Nghiên cứu trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc la mã (Matricaria chamomilla)

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA - VŨNG TÀU BÁO CÁO ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU TRÍCH LY THÀNH PHẦN DƯỢC LIỆU TỪ HOA CÚC LA MÃ (Matricaria chamomilla) Chủ nhiệm đề tài: TS. Đặng Thu Thủy (chủ nhiệm) KS. Nguyễn Văn Toàn Bà Rịa-Vũng Tàu, tháng 11 năm 2020 https://skkn.net/

i THÔNG TIN CHUNG CỦA ĐỀ TÀI Tên đề tài: “Nghiên cứu trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã Matricaria chamomilla” Chủ nhiệm đề tài: TS. Đặng Thu Thủy Danh sách cán bộ tham gia chính: KS. Nguyễn Văn Toàn Nội dung chính: Nghiên cứu phương pháp chiết tách thành phần dược liệu trong hoa cúc La Mã; Xác định định tính và định lượng nhóm hợp chất hoạt động sinh học của hoa cúc La Mã;Khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất trích ly được. Kết quả đạt được: Đã xác định được thông số tối ưu cho quá trình trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã; Đã xác định định tính thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã và định lượng thành phần dược liệu chính trong hoa cúc La mã; Đã khảo sát hoạt tính sinh học của thành phần dược liệu trích ly được. Đã hướng dẫn luận văn tốt nghiệp 03 sinh viên. Thời gian nghiên cứu: 10 tháng từ tháng 01/2020 10/2020 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI TS. Đặng Thu Thủy https://skkn.net/

ii MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........4 1.1. Đặc điểm của hoa cúc La Mã...................................................................................4 1.2. Thành phần dược liệu của hoa cúc La Mã 4 1.3. Tác dụng của hoa cúc La Mã....................................................................................8 1.4. Phương pháp chiết tách thành phần hoạt tính sinh học từ hoa cúc La Mã 9 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................11 2.1. Đối tượng nghiên cứu .........................11 2.2. Bố trí thí nghiệm.....................................................................................................11 2.3. Phương pháp nghiên cứu .............11 2.3.1. Nghiên cứu tối ưu hóa hiệu suất chiết cao cồn bằng phương pháp chưng ninh ..11 2.3.2 Chiết tách thành phần dược liệu bằng phương pháp chưng ninh.......13 2.3.3. Chiết cao cồn bằng phương pháp ngấm kiệt...............................................14 2.3.4. Chiết cao cồn bằng phương pháp Soxhlet.................................................14 2.3.5 Chiết tách thành phần dược liệu qua hai giai đoạn: Soxhlet và chưng 3.1.CHƯƠNGM2.3.kh2.2.3.2.3.2ninh.......................................................................................................................15.3.6.Phươngphápchiếttáchcaoetylacetatvàcaoetedầuhỏatừcaocồn.......167.Phươngphápđịnhtínhcácthànhphầncủadượcliệu................................178.Địnhlượngthànhphầndượcliêu(flavonoid)tổngtrongcaoetylacetat...183.9.Xácđịnhthànhphầndượcliệu(flavonoid)bằngsắckýlỏngcaoápghépốiphổ................................................................................................................1810.Thửhoạttínhsinhhọcthànhphầndượcliệu(flavonoid)từhoacúcLaã………………………………………………………….193.KẾTQUẢVÀTHẢOLUẬN................................................................21Nghiêncứuchiếttáchcaocồn................................................................................213.1.1.Nghiêncứutốiứuhoahiệusuấttáchchiếtcaocồnbằngphươngphápchưngninh............................................................................................................213.1.2.Sosánhhiệusuấtchiếtcaoetanolbằngphươngphápchưngninh,ngấmkiệt,Soxhlet……………………………………………………………………..243.1.3.Sosánhhiệusuấtchiếttáchcaoetanolbằngphươngphápchưngninhvà https://skkn.net/

3.2.

(flavonoid) từ hoa cúc La Mã………………………………………...27 3.4.1. Định lượng thành phần flavonoid trong cao etyl acetat…………………..27 3.4.2. Thành phần các hợp chất flavonoid………………………………………28 3.4.3. Hoạt tính sinh học của flavonoid…………………………………………29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................................31 TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................32 PHỤ LỤC https://skkn.net/

3.4.

3.3.

iii Soxhlet chưng ninh……………………………………………………………..25 So sánh hiệu suất chiết tách cao etyl acetat và cao ete dầu hỏa…………………25 Định tính thành phần dược liệu trong cao chiết thu được từ hoa cúc La Mã……26 3.3.1 Định tính thành phần dược liệu trong cao ete dầu hỏa……………………26 3.3.2. Định tính thành phần trong cao etyl acetate……………………………...27 Kết quả xác định hàm lượng, thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của thành phần dược liệu

Hình 1.1. Cây hoa Cúc La Mã Hình 2.1. Sơ đồ bố trí nội dung thí nghiệm.

Hình 2.4. Sơ đồ khảo sát chiết cao cồn bằng phương pháp ngấm kiệt.

Hình 2.5. Sơ đồ khảo sát tách chiết hợp chất trong hoa cúc La Mã bằng phương pháp HSoxhlet.ình2.6. Sơ đồ khảo sát chiết tách thành phần dược liệu qua hai giai đoạn Soxhlet và chưng ninh. Hình 2.7. Sơ đồ chiết cao etyl acetat và ete dầu hỏa. Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi lên mật độ quang. Hình 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên mật độ quang. Hình 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dược liệu/dung môi lên mật độ quang. Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian lên mật độ quang. Hình 3.5. Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo Catechin. https://skkn.net/

Hình 2.2. Quy trình chiết tách dược liệu bằng phương pháp chưng ninh Hình 2.3. Sơ đồ khảo sát chiết cao cồn bằng phương pháp chưng ninh.

iv DANH MỤC HÌNH

Bảng 1.2. Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao trong flavonoid.

Bảng 1.3. Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao trong coumarine Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung môi. Bảng 3.2. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nhiệt độ Bảng 3.3. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào tỷ lệ dược liệu/dung môi. Bảng 3.4. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào thời gian Bảng 3.5. Hiệu suất chiết cao cồn theo 3 phương pháp chưng ninh, ngấm kiệt, Soxhlet. Bảng 3.6. Hiệu suất chiết cao cồn bằng phương pháp chưng ninh và Soxhlet chưng Bninh.ảng 3.7. Hiệu suất chiết cao etyl acetat và cao ete dầu hỏa Bảng 3.8. Kết quả định tính thành phần dược liệu trong cao ete. Bảng 3.9. Kết quả định tính thành phần dược liệu trong cao etyl acetate. Bảng 3.10. Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất đối chiếu là catechin. Bảng 3.11. Hiệu suất flanovoid toàn phần. Bảng 3.12. Công thức cấu tạo và định danh một số chất Bảng 3.13. Khả năng kháng khuẩn của flanonoid với vi khuẩn. https://skkn.net/

Bảng 1.1. Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao trong tinh dầu hoa cúc La Mã.

v DANH MỤC BẢNG

vi https://skkn.net/

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Chamomile (Cúc La Mã) hay ở nước ta còn gọi là Cúc Hoạ Mi là một trong những loài thực vật thuộc họ Hoa Cúc có nguồn gốc từ Nam và Đông Âu. Loại thảo dược này cũng được trồng ở Đức, Hungary, Pháp, Nga, Croatia, và Brazil. Chamomile được biết đến ở Ấn Độ trong thời kỳ Mughal, bây giờ nó được trồng ở Punjab, Uttar Pradesh, Maharashtra, Jammu và Kashmir. Các loài thực vật có thể được tìm thấy ở Bắc Phi, châu Á, Bắc và Nam Mỹ, Australia, và New Zealand. Hungary là nơi trồng chính của loại thực vật này. Tại Hungary, Chamomile cũng mọc nhiều ở vùng đất nghèo và nó là một nguồn thu nhập cho người dân nghèo của khu vực này. Hoa được xuất khẩu sang Đức với số lượng lớn để chưng cất tinh dầu. Tại Ấn Độ, cây đã được trồng ở Lucknow khoảng 200 năm trước, và được đưa đến Punjab khoảng 300 năm trước trong thời kỳ Mughal [6]. Các tác dụng chữa bệnh của Chamomile được loài người phát hiện ra cách đây hàng ngàn năm từ thời La Mã cổ đại, và cũng đã được ghi nhận trong y văn của Hippocrate. Người Hy lạp và La Mã cổ đại đã biết dùng Chamomile để chữa bệnh bằng cách: giã nhỏ đắp hoặc chườm lên các vết thương, vết loét ngoài da giúp phòng nhiễm khuẩn, giảm đau, nhanh liền sẹo; hoặc hãm hay sắc lấy nước uống chữa viêm loét miệng, sưng lợi , đau răng, đau bụng (do tiêu hoá, do kinh nguyệt, …), đau đầu, mất ngủ, căng thẳng, … Hoa cúc La Mã từ lâu đã được người Ai Cập cổ xem là một phương thuốc trị bách bệnh. Trà của loại dược thảo quý này đã được sử dụng hàng trăm năm qua với nhiều lợi ích tuyệt vời đối với sức khỏe. Nó có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tán phong thấp, giáng hỏa,được dùng làm thuốc chữa nhức đầu, chóng mặt, đau mắt, tăng huyết áp (có thể dùng xoa bóp lên thái dương, vùng trán, gáy, hay cho thêm vào nước uống hàng ngày) [18].

