Nombre del estudiante: David Angel Ortega. PT. MsC.
Instituto de Estudios Superiores de Ingeniería Educativa
Doctorado en: CIENCIAS DE LA INVESTIGACIÓN DE LA ACTIVIDAD FÍSICA Y DEL DEPORTE
Asignatura: Bases Fisiológicas y Genéticas
Nombre del profesor: DR. JAVIER EDUARDO ROJAS FIGUEROA MD. ETFRI. MSc. PhD.
Robert Philibert
Joanna Moody
Willem Philibert
Meeshanthini V. Dogan
Eric A. Hoffman
La enfermedad coronaria (EC) es la principal causa de muerte en el mundo, con más de 9 millones de personas que mueren anualmente por infarto de miocardio. Hasta el 90% de estas muertes pueden ser prevenibles. Sin embargo, para lograr este objetivo, son necesarios enfoques más escalables para reconocer y monitorear a aquellos en riesgo de EC para la intervención preventiva inicial y aquellos con EC actual para una terapia más intensiva.
Existen limitaciones significativas en utilización de enfoques de diagnóstico contemporáneos de EC para monitorear efectividad de las intervenciones, tanto de de vida como terapéuticas. Los métodos actualmente aceptados para diagnosticar la estable de la Asociación Americana
Corazón/Colegio Americano de Cardiología incluyen pruebas de esfuerzo de ejercicio electrocardiogramas (ECG), pruebas esfuerzo de ejercicio o farmacología ecocardiografía, imágenes de perfusión miocárdica, angiografía tomografía computarizada coronaria (CCTA) y angiografía coronaria.
La elección de qué prueba se emplea depende de una serie de factores, incluido el grado de sospecha clínica de EC, la capacidad de ejercicio, la probabilidad de experimentar eventos de alto riesgo y la disponibilidad de recursos de prueba.
Cada una de esas modalidades tiene limitaciones significativas que afectan su implementación clínica. Por ejemplo, el ECG de ejercicio es el método más utilizado y menos invasivo, pero tiene solo un 58 % de sensibilidad y un 62 % de especificidad. Las imágenes de perfusión tienen mejor sensibilidad (~87%) y especificidad (70%), pero requieren una infraestructura costosa, una interpretación especializada y requieren una exposición considerable a la radiación (15-35 milisieverts).
El método final es la angiografía coronaria, que muchos consideran el "estándar de oro" para la evaluación de la EC. Sin embargo, es invasivo, implica una exposición considerable a la radiación y a los tintes de contraste yodados, y es insensible a las formas no obstructivas de EC. Más importante aún, estas herramientas de diagnóstico no proporcionan información procesable para personalizar la atención al paciente y carecen de la capacidad de medir la efectividad de las intervenciones.
Por lo tanto, existe una necesidad considerable de métodos menos costosos e invasivos para evaluar el estado de la enfermedad de salud que también proporcionen información procesable que los proveedores de atención médica puedan aprovechar para adaptar, refinar y mejorar los planes de tratamiento para cada paciente de manera más efectiva.
Cardio Diagnostics ha introducido una prueba genético-epigenética guiada por inteligencia artificial (PrecisionCHD™) para evaluar la EC actual. La prueba utiliza un modelo de aprendizaje automático para interpretar la señal genéticamente contextual de seis ensayos de PCR digital (MSdPCR) sensibles a la metilación para determinar el estado de EC, con el área general bajo la curva, sensibilidad y valores de especificidad del 82 %, 79 % y 76 %, respectivamente. La prueba utiliza ADN de sangre entera y un método de laboratorio basado en PCR relativamente barato; por lo tanto, a diferencia de muchas de las pruebas de diagnóstico actuales, este nuevo enfoque de prueba de EC es inherentemente más escalable y compatible con las operaciones de la mayoría de los laboratorios clínicos.
Además, presenta dos ventajas potenciales distintas en comparación con los métodos actuales para evaluar la EC.
En primer lugar, debido a que los ensayos de MSdPCR miden cada uno la metilación del ADN en las vías involucradas en la patogénesis de la EC, permite a los médicos recopilar información específica del paciente sobre el estilo de vida potencialmente objetivo o los factores fisiológicos.
En segundo lugar, debido a que la metilación del ADN es dinámica, también puede ser posible utilizar la metilación del ADN para servir como un indicador del éxito de la terapia con EC.
La creación de métodos más escalables para evaluar el éxito de la terapia con EC podría tener un alto impacto clínico. La introducción de la métrica de hemoglobina
A1c (HbA1c) tanto para evaluar el estado de la enfermedad como para monitorear los efectos de la terapia diabética revolucionó el tratamiento de la diabetes. Sin embargo, a diferencia de la diabetes, no hay una sola vía cuyo estado se pueda medir para determinar el éxito de la terapia para la EC. Como resultado, los médicos se relegan a agregar mediciones separadas de factores de riesgo individuales, como la presión arterial alta, el colesterol elevado o el propio estado de HbA1c, para determinar la efectividad de la terapia para la EC.
