BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH BÀI GLUCIDE, ĐỊNH TÍNH VÀ KHẢO SÁT PROTEIN, KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH KHOA DƯỢC

vectorstock.com/20938731

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection

THÍ NGHIỆM HÓA SINH BÀI GLUCIDE, ĐỊNH TÍNH VÀ KHẢO SÁT PROTEIN, KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME, KHẢO SÁT LIPID WORD VERSION | 2022 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

ƠN

OF

🙢✵🙠

QU Y

NH

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH BÀI 3. GLUCIDE

Sinh viên: Nguyễn Quỳnh Như

Y

KÈ

M

GVHD: TS. Phạm Phước Điền

DẠ

L

FI CI A

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA DƯỢC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, THÁNG 08 NĂM 2021

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

PHẢN ỨNG MOLISCH

FI CI A

I.

L

BÀI 3. GLUCIDE 1. Nguyên tắc

 Các loại glucide đều cho phức màu tím khi phản ứng với dung dịch α-naphthol trong sulfuric acid đậm đặc

 Có thể dùng phản ứng Molisch để phân loại các nhóm carbohydrate và phân biệt

OF

các nhóm carbohydrate với những chất khác dựa vào cường độ màu của chúng.

2. Thuốc thử

Thuốc thử Molisch là dung dịch naphthol 1% trong ethanol 90%.

ƠN

3. Cách tiến hành Chuẩn bị 5 ống nghiệm như bảng sau: Ống 1

Ống 2

Ống 3

Ống 4

Ống 5

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml hồ tinh

glucose 1%

fructose 1%

sucrose 1%

bột 1%

3 giọt

3 giọt

3 giọt

3 giọt

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml nước cất

Glucide

QU Y

3 giọt

TT Molisch

NH

Dung dịch

Lắc đều

H2SO4 đậm đặc

1 ml

1 ml

4. Hiện tượng và giải thích

KÈ

M

4.1. Hiện tượng

 Ống 2: Xuất hiện vòng màu tím.  Ống 3 và 4: Xuất hiện vòng máu tím đỏ.

Y

1

 Ống 1: Không có hiện tượng xảy ra.

4 5 2 3

DẠ

 Ống 5: Xuất hiện vòng màu tím nhạt màu.

2

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

L

4.2. Giải thích

FI CI A

 Dưới tác dụng của acid H2SO4 đậm đặc fructose, glucose, sucrose và hồ tinh bột đều bị khử nước cho ra một aldehyde (furfulral hoặc 5-hydroxyl methyl furfural).

Trong môi trường acid, aldehyde sẽ phản ứng thế nhân điện tử với α-naphthol (trong

NH

ƠN

OF

thuốc thử Molisch) cho ra phức chất màu tím hoặc tím đỏ.

QU Y

 Do fructose có cấu trúc vòng 5 cạnh nên trong môi trường acid H2SO4 đậm đặc sẽ dễ bị khử nước để tạo thành furfulral. Glucose có cấu trúc vòng 6 cạnh nên bền hơn.

Sucrose có liên kết α-1,2 glycoside nối giữa fructose và glucose nên khá bền. Hồ tinh bột bền nhất vì có nhiều liên kết α-1,4 glycoside và do đó cũng tạo phức có màu tím nhạt nhất.

KÈ

1. Nguyên tắc

M

II. PHẢN ỨNG FEHLING  Phản ứng Fehling dùng để xác định các đường khử như lactose, maltose, glucose, fructose, pentose (arabinose, ribose),… Trong môi trường kiềm mạnh, các

Y

monosaccharide ở dạng endiol không bền dễ dàng khử các kim loại nặng như Cu2+,

DẠ

Ag+, Hg2+. Các nối đôi bị cắt đứt tạo ra những hỗn hợp đường – acid.

 Phản ứng Fehling được ứng dụng trong hóa sinh lâm sàng để kiểm tra nhanh lượng đường có trong nước tiểu của bệnh nhân mắc bệnh đái tháo đường.

3

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

L

2. Thuốc thử

 Dung dịch B

CuSO4 kết tinh

35 g

H2SO4 đậm đặc

5 ml

Nước cất

vừa đủ 1000 ml

KOH hoặc NaOH

135 g

Natri kali tartrate

150 g

OF

 Dung dịch A

Nước cất

vừa đủ 1000 ml

Chuẩn bị 5 ống nghiệm như bảng sau: Ống 1

Ống 2

1 ml

1 ml

0,5 ml

Glucide

glucose 1%

NH

Dung dịch

ƠN

3. Cách tiến hành

TT Fehling

FI CI A

Thuốc thử Fehling gồm 2 dung dịch:

0,5 ml

fructose 1%

Ống 3

Ống 4

Ống 5

1 ml

1 ml

1 ml

0,5 ml

0,5 ml

0,5 ml hồ

lactose 1% sucrose 1% tinh bột 1%

QU Y

Lắc đều. Đun sôi cách thủy 3 phút

4. Hiện tượng và giải thích 4.1. Hiện tượng

DẠ

Y

KÈ

M

Glucose Fructose Lactose

4

Sucrose Hồ tinh bột

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

FI CI A

Khi cho tiếp các dung dịch glucide tương ứng vào mỗi ống nghiệm ta thấy:

L

Khi trộn dung dịch Fehling A và B ta thấy dung dịch chuyển sang màu xanh dương đậm.  Ống 1, 2, 3: Đều xuất hiện kết tủa đỏ gạch. Cường độ màu: ống 1 > ống 2 > ống 3.

Thời gian tạo tủa: ống 3 > ống 2 và ống 1.  Ống 4, 5: Không xảy ra hiện tượng gì.

4.2. Giải thích

OF

 Thuốc thử Fehling: Khi trộn 2 dung dịch Fehling A và Fehling B với thể tích bằng nhau, natri kali tartrate sẽ hòa tan tủa Cu(OH)2 do CuSO4 trong môi trường kiềm sinh ra, tạo ra phức chất Cu2+ alcolate màu xanh dương đậm. Phức chất này cung

QU Y

NH

ƠN

cấp Cu2+ cho phản ứng oxy hóa – khử tiếp theo.

 Ống 1 và 2: Đều xuất hiện tủa đỏ gạch, nhưng tủa ở ống 1 (chứa glucose) đậm màu hơn so với tủa ở ống 2 (chứa fructose) vì glucose và fructose đều là monosaccharide có nhóm –OH hemiacetal → có tính khử. Nhưng nhóm –CHO của glucose có tính

DẠ

Y

KÈ

M

khử mạnh hơn nhóm –C=O của fructose.