Trong y học khoa học hiện đại, hoa cúc được hãm hoặc đun sôi lấy nước, và tinh dầu. Hoa cúc La Mã được sử dụng trong thuốc điều điều trị nội và ngoại khoa. Nước hãm từ hoa cúc có tác dụng chống viêm, cầm máu, sát trùng, làm se, giảm đau, an thần, chống co thắt, ra mồ hôi, điều tiết tác động của mật. Số lượng của các hợp chất phenolic được tìm thấy trong hoa cúc được chứng minh hiệu quả lâm sàng trong điều trị sưng phổi, có tác dụng bảo vệ màng tế bào mạch máu. Các chế phẩm hoa cúc được sử dụng trong điều trị nội khoa như đổ mồ hôi, rối loạn co thắt kinh nguyệt, đau bụng, đầy hơi, tiêu chảy, viêm dạ dày, viêm đại tràng; điều trị ngoại khoa như nước súc miệng, họng và cổ họng. Thuốc sắc từ hoa cúc cũng được sử dụng để rửa vết thương mưng mủ và mắt. Chamazulene trong hoa cúc được sử dụng để điều trị bệnh hen suyễn, thấp khớp, viêm dạ dày dị ứng và viêm đại tràng, eczema, bỏng bởi X quang. Chamazulene thúc đẩy quá trình tái tạo da, làm giảm các phản ứng dị ứng [18]. Tinh dầu hoa cúc được sử dụng trong hương trị liệu cho chứng mất ngủ, đau nửa đầu, viêm da, cũng như bỏng và eczema. Tinh dầu cũng hoa cúc được khuyến https://skkn.net/

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng. Tuy nhiên hiện nay nguồn tài nguyên cây thuốc không còn nguyên vẹn nữa. Hiện nay, theo thống kê mới nhất của Viện Dược liệu (2007), có 144 loài cây thuốc thuộc diện quý hiếm có nguy cơ bị tuyệt chủng cần được bảo tồn. Trong số đó có rất nhiều loài cây thuốc quí như Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis), Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus), Tam thất hoang (P. stipuleanatus), các loài Hoàng liên (Berberis spp.), Bách hợp (Lilium brownii), Biến hóa núi cao (Asarum balansae), Thanh mộc hương (Aristolochia tuberosa), Ba kích (Morinda officinalis), Đảng sâm (Codonopsis javanica)… Chính vì vậy, việc tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên “mới” có hoạt tính sinh học cao, có khả năng nhân rộng ở quy mô công nghiệp để làm thuốc là một xu thế được rất nhiều các nhà khoa học quan tâm. Hoa cúc La Mã được du nhập vào Việt Nam ở thời gian gần đây chủ yếu qua đường tiểu ngạch và được bán rải rác ở những hiệu thuốc, cửa hàng mỹ phẩm. Sản phẩm chính của hoa cúc được một số nhà phân phối cung cấp là tinh dầu và trà hoa cúc với giá cao. Ngoài ra cúc La Mã mọc ở rất nhiều nơi ở Việt Nam, đặc biệt là ở những vùng khí hậu mát mẻ như Tây Nguyên và Đà Lạt. Tuy nhiên việc sự dụng loại dược liệu này còn rất nhiều e ngại trong tâm lý người tiêu dùng do chưa có một nghiên cứu chính thức một cách khoa học và có hệ thống được công bố trong nước về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của loại hoa này.

Chiết xuất hoa cúc đối với da có tác dụng chống viêm, chống dị ứng, làm dịu, giảm đau, giữ ẩm, tái tạo, làm dịu và chữa lành. Chính vì thế nó là một phần của các sản phẩm mỹ phẩm cho da nhạy cảm.

2 khích sử dụng để điều trị cho bệnh hen suyễn, viêm phế quản, ho, cảm cúm, viêm bàng quang. Mùi tinh dầu hoa cúc có đặc điểm như sau: hơi đắng, ấm và nặng mùi. Mùi tinh dầu hoa cúc có tác dụng an thần. Mùi tinh dầu còn có tác dụng làm giảm đau đầu, cơ bắp, cải thiện hoạt động của não với tinh thần mệt mỏi, làm giảm kích ứng và làm dịu những cơn bộc phát Trong lĩnh vực hương trị liệu, tinh dầu hoa cúc được khuyên dùng pha loãng trong nước dùng cho bệnh đau trong ruột; pha trong trà khác khi bị co giật; pha trong nước với mật ong khi bị kích thích thần kinh. Khi trầm cảm nhà hương trị liệu chuyên nghiệp Joan Redford khuyến cáo rằng, nên sử dụng dầu hoa cúc trong xông hơi hoặc nhỏ vào trong bồn tắm. Hoa cúc sấy khô được bỏ chiếc gối thảo dược thơm, thúc đẩy thư giãn cơ bắp. Tinh dầu hoa cúc có thể giúp ngăn ngừa các phản ứng dị ứng sau khi bị côn trùng cắn, hay làm giảm vết bầm tím. Dưỡng thể với tinh dầu hoa cúc được sử dụng đối với vết bỏng, bong gân, và da bị cháy nắng. Nếu bị kích ứng da ở trẻ sơ sinh có thể áp dụng mát xa, hoặc tắm với tinh dầu hoa cúc [18].

Cúc La Mã một trong những dược liệu được tiêu thụ nhiều nhất trong y học Vào năm 1986, cúc La Mã là nguyên liệu được khuyên dùng làm thuốc tại 26 quốc gia. Tổng sản lượng hoa cúc khô trên toàn thế giới năm 2007 lên đến 65000 tấn.

Chính vì vậy việc “Nghiên cứu trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã https://skkn.net/

Matricaria chamomile” để phổ biến rộng rãi loại dược liệu này trong nước là cấp thiết. Để đạt được mục tiêu trên, nghiên cứu cần thực hiện những nội dung như sau: Thu thập, nghiên cứu tài liệu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hoa cúc La Mã, cũng như tình hình sử dụng loại dược liệu này trên thế giới và trong nước; Nghiên cứu phương pháp chiết tách thành phần dược liệu trong hoa cúc La Mã; Xác định định tính và định lượng nhóm hợp chất hoạt động sinh học của hoa cúc La Mã;Khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất trích ly được. https://skkn.net/

3

4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặc điểm của hoa cúc La Mã Hoa cúc La Mã (Matricaria chamomile hay còn gọi là Roman Chamomile) là cây thảo dược lâu năm với rễ chùm, phát triển theo chiều ngang, số lượng rễ lớn do vậy khả năng hút nước và dinh dưỡng mạnh. Thân mọc đứng gần mặt đất và phân nhánh, lá kép dài và hẹp với các đoạn hình dải nhọn như gai, cụm hoa hình đầu nằm ở ngọn các cuống mảnh, đường kính của đầu hoa là 10 30 mm,với một vòng đơn các cánh hoa hình lưỡi trắng và ở giữa rất nhiều hoa con hình ống màu vàng xếp trên mặt đế hoa phồng lên tạo dạng nón sau khi hoa nở [4], [5]. Đặc điểm hình thái của hoa cúc La Mã được thể hiện ở hình 1.1. Hình 1.1. Cây hoa Cúc La Mã 1.2. Thành phần dược liệu của hoa cúc La Mã Theo kết quả nghiên cứu trước đây( [6], [7], [8], [15]) thì thành phần các hợp chất có trong hoa cúc La Mã rất đa dạng. Tùy thuộc vào điều kiện sinh trưởng và phát triển mà tỷ lệ các hợp chất trong hoa cúc La Mã ở mỗi vùng miền khác nhau. Qua các nghiên cứu cho thấy phần lớn các hợp chất có trong hoa cúc La Mã chủ yếu bao gồm các tinh dầu dễ bay hơi, các flanovoid, coumarin, các polyphenol khác, đường,…. a) Tinh dầu dễ bay hơi Về thành phần tinh dầu dễ bay hơi, hoa cúc La Mã có chứa khoảng 0,6-2,4 % tinh dầu dễ bay hơi. Thành phần hợp chất của tinh dầu khá phức tạp và cho đến nay có hơn 140 hợp chất đã được xác định chủ yếu là các dẫn chất của monoterpen, https://skkn.net/

Một nghiên cứu khác nữa cho thấy trong tinh dầu hoa Cúc La Mã chứa các sesquiterpene chính là Chamazulene (19,9 %), α-Bisabolol (20,9 %), A và B Bisabolol oxide (tương ứng là 21,6 % và 1,2 %), β farnesen (3,1 %), α và β caryophyllene, caryophyllene oxide và spathulenol, một số monoterpene như β phellandrene (0,8 %), limonene (0,8 %), β ocymene (0,4%) và γ terpinen (0,2 %) [16]. Các thành phần chiếm tỉ lệ cao trong tinh dầu hoa cúc La Mã có công thức cấu tạo như bảng 1.1. Bảng 1.1. Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao trong tinh dầu hoa cúc La Mã. Tên hợp chất Công thức cấu tạo n butyl angelate n butyl tigliate 1,8 Cineole β Myrcene α Pinene https://skkn.net/

5 sesquiterpen, các chất có nhân thơm, dẫn chất có chứa N, S. Các thành phần chính của hợp chất có trong tinh dầu dễ bay hơi của hoa cúc La Mã là: 25,85-36 % iso-butyl angelate; 10,9-23,7 % iso-amyl iso-butyrate; 11,7-19,9 % iso amyl tigliate; 12 % propyl tigliate; 5,3 17,9 % iso amyl angelate và 3,7 5,3 % iso butyl iso butyrate.Hơn nữa, tinh dầu có chứa đến 4% monoterpene: như α và β pinen, β-myrcene, limonene, γ-terpinene, p-xymen, camphene, (-) - pinocarvone và (-)trans pinocarveol; và 1,54 % dẫn xuất của sesquiterepene bao gồm:β selinene, α và β cubene, α và β caryophyllene, chamazulene, farnesene, cadinen, bisabolane [16].

