất khô tùy thuộc độ ẩm bã đậu nành cho vào cốc 250ml. Thêm dung môi đạt tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (tỉ lệ đã khảo sát ở quá trình chiết khuấy). Sau đó cắm ngập đầu dò siêu âm vào hỗn dịch thực hiện quá trình siêu âm. Hỗn dịch sau khi thực hiện quá trình siêu âm được đưa ra ngoài tiếp tục cho khuấy có gia nhiệt .

27 | P a g e

Tiếp đến là công đoạn ly tâm 5 phút với tốc độ 5000 vòng/phút, nhằm loại bỏ các phần tử lơ lửng rồi tiến hành đo hàm lượng isoflavone bằng HPLC. 2.4.2 Phương pháp định tính, định lượng isoflavone bằng HPLC [1], [2], [6], [9] Để định tính cũng như định lượng các cấu tử của isoflavone có trong cao chiết isoflavone tôi dùng thiết bị sắc ký lỏng cao áp hiệu nâng cao HPLC để phân tích. a) Khảo sát các điều kiện tối ưu cho hệ thống HPLC để phân tích isoflavone Chọn bước sóng Trong phép phân tích đồng thời, việc lựa chọn bước sóng rất quan trọng vì nó quyết định tới độ nhạy của phép phân tích. Do phương pháp phân tích là HPLC sử dụng đầu dò là detector UV-Vis cố định bước sóng, ta cần khảo sát điều kiện nhằm chọn bước sóng tối ưu để phân tích đồng thời các chất.

Từ quang phổ, tôi thấy rằng các chất hấp thu cực đại tại bước sóng không khác nhau nhiều và nằm trong khoảng 250 - 265nm. Vì vậy, để có bước sóng chung cho 6 chất tôi chọn bước sóng 260nm cho các thí nghiệm tiếp theo.

Chọn tốc độ dòng Tốc độ pha động cũng là yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký vì nó ảnh hưởng đến quá trình thiết lặp cân bằng của chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Tốc độ dòng quá nhỏ sẽ gây ra hiện tượng doãng peak, thời gian rửa giải lâu hơn. Tuy nhiên nếu tốc độ dòng quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp không tách khỏi nhau hoàn toàn, nghĩa là gây ra hiện tượng chồng chéo peak lên nhau. Vì vậy cần phải khảo sát để tìm ra tốc độ dòng phù hợp với hệ phân tích.

Dựa vào các tài liệu tham khảo về nghiên cứu tích isoflavone bằng HPLC sử dụng detector UV- VIS tôi nhận thấy có sự giống nhau về kết quả khảo sát thành phần pha động, nhiệt độ cột, bước sóng và tốc độ dòng [1], [2],. Chính vì thế, tôi chọn các điều kiện như sau: -

Pha động : Pha động B : Nước chứa 0,05 % acid phosphoric.

Pha động C : Acetonitrile.

-

Pha tĩnh : octadecyl silane liên kết với silicagel (ODS ; C18)

28 | P a g e

-

Thể tích tiêm mẫu : 10µl

-

Tốc độ dòng pha động: 1,5ml/phút

-

Detector : UV bước sóng 260nm.

-

Nhiệt độ buồng cột : 400C

b) Khảo sát tỷ lệ thành phần pha động Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng lớn đến quá trình rửa giải các chất mẫu ra khỏi cột. Trong phân tích HPLC, khái niệm lực rửa giải là đặc trưng cho quá trình sắc ký. Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của dung môi pha động thay đổi, nghĩa là làm thay đổi thời gian lưu của các chất phân tích qua đó làm thay đổi hệ số lưu của chất phân tích đó. Vì vậy để có được tỷ lệ thành phần pha động phù hợp theo cách thức rửa giải gradien tôi tiến hành khảo sát hệ sắc ký với tỷ lệ thành phần pha động khác nhau với các điều kiện sắc ký như nhau: -

Pha động : Pha động B : Nước chứa 0,05 % acid phosphoric.

Pha động C : Acetonitrile.

-

Pha tĩnh : octadecyl silane liên kết với silicagel (ODS ; C18)

-

Thể tích tiêm mẫu : 10µl

-

Tốc độ dòng pha động: 1,5ml/phút

-

Detector : UV bước sóng 260nm.

-

Nhiệt độ buồng cột : 400C

Hệ 1 : Thời gian

%B

%C

0.00

100.0

0.0

5.00

90.0

10.0

5.10

70.0

30.0

60.1

10.0

90.0

29 | P a g e

65.1

100.0

0.0

80.00

100.0

0.00

Thời gian

%B

%C

0.00

100.0

0.0

5.00

90.0

10.0

5.10

60.0

40.0

60.1

10.0

90.0

65.1

100.0

0.0

80.00

100.0

0.00

Thời gian

%B

%C

0.00

100.0

0.0

5.00

90.0

10.0

5.10

75.0

25.0

60.1

10.0

90.0

65.1

100.0

0.0

80.00

100.0

0.0

Hệ 2

Hệ 3

30 | P a g e

c) Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính Để xác định khoảng tuyến tính tôi tiến hành chuẩn bị một dãy các chất chuẩn có nồng độ thay đổi theo AOAC 2008:83 là daidzin, glycitin, genistin, daidzein, glycitein, genistein.