5

Thực tập hóa sinh

FI CI A

L

Nguyễn Quỳnh Như

↓ tủa đỏ gạch

D-Glucose

D-Gluconic acid

OF

 Ống 3: Có kết tủa đỏ gạch nhưng chậm hơn ống 1,2 là do lactose là disaccharide bị thủy phân tạo ra β-D-galactose và D-glucose (có nhóm –OH hemiacetal tự do ở C1)

NH

ƠN

→ có tính khử.

 Ống 4: Không tạo tủa đỏ gạch do sucrose (saccharose) không có nhóm –OH

QU Y

hemiacetal để chuyển thành aldehyde → không có tính khử. Do đó không tác dụng với thuốc thử Fehling.

M

 Ống 5: Không có hiện tượng do tinh bột là polysaccharide → không có tính khử

KÈ

III. PHẢN ỨNG SELIWANOFF (PHẢN ỨNG ĐẶC TRƯNG CHO CETONE) 1. Nguyên tắc

 Khi đun nóng với acid vô cơ, fructose và những cetohexose khác tạo thành hydroxy

Y

methyl furfural. Các chất này tác dụng với resorcinol cho phức màu đỏ. Các aldose

DẠ

cũng có thể tạo thành hydroxy methyl furfural khi đun nóng với acid, nhưng phản

ứng xảy ra rất chậm, nên phản ứng Seliwanoff có tính đặc hiệu cho cetose.

 Phản ứng dùng để nhận biết đường aldose và đường cetose.

6

Thực tập hóa sinh

2. Thuốc thử Thuốc thử Seliwanoff:

Resorcinol (resorcin) HCl pha loãng 1/3

0,05 g

100 ml

ƠN

3. Cách tiến hành

OF

FI CI A

L

Nguyễn Quỳnh Như

Chuẩn bị 2 ống nghiệm như bảng sau:

Ống 1

NH

Ống nghiệm Dung dịch TT Saliwanoff Glucide

Ống 2

1 ml

1 ml

0,5 ml fructcose 1%

0,5 ml glucose 1%

QU Y

Lắc đều. Đun sôi cách thủy 10 phút

DẠ

Y

KÈ

M

4. Hiện tượng và giải thích

Ống 1: Xuất hiện màu đỏ

Ống 2: Không xảy ra hiện tượng

Dưới tác dụng của acid HCl đậm đặc và nhiệt độ, các Các aldose cũng có thể tạo thành

cetohexose và cetopentose tạo thành hydroxy methyl hydroxy methyl furfural khi đun

7

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

tạo thành phức chất có màu đỏ.

L

furfural và furfural. Các chất này ngưng tụ với resorcinol nóng với acid nhưng phản ứng xảy ra

FI CI A

rất chậm.

OF

Phức màu đỏ

IV. THỦY PHÂN SACCHAROSE

ƠN

1. Nguyên tắc

Saccharose (sucrose) không có tính khử, nhưng khi thủy phân saccharose bằng acid sẽ cho

2. Cách tiến hành

QU Y

NH

ra D-glucose và D-fructose đều có tính khử.

 Tạo dung dịch thủy phân: Cho vào ống nghiệm 2 ml dung dịch saccharose 1% và 4

M

giọt HCN 1N, đun sôi cách thủy 5 phút. Lấy dịch thủy phân đem làm thí nghiệm.  Chuẩn bị 4 ống nghiệm như bảng sau: Ống 2

Ống 3

Ống 4

Dịch thủy phân saccharose

0,5 ml

-

0,5 ml

-

Dung dịch saccharose 1%

-

0,5 ml

-

0,5 ml

1 ml

1 ml

-

-

-

-

1 ml

1 ml

KÈ

Ống 1

Y

TT Fehling

DẠ

TT Seliwanoff Đun cách thủy

3 phút

8

10 phút

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

4

3

2

OF

1

FI CI A

L

3. Hiện tượng và giải thích

ƠN

 Ống 1: Tạo tủa màu đỏ gạch do khi thủy phân saccharose bằng acid HCN 1N cho ra D-glucose và D-fructose đều có tính khử nên phản ứng với thuốc thử Fehling.  Ống 2: Không xảy ra hiện tượng với thuốc thử Fehling vì saccharose không có

NH

nhóm –OH hemiacetal nên không có tính khử.

 Ống 3: Tạo kết tủa màu đỏ do khi thủy phân saccharose bằng acid HCN 1N tạo ra D-fructose – một cetose, fructose sẽ phản ứng với resorcinol trong thuốc thử Seliwanoff tạo phức màu đỏ.

QU Y

 Ống 4: Tạo kết tủa màu đỏ do trong thuốc thử Seliwanoff có chứa 1/3 HCl pha loãng nên khi đun sôi cách thủy ống nghiệm trong 10 phút thì saccharose trong ống nghiệm bị thủy phân cho ra fructose và tạo phản ứng như trong ống nghiệm 3.

1. Nguyên tắc

M

V. PHẢN ỨNG MÀU POLYSACCHARIDE Các polysaccharide kết hợp với iod tạo thành các phức chất có màu khác nhau tùy vào độ

KÈ

dài mạch carbon.

2. Cách tiến hành

Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1%. Thêm vào 1 giọt thuốc thử Lugol.

Y

Quan sát màu xuất hiện. Tiếp theo đun ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn, quan sát hiện

DẠ

tượng. Sau đó cho ống nghiệm vào cốc nước để nguội và quan sát hiện tượng.

3. Hiện tượng và giải thích 3.1. Hiện tượng

9

Thực tập hóa sinh

Đun nóng ống nghiệm

ƠN

1 ml hồ tinh bột 1% + 1 giọt lugol

OF

FI CI A

L

Nguyễn Quỳnh Như

Nhúng ống nghiệm vào cốc nước lạnh

Khi cho 1 giọt thuốc thử Lugol vào ống nghiệm chứa hồ tinh bột 1% ta thấy xuất hiện dung

NH

dịch đổi sang màu xanh dương tím. Khi đun nóng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn, dung dịch dần mất màu. Khi ngân ống nghiệm vào cốc nước lạnh màu xanh xuất hiện trở lại 3.2. Giải thích

QU Y

 Trong hồ tinh bột ở nhiệt độ thường, phân tử tinh bột tồn tại dưới dạng các chuỗi xoắn; cứ 6 phân tử glucose lập thành 1 bước xoắn có thể hấp phụ 1 phân tử iod làm cho dung dịch có màu. Màu này thay đổi tùy thuộc vào cấu trúc của phân tử tinh bột (tỉ lệ amylose/amylopectin) và chiều dài của phân tử. Amylose cho màu xanh dương đậm với iod trong khi amylopectin lại cho màu tím đỏ với iod.

M

 Khi đun nóng, các vòng xoắn trong phân tử tinh bột duỗi ra, không còn hấp phụ iod

KÈ

nữa nên dung dịch bị mất màu. Khi làm nguội, các phân tử có xu hướng trở về dạng chuỗi xoắn làm hồ tinh bột có màu trở lại.

