Bài dịch - The effectiveness of antioxidant vitamins C and E in reducing myocardial infarct size in

See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/262789795

The effectiveness of antioxidant vitamins C and E in reducing myocardial infarct size in patients subjected to percutaneous coronary angioplasty (PREVEC Trial): Study protocol for...

Article in Trials · May 2014 DOI: 10.1186/1745-6215-15-192 · Source: PubMed

CITATIONS

READS

11

390

9 authors, including: Ramón Rodrigo

Daniel Hasson

University of Chile

University of Chile

171 PUBLICATIONS 4,767 CITATIONS

9 PUBLICATIONS 178 CITATIONS

SEE PROFILE

SEE PROFILE

Juan Carlos Prieto

Cristobal Ramos

University of Chile

University of Chile

87 PUBLICATIONS 1,951 CITATIONS

14 PUBLICATIONS 151 CITATIONS

SEE PROFILE

Some of the authors of this publication are also working on these related projects:

NEUROPATHY View project

COPD: Lung function decline View project

All content following this page was uploaded by Ramón Rodrigo on 02 July 2014.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

SEE PROFILE

Rodrigo et al. Trials 2014, 15:192 http://www.trialsjournal.com/content/15/1/192

STUDY PROTOCOL

TRIALS Open Access

The effectiveness of antioxidant vitamins C and E in reducing myocardial infarct size in patients subjected to percutaneous coronary angioplasty (PREVEC Trial): study protocol for a pilot randomized double-blind controlled trial Ramón Rodrigo1*, Daniel Hasson1, Juan C Prieto1,2, Gastón Dussaillant2, Cristóbal Ramos3, Lucio León4, Javier Gárate4, Nicolás Valls1 and Juan G Gormaz1

Abstract Background: Acute myocardial infarction (AMI) is the leading cause of mortality worldwide. Oxidative stress has been involved in the ischemia-reperfusion injury in AMI. It has been suggested that reperfusion accounts for up to 50% of the final size of a myocardial infarct, a part of the damage likely to be prevented.Therefore, we propose that antioxidant reinforcement through vitamins C and E supplementation should protect against the ischemia-reperfusion damage, thus decreasing infarct size.

The PREVEC Trial (Prevention of reperfusion damage associated with percutaneous coronary angioplasty following acute myocardial infarction) seeks to evaluate whether antioxidant vitamins C and E reduce infarct size in patients subjected to percutaneous coronary angioplasty after AMI. Methods/Design: This is a randomized, 1:1, double-blind, placebo-controlled clinical trial.

The study takes place at two centers in Chile: University of Chile Clinical Hospital and San Borja Arriarán Clinical Hospital.

The subjects will be 134 adults with acute myocardial infarction with indication for percutaneous coronary angioplasty.

This intervention is being performed as a pilot study, involving high-dose vitamin C infusion plus oral administration of vitamin E (Vitamin-treatment group) or placebo (Control group) during the angioplasty procedure. Afterward, the Vitamin-treatment group receives oral doses of vitamins C and E, and the Control group receives placebo for 84 days after coronary angioplasty.

Primary outcome is infarct size, assessed by cardiac magnetic resonance (CMR), measured 6 and 84 days after coronary angioplasty.

Secondary outcomes are ejection fraction, measured 6 and 84 days after coronary angioplasty with CMR, and biomarkers for oxidative stress, antioxidant status, heart damage, and inflammation, which will be measured at baseline, at the onset of reperfusion, 6 to 8 hours after revascularization, and at hospital discharge.

(Continued on next page)

* Correspondence: rrodrigo@med.uchile.cl 1 Molecular and Clinical Pharmacology Program, Institute of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, University of Chile, Santiago, Chile Full list of author information is available at the end of the article © 2014 Rodrigo et al.; licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly credited.

Rodrigo et al. Trials 2014, 15:192 http://www.trialsjournal.com/content/15/1/192

Page 2 of 12

(Continued from previous page)

Discussion: The ischemia-reperfusion event occurring during angioplasty is known to increase myocardial infarct size. The cardioprotective benefits of high doses of vitamin C combined with vitamin E have not been fully explored. The PREVEC Trial seeks to determine the suitability of the therapeutic use of vitamins C and E against the reperfusion damage produced during angioplasty.

Patient recruitment opened in February 2013. The trial is scheduled to end in March 2016.

Trial registration: ISRCTN56034553 Keywords: Percutaneous coronary angioplasty, Ischemia-reperfusion, Oxidative stress, Vitamin C, Vitamin E, Acute myocardial infarction

Background Primary percutaneous coronary angioplasty (PCA) is recognized as the most useful way to recover coronary flow in the context of acute myocardial infarction (AMI). Myocardial salvage and limitation of infarct-size expansion are the principal mechanisms whereby patients with ST-segmentelevation myocardial infarction (STEMI) benefit from reperfusion [1]. Despite these important advances in pharmacologic treatment and reperfusion strategies, heart failure is a functional consequence of AMI that determines poor long-term prognosis in coronary patients [2]. Among others, global left ventricular function has always been viewed as an important prognostic factor after AMI. Different strategies have been assayed to preserve left ventricular function and reduce infarct size in patients undergoing primary PCA for STEMI [3,4], but no clinical benefits have been obtained.

Currently, it is widely accepted that cardiac magnetic resonance (CMR) imaging is the gold-standard method to measure infarct size associated with AMI in clinical practice [5-8] and in clinical trials [9]. CMR can also measure accurately and reproducibly ejection fraction, ventricular volumes and cardiac mass [5]. Infarct size has been deemed an “important trial end-point” in the Joint ESC/ACCF/AHA/WHF Task Force for the Redefinition of Myocardial Infarction [10] and is a well-known outcome in trials that evaluate amelioration of reperfusion injury, [11-15] because its variation reflects the interaction of multiple physiologic and metabolic factors while providing a direct measure of the amount of myocardial cell loss [16].

This direct measure is especially valuable in the context of AMI, in which functional measures, due to the phenomena of myocardial stunning or myocardial hibernation, may not reflect the long-term compromise of the heart.

Reperfusion injury presents as damage to the myocardium after blood restoration subsequent to a critical period of coronary occlusion [17]. Ischemia–reperfusion is a clinical problem associated with procedures such as thrombolysis, angioplasty, and coronary bypass surgery, which are commonly used to establish the blood reflow and minimize the damage of the heart due to severe myocardial ischemia. Reperfusion injury includes a series

of events: (a) reperfusion arrhythmias, (b) no-reflow phenomenon “microvascular damage, (c) myocardial stunning “reversible mechanical dysfunction,” and (d) lethal reperfusion “cell death,” which may occur either together or separately [18,19].

Two main hypotheses, oxidative stress and Ca2+ overload, have been proposed to explain the pathogenesis of ischemia–reperfusion injury [20,21]. Concerning this, oxidative stress, which is usually associated with increased formation of reactive oxygen species (ROS), modifies phospholipids and proteins, leading to lipid peroxidation and oxidation of thiol groups; these changes alter membrane permeability and configuration and generate functional modification of various cellular proteins [22].

Several studies have proposed the essential role of ROS in the pathogenesis of myocardial ischemia–reperfusion injury. In ischemic-reperfused hearts, many alterations, such as depression in contractile function, arrhythmias, change in gene expression, and loss of adrenergic pathways, have been observed [23]. Similar changes have been reported in hearts perfused with various ROS-generating systems. Furthermore, pretreatment of cardiac subcellular organelles with ROS showed similar changes. Thus, alterations in the myocardium during ischemia–reperfusion were suggested to be in part due to oxidative stress. In addition, ischemia–reperfusion was found to increase H2O2, cytosolic free Ca2+ concentration, malondialdehyde (MDA) content, and the formation of conjugated dienes in the heart. Treatment of the heart in animal models with antioxidant enzymes, superoxide dismutase (SOD), plus catalase protected against these changes [24,25]. ROS seem to increase significantly after a few minutes of reperfusion, but the increase during ischemia alone is still controversial.

On the basis of these changes, it has been suggested that the increase of superoxide anion and other ROS during reperfusion leads to lipid peroxidation and sulfhydryl group oxidation. It has been demonstrated that endothelial cells, inflammatory cells (that is, neutrophils and macrophages), and cardiomyocytes are all capable of generating ROS through several enzymatic reactions. It has been proposed that a burst of ROS from endothelial

Rodrigo et al. Trials 2014, 15:192 http://www.trialsjournal.com/content/15/1/192

cells and cardiomyocytes during early reperfusion can influence nearby neutrophils, setting up a local cycle of amplified cellular response through released inflammatory mediators.

Furthermore, neutrophils become sensitized (primed) to activating factors, such as chemotactic cytokines, after they adhere to the endothelium, and thus generate much greater quantities of ROS. After the initial burst of ROS at the onset of reperfusion, later events such as transendothelial migration of neutrophils and macrophages, might participate in delayed ROS generation during reperfusion [26,27]. Activated neutrophils produce superoxide as a cytotoxic agent as part of the respiratory burst via the action of membrane-bound NADPH oxidase on molecular oxygen. Neutrophils also produce the free radical nitric oxide (NO) that can react with superoxide to produce peroxynitrite, the most powerful oxidant agent of nitrogenreactive species (NOS), which may decompose to form hydroxyl radical [28].

In AMI, a clinical model of oxidative stress, ROS are generated in the ischemic myocardium, especially after reperfusion. ROS directly injure the cell membrane and cause cell death [29]. However, ROS also stimulate signal transduction to elaborate inflammatory cytokines(for example, tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)1β, and IL-6), in the ischemic region and surrounding myocardium as a host reaction. Inflammatory cytokines also regulate cell survival and cell death in the chain reaction with ROS. Apoptosis or programmed cell death is a distinct form of destruction of the cell, which is associated with synthesis of enzymes that degrade and fragment its own DNA. Updated information suggests that ischemia followed by reperfusion significantly induces myocardial injury by an apoptotic death pathway.

To understand the potential signaling mechanisms involved in ROS-triggered apoptosis, recent reports showed that cytosolic Ca2+overload and enhanced activity of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) family during reperfusion can participate in induction of ROS-mediated apoptosis, in addition to necrosis, and eventually could be a determinant in infarct size [30].

Cell death was once viewed as unregulated. It is now clear that at least a portion of cell death is a regulated cellsuicide process. This type of death can exhibit multiple morphologies. One of these, apoptosis, has long been recognized to be actively mediated, and many of its underlying mechanisms have been elucidated. Moreover, necrosis, the traditional example of unregulated cell death, is also regulated in some instances. Autophagy is usually a survival mechanism but can occur in association with increased ROS, leading to cell death. Little is known, however, about how autophagic cells die [31]. Apoptosis, necrosis, and autophagy occur in cardiac myocytes during myocardial infarction, ischemia-reperfusion, and heart failure.

Page 3 of 12

Pharmacologic or genetic inhibition of apoptosis and necrosis lessens infarct size and improves cardiac function in these disorders [32].

ROS and NOS are major initiators of myocardial damage during reperfusion. Accordingly, AMI is usually initiated by myocardial ischemia due to coronary artery obstruction.

In the ischemic myocardium, ROS are generated by a prooxidant state especially enhanced after reperfusion. Thus, neutrophils are the primary source of ROS during reperfusion. Endothelial cells and cardiomyocytes can also generate ROS. Increased ROS production is mainly due to activation of xanthine oxidase (enzyme that catalyzes the formation of uric acid with the co-production of superoxide) in endothelial cells [33], mitochondrial electrontransport chain reactions in cardiomyocytes, and NADPH oxidase in inflammatory cells [34]. Under these conditions, the enzymatic antioxidant effect is relevant against the detrimental effects of ROS. In agreement with this view, it has been reported that the transgenic mice in which superoxide dismutase (SOD) is overexpressed, infarct size is markedly reduced [35,36]. Accordingly, allopurinol, a xan thine oxidase inhibitor, has been demonstrated to block the superoxide production in ischemia–reperfusion settings involving organs such as heart [37], liver [33], kidney [38], and small intestine [39].

Therefore, it should be expected that a reinforcement of the antioxidant defense system through ROS scavengers results in a cardioprotective effect during the myocardial reperfusion. After an ischemic episode of the myocardium, left ventricle remodeling is known to occur; although its underlying mechanism is multifactorial, ROS and inflammatory cytokines may cause a cardiodepressive reaction [40-42]. It is of interest that ROS also stimulate the production of inflammatory cytokines and, inversely, inflammatory cytokines stimulate ROS formation. In the chronic stage, ROS and inflammatory cytokines activate the matrix metalloproteinases [43,44], thereby eliciting degradation of collagens, which may cause a slippage in myofibrillar alignment, causing left ventricular dilation [45].

Major evidence exists on the contribution of ROS to myocardial damage in AMI in humans. Therefore, it should be expected that treatments with antioxidant agents or upregulation of endogenous antioxidant enzymes could protect against reperfusion injury. Some studies have suggested that antioxidant agents attenuate the left ventricular remodeling after AMI. In patients with AMI subjected to primary percutaneous transluminal coronary angioplasty, the pretreatment with the inhibitor of xanthine oxidase allopurinol resulted in effective inhibition of the generation of oxygen-derived radicals during reperfusion therapy and the recovery of left ventricular function [46]. More recently, the administration of edaravone, a free radical scavenger, in patients with AMI just before reperfusion, reduced significantly the infarct size and reperfusion

Rodrigo et al. Trials 2014, 15:192 http://www.trialsjournal.com/content/15/1/192

arrhythmia [47]. However, other attempts, such as an intravenous bolus of either superoxide dismutase [48] or trimetazidine [49], showed no beneficial effects in the outcome of patients.

Most investigations on the health-protective effects of vitamins C and E have been focused merely on their antioxidant power. Nevertheless, the biologic properties of α-tocopherol and ascorbic acid have overwhelmed their antioxidant effects. Despite the enormous interest in antioxidant vitamins as potential protective agents against the development of human disease, the real contributions of such compounds to health maintenance and the mechanisms whereby they act remain unclear. Antioxidants, as well as numerous cardioprotective strategies for reducing lethal reperfusion injury, have been administered in patients with AMI [50]. Although the scientific rationale, epidemiologic data, and retrospective studies have been persuasive, prospective, randomized, placebo-controlled trials have so far failed to verify the actual benefit of antioxidant vitamins in human diseases [51-54]. Among the possible contributory factors likely to account for this discrepancy,the lack of consideration of basic aspects, such as the pharmacokinetic properties of antioxidant vitamins, will be discussed later. In agreement with this view, previous attempts to reduce free radical production after PCA for AMI by oral administration of vitamin C, failed to attenuate the increased production of F2-isoprostanes [55].

In turn, Jaxa-Chamiec et al. [56], performing a randomized, double-blind, placebo-controlled multicentric study in 800 patients, analyzed the effects of combined vitamins C and E, through infusion and capsules, could not demonstrate a major effect of this antioxidant treatment on the clinical outcome of patients, although diabetes patients showed a reduction in 30-day cardiac mortality [57]. It should be noted that the authors recognize as a limitation of the study the fact that the dose of vitamin C used in the study increases its plasma levels only up to 0.1 mM, a concentration 100 times lower than that required to scavenge superoxide anion.

Vitamin E, mainly α-tocopherol, is the major peroxyl radical scavenger in biologic lipid phases such as membranes or LDL [58,59]. The antioxidant action has been ascribed to its ability to act chemically as a lipid-based free radical chain-breaking molecule, thereby inhibiting lipid peroxidation through its own conversion into an oxidized product, α-tocopheroxyl. α-Tocopherol can be restored by reduction of the α-tocopheroxyl radical with redox-active reagents like vitamin C or ubiquinol [60].

In clinical studies of ischemia-reperfusion injury, positive effects of a multivitamin antioxidant solution, including vitamin E, were described for revascularization of the lower extremities, kidney transplantation, liver surgery, and aortic aneurysm repair [61-64]. Preoperative administration of vitamin E is safe, and it may have beneficial

Page 4 of 12

effects by reducing the impact of ischemia-reperfusion injury in liver surgery [65]. However, homologous studies in AMI are still lacking.

Regarding vitamin C, intraarterial administration of high doses of ascorbate has been demonstrated to abolish the in vivo effects of superoxide anion in the impairment of vascular endothelial function in subjects with essential hypertension [66]. In addition, recent in vitro studies have also been successful to study the effects of oxidative stress with and without this vitamin C concentration, thus validating the use of this concentration of ascorbate to counteract the effects of oxidative stress [66]. Vitamin C concentration in plasma is tightly controlled, and excess of vitamin C is excreted as a function of dose, being completely saturated at doses of 400 mg daily and higher, producing a steady-state plasma concentration of approximately 80 μM [67]. Unfortunately, this concentration is not enough to scavenge superoxide anion. Therefore, in settings accompanied by oxidative stress, such as the myocardial ischemiareperfusion cycle, a beneficial effect of oral administration of vitamin C in the prevention of oxidative damage should not be expected; however, intravenous infusion could be considered with this purpose. Indeed, superoxide reacts with NO at a rate 105-fold greater than the rate at which superoxide reacts with ascorbic acid [68]. As a consequence, 10 mM ascorbate is needed to support its competition with NO for superoxide. In patients undergoing elective PCA, impaired microcirculatory reperfusion is improved by vitamin C infusion, suggesting that oxidative stress is implicated in such a phenomenon [69]. Also, in patients subjected to thrombolysis after AMI, superoxide dismutase in the blood was found to be significantly reduced, whereas the activity of the oxidant enzyme, xanthine oxidase, and MDA levels were found to be significantly increased. However, oral supplementation of vitamin C to the postreperfusion patients restored these parameters back to normal or near-normal levels [70].

Although higher ascorbate doses would be needed to reach a better protective effect, its biologic properties, other than that of scavenging ROS, may have some beneficial effect.

The major source of ROS is their enzymatic production via NADPH oxidase, an enzyme subjected to downregulation by vitamin C. In addition, vitamin C prevents the oxidation of tetrahydrobiopterin, a cofactor of NO synthase that is highly sensitive to oxidation. When tetrahydrobiopterin is oxidized, endothelial nitric oxide synthase (eNOS) activity becomes uncoupled, resulting in the production of superoxide instead of NO, thus enhancing the oxidative damage [71].

Ascorbic acid and α-tocopherol act as potent hydrophilic and lipophilic antioxidants, respectively [72]. They also act synergistically; in aqueous compartments, ascorbic acid can recycle α-tocopherol in membranes by reducing the α-tocopheroxyl radical back to α-tocopherol [73].

Consequently, in vitamin-E-supplemented rat hearts, α-

Rodrigo et al. Trials 2014, 15:192 http://www.trialsjournal.com/content/15/1/192

tocopherol diminishes rapidly without the addition of vitamin C during reperfusion [74].

Finally, it is noteworthy that vitamin C could also abrogate the beneficial effects of ischemic preconditioning in animal models, a phenomenon induced by a series of brief sublethal episodes of ischemia and reperfusion before a potentially lethal episode of ischemia that renders the heart more resistant to myocardial infarction [75].

Pilot study objectives

It is hypothesized that patients subjected to percutaneous coronary angioplasty to restore the coronary blood flow previously impaired by an acute myocardial infarction, while receiving a short-term infusion of high doses of vitamin C, plus oral doses of the recommended dose of vitamin E, will have a smaller infarct size, as well as an attenuation of the functional and biochemical damage occurring during the reperfusion afterthe sudden loss of blood supply, as compared with placebo-treated patients.

The objectives of this study are to determine in patients subjected to PCA after AMI: i. the efficacy of vitamins C and E in reducing myocardial infarct size; ii. the protective effects of vitamin C and E in cardiac function, assessed by measurement of ejection fraction; iii. the levels of lipid peroxidation and protein carbonylation at baseline and immediately after successful reperfusion, 6 to 8 hours after vascular recanalization and at discharge; iv. the levels of antioxidant potential at baseline and immediately after successful reperfusion, 6 to 8 hours after vascular recanalization, and at discharge; and v. the correlation between oxidative stress-related biomarkers and both the infarct size and ejection fraction at 6 and 84 days after vascular recanalization.

Methods/Design Design

This double-blind, placebo-controlled, multicenter clinical trial will randomize in a 1:1 ratio to either placebotreatment or vitamin-treatment groups. The study design is summarized in Figure 1.

Study population

Patients of either sex, older than18 years, with an indication for primary percutaneous coronary angioplasty and experiencing their first acute myocardial infarction, admitted to University of Chile Clinical Hospital or San Borja Arriarán Clinical Hospital, will be invited to participate in

Page 5 of 12

the study. Inclusion and exclusion criteria are expressed in Tables 1 and 2, respectively.

Recruitment of patients

Patients will be screened by a member of the research team from those admitted to the emergency department of both clinical centers involved in the study. Patients diagnosed with AMI will be invited to participate in the study.

Informed consent will be obtained from suitable patients or their representative by one of the investigators or a delegated subinvestigator at each site. A member of the research team will answer all questions regarding the study and risks of the protocol procedure before the patient signs an informed-consent form.

Sample size

Taking into account that until 50% infarct size is due to reperfusion damage, a minimal efficacy of the intervention is considered to reach a relative improvement up to 25% infarct size. Similar studies applying the same method have provided the accuracy of measurements as variance value. The sample size was calculated from the following formula [76]: n ¼ 2ðZS þ ZPÞ2 x S2 =ðMA–MBÞ2 Where n is the sample size for each group, “ZS” corresponds to the level of significance (5%), “ZP” represents the potency (80%), “MA” is the mean of supplemented group, MB, the mean of the placebo group (control), and S is the variance of CMR determination for assessment for IS. A 10% patient loss was considered for the purposes of this calculation. This calculation rendered a sample size of 66 patients for each branch (placebo and supplemented). This sample size is suitable to be covered by the population of patients being treated for PCA in the Cardiovascular Department, University of Chile Clinical Hospital, and Cardiovascular Center, San Borja Arriarán Clinical Hospital, during the estimated period (3 years).

Randomization and followup

Patients will be randomly allocated to one of the two groups. The allocation sequence will be centrally generated, stored, and assigned by using online randomization software (http://www.randomization.com) in random permuted blocks, each consisting of a box containing six treatment kits allocated in a placebo-to-vitamin treatment, 1:1 ratio for each participating center.

Random allocation is generated by intervention of the technician responsible for the treatment assignment to recruited patients, according to the sequence already established through the randomization method indicated previously. The reasons for losses and exclusions after randomization will be provided.

Rodrigo et al. Trials 2014, 15:192 http://www.trialsjournal.com/content/15/1/192

Page 6 of 12

Figure 1 CONSORT flowchart for PREVEC Trial.

Neither participants, nor care providers, nor the investigators are aware of the treatment assignments. Adverse events, unintended effects and technical problems will be recorded.