Bảng 2.1. Nồng độ các chất chuẩn làm việc (µg/ml).

Mẫu OKR chuẩn

Daidzin

Glycitin

Genistin

STD OKR1

1.545826

1.521483

1.448452 0.973749 1.618858 1.278046

STD OKR2

3.091653

3.042965

2.896903 1.947498 3.237715 2.556091

STD OKR3

6.183306

6.085931

5.793806 3.894996 6.475431 5.112182

STD OKR4

12.36661

12.17186

11.58761 7.789992 12.95086 10.22436

STD OKR5

24.78627

24.39593

23.22493

Daidzein Glycitein Genistein

15.6134

25.95727 20.49258

Vì các chuẩn OKR rất đắt tiền, điều kiện lại không cho phép nên tôi không pha trực tiếp, các dãy chuẩn có được nhờ sự giúp đỡ của công ty Vinasoy. Với chuẩn Stock pha trong DMSO, chuẩn làm việc pha trong Acetonitril 40%.

Sau khi chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn tôi tiến hành chạy các khoảng nồng độ từ STDOKR 1-STDOKR 5 như trên để có được diện tích peak, từ đó vẽ đồ thị biểu sự tương quan giữa nồng độ và diện tích peak, đánh giá tính tuyến tính. d) Phân tích định tính isoflavone Để định tính isoflavone tôi tiến hành chuẩn bị mẫu dung dịch chuẩn isoflavone và mẫu dịch thử và đo trong cùng điều kiện sắc ký đã khảo sát. Sau đó, so sánh giữa sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu dịch thử (dựa vào thời gian lưu) để định danh các chất. e) Phân tích định lượng isoflavone

31 | P a g e

Quy trình chuẩn bị mẫu đo HPLC ❖ Đối với dịch chiết [1], [6] Lấy 7,5ml dịch chiết cho vào bình định mức 25ml, thêm vào 8,5ml Acteonitril.

Lắc 60 phút với tốc độ 140 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, chuyển vào ống ly tâm và thêm vào 4ml nước cất. Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút.

Cuối cùng, chuyển dịch chiết vào bình định mức 10ml (bảo quản ở 180C). Lọc qua màng PTFE 0,2 µm và đo HPLC. ❖ Đối với mẫu khô : Có 3 quy trình theo AOAC ➢ Quy trình xử lý mẫu với thao tác lắc [5],[13] Cân 1.0619g mẫu bã ẩm (tương đương 1g mẫu khô) cho vào bình tam giác 100ml, thêm vào 8.5ml Acetonitril. Lắc 60 phút với tốc độ 140 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng.

Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào ống ly tâm và dùng 5 ml nước cất để tráng bình (nước tráng cũng cho vào ống ly tâm). Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút. Cuối cùng, chuyển dịch chiết vào bình định mức 25ml (bảo quản ở -180C).

Lọc qua màng PTFE 0,2 µm và đo HPLC. ➢ Quy trình xử lý mẫu bằng siêu âm kết hợp lắc[5],[1], [13] Cân 1.0619g mẫu bã ẩm (tương đương 1g mẫu khô) cho vào bình tam giác 100ml, thêm vào 8.5ml Acetonitril. Đem đi siêu âm trong vòng 10 phút. Sau đó, lắc 60 phút với tốc độ 140 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Chuyển toàn bộ dung dịch vào ống ly tâm và dùng 5ml nước cất để tráng bình (nước tráng cũng cho vào ống ly tâm). Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút. Cuối cùng, chuyển dịch chiết vào bình định mức 25ml (bảo quản ở -180C). Lọc qua màng PTFE 0,2 µm và đo HPLC. Xác định hàm lượng isoflavone Sau khi chuẩn bị mẫu tôi tiến hành đo mẫu trong điều kiện sắc ký đã khảo sát.

Dựa vào thời gian lưu và diện tích peak đo được, tôi tính toán được nồng độ từng hợp chất isoflavone trong dung dịch theo phương trình đường chuẩn. Từ đó xác định được hàm lượng isoflavone tổng số X (g/g) trên khối lượng chất khô của mẫu nguyên liệu ban đầu.