6

ChamazuleneΑLimonenebisabololFarnesene

Về tính chất, tinh dầu hoa cúc La Mã là chất lỏng trong suốt, nhẹ hơn nước, không tan hoặc tan rất ít trong nước, tan nhiều trong cồn và các dung môi hữu cơ khác. Tinh dầu hoa cúc La Mã có màu xanh nhạt do các hợp chất azulen. Dưới tác dụng của oxy không khí, một phần tinh dầu chủ yếu là hợp chất không no bị oxy hóa và cho mùi nhựa [16].

b) Flavonoids Về thành phần các hợp chất flanvonoid có trong hoa cúc La Mã chiếm khoảng 0,5%, chủ yếu ở dạng glycosid: bao gồm flavone apigenin và luteolin, các quercetin và flavonol glycosides họapigenin 7 apiosylglucoside, luteolin 7 glucoside và quercetin 3 mtin [2]. Các thành phần flavonoid chiếm tỷ lệ cao trong hoa cúc La Mã được thể hiện trong bảng 1.2. Bảng 1.2. Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao trong flavonoid. Tên các hợp chất Công thức cấu tạo Apigenin https://skkn.net/

c) Coumarin Catechin là thành phần làm cho hoa có màu nâu khi khô. Coumarine Scopolin (7-β-D-glucopyranosyl-scopoletin),

Về tính chất, các hợp chất flavonoid có màu vàng rất nhạt có khi không màu (trường hợp các nhóm OH đã methyl hoá).Độ tan không giống nhau, thường flavonoid glycosid và flavonoid sulfat là những hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi không phân cực mà tan được trong nước. Các aglycon flavonoid thì tan được trong dung môi hữu cơ như ete, aceton, cồn nhưng hầu như không tan trong nước. Các dẫn chất flavonoid có nhóm 7 hydroxy thường dễ tan trong dung dịch kiềm loãng [2].

7 QuercetinLuteolin

umbelliferone, herniarin, scopoletin là các thành phần cũng đã được xác định [17]. Các thành phần hợp chất coumarin chiếm tỉ lệ cao trong hoa cúc La Mã được thể hiện trong bảng 1.3. Bảng 1.3. Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao trong coumarine. Tên các hợp chất Công thức cấu tạo

UmbelliferoneScopolinHerniarin https://skkn.net/

d) Các thành phần còn lại trong hoa cúc Các hợp chất phenol dùng để chỉ chung các hợp chất mà trong cấu trúc có vòng benzen mang một hoặc nhiều nhóm chức hydroxy OH. Các hợp chất phenol trong tự nhiên như: flavonoid, xanthon, coumarin, quinon, các polyphenol (lignin, tanin, …).

8 Về tính chất, Coumarin là những chất kết tinh không màu, một số lớn dễ thăng hoa có mùi thơm. Ở dạng kết hợp glycosid thì có thể tan trong nước, ở dạng aglycon thì dễ tan trong dung môi kém phân cực. Coumarin có vòng lacton nên bị mở vòng bởi kiềm tạo thành muối tan trong nướcnếu acid hóa thì sẽ đóng vòng trở lại [4].

Sáp là este cùa các acid béo có mạch cacbon dài và rượu đơn hoặc đa chức, nằm trên các mô bì của thực vật. Sáp rất trơ hóa học, không tan trong nước nhưng tan trong rượu. 1.3. Tác dụng của hoa cúc La Mã Tại Ai Cập, Hy Lạp và La Mã, thảo dược này được sử dụng như một phương thuốc thảo dược hàng ngàn năm nay.Ở các tài liệu [6], [9], [13],[15], [16], hoa cúc La Mã có tác dụng làm dịu tinh thần, được sử dụng để trấn an giấc ngủ, giảm căng thẳng thần kinh, giúp làm sạch và bảo vệ vết thương khỏi bị nhiễm trùng. Sử dụng như một phương thuốc tự nhiên chữa các mẫn ngứa, kích ứng, giảm sưng do phát ban và các bệnh nhiễm trùng khác. Giảm bớt các vấn đề đau lưng, thấp khớp, đau bụng kinh, chống co thắt đường ruột, điều trị ho, sốt rét, nhiễm giun ký sinhvà các bệnh về tiêu hóa. Cúc La Mã không chỉ là một loại thuốc trong dược điển của 26 quốc gia mà ngoài ra nó còn phục vụ đắc lực cho công cuộc làm đẹp của nữ giới. Theo những nghiên cứu gần đây cho thấy hoa cúc La Mã chứa các thành phần có tác dụng chữa bệnh điển hình như: Tác dụng chống co thắt: Đã được quy cho một sốthành phần hoạt tính của hoa cúc, đặc biệt là các flavonoid (anthemidin, apigenin, luteolin), glycosid, coumarin https://skkn.net/

Tanin là hợp chất polyphenol, có vị chát, tanin hầu như không tan trong dung môi kém phân cực, tan được trong cồn loãng, tốt nhất là nước nóng. Glycosid là dạng phổ biến của nhiều hợp chất tự nhiên, cấu trúc của các hợp chất này gồm hai thành phần là phần đường và phần không đường. Phần đường của glycosid gọi là glycon, phần không đường gọi là aglycon hoặc genin. Phần đường và phần không đường liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycosid dễ bị phân huỷ khi có nước dưới ảnh hưởng của các enzyme thực vật hoặc dung dịcd acid hoặc kiềm. Phần đường trong glycosid chủ yếu là monosaccarid hoặc oligosaccaride, thường là glucose, rhamnose, galactose… nói chung các glycoside có tính phân cực khá mạnh, nên không tan trong été dầu hỏa, hexan, benzen nhưng tan được trong cloroform, dietyl ether, tan tốt trong acol và nước.

Các acid béo là 1 nhóm hợp chất hữu cơ bao gồm những este của acid béo với các alcol. Chất béo nhẹ hơn nước, tan trong dung môi hữu cơ kém phân cực như benzen, ete, chloroform, ít tan trong cồn và không tan trong nước.

Tác dụng chống Alzheimer:Các flavonoid như quercetin có tác dụng chống Alzheimer thông qua ức chế acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase [2], [9].

Tác dụng kháng khuẩn: Hoạt tính kháng khuẩn của hoa cúc đã được các nhà khoa học nghiên cứu trong ống nghiệm và kết quả rất đáng khích lệ. Thành phần coumarin, hernearin có tính chất kháng khuẩn và kháng nấm trong sự hiện diện của ánh sáng cực tím. Nó cũng đã được chứng minh hiệu quả như một thành phần chống lại nấm Candida albicans. Chống lại một số chủng vi khuẩn gram dương (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis) và vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa). Ức chế sự tăng trưởng của B. anthracis, Micrococcus glutamicus, B. sacchrolyticus, B. thuringiensis, Sarcina lutea, B. stearothermophilus, Lactobacillus plantarum, và Lactobacillus casei [12],[13], [14]. Tác dụng chống ung thư: Tác dụng chống ung thư của apigenin, một hợp chất flavonoid trong hoa cúc, đã được nghiên cứu trên động vật, apigenin giảm số lượng các ung thư biểu mô tế bào da UVB gây ra ở chuột, apigenin đã được tìm thấy để đàn áp 12 O tetradecanoyl phorbol 13 acetate gây xúc tiến khối u ở da chuột và được chứng minh là một thành phần chống nắng hữu ích. Sesquiterpenoids, nobilin, và dẫn xuất của nó đã chứng minh kháng u chống lại các tế bào khối u của con người trong ống nghiệm [18]

9 (herniarin và umbelliferone)và các loại dầu dễ bay hơi của nó (có chứa alpha và Bisabolol matricine) [16].

Tác dụng chống oxy hóa: Chamazulenelà một chất chống oxy hóa mạnh có giá trị trong quá trình chống viêm. Nó đã được chứng minh để ngăn chặn cyclooxygenase enzyme trong quá trình tổng hợp prostaglandin. Tác dụng chống viêm của nó có thể là do sự ức chế hình thành leukotriene B4. Ngoài ra tác dụng chống oxy hóa còn do thành phần apigenin của nó [14].

Trong đó các bisabolol và các flavonoid có tác dụng chống viêm cao nhất so với các thành phần còn lại. [6], [9], [17].Các thử nghiệm đã được tiến hành để kiểm tra với sự phù nề trên chân của loài chuột Sprague Dowley [13].

Tác dụng chống viêm: Một số thành phần của hoa cúc bao gồm apigenin 7 glucoside, luteoline, hợp chất terpene, herniarine, matricin, chamazulene, ( ) alpha bisabololoxides A và B, và (-) alpha-bisabolol, patuletin, umbelliferone, quercetin, myricetin, rutin, và spiroethers đã được nghiên cứu trong các hoạt tính chống viêm.