Interventions

All patients will be asked to sign the informed consent before beginning the protocol. For those patients allocated to receive vitamin treatment, the intervention will be started as soon as the patient has signed the informed consent. The protocol will be started by administering an unique oral dose of vitamin E as Îą-tocopherol (800

IU) and an intravenous infusion of vitamin C as sodium ascorbate (320 mM) infused at a 10-ml/min flow rate during the initial hour and at 3 ml/min rate during the following 2 hours. Percutaneous coronary angioplasty will be performed about 30 minutes after initiating the vitamin C infusion. Oral doses of vitamin E (400 IU/day) and vitamin C (500 mg/12 hours) will be taken by the patients for 84 days after PCA. For those patients allocated to receive placebo treatment, the 800-IU oral dose of vitamin E will be replaced for two vegetable oil capsules (400 mg each). The intravenous infusion of vitamin C will be replaced by an equal

Rodrigo et al. Trials 2014, 15:192 http://www.trialsjournal.com/content/15/1/192

Table 1 Inclusion criteria of the study protocol Inclusion criteria 1

Subjects may be of either sex and must be at least 18 years old

2

Subjects must have indication of primary percutaneous coronary angioplasty (PCA):

Page 7 of 12

by two independent individuals with the purpose of applying the concordance kappa index. Adherence to oral intake of vitamins C and E or placebo will be evaluated by telephonic contact effectuated weekly by the nurse responsible for the trial patient´s care.

-Angina or equivalent at least 120 minutes in duration - Electrocardiogram with ST-segment elevation myocardial infarction that concernsmore than two contiguous leads (>2 mm) 3

Presentation within 12 hours of symptoms onset

4

First myocardial infarction

5

Primary PCA must show a pre-PCA TIMI flow of 0

6

Subject must be able and willing to sign informed consent

sodium chloride solution volume having the same osmolality as the vitamin C infusion administered to supplemented patients. The 400-IU oral doses of vitamin E will be replaced by vegetable oil (400 mg), and oral doses of vitamin C will be replaced with inert starch microgranules (500 mg). The pharmaceutical forms of vitamin C and E are indistinguishable from their respective placebos.

After the initial evaluation, patients will go to the catheterization laboratory. According to the standard protocol in AMI, an angiography will be performed to identify the infarct-related artery. The location and extent of AMI (number of arteries involved), percentage of stenosis, TIMI flow, type of stent, and so on, will be recorded.

Immediately before coronary arteriography to confirm total occlusion of one coronary artery, a basal blood sample will be drawn from the antecubital vein. Three more blood samples will be obtained: immediately after successful reperfusion, at 6 to 8 hours after finishing the revascularization process and before hospital discharge.

Infarct size, the primary endpoint of the study, will be measured with cardiac magnetic resonance (CMR) at 6 and 84 days (12 weeks) after PCA. Both determination and data obtained by these procedures will be evaluated

Table 2 Exclusion criteria of the study protocol Exclusion criteria 1

History of renal or hepatic insufficiency

2

History of renal lithiasis

3

History of heart failure (New York Heart Association III, IV)

4

Cardiogenic shock

5

Postprimary PCA TIMI grade flow of 0, 1, or 2

6

Any serious medical comorbidity that determines life expectancy <6 months

7

Current participation in any other clinical investigation

8

Pregnancy

9

Glucose 6-phosphate dehydrogenase deficiency

Primary and secondary outcomes

Primary outcome will be infarct size, which will be measured with CMR at 6 and 84 days (12 weeks) after PCA. Both determination and data obtained by these procedures will be evaluated by two blinded independent individuals with the purpose of applying the concordance kappa index.

As our primary outcome is fully dependent on a highquality blood-flow restoration to the ischemic myocardium region, we established as our criteria for successful reperfusion only patients who have a starting TIMI flow of 0 in the PCA and finish the procedure with TIMI flow 3, according to the most rigorous literature standards [77-79]. Secondary outcomes will be myocardial-damage biomarkers, oxidative stress- and inflammation-related biomarkers, and ejection fraction.

1. Ejection fraction: will be measured with cardiac magnetic resonance (CMR) at 6 and 84 days (12 weeks) after PCA. Both determination and data obtained by these procedures will be evaluated by two blinded independent individuals with the purpose of applying the concordance kappa index.

2. Oxidative stress-related biomarkers: Plasma protein carbonylation Antioxidant capacity of plasma: Ferric reducing ability of plasma (FRAP) Plasma concentration of vitamins C and E Thiol index: GSH/GSSG ratio in erythrocytes Lipid peroxidation: F2-isoprostane and malondialdehyde levels in plasma and erythrocytes, respectively, will be measured.

3. Inflammation biomarkers: High-sensitivity C-reactive protein Leukocyte count by standard method 4. Myocardial-damage biomarkers: Troponin, CK, and CK-MB will be measured in plasma with standard methods Oxidative stress- and inflammation-related biomarkers and myocardial-damage biomarkers will be assessed through antecubital venous blood extraction, at the moment of enrollment (30 to 60 minutes before PCA), immediately after successful reperfusion, at 6 to 8 hours after finishing the revascularization process and before discharge, as previously described. The samples will be collected in chilled vacutainers containing disodium EDTA (final concentration, 4 mM) and centrifuged at

Rodrigo et al. Trials 2014, 15:192 http://www.trialsjournal.com/content/15/1/192

3,000 g for 10 minutes to separate the plasma from figurate elements. Erythrocytes will be subjected to hypotonic hemolysis by dilution with distilled water. Plasma and red blood cell lysates will be stored at -80°C until performing the biochemical analyses.

Statistical analyses

Results of continuous variables will be expressed as mean ± standard deviation (SD). Comparison between parametric variables will be performed by using Student t test for unpaired samples. Nonparametric variables will be expressed as median (interquartile range) and compared through Wilcoxonrank-sum test. The significant differences for normally distributed variables will be compared with Student t test analysis of variance (ANOVA) for repeated measures. The significant differences for nonnormally distributed variables will be compared by using the Mann–Whitney U test. Categoric variables will be expressed as numbers and frequencies (percentage). The Fisher Exact test with Katz approximation will be used to compare adverse-event frequencies.

Determination and data obtained for infarct size and ventricular function by cardiac resonance will be evaluated by two independent individuals with the purpose of applying the concordance kappa index. Among the limitations of using infarct size as an outcome, is that the use of final infarct size carries the risk of imbalances in baseline myocardium at risk, according to treatment group, as well as comparing different AMI locations, which may have different sensitivity to the therapy [80].

In addition to this, the groups may have variable time to reperfusion and other confounding variables that determine infarct size [81,82]. Whereas some of these difficulties may have been corrected through a careful stratification on entering the study, this option was discarded, given the small sample size of this study. We are currently considering an analysis of the data though a linear regression model, adjusted by all confounding variables, such as those mentioned before, and others present in the current literature [83]. P< 0.05 will be considered statistically significant. Results will be analyzed by using Stata version 8.0, Microsoft Excel,and Graphpad Prism 4.0.

Ethical approval of the clinical trial

The research protocol was approved by the institutional ethics committees, including the University of Chile Faculty of Medicine (Approval certificate 060–2011; July 19, 2011), University of Chile Clinical Hospital (Approval certificate 53; July 27, 2011), San Borja Arriarán Clinical Hospital (Approval certificate 468–13; July 18, 2013), and also by the ethics committee of the National Fund for Scientific, Technological, and Innovation Development (FONDECYT) (Approval certificate G2-G3/590; May 24, 2012), the institution that approved the government grants

Page 8 of 12

for this clinical trial, all according to the Helsinki Declaration of the World Medical Association (2000).

Trial management

Patients or their representatives will be asked to sign two copies of the informed consent. Patients will be given a copy of their consent form to keep for reference, and the other will be filed in the Investigator Site File on site. Data forms will be checked for completeness and merged into a master chart, which will be communicated to the study statistician. Patient confidentiality will be maintained at every stage.

Patients may withdraw from the trial or the trial treatment at any time without prejudice. Patients may be withdrawn from the study at the discretion of the local ethics committee for safety reasons. All adverse events and serious adverse events will be recorded during hospital stay and through patient communication while they are being subjected to ambulatory oral treatment. The study coordinator will conduct meetings with the study statistician on a regular basis, and the Chief Investigator will be made aware of all adverse events and serious adverse events as they happen.

Discussion Given the unpredictable nature of AMI, it is not feasible to obtain a basal myocardial image of patients; however, this trial also does not include performing an “acute” imaging on admission before the PCA (again, for feasibility reasons), but rather relies on performing a CMR on the sixth day after AMI. In this context, it is impossible to distinguish reperfusion damage from ischemic damage in the same patient, based in a single “6-day after” cardiac image. It would be expected on an imaging comparison among groups that on the 6th and 84th days, the placebo group exhibits, on average, a greater infarct size compared with the supplemented group. Any significant reduction of infarct size in the supplemented group could be attributed only to a decrease of reperfusion damage, because full coronary ischemia would not allow the arrival of ascorbate to the postoccluded artery segment. However, it will be impossible to determine whether a significant decrease of infarct size corresponds to total or partial reduction reperfusion damage.

To the best of our knowledge, no published reports have assessed human populations with high vitamin C levels in AMI patients during the PCA procedure; therefore, it is more difficult to compare data obtained with those in the current literature. In addition, given the characteristics of the study population, trial results are not applicable to patients having a second AMI, III or IV Killip score AMI, or other conditions established in the trial-exclusion criteria. Given that this study is being performed in a

Rodrigo et al. Trials 2014, 15:192 http://www.trialsjournal.com/content/15/1/192

mostly Chilean population, its applicability to other ethnicities is uncertain.

Concerning the loss of data or patients during the study, patients undergoing a claustrophobic reaction will not be capable of being analyzed by CMR. Furthermore, due to the ambulatory nature of the trial, a small loss of patients may occur between the day 6 CMR and day 84 CMR. Given the multicentric nature of the study, the loss of samples is possible.

To our knowledge, no previous attempts have been made to use high doses of ascorbate to prevent or attenuate the myocardial damage caused by AMI. Pharmacokinetic studies on vitamin C in humans have shown that short-term infusion of high doses makes possible the reaching of peak concentrations even higher than 20 mM, but never being below 10 mM for at least 3 hours [84]. High doses of intravenous vitamin C have been reported to be remarkably safe, even when administered by infusions at a rate 3 times higher than that here proposed [85]. Nevertheless, patients having renal impairment or glucose 6-phosphate dehydrogenase deficiency, known possible complications of intravenous vitamin C, will be excluded from the present trial. However, a theoretic risk derived from high vitamin C levels is the development of kidney stones in unreported or first-time stone-forming patients [85].

Regarding vitamin E possible adverse effects, current epidemiologic evidence (based on clinical trials that tested the effect of vitamin E supplementation in healthy participants and patients with various diseases) found that long-term supplementation with this nutrient shows a trend toward increasing slightly all-cause mortality (RR, 1.03; 95% CI, 1.00 to 1.05) independent of dose and exposition time [86]. However, the confidence interval is barely significant, because the lower interval is 1.00. In addition, as the Cochrane Meta-analysis explicitly excludes tertiary prevention trials, that is, randomized studies in which antioxidant supplements were used to treat a specific disease, such as trials involving patients with acute conditions (except nonmelanoma skin cancer), their conclusions are not applicable to our study.

Concerning the dosage, a previous meta-analysis reported that high-dosage supplementations (doses ≥400 IU/d) only increase all-cause mortality with expositions equal to or greater than 1 year [87]. Specifically in cardiovascular diseases, two recent meta-analysis that evaluate the efficacy of antioxidant supplements on these pathologies found no overall harmful effects in the analyzed endpoints [88,89], with the only exception of one controlled clinical trial [90]. However, those results are not consistent with the other related long-term large controlled clinical trials. In any case, that study supplemented the patients with twice our dose for more than a year, not being comparable in dose and timings with our study.

Page 9 of 12

This novel strategy, by using innocuous and easily available substances, might significantly improve the clinical outcome of AMI patients, by reducing the infarct size, otherwise likely to result in working disability and diminution of both their life quality and expectancy.

Given the high incidence of AMI throughout the world and the innocuous and easily available substances used in the study, large-scale replication of this clinical trial worldwide seems feasible to the authors.

Trial status The PREVEC trial began recruitment in February 2013.

Forty-three patients have been enrolled to date (3 June 2014) The trial is scheduled to end in March 2016.

Abbreviations AMI: Acute myocardial infarction; CMR: cardiac magnetic resonance; eNOS: endothelial nitric oxide synthase; IL-1β: interleukin-1β; IL-6: interleukin6; MDA: malondialdehyde; MAPK: mitogen-activated protein kinase; NO: nitric oxide; PCA: percutaneous coronary angioplasty; ROS: reactive oxygen species; SOD: superoxide dismutase; STEMI: ST-segment elevation myocardial infarction; TNF-α: tumor necrosis factor-α.

Competing interests The authors report no conflicts of interest.

Authors’ contributions RR is the trial Chief Investigator. RR, JCP, GD, and CR contributed to the concept and study design and funding acquisition. JCP and JGG are responsible for patient recruitment and data collection in University of Chile Clinical Hospital. JG is responsible for patient recruitment and clinical data collection in San Borja Arriarán Clinical Hospital. GD is responsible for PCA intervention in the University of Chile Clinical Hospital. LL is responsible for PCA intervention in San Borja Arriarán Clinical Hospital. DH is responsible for oxidative-stress biomarker samples assessment. NV is responsible for the collection and interpretation of laboratory data. DH and RR drafted the first version of the manuscript. DH, JGG, and NV drafted the revised manuscript.

All authors have commented on drafts of the article and have given final approval to this version.

Acknowledgements This article is supported by the Chilean Government through National Fund for Scientific, Technological and Innovation Development; FONDECYT grant 1120594.

Author details 1 Molecular and Clinical Pharmacology Program, Institute of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, University of Chile, Santiago, Chile.

2 Cardiovascular Department, University of Chile Clinical Hospital, Santiago, Chile. 3Department of Radiology, University of Chile Clinical Hospital, Santiago, Chile. 4Cardiovascular Center, San Borja Arriarán Clinical Hospital, Santiago, Chile.

Received: 27 June 2013 Accepted: 9 May 2014 Published: 29 May 2014 References 1. Braunwald E: Myocardial reperfusion, limitation of infarct size, reduction of left ventricular dysfunction, and improved survival. should the paradigm be expanded? Circulation 1989, 79:441–444.

2. van der Vleuten PA, Rasoul S, Huurnink W, van der Horst IC, Slart RH, Reiffers S, Dierckx RA, Tio RA, Ottervanger JP, De Boer MJ, Zijlstra F: Effect of intravenous FX06 as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute ST-segment elevation myocardial infarction: results of the F.I.R.E. (Efficacy of FX06 in the Prevention of Myocardial Reperfusion Injury) trial. BMC Cardiovasc Disord 2008, 8:4.

Rodrigo et al. Trials 2014, 15:192 http://www.trialsjournal.com/content/15/1/192

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

Atar D, Petzelbauer P, Schwitter J, Huber K, Rensing B, Kasprzak JD, Butter C, Grip L, Hansen PR, Süselbeck T, Clemmensen PM, Marin-Galiano M, Geudelin B, Buser PT, F.I.R.E. Investigators: Effect of intravenous FX06 as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute ST-segment elevation myocardial infarction results of the F.I.R.E. (Efficacy of FX06 in the Prevention of Myocardial Reperfusion Injury) trial. J Am Coll Cardiol 2009, 53:720–729.

Jang IK, Pettigrew V, Picard MH, Kowey PR, Demmel V, Zile MR, Tatsuno J, Wackers FJ, Hibberd M: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of the safety and efficacy of intravenous MCC-135 as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention in patients with acute myocardial infarction: rationale and design of the evaluation of MCC-135 for left ventricular salvage in acute MI (EVOLVE) study. J Thromb Thrombolysis 2005, 20:147–153. von Knobelsdorff-Brenkenhoff F, Schulz-Menger J: Cardiovascular magnetic resonance imaging in ischemic heart disease. J Magn Reson Imaging 2012, 36:20–38.

Perazzolo Marra M, Lima JA, Iliceto S: MRI in acute myocardial infarction.

Eur Heart J 2011, 32:284–293.

Kim HW, Farzaneh-Far A, Kim R: Cardiovascular magnetic resonance in patients with myocardial infarction: current and emerging applications.

J Am Coll Cardiol 2009, 55:1–16.

Martin TN, Groenning BA, Murray HM, Steedman T, Foster JE, Elliot AT, Dargie HJ, Selvester RH, Pahlm O, Wagner GS: ST-segment deviation analysis of the admission 12-lead electrocardiogram as an aid to early diagnosis of acute myocardial infarction with a cardiac magnetic resonance imaging gold standard. J Am Coll Cardiol 2007, 50:1021–1028.

Desch S, Eitel I, de Waha S, Fuernau G, Lurz P, Gutberlet M, Schuler G, Thiele H: Cardiac magnetic resonance imaging parameters as surrogate endpoints in clinical trials of acute myocardial infarction. Trials 2011, 12:204.

Thygesen K, Alpert JS, White HD: Joint ESC/ACCF/AHA/WHF Task Force for the Redefinition of Myocardial Infarction. J Am Coll Cardiol 2012, 60:1581–1598.

Faxon DP, Gibbons RJ, Chronos NA, Gurbel PA, Sheehan F: The effect of blockade of the CD11/CD18 integrin receptor on infarct size in patients with acute myocardial infarction treated with direct angioplasty: the results of the HALTMI study. J Am Coll Cardiol 2002, 40:1199–1204.

Zeymer U, Suryapranata H, Monassier JP, Opolski G, Davies J, Rasmanis G, Linssen G, Tebbe U, Schröder R, Tiemann R, Machnig T, Neuhaus KL: ESCAMI Investigators. J Am Coll Cardiol 2001, 38:1644–1650.

Baran KW, Nguyen M, McKendall GR, Lambrew CT, Dykstra G, Palmeri ST, Gibbons RJ, Borzak S, Sobel BE, Gourlay SG, Rundle AC, Gibson CM, Barron HV: Limitation of Myocardial Infarction Following Thrombolysis in Acute Myocardial Infarction (LIMIT AMI) Study Group. Circulation 2001, 104:2778–2783.

Mahaffey KW, Granger CB, Nicolau JC, Ruzyllo W, Weaver WD, Theroux P, Hochman JS, Filloon TG, Mojcik CF, Todaro TG, Armstrong PW, COMPLY Investigators: Effect of pexelizumab, an anti-C5 complement antibody, as adjunctive therapy to fibrinolysis in acute myocardial infarction: the Complement inhibition in myocardial infarction treated with thromboLYtics (COMPLY) trial. Circulation 2003, 108:1176–1183.

Ross AM, Gibbons RJ, Stone GW, Kloner RA, Alexander RW: A Randomized, Double-Blinded, Placebo-Controlled Multicenter Trial of Adenosine as an Adjunct to Reperfusion in the Treatment of Acute Myocardial Infarction (AMISTAD-II). J Am Coll Cardiol 2005, 45:1775–1780.

Lowe JE, Reimer KA, Jennings RB: Experimental infarct size as a function of the amount of myocardium at risk. Am J Pathol 1978, 90:363–379.

Dhalla NS, Elmoselhi AB, Hata T, Makino N: Status of myocardial antioxidants in ischemia-reperfusion injury. Cardiovasc Res 2000, 47:446–456.

Bolli R, Marbán E: Molecular and cellular mechanisms of myocardial stunning. Physiol Rev 1999, 79:609–634.

Murphy AM: Heart failure, myocardial stunning, and troponin: a key regulator of the cardiac myofilament. Congest Heart Fail 2006, 12:32–38.

Ferrari R: The role of mitochondria in ischemic heart disease. J Cardiovasc Pharmacol 1996, 28:1–10.

Jahangiri A, Leifert WR, Kind KL, McMurchie EJ: Dietary fish oil alters cardiomyocyte Ca2+ dynamics and antioxidant status. Free Radic Biol Med 2006, 40:1592–1602.

Hool LC: Evidence for the regulation of L-type Ca2+ channels in the heart by reactive oxygen species: mechanism for mediating pathology.

Clin Exp Pharmacol Physiol 2008, 35:229–234.

Page 10 of 12

23. Rensing H, Bauer I, Kubulus D, Wolf B, Winning J, Ziegeler S, Bauer M: Heme oxygenase-1 gene expression in pericentral hepatocytes through beta1adrenoceptor stimulation. Shock 2004, 21:376–387.

24. Dhalla NS, Golfman L, Takeda S, Takeda N, Nagano M: Evidence for the role of oxidative stress in acute ischemic heart disease: a brief review. M Can J Cardiol 1999, 15:587–593.

25. Xu Y, Liu B, Zweier JL, He G: Formation of hydrogen peroxide and reduction of peroxynitrite via dismutation of superoxide at reperfusion enhances myocardial blood flow and oxygen consumption in postischemic mouse heart. J Pharmacol Exp Ther 2008, 327:402–410.

26. Cooper D, Stokes KY, Tailor A, Granger DN: Oxidative stress promotes blood cell-endothelial cell interactions in the microcirculation. Cardiovasc Toxicol 2002, 2:165–180.

27. Pavelková M, Kubala L, Cíz M, Pavlík P, Wagner R, Slavík J, Ondrásek J, Cerný J, Lojek A: Blood phagocyte activation during open heart surgery with cardiopulmonary bypass. Physiol Res 2006, 55:165–173.

28. Hori M, Nishida K: Oxidative stress and left ventricular remodelling after myocardial infarction. Cardiovasc Res 2009, 81:457–464.

29. van Dijk A, Krijnen PA, Vermond RA, Pronk A, Spreeuwenberg M, Visser FC, Berney R, Paulus WJ, Hack CE, van Milligen FJ, Niessen HW: Inhibition of type 2A secretory phospholipase A2 reduces death of cardiomyocytes in acute myocardial infarction. Apoptosis 2009, 14:753–763.

30. Matsui Y, Takagi H, Qu X, Abdellatif M, Sakoda H, Asano T, Levine B, Sadoshima J: Distinct roles of autophagy in the heart during ischemia and reperfusion: roles of AMP-activated protein kinase and Beclin 1 in mediating autophagy. Circ Res 2007, 100:914–922.

31. Baines CP, Kaiser RA, Purcell NH, Blair NS, Osinska H, Hambleton MA, Brunskill EW, Sayen MR, Gottlieb RA, Dorn GW, Robbins J, Molkentin JD: Loss of cyclophilin D reveals a critical role for mitochondrial permeability transition in cell death. Nature 2005, 434:658–662.

32. Juránek I, Bezek S: Controversy of free radical hypothesis: reactive oxygen species–cause or consequence of tissue injury? Gen Physiol Biophys 2005, 24:263–278.