32 | P a g e

2.4.3 Khảo sĂĄt Ä‘áť™ lạp lấi cᝧa phĂŠp Ä‘o [14] Máť™t phĆ°ĆĄng phĂĄp phân tĂ­ch táť‘t ngoĂ i yĂŞu cầu váť Ä‘áť™ Ä‘Ăşng cᝧa phĆ°ĆĄng phĂĄp, ngĆ°áť?i ta còn chĂş Ă˝ Ä‘áşżn Ä‘áť™ lạp lấi cᝧa phĆ°ĆĄng phĂĄp. Ä?áť™ lạp lấi cᝧa hᝇ tháť‘ng sắc kĂ˝ đưᝣc khảo sĂĄt báşąng cĂĄch tiĂŞm lạp 5 lần cĂšng máť™t mẍu chuẊn háť—n hᝣp cĂĄc isoflavone vĂ o hᝇ tháť‘ng sắc kĂ˝ váť›i Ä‘iáť u kiᝇn táť‘i Ć°u Ä‘ĂŁ đưᝣc khảo sĂĄt. Káşżt quả đưᝣc Ä‘ĂĄnh giĂĄ thĂ´ng qua Ä‘áť™ lᝇch chuẊn (SD), Ä‘áť™ lᝇch chuẊn tĆ°ĆĄng Ä‘áť‘i (RSD) cᝧa tháť?i gian lĆ°u tR. GiĂĄ tráť‹ trung bĂŹnh : Ä?áť™ lᝇch chuẊn:

Ä?áť™ lᝇch chuẊn:

đ?‘ĽĚ… =

1 đ?‘›

∑đ?‘›đ?‘–=1 đ?‘Ľđ?‘–

2 ∑đ?‘› đ?‘–=1(đ?‘Ľđ?‘– −đ?‘ĽĚ… )

SD = √

đ?‘›âˆ’1

�

đ?‘…đ?‘†đ??ˇ(%) = Ă— 100 đ?‘ĽĚ…

33 | P a g e

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ thành phần pha động Kết quả khảo sát thời gian lưu và độ phân giải của isoflavone khi rửa giải bằng chương trình gradien với tỷ lệ thành phần pha động khác nhau được thể hiện trên hình 3.1, 3.2 và 3.3

Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ 1

34 | P a g e

Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ 2.

Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ 3.

Nhận xét : Kết quả khảo sát cho thấy hệ 1 cho hiệu quả tách isoflavone trong mẫu chuẩn là tốt nhất, sắc ký đồ có đủ sáu peak của sáu hợp chất isoflavone cần phân tích và các peak phân tách rõ ràng, không bị chồng peak lên nhau. Trong khi đó, hệ 2 và hệ 3 cho

35 | P a g e

sắc ký đồ với các peak không phân tách rõ ràng, xếp chồng lên nhau. Do đó, tôi lựa chọn pha động theo hệ 1 cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.2 Kết quả khảo sát các mẫu đậu nành có isoflavone theo hệ 1.

Sau khi chọn pha động theo hệ 1, tôi tiến hành khảo sát các mẫu đậu nành có isoflavone theo hệ này và kết quả được thể hiện trong hình 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi của thành phần pha động theo hệ 1. ➢

Mẫu cao hạt đậu nành

Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu cao hạt đậu nành.

36 | P a g e

➢ Mẫu dịch hạt đậu nành chiết bằng cồn 80%

Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu dịch hạt đậu nành chiết bằng cồn 80% ➢ Mẫu hạt khô

Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu hạt khô. ➢ Mẫu cao bã đậu nành

37 | P a g e

Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu cao bã đậu nành ➢ Mẫu dịch bã đậu nành

Hình 3.9 : Sắc ký đồ mẫu dịch bã đậu nành. ➢ Nhận xét : Kết quả khảo sát cho thấy các mẫu đậu nành chạy theo hệ pha động đã chọn (hệ 1) cho kết quả các peak phân tách rõ ràng nên tôi tiến hành chiết và đo mẫu theo hệ 1 và tính toán kết quả.

38 | P a g e

3.3 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính. ❖

Kết quả đo dãy dung dịch chuẩn STD OKR 1-» STD OKR5 Bảng 3.1. Kết quả đo chuẩn STD OKR1

STD OKR1

Thời gian lưu ( t lưu)

Diện tích peak (Speak)

Daidzin

17.582

33.0

Glycitin

19.356

28.5

Genistin

24.462

36.5

Daidzein

35.840

24.3

Glycitein

39.473

42.8

Genistein

47.840

45.9

Bảng 3.2. Kết quả đo chuẩn STD OKR2 STD OKR2

Thời gian lưu ( t lưu)

Diện tích peak (Speak)

Daidzin

17.585

61.8

Glycitin

19.373

57.1

Genistin

24.470

76.0

Daidzein

35.809

50.1

Glycitein

39.483

83.1

Genistein

47.836

102.3

39 | P a g e

Bảng 3.3. Kết quả đo chuẩn STD OKR3 STD OKR3

Thời gian lưu ( t lưu)

Diện tích peak (Speak)

Daidzin

17.575

128.0

Glycitin

19.370

111.3

Genistin

24.508

161.9

Daidzein

35.901

109.1

Glycitein

39.528

157.4

Genistein

47.940

172.4

Bảng 3.4. Kết quả đo chuẩn STD OKR4 STDOKR2

Thời gian lưu ( t lưu)