VI. PHẢN ỨNG BENEDICT (PHẢN ỨNG GLUCOSE TRONG NƯỚC TIỂU)

Y

1. Nguyên tắc

DẠ

 Glucose có nhóm aldehyde sẽ khử Cu2+ thành Cu+ tạo Cu2O (tủa màu đỏ gạch).  Phản ứng Benedict là phản ứng bán định lượng vì thông qua phản ứng này người ta có thể ước chừng được lượng glucose trong nước tiểu.

10

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

L

2. Thuốc thử

 Dung dịch B

Natri citrate

173 g

Natri carbonate (Na2CO3)

200 g

Nước cất đun nóng

700 ml

Cu2SO4.5H2O

17,3 g

Nước cất

100 ml

OF

 Dung dịch A

FI CI A

Thuốc thử Benedict gồm 2 dung dịch:

Chuẩn bị thuốc thử: Đổ dung dịch B từ từ vào dung dịch A, lắc đều. thêm nước cất vừa 3. Cách tiến hành

ƠN

đủ 1000 ml. Đun sôi cách thủy. Thuốc thử phải không có tủa đỏ.

Cho vào ống nghiệm 1 ml thuốc thử Benedict. Thêm vào 0,1 ml (2 giọt) nước tiểu. Đun 4. Hiện tượng và giải thích

M

QU Y

4.1. Hiện tượng

NH

sôi cách thủy và nhận xét sự chuyển màu.

Hiện tượng

Thuốc thử trong, màu xanh dương.

Phản ứng âm tính (-).

xanh lá.

Lượng glucose trong nước tiểu ≤ 5 g/l.

Có tủa màu vàng cam.

Phản ứng dương tính (++).

Không có glucose trong nước tiểu.

Có ít tủa, thuốc thử chuyển sang màu Phản ứng dương tính (+).

Y

Ống 2

KÈ

Ống 1

Kết luận

DẠ

Ống 3

Lượng glucose trong nước tiểu 5 – 10 g/l.

11

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

Có tủa đỏ gạch.

Phản ứng dương tính (+++).

L

Ống 4

ƠN

OF

FI CI A

Lượng glucose trong nước tiểu 10 – 20 g/l.

NH

Thanh đánh giá kết quả phản ứng Benedict 4.2. Giải thích

 Dưới sự có mặt của đường khử, ion Cu2+ có trong thuốc thử Benedict sẽ bị khử thành ion Cu+. Các ion Cu+ sẽ tạo thành tủa đồng oxide (Cu2O) màu đỏ gạch.

QU Y

 Glucose có nhóm aldehyde -CHO có tính khử nên sẽ tạo tủa khi phản ứng với thuốc thử Benedict, và tùy thuộc vào lượng glucose có trong nước tiểu mà sẽ có sự chuyển

M

màu khác nhau.

↓ tủa đỏ gạch

KÈ

 Phản ứng Benedict và phản ứng Fehling đều tạo tủa Cu2O màu đỏ gạch. Tuy nhiên, phản ứng Fehling chỉ có thể định tính glucose trong nước tiểu, còn phản ứng Benedict là phản ứng bán định lượng vì thông qua phản ứng này người ta có thể ước

DẠ

Y

chừng được lượng glucose trong nước tiểu.

12

L

FI CI A

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA DƯỢC

ƠN

OF

🙢✵🙠

QU Y

NH

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH BÀI 1. ĐỊNH TÍNH VÀ KHẢO SÁT PROTEIN

Sinh viên: Nguyễn Quỳnh Như

DẠ

Y

KÈ

M

GVHD: TS. Phạm Phước Điền

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, THÁNG 08 NĂM 2021

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

PHẢN ỨNG BIURET

FI CI A

I.

L

BÀI 1. ĐỊNH TÍNH VÀ KHẢO SÁT PROTEIN 1. Nguyên tắc

 Phản ứng màu Biuret là phản ứng dùng để nhận biết sự có mặt của liên kết peptide trong cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ. Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptide trở lên có thể phản ứng với ion Cu2+ tạo thành phức

OF

chất màu xanh tím, tím, tím đỏ hay đỏ. Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide.

 Do các protein chứa các mạch peptide có chứa nhóm -CO-NH- (liên kết peptide)

ƠN

nên cũng có phản ứng Biuret. Phản ứng này thường được ứng dụng để xác nhận các liên kết peptide và định lượng protein.

2. Cách tiến hành

NH

 Ống nghiệm 1: Cho vào ống nghiệm khô một ít tinh thể urea, đun nhẹ. Lúc đầu urea nóng chảy, đến khi bắt đầu cứng lại thì ngừng đun.  Ống nghiệm 2: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch lòng trắng trứng và 0,5ml dung

QU Y

dịch NaOH 10%. Nhỏ tiếp 3 giọt dung dịch CuSO4 1%. Lắc đều.

3. Hiện tượng và giải thích

KÈ

M

3.1. Hiện tượng

Ống nghiệm 2: Sau khi cho dung dịch

NaOH 10% và CuSO4 1%, dung dịch

NaOH 10% và CuSO4 1%, dung dịch

chuyển từ trắng trong sang màu đỏ tím.

chuyển sang màu tím xanh.

DẠ

Y

Ống nghiệm 1: Sau khi cho dung dịch

2

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

L

3.2. Giải thích

FI CI A

 Ống 1: Khi đun chảy các tinh thể urea sẽ tạo ra biuret, cianuric acid và amoniac.

Trong môi trường kiềm (dung dịch NaOH 10%), nitrogen trong liên kết peptide của biuret sẽ phản ứng với ion Cu2+ của CuSO4, tạo phức màu đỏ tím. Do số lượng liên

NH

ƠN

OF

kết peptide của biuret rất ít nên ống nghiệm 1 chỉ chuyển sang màu đỏ tím.

 Ống 2: Trong môi trường kiềm, ion Cu2+ trong muối CuSO4 phản ứng với nitrogen trong liên kết peptide (-CO-NH-) của protein trứng và số liên kết peptide có trong

DẠ

Y

KÈ

M

QU Y

protein trứng vô cùng nhiều nên tạo phức chất có màu tím xanh.

3

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

L

II. KẾT TỦA THUẬN NGHỊCH PROTEIN BẰNG MUỐI TRUNG TÍNH

FI CI A

1. Nguyên tắc

 Các muối của kim loại kiềm ((NH4)2SO4 , Na2SO4, NaCl) và kiềm thổ (MgSO4) có tác dụng gây kết tủa thuận nghịch protein. Sau đó, nếu loại bỏ nhanh các yếu tố gây kết tủa protein sẽ trở về trạng thái dung dịch keo bền.

 Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với các nồng độ muối khác nhau. Vì vậy có

OF

thể ứng dụng điều này để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng.