Sin embargo, muchas de esas medidas, como la presión arterial y los niveles de colesterol, son relativamente imprecisas, pueden variar considerablemente de un día a otro y no son suficientes para abordar completamente la EC. Por lo tanto, una prueba más robusta, como el ensayo de HbA1c, que se utiliza para evaluar directa y con mayor precisión el estado de la enfermedad de enfermedad coronaria y la eficacia del tratamiento, sería un avance significativo.
Anteriormente, hemos demostrado que una de las tres medidas de MSdPCR contenidas en una prueba genéticaepigenética integrada para evaluar el riesgo de EC de 3 años cambió significativamente en función del tratamiento del tabaquismo. Dado que fumar es un factor clave de la EC y la terapia para dejar de fumar puede mejorar notablemente la supervivencia en fumadores con EC, esto sugiere que la metilación en uno de los más de los seis loci evaluados en la prueba Precision EC también puede responder a la terapia del tabaquismo.
39 sujetos que participaron en este estudio formaron parte de un programa de 90 días para dejar de fumar basado en incentivos
(National Clinical Trials
NCT02682147) cuyo propósito general era comprender la relación entre dejar de fumar y la inflamación pulmonar.
Después de proporcionar el consentimiento informado por escrito, cada participante fue inscrito en un protocolo que incluía una visita de admisión y tres visitas mensuales de seguimiento posteriores a los 30, 60 y 90 días después de la admisión. En cada una de estas visitas, se preguntó a cada uno de los sujetos sobre sus niveles actuales de tabaquismo y se les flebotomizó para proporcionar ADN para los análisis epigenéticos.
Debido a la preocupación de que los medicamentos para dejar de fumar puedan interferir con los estudios de imágenes pulmonares, se les indicó a los sujetos que no usaran medicamentos para dejar de fumar. Sin embargo, se les ofreció 400 USD por haber verificado bioquímicamente el abandono del tabaquismo en cada una de las tres visitas de seguimiento. Dejar de fumar puede tomar un curso variable y los autoinformes de fumar pueden no ser confiables; por lo tanto, la intensidad del tabaquismo en cada visita se evaluó utilizando medidas digitales de cg05575921, una medida generalmente aceptada de la intensidad del tabaquismo y el abandono del tabaco. En el momento de la preparación de la muestra, un total de 75 sujetos se habían inscrito en el estudio, con 39 asistiendo con éxito a las cuatro visitas a la clínica.
La determinación de la metilación del ADN en cg05575921 y los seis loci en la prueba PrecisionCHD (cg03725309, cg12586707, cg04988978, cg17901584, cg21161138 y cg12655112) se realizó utilizando reactivos digitales de PCR de gota universal y equipos obtenidos de Bio-Rad (Hércules, CA, EE. UU.). 1 µg de ADN se convirtió en bisulfito utilizando un kit de bisulfito Qiagen EpiTect (Hilden, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con el ADN modificado que luego se eluyó en 70 µL de tampón tris. Luego se realizaron catorce ciclos de amplificación de PCR de alta stringencia de la región diana en una alicuota de 3 µL de cada muestra de ADN convertida en bisulfito utilizando un conjunto de cebadores patentados específicos de amplicón. Luego, se diluyó una alicuota de la solución diana de amplicón enriquecida 1:1500, se mezcló con imprimación y sondas específicas para los loci objetivo y los reactivos de PCR digitales de gotitas, se particionó en gotitas con un generador de gotitas Bio-Rad, y luego se amplificó la PCR. A continuación, se determinó la metilación fraccional (CpG/metilado/(CpG metilado + desmetilación)) de cada muestra utilizando un lector Bio-Rad QX-200 y su software BioRad QuantaSoft™ que lo acompaña. Los resultados de todos los estándares de prueba de metilación de bisulfito estaban dentro de sus rangos calibrados.
En general, los sujetos tendían a ser blancos, de unos 40 años, y hombres (22 de 39, o 56%). Los sujetos tendían a ser fumadores empedernidos, con el sujeto promedio fumando 17 cigarrillos por día durante el mes anterior a la ingesta del estudio y habiendo tenido previamente 28 paquetesaños de consumo total de cigarrillos.
La cotinina sérica promedio en el momento de la ingesta fue de 278 ng/mL, con una puntuación promedio de la prueba de Fagerstrom para la dependencia de la nicotina de 3,7 ± 9,7. En particular, el valor promedio de metilación de cg05575921, una medida generalmente aceptada de la intensidad del tabaquismo, fue del 52,3% en la ingesta.