Diện tích peak (Speak)

Daidzin

17.322

233.8

Glycitin

19.110

218.2

Genistin

24.230

323.2

Daidzein

35.515

212.2

Glycitein

39.132

321.7

Genistein

47.549

402.8

40 | P a g e

Bảng 3.5. Kết quả đo chuẩn STD OKR5 Thời gian lưu ( t lưu)

STD OKR5

Diện tích peak (Speak)

Daidzin

17.490

486

Glycitin

19.142

455.7

Genistin

24.899

668.7

Daidzein

36.307

450.9

Glycitein

39.879

641.7

Genistein

47.902

788.2

❖ Xây dựng đường chuẩn S peak

Đường chuẩn daidzin

900 800 700 600

y = 19.394x + 2.4436 R² = 0.9992

500 400 300 200 100 0 0

5

10

15

20

25

Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc dện tích peak vào nồng độ Daizdin.

41 | P a g e

Đường chuẩn glycitin 900 800 700 600

y = 18.624x - 1.7143 R² = 0.9995

500 400 300 200 100 0 0

5

10

15

20

25

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào glycitin.

S peak

Đường chuẩn Genistin

900 800 700 600

y = 29.025x - 7.686 R² = 0.9998

500 400 300 200 100 0 0

5

10

15

20

25

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào genistin.

42 | P a g e

Đường chuẩn Daidzein

S peak 900 800 700 600

y = 29.087x - 6.4813 R² = 0.9993

500 400 300 200 100 0 0

5

10

15

20

25

Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của Daidzein. Đường chuẩn Glycitein

S peak 900 800

700 600 500

y = 24.644x + 1.7139 R² = 0.9999

400 300 200 100 0 0

5

10

15

20

25

Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ glycitein.

43 | P a g e

Đường chuẩn Genistein

S peak 900

800 700 600

y = 38.833x - 5.7301 R² = 0.9983

500 400 300 200 100 0 0

5

10

15

20

25

Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ genistein.

Dựa vào kết quả khảo sát, ta có các phương trình hồi quy sau được biểu diễn trong hình 3.10, 3.11, 3.12, 3.13, 3.14, 3.15 và bảng 3.6 Bảng 3.6. Phương trình hồi quy của sáu hợp chất isoflavone.

Phương trình hồi quy

Hệ số tương quan

Khoảng nồng độ tuyến

R2

tính (µg/ml)

Daidzin

y = 19.394x + 2.4436

0.9992

1.545826 - 24.78627

Glycitin

y = 18.624x - 1.7143

0.9995

1.521483 - 24.39593

Genistin

y = 29.025x - 7.686

0.9998

1.448452 - 23.22493

Daidzein

y = 29.087x - 6.4813

0.9993

0.973749 - 15.61340

Glycitein

y = 24.644x + 1.7139

0.9999

1.618858 - 25.95727

Genistein

y = 38.833x - 5.7301

0.9983

1.278046 - 20.49258

➢ Nhận xét:

44 | P a g e

➢ Qua các kết quả phân tích và thống kê cho thấy, tỷ lệ diện tích peak sắc ký và nồng độ các isoflavone phụ thuộc tuyến tính với nhau một cách chặt chẽ với hệ số tương quan cao. Do đó, ta có thể sử dụng các phương pháp đường chuẩn để định lượng isoflavone trong mẫu thật ở khoảng tuyến tính đã khảo sát.

3.4 Khảo sát độ lặp lại của phép đo Bảng 3.7. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Daidzin.

Thời gian lưu của Daidzin STT Thời gian lưu 1

17.582

2

17.585

3

17.575

Các thông số thống kê Giá trị trung bình: Xtb= 17.511 Độ lệch chuẩn SD = 0.106

4

17.322

5

17.490

Độ lệch chuẩn tương đối RSD(%) = 0.605%

Bảng 3.8. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Glycitin.

Thời gian lưu của Glycitin STT Thời gian lưu 1

19.356

2

19.373

3

19.370

Các thông số thống kê Giá trị trung bình: Xtb= 19.270 Độ lệch chuẩn SD = 0.162

4

19.110

5

19.142

Độ lệch chuẩn tương đối RSD(%) = 0.84%

45 | P a g e

Bảng 3.9. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Genistin.

Thời gian lưu của Genistin STT Thời gian lưu 1

24.462

2

24.470

3

24.508

Các thông số thống kê Giá trị trung bình: Xtb= 24.513 Độ lệch chuẩn SD = 0.242

4

24.230

5

24.899

Độ lệch chuẩn tương đối RSD(%) = 0.98%

Bảng 3.10. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Daidzein Thời gian lưu của Daidzein STT Thời gian lưu 1

35.840

2

35.809

3

35.901

Các thông số thống kê Giá trị trung bình: Xtb= 35.874 Độ lệch chuẩn SD = 0.284

4

35.515

5

36.307

Độ lệch chuẩn tương đối RSD(%) = 0.79%

46 | P a g e

Bảng 3.11. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Glycitein.