Tác dụng chống viêm loét dạ dày: Bisabolol đã được tìm thấy và nghiên cứu là làm giảm lượng enzyme phân giải protein tiết ra pepsin của dạ dày mà không cần bất kỳ sự thay đổi xảy ra trong lượng axit dạ dày, do đó nó đã được đề nghị để điều trị bệnh đường ruột [13].

1.4. Phương pháp chiết tách thành phần hoạt tính sinh học từ hoa cúc La Mã https://skkn.net/

10 Chiết xuất dược liệu là phương pháp sử dụng dung môi lấy các chất tan ra khỏi mô thực vật. Nguyên liệu có nguồn gốc từ tự nhiên chứa các tinh chất quý giá. Nguyên liệu thường ở dạng tươi hoặc đã qua sơ chế, hoặc sấy khô. Sản phẩm thu được sau quá trình chiết xuất là dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi dung dịch này được gọi là dịchChiếtchiết.xuất dược liệu hướng đến mục đích: tạo ra các chế phẩm toàn phần, tách chiết riêng các hoạt chất tinh khiết; thu nhận chúng dưới dạng tinh khiết nhất để làm thuốc mới hoặc bán tổng hợp ra thuốc mới; làm cho dược liệu có tác dụng mạnh hơn; giảm tác dụng phụ không mong muốn của thảo dược. Chiết xuất là bước đầu tiên để tách các sản phẩm tự nhiên mong muốn khỏi các nguyên liệu thô. Phương pháp chiết bao gồm chiết bằng dung môi, phương pháp chưng cất, ép và thăng hoa theo nguyên tắc chiết. Chiết dung môi là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất. Việc chiết xuất các sản phẩm tự nhiên tiến triển qua các giai đoạn sau: (1) dung môi thâm nhập vào cấu trúc rắn; (2) chất tan hòa tan trong dung môi; (3) chất tan được khuếch tán ra khỏi chất rắn; (4) các chất hòa tan được thu thập. Bất kỳ yếu tố nào tăng cường độ khuếch tán và độ hòa tan trong các bước trên sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc chiết xuất. Các tính chất của dung môi chiết, kích thước hạt của nguyên liệu thô, khẩu phần dung môi đến chất rắn, nhiệt độ chiết và thời gian chiết sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết. Phương pháp chiết xuất dược liệu bằng siêu âm: Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng sự hòa tan của các chất trong môi trường dung môi. Tăng quá trình khuếch tán, được áp dụng trong quy mô lớn. Đầu phát siêu âm được nhúng trực tiếp vào bình chiết chứa dược liệu. Phương pháp chiết xuất bằng vi sóng: Có tác dụng khuấy trộn, làm tăng tiếp xúc pha. Làm cho hiệu suất phản ứng được lớn hơn. Phương pháp chiết xuất bằng dung môi: dịch chiết còn được cô đặc. Thêm vào đó bằng dung môi hữu có không phân cực. Trong khuôn khổ của đề tài cao chiết từ hoa cúc La Mã bằng phương pháp ngấm kiệt, chưng ninh, Sohxlet, và Sohxlet kết hợp chưng ninh. https://skkn.net/

11 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu Để “Nghiên cứu trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã Matricaria chamomile” trong khuôn khổ của đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu là hoa cúc La Mã khô, sau đó nguyên liệu được nghiền thành bột với độ ẩm 10 %. 2.2. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm, Khoa Kỹ thuật Công nghệ & Nông nghiệp Công nghệ cao, Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu, Trung tâm phân tích Trường đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh và Phòng thí nghiệm Vi khuẩn Khoa Vi sinh miễn dịch, Viện Pasteur TP.HCM. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ở hình 2.1. Hình 2.1. Sơ đồ bố trí nội dung thí nghiệm. 2.3. Phương pháp nghiên cứu [1] 2.3.1. Nghiên cứu tối ưu hóa hiệu suất chiết cao cồn bằng phương pháp chưng ninh Định lượng và xác định thành phần thành phần hóa hoc, hoạt tính sinh học flavonoid trong dược liệu Hoa cúc Chiết cao cồn Chiết cao acetateetyl Chiết cao ete dầu hỏa Định tính thành phần dược liệu Xử lý https://skkn.net/

ChưngcúcninhLọcXửlýĐoquang

12

Hoa Cồn Bã https://skkn.net/

Hình 2.2. Quy trình chiết tách dược liệu bằng phương pháp chưng ninh.

Quy trình chiết tách theo phương pháp chưng ninh được thực hiện theo sơ đồ ở hình 2.1.

a) Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của nồng độ etanol tới hiệu suất chiết Mục đích: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi lên mật độ quang khi thực hiện chiết bằng phương pháp ngâm ninh, nhằm tìm ra được nồng độ dung môi tối ưu để tối ưu hóa quy trình tách chiết. Thực nghiệm: Cân 1,5 g hoa cúc cho vào bình cầu 2 cổ có lắp nhiệt kế để đo nhiệt độ. Lắp hệ thống sinh hàn hồi lưu. Thực hiện chưng ninh trên bếp khuấy từ với 3 nồng độ cồn (96o, 70o, 50o) trong 3 giờ ở nhiệt độ 60 oC. Tỷ lệ “dung môi : nguyên liệu” (20:1). Tháo hệ thống sinh hàn sau khi kết thúc thí nghiệm. Dịch chiết được làm lạnh bằng nước đá sau đó đem đi lọc bằng máy lọc hút chân không. Pha loãng mẫu và đo quang ở bước sóng 390 nm. Lặp lại thí nghiệm 3 lần. b) Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất chiết Mục đích: khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên mật độ quang khi thực hiện chiết bằng phương pháp ngâm ninh, nhằm tìm ra được nhiệt độ tối ưu để tối ưu hóa quy trình tách chiết. Thực nghiệm: Cân 1,5 g hoa cúc cho vào bình cầu 2 cổ có lắp nhiệt kế để đo nhiệt độ. Lắp hệ thống sinh hàn hồi lưu. Thực hiện chưng ninh trên bếp khuấy từ ở các nhiệt độ (50 oC, 60 oC, 70 oC, 78 oC) trong 3 giờ với nồng độ dung môi tối ưu như đã khảo sát ở trên. Tỷ lệ “dung môi/nguyên liệu” (20:1). Tháo hệ thống sinh hàn sau khi kết thúc thí nghiệm. Dịch chiết được làm lạnh bằng nước đá sau đó đem đi lọc bằng máy lọc hút chân không. Pha loãng mẫu và đo quang ở bước sóng 390 nm. Lặp lại thí nghiệm 3 lần. c) Nghiên cứu tỷ lệ nguyên liệu/dung môi ảnh hưởng tới hiệu suất chiết

13 Mục đích: khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi lên mật độ quang khi thực hiện chiết bằng phương pháp ngâm ninh, nhằm tìm ra được tỷ lệ tối ưu để tối ưu hóa quy trình tách chiết. Thực nghiệm: Cân 1,5 g hoa cúc cho vào bình cầu 2 cổ có lắp nhiệt kế để đo nhiệt độ. Lắp hệ thống sinh hàn hồi lưu. Thực hiện chưng ninh trên bếp khuấy từ ở các tỷ lệ dung môi và nguyên liệu (1:10; 1:20; 1:30; 1:40; 1:50) trong 3 giờ ở nhiệt độ tối ưu với nồng độ dung môi tối ưu như đã khảo sát ở trên. Tháo hệ thống sinh hàn sau khi kết thúc thí nghiệm. Dịch chiết được làm lạnh bằng nước đá sau đó đem đi lọc bằng máy lọc hút chân không. Pha loãng mẫu và đo quang ở bước sóng 390 nm. Lặp lại thí nghiệm 3 lần. d) Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất chiết Mục đích: khảo sát ảnh hưởng thời gian lên mật độ quang khi thực hiện chiết bằng phương pháp ngâm ninh, nhằm tìm ra được thời gian tối ưu để tối ưu hóa quy trình tách chiết. Thực nghiệm: Cân 1,5 g hoa cúc cho vào bình cầu 2 cổ có lắp nhiệt kế để đo nhiệt độ Lắp hệ thống sinh hàn hồi lưu. Thực hiện chưng ninh trên bếp khuấy từ ở các thời gian (1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ) ở nhiệt độ tối ưu với nồng độ dung môi tối ưu và tỷ lệ tối ưu như đã khảo sát ở trên. Tháo hệ thống sinh hàn sau khi kết thúc thí nghiệm. Dịch chiết được làm lạnh bằng nước đá sau đó đem đi lọc bằng máy lọc hút chân không. Pha loãng mẫu và đo quang ở bước sóng 390 nm. Lặp lại thí nghiệm 3 lần. 2.3.2 Chiết tách thành phần dược liệu bằng phương pháp chưng ninh Quy trình chiết tách theo phương pháp Soxhlet được thực hiện theo sơ đồ ở hình 2.2. Hình 2.3. Sơ đồ khảo sát chiết cao cồn bằng phương pháp chưng ninh. Hoa ChưngcúcninhLọc Xử lý