2. Cách tiến hành 3ml dung dịch protein trứng

ƠN

+ 3ml dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa

Tủa 1

QU Y

Lọc

NH

Cho vào ống nghiệm 1. Lắc đều

Thu dịch lọc trong + từ từ (NH4)2SO4 tinh thể cho đến khi không tan nữa

KÈ

M

Cho vào ống nghiệm 2. Lắc đều

Tủa 2

3. Hiện tượng và giải thích

DẠ

Y

3.1. Hiện tượng

4

Thực tập hóa sinh

OF

FI CI A

L

Nguyễn Quỳnh Như

Ống nghiệm 2: Kết tủa 2 thu được khi

ƠN

Ống nghiệm 1: Kết tủa 1 thu được khi

cho tinh thể muối (NH4)2SO4 vào dịch lọc

cho protein trứng tác dụng với dung dịch

trong, khi lắc lên thấy rõ các kết tủa li ti.

NH

muối trung tính (NH4)2SO4 và lắc đều.

Nhận xét: Kết tủa 1 là globulin và kết tủa 2 là albumin. Đây là 2 loại protein chính có trong lòng trắng trứng. Hai protein này đã bị kết tủa khi cho lòng trắng trứng tác dụng

QU Y

với muối (NH4)2SO4.

3.2. Giải thích

1. Tại sao khi cho protein tác dụng với muối trung tính thì lại xuất hiện kết tủa?  Trong protein trứng có cả globulin và albumin, đây là những protein mang tính

M

acid yếu. Ở điều kiện bình thường, trong trạng thái dung dịch, phân tử protein tích điện âm, bên ngoài được bao bởi một lớp áo nước với đầu (+) quay vào và đầu (-)

DẠ

Y

KÈ

quay ra, làm protein ‘lơ lửng’ trong nước.

5

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

L

 Khi cho muối (NH4)2SO4 có nồng độ cao vào thì muối sẽ tạo ra các ion NH4+ và

FI CI A

SO42-. Các ion này sẽ trung hòa các tiểu phân tử protein trứng và đồng thời lấy đi lớp áo ion âm bên ngoài → làm bất hoạt các gốc ưa nước của protein → làm chúng kết tụ lại với nhau, tạo thành kết tủa.

2. Tại sao kết tủa đầu tiên xuất hiện là globumin mà không phải là albumin?

 Vì globumin có trọng lượng phân tử lớn và lớp áo nước bên ngoài lớn hơn so với

OF

albumin . Các ion NH4+ và SO42- dễ tác dụng vào lớp ion âm bao quanh globumin hơn, từ đó tạo ra kết tủa của globumin trước albumin → khi lọc ta được dung dịch bán bão hòa albumin.

ƠN

 Khi cho tinh thể (NH4)2SO4 vào dịch lọc sẽ làm cho dung dịch lọc ở trạng thái bão hòa, lúc này albumin có hiện tượng kết tủa.  Kết luận

NH

 Phản ứng tủa protein bằng phương pháp muối kết chỉ thực hiện được trong môi trường acid yếu hoặc kiềm yếu.

 Vì các muối kết protein không mất đi các tính chất vật lí, hóa học và sinh học đặc hiệu nên có thể dùng phản ứng tủa thuận nghịch này để chiết protein dưới dạng

QU Y

tinh khiết, điều chế những sản phẩm men, nội tiết tố.

III. KẾT TỦA KHÔNG THUẬN NGHỊCH PROTEIN 1. KẾT TỦA PROTEIN BẰNG ACID HỮU CƠ 1.1. Nguyên tắc

M

Sử dụng acid hữu cơ để làm tác nhân gây kết tủa không thuận nghịch ở protein.

KÈ

1.2. Cách tiến hành

+ 5 giọt

+ 5 giọt TCA 10%

Y DẠ

1ml protein trứng

sunfolsalisilic acid

20% Ống 1

Ống 2 6

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

L

1.3. Hiện tượng và giải thích

OF

FI CI A

1.3.1. Hiện tượng

Ống nghiệm 2: Xuất hiện kết tủa đục

ƠN

Ống nghiệm 1: Xuất hiện tủa đục.

nhưng với thời gian nhanh hơn và độ đục

NH

nhiều hơn so với ống 1.

1.3.2. Giải thích

 Khi cho các acid hữu cơ vào dung dịch protein trứng sẽ tạo nên môi trường acid

QU Y

yếu, có khả năng gây tủa. Vì sunfosalisilic acid có thể tủa protein, polypeptide và acid amin, còn trichloracetic acid chỉ có khả năng tủa protein → Sunfosalisilic acid là acid mạnh hơn TCA nên ở ống nghiệm 2 có thời gian kết tủa nhanh hơn và độ đục nhiều hơn so với ống nghiệm 1.  Lưu ý: Sau khi tác dụng với acid hữu cơ, protein đã kết tủa, biến tính và không thể

M

trở lại trạng thái ban đầu vì acid hữu cơ là tác nhân gây kết tủa không thuận nghịch.

KÈ

2. KẾT TỦA PROTEIN BẰNG MUỐI KIM LOẠI NẶNG 2.1. Nguyên tắc

 Sử dụng các ion kim loại nặng (hầu hết nằm trong nhóm chuyển tiếp) để tác dụng

Y

với protein gây kết tủa.

DẠ

 Thường những phản ứng này xảy ra cực kỳ nhanh chóng, vì thế có thể ứng dụng vào việc giải độc cho cơ thể khi nhiễm các kim loại nặng như chì (Pb), thủy ngân (Hg),…

Protein sữa, trứng thường được dùng để giải độc.

7

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

Muối kim loại nặng

Lần 1

Lần 2

Thứ tự xuất

FI CI A

Ống nghiệm

L

2.2. Cách tiến hành

hiện kết tủa

1

Nhỏ 1 giọt theo thành Cho

Pb(CH3COO)2 2%

lượng

3

2

1ml lòng

AgNO3 2%

ống, chờ đến khi xuất thừa để xem

4

3

trắng trứng

FeCl3 0,5%

hiện kết tủa.

1

CuSO4 2%

2

OF

4

tủa tan.

2.3. Hiện tượng và giải thích

ƠN

2.3.1. Hiện tượng

2

3

4

QU Y

NH

1

4 ống nghiệm chứa lòng trắng trứng

4 ống nghiệm sau khi cho muối kim loại nặng

 Ống 1: Xuất hiện kết tủa màu trắng đục, khi cho dư muối Pb(CH3COO)2 2% thì tủa tan từ từ.  Ống 2: Xuất hiện tủa màu trắng đục, khi cho dư muối AgNO3 2% thì tủa không tan và tách lớp.

M

 Ống 3: Xuất hiện kết tủa màu vàng nâu, khi cho một lượng dư muối FeCl3 0,5% thì tủa tan nhanh.