33. Granger DN: Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemiareperfusion injury. Am J Physiol 1988, 255:1269–1275.

34. Tan S, Yokoyama Y, Dickens E, Cash TG, Freeman BA, Parks DA: Xanthine oxidase activity in the circulation of rats following hemorrhagic shock.

Free Radic Biol Med 1993, 15:407–414.

35. Terada LS, Dormish JJ, Shanley PF, Leff JA, Anderson BO, Repine JE: Circulating xanthine oxidase mediates lung neutrophil sequestration after intestinal ischemia-reperfusion. Am J Physiol 1992, 263:394–401.

36. Grisham MB, Hernandez LA, Granger DN: Xanthine oxidase and neutrophil infiltration in intestinal ischemia. Am J Physiol 1986, 251:567–574.

37. Duilio C, Ambrosio G, Kuppusamy P, DiPaula A, Becker LC, Zweier JL: Neutrophils are primary source of O2 radicals during reperfusion after prolonged myocardial ischemia. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2001, 280:2649–2657.

38. Chen Z, Siu B, Ho YS, Vincent R, Chua CC, Hamdy RC, Chua BH: Overexpression of MnSOD protects against myocardial ischemia/ reperfusion injury in transgenic mice. J Mol Cell Cardiol 1998, 30:2281–2289.

39. Wang P, Chen H, Qin H, Sankarapandi S, Becher MW, Wong PC, Zweier JL: Overexpression of human copper, zinc-superoxide dismutase (SOD1) prevents postischemic injury. Proc Natl Acad Sci U S A 1998, 95:4556–4560.

40. Frangogiannis NG, Smith CW, Entman ML: The inflammatory response in myocardial infarction. Cardiovasc Res 2002, 53:31–47.

41. Ferdinandy P, Danial H, Ambrus I, Rothery RA, Schulz R: Peroxynitrite is a major contributor to cytokine-induced myocardial contractile failure. Circ Res 2000, 87:241–247.

42. Suematsu N, Tsutsui H, Wen J, Kang D, Ikeuchi M, Ide T, Hayashidani S, Shiomi T, Kubota T, Hamasaki N, Takeshita A: Oxidative stress mediates tumor necrosis factor-alpha-induced mitochondrial DNA damage and dysfunction in cardiac myocytes. Circulation 2003, 107:1418–1423.

43. Siwik DA, Pagano PJ, Colucci WS: Oxidative stress regulates collagen synthesis and matrix metalloproteinase activity in cardiac fibroblasts.

Am J Physiol Cell Physiol 2001, 280:53–60.

44. Deten A, Hölzl A, Leicht M, Barth W, Zimmer HG: Changes in extracellular matrix and in transforming growth factor beta isoforms after coronary artery ligation in rats. J Mol Cell Cardiol 2001, 33:1191–1207.

45. Rohde LE, Ducharme A, Arroyo LH, Aikawa M, Sukhova GH, Lopez-Anaya A, McClure KF, Mitchell PG, Libby P, Lee RT: Matrix metalloproteinase

Rodrigo et al. Trials 2014, 15:192 http://www.trialsjournal.com/content/15/1/192

46.

47.

48.

49.

50.

51.

52.

53.

54.

55.

56.

57.

58.

59.

60.

61.

62.

63.

64.

65.

inhibition attenuates early left ventricular enlargement after experimental myocardial infarction in mice. Circulation 1999, 99:3063–3070.

Guan W, Osanai T, Kamada T, Hanada H, Ishizaka H, Onodera H, Iwasa A, Fujita N, Kudo S, Ohkubo T, Okumura K: Effect of allopurinol pretreatment on free radical generation after primary coronary angioplasty for acute myocardial infarction. J Cardiovasc Pharmacol 2003, 41:699–705.

Tsujita K, Shimomura H, Kaikita K, Kawano H, Hokamaki J, Nagayoshi Y, Yamashita T, Fukuda M, Nakamura Y, Sakamoto T, Yoshimura M, Ogawa H: Long-term efficacy of edaravone in patients with acute myocardial infarction. Circ J 2006, 70:832–837.

Flaherty JT, Pitt B, Gruber JW, Heuser RR, Rothbaum DA, Burwell LR, George BS, Kereiakes DJ, Deitchman D, Gustafson N: Recombinant human superoxide dismutase (h-SOD) fails to improve recovery of ventricular function in patients undergoing coronary angioplasty for acute myocardial infarction. Circulation 1994, 89:1982–1991.

Downey JM: Free radicals and their involvement during long-term myocardial ischemia and reperfusion. Annu Rev Physiol 1990, 52:487–504.

Yellon DM, Hausenloy DJ: Myocardial reperfusion injury. N Engl J Med 2007, 357:1121–1135.

Lassnigg A, Punz A, Barker R, Keznickl P, Manhart N, Roth E, Hiesmayr M: Influence of intravenous vitamin E supplementation in cardiac surgery on oxidative stress: a double-blinded, randomized, controlled study. Br J Anaesth 2003, 90:148–154.

Rodrigo R, Guichard C, Charles R: Clinical pharmacology and therapeutic use of antioxidant vitamins. Fund Clin Pharmacol 2007, 21:111–127.

Sesso HD, Buring JE, Christen WG, Kurth T, Belanger C, MacFadyen J, Bubes V, Manson JE, Glynn RJ, Gaziano JM: Vitamins E and C in the prevention of cardiovascular disease in men: the Physicians' Health Study II randomized controlled trial. JAMA 2008, 300:2123–2133.

Gaziano JM, Glynn RJ, Christen WG, Kurth T, Belanger C, MacFadyen J, Bubes V, Manson JE, Sesso HD, Buring JE: Vitamins E and C in the prevention of prostate and total cancer in men: the Physicians' Health Study II randomized controlled trial. JAMA 2009, 301:52–62.

Guan W, Osanai T, Kamada T, Ishizaka H, Hanada H, Okumura K: Time course of free radical production after primary coronary angioplasty for acute myocardial infarction and the effect of vitamin C. Jpn Circ J 1999, 63:924–928.

Jaxa-Chamiec T, Bednarz B, Drozdowska D, Gessek J, Gniot J, Janik K, KawkaUrbanek T, Maciejewski P, Ogórek M, Szpajer M, MIVIT Trial Group: Antioxidant effects of combined vitamins C and E in acute myocardial infarction: the randomized, double-blind, placebo controlled, multicenter pilot Myocardial Infarction and VITamins (MIVIT) trial. Kardiol Pol 2005, 62:344–350.

Jaxa-Chamiec T, Bednarz B, Herbaczynska-Cedro K, Maciejewski P, Ceremuzynski L, MIVIT Trial Group: Effects of vitamins C and E on the outcome after acute myocardial infarction in diabetics: a retrospective, hypothesis-generating analysis from the MIVIT study. Cardiology 2009, 112:219–223.

Upston JM, Witting PK, Brown AJ, Stocker R, Keaney JF Jr: Effect of vitamin E on aortic lipid oxidation and intimal proliferation after arterial injury in cholesterol-fed rabbits. Free Radic Biol Med 2001, 31:1245–1253.

Terentis AC, Thomas SR, Burr JA, Liebler DC, Stocker R: Vitamin E oxidation in human atherosclerotic lesions. Circ Res 2002, 90:333–339.

Shi H, Noguchi N, Niki E: Comparative study on dynamics of antioxidative action of alpha-tocopheryl hydroquinone, ubiquinol, and alpha-tocopherol against lipid peroxidation. Free Radic Biol Med 1999, 27:334–346.

Rabl H, Khoschsorur G, Colombo T, Petritsch P, Rauchenwald M, Költringer P, Tatzber F, Esterbauer H: A multivitamin infusion prevents lipid peroxidation and improves transplantation performance. Kidney Int 1993, 43:912–917.

Cerwenka H, Bacher H, Werkgartner G, El-Shabrawi A, Quehenberger F, Hauser H, Mischinger HJ: Antioxidant treatment during liver resection for alleviation of ischemia-reperfusion injury. Hepatogastroenterology 1998, 45:777–782.

Wijnen MH, Roumen RM, Vader HL, Goris RJ: A multiantioxidant supplementation reduces damage from ischaemia reperfusion in patients after lower torso ischaemia: a randomised trial. Eur J Vasc Endovasc Surg 2002, 23:486–490.

Rabl H, Khoschsorur G, Petek W: Antioxidative vitamin treatment: effect on lipid peroxidation and limb swelling after revascularization operations. World J Surg 1995, 19:738–744.

Bartels M, Biesalski HK, Engelhart K, Sendlhofer G, Rehak P, Nagel E: Pilot study on the effect of parenteral vitamin E on ischemia and reperfusion

Page 11 of 12

66.

67.

68.

69.

70.

71.

72.

73.

74.

75.

76.

77.

78.

79.

80.

81.

82.

83.

84.

induced liver injury: a double blind, randomized, placebo-controlled trial.

Clin Nutr 2004, 23:1360–1370.

Schneider MP, Delles C, Schmidt BM, Oehmer S, Schwarz TK, Schmieder RE, John S: Superoxide scavenging effects of N-acetylcysteine and vitamin C in subjects with essential hypertension. Am J Hypertens 2005, 18:1111–1117.

Graumlich JF, Ludden TM, Conry-Cantilena C, Cantilena LR Jr, Wang Y, Levine M: Pharmacokinetic model of ascorbic acid in healthy male volunteers during depletion and repletion. Pharm Res 1997, 14:1133–1139.

Jackson TS, Xu A, Vita JA, Keaney JF Jr: Ascorbate prevents the interaction of superoxide and nitric oxide only at very high physiological concentrations. Circ Res 1998, 83:916–922.

Basili S, Tanzilli G, Mangieri E, Raparelli V, Di Santo S, Pignatelli P, Violi F: Intravenous ascorbic acid infusion improves myocardial perfusion grade during elective percutaneous coronary intervention: relationship with oxidative stress markers. JACC Cardiovasc Interv 2010, 3:221–229.

Bhakuni P, Chandra M, Misra MK: Effect of ascorbic acid supplementation on certain oxidative stress parameters in the post reperfusion patients of myocardial infarction. Mol Cell Biochem 2006, 290:153–158.

Virdis A, Colucci R, Fornai M, Polini A, Daghini E, Duranti E, Ghisu N, Versari D, Dardano A, Blandizzi C, Taddei S, Del Tacca M, Monzani F: Inducible nitric oxide synthase is involved in endothelial dysfunction of mesenteric small arteries from hypothyroid rats. Endocrinology 2009, 150:1033–1042.

Niki E, Noguchi N, Tsuchihashi H, Gotoh N: Interaction among vitamin C, vitamin E, and beta-carotene. Am J Clin Nutr 1995, 62:1322S–1326S. Rodrigo R, Libuy M, Feliú F, Hasson D: Molecular basis of cardioprotective effect of antioxidant vitamins in myocardial infarction. Biomed Res Int 2013, 2013:437613.

Molyneux CA, Glyn MC, Ward BJ: Oxidative stress and cardiac microvascular structure in ischemia and reperfusion: the protective effect of antioxidant vitamins. Microvasc Res 2002, 64:265–277.

Tsovolas K, Iliodromitis EK, Andreadou I, Zoga A, Demopoulou M, Iliodromitis KE, Manolaki T, Markantonis SL, Kremastinos DT: Acute administration of vitamin C abrogates protection from ischemic preconditioning in rabbits. Pharmacol Res 2008, 57:283–289. van Belle G: Statistical Rules of Thumb 2nd ed. Hoboken, NJ: Wiley; 2008:30.

Brener SJ, Maehara A, Dizon JM, Fahy M, Witzenbichler B, Parise H, El-Omar M, Dambrink JH, Mehran R, Oldroyd K, Gibson CM, Stone GW: Relationship between myocardial reperfusion, infarct size, and mortality: the INFUSEAMI (Intracoronary Abciximab and Aspiration Thrombectomy in Patients with Large Anterior Myocardial Infarction) trial. JACC Cardiovasc Interv 2013, 6:718–724.

De Luca G, Parodi G, Sciagrà R, Venditti F, Bellandi B, Vergara R, Migliorini A, Valenti R, Antoniucci D: Preprocedural TIMI flow and infarct size in STEMI undergoing primary angioplasty. J Thromb Thrombolysis 2013, Aug 9.

[Epub ahead of print].

Stone GW, Dixon SR, Grines CL, Cox DA, Webb JG, Brodie BR, Griffin JJ, Martin JL, Fahy M, Mehran R, Miller TD, Gibbons RJ, O'Neill WW: Predictors of infarct size after primary coronary angioplasty in acute myocardial infarction from pooled analysis from four contemporary trials. Am J Cardiol 2007, 100:1370–1375.

Mahaffey KW, Puma JA, Barbagelata NA, DiCarli MF, Leesar MA, Browne KF, Eisenberg PR, Bolli R, Casas AC, Molina-Viamonte V, Orlandi C, Blevins R, Gibbons RJ, Califf RM, Granger CB: Adenosine as an adjunct to thrombolytic therapy for acute myocardial infarction: results of a multicenter, randomized, placebo-controlled trial: the Acute Myocardial Infarction Study of Adenosine (AMISTAD) trial. J Am Coll Cardiol 1999, 34:1711–1720.

Henriques JPS, Zijlstra F, Ottervanger JP, Dambrink J-HE, Hof AWJ v 't, Hoorntje JCA, de Boer M-J, Suryapranat H: Angiographic determinants of infarct size after successful percutaneous intervention for acute STelevation myocardial infarction: the impact of distal embolisation. Neth Heart J 2002, 10:353–359.

Bruce CJ, Christian TF, Schaer GL, Spaccavento LJ, Jolly MK, O'Connor MK, Gibbons RJ: Determinants of infarct size after thrombolytic treatment in acute myocardial infarction. Am J Cardiol 1999, 83:1600–1605.

Christian TF, Schwartz RS, Gibbons RJ: Determinants of infarct size in reperfusion therapy for acute myocardial infarction. Circulation 1992, 86:81–90.

Duconge J, Miranda-Massari JR, Gonzalez MJ, Jackson JA, Warnock W, Riordan NH: Pharmacokinetics of vitamin C: insights into the oral and intravenous administration of ascorbate. P R Health Sci J 2008, 27:7–19.

Rodrigo et al. Trials 2014, 15:192 http://www.trialsjournal.com/content/15/1/192

Page 12 of 12

85. Padayatty SJ, Sun AY, Chen Q, Espey MG, Drisko J, Levine M: Vitamin C: intravenous use by complementary and alternative medicine practitioners and adverse effects. PLoS One 2010, 5:e11414.

86. Bjelakovic G, Nikolova D, Gluud LL, Simonetti RG, Gluud C: Antioxidant supplements for prevention of mortality in healthy participants and patients with various diseases. Cochrane Database Syst Rev 2012, 3, CD007176.

87. Miller ER 3rd, Pastor-Barriuso R, Dalal D, Riemersma RA, Appel LJ, Guallar E: Meta-analysis: high-dosage vitamin E supplementation may increase all-cause mortality. Ann Intern Med 2005, 142:37–46.

88. Ye Y, Li J, Yuan Z: Effect of antioxidant vitamin supplementation on cardiovascular outcomes: a meta-analysis of randomized controlled trials.

PLoS One 2013, 8:e56803.

89. Myung SK, Ju W, Cho B, Oh SW, Park SM, Koo BK, Park BJ, Korean MetaAnalysis Study Group: Efficacy of vitamin and antioxidant supplements in prevention of cardiovascular disease: systematic review and meta-analysis of randomised controlled trials. BMJ 2013, 346:f10.

90. Waters DD, Alderman EL, Hsia J, Howard BV, Cobb FR, Rogers WJ, Ouyang P, Thompson P, Tardif JC, Higginson L, Bittner V, Steffes M, Gordon DJ, Proschan M, Younes N, Verter JI: Effects of hormone replacement therapy and antioxidant vitamin supplements on coronary atherosclerosis in postmenopausal women: a randomized controlled trial. JAMA 2002, 288:2432–2440. doi:10.1186/1745-6215-15-192 Cite this article as: Rodrigo et al.: The effectiveness of antioxidant vitamins C and E in reducing myocardial infarct size in patients subjected to percutaneous coronary angioplasty (PREVEC Trial): study protocol for a pilot randomized double-blind controlled trial. Trials 2014 15:192.

Submit your next manuscript to BioMed Central and take full advantage of: • Convenient online submission • Thorough peer review • No space constraints or color figure charges • Immediate publication on acceptance • Inclusion in PubMed, CAS, Scopus and Google Scholar • Research which is freely available for redistribution Submit your manuscript at www.biomedcentral.com/submit

View publication stats

Trường Đại học Dược Hà Nội Bộ môn Hóa ĐC - Vô cơ

Tiểu luận

Gốc tự do&Chất chống oxy hóa

Mã bài: AO-12

Họ tên: Nguyễn Thế Phương Mã HV: 1811048 Khóa: CH23 Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc

Hà Nội, tháng 5 / 2019

MỤC LỤC

I. PHẦN CHỦ ĐỀ BẮT BUỘC ............................................................... 1 1.1 Bài dịch ............................................................................................ 1 1.2 Nhận xét cá nhân về chủ đề bắt buộc............................................ 25 II. PHẦN CHỦ ĐỀ TỰ CHỌN.............................................................. 28 2.1 Bài dịch .......................................................................................... 28 2.2 Nhận xét cá nhân về chủ đề tự chọn ............................................. 38 2.3 Bài báo gốc chủ đề tự chọn ........................................................... 40

I. PHẦN CHỦ ĐỀ BẮT BUỘC 1.1 Bài dịch Tập tin PDF tạm thời này có nội dung tương ứng với bài báo khi nó được chấp nhận xuất bản. Phiên bản PDF đầy đủ và toàn văn (HTML) sẽ sớm được cung cấp.

Hiệu quả của vitamin chống oxy hóa C và E trong việc giảm kích thước vùng nhồi máu cơ tim ở bệnh nhân đã nong mạch vành qua da (thử nghiệm PREVEC): nghiên cứu thử nghiệm với thử nghiệm mù đôi ngẫu nhiên có kiểm soát Trials 2014, 15:192 doi:10.1186/1745-6215-15-192 Ramón Rodrigo (rrogrigo@med.uchile.cl) Daniel Hasson (danielhasson2@gmail.com) Juan C Prieto (jprieto@med.uchile.cl) Gastón Dussaillant (gdussaillant@redclinicauchile.cl) Cristóbal Ramos (kristobalramos@gmail.com) Lucio Leon (lleoncl@yahoo.com) Javier Gárate (javier_garate@hotmail.com) Nicolás Valls (nvallsj@ug.uchile.com) ISSN Loại bài báo Ngày nộp Ngày chấp nhận Ngày xuất bản Đường dẫn bài báo

1745-6215 Nghiên cứu thử nghiệm 27 / 6 / 2013 9 / 5 / 2014 29 / 5 / 2014 http://www.trialsjournal. com/content/15/1/192

Bài viết này có thể được tải xuống, in và phân phát miễn phí với bất kì mục đích sử dụng nào (xem thông báo bản quyền bên dưới).

Những bài báo trên Trials đã được liệt kê tại Pubmed và lưu trữ ở Pubmed Central.

1

Để biết thông tin về việc xuất bản nghiên cứu của bạn trên Trials hoặc tạp chí BioMed Central bất kỳ, hãy truy cập vào đường dẫn http://www. trialjournal.com/authors/instructions/ Để biết thông tin về các ấn phẩm BioMed Central khác, hãy truy cập vào đường dẫn http://www.biomedcentral.com/ © 2014 Rodrigo et al. Đây là một bài báo truy cập mở được phân phối theo các điều khoản của Giấy phép ghi nhận sáng tạo (http://creativecommons.org/ licenses /by/2.0), nó cho phép sử dụng, phân phối và sao chép lại không hạn chế trong bất kỳ hoàn cảnh nào, miễn là bản gốc có thông tin đó.

Hiệu quả của vitamin chống oxy hóa C và E trong việc giảm kích thước vùng nhồi máu cơ tim ở bệnh nhân đã nong mạch vành qua da (thử nghiệm PREVEC): nghiên cứu thử nghiệm với thử nghiệm mù đôi ngẫu nhiên có kiểm soát Ramón Rodrigo 1* * Đồng tác giả Email: rrogrigo@med.uchile.cl Daniel Hasson 1 Email: danielhasson2@gmail.com Juan C Prieto 1,2 Email: jprieto@med.uchile.cl Gastón Dussaillant 2 Email: gdussaillant@redclinicauchile.cl Cristóbal Ramos 3 Email: kristobalramos@gmail.com Lucio Leon 4 Email: lleoncl@yahoo.com Javier Gárate 4 Email: javier_garate@hotmail.com Nicolás Valls 1 Email: nvallsj@ug.uchile.com

2

Juan G Gormaz 1 Email: jgormaz@med.uchile 1

Chương trình Dược lý Phân tử và Lâm sàng, Viện Khoa học Y sinh, Khoa Y, Đại học Chile, Santiago, Chile 2 Khoa Tim mạch, Bệnh viện Lâm sàng Đại học Chile, Santiago, Chile 3 Khoa Chẩn đoán hình ảnh, Bệnh viện Lâm sàng Đại học Chile, Santiago, Chile 4 Trung tâm tim mạch, Bệnh viện Lâm sàng San Borja Arriarán, Santiago, Chile Tóm tắt Nền tảng của nghiên cứu Nhồi máu cơ tim cấp (AMI) là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới. Stress oxy hóa có liên quan đến hiện tượng chấn thương do tái tưới máu sau thiếu máu cục bộ ở AMI. Có ý kiến cho rằng sự tái tưới máu góp phần tạo lên khoảng 50% kích thước cuối cùng của vùng nhồi máu cơ tim, một phần tổn thương có khả năng được ngăn ngừa. Do đó, chúng tôi cho rằng tăng cường chất chống oxy hóa thông qua bổ sung vitamin C và E sẽ giúp chống lại chấn thương do tái tưới máu sau thiếu máu cục bộ, nhờ đó làm giảm kích thước vùng nhồi máu.

Thử nghiệm PREVEC (Ngăn ngừa tổn thương tái tưới máu liên quan đến nong tạo hình mạch vành qua da sau nhồi máu cơ tim cấp) tìm cách đánh giá xem các vitamin chống oxy hóa C và E có làm giảm kích thước vùng nhồi máu ở bệnh nhân bị nhồi máu động mạch vành sau nhồi máu cơ tim cấp hay không.

Phương pháp/Thiết kế nghiên cứu Đây là một thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên, 1:1, mù đôi, giả dược có kiểm soát.