Thời gian lưu của Glycitein STT Thời gian lưu 1

39.473

2

39.483

3

39.528

Các thông số thống kê Giá trị trung bình: Xtb= 39.499 Độ lệch chuẩn SD = 0.265

4

39.132

5

39.879

Độ lệch chuẩn tương đối RSD(%) = 0.67%

Bảng 3.12. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Genistein.

Thời gian lưu của Genistein STT Thời gian lưu 1

47.840

2

47.836

3

47.940

Các thông số thống kê Giá trị trung bình: Xtb= 47.813 Độ lệch chuẩn SD = 0.154

4

47.549

5

47.902

Độ lệch chuẩn tương đối RSD(%) = 0.32%

➢ Nhận xét: Theo kết quả khảo sát tôi nhận thấy độ lệch chuẩn tương đối của các chất đều nhỏ hơn 1%. Như vậy, hệ thống sắc ký HPLC có độ lặp lại tốt, quy trình phân tích ổn định và có thể áp dụng để phân tích mẫu thật.

47 | P a g e

3.5 Gi᝛i hấn phåt hiᝇn (LOD), gi᝛i hấn đᝋnh lưᝣng (LOQ) [14] Gi᝛i hấn phåt hiᝇn đưᝣc xem là nᝓng đ᝙ thẼp nhẼt cᝧa chẼt phân tích mà hᝇ thᝑng phân tích còn cho tín hiᝇu phân tích khåc có nghĊa v᝛i tín hiᝇu cᝧa mẍu trắng hay tín hiᝇu nᝠn.

LOD =

3 Ă— đ?‘†đ?‘Œ/đ?‘‹ a

Gi᝛i hấn đᝋnh lưᝣng đưᝣc xem là nᝓng đ᝙ thẼp nhẼt (xQ) cᝧa chẼt phân tích mà hᝇ thᝑng phân tích đᝋnh lưᝣng đưᝣc v᝛i tín hiᝇu phân tích (yQ) khåc có ý nghĊa đᝋnh lưᝣng v᝛i tín hiᝇu cᝧa mẍu trắng hay tín hiᝇu nᝠn.

LOQ = 3 × LOD Trong đó: ▪ a là hᝇ sᝑ góc trong phưƥng trÏnh hᝓi quy ▪ SY/X là đ᝙ lᝇch chuẊn cᝧa mẍu trắng, đưᝣc xåc đᝋnh theo hà m LINEST bẹng excel 2016 ➢ Kết quả LOD và LOQ đưᝣc trÏnh bà y trong bảng 3.13 Bảng 3.13. Kết quả LOD và LOQ Phưƥng trÏnh hᝓi quy

SY/X

LOD (Âľg/ml)

LOQ (Âľg/ml)

Daidzin

y = 19.394x + 2.4436

6.124951

0.94745

3.15817

Glycitin

y = 18.624x - 1.7143

4.601053

0.74115

2.47050

Genistin

y = 29.025x - 7.686

3.724970

0.38501

1.28337

Daidzein

y = 29.087x - 6.4813

5.299281

0.54656

1.82187

Glycitein y = 24.644x + 1.7139

2.575494

0.313521

1.045069

Genistein y = 38.833x - 5.7301

14.51576

1.121394

3.737979

3.6 Kết quả đᝋnh tính isoflavone trong mẍu dᝋch bã 48 | P a g e

➢

Mẫu dịch cốt bã: Mẫu được xử lý và chuẩn bị theo quy trình 2.4.2.5.1

➢

Mẫu dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn isoflavone được pha trong Acetonitril.

➢

Điều kiện sắc ký: -

Pha động :

Pha động B : Nước chứa 0,05 % acid phosphoric.

Pha động C : Acetonitrile.

-

Pha tĩnh : octadecyl silane liên kết với silicagel (ODS ; C18)

-

Thể tích tiêm mẫu : 10µl

-

Tốc độ dòng pha động: 1,5ml/phút

-

Detector : UV bước sóng 260nm.

-

Nhiệt độ buồng cột : 400C

➢ Kết quả sắc ký đồ mẫu dịch cốt bã và mẫu dung dịch chuẩn được thể hiện ở hình 3.16 và 3.17

Hình 3.16: Sắc ký đồ isoflavone trong mẫu dung dịch chuẩn.

49 | P a g e

Hình 3.17: Sắc ký đồ isoflavone trong mẫu dịch cốt bã. ➢ Nhận xét: Dựa vào kết quả sắc ký đồ mẫu dịch chuẩn isoflavone và mẫu dịch thử, tôi định danh các hợp chất isoflavone trong mẫu thử theo thời gian lưu. Kết quả cho thấy: Thời gian lưu của các píc lần lượt là: daidzin (17 phút), glycitin (19 phút), genistin (24 phút), diadzein (36 phút), glycitein (39 phút), genistein (47 phút).