KÈ

 Ống 4: Xuất hiện kết tủa màu xanh nhạt, sau khi cho thêm muối CuSO4 2% thì kết tủa tan.

Nhận xét: Các muối kim loại nặng tác dụng với protein tạo các phức chất không tan trong nước nhưng tan trở lại khi có lượng muối dư tương ứng (trừ AgNO3).

Y

2.3.2. Giải thích

DẠ

 Các muối kim loại nặng khi tác dụng với protein sẽ tạo thành kết tủa do các ion kim loại nặng làm lộ các đầu kỵ nước của protein ra ngoài và biến tính protein sâu sắc, phá vỡ cấu trúc bậc 2, bậc 3 của protein.

8

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

L

 Khi cho thêm một lượng dư muối tương ứng sẽ dẫn đến dư thừa các ion kim loại

FI CI A

nặng → các phân tử keo hấp thụ các ion kim loại nặng trên bề mặt các tiểu phân tử protein làm chúng cùng tích điện dương (trở thành trạng thái tích điện) → kết tủa bị tan ra. Ion có hóa trị càng cao thì tủa càng dễ tan trở lại.

3. KẾT TỦA PROTEIN BẰNG NHIỆT 3.1. Nguyên tắc

OF

Sử dụng nhiệt độ và các chất cần thiết để tạo kết tủa từ protein, qua đó nhận thấy được nhiệt độ là một trong những nguyên nhân chính gây kết tủa.

3.2. Cách tiến hành Protein CH3COOH CH3COOH 1% 10% trứng

1 1 giọt

NH

2 2ml

3

NaOH 10%

ƠN

Ống nghiệm

NaCl bão hòa

5-8 giọt

4

Đun

2

sôi

Không Không

5-8 giọt

5-8 giọt

5-8 giọt

1

QU Y

5

Thứ tự xuất hiện kết tủa 3

3.3. Hiện tượng và giải thích

1

2

3

4

5

Y

KÈ

M

3.3.1. Hiện tượng

5 ống nghiệm sau khi cho dung dịch và đun sôi

DẠ

5 ống nghiệm chỉ chứa lòng trắng trứng

 Ống 1: Xuất hiện kết tủa màu trắng, khi ngừng đun thì không trở lại trạng thái ban đầu, thời gian xuất hiện kết tủa lâu hơn ống nghiệm 2 và 5.

9

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

L

 Ống 2: Xuất hiện tủa trắng đục, thời gian xuất hiện tủa nhanh hơn ống 1.

FI CI A

 Ống 3 và 4: Sau khi đun sôi không xuất hiện kết tủa.

 Ống 5: Xuất hiện kết tủa trắng đục, thời gian xuất hiện sớm nhất, khi ngừng đun thì không thấy trở lại trạng thái ban đầu.

Nhận xét: Nhiệt độ là tác nhân chính gây biến tính và gây kết tủa ở protein. Vì nhiệt độ là tác nhân gây kết tủa không thuận nghịch nên khi sử dụng tác nhân này nên cân nhắc kỹ. Để tránh làm

OF

biến tính protein trong thực phẩm, chúng ta có thể sử dụng các biện pháp xác định nhiệt độ gây biến tính protein.

3.3.2. Giải thích

ƠN

 Ống 1: Dưới tác động của nhiệt độ, mạch protein bị giãn nở, các liên kết thứ cấp bị phá vỡ, do đó protein bị vón cục không theo một quy luật nào tạo thành kết tủa.

NH

 Ống 2: Khi cho 1 giọt acetic acid 1% vào ống nghiệm sẽ tạo nên môi trường acid yếu. Nhóm (–COO)- bị ức chế sự phân ly nên tiểu phân tử protein mất điện tích, mất

QU Y

lớp áo nước bao quanh → kết tủa. pH của môi trường đạt gần tới điểm đẳng điện.

 Ống 3: Khi cho 5-8 giọt acetic acid 10% sẽ tạo nên môi trường acid mạnh. Do tính

M

háo nước của acid và môi trường acid mạnh có nhiều ion H+ nên protein bị khử nước. Các nhóm (–COO)- được trung hòa, còn các nhóm NH3+ không được trung

DẠ

Y

KÈ

hòa. Phân tử protein vẫn còn tích điện dương, do đó không tạo kết tủa.

10

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

L

 Ống 4: Khi thêm 2 giọt NaOH 10% sẽ tạo ra môi trường kiềm. Nhóm NH3+ của

FI CI A

protein được trung hòa bởi ion OH-. Vì vậy khi đun sôi điện tử âm của tiểu phân tử protein vẫn còn. Protein tích điện âm, do đó không tạo tủa.

 Ống 5: Khi cho 5 giọt acetic acid 1% và 2 giọt NaCl bão hòa sẽ tạo nên môi trường trung hòa về điện, từ đó tạo kết tủa.

3.3.3. Kết luận

OF

 Phần lớn protein bị đông tụ khi đun trong môi trường trung tính hay acid yếu.

 Trong môi trường kiềm mạnh, acid mạnh, protein còn tích điện nên không tạo tủa.  Protein dễ dàng tạo tủa khi pH môi trường đạt điểm đẳng điện.

ƠN

 Nồng độ muối và pH môi trường đóng vai trò quan trọng trong tạo tủa của protein.

IV. XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐẲNG ĐIỆN CỦA PROTEIN 1. Nguyên tắc

NH

Điểm đẳng điện của protein là ở đó protein bị kết tủa lại. Từ đó, chúng ta có thể xác định độ pH cần để gây kết tủa protein hoặc ngược lại. Dựa trên 1 thước đo pH đã xác định từ trước, việc xác định điểm đẳng điện có thể giúp protein tránh kết tủa hoặc ngược lại

QU Y

2. Cách tiến hành

Lấy 4 ống nghiệm sạch, khô. Cho vào mỗi ống nghiệm dung dịch Na2HPO4 0,2M và citric acid 0,1M theo bảng sau. Lắc đều rồi cho dung dịch albumin 1 % vào, thêm cồn, lắc nhẹ. Để yên trong 5 phút và ghi nhận hiện tượng xuất hiện.

3

pH

Albumin

EtOH (ml)

Độ đục⁕

0,1M (ml)

1% (ml)

0,50

1,50

3,2

1

1

3

0,68

1,32

3,7

1

1

2

0,96

1,04

4,7

1

1

1

1,32

0,68

5,7

1

1

4

Y

4

Citric acid

0,2M (ml)

KÈ

1 2

Na2HPO4

M

Ống nghiệm

⁕Thang độ đục: 1-trong nhất, 4-đục nhất.