Nghiên cứu này diễn ra tại hai trung tâm ở Chile: Bệnh viện lâm sàng Đại học Chile và Bệnh viện lâm sàng San Borja Arriarán.

3

Đối tượng nghiên cứu là 134 người trưởng thành bị nhồi máu cơ tim cấp tính được chỉ định điều trị nong tạo hình mạch vành qua da.

Thử nghiệm này được thực hiện như một nghiên cứu sơ bộ, trong đó đối tượng nghiên cứu được tiêm truyền vitamin C liều cao và uống vitamin E (nhóm điều trị vitamin) hoặc được sử dụng giả dược (nhóm đối chứng) trong quá trình nong mạch vành. Sau đó, nhóm điều trị Vitamin được uống vitamin C và E, và nhóm đối chứng được uống giả dược trong 84 ngày sau khi nong mạch vành.

Kết quả chính: kích thước vùng nhồi máu, được đánh giá bằng cộng hưởng từ tim mạch (CMR) vào ngày thứ 6 và 84 sau khi nong mạch vành.

Kết quả thứ phát: phân suất tống máu, được đánh giá vào ngày thứ 6 và 84 sau nong mạch vành bằng CMR và những chỉ báo sinh học (biomarkers) của stress oxy hóa, tình trạng chống oxy hóa, tổn thương tim và viêm, sẽ được đánh giá tại thời điểm trước phẫu thuật, khi bắt đầu tái tưới máu, 6 đến 8 giờ sau tái thông mạch, và khi xuất viện.

Bàn luận Việc tái tưới máu sau thiếu máu cục bộ xảy ra trong quá trình nong mạch vành đã được biết là làm tăng kích thước vùng nhồi máu cơ tim.

Những lợi ích trong việc bảo vệ tim mạch của vitamin C liều cao kết hợp với vitamin E chưa được nghiên cứu đầy đủ. Thử nghiệm PREVEC tìm cách xác định sự phù hợp trong điều trị khi sử dụng vitamin C và E nhằm chống lại tổn thương do tái tưới máu trong quá trình phẫu thuật nong mạch vành.

Việc tuyển chọn bệnh nhân được bắt đầu vào tháng 2 năm 2013. Thử nghiệm được lên kế hoạch kết thúc vào tháng 3 năm 2016. Đăng ký tham gia thử nghiệm ISRCTN56034553 Từ khóa Nong tạo hình mạch vành qua da, tái tưới máu sau thiếu máu cục bộ, stress oxy hóa, Vitamin C, Vitamin E, nhồi máu cơ tim cấp

4

Tổng quan Nong tạo hình mạch vành qua da (PCA) tiên phát được công nhận là cách hữu hiệu nhất để phục hồi lưu lượng máu vào mạch vành trong ca nhồi máu cơ tim cấp (AMI). Phục hồi cơ tim và hạn chế mở rộng kích thước vùng nhồi máu là các cơ chế chính mà nhờ đó bệnh nhân bị nhồi máu cơ tim có ST chênh lên (STEMI) được hưởng lợi từ sự tái tưới máu [1].

Mặc dù có những tiến bộ quan trọng trong điều trị bằng thuốc và các phương pháp tái tưới máu, nhưng suy tim là một hậu quả về mặt chức năng của nhồi máu cơ tim cấp - tiên lượng xấu lâu dài ở bệnh nhân mạch vành [2]. Trong các hậu quả khác, chức năng toàn thể của thất trái luôn được xem là một yếu tố tiên lượng quan trọng sau khi bị AMI. Các phương pháp khác nhau đã được thử nghiệm nhằm bảo tồn chức năng của tâm thất trái và giảm kích thước vùng nhồi máu ở bệnh nhân bị STEMI đã trải qua PCA [3,4], nhưng không đạt được hiệu quả lâm sàng mong muốn.

Hiện nay, người ta chấp nhận rằng hình ảnh cộng hưởng từ tim mạch (CMR) là tiêu chuẩn vàng để đo đạc kích thước vùng nhồi máu liên quan đến AMI trong thực hành lâm sàng [5,6,7,8] và trong các thử nghiệm lâm sàng [9]. CMR cũng có thể giúp đo và mô phỏng chính xác phân suất tống máu, thể tích thất và khối lượng tim [5]. Kích thước của vùng nhồi máu được coi là một tiêu chí sau cuối và quan trọng giúp đánh giá kết quả của thử nghiệm của nhóm các hiệp hội ESC/ACCF/AHA/WHF trong việc xác định nhồi máu cơ tim [10] và là tiêu chí thường dùng trong các thử nghiệm đánh giá sự cải thiện tổn thương do tái tưới máu [11,12,13 ,14,15], bởi vì giá trị của nó vừa phản ánh sự ảnh hưởng lẫn nhau của các yếu tố sinh lý và trao đổi chất, vừa cung cấp một thước đo trực tiếp về lượng tế bào cơ tim bị mất [16]. Phép đo trực tiếp này đặc biệt có giá trị trong trường hợp AMI, trong khi những phép đo khác, ví dụ như hiện tượng vùng cơ tim bị choáng hoặc vùng cơ tim ngủ đông, có thể không phản ánh được mức độ bị làm tổn thương lâu dài của tim.

Tổn thương do tái tưới máu có biểu hiện giống như tổn thương cơ tim khi tim được tưới máu lại sau hiện tượng tắc động mạch vành nguy kịch [17]. Tái tưới máu sau thiếu máu cục bộ là một vấn đề lâm sàng có liên quan đến các thủ thuật như liệu pháp tan huyết khối, nong mạch vành và

5

phẫu thuật bắc cầu mạch vành, thường được sử dụng để thiết lập lại dòng chảy và giảm thiểu tổn thương của tim do thiếu máu cơ tim nặng. Tổn thương do tái tưới máu bao gồm một loạt các hiện tượng: (a) loạn nhịp do tái tưới máu, (b) hiện tượng không dòng chảy - liên quan đến “tổn thương vi mạch”, (c) vùng cơ tim choáng - “cơ tim mất chức năng co bóp”, (d) tái tưới máu gây chết người - “chết tế bào”, những hiện tượng này có thể xảy ra cùng lúc hoặc riêng lẻ [18,19].

Hai giả thuyết chính là stress oxy hóa và quá tải Ca 2+ đã được đề xuất để giải thích cơ chế bệnh sinh của tổn thương do tái tưới máu sau thiếu máu cục bộ [20,21]. Liên quan đến điều này, stress oxy hóa, thường liên quan đến sự hình thành các dạng oxy hoạt động (ROS), làm thay đổi cấu trúc của phospholipid và protein, dẫn đến peroxid hóa lipid và oxy hóa các nhóm thiol; những thay đổi này làm thay đổi tính thấm và cấu hình màng tế bào và gây ra sự biến đổi chức năng của hàng loạt các protein khác nhau trong tế bào [22].

Một vài nghiên cứu đã chỉ ra vai trò thiết yếu của ROS trong cơ chế bệnh sinh của tổn thương do tái tưới máu cơ tim sau thiếu máu cục bộ. Có nhiều thay đổi xảy ra ở trường hợp tim bị thiếu máu cục bộ được tái tưới máu, ví dụ như mất chức năng co bóp, rối loạn nhịp tim, thay đổi biểu hiện gen và rối loạn con đường adrenergic đã được quan sát thấy [23]. Những thay đổi tương tự đã được ghi nhận ở những trái tim được tưới máu cùng với các hệ thống khác nhau tạo ra ROS. Hơn nữa, hoạt động tiền xử lý ROS của các bào quan trong tế bào tim đã cho thấy những thay đổi tương tự. Do đó, stress oxy hóa cũng góp một phần gây ra những thay đổi trên cơ tim trong quá trình tái tưới máu sau thiếu máu cục bộ. Ngoài ra, tái tưới máu sau thiếu máu cục bộ đã được biết là gây tăng H2O2, nồng độ Ca 2+ nội bào, hàm lượng malondialdehyde (MDA) và sự hình thành các dien liên hợp tại tim. Việc điều trị trên động vật thí nghiệm bằng các enzyme chống oxy hóa superoxide dismutase (SOD cùng với enzym catalase đã giúp bảo vệ và chống lại những thay đổi này [24,25]. ROS dường như tăng đáng kể sau vài phút tái tưới máu, nhưng sự gia tăng của chúng trong giai đoạn thiếu máu cục bộ vẫn gây tranh cãi.

Dựa vào những thay đổi này, có thể đưa ra giả thiết là sự gia tăng anion superoxide và các ROS khác trong quá trình tái tưới máu là nguyên

6

nhân dẫn đến sự peroxid hóa lipid và oxy hóa các nhóm sulfhydryl. Người ta đã chứng minh rằng các tế bào nội mô, tế bào viêm (bạch cầu trung tính, đại thực bào) và tế bào cơ tim đều có khả năng tạo ra ROS thông qua một số phản ứng xúc tác bởi enzyme. Các nhà khoa học đã đề xuất rằng sự giải phóng lượng lớn các ROS từ các tế bào nội mô và tế bào cơ tim trong giai đoạn đầu của quá trình tái tưới máu có thể ảnh hưởng đến các bạch cầu trung tính gần đó, từ đó bắt đầu chu trình khuếch đại các phản ứng của tế bào thông qua các chất trung gian gây viêm.

Hơn nữa, sau khi bạch cầu trung tính bám vào nội mạc, chúng trở thành nguyên nhân gây giải phóng các yếu tố như các cytokine, vì thế tạo ra lượng ROS lớn hơn nhiều. Sau sự bùng nổ ban đầu của ROS khi bắt đầu tái tưới máu, những sự việc xảy ra sau đó như sự di chuyển của bạch cầu trung tính và đại thực bào có thể làm chậm lại việc tiếp tục tạo ra ROS trong quá trình tái tưới máu [26,27]. Các bạch cầu trung tính được hoạt hóa sẽ sản xuất ra superoxide, vừa là tác nhân gây độc tế bào, vừa là một phần của sự bùng nổ hô hấp thông qua phản ứng của enzym NADPH oxidase bám màng với oxy phân tử. Bạch cầu trung tính cũng tạo ra tác nhân nitric oxide (NO) có thể phản ứng với superoxide để tạo ra peroxynitrite - tác nhân oxy hóa mạnh nhất trong các dạng nitơ hoạt động (NOS), nó có thể phân hủy để tạo thành gốc hydroxyl [28].

Trong AMI, một mô hình lâm sàng của stress oxy hóa, ROS được tạo ra trong cơ tim bị thiếu máu cục bộ, đặc biệt là sau khi tái tưới máu. ROS làm tổn thương trực tiếp màng tế bào và gây chết tế bào [29]. Tuy nhiên, ROS cũng kích thích sự truyền tín hiệu đến các cytokine gây viêm (ví dụ, yếu tố hoại tử khối u (TNF-α), interleukin (IL) -1β và IL-6) ở vùng thiếu máu cục bộ và xung quanh cơ tim như một phản ứng chủ yếu. Các cytokine gây viêm cũng điều hòa sự sống và sự chết của tế bào trong phản ứng dây chuyền với ROS. Apoptosis hay sự chết theo chương trình là một hình thức phá hủy tế bào riêng biệt, có liên quan đến sự tổng hợp các enzyme làm thoái hóa và phân cắt DNA của chính tế bào. Có thêm thông tin cho thấy thiếu máu cục bộ sau khi tái tưới máu gây ra tổn thương cơ tim đáng kể thông qua con đường chết theo chương trình.

7

Nhờ hiểu biết về các cơ chế truyền tín hiệu điện thế liên quan đến quá trình apoptosis do ROS kích hoạt, các báo cáo gần đây đã chỉ ra rằng sự quá tải Ca 2+ trong tế bào và sự tăng cường hoạt động của họ enzym protein kinase được hoạt hóa bằng mitogen (MAPK) trong quá trình tái tưới máu có thể góp phần vào quá trình gây ra apoptosis qua trung gian ROS, thêm vào đó là hoại tử, và cuối cùng đây có thể là một yếu tố quyết định kích thước vùng nhồi máu [30].

Sự chết của tế bào từng được coi là không có cơ chế kiểm soát. Hiện nay, người ta đã biết rõ là sự chết của tế bào có một phần tuân theo quy trình chết thông thường. Loại chết này được biểu hiện dưới nhiều hình thái khác nhau. Trong đó có apoptosis từ lâu đã được công nhận là trung gian tích cực và cơ chế cơ bản của nó đã được làm sáng tỏ. Ngoài ra còn có sự hoại tử (necrosis), đây là ví dụ cơ bản về cái chết tế bào không được kiểm soát, cũng diễn ra trong một số trường hợp. Autophagy (Sự tự thực bào) thường được biết đến là một cơ chế sinh tồn nhưng nó có thể xảy ra liên quan đến tăng ROS và dẫn đến chết tế bào. Tuy nhiên, hiện nay hiểu biết về việc các tế bào autophagic chết như thế nào còn rất hạn chế [31].

Apoptosis, hoại tử và autophagy xảy ra trong các tế bào cơ tim trong quá trình nhồi máu cơ tim, thiếu máu cục bộ - tái tưới máu và suy tim. Ức chế một vài giai đoạn trong cả quá trình hoặc ức chế sự khởi phát của apoptosis và sự hoại tử giúp làm giảm kích thước vùng nhồi máu và cải thiện chức năng tim trong các rối loạn này [32].

ROS và NOS là những tác nhân khởi xướng chính gây ra tổn thương cơ tim trong quá trình tái tưới máu. Theo đó, AMI thường được khởi đầu bởi hiện tượng thiếu máu cơ tim do tắc nghẽn động mạch vành. Khi cơ tim bị thiếu máu cục bộ, ROS được tạo ra bởi tác nhân tiền oxy hóa (prooxidant) được đặc biệt tăng cường sau khi tái tưới máu. Vì vậy, bạch cầu trung tính chính là nguồn chủ yếu cung cấp ROS trong quá trình tái tưới máu. Các tế bào nội mô và tế bào cơ tim cũng có thể tạo ra ROS. ROS được tăng sản xuất chủ yếu là do hoạt hóa enzym xanthine oxidase (enzyme xúc tác sự hình thành axit uric cùng với sự đồng sản xuất superoxide) trong các tế bào nội mô [33], kích thích hoạt động của chuỗi vận chuyển điện tử của ty thể trong tế bào cơ tim cũng như hoạt hóa enzym NADPH oxidase trong các tế bào viêm [34]. Trong các trường hợp này, tác

8

dụng chống oxy hóa của enzym có liên quan đến khả năng chống lại tác động bất lợi của ROS. Đồng ý với quan điểm này, đã có báo cáo rằng ở chuột biến đổi gen có enzym superoxide dismutase (SOD) biểu hiện quá mức, kích thước vùng nhồi máu giảm đáng kể [35,36]. Theo đó, allopurinol, một chất ức chế enzym xanthine oxidase, đã được chứng minh là ngăn chặn sự sản xuất superoxide ở các cơ quan được tái tưới máu sau thiếu máu cục bộ như tim [37], gan [33], thận [38] và ruột non [39].

Do đó, cần phải dự kiến rằng việc tăng cường hệ thống phòng thủ chống oxy hóa thông qua các yếu tố “dọn rác” ROS (scavengers) sẽ đưa đến hiệu quả bảo vệ tim trong quá trình tái tưới máu cơ tim. Sau đợt thiếu máu cơ tim cục bộ, sự tái cấu trúc thất trái (left ventricle remodeling) được biết là sẽ xảy ra; mặc dù cơ chế cơ bản của nó rất phức tạp, nhưng ROS và các cytokine gây viêm có thể gây ra phản ứng đình trệ tim (cardiodepressive reaction) [40,41,42]. Điều đáng quan tâm là ROS cũng kích thích sản xuất các cytokine gây viêm và ngược lại, các cytokine gây viêm kích thích sự hình thành ROS. Trong giai đoạn mãn tính, ROS và các cytokine gây viêm kích hoạt họ enzym matrix metalloproteinase [43,44], từ đó khơi mào sự thoái hóa của collagens, các enzym đó có thể gây ra sự rối loạn trong sắp xếp tổ chức sợi vi cơ tim và gây giãn thất trái [45].

Tồn tại bằng chứng chính cho thấy sự góp phần gây tổn thương cơ tim trong AMI ở người của ROS. Do đó, có thể hy vọng rằng việc điều trị bằng các tác nhân chống oxy hóa hoặc tăng cường các enzyme chống oxy hóa nội sinh có thể giúp bảo vệ và chống lại chấn thương do tái tưới máu. Một số nghiên cứu cho thấy các tác nhân chống oxy hóa làm giảm sự tái cấu trúc thất trái sau AMI. Ở những bệnh nhân AMI được nong tạo hình mạch vành qua da tiên phát, điều trị tiền phẫu thuật bằng các chất ức chế xanthine oxidase như allopurinol sẽ giúp sự ức chế có hiệu quả các gốc oxy hoạt động sinh ra khi tiến hành tái tưới máu và phục hồi chức năng thất trái [46].

Gần đây, việc sử dụng edaravone (một tác nhân dọn gốc tự do) ở bệnh nhân AMI ngay trước khi tái tưới máu đã giúp giảm đáng kể kích thước vùng nhồi máu và rối loạn nhịp tim do tái tưới máu [47]. Tuy nhiên, những phương pháp khác như tiêm truyền tĩnh mạch enzym superoxide dismutase [48] hoặc trimetazidine [49] không cho thấy tác dụng có lợi trong kết quả điều trị của bệnh nhân.

9

Hầu hết các nghiên cứu về tác dụng bảo vệ sức khỏe của vitamin C và E chỉ tập trung vào khả năng chống oxy hóa của chúng. Tuy thế, những đặc tính sinh học của α-tocopherol và axit ascorbic thường áp đảo tác dụng chống oxy hóa của chúng. Mặc dù, các vitamin chống oxy hóa rất được quan tâm với vai trò là tác nhân bảo vệ tiềm năng giúp chống lại sự phát triển của bệnh ở người, nhưng những đóng góp thực sự của chúng để duy trì sức khỏe và các cơ chế đưa đến tác dụng đó vẫn chưa rõ ràng. Các chất chống oxy hóa, cũng như nhiều chiến lược bảo vệ tim mạch để giảm tổn thương gây chết người do tái tưới máu, đã được sử dụng ở những bệnh nhân bị AMI [50]. Mặc dù các cơ sở khoa học, dữ liệu dịch tễ học và các nghiên cứu hồi cứu đều có sức thuyết phục, nhưng cho đến nay các thử nghiệm tiến cứu, ngẫu nhiên, dùng giả dược có kiểm soát vẫn chưa thể xác minh lợi ích thực sự của vitamin chống oxy hóa trong các bệnh ở người [51,52,53,54]. Trong số các yếu tố có thể chịu trách nhiệm góp phần giải thích cho sự khác biệt này, việc thiếu xem xét các khía cạnh cơ bản, chẳng hạn như các đặc tính dược động học của các vitamin chống oxy hóa, sẽ được thảo luận sau. Đồng ý với quan điểm này, những nỗ lực trước đây nhằm giảm sản xuất gốc tự do sau tiến hành PCA ở bệnh nhân AMI bằng cách uống vitamin C, đã thất bại trong việc làm giảm sự tăng sản xuất các F2-isoprostane [55]. Ngược lại, Jaxa-Chamiecet al . [56] thực hiện một nghiên cứu ngẫu nhiên, đa trung tâm, mù đôi, dùng giả dược ở 800 bệnh nhân, đã phân tích tác dụng của hỗn hợp vitamin C - E được sử dụng theo đường truyền dịch và uống viên nang, đã không thể chứng minh tác dụng chính chống oxy hóa của chúng dựa trên kết quả lâm sàng của bệnh nhân, mặc dù bệnh nhân tiểu đường cho thấy giảm tỷ lệ tử vong do tim trong 30 ngày [57]. Cần lưu ý rằng các tác giả đã nhận ra trong nghiên cứu có một hạn chế là liều vitamin C được sử dụng chỉ làm tăng nồng độ của nó trong huyết tương lên tới 0,1 mM, nồng độ này thấp hơn 100 lần so với mức cần thiết để dọn gốc tự do anion superoxide.

Vitamin E, chủ yếu là α-tocopherol, là chất dọn gốc tự do chủ yếu cho các pha lipid sinh học như các loại màng hoặc LDL [58,59]. Tác dụng chống oxy hóa được cho là nhờ khả năng hoạt động hóa học như là một phân tử phá vỡ chuỗi phản ứng sinh gốc tự do của lipid, do đó ức chế quá trình peroxy hóa lipid thông qua việc chuyển đổi thành một sản phẩm oxy

10

hóa là α-tocopheroxyl. α-tocopherol có thể được phục hồi bằng cách khử gốc α-tocopheroxyl bằng các chất có hoạt tính oxi hóa khử như vitamin C hoặc ubiquinol [60]. Trong các nghiên cứu lâm sàng về tổn thương do tái tưới máu sau thiếu máu cục bộ, tác dụng khả quan của dung dịch vitamin E và các vitamin chống oxy hóa khác đã được ghi nhận trong các trường hợp tái thông mạch của chi dưới, ghép thận, phẫu thuật gan và phẫu thuật chỉnh sửa phình động mạch chủ [61,62,63,64]. Việc sử dụng vitamin E trước phẫu thuật là an toàn, và nó đem lại các tác dụng có lợi bằng cách giảm tác động của tổn thương do tái tưới máu sau thiếu máu cục bộ trong phẫu thuật gan [65]. Tuy nhiên, các nghiên cứu tương tự với bệnh nhân bị AMI vẫn còn rất hạn chế.

Về vitamin C, sử dụng liều cao muối ascorbate qua truyền động mạch đã được chứng minh là loại bỏ được các tác dụng trên in vivo của anion superoxide trong việc làm suy giảm chức năng nội mô mạch máu ở những người bị tăng huyết áp nguyên phát [66]. Ngoài ra, các nghiên cứu in vitro gần đây cũng đã thành công khi nghiên cứu tác động của stress oxy hóa khi có sử dụng và không sử dụng vitamin C liều cao như trên, nhờ đó xác định rằng việc sử dụng nồng độ cao muối ascorbate như vậy sẽ giúp chống lại tác động của stress oxy hóa [66]. Nồng độ vitamin C trong huyết tương luôn được kiểm soát chặt chẽ, và lượng vitamin C dư thừa được bài tiết dưới dạng ban đầu, nồng độ bão hòa đạt được khi sử dụng liều 400 mg mỗi ngày hoặc cao hơn, khi đó nồng độ của vitamin C trong huyết tương ổn định ở mức khoảng 80 µM [67]. Đáng tiếc là nồng độ này không đủ để làm sạch anion superoxide. Do đó, trong các trường hợp có kèm theo stress oxy hóa, chẳng hạn như chu trình tái tưới máu cơ tim sau thiếu máu cục bộ, không nên mong chờ lợi ích của việc uống vitamin C nhằm phòng ngừa tổn thương oxy hóa; tuy nhiên, truyền tĩnh mạch có thể được xem xét nếu muốn đạt được mục đích này. Thật vậy, superoxide phản ứng với NO với tốc độ gấp 105 lần so với tốc độ superoxide phản ứng với axit ascobic [68].