En general, aquellos con niveles negativos de cotinina en las tres visitas redujeron la intensidad del tabaquismo más que aquellos con una o más pruebas de cotinina positivas (∆cg05575921; 7,1% ± 6,2 vs. -2,5% ± 5,4; p < 0,02), pero ambos grupos tuvieron disminuciones en la ingesta autoinformada y aumentos en la metilación general cg05575921.
Crear métodos mejores y más escalables para evaluar la eficacia de las intervenciones de EC puede ser un paso importante para aumentar la eficacia del tratamiento de EC. En ese sentido, nuestra demostración de que cinco de los seis loci de la prueba PrecisionEC muestran cambios significativos en respuesta a un curso de 90 días de dejar de fumar es un primer paso prometedor. Una de las limitaciones de este estudio es el tamaño relativamente pequeño de la muestra y la cohorte es casi exclusivamente blanca. Además, solo analizamos una intervención relacionada con la EC: dejar de fumar.
La compleja dinámica de la respuesta metilómica a la terapia exitosa de EC detallada en este manuscrito refleja la complejidad de las vías interrogadas por la prueba. Los seis loci CpG dirigidos por la prueba PrecisionEC evalúan seis vías moleculares diferentes que moderan la vulnerabilidad a la EC.
El sitio CpG en la primera vía, que es evaluado por el ensayo cg03725309 MSdPCR, se asigna a un elemento regulador cis candidato en el intron 1 del gen seril-ARNt sintatasa 1 (SARS1).
La desmetilación en este lugar está asociada con la obesidad, la calcificación de la arteria coronaria y el síndrome cardiometabólico.
El sitio CpG en la segunda vía, medido por el ensayo cg12586707 MSdPCR, se encuentra en un elemento regulador cis candidato aproximadamente 1,5 kb aguas abajo del 5' UTR del gen CXCL1.
CXCL1 es un miembro clave de un grupo de mensajeros quimiotácticos involucrados en la patogénesis de una serie de trastornos inflamatorios, como la CHD, y tiene un papel importante en la regulación de la angiogénesis y la remodelación cardíaca.
El sitio de CpG en la tercera vía, que se evalúa mediante el ensayo cg04988978 MSdPCR, se asigna al área promotora aguas arriba de la mieloperoxidasa (MPO), que se ha demostrado que contribuye a la aterosclerosis por la oxidación de LDL.
El sitio de CpG en la cuarta vía, que se evalúa mediante el ensayo cg17901584 MSdPCR, se encuentra en un intron de la transcripción divergente de la reductasa de 24dehidrocolesterol (DHCR24-DT), un gen largo de ARN no codificante (ARNlnc) que está en una configuración divergente (cabeza a cabeza) con DHCR24, un gen clave en la biosíntesis del colesterol.
El CpG dirigido por el ensayo
cg21161138 MSdPCR se asigna al represor del receptor de hidrocarburos de aril (AHRR) 267 kb distal a cg05575921. Al igual que cg05575921, este marcador evalúa la actividad en la vía xenobiótica que es esencial para desintoxicar los hidrocarburos poliaromáticos que se encuentran en el humo.
Finalmente, el sexto ensayo, cg12655112,
mide la metilación en una región reguladora
del primer intron del gen EH Domain
Containing 4 (EHD4). La metilación de EHD4 en este sitio se ha asociado negativamente con los niveles de glucosa sérica, mientras que la expresión de EHD4 predice el éxito de los trasplantes de islotes pancreáticos.
Para los médicos familiarizados con los procesos psicosociales involucrados en dejar de fumar, el hallazgo de que la metilación en cinco de las seis vías interrogadas por los ensayos de MSdPCR comienza a volver a la línea de base después de solo 90 días de terapia no es sorprendente. Para reducir o dejar de fumar, los pacientes a menudo hacen cambios radicales en su estilo de vida para evitar estímulos, como bares o amigos que fuman, que pueden desencadenar la necesidad de fumar. A menudo, estos cambios van acompañados de mejoras en la dieta y los patrones de ejercicio y disminuciones en el consumo de alcohol.
Existieron cambios significativos en la metilación del ADN en cinco de los seis loci medidos en la prueba PrecisionEC descrita recientemente para la evaluación de la EC actual. Sugerimos que otros estudios para comprender la respuesta metilómica al tratamiento de la EC pueden conducir a métodos mejorados para guiar el tratamiento de la EC.
Philibert, R., Moody, J., Philibert, W., Dogan, M. V., & Hoffman, E. A. (2023). The reversion of the epigenetic signature of coronary heart disease in response to smoking cessation. Genes, 14(6), 1233.