Cô quay Cồn Bã Cao cồn Dung môi https://skkn.net/

CôXLọcửlýquay

Cồn Bã Cao cồn Dung môi https://skkn.net/

14 Cân hoa cúc cho vào bình cầu 2 cổ có lắp nhiệt kế để đo nhiệt độ. Lắp hệ thống sinh hàn hồi lưu. Thực hiện chưng ninh trên bếp khuấy từ ở các thời gian, nhiệt độ với nồng độ dung và tỷ lệ tối ưu như đã khảo sát ở trên. Tháo hệ thống sinh hàn khi kết thúc thì nghiệm, dịch chiết được làm lạnh bằng nước đá sau đó đem đi lọc bằng máy lọc hút chân không và tiếp tục đưa đi cô quay chân không để loại dung môi thu được cao cồn chứa các thành phần của dược liệu. 2.3.3. Chiết cao cồn bằng phương pháp ngấm kiệt Quy trình chiết tách theo phương pháp Soxhlet được thực hiện theo sơ đồ ở hình 2.4. Hình 2.4. Sơ đồ khảo sát chiết cao cồn bằng phương pháp ngấm kiệt. Cân 100 g hoa cúc, xay nhỏ đến độ mịn thích hợp và cho vào bình chiết, đổ dung môi vào ngập dược liệu khoảng 2-3 cm và để ngâm trong 24 giờ. Sau đó tiến hành mở van rút dịch chiết cho sản phẩm ra đồng thời bổ sung thêm dung môi từ bình lóng vào bình chiết. Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình chiết bằng vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này. Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách nhỏ một giọt dịch chiết từ bình hứng vào một tấm kiếng và cho bốc hơi hoàn toàn, nếu không thấy vết gì nghĩa là chiết kiệt. Dịch chiết cồn sau khi lọc đưa đi cô quay để tách cồn và thu được cao cồn. 2.3.4. Chiết cao cồn bằng phương pháp Soxhlet Quy trình chiết tách theo phương pháp Soxhlet được thực hiện theo sơ đồ ở hình 2.5 Hoa cúc Chiết ngấm kiệt

Cồn Bã Cao cồn Dung môi https://skkn.net/

15 Hình 2.5. Sơ đồ khảo sát tách chiết hợp chất trong hoa cúc La Mã bằng phương pháp Soxhlet Cân 100 g hoa cúc cho vào túi lọc và đặt vào bình chiết, thêm dung môi vào bình cầu sao cho dung môi trong bình cầu không được nhiều hơn hai phần ba thể tích bình cầu. Lắp hệ thống Soxhlet và kiểm tra hệ thống, mở nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng, cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt cho dung môi trong bình cầu sôi đều. Quan sát dịch hút ra trong ống thông nhau và kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy để nguội, mở hệ thống và rút lấy một giọt dung môi thử trên mặt kiếng, nếu không còn dấu vết gì là đã chiết kiệt. Tháo hệ thống Soxhlet, tiến hành lọc dịch chiết bằng máy lọc hút chân không, sau đó đưa đi cô quay loại dung môi thu được cao cồn. 2.3.5 Chiết tách thành phần dược liệu qua hai giai đoạn: Soxhlet và chưng ninh Quy trình chiết tách theo phương pháp Soxhlet được thực hiện theo sơ đồ ở hình 2.6. Cân hoa cúc cho vào túi lọc và đặt vào bình chiết, thêm dung môi là ete dầu hỏa vào bình cầu sao cho dung môi trong bình cầu không được nhiều hơn hai phần ba thể tích bình cầu. Lắp hệ thống Soxhlet và kiểm tra hệ thống, mở nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng, cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt cho dung môi trong bình cầu sôi đều. Quan sát dịch hút ra trong ống thông nhau và kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy để nguội, mở hệ thống và rút lấy một giọt dung môi thử trên mặt kiếng, nếu không còn dấu vết gì là đã chiết kiệt. Dịch chiết ete được đưa đi cô quay để tách dung môi thu được cao ete dầu hỏa. Cân lượng cao ete dầu hỏa thu được. Phần bã sau khi tháo ra khỏi máy được đưa đi chưng ninh bằng cồn với hệ thống ống sinh hàn hồi lưu trên bếp khuấy từ gia nhiệt với các thông số về nồng độ dung môi, nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ nguyên liệu dung môi tối ưu như đã khảo sát ở trên. Dịch chiết cồn sau khi lọc và đưa đi cô quay để tách cồn

Hoa cúc Chiết

CôXLSoxhletọcửlýquay

Dịch ete Bã Cô quay Chưng ninh bằng CôLcồnọcquayeteCao https://skkn.net/

Hình 2.6. Sơ đồ khảo sát chiết tách thành phần dược liệu qua hai giai đoạn Soxhlet và chưng ninh 2.3.6. Phương pháp chiết tách cao etyl acetat và cao ete dầu hỏa từ cao cồn Quy trình chiết tách theo phương pháp Soxhlet được thực hiện theo sơ đồ ở hình 2.7.Cao cồn sau khi đã đuổi hết dung môi được kiềm hóa bằng dung dịch KOH đến pH=10 12. Lắc nhiều lần với 500 ml dung môi ete dầu hỏa (lần thứ nhất 200 ml dung môi, 100 ml cho những lần tiếp theo). Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách nhỏ dịch ete lên một tấm kiếng sạch và để bay hơi hết, nếu không còn dầu vết gì là chiết kiệt. Gộp các dịch chiết ete lại và tiến hành cô quay để thu dung môi. Cân khối lượng cao ete thu được. Dung dịch kiềm sau khi đã chiết lấy dịch ete được acid hóa bằng HCl (10 %) đưa về pH=2. Lắc nhiều lần với 500 ml dung môi etyl acetat (lần thứ nhất 200 ml dung môi, 100 ml cho những lần tiếp theo). Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách nhỏ dịch etyl acetat lên một tấm kiếng sạch và để bay hơi hết, nếu không còn dầu vết gì là chiết kiệt. Hoa cúc Xử lý Chiết SoxhletEte dầu hỏa Caocồn

16 được cao cồn. Cân khối lượng cao cồn thu được.

17 Gộp các dịch chiết etyl lại và đem đi cô quay để thu hồi dung môi. Cân khối lượng cao etyl acetat thu được.

Hình 2.7. Sơ đồ chiết cao etyl acetat và ete dầu hỏa 2.3.7. Phương pháp định tính các thành phần của dược liệu a) Định tính thành phần trong cao ete dầu hỏa Phản ứng Liebermann Burchard để nhận biết terpenoid Cho mẫu vào ống nghiệm, thêm 1 ml Anhidric acetic, 1ml cloroform, làm lạnh ống nghiệm rồi thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc. Quan sát sau 1 đến 2 phút và nhận xét màu sắc trong ống ngiệm. Phản ứng Salkowski để nhận biết terpenoid Cho 1 2 mg mẫu vào ống nghiệm, thêm 1ml cloroform sau đó nhỏ thêm 1ml H2SO4 đậm đặc. Quan sát sau 1 đến 2 phút và nhận xét màu sắc trong ống nghiệm. Với thuốc thử FeCl3 để nhận biết flavonoid và coumarine Cho 1 2 mg mẫu vào ống ngiệm, thêm FeCl3 hòa tan trong ethanol để hóa tan mẫu. Quan sát sau 1 đến 2 phút và nhận xét màu sắc trong ống nghiệm. b) Định tính thành phần trong cao etyl acetat Caocồn Dịch kiềm Acid hóa Dịch etyl acetate Cô quay eteCao Dịch ete Cô quay Lắc với ete dầu hỏa Cao cồn Kiềm hóaKOH (pH=10 12) https://skkn.net/

Nguyên lý: phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện https://skkn.net/

18 Phản ứng Liebermann Burchard để nhận biết terpenoid Cho mẫu vào ống nghiệm, thêm 1ml Anhidric acetic, 1ml cloroform, làm lạnh ống nghiệm rồi thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc. Quan sát sau 1 đến 2 phút và nhận xét màu sắc trong ống ngiệm. Tác dụng của FeCl3 để nhận biết flavonoid và coumarin Cho 1 2 mg mẫu vào ống ngiệm, thêm FeCl3 hòa tan trong ethanol để hóa tan mẫu. Quan sát sau 1 đến 2 phút và nhận xét màu sắc trong ống nghiệm. Tác dụng với H2SO4 đậm đặc để nhận biết flavonoid Cho 1 2 mg mẫu vào ống nghiệm, thêm H2SO4 đậm đặc để hòa tan mẫu. Quan sát sau 1 đến 2 phút và nhận xét màu sắc trong ống nghiệm. 2.3.8. Định lượng thành phần dược liệu (flavonoid) tổng trong cao etyl acetat a. Xây dựng đường chuẩn bằng chất chuẩn Catechin: Hòa tan Catechin vào bình định mức lần lược với các nồng độ 85 mg; 42,5 mg; 21,25 mg; 10,626 mg; 5,3125 mg; 2,65625 mg vào bình định mức 100 ml với dung môi là etanol 70o. Ta lấy 20 µl mẫu catechin đã hòa tan + 6 ml H2O + 200 µl thuốc thử Folin Ciocalteau để sau 5 phút, thêm 600 µl Na2CO3 bảo hòa lắc đều để trong chỗ kín trong 2 giờ sẽ tạo phức màu xanh. Tiến hành đo quang với bước song 425 nm và xây dựng đường chuẩn. b. Định lượng flavonoid toàn phần trong cao etyl acetat: Cân 100 mg cao etyl acetat cho vào bình định mức 100 ml, cho thêm etanol 70o vào bình cho đủ 100 ml. Tương tự sau khi lắc cho cao etanol tan hết, ta lấy Ta lấy 20 µl mẫu cao etyacetat đã hòa tan + 6 ml H2O + 200 µl thuốc thử Folin Ciocalteau để sau 5 phút, thêm 600 µl Na2CO3 bảo hòa lắc đều để trong chỗ kín trong 2 giờ sẽ tạo phức màu xanh. Tiến hành đo quang và xác định nồng độ catecin thông qua phương trình đường chuẩn. Hiệu suất flavonoid được tính theo công thức sau: F(%) = & () (* × 100, (2.1); Trong đó: A: nồng độ catechin tính từ đường chuẩn (mg); m1: khối lượng cao etyl acetat (mg); m2: khối lượng mẫu khô (mg). 2.3.9. Xác định thành phần dược liệu (flavonoid) bằng sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ Mục đích: xác định thành phần hóa học trong flavonoid các dịch chiết từ cây hoa cúc La Mã bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp ghép phối phổ (HPLC MS).