3.5 Kết quả đo mẫu thực ❖ Kết quả đo dịch bã chiết bằng cồn 80%, tỉ lệ bã khô/dung môi=20/1 ở 60oC được trình bày trong bảng 3.14 với mẫu được chuẩn bị như sau: 50g bã khô chiết bằng cồn 80%, tỉ lệ bã khô/ dung môi là 20/1 ở 60oC theo quy trình chiết đã khảo sát thu được 60ml dịch chiết. Lấy chính xác 4ml dịch chiết, thêm vào 5ml Acteonitril. Lắc 60 phút với tốc độ dòng 150 vòng/ phút. Sau đó, chuyển toàn bộ dịch vào ống ly tâm, tráng bình bằng 1ml nước cất cho vào ống ly tâm. Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/ phút trong vòng 5 phút. Cuối cùng, chuyển dịch chiết vào bình định mức 10ml (bảo quản ở -180C). Lọc qua màng PTFE 0,2 µm và đo HPLC.

50 | P a g e

Hình 3.18 Sắc ký đồ mẫu dịch bã chiết bằng etanol.

Bảng 3.14. Kết quả đo dịch bã chiết bằng cồn 80%

❖

Thời gian lưu

Diện tích peak

Daidzin

17.461

228.6

Glycitin

19.222

70.3

Genistin

24.934

322.1

Daidzein

38.085

2043.1

Glycitein

41.372

298.0

Genistein

49.090

2807.5

Kết quả đo mẫu bã khô chiết theo AOAC với quy trình xử lý mẫu với thao tác lắc ở mục 2.4.2 được thể hiện trong bảng 3.15 và hình 3.19

51 | P a g e

Hình 3.19 Sắc ký đồ mẫu bã khô chiết theo AOAC với thao tác lắc.

Bảng 3.15. Kết quả đo mẫu bã khô chiết theo AOAC với thao tác lắc

❖

Thời gian lưu

Diện tích peak

Daidzin

18.014

14.8

Glycitin

19.994

3.10

Genistin

24.494

9.20

Daidzein

38.570

213.6

Glycitein

41.835

22.40

Genistein

49.457

272.6

Kết quả đo mẫu bã khô chiết theo AOAC với quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp siêu âm kết hợp lắc ở mục 2.4.2được thể hiện trong bảng 3.16 và hình 3.20

52 | P a g e

Hình 3.20 Sắc ký đồ mẫu bã khô chiết theo AOAC bằng siêu âm kết hợp lắc.

Bảng 3.15. Kết quả đo mẫu bã khô chiết theo AOAC bằng siêu âm kết hợp lắc.

Thời gian lưu

Diện tích peak

Daidzin

18.072

43.8

Glycitin

19.919

17.6

Genistin

24.655

33.7

Daidzein

38.597

396.7

Glycitein

41.429

72.9

Genistein

49.506

386.1

➢ Nhận xét: Kết quả phân tích cho thấy có sự ảnh hưởng của siêu âm đến kết quả isoflavone.

Mẫu xử lý bằng siêu âm kết hợp lắc cho kết quả hàm lượng isoflavone cao hơn so với mẫu xử lý với thao tác lắc.

3.6 Áp dụng đường chuẩn trong tính toán hàm lượng isoflavone trong bã đậu nành 53 | P a g e

â?– Mẍu dáť‹ch cáť‘t bĂŁ chiáşżt báşąng cáť“n 80% HĂ m lưᝣng cĂĄc isoflavone trong mẍu đưᝣc tĂ­nh theo cĂ´ng thᝊc: đ??ś (Âľg/g) = đ??śđ?‘‹ Ă— đ??š Ă—

�

(3.1)

đ?‘šđ?‘šáşŤđ?‘˘ đ?‘˜â„ŽĂ´

Trong Ä‘Ăł: â–Ş CX lĂ náť“ng Ä‘áť™ chẼt phân tĂ­ch tĂ­nh theo phĆ°ĆĄng trĂŹnh háť“i quy (Âľg/ml). â–Ş V lĂ tháťƒ tĂ­ch dáť‹ch chiáşżt (ml). V= 60ml â–Ş F lĂ hᝇ sáť‘ pha loĂŁng. Trong trĆ°áť?ng hᝣp nĂ y F=10/4 â–Ş mbĂŁ khĂ´ = 50g ➢ Káşżt quả náť“ng Ä‘áť™ cĂĄc hᝣp chẼt isoflavone tĂ­nh theo phĆ°ĆĄng trĂŹnh háť“i quy báşąng Excel 2016 đưᝣc trĂŹnh bĂ y trong bảng 3.16.