Kết quả là, 10 mM ascorbate là cần thiết để phục vụ cho việc vitamin C cạnh tranh phản ứng với superoxide. Ở những bệnh nhân đã trải qua PCA tự nguyện, sự suy yếu khi tái tưới máu vi tuần hoàn được cải thiện bằng cách truyền vitamin C, điều này cho thấy stress oxy hóa có liên quan đến hiện tượng như vậy [69]. Ngoài ra, ở những bệnh nhân bị huyết khối sau

11

AMI, enzym superoxide dismutase trong máu đã được xác định là bị giảm đáng kể, trong khi đó hoạt tính của enzyme oxy hóa như xanthine oxidase và nồng độ MDA được nhận thấy là tăng đáng kể. Tuy nhiên, việc bổ sung vitamin C bằng đường uống cho bệnh nhân sau lọc máu đã giúp đưa các thông số này trở lại mức bình thường hoặc gần mức bình thường [70]. Mặc dù dùng liều ascorbate cao hơn sẽ là cần thiết để đạt được hiệu quả bảo vệ tốt hơn, các đặc tính sinh học của nó, ngoài chức năng thu dọn ROS, có thể có một số tác dụng có lợi. Nguồn chính tạo ra ROS là các enzyme sản xuất chúng như enzym NADPH oxidase, một loại enzyme chịu sự điều hòa của vitamin C. Thêm vào đó, vitamin C có khả năng cản trở quá trình oxy hóa tetrahydrobiopterin, một cơ chất của enzym NO synthase và nó rất nhạy cảm với quá trình oxy hóa. Khi tetrahydrobiopterin bị oxy hóa, hoạt tính của enzym nitric oxide synthase nội mô (eNOS) chuyển sang ứng với hoạt tính của dạng không ghép cặp, dẫn đến việc chuyển sang sản xuất các superoxide thay vì sản xuất NO, dẫn đến làm tăng tổn hại do oxy hóa [71].

Axit ascorbic và α-tocopherol hoạt động như các chất chống oxy hóa thân nước và thân dầu mạnh trong môi trường tương ứng [72]. Chúng cũng có tác dụng hiệp đồng; trong khoang nước, axit ascorbic có thể hoàn nguyên α-tocopherol trong màng bằng cách chuyển hóa gốc α-tocopheroxyl trở lại thành α-tocopherol [73]. Vì vậy, tim của những con chuột được cho dùng vitamin E nhưng không được dùng vitamin C có lượng α-tocopherol giảm nhanh trong quá trình tái tưới máu [74].

Cuối cùng, điều đáng chú ý là vitamin C cũng có thể vô hiệu hóa những tác dụng có lợi của hiện tượng điều hòa thiếu máu (ischemic preconditioning) ở mô hình động vật, đây là một hiện tượng gây ra bởi một loạt các cơn thiếu máu cục bộ ngắn và tái tưới máu trước khi có một đợt thiếu máu cục bộ có thể gây tử vong, cơ chế này giúp tim tăng khả năng chống lại tai biến nhồi máu [75].

Mục tiêu của nghiên cứu Giả thiết là ở các bệnh nhân được phẫu thuật nong tạo hình mạch vành qua da để khôi phục lưu lượng máu qua mạch vành bị suy yếu do nhồi máu cơ tim cấp, những người được tiêm truyền vitamin C liều cao trong thời gian ngắn và được uống vitamin E theo liều khuyến cáo sẽ có kích thước

12

vùng nhồi máu nhỏ hơn, các tổn hại về chức năng và sinh hóa xảy ra trong quá trình tái tưới máu sau khi đột ngột ngưng cấp máu cũng giảm thiểu hơn so với bệnh nhân được điều trị bằng giả dược.

Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định ở những bệnh nhân đã trải qua PCA do bị AMI: i. hiệu quả của vitamin C và E trong việc giảm kích thước vùng nhồi máu cơ tim; ii. tác dụng bảo vệ chức năng tim của vitamin C và E, được đánh giá bằng cách đo phân suất tống máu; iii. mức độ peroxy hóa lipid và carbonyl hóa protein tại thời điểm ban đầu, ngay sau khi tái tưới máu thành công, 6 đến 8 giờ sau khi tái tưới máu và khi xuất viện; iv. mức độ của khả năng chống oxy hóa tại thời điểm ban đầu, ngay sau khi tái tưới máu thành công, 6 đến 8 giờ sau khi tái tái tưới máu và khi xuất viện; và v. mối tương quan giữa các chỉ báo sinh học (biomarker) liên quan đến stress oxy hóa với kích thước vùng nhồi máu cũng như phân suất tống máu tại thời điểm ngày thứ 6 và 84 sau khi tái tưới máu.

Phương pháp/Thiết kế Thiết kế Thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm, mù đôi, dùng giả dược, có kiểm soát này sẽ tiến hành chia đối tượng nghiên cứu ngẫu nhiên theo tỷ lệ 1: 1 vào nhóm dùng giả dược hoặc nhóm điều trị bằng vitamin. Thiết kế nghiên cứu được tóm tắt trong Hình 1.

13

Hình 1. Sơ đồ thiết kế cho thử nghiệm PREVEC.

14

Đối tượng nghiên cứu Bệnh nhân thuộc cả hai giới tính, trên 18 tuổi, có chỉ định nong tạo hình mạch vành qua da tiên phát và lần đầu tiên trải qua cơn nhồi máu cơ tim cấp, được đưa vào Bệnh viện lâm sàng Đại học Chile hoặc Bệnh viện lâm sàng San Borja Arriarán, được mời tham gia nghiên cứu. Các tiêu chí lựa chọn và loại trừ được thể hiện tương ứng trong bảng 1 và 2.

Bảng 1. Bảng liệt kê các tiêu chí lựa chọn đối tượng nghiên cứu Tiêu chí lựa chọn 1

Đối tượng có thể thuộc một trong hai giới tính và phải ít nhất 18 tuổi

2

Đối tượng có chỉ định nong mạch vành qua da (PCA) tiên phát: - Có cơn đau thắt ngực hoặc hội chứng tương tự trong khoảng thời gian ít nhất là 120 phút - Nhồi máu cơ tim cấp đoạn ST chênh lên có điện tâm đồ xuất hiện nhiều hơn hai chuyển đạo liên tục (> 2 mm)

3

Nhập viện trong vòng 12 giờ kể từ khi xuất hiện triệu chứng

4

Nhồi máu cơ tim lần đầu tiên

5

PCA tiên phát với lưu lượng TIMI tiền PCA bằng 0

6

Đối tượng phải có khả năng nhận thức và sẵn sàng ký vào mẫu “chấp thuận sau khi được giải thích” (Informed consent) Bảng 2. Bảng liệt kê tiêu chí loại trừ đối tượng nghiên cứu

Tiêu chí loại trừ 1

Tiền sử có suy thận hoặc suy gan

2

Tiền sử mắc bệnh sỏi thận

3

Tiền sử suy tim (Hiệp hội Tim mạch New York III, IV)

4

Sốc tim

5

Lưu lượng TIMI sau tiến hành PCA tiên phát ở mức 0, 1 hoặc 2

6

Bất kỳ bệnh mắc kèm nghiêm trọng nào kéo theo tuổi thọ < 6 tháng

7

Hiện tại có tham gia vào bất kỳ chương trình nghiên cứu lâm sàng khác

8

Mang thai

9

Thiếu glucose 6-phosphate dehydrogenase

15

Lựa chọn bệnh nhân Các bệnh nhân sẽ được chọn lựa từ những người được đưa vào khoa cấp cứu của cả hai bệnh viện lâm sàng tham gia trong nghiên cứu bởi một thành viên của nhóm nghiên cứu. Những bệnh nhân được chẩn đoán mắc AMI sẽ được mời tham gia nghiên cứu này.

Biên bản đồng ý sẽ được lấy từ những bệnh nhân phù hợp hoặc người đại diện của họ bởi một trong những điều tra viên hoặc một nghiên cứu viên phụ được ủy quyền tại mỗi địa điểm. Một thành viên của nhóm nghiên cứu sẽ trả lời tất cả các câu hỏi liên quan đến nghiên cứu và rủi ro của việc tiến hành thủ thuật trước khi bệnh nhân ký vào mẫu “chấp thuận sau khi được giải thích”.

Cỡ mẫu Có xét đến các trường hợp mà tổn thương tái tưới máu chịu trách nhiệm gây ra lên đến 50% kích thước vùng nhồi máu, hiệu quả can thiệp tối thiểu được coi là đạt được sự cải thiện tương đối lên đến 25% kích thước vùng nhồi máu. Các nghiên cứu tương tự dùng cùng phương pháp đã cung cấp độ chính xác của các phép đo là giá trị phương sai. Cỡ mẫu được tính dựa vào công thức sau [76]: n = 2(ZS + ZP)2 x S2 / (MA - MB)2 Trong đó: n là cỡ mẫu cho mỗi nhóm, “ZS” tương ứng với mức ý nghĩa (5%), “ZP” đại diện cho mức hiệu lực (80%), “MA” là giá trị trung bình của nhóm được dùng vitamin, MB là giá trị trung bình của nhóm giả dược (đối chứng) và S là phương sai của phương pháp CMR để đánh giá IS. Mất 10% bệnh nhân đã được xem xét nhằm mục đích tính toán. Cách tính toán này đưa ra kích thước mẫu là 66 bệnh nhân cho mỗi nhóm (giả dược và thử). Cỡ mẫu này phù hợp với quần thể bệnh nhân đang được điều trị bằng PCA tại Khoa Tim mạch, Bệnh viện Lâm sàng Đại học Chile và Trung tâm Tim mạch, Bệnh viện Lâm sàng San Borja Arriarán trong thời gian ước tính (3 năm).

Ngẫu nhiên hóa và theo dõi Bệnh nhân sẽ được phân chia ngẫu nhiên vào một trong hai nhóm.

Trình tự phân bổ sẽ được tập trung tạo, lưu trữ và được xác lập bằng cách

16

sử dụng phần mềm ngẫu nhiên hóa trực tuyến (http://www.randomization.com) trong các khối hoán vị ngẫu nhiên, mỗi khối bao gồm một hộp chứa sáu bộ KIT điều trị được phân bổ vào giả dược hoặc bổ sung vitamin, tỷ lệ 1: 1 cho mỗi trung tâm tham gia nghiên cứu.

Sự phân phối ngẫu nhiên được tạo ra nhờ sự can thiệp của kỹ thuật viên chịu trách nhiệm xác định phương án điều trị cho những bệnh nhân đã tuyển dụng, theo trình tự đã thiết lập thông qua phương pháp ngẫu nhiên đã nêu trước đó. Những lý do cho sự tổn thất và loại bỏ sau khi ngẫu nhiên hóa cũng được chuẩn bị sẵn.

Cả người tham gia và nhà cung cấp dịch vụ chăm sóc cũng như những điều tra viên đều không biết về sự phân phối các phương án điều trị. Các biến cố bất lợi, tác động ngoài ý muốn và các vấn đề về chuyên môn đều được ghi chép lại.

Can thiệp Tất cả bệnh nhân sẽ được yêu cầu ký giấy “chấp thuận sau khi được giải thích” trước khi bắt đầu nghiên cứu. Đối với những bệnh nhân được chỉ định điều trị bằng vitamin, sự can thiệp sẽ được tiến hành ngay khi bệnh nhân ký giấy đồng ý. Quy trình thử được bắt đầu bằng việc cho bệnh nhân uống một liều duy nhất vitamin E ở dạng α-tocopherol (800 IU), đồng thời truyền vitamin C (320 mM natri ascorbate) qua đường tĩnh mạch với tốc độ dòng 10 ml/phút trong giờ đầu tiên và tốc độ 3 ml/phút trong 2 giờ tiếp theo. Nong tạo hình mạch vành qua da sẽ được thực hiện sau khi bắt đầu truyền vitamin C khoảng 30 phút. Liều uống vitamin E (400 IU/ngày) và vitamin C (500 mg/12 giờ) sẽ được dùng cho bệnh nhân trong 84 ngày sau khi tiến hành PCA. Đối với bệnh nhân được chỉ định điều trị bằng giả dược, liều uống 800 IU vitamin E sẽ được thay thế bằng hai viên nang dầu thực vật (400 mg/ mỗi viên). Truyền tĩnh mạch vitamin C sẽ được thay thế bằng cùng một thể tích dung dịch natri clorua có cùng độ thẩm thấu như dịch truyền vitamin C dùng cho bệnh nhân được điều trị bằng vitamin. Liều vitamin E uống 400 IU sẽ được thay thế bằng dầu thực vật (400 mg) và liều vitamin C uống sẽ được thay thế bằng các vi hạt tinh bột trơ (500 mg). Các dạng bào chế của vitamin C và E không thể phân biệt với các giả dược tương ứng.

17

Sau khi đánh giá ban đầu, bệnh nhân sẽ đến phòng thí nghiệm thông tim. Dựa vào thủ tục chuẩn đối với một ca AMI, chụp Xquang động mạch sẽ được thực hiện để xác định động mạch liên quan đến nhồi máu. Vị trí và phạm vi của AMI (số động mạch có liên quan), tỷ lệ hẹp, lưu lượng TIMI, loại stent... sẽ được ghi lại. Ngay trước khi phẫu thuật động mạch vành để thông tắc hoàn toàn cho nó, một mẫu máu sẽ được rút ra từ tĩnh mạch khuỷu. Sau đó sẽ lấy thêm ba mẫu máu: ngay sau khi tái tưới máu thành công, vào lúc 6 đến 8 giờ sau khi kết thúc quá trình tái thông mạch và trước khi xuất viện.

Kích thước vùng nhồi máu, tiêu chí đánh giá cốt yếu cuối cùng của nghiên cứu, sẽ được đo bằng cộng hưởng từ tim (CMR) tại thời điểm ngày thứ 6 và 84 (12 tuần) sau khi tiến hành PCA. Cả việc định hướng can thiệp và dữ liệu thu được từ các phương pháp can thiệp này đều sẽ được xác định bởi hai cá nhân độc lập nhằm mục đích áp dụng hệ số kappa phù hợp. Sự tuân thủ việc dùng vitamin C và E hoặc giả dược bằng đường uống sẽ được đánh giá bằng cách liên lạc qua điện thoại hàng tuần bởi y tá chịu trách nhiệm chăm sóc bệnh nhân tham gia thử nghiệm.

Kết quả chính và phụ Kết quả chính là kích thước vùng nhồi máu, sẽ được đo bằng cộng hưởng từ tim (CMR) tại thời điểm ngày thứ 6 và 84 (12 tuần) sau khi tiến hành PCA. Cả việc định hướng can thiệp và dữ liệu thu được từ các phương pháp can thiệp này đều sẽ được xác định bởi hai cá nhân “bị mù” không phụ thuộc nhau nhằm mục đích áp dụng hệ số kappa phù hợp.

Do kết quả chính của chúng tôi hoàn toàn phụ thuộc vào sự phục hồi lưu lượng máu chất lượng cao đến vùng cơ tim bị thiếu máu cục bộ, chúng tôi đã quyết định rằng chỉ xét tiêu chí tái tưới máu thành công ở những bệnh nhân có lưu lượng TIMI bắt đầu bằng 0 và lưu lượng TIMI bằng 3 khi hoàn thành xong thủ thuật, dựa theo những tiêu chuẩn khắt khe nhất trong y văn [77,78,79]. Các kết quả phụ sẽ là những chỉ báo sinh học (biomarker) của tổn thương cơ tim; các biomarker liên quan đến stress oxy hóa, sự viêm; và phân suất tống máu.

1. Phân suất tống máu: được đo bằng cộng hưởng từ tim (CMR) vào ngày thứ 6 và 84 (12 tuần) sau PCA. Cả việc định hướng can thiệp và dữ

18

liệu thu được từ các phương pháp can thiệp này đều sẽ được xác định bởi hai cá nhân “bị mù” không phụ thuộc nhau nhằm mục đích áp dụng hệ số kappa phù hợp.

2. Các biomarker liên quan đến stress oxy hóa sẽ được đo: Sự carbonyl hóa protein huyết tương Khả năng chống oxy hóa của huyết tương: Khả năng khử sắt của huyết tương (FRAP) Nồng độ vitamin C và E trong huyết tương Chỉ số Thiol: Tỷ lệ GSH/GSSG trong hồng cầu Peroxid hóa lipid: nồng độ F2-isoprostane và malondialdehyde trong huyết tương và hồng cầu.

3. Chỉ báo sinh học của sự viêm: Protein phản ứng C siêu nhạy (High-sensitivity C-reactive protein) Tính số lượng bạch cầu theo phương pháp chuẩn 4. Chỉ báo sinh học của tổn thương cơ tim: Troponin, CK và CK-MB sẽ được đo trong huyết tương bằng các phương pháp chuẩn.

Các chỉ báo sinh học liên quan đến viêm và oxy hóa cùng các chỉ báo sinh học của tổn thương cơ tim sẽ được xác định thông qua việc lấy máu tĩnh mạch khủy, tại thời điểm ghi danh (30 đến 60 phút trước PCA), ngay sau khi tái tưới máu thành công, vào lúc 6 đến 8 giờ sau khi tái thông mạch thành công xử lý và trước khi xuất viện, như đã mô tả ở trên. Các mẫu sẽ được cất trữ trong các ống nghiệm lấy mẫu được giữ lạnh có sẵn EDTA (nồng độ cuối cùng là 4 mM) và ly tâm ở mức 3,000 g trong 10 phút để tách huyết tương khỏi các yếu tố khác của máu. Sự tán huyết do nhược trương của tế bào hồng cầu sẽ xảy ra khi pha loãng với nước cất. Huyết tương và sản phẩm phân giải hồng cầu (red blood cell lysates) sẽ được lưu trữ ở -80°C cho đến khi thực hiện các phân tích sinh hóa.

Phương pháp phân tích số liệu Kết quả của các biến liên tục sẽ được mô tả bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Việc so sánh giữa các biến liên tục không ghép cặp này sẽ được thực hiện bằng cách sử dụng kiểm định T-test Student. Các biến phi tham số sẽ được mô tả bằng giá trị trung vị (khoảng tứ phân vị) và

19

được so sánh thông qua kiểm định tổng xếp hạng Wilcoxon. Sự khác biệt giữa các biến phân phối chuẩn sẽ được so sánh bằng T-test student kiểm định phương sai ANOVA. Sự khác biệt giữa các biến không phân phối chuẩn sẽ được so sánh bằng cách sử dụng kiểm định Mann-Whitney. Các biến định danh sẽ được biểu diễn dưới dạng số lượng và tỷ lệ (phần trăm).

Kiểm định Fisher Exact với xấp xỉ Katz sẽ được sử dụng để so sánh tần số xuất hiện của các biến cố bất lợi.

Sự định hướng can thiệp cũng như dữ liệu thu được về kích thước vùng nhồi máu, chức năng tâm thất bằng phương pháp chụp cộng hưởng tim sẽ được đánh giá bởi hai cá nhân độc lập với mục đích áp dụng hệ số kappa phù hợp. Trong số các hạn chế của việc sử dụng kích thước vùng nhồi máu như kết quả nghiên cứu, việc sử dụng kích thước vùng nhồi máu cuối cùng có nguy cơ thiếu cân bằng trên thực tế cơ tim có nguy cơ tai biến, tùy theo nhóm điều trị, khi so sánh giữa các vị trí AMI khác nhau, có thể có độ nhạy khác nhau với phương án trị liệu [80].

Ngoài ra, các nhóm có thể có thời gian tái tưới máu và các biến gây nhiễu khác, chúng sẽ quyết định kích thước vùng nhồi máu [81,82]. Tuy một số trở ngại có thể đã được giải quyết thông qua phân tầng hợp lý ở khâu đăng ký tham gia nghiên cứu, nhưng tùy chọn này đã bị loại bỏ, bởi nghiên cứu này có kích thước mẫu nhỏ. Chúng tôi đang xem xét phân tích dữ liệu trên mô hình hồi quy tuyến tính, các biến bị lặp được điều chỉnh lại, ví dụ như các biến được đề cập trước đó và các biến khác có trong tài liệu hiện tại [83]. P <0,05 sẽ được coi là có ý nghĩa thống kê. Kết quả sẽ được phân tích bằng cách sử dụng phần mềm Stata phiên bản 8.0, Microsoft Excel và Graphpad Prism 4.0.

Phê duyệt đạo đức của thử nghiệm lâm sàng Quy trình nghiên cứu đã được phê duyệt bởi các ủy ban đạo đức, bao gồm: Khoa Y của Đại học Chile (Chứng nhận phê duyệt số 060-2011; ngày 19 tháng 7 năm 2011), Bệnh viện lâm sàng Đại học Chile (Chứng nhận phê duyệt số 53; 27 tháng 7 năm 2011), Bệnh viện lâm sàng San Borja Arriarán (Giấy chứng nhận phê duyệt số 468-13; ngày 18 tháng 7 năm 2013) và cũng bởi ủy ban đạo đức của Quỹ phát triển khoa học, công nghệ và đổi mới (FONDECYT) (Giấy chứng nhận phê duyệt G2-G3/590; ngày 24

20

tháng 5 năm 2012), tổ chức đó đã phê duyệt khoản tài trợ của chính phủ cho thử nghiệm lâm sàng này; tất cả đều tuân theo Tuyên bố Helsinki của Hiệp hội Y khoa Thế giới (2000).

Quản lý trong quá trình thử nghiệm Bệnh nhân hoặc đại diện của họ sẽ được yêu cầu ký hai bản sao của giấy “chấp thuận sau khi được giải thích”. Bệnh nhân sẽ được cung cấp một bản sao của mẫu giấy chấp thuận này để giữ lại nhằm tham khảo, và cái còn lại sẽ được nộp vào hồ sơ nghiên cứu lưu tại cơ sở nghiên cứu. Các biểu mẫu dữ liệu sẽ được kiểm tra tính toàn vẹn và tập hợp thành biểu đồ tổng thể, sẽ được chuyển tới người chịu trách nhiệm thống kê. Bảo mật thông tin của bệnh nhân sẽ được duy trì ở mọi giai đoạn.