DẠ

3. Hiện tượng và giải thích

3.1. Hiện tượng

11

Thực tập hóa sinh

1

3

4

ƠN

OF

2

FI CI A

L

Nguyễn Quỳnh Như

3.2. Giải thích

 Khi độ pH đạt đến điểm đẳng điện, tức là tổng số điện tích âm và tổng số điện tích

NH

dương của phân tử protein bằng 0, lúc đó, protein sẽ không thể dễ dàng di chuyển và kết tụ lại với nhau tạo kết tủa.

 Điểm đẳng điện của protein gần nhất với 4,7 do ở pH = 4,7 thì mức độ kết tủa của

QU Y

protein đạt lớn nhất.

V. ĐÔNG TỤ SỮA BẰNG PROTEASE 1. Nguyên tắc

Xác định hoạt động đông tụ sữa dựa vào thời gian cần thiết để làm đông tụ một thể tích dung dịch sữa có nồng độ xác định.

M

2. Cách tiến hành

KÈ

 Pha dung dịch sữa gầy 10% trong CaCl2 0,01M.  Lấy dứa (thịt,vỏ,lõi) vắt lấy nước, lọc hoặc ly tâm thu nước trong là dịch enzyme.  Cho 5ml dung dịch sữa vào ống nhiệm, để vào bể điều nhiệt đến khi đạt 50oC.

Y

 Cho một lượng dịch enzyme (khoảng 0,1 – 0,5ml), lắc đều. Tiếp tục giữ ở 50oC, ghi

DẠ

lại thời gian tạo thành kết tủa protein, tính từ lúc bắt đầu cho enzyme vào cho đến

lúc vừa xuất hiện những hạt sữa mịn nhỏ, hiện rõ trên nền đỏ của nhiệt kế (dung dịch enzyme cần được chuẩn bị sao cho thời gian đông tụ sữa khoảng 1 – 5 phút).

12

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

ƠN

OF

FI CI A

L

3. Hiện tượng và giải thích

NH

Hạt sữa nhỏ li ti trên nền đỏ nhiệt kế

Kết tủa trắng xuất hiện khi cho dịch enzyme vào dung dịch sữa và giữ ở 50oC.

QU Y

Giải thích: Protease động tụ sữa là một dạng protease có khả năng tấn công vào vị trí Phe(105)-Met(106) của kappa-casein làm lộ ra các đầu kỵ nước và dẫn tới hiện tượng động tụ.

M

4. Tính toán

Công thức tính: E =

𝑽𝒔ữ𝒂 (𝒎𝒍) 𝒙 𝑲 𝑻 (𝒔) 𝒙 𝑽𝒆𝒏𝒛𝒚𝒎𝒆 (𝒎𝒍)

KÈ

Protease được lấy từ thơm chứa enzym bromelin VS = 5ml 11 12

phút = 55 giây

Y

T=

𝑉𝑠ữ𝑎 𝑥 𝐾 𝑇 𝑥 𝑉𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚𝑒

DẠ

VE = 0,5ml

E=

K = 0,2

E = ? (ĐV/ml)

13

=

5 𝑥 0,2 55 𝑥 0,5

= 2,1818 (ĐV/ml)

L

FI CI A

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA DƯỢC

ƠN

OF

🙢✵🙠

QU Y

NH

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH BÀI 2. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME

GVHD: TS. Phạm Phước Điền Sinh viên: Nguyễn Quỳnh Như

DẠ

Y

KÈ

M

BÀI 4. KHẢO SÁT LIPID

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, THÁNG 08 NĂM 2021

Thực tập hóa sinh

BÀI 2. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME LY TRÍCH VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA α-AMYLASE MẦM LÚA

FI CI A

I.

L

Nguyễn Quỳnh Như

1. Ly trích Khoảng 100 hạt lúa nẩy mầm

NH

Lọc dịch bằng giấy lọc

QU Y

Thu dịch lọc có chứa amylase

ƠN

OF

Nghiền nhuyễn trong cối sứ với 50ml nước cất để hòa tan enzyme

2. Khảo sát hoạt tính tương đối của α-amylase mầm lúa

M

2.1. Tiến hành thí nghiệm và kết quả

KÈ

 Chuẩn bị 8 ống nghiệm như trong bảng dưới đây.  Ổn định nhiệt độ của bể điều nhiệt ở 50oC, sau đó cho các ống nghiệm từ 1 đến 4 vào ổn định 5 phút. Sau khi kết thúc thí nghiệm ống nghiệm 1, lấy ra khỏi bể điều

Y

nhiệt và đưa ống 5 vào. Làm tương tự với các ống nghiệm từ 6 đến 8.

DẠ

 Hút 1,6ml dịch enzyme ly trích được ở trên cho vào ống nghiệm 1, đồng thời ghi nhận thời điểm đó. Dùng pipet loại 1 ml khuấy nhẹ dung dịch và lấy ra 1 giọt để thử màu với iod. Khi màu của dung dịch iod không thay đổi thì sự thủy phân tinh bột được coi là kết thúc. Ghi lại thời điểm kết thúc.

2

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

Ống nghiệm Dung dịch

1

2

3

4

5

6

7

8

1

1

1

1

1

1

1

1

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2

2

2

2

2

2

2

cho vào Hồ tinh bột 1% (ml) Nước cất (ml)

Thể tích dịch enzyme (ml)

1,6

1,4

1,2

OF

Dung dịch đệm pH 5 (ml)

FI CI A

L

 Kết quả của các lần đo được ghi ở bảng sau:

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

Thời gian kết thúc thủy phân (s)

250

197

145

66

42

36

42

56

NH

Hoạt tính tương đối của enzyme amylase

250

QU Y

200

150

100

50

0

M

Thời gian kết thúc thủy phân (s)

300

ƠN

Để ổn định ở 50oC

KÈ

1,6

1,4

1,2

1

0,8

0,6

0,4

0,2

Thể tích enzyme (ml)

2.2. Nhận xét

DẠ

Y

Nhìn vào đồ thị ta thấy rằng:  Dịch chiết enzyme amylase thu được thường có họat tính xúc tác ít ổn định, hoạt tính thay đổi tùy theo điều kiện thí nghiệm và các yếu tố môi trường.

3

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

L

 Hoạt tính enzyme amylase ổn định nhất ở thể tích V = 1ml. Khi tăng dần thể tích

FI CI A

dịch enzyme trên 1ml (hay nồng độ enzyme tăng dần) thì thời gian kết thúc thủy phân tăng dần (hay tốc độ thủy phân giảm dần). Khi giảm dần thể tích enzyme dưới 1ml thì thời gian kết thúc thủy phân tăng chậm. Từ đó cho thấy nếu nồng độ enzyme quá cao hoặc quá thấp có thể dẫn đến giảm hoạt tính xúc tác của enzyme.