Bảng 3.16. Nᝓng đ᝙ cåc hᝣp chẼt isoflavone tính theo phưƥng trÏnh hᝓi quy CX (¾g/ml) Daidzin

11.66

Glycitin

3.68

Genistin

10.83

Daidzein

70.02

Glycitein

12.02

Genistein

72.44

➢ Kết quả hà m lưᝣng isoflavone tính theo công thᝊc 3.1 bẹng Excel 2016 đưᝣc trÏnh bà y trong bảng 3.17

54 | P a g e

Bảng 3.17. Hà m lưᝣng isoflavone Hà m lưᝣng ¾g/g

â?–

Daidzin

34.98

Glycitin

11.60

Genistin

34.09

Daidzein

211.39

Glycitein

36.07

Genistein

217.33

T᝕ng hà m lưᝣng isoflavone

545.46

Mẍu bã khô chiết theo AOCA v᝛i thao tåc lắc

HĂ m lưᝣng cĂĄc isoflavone trong mẍu đưᝣc tĂ­nh theo cĂ´ng thᝊc: đ??ś = đ??śđ?‘‹ Ă—

đ?‘‰ đ?‘šđ?‘?ĂŁ đ?‘˜â„ŽĂ´

(3.2)

Trong Ä‘Ăł: â–Ş CX lĂ náť“ng Ä‘áť™ chẼt phân tĂ­ch tĂ­nh theo phĆ°ĆĄng trĂŹnh Ä‘Ć°áť?ng chuẊn (Âľg/ml) â–Ş V lĂ tháťƒ tĂ­ch dáť‹ch chiáşżt (ml) â–Ş m bĂŁ khĂ´ = 1g ➢ Káşżt quả náť“ng Ä‘áť™ cĂĄc hᝣp chẼt isoflavone tĂ­nh theo phĆ°ĆĄng trĂŹnh háť“i quy báşąng Excel 2016 đưᝣc trĂŹnh bĂ y trong bảng 3.18

55 | P a g e

Bảng 3.18. Nồng độ các hợp chất isoflavone tính theo phương trình hồi quy CX (µg/ml) Daidzin

0.64

Glycitin

0.07

Genistin

0.05

Daidzein

7.12

Glycitein

0.84

Genistein

7.17

➢ Kết quả hàm lượng isoflavone tính theo công thức 3.2 bằng Excel 2016 được trình bày trong bảng 3.19 Bảng 3.19. Hàm lượng isoflavone trong 1 g bã khô Hàm lượng µg/g Daidzin

8.64

Glycitin

3.51

Genistin

7.83

Daidzein

102.20

Glycitein

11.34

Genistein

96.80

Tổng hàm lượng isoflavone trong 1g

230.32

bã khô

56 | P a g e

â?–

Mẍu bã khô chiết theo AOAC bẹng siêu âm kết hᝣp lắc

HĂ m lưᝣng cĂĄc isoflavone trong mẍu đưᝣc tĂ­nh theo cĂ´ng thᝊc: đ??ś = đ??śđ?‘‹ Ă—

đ?‘‰ đ?‘šđ?‘?ĂŁ đ?‘˜â„ŽĂ´

(3.3)

Trong Ä‘Ăł: â–Ş CX lĂ náť“ng Ä‘áť™ chẼt phân tĂ­ch tĂ­nh theo phĆ°ĆĄng trĂŹnh Ä‘Ć°áť?ng chuẊn (Âľg/ml). â–Ş V lĂ tháťƒ tĂ­ch dáť‹ch chiáşżt (ml). â–Ş m bĂŁ khĂ´ ➢ Káşżt quả náť“ng Ä‘áť™ cĂĄc hᝣp chẼt isoflavone tĂ­nh theo phĆ°ĆĄng trĂŹnh háť“i quy báşąng Excel 2016 đưᝣc trĂŹnh bĂ y trong bảng 3.20 Bảng 3.20. Náť“ng Ä‘áť™ cĂĄc hᝣp chẼt isoflavone tĂ­nh theo phĆ°ĆĄng trĂŹnh háť“i quy CX (Âľg/ml) Daidzin

2.13

Glycitin

0.85

Genistin

0.90

Daidzein

13.42

Glycitein

2.89

Genistein

10.09

➢ Kết quả hà m lưᝣng isoflavone tính theo công thᝊc 3.3 bẹng Excel 2016 đưᝣc trÏnh bà y trong bảng 3.21.

57 | P a g e

Bảng 3.21. Hàm lượng isoflavone trong 1g bã khô Hàm lượng µg/g Daidzin

28.76

Glycitin

14.04

Genistin

19.31

Daidzein

187.11

Glycitein

39.02

Genistein

136.22

Tổng hàm lượng isoflavone trong 1g

424.46

bã khô

58 | P a g e

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Kết quả đề tài “Bước đầu xác định sáu hợp chất isoflavone trong bã đậu nành bằng phương pháp HPLC” cho những kết luận sau: 1. Chọn điều kiện phù hợp để tách và xác định đồng thời sáu hợp chất isoflavone là daidzin, glycitin, genistin, daidzein, glycitein, genistein bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector UV/Vis. -

Cột tách: Đường kính 4,6mm.