Bệnh nhân có thể rút khỏi thử nghiệm hoặc bắt đầu điều trị thử nghiệm bất cứ lúc nào. Bệnh nhân có thể được rút khỏi nghiên cứu theo quyết định của ủy ban đạo đức địa phương vì lý do an toàn. Tất cả các tác dụng phụ và tác dụng phụ nghiêm trọng sẽ được ghi lại trong suốt thời gian nằm viện và thông qua giao tiếp với bệnh nhân trong khi họ đang được thăm khám. Điều phối viên sẽ thường xuyên tiến hành các cuộc họp với thống kê viên, và điều tra viên trưởng sẽ được biết về tất cả tác dụng phụ và tác dụng phụ nghiêm trọng khi chúng xảy ra.

Bàn luận Do tính chất không thể đoán trước của AMI, việc lấy được hình ảnh cơ tim cơ bản của bệnh nhân là không khả thi; thử nghiệm này cũng không ghi nhận hình ảnh tim mạch của họ khi mới nhập viện và trước tiến hành PCA (lý do lại là vì tính khả thi), chúng tôi chỉ dựa vào việc thực hiện chụp CMR vào ngày thứ sáu sau AMI. Trong bối cảnh này, không thể phân biệt tổn thương tái tưới máu với tổn thương do thiếu máu cục bộ ở cùng một bệnh nhân, dựa trên một hình ảnh duy nhất tại ngày thứ 6 sau PCA. Chúng tôi đã tiến hành so sánh hình ảnh giữa các nhóm đó được chụp tại thời điểm ngày thứ 6 và 84, xét giá trị trung bình, nhóm dùng giả dược được xác định rằng có kích thước vùng nhồi máu lớn hơn so với nhóm được bổ sung vitamin. Bất kỳ sự giảm đáng kể nào về kích thước vùng nhồi máu trong

21

nhóm được bổ sung vitamin chỉ có thể được quy cho việc giảm tổn thương tái tưới máu, bởi vì trong thiếu máu cục bộ mạch vành hoàn toàn, ascorbate không thể xuất hiện ở sau đoạn động mạch bị tắc. Tuy nhiên, sẽ không thể xác định liệu kích thước nhồi máu giảm đáng kể có tương ứng với tổn thương tái tưới máu giảm toàn bộ hay một phần hay không.

Theo hiểu biết của chúng tôi, không có báo cáo được công bố nào về quần thể người có mức vitamin C cao ở bệnh nhân AMI trải qua thủ thuật PCA; do đó rất khó khăn để so sánh dữ liệu thu được với dữ liệu trong y văn. Ngoài ra, do đặc điểm của quần thể nghiên cứu, kết quả thử nghiệm không áp dụng cho bệnh nhân bị AMI lần 2, có điểm số AMI, phân độ Killip ở mức III hoặc IV, hoặc các điều kiện khác nằm trong các tiêu chí loại trừ. Vì nghiên cứu này đang được thực hiện chủ yếu trên người Chile nên việc áp dụng kết quả nghiên cứu cho các dân tộc khác là không đáng tin cậy.

Liên quan đến việc loại bỏ dữ liệu hoặc bệnh nhân trong quá trình nghiên cứu, bệnh nhân mắc chứng sợ bị giam giữ sẽ không thể tham gia phân tích bằng CMR. Hơn nữa, do tính chất lưu động của thử nghiệm, sự giảm một lượng nhỏ bệnh nhân có thể xảy ra giữa ngày thứ 6 CMR và ngày thứ 84 CMR. Với tính chất đa trung tâm của nghiên cứu, việc mất mẫu là có thể.

Theo hiểu biết của chúng tôi, chưa có thử nghiệm nào được thực hiện trước đây có sử dụng liều cao ascorbate để ngăn ngừa hoặc làm giảm tổn hại trên cơ tim do AMI gây ra. Các nghiên cứu dược động học về vitamin C ở người đã chỉ ra rằng việc tiêm truyền liều cao trong thời gian ngắn có thể đạt được nồng độ đỉnh có thể cao hơn 20 mM và không bao giờ dưới 10 mM trong ít nhất 3 giờ [84]. Liều cao vitamin C tiêm tĩnh mạch đã được báo cáo là khá an toàn, ngay cả khi tiêm truyền với tốc độ cao gấp 3 lần so với đề xuất ở đây [85]. Tuy nhiên, những bệnh nhân bị suy thận hoặc thiếu glucose 6-phosphate dehydrogenase, được biết có thể gặp các biến chứng khi tiêm tĩnh mạch vitamin C, sẽ được loại trừ khỏi thử nghiệm này. Dù vậy, có một nguy cơ về mặt lý thuyết là sự tăng tạo sỏi vì nồng độ cao vitamin C ở những bệnh nhân không hoặc có khai báo họ bị sỏi thận [85] .

Về các tác dụng phụ có thể có của vitamin E, dựa trên các thử nghiệm lâm sàng đánh giá hiệu quả việc bổ sung vitamin E ở những người tham gia

22

khỏe mạnh và bệnh nhân mắc các bệnh khác nhau, những bằng chứng dịch tễ học cho thấy việc bổ sung lâu dài vitamin E có xu hướng gây tăng nhẹ mọi nguyên nhân tỷ lệ tử vong (RR=1,03; khoảng tin cậy 95% từ 1,00 đến 1,05) không phụ thuộc vào liều và thời gian phơi nhiễm [86]. Tuy nhiên, khoảng tin cậy đó hầu như không có ý nghĩa, bởi vì cận dưới của khoảng tin cậy này là 1,00. Ngoài ra, do khi phân tích dữ liệu từ Cochrane, các nhà nghiên cứu đã loại trừ các thử nghiệm loại 3 (tertiary prevention trial), nghĩa là loại trừ các nghiên cứu ngẫu nhiên trong đó bổ sung chất chống oxy hóa đã được sử dụng để điều trị một bệnh cụ thể, chẳng hạn như các thử nghiệm liên quan đến bệnh nhân mắc bệnh cấp tính (không kể đến ung thư da không có u hắc sắc tố - nonmelanoma skin cancer), các kết luận của họ không áp dụng cho nghiên cứu của chúng tôi.

Về liều lượng, trước đây một phân tích tổng hợp đã báo cáo rằng liều cao những chất bổ sung (liều ≥400 IU/ngày) chỉ làm tăng tỷ lệ tử vong do mọi nguyên nhân bằng hoặc lớn hơn 1 năm [87]. Cụ thể trong các bệnh tim mạch, kết quả của hai phân tích tổng hợp được làm gần đây, nhằm đánh giá hiệu quả của việc bổ sung chất chống oxy hóa trên các bệnh lý này, cho thấy rằng không có tác dụng có hại [88,89], ngoại trừ duy nhất một thử nghiệm lâm sàng có kiểm soát [90]. Tuy nhiên, những kết quả đó không phù hợp với các thử nghiệm lâm sàng lớn có kiểm soát dài hạn khác có liên quan. Trong bất kỳ ca bệnh nào, nghiên cứu đó đã bổ sung các vitamin trong hơn một năm cho bệnh nhân với liều dùng gấp đôi liều mà chúng tôi sử dụng, nên không thể so sánh về liều lượng và thời gian với nghiên cứu của chúng tôi.

Với biện pháp mới này, bằng việc sử dụng các chất không độc và dễ kiếm, có thể cải thiện đáng kể kết quả lâm sàng của bệnh nhân AMI, nhờ việc làm giảm kích thước vùng nhồi máu, nên có thể không có khả năng dẫn đến suy yếu khả năng vận động hoặc suy giảm cả chất lượng cuộc sống và tuổi thọ của bệnh nhân.

Với tỷ lệ mắc AMI cao trên toàn thế giới và các chất không độc, dễ kiếm được sử dụng trong nghiên cứu, việc nhân rộng quy mô của thử nghiệm lâm sàng này trên toàn thế giới có thể trở nên khả thi đối với các tác giả của nghiên cứu.

23

Tình trạng của thử nghiệm Thử nghiệm PREVEC bắt đầu tuyển chọn người tham gia vào tháng 2 năm 2013. Bốn mươi ba bệnh nhân đã ghi danh cho đến nay (3 tháng 6 năm 2014). Thử nghiệm dự kiến kết thúc vào tháng 3 năm 2016.

Các từ viết tắt AMI: Nhồi máu cơ tim cấp CMR: cộng hưởng từ tim eNOS: enzym nitric oxide synthase nội mô IL-1β: interleukin-1β IL-6: interleukin-6 MDA: malondialdehyd MAPK: enzym protein kinase hoạt hóa mitogen NO: oxit nitric PCA: nong tạo hình mạch vành qua da ROS: các dạng oxy hoạt động SOD: superoxide dismutase STEMI: nhồi máu cơ tim có ST chênh lên TNF-α: yếu tố hoại tử khối u α.

Cạnh tranh lợi ích Các tác giả không báo cáo bất kỳ xung đột về lợi ích nào.

Những đóng góp của các tác giả RR là điều tra viên trưởng. RR, JCP, GD và CR đã đóng góp cho khái niệm và thiết kế nghiên cứu và xin tài trợ. JCP và JGG chịu trách nhiệm tuyển chọn bệnh nhân và thu thập dữ liệu tại Bệnh viện lâm sàng Đại học Chile. JG chịu trách nhiệm lấy mẫu bệnh nhân và thu thập dữ liệu lâm sàng tại Bệnh viện lâm sàng San Borja Arriarán. GD chịu trách nhiệm tiến hành can thiệp PCA tại Bệnh viện lâm sàng Đại học Chile. LL chịu trách nhiệm tiến hành can thiệp PCA tại Bệnh viện lâm sàng San Borja Arriarán. DH chịu trách nhiệm đánh giá các mẫu chỉ báo sinh học của stress oxy hóa. NV chịu trách nhiệm thu thập và đọc dữ liệu ở phòng thí nghiệm. DH và RR đã tạo ra bản phác thảo đầu tiên. DH, JGG và NV đã sửa đổi phác thảo bản

24

thảo đó. Tất cả các tác giả đã góp ý về bản nháp của bài viết và cùng chỉnh sửa để tạo ra phiên bản cuối cùng này.

Lời cảm ơn Bài báo này được Chính phủ Chile hỗ trợ thông qua Quỹ phát triển khoa học, công nghệ và đổi mới; FONDECYT 1120594.

Tài liệu tham khảo (như bài báo gốc) 1.2 Nhận xét cá nhân về chủ đề bắt buộc Gốc tự do, có tên tiếng Anh là free radical, đã được biết đến là nguyên nhân gây ra lão hóa và hàng loạt chứng bệnh như bệnh lý tim mạch (vữa xơ động mạch, tổn thương do tái tưới máu sau nhồi máu mạch vành...), bệnh lý nhãn khoa (thoái hóa võng mạc, đục thủy tinh thể...), bệnh đái tháo đường... Vai trò của gốc tự do trong các quá trình sinh hóa bình thường của cơ thể hoặc cơ chế gây bệnh của chúng đang dần dần được khám phá và làm rõ.

Trái ngược về tác động lên cơ thể sống với gốc tự do là các chất chống oxy hóa, các chất này giúp bảo vệ cơ thể, kết hợp với cơ chất oxy hóa để làm chậm sự oxy hóa của các cơ chất này. Ngày nay, có nhiều chất có tác dụng chống oxy hóa được phát hiện và nghiên cứu càng lúc càng sâu cả về cơ chế hoạt động, dược động học, hiệu quả tác dụng...

Dựa vào hiểu biết về cơ chế bệnh sinh liên quan đến gốc tự do, cũng như hiểu biết về việc sử dụng các chất có hoạt tính chống gốc tự giúp các nhà khoa học đưa ra những thử nghiệm lâm sàng nhằm tìm ra phương pháp phòng và điều trị các bệnh lý trên.

Qua bài báo về thử nghiệm lâm sàng PREVEC, chúng ta hiểu rõ hơn về một số vấn đề và có thể đưa ra những nhận xét như sau: - Cơ chế gây tổn thương trên tim do tái tưới máu sau thiếu máu cục bộ cơ tim ở bệnh nhân bị nhồi máu cơ tim cấp rất đa dạng, và cơ chế chủ yếu là do hậu quả của stress oxy hóa, tác hại của ROS, NOS và quá tải ion canxi nội bào...

25

- Sự an toàn khi sử dụng liều cao và cơ chế chống oxy hóa của Vitamin C và E đã đem đến tác dụng chống gốc tự do, chống lại stress oxy hóa của 2 vitamin này. Mối liên quan giữa liều dùng và tác dụng chống gốc tự do của vitamin C. - Tác dụng hiệp đồng chống gốc tự do của 2 vitamin C và E và mỗi vitamin thể hiện mạnh mẽ tác dụng của nó ở pha nước và dầu tương ứng - Vitamin chống oxy hóa C và E có làm giảm kích thước vùng nhồi máu ở bệnh nhân bị nhồi máu động mạch vành sau nhồi máu cơ tim cấp hay không.

- Việc tái tưới máu sau thiếu máu cục bộ xảy ra trong quá trình nong mạch vành làm tăng kích thước vùng nhồi máu cơ tim. Thử nghiệm PREVEC giúp minh chứng rõ hơn về lợi ích trong việc bảo vệ tim mạch của vitamin C liều cao kết hợp với vitamin E. So với những thử nghiệm lâm sàng đã tiến hành trước đây thì thử nghiệm này đã xác định được phương án điều trị phù hợp khi sử dụng liều cao vitamin C và E nhằm chống lại tổn thương do tái tưới máu trong quá trình phẫu thuật nong mạch vành.

- Sử dụng các chất không độc và dễ kiếm như vitamin C và E với liều hợp lý và trong thời gian phù hợp có thể cải thiện đáng kể kết quả lâm sàng của bệnh nhân AMI, giúp làm giảm đáng kể kích thước vùng nhồi máu, hạn chế biến chứng làm suy yếu khả năng vận động hoặc suy giảm chất lượng cuộc sống và tuổi thọ của bệnh nhân AMI sau PCA. - Trên toàn thế giới, tỷ lệ mắc AMI khá cao; các vitamin E, C vừa rẻ, vừa dễ kiếm, vừa an toàn; thử nghiệm PREVEC chỉ được tiến hành trên đa số bệnh nhân thuộc dân tộc Chi lê - kết quả của thử nghiệm có thể không có ý nghĩa trên những chủng tộc người khác. Do đó, nên nhân rộng quy mô của thử nghiệm lâm sàng này trên toàn thế giới để có thông tin đầy đủ hơn nữa.

- Thử nghiệm này chỉ tiến hành trên bệnh nhân có chỉ số lưu lương TIMI trước PCA bằng 0 và sau PCA là 3, loại bỏ các trường hợp có chỉ số lưu lượng TIMI sau PCA bằng 0,1,2 ; tiêu chí đánh giá chính để đánh giá hiệu quả của phương án bổ sung vitamin là kích thước vùng nhồi máu; và các tiêu chí loại trừ khi chọn đối tượng nghiên cứu và lọc bỏ dữ liệu khi

26

phân tích làm cho kết quả của nghiên cứu chỉ có giá trị đại diện cho hữu hạn trường hợp. Vì thế, việc nghiên cứu rộng và sâu hơn là cần thiết.

27

II. PHẦN CHỦ ĐỀ TỰ CHỌN 2.1 Bài dịch NHỮNG ẢNH HƯỞNG CỦA AXIT L-ASCORBIC VÀ ALPHATOCOPHEROL ĐẾN CÁC THÔNG SỐ SINH HÓA CỦA STRESS OXY HÓA GÂY RA KHI BƠI TRONG HUYẾT THANH CỦA CHUỘT LANG. 1

Marija Bursać-Mitrović, 2Dragan R. Milovanović, 1Radoslav Mitić, 3Danijela Jovanović, 2 Miroslav 4 2 Sovrlić, Perica Vasiljević, Jovica Tomović, *2Nedeljko Manojlović 1 Khoa Dược, Nhóm khoa Y dược, Đại học Kosovska Mitrovica, Serbia 2 Khoa Dược, Nhóm ngành Khoa học y học, Đại học Kragujevac, Kragujevac, Serbia, 3 Khoa Gây mê hồi sức, Trung tâm lâm sàng “Kragujevac”, Kragujevac, Serbia 4 Khoa Sinh học, Nhóm ngành Khoa học, Đại học Niš, Niš, Serbia, *

Email của tác giả tương ứng: mtnedeljko@yahoo.com

Tóm tắt Nền tảng của nghiên cứu Nghiên cứu này được tiến hành với mục đích để xác định ảnh hưởng của axit L-ascorbic và alpha-tocopherol cũng như hỗn hợp các vitamin này khi tập thể dục hoặc không trên cường độ peroxid hóa lipid, hoạt tính của xanthine oxidase, hoạt tính của hệ thống chống oxy hóa, nồng độ glutathione và hoạt tính của enzym catalase trong huyết thanh của chuột lang.

Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu Những phương pháp đo lường thực nghiệm về cường độ peroxid hóa lipid, hoạt động của xanthine oxidase, hoạt tính của hệ thống chống oxy hóa, nồng độ glutathione và hoạt tính của catalase được thực hiện trên huyết thanh của chuột lang. Trong khi thử nghiệm diễn ra, những con chuột được đeo vật nặng khiến nó bị kiệt sức và thử nghiệm sẽ kết thúc khi con vật chìm xuống nước lần thứ ba.

28

Kết quả của nghiên cứu Kết quả của nghiên cứu này đã chứng minh rằng ở chuột lang, hoạt động thể lực liên tục gây ra hiện tượng stress oxy hóa, bao gồm các hiện tượng tăng peroxid hóa lipid và tăng hoạt tính của xanthine oxidase trong huyết thanh của những động vật tham gia thí nghiệm. Trong khuôn khổ nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của axit Lascorbic và alpha-tocopherol thông qua đo ba dấu hiệu bảo vệ (protective marker) trong huyết thanh: tổng hoạt tính chống oxy hóa, hàm lượng glutathione và hoạt tính của catalase. Kết quả thu được cho thấy rằng các vitamin trên có ảnh hưởng đến các thông số sinh hóa đã đề cập ở trên, trong đó các kết quả đó chỉ ra tác dụng bảo vệ của các vitamin này đối với stress oxy hóa do bơi lội gây ra.

Kết luận Việc sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp axit L-ascorbic và alphatocopherol sẽ gây ra sự ức chế rõ ràng đối với các chất chỉ báo nêu trên, điều này giúp chỉ ra tầm quan trọng trong hoạt động chống oxy hóa của các vitamin đó. Dựa vào các kết quả nghiên cứu, kết luận được rút ra ở đây là khi có tập thể dục hoặc không, phương pháp điều trị bằng hỗn hợp các vitamin trên đã cho thấy hiệu quả rõ ràng về mặt hiệp đồng tác dụng.

Từ khóa: Axit L-ascorbic, alpha-tocopherol, chuột lang, stress oxy hóa, các thông số sinh hóa Giới thiệu / Đặt vấn đề Thuật ngữ stress oxy hóa lần đầu tiên được định nghĩa vào năm 1985, là “sự rối loạn của trạng thái cân bằng có lợi vốn có giữa tác nhân tiền oxy hóa (pro-oxydant) và các tác nhân chống oxy hóa” (Sies, 1985; Sies at al., 1985). Dean Jones đã đề xuất rằng thuật ngữ Stress oxy hóa nên được định nghĩa lại là “một sự gián đoạn của việc truyền tín hiệu và kiểm soát quá trình oxi hóa khử” và định nghĩa này đang được công nhận rộng rãi (Jones, 2006). Trên thực tế, ở điều kiện sinh lý bình thường (nguồn nội sinh) hoặc ở dưới một vài tác động bất lợi (nguồn ngoại sinh), trong các hệ

29

thống sinh học các gốc tự do liên tục được tạo ra, ví dụ như các ion, phân tử và các hợp chất có electron tự do, và chúng có khả năng phản ứng cao với các phân tử sinh học (Halliwell và Gutteridge, 1999). Các sản phẩm oxy hóa được tạo ra do phản ứng của gốc tự do với các phân tử lipid, protein hoặc DNA, (Halliwell và Whiteman, 2004). Trong các tế bào có sẵn những hệ thống enzyme và phi enzym chống oxy hóa (enzymatic and nonenzymatic antioxidant system) để loại bỏ các gốc tự do và giúp duy trì trạng thái cân bằng oxy hóa khử ở nội môi (Valko et al., 2007). Trong đánh giá mức độ stress oxy hóa, thay vì đo các gốc tự do (gốc tự do có thời gian bán hủy rất ngắn), chúng ta có thể dựa vào đo lường các sản phẩm sinh ra do tổn thương sinh học (biological damage) cũng như đo lường khả năng chống oxy hóa (các enzyme và phi enzym). Vitamin C và Vitamin E đóng vai trò then chốt trong việc bảo vệ tế bào chống lại các dạng oxy hoạt động (Halliwell và Whiteman, 2004).

Vitamin E (alpha-tocopherol), một tác nhân có trọng lượng phân tử thấp, là chất chống oxy hóa phá vỡ chuỗi tan dầu (chain-breaking lipidsoluble antioxidant) chủ chốt trong màng sinh học và nó có khả năng làm sạch các dạng oxy hoạt động (Janero, 1991; Packer, 1991). Axit ascoricic (vitamin C) được biết là có thể tồn tại ở 2 dạng, là dạng khử (axit Lascorbic và dạng L-ascorbate bị ion hóa) và dạng oxy hóa (axit Ldehydroascorbic và dạng L-dehydroascorbate bị ion hóa). Axit ascoricic là hợp chất thân nước và hoạt động tốt hơn trong môi trường nước. Ở pH sinh lý, anion ascorbate là dạng tồn tại chiếm ưu thế (pKa của axit ascorbic là 4,25) (Powers và Jackson, 2008; Yu, 1994). Hóa tính nổi bật nhất của axit ascorbic là nó có khả năng hoạt động như một chất khử, đặc điểm này có liên quan đến việc giải độc hàng loạt các gốc oxy tự do khác nhau trong in vivo. Trong điều kiện hiếu khí, so với môi trường axit, sự biến đổi axit ascorbic thành axit dehydroascorbic trở nên thuận lợi hơn trong môi trường có giá trị pH cao (Carr và Frei, 1999). Cơ chế của tác dụng chống oxy hóa của vitamin C có liên quan đến việc chuyển axit ascorbic thành dạng oxy hóa của nó (axit dehydroascorbic), bằng cách nhường 2 điện tử cho các dạng oxy hoạt động (Fischer et al., 2004). Axit ascoricic có thể trực tiếp loại bỏ các gốc lipid hydroperoxide, superoxide và hydroxyl, hoặc tác dụng gián tiếp thông qua việc đóng vai trò quan trọng trong quá trình hoàn

30

nguyên tocopherol, quá trình này dẫn đến việc chuyển axit ascorbic thành gốc semiascorbyl (Packer tại al., 1979). Một số tác giả đã chỉ ra ảnh hưởng của tập thể dục lên hiện tượng stress oxy hóa và những thay đổi của giấc ngủ (Esteves et al., 2014).