Ứng dụng: phát hiện và xác định các chất hóa học trong sự có mặt của các chất hóa học khác (trong một hợp chất phức tạp) bằng cách dựa vào khối lượng của phân tử Xác định kết cấu chất đồng vị của các thành phần trong hợp chất, cấu trúc của một hợp chất bằng cách quan sát từng phần tách riêng của nó. Sử dụng trong nhiều nhiều ứng dụng có độ nhạy và tính chọn lọc cao. Thực nghiệm: sản phẩm được ghi phổ bằng máy sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ micro OTOF Q tại phòng phân tích trung tâm trường đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh. 2.3.10. Thử hoạt tính sinh học thành phần dược liệu (flavonoid) từ hoa cúc La mã Mục đích: Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học của flavonoid nhằm đánh giá được khả năng kháng khuẩn của flavonoid chiết suất từ hoa cúc la mã. Nguyên tắc: Hoạt tính sinh học của phân đoạn flavonoid được thử nghiệm bằng phương pháp khuyêch tán kiểm soát trên đĩa thạch: trải vi sinh vật với một số lượng nhất định trên mặt đĩa thạch, sao cho tiếp xúc đều. Đặt đĩa giấy đã tẩm sẵn terpenoid steroid lên bề mặt đĩa thạch. Flavonoid sẽ khuyêch tán vào trong đĩa thạch và ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật tạo vòng kháng vi sinh vật xung quanh đĩa giấy. Thử hoạt tính sinh học sẽ được tiến hành trên các chủng vi khuẩn kiểm định bao gốm: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Samonella typhi Thực nghiệm : Hấp khử trùng đĩa petri trong 50 phút. Sau đó để trong tủ sấy 3 giờ để đĩa khô hoàn toàn. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy, nấu sôi và khuấy đều. Cho môi trường vào bình thuỷ tinh và đem hấp khử trùng trong 50 phút; - Cho khoảng 20 ml môi trường nuôi cấy vào đĩa petri, ủ 37 oC trong 24 giờ để kiểm tra độ vô trùng. Cấy các chủng vi sinh vật cần kiểm định vào mỗi đĩa petri (nồng độ vi sinh vật khoảng 108 tế bào; Dùng kẹp cho các khoanh giấy lọc Whatman vào lọ flavonoid nguyên chất (C0) và flavonoid được pha loãng trong dung môi DMSO ở các nồng độ khác nhau như: 0,01 % (C1), 0,02 % (C2), 0,03 % (C4), sau đó đặt lên mặt đĩa thạch đã cấy sẵn vi sinh vật kiểm định, mỗi đĩa petri đặt 2 4 đĩa giấy cách đều nhau, ủ 37 oC; sau 24 giờ nuôi cấy lấy ra quan sát, đo đường kính vòng vô khuẩn; Quan sát đường kính của vòng vô khuẩn và đo đường kính vòng vô khuẩn Có hoạt tính kháng khuẩn: có vòng vô khuẩn (có đường kính vòng vô khuẩn lớn hơn 6 mm) Không có hoạt tính kháng khuẩn: không có vòng vô khuẩn (đường kính vòng vô khuẩn nhỏ hơn hoặc bằng 6 mm) https://skkn.net/

19 tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó.

1,200 1,250 1,300 1,350 1,400 1,450 1,500 50 70

20 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu chiết tách cao cồn 3.1.1. Nghiên cứu tối ứu hoa hiệu suất tách chiết cao cồn bằng phương pháp chưng ninh a. Ảnh hưởng của nồng độ etanol đến mật độ quang dung dịch chiết Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi tới hiệu suất chiết tách bằng phương pháp chưng ninh được thực hiện ở nhiệt độ 60 oC với thời gian 3 giờ và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 có kết quả được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung môi Nồng độ dung môi (o) Mật độ quang 50o 1,297± 0,005 70o 1,467± 0,015 96o 1,323± 0,012 Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi lên mật độ quang. Từ bảng 3.1 cho thấy ở nổng độ cồn 70o thì mật độ quang cao nhất (1,467) Ở nồng độ cồn 96o, mật độ quang là 1,323 do ở nồng độ này dung môi có độ phân cực kém nên chỉ hòa tan được các chất khó phân cực mà không hòa tan được các hợp chất có độ phân cực tương đối cao như flavonoid và polyphenol. Cồn ở nồng độ 50o thì mật độ quang của dịch chiết là 1,297, thấp hơn so với dịch chiết thu nhận được ở nồng độ 70o và 96o. Sở dĩ có kết quả như vậy vì dung môi có độ phân cực cao có khả năng hòa tan các hợp chất có độ phân cực mạnh dẫn đến việc lôi kéo các thành phần không phân cực như terpen, nhựa, sáp là thấp. Vậy theo kết quả thực nghiệm ta thấy nồng độ cồn 96 Nồng độ dung môi, o quangđộMật https://skkn.net/

21 70o là có độ phân cực thích hợp nhất để chiết các thành phần phân cực và không phân cực trong hoa cúc La Mã. Kết quả này được lựa chọn để làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo. b. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật độ quang dung dịch chiết Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất chiết tách được thực hiện ở nồng độ dung môi tối ưu như đã khảo sát là cồn 70o với thời gian là 3 giờ và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi tương ứng là 1/20 được trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nhiệt độ Nhiệt độ (oC) Mật độ quang 50o 1,367± 0,023 60o 1,493± 0,013 70o 1,447± 0,030 78o 1,223± 0,041 Hình 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên mật độ quang. Từ bảng 3.2 có thể thấy khi tăng nhiệt độ phản ứng từ 50 oC lên 60 oC thì mật độ quang tăng từ 1,367 lên 1,493. Nhưng khi nhiệt độ càng tăng hơn nữa lên đến nhiệt độ sôi của cồn 78 oC thì mật độ quang lại giảm dần xuống 1,223. Nguyên nhân là do khi tăng nhiệt độ sẽ làm giảm độ nhớt đồng thời các phân tử dung môi và chất tan xảy ra sự chuyển động hỗn độn làm tăng vận tốc khuếch tán từ nguyên liệu vào dung môi làm tăng mật độ quang của dịch chiết. Nhưng khi tăng nhiệt độ lên quá cao 70 78 oC các cấu tử kém bền nhiệt trong hợp chất có thể đã bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ dẫn đến giảm mật độ quang của dịch chiết. Vậy nhiệt độ 60 oC được chọn làm nhiệt độ tối ưu cho quy trình tách chiết. cồn,

0 200 400 600 800 1,000 1,200 1,400 1,600 50 60 70 78 Độ

o quangđộMật https://skkn.net/

22 c. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến mật độ quang dung dịch chiết Sự ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi tới hiệu suất chiết tách được thực hiện ở nhiệt độ là 60 oC với nồng độ dung môi là cồn 70o và thời gian tách chiết là 3 giờ cho kết quả ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào tỷ lệ dược liệu/dung môi Tỷ lệ dược liệu/dung môi (g/ml) Mật độ quang 1/10 0,396± 0,021 1/20 0,564± 0,019 1/30 0,678± 0,025 1/40 0,759± 0,010 1/50 0,766± 0,013 Hình 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dược liệu/dung môi lên mật độ quang. Từ bảng 3.3 cho thấy, cùng một khối lượng nguyên liệu, khi thể tích dung môi tăng thì mật độ quang của dịch chiết tăng. Nguyên nhân là do khi lượng dung môi càng tăng lên thì khả năng tiếp xúc với nguyên liệu càng lớn và lượng cấu tử tách ra càng nhiều. Nhận thấy là khi tăng từ tỷ lệ 1/40-1/50 thì mật độ quang tăng không đáng kể. Do vậy, tỷ lệ tối ưu được chọn để thực hiện chiết tách là 1/40 vừa tiết kiệm được dung môi, vừa tiết kiệm được năng lượng để thu hồi dung môi sau khi chiết. Kết quả này được lựa chọn để làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo. d. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến mật độ quang dung dịch chiết Quá trình khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất chiết tách được thực hiện ở nhiệt độ tối ưu 60 oC với nồng độ dung môi tối ưu là cồn 70o và tỷ lệ nguyên 1:20 1:30 1:40 1:50 Tỷ lệ dược liệu: dung môi quangđộMật https://skkn.net/