-

Thể tích vòng mẫu: 10 µl.

-

Bước sóng: 260nm.

-

Pha tĩnh: octadecyl silane liên kết với silicagel (ODS ; C18).

-

Thành phần pha động:

Pha động A : Nước chứa 0,05 % acid phosphoric.

Pha động B : Acetonitril

-

Tốc độ dòng: 1.5 ml/phút.

2. Đề xuất quy trình chuẩn bị mẫu – chiết chất tối ưu.

Cân 1.0619g mẫu ẩm (tương đương 1g mẫu khô) cho vào bình tam giác 100ml, thêm vào 8.5ml Acetonitril. Đem đi siêu âm trong vòng 10 phút. Sau đó, lắc 60 phút với tốc độ 140 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Chuyển toàn bộ dung dịch vào ống ly tâm và dùng 5ml nước cất để tráng bình (nước tráng cũng cho vào ống ly tâm). Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút. Cuối cùng, chuyển dịch chiết vào bình định mức 25ml (bảo quản ở -180C). Lọc qua màng PTFE 0,2 µm và đo HPLC. 3. Xác định được LOD, LQD cho 6 hợp chất isoflavone trên.

4.2. Đề xuất Như vậy, với kết quả thu được, ta thấy phương pháp HPLC có độ nhạy cao, độ lặp lại tốt, thích hợp cho việc phân tích đồng thời sáu hợp chất isoflavone trong mẫu đậu nành. Tôi hi vọng những nghiên cứu trên có thể góp phần vào việc ứng dụng phương pháp HPLC để xác định các hợp chất isoflavone nói riêng và các hợp chất khác nói chung trong mẫu đậu nành cũng như các mẫu hạt hoặc bã khác.

59 | P a g e

TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] ”Determination of Total Soy Isoflavones in Dietary Supplements, Supplement Ingredients, and Soy Foods by High-Performance Liquid Chromatography with Ultraviolet Detection: Collaborative Study”. Published in final edited form as: J AOAC Int. 2008 ; 91(3): 489–500.

[2] Griffith AP, Collison MW. J Chromatogr A 2001;913:397–413.

[3] Lena Jankowiak, Olivera Trifunovic, Remko M. Room, Atze J. van der Goot (2013), The potential of crude okara for isoflavone production.

[4] Trương Thị Minh Hạnh, Trần Thị Ngọc Thư (2016). Nghiên cứu các điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành trong dung môi ethanol, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, số chuyên đề “Nông nghiệp xanh”, 219-224.

[5] Trương Thị Minh Hạnh, Trần Thị Ngọc Thư (2016). Research on conditions for isoflavones extration from okara using ultrasound in combination with conventional shaking, Kỷ yếu hội thảo khoa học toàn quốc 2016 “Tiến bộ kỹ thuật thực phẩm và kỹ thuật sinh học: từ nghiên cứu đến sản xuất”, 11/2016, 199-207.

[6] P. A. Murphy et al/ J. Chromatogr. B777 (2002) 129–138.

[7] Đỗ Thị Hoa Viên (2004). Quy trình chiết tách phytoestrogen từ đậu tương. Báo cáo kết quả nghiên cứu Đề tài KC 04-17-2004 “Nghiên cứu các giải pháp công nghệ sinh học sản xuất các chế phẩm y sinh học đặc thù để bảo vệ sức khỏe nhân dân từ nguồn tài nguyên sinh vật Việt Nam”, 10-16.

[8] Bùi Xuân Vững, “Lý thuyết sắc kí lỏng hiệu năng cao, Khoa Hóa” - Trường Đại học Sư phạm, 2012.

[9] “Comprasion of extraction solvents and techniques used for the assay of isoflavones from soybean” D.L. Luthria et al./Food Chemistry 105 (2007) 325–33.

[10] “Nghiên cứu một số giải pháp nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside sang dạng aglycone”, Nguyễn Thị Việt Hà, 2012.

60 | P a g e

[11] Lại Mai Hương và các CTV (2008),” Nghiên cứu công nghệ chế biến bã đậu nành tạo chế phẩm dinh dưỡng giàu chất xơ”, Báo cáo nghiệm thu, Trường Đại học Bách Khoa, TPHCM. [12] Kaufman PB, Duke JA, Brielmann H, Boik J, Hoyt JE (1997) “A comparative survey of leguminous plants as sources of the isoflavones genistein and daidzein: Implications for human nutrition and health” J Altern Compl Med 3:7-12 [13] Báo cáo kết quả đề tài khoa học công nghệ “Bước đầu xác định hàm lượng daidzein, genistein và 17 acid amin trong đậu tương và sản phẩm chế biến”, 2007.

[14] “Method Development and Validation of Analytical Procedures”, Kapil Kalra, Dev Bhoomi Institute of Pharmacy and Research, Dehradun, Uttarakhand, India.

61 | P a g e