2.3. Hiện tượng cho màu tím đến tím đỏ cuối cùng là không màu.

2.4. Giải thích

OF

Những giọt đầu tác dụng với iod cho màu xanh đen, những giọt sau tác dụng với iod

ƠN

 Ban đầu, khi mới cho enzyme vào, tinh bột trong ống nghiệm chưa kịp bị thủy phân, nên khi tác dụng với iod cho ra màu xanh đen chính là tinh bột chưa thủy phân tác dụng với iod. Sau đó, enzyme xúc tác thúc đẩy nhanh quá trình thuỷ phân

NH

tinh bột tạo thành amylodextrin (cho màu tím với iod), tiếp tục thuỷ phân tạo thành erythrodextrin (cho màu tím đỏ với iod), tiếp tục tạo thành acrodextrin (không kết hợp với iod nên không cho màu) tiếp tục tạo thành maltodextrin (không kết hợp với iod) cuối cùng tạo thành maltose và glucose (không kết hợp với iod).

QU Y

 Trong hồ tinh bột ở nhiệt độ thường, phân tử tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó là dextrin tồn tại dưới dạng các chuỗi xoắn; cứ 6 phân tử glucose lập thành 1 bước xoắn có thể hấp phụ 1 phân tử iod làm cho dung dịch có màu. Màu này thay đổi tùy thuộc vào cấu trúc của phân tử tinh bột (tỉ lệ amylose/amylopectin) và

M

chiều dài của phân tử. Amylose cho màu xanh dương đậm với iod trong khi amylopectin lại cho màu tím đỏ với iod.

KÈ

II. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT LÊN TỐC ĐỘ THỦY GIẢI CỦA AMYLASE

1. Tiến hành thí nghiệm và kết quả

DẠ

Y

 Chuẩn bị thí nghiệm theo bảng dưới, tiến hành tương tự thí nghiệm đầu.  Kết quả các lần đo được ghi ở bảng sau:

4

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

Ống nghiệm

2

3

4

2

3

4

5

6

7

8

Hồ tinh bột 1% (ml)

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

Nước cất (ml)

1,6

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

166

131

92

Dung dịch đệm pH 5 (ml)

FI CI A

(mg/ml)

6

7

OF

Nồng độ tinh bột tương ứng

5

L

1

Dung dịch cho vào

2 ml

Để ổn định ở 50oC Thể tích enzyme (ml) Thời gian kết thúc thủy phân (s)

241

ƠN

1 ml

222

216

201

NH

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT ĐẾN TỐC ĐỘ THỦY PHÂN CỦA AMYLASE

200

150

222

216 201 166 131 92

M

100

241

QU Y

250

50

KÈ

Thời gian kết thúc thủy phân (s)

300

0

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

Hồ tinh bột 1% (ml)

Y

0,4

DẠ

2. Nhận xét  Khi tăng nồng độ cơ chất, thời gian kết thúc thủy phân giảm dần nghĩa là tốc độ phản ứng tăng dần.

5

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

L

 Khi tăng nồng độ cơ chất lên đến một giới hạn xác định nào đó, tốc độ phản ứng

FI CI A

đạt giá trị cực đại Vmax, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất lên nữa thì tốc độ phản ứng sẽ không tăng tiếp tục tăng.

3. Giải thích

 Trong quá trình tạo phức trung gian enzyme – cơ chất, do ảnh hưởng của enzyme, cơ chất được hoạt hóa, cấu tạo của cơ chất bị biến đổi, phân tử của cơ chất bị phân

OF

cực, các electron được phân phối lại, do đó điện tích của cơ chất cũng thay đổi.

Các liên kết bên trong phân tử cơ chất trở nên lỏng lẻo hơn, năng lượng họat hóa để vượt qua hàng rào năng lượng giảm, tốc độ phản ứng tăng lên.

ƠN

 Khi tốc độ phản ứng đạt giá trị cực đại nếu ta tiếp tục thêm cơ chất vào thì tốc độ sẽ không tăng nữa do tất cả các trung tâm hoạt động của enzyme đã được bão hòa bởi cơ chất.

NH

4. Kết luận

 Với cùng một lượng enzyme xác định, nếu tăng dần lượng cơ chất trong dung dịch thì thoạt đầu hoạt tính của enzyme tăng nhưng đến một lúc nào đó thì sự gia tăng về nồng độ cơ chất cũng không làm tăng hoạt tính enzyme. Đó là vì tất cả các trung

QU Y

tâm hoạt động của enzyme đã được bão hòa bởi cơ chất.  Tốc độ phản ứng của phần lớn các phản ứng biến đổi theo nồng độc của cơ chất và nồng độ enzyme. Khi tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng tăng chỉ khi nồng độ cơ chất tương đối thấp. Khi nồng độ cơ chất lớn tốc độ phản ứng ít phụ

M

thuộc vào nồng độ cơ chất và có khuynh hướng đạt cực đại do nồng độ enzyme có mặt quyết định.

KÈ

 Với một lượng cơ chất xác định, nồng độ enzyme càng cao thì tốc độ phản ứng xảy ra càng nhanh. Tế bào có thể điều hoà tốc độ chuyển hoá vật chất bằng việc

DẠ

Y

tăng giảm nồng độ enzyme trong tế bào.

6

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

TÍNH HÓA TAN CỦA LIPID 1. Tính hòa tan của mỡ trung tính 1.1. Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị 4 ống nghiệm như bảng sau: 1

2

Dầu thực vật

3 giọt

3 giọt

Dung môi

1 ml nước

1 ml Ethanol

Hóa chất

3

4

OF

Ống nghiệm

FI CI A

I.

L

BÀI 4. KHẢO SÁT LIPID

3 giọt

3 giọt

1 ml Acetone

1 ml Ether

ƠN

Lắc đều, so sánh kết quả trong ống nghiệm 1 với các ống nghiệm còn lại 5 phút

Đun cách thủy

KÈ

M

QU Y

NH

1.2. Hiện tượng

Ống 1: Dầu không tan trong nước, phân

Ống 3, 4: Lipid tan hoàn toàn trong

tách thành 2 lớp khác nhau, dầu ở trên,

dung môi và không có sự tách lớp.

Y

nước ở dưới.

DẠ

Ống 1: Dầu không tan trong ethanol, phân

tách thành 2 lớp khác nhau, dầu ở dưới,

ethanol ở lớp trên.

7

Thực tập hóa sinh

FI CI A

L

Nguyễn Quỳnh Như

Ống nghiệm 2 sau khi đun cách thủy thì

OF

một phần lipid tan ra.

1.3. Giải thích

ƠN

 Ống 1: Không tan, vì dầu thực vật là chất không phân cực, nước là dung môi phân cực mạnh nên lipid và nước không hỗn hòa vào nhau. Lớp dầu nổi lên trên mặt nước vì tỷ trọng của lipid nhỏ hơn tỷ trọng của nước.

