celular, pueden emplearse extractos celulares con ADN no purificado. La cantidad de ADN inicial puede ser ínfima; la técnica funciona incluso partiendo de una sola molécula de ADN inicial. -Nucleótidos de ADN libres con las distintas cuatro bases alternativas. Estos son los bloques de construcción....................... -Enzima ADN polimerasa para mediar o catalizar la síntesis del ADN. Permite el crecimiento de la banda de ADN que está siendo sintetizada mediante la unión de nuevos nucleótidos. -El cebador: En la técnica de PCR se emplean en realidad un par de cebadores que resulten complementarios a dos regiones del ADN que se encuentran a ambos lados flanqueando el fragmento de interés. Cada uno de los dos cebadores se une a una de las dos bandas del ADN. Estos cebadores ( primers u oligómeros) son fragmentos de ARN de unos 20 nucleótidos de largo, que son previamente sintetizados de forma artificial, incorporando uno por uno los nucleótidos en la secuencia deseada.
algunas decenas de nucleótidos. Los nucleótidos del cebador son complementarios a los del extremo de la banda molde. Este pequeño fragmento ceba o permite el arranque de la síntesis de la nueva banda de ADN. En la célula el cebador es sintetizado por una polimerasa de ARN. La ADN polimerasa permite la unión consecutiva de nucleótidos al cebador, haciéndolo crecer; los nucleótidos incorporados son complementarios a los de la banda molde. La ADN polimerasa continúa incorporando nucleótidos hasta llegar al último nucleótido de la banda molde. De esta forma se sintetiza una molécula completa, es decir, un ADN doble banda. Clonación de un Fragmento de ADN: Para poder estudiar un fragmento determinado de ADN es preciso obtener múltiples copias o clones del mismo, que luego pueden ser descritos, modificados e incluso visualizados mediante técnicas específicas. En las décadas de 1960 y 1970, se trabajó arduamente en la descripción del ADN. Las técnicas empleadas en esa época exigían gran dedicación y tiempo. Se extraía el ADN de interés a partir de células; se cortaba con proteínas especiales (enzimas endonucleasas); se introducía en pequeñas moléculas de ADN bacteriano circular que luego eran reincorporadas a las bacterias; se permitía a estas bacterias con ADN insertado reproducirse para obtener múltiples copias del ADN de interés; se aislaba el ADN bacteriano y se recuperaba el fragmento insertado empleando enzimas. Así, luego de semanas de trabajo, finalmente se obtenían múltiples clones de un fragmento de ADN.
Tanto el poder de la técnica de PCR como una de sus principales limitaciones, vienen dados en gran medida por el rol de los cebadores en la reacción. Para poder amplificar un fragmento específico de ADN, es preciso conocer la secuencia, si no de todo el fragmento, al menos de pequeñas secuencias flanqueadoras del mismo. Esta información es necesaria para el diseño de los cebadores. En especies de seres vivos cuyo ADN ha sido poco estudiado y para las que se conocen pocas secuencias, puede usarse PCR en el estudio de ADN altamente conservado, recurriendo a secuencias conocidas en especies cercanas.
En 1983, el bioquímico Kary Mullis, quien estudiaba la secuencia de nucleótidos del ADN, diseñó una ingeniosa y práctica técnica que permitía la clonación de fragmentos de ADN in vitro (fuera de organismos vivos, en tubos de ensayo). Esta técnica, llamada Reacción en Cadena de la Polimerasa o (PCR), fue incorporada de inmediato en los laboratorios genéticos y sigue siendo empleada hoy día para los más diversos fines.
Si se emplean las condiciones adecuadas (principalmente de temperatura) los cebadores se unirán mediante puentes de hidrógeno a su correspondiente banda de ADN molde, exclusivamente en donde encuentren una complementariedad perfecta. Es decir cada cebador, buscará en la enorme cantidad de ADN celular, aquella región con la que es del todo complementario, nucleótido a nucleótido y se unirá exclusivamente allí.
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): Ésta es una técnica de clonación de ADN in vitro , que permite en unas cuantas horas, obtener a partir de un(os) fragmento(s) de ADN, más de 100.000 millones de clones o copias idénticas del fragmento inicial.
El número de nucleótidos con los que se construye un cebador para PCR (al menos 20), no es un capricho. Exceptuando las regiones de ADN repetitivo, si se toma cualquier secuencia de ADN de al menos 20 nucleótidos de longitud, resultará en la grandísima mayoría de los casos, que es una secuencia única dentro del universo del ADN celular o genoma. En consecuencia si se busca la complementariedad perfecta de un cebador de 20 nucleótidos (o más), dicho cebador con altísima probabilidad se unirá de forma exclusiva en una única ubicación del genoma, aquella que está junto a la secuencia que quiere ser amplificada. Al crecer el cebador por la incorporación de los nucleótidos complementarios, se estará copiando el fragmento de interés..........
Esta técnica se basa en las propiedades de la molécula de ADN y en el mecanismo de síntesis del ADN utilizado por la misma célula. Elementos Indispensables para el PCR: -El fragmento de ADN ha ser clonado o amplificado: Esta técnica permite emplear el ADN celular completo en el que se encuentra contenido el fragmento de interés. No es necesario aislar dicho fragmento e incluso tampoco es indispensable aislar el ADN
20