Mục đích của nghiên cứu này là nghiên cứu tác động của axit Lascorbic và alpha-tocopherol trên một số thông số sinh hóa của stress oxy hóa trong huyết thanh của chuột lang. Vì không có nghiên cứu nào trước đây, chúng tôi nghiên cứu về tác dụng của các vitamin đó trên mô hình thực nghiệm được áp dụng trong nghiên cứu của chúng tôi. Chúng tôi đưa ra giả thiết rằng kết hợp hai loại vitamin sẽ đạt được giúp đạt hiệu quả hiệp đồng đáng kể về mặt bảo vệ oxy hóa.

Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu Hóa chất Tất cả các hóa chất được mua từ công ty Sigma-Aldrich, Đức. Các chất chuẩn dùng trong phân tích là vitamin C (axit L-ascorbic, loại ống 1000 mg) và vitamin E ((+/-)-alpha-tocopherol, loại ống 100 mg) đã được sử dụng. Động vật thí nghiệm Bốn mươi con chuột lang đã được sử dụng trong thí nghiệm. Những con vật này được lấy từ VMA - Trung tâm chăn nuôi và nhân giống động vật thí nghiệm, Belgrade, Serbia). Khi bắt đầu thí nghiệm, cả chuột lang đực và cái có cân nặng là 450 g ± 50 g và được nuôi trong điều kiện môi trường ổn định không đổi (nhiệt độ 25°C ± 2°C; độ ẩm 60 ± 1,5% với chu kỳ chiếu sáng 12 giờ, trong 10 ngày trước khi thí ngiệm bắt đầu cũng như duy trì trong suốt quá trình làm thí nghiệm). Tất cả các động vật đều được chăm sóc theo các tiêu chí đã nêu trong “Hướng dẫn chăm sóc và sử dụng động vật thí nghiệm” do Viện hàn lâm khoa học quốc gia biên soạn và do Viện sức khỏe quốc gia xuất bản. Các quy định đạo đức được tuân thủ theo hướng dẫn của quốc gia và hiệp hội về bảo vệ phúc lợi động vật trong các thí nghiệm.

31

Thiết kế của thử nghiệm Những động vật thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 8 nhóm, mối nhóm thí nghiệm có 5 con. Nhóm thử nghiệm đầu tiên là nhóm đối chứng.

Nhóm thử nghiệm thứ hai được cho tham gia bài luyện tập thể lực quá mức - bơi đến kiệt sức. Nhóm thử nghiệm thứ ba được cho dùng axit L-ascorbic (Vitamin C) với liều 20 mg/kg qua đường tiêm màng bụng (ip), và không tham gia bài kiểm tra quá sức. Các hóa chất dùng trong thử nghiệm (alphatocopherol và axit L-ascorbic) được tiêm vào màng bụng ở một trong các góc phần tư bụng dưới của chuột lang, chú ý tránh tổn thương bàng quang, gan hoặc nội tạng. Nhóm thử nghiệm thứ tư được tham gia bài kiểm tra thể chất gắng sức và bổ sung axit L-ascorbic (20 mg/kg). Nhóm thứ năm được dùng alpha-tocopherol (vitamin E) với liều 25 mg/kg qua đường tiêm màng bụng (ip), và không tham gia bài kiểm tra stress về thể chất. Nhóm thử nghiệm nhóm thứ sáu phải tham gia bài kiểm tra thể chất gắng sức và được bổ sung alpha-tocopherol (25 mg/kg). Nhóm thứ bảy được tiêm màng bụng hỗn hợp 2 vitamin (20 mg/kg axit L-ascorbic và 25 mg/kg alphatocopherol), và không tham gia bài kiểm tra thể chất. Nhóm thử nghiệm thứ tám được làm bài tập thể chất quá sức và bổ sung hỗn hợp 2 vitamin (20 mg/kg axit L-ascorbic và 25 mg/kg alpha-tocopherol). Bài kiểm tra quá sức được tiến hành bằng cách để chuột bơi đến kiệt sức. Các động vật thí nghiệm được cho bơi xung quanh bể nước sâu 60 cm, với trung bình lượng nước trong bể khoảng 20 dm3, nhiệt độ 32°C. Các con vật phải tham gia thử nghiệm đến khi bị kiệt sức và thử nghiệm đã sẽ chấm dứt khi con vật chìm xuống nước lần thứ ba. Đánh giá các chỉ tiêu sinh hóa Mức độ peroxid hóa lipid (LPx) được xác định theo Buege và Aust (1988), hoạt độ của xanthine oxydase (XOD) theo Bergmayer (1976), hoạt tính của catalase (CAT) theo Beers và Sizer (1952), hàm lượng glutathione (GSH) theo Beuthler et al. (1983) và tình trạng chống oxy hóa toàn phần (TAS) theo Miller et al. (1993). Các xét nghiệm đánh giá các thông số nêu trên được thực hiện mẫu là huyết thanh của chuột lang. Kết quả phân tích các chỉ tiêu sinh hóa trên được biểu diễn dưới dạng các giá trị trung bình ±

32

độ lệch chuẩn. Sự khác biệt giữa nhóm đối chứng và các nhóm thử được phân tích bằng sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy p ≤ 0,005.

Phương pháp thống kê phân tích Kết quả thu được từ 5 lần lặp lại của mỗi thí nghiệm (n = 5). Các giá trị mô tả được thể hiện qua giá trị trung bình, độ lệch chuẩn (SD), giá trị nhỏ nhất (min) và giá trị lớn (max), sai số chuẩn (SE) và hệ số biến thiên (CV%). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm trong thử nghiệm được kiểm định hai phía bằng cách sử dụng phương pháp kiểm định Student t-test hoặc kiểm định Mann-Whitney tùy thuộc vào dạng phân phối của dữ liệu (chuẩn hoặc phi tham số). SPSS phiên bản 19.0 được sử dụng để phân tích dữ liệu. Xác suất có ý nghĩa thống kê được thiết lập ở mức p ≤ 0,05.

Kết quả và bàn luận Kết quả của sự ảnh hưởng của axit L-ascorbic và alpha-tocopherol và hỗn hợp của các vitamin này khi có hoặc không có tiếp xúc với stress về thể chất lên cường độ peroxid hóa lipid, hoạt tính của xanthine oxidase, hoạt tính của toàn bộ hệ thống chống oxy hóa, hàm lượng glutathione và hoạt tính của catalase ở chuột lang được mô tả trong các bảng 1-5. Các phép thử để đo lường các thông số nêu trên được thực hiện trên huyết thanh của chuột lang.

Trên chuột lang, bài thử nghiệm sức bền đã làm tăng đáng kể cường độ peroxid hóa lipid (LPx) trong huyết thanh của chúng (Bảng 1). Dùng 1 liều duy nhất axit L-ascorbic hoặc alpha-tocopherol làm giảm đáng kể hoạt tính của enzym tiền oxi hóa (pro-oxidative enzyme) trong cả nhóm động vật thí nghiệm đối chứng và các nhóm tham gia thử nghiệm sức bền.

Trên chuột lang, bài thử nghiệm sức bền đã làm tăng thêm đáng kể hoạt tính của xanthine oxidase (XOD) trong huyết thanh của chúng (Bảng 2). Dùng 1 liều duy nhất axit L-ascorbic hoặc alpha-tocopherol làm giảm đáng kể sự tăng hoạt tính XOD này trong cả nhóm đối chứng và các nhóm tham gia thử nghiệm sức bền của động vật thí nghiệm. Ngoài ra, việc dùng kết hợp các vitamin cho thấy hiệu quả hiệp đồng rõ ràng.

33

Trên chuột lang, bài thử nghiệm sức bền làm tăng nhẹ hoạt tính của toàn bộ hệ thống các chất chống oxy hóa (TAS) trong huyết thanh của chúng nhưng tác dụng này không có ý nghĩa thống kê (Bảng 3). Việc sử dụng một lần duy nhất axit L-ascorbic hoặc alpha-tocopherol làm giảm nhẹ hoạt tính của TAS trên cả nhóm động vật thí nghiệm đối chứng và nhóm tập thể dục, nhưng hiệu quả của tác dụng này không đáng kể.

Trên chuột lang, bài thử nghiệm sức bền làm tăng rất ít hàm lượng glutathione (GSH) trong huyết thanh của chúng và kết quả này không có ý nghĩa thống kê (Bảng 4). Dùng một lần duy nhất axit L-ascorbic và alphatocopherol làm giảm nhẹ sự tăng hoạt tính đó khi so sánh với nhóm đối chứng, nhưng tác dụng làm giảm nhẹ này là không đáng kể. Thêm vào đó, hỗn hợp các vitamin này làm thay đổi hàm lượng glutathione và dao động mà chúng gây ra không khác biệt đáng kể khi so sánh với cả nhóm đối chứng và các nhóm tập thể dục.

Bài tập sức bền đã làm tăng đáng kể hoạt tính của enzym catalase (CAT) trong huyết thanh của chuột lang (Bảng 5). So với nhóm đối chứng, việc sử dụng liều duy nhất axit L-ascorbic hoặc alpha-tocopherol đều làm tăng hoạt tính của catalase, nhưng hiệu quả này chỉ có ý nghĩa thống kê trong trường hợp sử dụng axit L-ascorbic. Việc dùng đồng thời axit Lascorbic và alpha-tocopherol có tác dụng lên hoạt tính của CAT kém hơn so với khi dùng riêng, và so với nhóm đối chứng thì sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê. So với nhóm tham gia bài thử sức bền, sử dụng liều duy nhất axit L-ascorbic hoặc alpha-tocopherol làm giảm hoạt tính catalase trong huyết thanh, và nếu dùng kết hợp 2 vitamin cũng làm tăng nó, nhưng sự khác biệt có ý nghĩa thống kê chỉ xảy ra trong trường hợp sử dụng axit L-ascorbic.

Từ các kết quả nghiên cứu, chúng tôi thấy rằng trên chuột lang, bài tập sức bền gây ra stress oxy hóa do tăng peroxid hóa lipid và hoạt tính của xanthine oxidase trong huyết thanh của động vật thí nghiệm. Chế độ sử dụng đơn độc hoặc kết hợp axit L-ascorbic và alpha-tocopherol gây ra tác dụng ức chế đáng kể cả hai thông số chỉ báo trên, điều này chứng tỏ tác dụng quan trọng trong chống oxy hóa của vitamin.

Tập thể dục gây ra bùng nổ trao đổi chất (metabolic stress) thông qua việc tạo ra lượng lớn các dạng oxy hoạt động (Mason et al., 2014). Các

34

dạng oxy hoạt động liên tục phản ứng với các phân tử lipid của tế bào làm sản sinh ra các gốc peroxid lipid bên trong các tế bào (Zsolt et al., 2013).

Vitamin C và vitamin E là một trong những chất chống oxy hóa được nghiên cứu rộng rãi nhất. Cả vitamin E và vitamin C đều có khả năng phản ứng và dọn dẹp hàng loạt các dạng oxy hoạt động, giúp bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa gây ra bởi những tác nhân khác nhau (Janero, 1991; Packer, 1991; Fischer et al., 2004; Wu et al., 2014). Cuối cùng, vitamin C đã được mô tả là chất có khả năng tái tạo vitamin E (Krishnamurthy và Wadhwani, 2012). Tất cả những điều này giúp giải thích kết quả nghiên cứu của chúng tôi về tác dụng hiệp đồng của vitamin E và vitamin C trong việc làm giảm peroxid hóa lipid và nó góp phần chứng minh giả thuyết của chúng tôi về tính hữu ích của việc kết hợp 2 vitamin này nhằm mục đích bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do stress oxy hóa vì tập thể dục.

Trong nghiên cứu này, việc sử dụng vitamin E và vitamin C đã ngăn chặn hoạt động của xanthine oxidase, một loại enzyme là tác nhân tiền oxy hóa (Pro-oxidant) tự nhiên. Vitamin E có cường độ tác dụng lớn hơn và hỗn hợp 2 vitamin cho tác dụng ức chế tốt nhất. Trước đây, những nhà nghiên cứu khác đã chứng minh tác dụng ức chế của cả vitamin E và vitamin C (dùng liều thấp hơn so với nghiên cứu này) đối với hoạt tính của xanthine oxidase, điều này này giúp củng cố cho kết quả nghiên cứu của chúng tôi (Mohd et al. 2012, Dwenger et al., 1992).

Theo chúng tôi biết, trước đây không có nghiên cứu nào về các tác động của việc kết hợp sử dụng axit L-ascorbic và alpha-tocopherol có thiết kế thí nghiệm tương tự trên chuột lang hoặc trên những loài động vật có vú khác, điều này làm cho kết quả nghiên cứu được công bố của chúng tôi có tính mới. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu cơ chế có thể có của hoạt tính chống oxy hóa của axit L-ascorbic và alpha-tocopherol thông qua đánh giá ba dấu hiệu bảo vệ (protective marker) trong mẫu huyết thanh lấy từ những động vật thí nghiệm: tổng hoạt tính chống oxy hóa (total antioxidant activity), hàm lượng glutathione và hoạt tính của catalase. Vấn đề chính được khám phá ra là bài tập thử sức bền và axit L-ascorbic gây ra sự gia tăng hoạt tính của catalase, nhưng alpha tocopherol không có tác dụng này. Sự suy giảm đáng kể về dung lượng chống oxy hóa toàn phần (total antioxidant capacity) và hoạt tính của glutathione trong nghiên cứu

35

của chúng tôi có thể, ít nhất một phần, được giải thích bằng các vấn đề phương pháp luận. Nhiều nghiên cứu viên đã báo cáo rằng các xét nghiệm khác nhau được sử dụng để phát hiện những dấu hiệu chống oxy hóa đó (bao gồm những xét nghiệm được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu) có thể có hiệu suất chẩn đoán khác nhau (Cighetti et al. 2015, Güngor et al., 2011). Vì vậy, chúng tôi không thể loại trừ khả năng các xét nghiệm được làm trong nghiên cứu của chúng tôi cho hai phân tích này đã cho những kết quả âm tính giả, đặc biệt trong trường hợp sự thay đổi đó có cường độ nhỏ.

Axit L-ascorbic và alpha-tocopherol gây kích hoạt các phân tử chống stress oxy hóa khác nhau, những phân tử này đóng vai trò trong việc chống lại hiệu ứng stress oxy hóa do bơi gây ra. Gần đây có một nghiên cứu theo dõi một vài chỉ báo về mặt sinh hóa và phân tử liên quan đến tổn thương do oxy hóa và sự bảo vệ chống oxy hóa đã báo cáo về tác dụng qua lại giữa hỗn hợp vitamin C và vitamin E, tác nhân tiền oxy hóa (pro-oxidant) và chất chống oxy hóa, tùy thuộc vào liều và điều kiện thí nghiệm (de Oliveira et al., 2013). Như vậy, các nghiên cứu trong tương lai cần áp dụng các thiết kế nghiên cứu chi tiết và tập trung hơn, sử dụng đa dạng xét nghiệm hơn với các điều kiện thử nghiệm khác nhau để làm rõ cơ chế hoạt động chính xác của vitamin C và vitamin E đối với phản ứng stress oxy hóa gây bởi bài tập thử sức bền.

Bảng 1: Cường độ peroxid hóa lipid (LPx) trong huyết thanh của chuột lang thí nghiệm ở các nhóm nghiên cứu khác nhau

C = đối chứng; E = thử sức bền; A = L-ascorbic acid; T = alpha-tocopherol; *so sánh với nhóm đối chứng; **so sánh với nhóm thử sức bền Cường độ LPx được biểu thị bằng số nmol malondialdehyde/mg protein

36

Bảng 2: Hoạt tính của xanthine oxidase (XOD) trong huyết thanh của chuột lang thí nghiệm ở các nhóm nghiên cứu khác nhau

C = đối chứng; E = thử sức bền; A = axit L-ascorbic; T = alpha-tocopherol; *so sánh với nhóm đối chứng; **so sánh với nhóm thử sức bền Hàm lượng XOD được biểu thị bằng số nmol XOD /mg protein.phút-1

Bảng 3: Tình trạng chống oxy hóa toàn phần (total antioxidant status TAS) trong huyết thanh của chuột lang thí nghiệm ở các nhóm nghiên cứu khác nhau

C = đối chứng; E = thử sức bền; A = axit L-ascorbic; T = alpha-tocopherol; *so sánh với nhóm đối chứng; **so sánh với nhóm thử sức bền Hàm lượng TAS được biểu thị bằng số nmol TAS /l

Bảng 4: Hàm lượng glutathione (GSH) trong huyết thanh của chuột lang thí nghiệm ở các nhóm nghiên cứu khác nhau

C = đối chứng; E = thử sức bền; A = axit L-ascorbic; T = alpha-tocopherol; *so sánh với nhóm đối chứng; **so sánh với nhóm thử sức bền Hàm lượng GSH được biểu thị bằng số nmol GSH/mg protein

37

Bảng 5: Hoạt tính catalase (CAT) trong huyết thanh của chuột lang thí nghiệm ở các nhóm nghiên cứu khác nhau

C = đối chứng; E = thử sức bền; A = axit L-ascorbic; T = alpha-tocopherol; *so sánh với nhóm đối chứng; **so sánh với nhóm thử sức bền Hàm lượng CAT được biểu thị bằng số nmol CAT/mg protein.phút-1

Kết luận Nghiên cứu này là về ảnh hưởng của axit L-ascorbic và alphatocopherol cũng như sự kết hợp của các vitamin này khi có hoặc không tiếp xúc với ảnh hưởng tập thể dục đến sự thay đổi của các thông số sinh hóa quan trọng trong huyết thanh của chuột lang. Các phương pháp sử dụng hỗn hợp các vitamin có tác dụng bảo vệ đối với stress oxy hóa do bơi bắt buộc và hiệu quả hiệp đồng tác dụng là rõ ràng.

Tài liệu tham khảo (như bài báo gốc) 2.2 Nhận xét cá nhân về chủ đề tự chọn Từ thông tin được đưa ra trong bài báo được công bố của nghiên cứu trên có thể rút ra một số vấn đề sau: - Gốc tự do (GTD) là những phân tử hay những mảnh phân tử chứa một hoặc electron độc thân. Các electron độc thân này làm cho các GTD có khả năng phản ứng đáng kể. Các GTD là sản phẩm từ quá trình chuyển hóa bình thường của tế bào với vai trò vừa có lợi vừa có hại. Chúng có lợi cho cơ thể khi giúp tham gia một số quá trình sinh lý bình thường như truyền tín hiệu trong tế bào, phân hủy chất độc... Nhưng khi bị quá tải các gốc tự do thì sẽ tạo ra hiện tượng stress oxy hóa có hại cho cơ thể. GTD có thể là sản phẩm phụ của các phản ứng chuyển hóa bình thường và cơ bản trong tế

38

bào (nguồn nội sinh), hoặc từ nguồn ngoại sinh như tiếp xúc với khói thuốc lá, chất ô nhiễm môi trường, phóng xạ ion hóa, nhiễm vi khuẩn, nấm, hoặc virus... Trong các tế bào có sẵn những hệ thống các tác nhân chống oxy hóa (các enzym hoặc phức hợp không phải enzym) giúp loại bỏ các gốc tự do và duy trì trạng thái cân bằng oxy hóa khử.

- Stress oxy hóa là trạng thái bùng nổ của các GTD, xảy ra khi có sự sản sinh quá mức các GTD hoặc do sự suy giảm của các chất chống oxy hóa trong hệ thống sinh học dẫn đến mất cân bằng oxy hóa khử trong tế bào. Hậu quả của sự dư thừa các GTD là dẫn đến sự phá hủy hoặc ức chế chức năng bình thường các lipid, protein, hoặc DNA của tế bào. Trong đánh giá mức độ stress oxy hóa, có thể dựa vào việc đánh giá về hoạt tính của hệ các chất chống oxy hóa. Thêm vào đó, các gốc tự do có thời gian bán hủy rất ngắn nên khi muốn đo lường mức độ stress oxy hóa, chúng ta có thể đo lường các sản phẩm sinh ra do sự phá hủy lipid, protein, hoặc DNA của tế bào.

- Tập thể dục quá mức gây ra bùng nổ trao đổi chất do tạo ra lượng lớn các dạng oxy hoạt động. Các dạng oxy hoạt động phản ứng với các phân tử lipid của tế bào làm sản sinh ra các gốc peroxid lipid. Và ở chuột lang, hoạt động thể lực liên tục đến kiệt sức sẽ gây ra hiện tượng stress oxy hóa: tăng peroxid hóa lipid và tăng hoạt tính của xanthine oxidase trong huyết thanh.

- Vitamin C và Vitamin E đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào chống lại các dạng oxy hoạt động. Cơ chế của tác dụng này của vitamin C có liên quan đến việc chuyển axit ascorbic thành dạng oxy hóa của nó bằng cách nhường 2 điện tử cho các dạng oxy hoạt động. Axit ascoricic còn có thể tác dụng gián tiếp thông qua việc hoàn nguyên tocopherol.

- Chế độ sử dụng đơn độc hoặc kết hợp axit L-ascorbic và alphatocopherol gây ra tác dụng ức chế đáng kể sự tăng mức độ peroxid hóa lipid và hoạt tính của xanthine oxidase trong huyết thanh chuột lang, điều này chứng tỏ tác dụng quan trọng trong chống oxy hóa của các vitamin.

- Hai vitamin E và vitamin C có tác dụng hiệp đồng trong việc làm giảm peroxid hóa lipid và hiệu quả trong việc kết hợp 2 vitamin này nhằm

39

mục đích bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do stress oxy hóa vì tập thể dục quá mức là có bằng chứng rõ ràng.

- Nghiên cứu này, cho đến thời điểm công bố, là nghiên cứu có thiết kế khác biệt so với những nghiên cứu trước đây, điều này chứng tỏ tính mới của nghiên cứu. Tuy nhiên các xét nghiệm trong khuôn khổ của nghiên cứu có hiệu suất chẩn đoán khác nhau và có thể gây ra sai số do hiện tượng âm tính giả (trường hợp mà các nhà nghiên cứu không thể loại trừ).

- Nghiên cứu này chỉ sử dụng một vài chỉ báo sinh học nhằm đánh giá ảnh hưởng của các vitamin lên stress oxy hóa gây bởi thử nghiệm bơi kiệt sức trên chuột lang. Như vậy, có những yếu tố chưa được xét đến. Và loài động vật được dùng để thử là chuột lang, vấn đề đặt ra ở đây là ở những loài động vật khác hoặc ở con người thì những kết luận đã có được trên có thay đổi như thế nào? Vì thế, trong tương lai, việc mở rộng nghiên cứu trên các đối tượng thử nghiệm khác, với các thông số chỉ báo khác, sử dụng đa dạng xét nghiệm hơn với các điều kiện thử nghiệm khác nhau... để làm rõ cơ chế hoạt động chính xác của vitamin C và vitamin E là cần thiết.