NH

 Ống 2: Không tan, vì dầu thực vật là chất không phân cực, ethanol là dung môi phân cực nên dầu không thể tan trong ethanol. Lớp dầu chìm xuống đáy ống nghiệm vì tỷ trọng của lipid lớn hơn tỷ trọng của ethanol.

QU Y

 Ống 3: Dầu thực vật tan trong dung môi acetone vì cả dầu và acetone đều là chất không phân cực nên dễ dàng hòa tan vào nhau.  Ống 4: Dầu thực vật tan trong dung môi ether vì cả dầu và ether đều là chất không phân cực nên dầu thực vật dễ dàng tan trong ether.

M

2. Tính hòa tan của Lecithin 2.1. Tiến hành thí nghiệm

KÈ

 Dùng 2 ml lòng đỏ trứng đã đánh nhuyễn cho vào 1 ống nghiệm 25ml, thêm vào ống nghiệm 10ml cồn tuyệt đối, khuấy đều.

DẠ

Y

 Đun cách thủy ở nhiệt độ 75- 80oC, tiếp tục khuấy đều trong 10 phút.

 Lọc hỗn hợp trên qua ống nghiệm khô, dung dịch chiết tiến hành thí nghiệm sau:

8

Thực tập hóa sinh

Ống nghiệm

2

Dịch chiết

1 ml

Acetone

2 ml

Nước cất

-

FI CI A

1

1 ml -

2 ml

2.2. Hiện tượng và giải thích Giải thích

OF

Dung dịch

L

Nguyễn Quỳnh Như

ƠN

 Ống nghiệm 1 không đổi màu vì lecithin không tan trong acetone.

 Ống nghiệm 2 đổi màu là do lecithin tan

NH

trong nước cất dẫn đến sự chuyển màu

của dung dịch.

1

QU Y

Ống 1: Không đổi màu.

2

Ống 2: Có màu vàng đục nhẹ.

2.3. Kết luận

Do cấu tạo như trên nên lecithin trong nước sẽ tạo thành dung dịch gọi là dung dịch giả.

M

Nhờ đặc tính vừa kỵ nước vừa ưa nước mà phospholipid tham gia trong việc đảm bảo

KÈ

tính thấm một chiều trong mang cấu trúc tế bào.

II. CHỈ SỐ ACID CỦA LIPID 1. Tiến hành thí nghiệm  Cân 0,3 g chất béo cho vào bình tam giác 100 ml, thêm 10 ml ethylic ether (5 ml

Y

cồn 96% và 5 ml ether), lắc đều cho tan chất béo.

DẠ

 Cho 2-3 giọt phenolphtalein vào và chuẩn độ bằng KOH 0,01N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây.

9

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

FI CI A

Thể tích KOH 0,01N đã dùng là: V = 0,1 ml.

L

2. Tính toán kết quả mKOH = 0,1 𝑥 0,01 𝑥 56 = 0,056 (g).

Chỉ số acid là số miligam KOH cần để trung hòa acid béo tự do có trong 1g chất béo.

0,056 𝑥 1000 0,3

≈ 187

ƠN

OF

Chỉ số acid của lipid là: A =

III. ĐỊNH LƯỢNG THEO PHƯƠNG PHÁP SOXLET 1. Tiến hành thí nghiệm

cho lạc khỏi rơi vãi.

NH

Chuẩn bị mẫu để chiết rút mẫu: + Cân 1 g lạc khô cho vào cối sứ, nghiền nhỏ, chuyển qua bao giấy, gấp miệng bao quanh + Sấy lại bao đựng mẫu ở nhiệt độ 105oC trong 30 phút. Lấy ra để nguội trong bình hút

QU Y

ẩm, cân lại bao có chứa mẫu, xác định khối lượng bao mẫu.

Chuẩn bị mẫu trên máy Soxlet:

+ Đặt bình đun trên nồi cách thủy, lắp bình chiết khớp với miệng của bình đun, đặt bao đựng mẫu vào đáy bình chiết, lắp ống sinh hàn khớp với miệng của bình chiết, đặt phễu

M

thủy tinh lên miệng ống sinh hàn, lắp các ống cao su theo nguyên tắc bình thông nhau. + Mở máy nước để nước chảy vào hệ thống sinh hàn. Đổ dung môi hữu cơ (ether) qua

KÈ

phễu thủy tinh, sao cho lượng dung môi đủ ngập phễu và chiếm khoảng 2/3 dung tích bình đun.

Chiết rút mỡ trên máy Soxlet:

Y

+ Bật bếp cách thủy ở 45 – 50 oC, khi dung môi bắt đầu sôi mở kẹp ống cao su cho nước

DẠ

lạnh chạy vào hệ thống sinh hàn làm ngưng đọng hơi dung môi thành giọt xuống bình chiết chứa mẫu. + Cẩn thận điểu chỉnh kẹp cao su cho nước từ từ chảy ra ngoài.

10

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

L

+ Thời gian chiết khoảng 1,5 – 2 giờ, sau đó tháo bình chiết ra, hứng vài giọt ether trên

FI CI A

lam kính, hơ kính nếu lam kính trong suốt thì chứng tỏ mỡ trong nguyên liệu đã được chiết hết.

+ Tắt bếp cách thủy, khóa máy nước, tháo ống sinh hàn, dùng đũa thủy tinh gắp gói mẫu ra khỏi bình chiết.

+ Đặt trên đĩa petri, để nơi thoáng gió để dung môi bay hết. Sấy khô gói mẫu ở nhiệt độ

OF

105oC khoảng 30 phút, để nguội trong bình hút ẩm.

Cân, xác định khối lượng gói mẫu đã chiết rút lipid ở nhiệt độ khô tuyệt đối.

2. Tính toán kết quả

Hàm lượng lipid trong mẫu được tính theo công thức sau:

Trong đó

(𝒂 − 𝒃) 𝒙 𝟐𝟖, 𝟎𝟓 𝒄

ƠN

𝑿𝒑 =

NH

X: Hàm lượng lipid có trong nguyên liệu ở độ khô tuyệt đối. a (g): Khối lượng gói mẫu ở độ khô tuyệt đối. b (g): Khối lượng gói mẫu đã chiết rút ở độ khô tuyệt đối.

QU Y

c (g): Khối lượng mẫu đem phân tích.

Theo thực nghiệm ta được:

 Khối lượng mẫu khô đem đi nghiền là 1 g.  Khối lượng mẫu (bao gồm cả giấy bọc) sau khi sấy lại là 2,02 g.

Suy ra:

M

 Khối lượng sau khi chiết rút lipid (bao gồm giấy bọc) là 1,50 g.

KÈ

Xp =

(2,02−1,50) 𝑥 28,05 1

= 14,586

DẠ

Y

Vậy hàm lượng lipid có trong 1 g lạc khô là 14,586%.

11