0.90.80.70.60.50.40.30.20.10 1:10

23 liệu dung môi tối ưu là 1/40 được trình bày ở bảng 3.4. Thời gian tiếp xúc của nguyên liệu và dung môi càng dài thì khả năng hòa tan của các cấu tử vào dung môi càng lớn. Khi tăng khoảng thời gian từ 1 giờ lên 2 giờ thì mật độ quang tăng từ 1,397 lên 1,503, nhưng khi tăng thời gian lên 3 giờ đến 4 giờ thì mật độ quang vẫn không thay đổi đáng kể. Điều này có thể giải thích rằng các hợp chất trong dược liệu đã được chiết kiệt ở khoảng thời gian tối ưu là 2-3 giờ. Vậy mốc 2 giờ được chọn làm thời gian tối ưu cho quy trình tách chiết. Bảng 3.4. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào thời gian Thời gian (giờ) Mật độ quang 1 1,397± 0,016 2 1,503± 0,019 3 1,493± 0,008 4 1,467± 0,027 Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian lên mật độ quang. 3.1.2. So sánh hiệu suất chiết cao etanol bằng phương pháp chưng ninh, ngấm kiệt, Soxhlet Kết quả khảo sát chiết cao cồn theo các phương pháp chưng ninh, ngấm kiệt, Soxhlet được trình bày ởbảng 3.5. Theo kết quả được khảo sát ở bảng 3.5 ta thấy, khi chiết cao cồn bằng phương pháp chưng ninh, hiệu suất cao cho được là (33,37 %), khi chiết bằng phương pháp Soxlet thì hiệu suất cao cũng cao không kém (32,85 %), chỉ có phương pháp ngấm kiệt là thấp (24,60). Có thể giải thích như sau: nhiệt độ tối ưu nhất để khảo sát là 60 oC, vậy ở khoảng nhiệt độ này các thành phần cấu tử trong hoa cúc có thể hòa tan vào dung

1,5201,5001,4801,4601,4401,4201,4001,3801,3601,340 1 2 3 4 Thời gian, giờ quangđộMật https://skkn.net/

Theo kết quả khảo sát ở bảng 3.6 cho thấy khi chiết qua hai giai đoạn Soxhlet chưng ninh thì lượng cao cồn thu được là cao hơn. Điều đó là do màng tế bào của dược liệu được bao bởi một lớp sáp, thành phần này thì khó có thể bị đánh bật bởi cồn 70 khi ta chiết bằng phương pháp chưng ninh và do đó dung môi khó tiến sâu vào mô bì để hòa tan các thành phần hợp chất. Nhưng khi ta thực hiện chiết Soxhlet trước, do bước này ta sử dụng dung môi là ete dầu hỏa là dung môi không phân cực, nó có khả năng hòa tan đi lớp sáp này cùng các thành phần hợp chất không phân cực, tạo điều kiện cho dung môi cồn hòa tan các thành phần hợp chất còn lại trong hoa cúc. 3.2. So sánh hiệu suất chiết tách cao etyl acetat và cao ete dầu hỏa Khảo sát so sánh hiệu suất tách chiết cao etyl acetat và cao ete dầu hỏa được thể hiện ở bảng 3.7. Theo kết quả khảo sát ở bảng 3.7 ta thấy hiệu suất cao ete thu được ở phương https://skkn.net/

24 môi là tốt nhất, nhưng khi chiết bằng phương pháp Soxhlet dịch chiết được hút ngược lại bình cầu, nó được gia nhiệt lên đến nhiệt độ sôi của cồn, có thể trong quá trình này một số thành phần hoạt chất trong hoa cúc đã bị nhiệt phân hủy nên hiệu suất chiết cao cồn chưa cao lắm. Còn ở phương pháp ngấm kiệt, do tiến hành ở nhiệt độ thường, không có sự tác động của nhiệt độ nên hiệu suất cao thu được thấp. Do vậy, phương pháp chưng ninh là phương pháp chiết tách tối ưu nhất trong 3 phương pháp. Bảng 3.5. Hiệu suất chiết cao cồn theo 3 phương pháp chưng ninh, ngấm kiệt, Soxhlet Phương pháp Khối lượng mẫu (g) Khối lượng cao etanol (g) Hiệu suất (%) Chưng ninh 100 37,08± 0,026 33,37± 0,031 Ngấm kiệt 100 27,34± 0,032 24,60± 0,015 Soxhlet 100 36,5± 0,037 32,85± 0,022 3.1.3. So sánh hiệu suất chiết tách cao etanol bằng phương pháp chưng ninh và Soxhlet chưng ninh Kết quả khảo sát hiệu suất chiết cao cồn bằng phương pháp chưng ninh và Soxhlet chưng ninh được thể hiện ở bảng 3.6. Bảng 3.6. Hiệu suất chiết cao cồn bằng phương pháp chưng ninh và soxhlet chưng ninh Phương pháp Khối lượng etanol (g) Hiệu(%)suất Chưng ninh 37,08± 0,014 33,37± 0,014 Soxhlet chưng ninh 37,29± 0,039 33,56± 0,042

25 pháp ngấm kiệt là tương đối cao (21,51 %)và chỉ phương pháp này là không sử dụng nhiệt độ, từ đó nhận thấy hỗn hợp các chất không phân cực và phân cực yếu trong thành phần dược liệu sẽ hòa tan tốt hơn trong dung môi khi được tiến hành ở nhiệt độ thường mà không gây hư hại cho các thành phần kém bền nhiệt. Bảng 3.7. Hiệu suất chiết cao etyl acetat và cao ete dầu hỏa Phương pháp Khối lượng cao ete (g) Hiệu suất cao ete (%) Khối lượng cao acetatetyl(g) Hiệu suất cao etyl(%)acetat Chưng ninh 1,52± 0,022 4,10± 0,022 4,73± 0,045 12,76± 0,045 Ngấm kiệt 2,06± 0,019 7,53± 0,019 4,26± 0,048 15,58± 0,048 Soxhlet 0,80± 0,021 2,19± 0,021 4,10± 0,021 11,23± 0,021 Soxhletninhchưng 1,01± 0,043 2,70± 0,043 8,02± 0,014 21,51± 0,014 Ta thấy cao etyl acetate thu được ở phương pháp Soxhlet chưng ninh là cao nhất (21,51 %). Do phương pháp này ta tiến hành chiết ở hai giai đoạn, giai đoạn đầu chiết bằng dung môi không phân cực là ete dầu hỏa, dung môi này đã đánh bật lớp sáp ở màng tế bào dược liệu, tạo điều kiện cho dung môi cồn chiết hết các thành phần còn lại trong dược liệu. Còn ở các phương pháp khác, chỉ sử dụng một loại dung môi là cồn nên hiệu suất chiết không cao. 3.3. Định tính thành phần dược liệu trong cao chiết thu được từ hoa cúc La Mã 3.3.1 Định tính thành phần dược liệu trong cao ete dầu hỏa Kết quả định tính thành phần dược liệu trong cao ete được thể hiện ở bảng 3.8. Bảng 3.8. Kết quả định tính thành phần dược liệu trong cao ete Nhóm chất Phản ứng/ thuốc thử Màu sắc quKếtả Kết luận Terpenoid Phản LiebermannứngBurchard Dung dịch chuyển sang đỏ + Có terpenoidchứa Phản ứng Rosenhemi Dung dịch chuyển sang xanh đậm + Có terpenoidchứa Coumarine,flavonoid Thuốc thử FeCl3 Dung dịch chuyển sang đỏ + Có coumarine,chứaflavonoid (Dấu (+) cho kết quả dương tính với thuốc thử, có mặt nhóm chất tương ứng cần định tính. Dấu ( ) cho kết quả âm tính) Kết quả định tính trong bảng 3.8 cho thấy trong cao chiết phân đoạn ete dầu hỏa khi tiến hành định tính thành phần với các phản ứng Liebermann Burchard, Salkowsi https://skkn.net/

quả định tính trong bảng 3.9 cho thấy trong cao chiết phân đoạn etyl acetat khi tiến hành định tính thành phần với các thuốc thử FeCl3, H2SO4 đều cho phản ứng dương tính. Theo kết quả trên cho phép ta dự đoán trong cao chiết etyl có chứa các thành phần flavonoid và coumarine. Bảng 3.9. Kết quả định tính thành phần dược liệu trong cao etyl acetate Nhóm chất Phản ứng/ thuốc thử Màu sắc quKếtả Kết luận Terpenoid Phản LiebermannứngBurchard Dung dịch chuyển sang đỏ Khôngterpenoidchứa Flavonoid Thuốc thử FeCl3 Dung dịch cho màu xanh đậm + Có Flavonoidchứa Thuốc thử H2SO4 Dung dịch cho màu đỏ cam + Có Flavonoidchứa Coumarine Thuốc thử FeCl3 Dung dịch cho màu xanh đậm + Có Coumarinechứa (Dấu (+) cho kết quả dương tính với thuốc thử, có mặt nhóm chất tương ứng cần định tính. Dấu ( ) cho kết quả âm tính). 3.4. Kết quả xác định hàm lượng, thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của thành phần dược liệu (flavonoid) từ hoa cúc La Mã 3.4.1. Định lượng thành phần flavonoid trong cao etyl acetat Xây dựng đường chuẩn với chất đối chiếu là catechin với nồng độ chính xác là 85; 42,5; 21,25; 10,626; 5,3125; 2,65625 (mg/100ml). Kết quả được trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3.10. Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất đối chiếu là catechin Nồng độ (mg/100ml) 2.65625 5.3125 10.625 21.25 42.5 85 OD425nm 0.061 0.083 0.089 0.101 0.150 0.25 https://skkn.net/