2.3 Bài báo gốc chủ đề tự chọn - Tên bài báo gốc: EFFECTS OF L-ASCORBIC ACID AND ALPHA-TOCOPHEROL ON BIOCHEMICAL PARAMETERS OF SWIMMING-INDUCED OXIDATIVE STRESS IN SERUM OF GUINEA PIGS - Đường dẫn của bài báo: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5566150/ - Nguyên văn bài báo: (trang tiếp theo)

40

EFFECTS OF L-ASCORBIC ACID AND ALPHA-TOCOPHEROL ON BIOCHEMICAL PARAMETERS OF SWIMMING-INDUCED OXIDATIVE STRESS IN SERUM OF GUINEA PIGS 1

2 1 3 2 Marija Bursać-Mitrović, Dragan R. Milovanović, Radoslav Mitić, Danijela Jovanović, Miroslav 4 2 2 Sovrlić, Perica Vasiljević, Jovica Tomović, * Nedeljko Manojlović 1 Department of Pharmacology, Medical faculty, University of Kosovska Mitrovica, Serbia 2 Department of Pharmacy, Facult y of Medical Sciences, University of Kragujevac, Kragujevac, Serbia, 3 4 Department of Anesthesiology, Clinical Centre “Kragujevac”, Kragujevac, Serbia Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Niš, Niš, Serbia, * Corresponding author E-mail: mtnedeljko@yahoo.com

Abstract Background: The purpose of this study is to determine the effect of L-ascorbic acid and alpha-tocopherol as well as combination of these vitamins with or without exposure to physical exercise on intensity of lipid peroxidation, activity of xanthine oxidase, activity of total antioxidative system, concentration of glutathione, and activity of catalase in the serum of guinea pigs.

Materials and Methods: The experimental measurements of intensity of lipid peroxidation, activity of xanthine oxidase, activity of total antioxidative system, concentration of glutathione, and activity of catalase were done in the serum of guinea pigs. The animals were exposed to the test load to achieve exhaustion and the test was terminated when the animal for the third time to sink into the water.

Results: The results of this study demonstrated that endurance exercise of guinea pigs induced oxidative stress response in terms of increased lipid peroxidation and activity of xanthine oxidase in the serum of experimental animals. Our study investigated the antioxidant activity of L-ascorbic acid and alpha-tocopherol also measuring three protective markers in the serum: total antioxidant activity, content of glutathione and activity of catalase. The results obtained show that the vitamins influence the concentrations of above mentioned biochemical parameters, which points out their protective effect of swimming-induced oxidative stress.

Conclusion: Single or combined administration of L-ascorbic acid and alpha-tocopherol caused significant inhibition of these markers indicating the important antioxidant activity of the vitamins. Results lead to conclude that the combined treatments with vitamins with or without exposure to physical exercise showed the clear synergistic effect..

Key words: L-ascorbic acid, alpha-tocopherol, guinea pigs, oxidative stress, biochemical parameters

Introduction The term oxidative stress was first defined in 1985 as “a disturbance in the pro-oxidant-antioxidant balance in favor of the former” (Sies, 1985; Sies at al., 1985). Dean Jones has proposed that the term “oxidative stress” should be redefined as “a disruption of redox signaling and control” and this definition is gaining widespread acceptance (Jones, 2006). Practically, under physiological conditions (endogenous sources) as well as under some adverse events (exogenous sources), in biological systems there is continuous production of free radicals i.e, ions, molecules and compounds that have unpaired electron and are highly reactive with biological molecules (Halliwell аnd Gutteridge, 1999). As a result of their reaction with lipids, proteins or DNA, oxidized products are made (Halliwell and Whiteman, 2004). Cells are equipped with enzymatic and nonenzymatic antioxidant system to eliminate free radicals and to maintain redox homeostasis (Valko et al., 2007). In oxidative stress assessment, instead of measuring free radicals themselves (which have very short half-life) we can rely on measurement of products of biological damage as well as on measurement of antioxidative capacity (enzymatic and nonenzymatic components). Vitamin C and Vitamin E play pivotal role in cellular protection against reactive oxygen species (Halliwell and Whiteman, 2004).

Vitamin E (alpha-tocopherol) as a low-molecular-weight agent is the primary chain-breaking lipid-soluble antioxidant located primarily in the membranes of tissues and it is capable of scavenging reactive oxygen species (Janero, 1991; Packer, 1991). Ascorbic acid (vitamin C) is found in two chemical forms, as reduced (L-ascorbic acid, and its ionized form of L-ascorbate) and oxidized form as (L-dehydroascorbic acid; and its ionized form of L-dehydroascorbate).

41

Ascorbic acid is hydrophilic compound and functions better in an aqueous environment. The ascorbate anion is the predominant form existing at physiological pH (pKa of ascorbic acid is 4.25) (Powers and Jackson, 2008; Yu, 1994). The most striking chemical activity of ascorbic acid is its ability to act as a reducing agent, implicated in detoxifying various oxygen radicals in vivo. The speed of conversion of ascorbic acid into dehydroascorbic acid in aerobic conditions is facilitated by the higher pH values, compared to the acidic environment (Carr and Frei, 1999). Mechanism of antioxidant activity involves the conversion of ascorbic acid into its oxidized form (dehydro-ascorbic acid) by donating two electrons to reactive oxygen species (Fischer et al., 2004). Ascorbic acid can act directly scavenging lipid hydroperoxide, superoxide and hydroxyl radicals or, indirectly, playing an important role in recycling of tocopherol, a process that results in the conversion of ascorbic acid into semiascorbyl radical (Packer at al., 1979). Some authors have shown the influence of physical exercise on oxidative stress and changes in sleep pattern (Esteves et al., 2014).

The aim of this work was to study the effect of L-ascorbic acid and alpha-tocopherol on some biochemical parameters of oxidative stress in the serum of guinea pigs as no previous study known to us investigated their effects on the experimental model exploited in our research. We hypothesized that the combination of two vitamins would achieve significant synergistic effects in the terms of oxidative protection.

Materials and methods Chemicals All the chemicals were purchased from Sigma-Aldrich, Germany. Analytical grade chemicals vitamin C (L-Ascorbic acid, ampule 1000 mg) and vitamin E ((+/-)-аlphа-tocopherol, ampule 100 mg) were used.

Study animals Forty guinea pigs were used during the experiment. The animals were obtained from VMA-Department for breeding laboratory and experimental animals, Belgrade, Serbia). At the start of the experiment, the both sexes of guinea pigs weighed 450 g ± 50 g and were kept under constant environmental conditions (temperature 25˚C ± 2˚C; humidity 60 ± 1.5 %, with 12 h light period, 10 days before the beginning experiment and during the experiment). All the animals received human care according to the criteria outlined in the ‘Guide for the Care and Use of Laboratory Animals’ prepared by the National Academy of Science and published by the National Institute of Health. The ethic regulations have been followed in accordance with National and institutional guidelines for the protection of animal welfare during experiments.

Experimental design The animals were randomly assigned into eight groups consisting five animals for each experiment. The first experimental group was the control group. The second experimental group is exposed to a test of excessive physical activity swimming to exhaustion. The third group was administered with 20 mg/kg, L-ascorbic acid (Vitamin C) intraperitoneally (ip), without exposing test physical load. The test substances (alpha-tocopherol and L-ascorbic acid) were administered intraperitoneally in one of the quadrants lower abdominal guinea pigs lateral to the midline, taking care to avoid injury of the bladder, liver or intestines. After the needle stick, before the injection of the substance required aspirated content. The fourth experimental group is exposed to a test of physical load and supplementation of Lascorbic acid (20 mg/kg). The fifth group was administered with 25 mg/kg, alpha-tocopherol (vitamin E) intraperitoneally (ip), without exposure to physical stress test. The sixth group experimental group is exposed to a test of physical load and supplementation of alpha-tocopherol (25 mg/kg). The seventh group was administered with a combination of 20 mg/kg of L-ascorbic acid and 25 mg/kg alpha-tocopherol ip, without exposure to a test of the physical load. The eighth experimental group is exposed to a test of physical load and supplementation of combination of L-ascorbic acid (20 mg/kg) and alpha-tocopherol (25 mg/kg). The test load was determined by swimming to exhaustion. The experimental animals were swimming around in the water tank depth of 60 cm, with the average amount of water and 20 dm 3, a temperature of 32 °C. The animals were exposed to the test load to achieve exhaustion and the test was terminated when the animal for the third time to sink into the water.

Biochemical evaluation The extent of lipid peroxidation (LPx) was determined after Buege and Aust (1988), activities of xanthine oxidase (XOD) after Bergmayer (1976), catalase (CAT) after Beers and Sizer (1952), the content of reduced glutathione (GSH) after Beuthler et al. (1983) and total antioxidant status (TAS) after Miller et al. (1993). The experimental measurements of above-mentioned parameters were done in the serum of guinea pigs. The results of biochemical analysis are presented as mean value ± standard deviation. The difference between the control and test groups was analyzed by the last significant difference at the p ≤ 0.005 confidence levels.

42

Statistical analysis The results obtained from 5 replicates (n = 5) of each experiment. The descriptive values are presented as the mean, standard deviation (SD), minimal (min) and maximal (max) values, standard error (SĐ&#x2022;) and coefficient of variation (CV%). The significance of the difference between the experimental groups was tested two-sided using Studentâ&#x20AC;&#x2122;s t-test or MĐ°nn-Whitney test depending on the data distribution pattern (normal or non-parametric). SPSS version 19.0 was employed to analyze data. The level of probability of statistical significance was set up at p 0.05.

Results and Discussion The results of the influence of L-ascorbic acid and alpha-tocopherol and the combination of these vitamins with or without exposure to physical stress on the intensity of lipid peroxidation, the activity of xanthine oxidase, the activity of total antioxidative system, content of glutathione, and the activity of catalase in guinea pigs are given in Tables 1-5.

The experimental measurements of above-mentioned parameters were done in the serum of guinea pigs.

The endurance exercise of guinea pigs significantly increased the lipid peroxidation values (LPx) in their serum (Table 1). Single administration of L-ascorbic acid and alpha-tocopherol decreased significantly activity of this prooxidative enzyme in both the control and the endurance-exercise group of experimental animals.

The endurance exercise of guinea pigs significantly increased the activity of xanthine oxidase (XOD) in their serum (Table 2). Single administration of L-ascorbic acid and alpha-tocopherol gave significantly lower increase in comparison with both the control and the endurance-exercise group of experimental animals. In addition, the combination of the vitamins showed the clear synergistic effect.

The endurance exercise of guinea pigs slightly increased the activity of total antioxidant system (TAS) in their serum but the effect was not statistically significant (Table 3). Single administration of L-ascorbic acid and alphatocopherol slightly reduced the activity in the comparison with both the control and the endurance-exercise group of experimental animals but the effect was not significant.

The endurance exercise of guinea pigs very slightly increased the content of glutathione (GSH) in their serum but the effect was not statistically significant (Table 4). Single administration of L-ascorbic acid and alpha-tocopherol slightly reduced the activity in comparison with the control group but the effects were not significant. On the other side, the combination of the vitamins had variable effects on glutathione content and the oscillation which they induced was not significantly different from both the control and the endurance activity groups.

The endurance exercise of guinea pigs significantly increased the activity catalase (CAT) in their serum (Table 5). In comparison with the control, single administration of L-ascorbic acid and alpha-tocopherol increased catalase activity but only in the case of L-ascorbic acid the effect was statistically significant. The combination of L-ascorbic acid and alpha-tocopherol had the effect of lesser magnitude than the individual vitamins and in comparison with the control the difference was not statistically significant. In comparison with endurance-exercise group, single administration of L-ascorbic acid and alpha-tocopherol decreased serum catalase activity and their combination increased it but only in the case of L-ascorbic acid the difference was statistically significant.

The results of our study showed that the endurance exercise of guinea pigs induced oxidative stress response in terms of increased lipid peroxidation and activity of xanthine oxidase in the serum of experimental animals. Single or combined administration of L-ascorbic acid and alpha-tocopherol caused significant inhibition of both markers indicating the important antioxidant effects of the vitamins.

It is well-known that exercise induced metabolic stress by the generation of wide range of reactive oxygen species (Mason et al., 2014). Reactive oxygen species, in turn, react with cellular lipids producing lipid peroxides within tissues (Zsolt et al., 2013). Vitamin C and vitamin E are among the most widely studied dietary antioxidants. Both, vitamin E and vitamin C, react with and scavenge various reactive oxygen species providing protection from oxidative stress induced by different triggers (Janero, 1991; Packer, 1991; Fischer et al., 2004; Wu et al., 2014). Finally, vitamin C has been cited as being capable of regenerating vitamin E (Krishnamurthy and Wadhwani, 2012). This all explain our results about synergistic effects of vitamin E and vitamin C in diminishing lipid peroxidation and it support our hypothesis of usefulness of the vitamin combination for protection from exercise- induced oxidative stress damage.

In our study, administration of vitamin E and vitamin C suppressed the activity of xanthine oxidase, an enzyme having pro-oxidant nature. The effect of vitamin E was of greater magnitude and the most inhibition was achieved with their combination. Previous investigators proved the inhibitor effect of both vitamin E and in some lesser extent of vitamin C on xanthine oxidase activity supporting the results of our study (Mohd et al. 2012, Dwenger et al., 1992).

To our knowledge, no previous study investigated the effects of L-ascorbic acid and alpha-tocopherol combination in similar settings neither in the same or other mammal species, making our results the novelty in the

43

available published literature. Our study investigated the possible mechanism of antioxidant activity of L-ascorbic acid and alpha-tocopherol measuring three protective markers in the serum samples taken from experimental animals: total antioxidant activity, activity of glutathione and activity of catalase. The major finding was the increase of catalase activity, induced with endurance exercise and L-ascorbic acid but not with alpha tocopherol. The absence of significant changes of total antioxidant capacity and glutathione activity in our study could be, at least partly, explained with methodological issues. Researchers reported that different assays used for detection of these antioxidative markers (including those used in our research) could have different diagnostic performances (Cighetti et al. 2015, GĂźngĂśr et al., 2011). Consequently, we could not exclude the possibility that the laboratory assays used in our study for these two analytes gave false-negative results, particularly if their changes were of small magnitude.

L-ascorbic acid and alpha-tocopherol had triggered different molecules of oxidative stress defense which played the role in the protection from swimming-induced oxidative stress response. A recent research tracing several biochemical and molecular markers of oxidative damage and antioxidative defense reported dual effects of vitamin C and vitamin E combination, pro-oxidant and antioxidant, depending on the doses and other experimental conditions (de Oliveira et al., 2013). Therefore, the future research with more detailed and focused designs, using various laboratory assays and different experimental conditions, are necessary in order to clarify the exact mechanisms of action of vitamin C and vitamin E on oxidative stress response during endurance exercise.

Table 1: The intensity of lipid peroxidation (LPx) in the serum of experimental guinea pigs in different study groups

C = control; E = endurance exercise; A = L-ascorbic acid; T = alpha-tocopherol; *compared with the control group; **compared with the endurance exercise group Content of LPx is expressed in nmol malondialdehyde/mg protein Table 2: The activity of (XOD) in the serum of experimental guinea pigs in different study groups

C = control; E = endurance exercise; A = L-ascorbic acid; T = alpha-tocopherol; *compared with the control group; **compared with the endurance exercise group Content of XOD is expressed in nmol/mg protein¡min-1 Table 3: The total antioxidant status (TAS) in the serum of experimental guinea pigs in different study groups

44

C = control; E = endurance exercise; A = L-ascorbic acid; T = alpha-tocopherol; *compared with the control group; **compared with the endurance exercise group Content of TAS is expressed in mmol/l Table 4: The glutathione (GSH) content in the serum of experimental guinea pigs in different study groups

C = control; E = endurance exercise; A = L-ascorbic acid; T = alpha-tocopherol; *compared with the control group; **compared with the endurance exercise group Content of GSH is expressed in nmol GHS/mg protein Table 5: The activity of catalase (CAT) in the serum of experimental guinea pigs in different study groups

C = control; E = endurance exercise; A = L-ascorbic acid; T = alpha-tocopherol; *compared with the control group; **compared with the endurance exercise group Content of CAT is expressed in nmol/mg proteinâ&#x20AC;˘min-1

Conclusion L-ascorbic acid and alpha-tocopherol and the combination of these vitamins with or without exposure to physical exercise influence on the changes of important biochemical parameters in the serum of guinea pigs. The combined treatments with vitamins has a protective effect on forced swimming-induced oxidative stress and show the clear synergistic effect.

References

1. Beers, R.F. and Sizer, I.W. (1952). Spectrophotometric method for measuring of breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J. Biol. Chem. 195: 133-140.

2. Bergmayer, U.H. (1970). Methoden Der Enzymatischen analyse. Pharmazie in unserer Zeit Verlag Chemies: Weinhem: 483-484.

3. Beuthler, E., Duron, O. and Kelly, B. (1983). Improved method for the determination of blood glutathione. J. Lab. Clin. Med.61(5): 882-888.

4. Buege, A.J., Aust, D.S. (1988). Methods in enzymology; Fleischer S, Parker L. (Eds.). Academic Press, New York.

5. Carr, A. and Frei, B. (1999). Does vitamin C act as a pro-oxidant under physiological conditions? FASEB J. 13: 1007â&#x20AC;&#x201C; 1024.

6. Cighetti, G, Bamonti, F, Aman, CS, Gregori, D, De Giuseppe, R, Novembrino, C, de Liso F, Maiavacca, R. and Paroni, R. (2015). Oxidative status in different settings and with different methodological approaches compared by receiver operating characteristic curve analysis. Clin. Biochem. 48(1-2): 73-78.

45

7. Dwenger A., Funck M., Lueken B., Schweitzer G. and Lehmann U. (1992). Effect of ascorbic acid on neutrophil functions and hypoxanthine/xanthine oxidase-generated, oxygen-derived radicals. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem.

30(4): 187-191.

8. Esteves, A.M., Ackel-D'Elia, C., Tufik, S. and De Mello, M.T. (2014). Sleep patterns and acute physical exercise: the effects of gender sleep disturbances, type and time of physical exercise. J. Sports Med. Phys. Fitness. 54(6): 809-815.

9. Fischer, H., Schwarzer, C. and Illek, B. (2004). Vitamin C controls the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator chloride channel. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 101(10): 3691–3696.

10. Glatzle, D. and Vuilleumier, F. (1974). Glutathione reductase test with whole blood a convenient procedure for the assessment of the riboflavin status in human. Experientia 30(6): 665-667.

11. Güngör, N., Ozyürek, M., Güçlü, K., Cekiç, S.D. and Apak R. (2011). Comparative evaluation of antioxidant capacities of thiol-based antioxidants measured by different in vitro methods. Talanta. 83(5): 1650-1658.

12. Halliwell, B and Whiteman, M. (2004). Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? Bras. J Pharmacol. 142(2): 231-255.

13. Halliwell, B and Gutteridge, J. Free radicals in biology and medicine. 4th ed. Oxford, Oxford University Press, 2007.

14. Jones, D.P. (2006). Redefining oxidative stress. Antioxid. Redox. Signal. 8: 1865-1879.

15. Janero, D.R. (1991). Therapeutic potential of vitamin E in the pathogenesis of spontaneous atherosclerosis. Free Radic. Biol.Med. 11: 129-144.

16. Kanagasabai, T. and Ardern, C.I. (2015). Contribution of inflammation, oxidative stress, and antioxidants to the relationship between sleep duration and cardiometabolic health. Sleep. sp-00153-15.

17. Mason S. and Wadley G.D. (2014). Skeletal muscle reactive oxygen species: a target of good cop/bad cop for exercise and disease. Redox Rep. 19(3): 97-106.

18. Miller N.J., Rice-Evans C., Davies M.J., Gopinathan V. and Milner A. (1993). A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates. Clin. Sci. 84(4): 407412.

19. Mohd F.N.A., Ibrahim I.A., Kamisah Y. and Mohd I.N. (2012). Palm vitamin E reduces catecholamine, xanthine oxidase activity and gastric lesions in rats exposed to water-immersion restraint stress. BMC Gastroenterol. 28: 12-54.

20. de Oliveira, B.F., Costa, D.C., Nogueira-Machado. J.A. and Chaves, M.M. (2013). β-Carotene, α-tocopherol and ascorbic acid: differential profile of antioxidant, inflammatory status and regulation of gene expression in human mononuclear cells of diabetic donors. Diabetes Metab. Res. Rev. 29(8): 636-645.

21. Packer, L. (1991). Protective role of vitamin E in biological systems. Am. Clin. Nutr. 53: 1050S–1055S. 22. Packer, J. E., Slater, T. F., Willson, R. L. (1979). Direct observation of a free radical interaction between vitamin E and vitamin C. Nature. 278: 737–738.

23. Powers, S.K., Jackson and M.J. (2008). Exercise-induced oxidative stress: cellular mechanisms and impact on muscle force production. Physiol. Rev. 88: 1243-1276.

24. Simon, L.M., Fatrai, Z., Jonas, D. E. and Matkovics, B. (1974). Study of metabolism enzyme during the development of Phaseoum vulgaris. Biochem. Physiol. Pflanz. 166: 389-393.

25. Sies, H. (1985). Oxidative stress, Introductory remarks, In: Oxidative Stress (H. Sies, ed.) Academic Press, London.

26. Sies, H., Cadenas, E., Symons, M. C. R. and Scott, G. (1985). Oxidative stress: Damage to intact cells and organs [and discussion]. Philos. Trans. R. Soc. Lond., B, Biol. Sci. 311: 617-631.

27. Valko, M., Morris, H. and Cronin, M.T. (2005). Metals, toxicity and oxidative stress. Curr. Med. Chem. 12(10): 1161-1208.

28. Yu, B. P. (1994). Cellular defenses against damage from reactive oxygen species. Physiol. Rev. 74: 139–162.

29. Wu, C.M., Cheng, Y.L., Dai, Y.H., Chen, M.F., Wang, C.C. (2014). α-Tocopherol protects keratinocytes against ultraviolet A irradiation by suppressing glutathione depletion, lipid peroxidation and reactive oxygen species generation.

Biomed. Rep. 2(3): 419-423.

30. Zsolt, R., Orsolya, M., Eniko, N. Erika, K., and Sataro, G. (2013). The complex role of physical exercise and reactive oxygen species on brain. J. Sport. Health Sci. 2(2): 87-93.

46