26 và thuốc thử FeCl3 đều cho phản ứng dương tính. Theo kết quả trên cho phép ta dự đoán trong cao chiết ete có chứa các thành phần terpenoid, flavonoid và coumarine. 3.3.2. Định tính thành phần trong cao etyl acetate Kết quả định tính thành phần dược liệu trong cao etyl acetate được thể hiện ở bảng 3.9.Kết

27 Hình 3.5. Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo Catechin. Dựa vào phương trình đường chuẩn và kết quả đo quang của các mẫu cao etyl acetate, hàm lượng flanovoid toàn phần thể hiện trong bảng 3.11. Từ bảng 3.11 cho thấy, phương pháp Soxhlet kết hợp chưng ninh cho hiệu suất flavonoid toàn phần cao nhất, điều đó cho thấy hiệu suất flavonoid toàn phần tăng khi hiệu suất cao etyl acetat tăng. Như vậy phương pháp Soxhlet kết hợp chưng ninh mang lại hiệu quả cao nhất. Bảng 3.11 Hiệu suất flanovoid toàn phần Phương pháp chiết Hiệu suất cao etyl acetate (%H) Hiệu suất flavonoid toàn phần (%F) Ngấm kiệt bằng etanol 4,73± 0,026 1,02± 0,045 Chưng ninh bằng etanol 5,25± 0,037 0,90± 0,022 Soxhlet bằng etanol 4,56± 0,011 0,89± 0,050 Soxhlet bằng ete kết hợp chưng ninh 8,91± 0,048 1,98± 0,019 Mặc dù hiệu suất cao etyl acetat của phương pháp ngấm kiệt thấp hơn phương pháp chưng ninh nhưng hiệu suất flavonoid toàn phần thu được thì cao hơn, điều đó cho thấy có khả năng các hợp chất flavonoid thu được từ phương pháp ngấm kiệt không bị biến đổi trong quá trình chiết tách. Phương pháp ngấm kiệt thực hiện ở nhiệt độ thấp cho nên sự bảo toàn cấu trúc của các flavonoid có thể hiệu quả hơn phương pháp chưng ninh. 3.4.2. Thành phần các hợp chất flavonoid Để xác định thành phần các flavonoid có trong cao etyl acetat, tiến hành phân tích sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ một mẫu cao etyl acetat thu được theo phương pháp chưng ninh. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.12. https://skkn.net/

O O

O O

4

M

O

1 21,0 271.0628 5,7

O

3 21,6

O

28 Bảng 3.12 Công thức cấu tạo và định danh một số chất STT (phút)Thờigianlưu Công thức cấu tạo Định danh dihydroxy 2 (Cnhydroxyphenyl)chroma(44one15H12O5) 2 3,5,7dihydroxyphenyl)(3,4trihydroxy4H chromen 4 one (C15H10O7) 351.2138 5 hydroxy 2 (4 hydroxy methoxyphenyl)3 trimethoxychromen3,6,74one(C19H18O8) 26,5 286,24 2 Dihydroxyphenyl)(3,4-5,7dihydroxy4chromenone(C15H10O6) Ngoài ra còn có một số hợp chất chưa định danh được. 3.4.3. Hoạt tính sinh học của flavonoid Để xác định khả năng kháng khuẩn của nhóm hợp chất flavonoid, chiết bởi dung môi etyl acetate với chủng vi sinh vật lần lượt là Samonella typhi ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, mẫu chiết đã được bổ sung vào đĩa thạch (chứa môi trường Mueller Hinton). Nồng độ ban đầu của mỗi chủng vi sinh vật nêu trên là 105 CFU/ml. Hàm lượng flavonoid lần lượt được pha loãng C0, C1, C2, C3, C4 (nồng độ 0,01 %; 0,02 %; 0,03 %; 0,04 %; 0,05 %). Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành đo đường kính vòng ức chế thu được kết quả được ghi trong HO OH O OH HO OH OH OH OH H3CO OH OH H3CO OCH3 OCH3 HO OH OH OH https://skkn.net/

2 25,1 301,1433

29 bảng 3.13. Bảng 3.13 Khả năng kháng khuẩn của flanonoid với vi khuẩn Vi sinh vật thử nghiệm Đường kính vòng vô khuẩn (mm)

Samonella typhi ATCC 14028 9.0 8.0 8.0 6.0 6.0 Staphylococcus aureus ATCC 25923 8.0 8.0 6.0 6.0 6.0 Escherichia coli ATCC 25922 7.0 7.0 6.0 6.0 6.0 Nồng độ (C) Co C1 C2 C3 C4 Qua kết quả bảng 3.13 cho thấy, tương ứng với nồng độ Co và C1, đường kính vòng kháng khuẩn đối với cả 3 chủng vi sinh vật nêu trên là 7.0 cm (Escherichia coli), 8.0 cm (Staphylococcus aureus), và 9.0 cm (Samonella typhi), có nghĩa là thể hiện khả năng kháng khuẩn mạnh của hợp chất nhóm flavonoid với những chủng vi sinh vật kể trên. Đối với nồng độ C2, C3, C4, khả năng kháng khuẩn của flavonoid chỉ thể hiện đối với chủng vi sinh vật Samonella typhi với đường kính kháng khuẩn 8.0 cm ở nồng độ C2. Như vậy khả năng kháng khuẩn của flavonoid giảm theo sự pha loãng của nồng độ https://skkn.net/

30 KẾT LUẬN

Định tính thành phần dược liệu trong cao ete và cao etyl chiết từ hoa cúc La Mã, cho thấy 02 loại cao thu được từ hoa cúc La mã dương tính đối với terpenoid, flavonoid và coumarin.

Phân tích sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ một mẫu cao etyl acetat và xác định được các hợp chất thuộc nhóm flanovoid. Hoạt tính sinh học của flavonoid trong cao etyl acetat được thử trên các chủng vi khuẩn Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Samonella typhi ATCC 14028, lần lượt cho đường kính vòng kháng khuẩn là 7cm, 8cm, 9cmDo điều kiện về kỹ thuật, thời gian và kinh phí còn hạn chế nên còn một số vấn đề chưa giải quyết được nên chúng tôi đề xuất cho hướng nghiên cứu tiếp theo như sau: Chiết suất phân đoạn thành phần dược liệu trong hoa cúc La Mã bằng các phương pháp khác như: chưng lôi cuốn hơi nước trực tiếp và gián tiếp, chiết bằng CO2 lỏng siêu tới hạn, phương pháp có sự hỗ trợ của vi sóng,... để so sánh và đưa ra được phương pháp cho hiệu suất thu thành phần dược liệu tối ưu nhất.

Kết quả định lượng flavonoid toàn phần từ cao etyl acetat với chất chuẩn là catechin, hiệu suất flavonoid cao nhất thu được từ cao etyl acetat chiết từ cao etanol theo phương pháp Soxhlet kết hợp chưng ninh là 1,98%.

Tiến hành phân tích thành phần hoá học của tất cả các mẫu hợp chất hoạt động sinh học thu được từ các quá trình thực nghiệm để so sánh và đưa ra được phương pháp cho chất lượng terpenoid steroid có chất lương tốt nhất và tỷ lệ cao nhất. https://skkn.net/

Sau khi tiến hành các nội dung thí nghiệm của đề tài “Nghiên cứu trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã Matricaria chamomile”, trong khuôn khổ của đề tài thu được những kết quả như sau: Điều kiện tối ưu để tách chiết các thành phần dược liệu trong hoa cúc La Mã bằng phương pháp chưng ninh cho thấy ở nồng độ dung môi sử dụng cồn 70o, nhiệt độ 60 oC thời gian tách chiết 2 giờ với tỷ lệ “nguyên liệu/dung môi” là 1/40 là điều kiện thích hợp để tách chiết Cao ete dầu hỏa và cao etyl acetat chiết từ cao cồn bằng bốn phương pháp: chưng ninh, ngấm kiệt, Soxhlet, Soxhlet chưng ninh thì ở phương pháp ngấm kiệt hiệu suất chiết là cao nhất (7,53 %) đối với cao ete dầu hỏa; còn cao etyl acetat ở phương pháp Soxhlet chưng ninh là cao nhất (21,51 %).

31 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt [1]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia TP.HCM. [2]. Nguyễn Thu Hằng. Bài giảng dược liệu chứa flavonoid. [3]. Trần Việt Hưng, Phan Đức Bình (2014). Cây hoa của sự quân bình, Khoa học phổ thông số 199, 2014;16:22. [4]. Phan Quốc Kinh. Giáo trình các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học: phần 2, 181 121. [5]. Trần Anh Vũ (2013). Dương cam cúc, Tạp chí dược học. Tài liệu tiếng Anh [6]. European Medicines Agency (2014). Assessment report on Matricaria recutita L., flos and Matricaria racutita L., aetheroleum.Based on Article 16d(1), Article 16f and Article 16h of Directive 2001/83/EC as amended (traditional use). [7] Janmejai K Srivastava, Eswar Shankar, Sanjay Gupta (2010). Chamomile: A herbal medicine of the past with bright tuture, molecular medicine report 1;3 (6): 895 901.[8] Janmejai K Srivastava, Eswar Shankarand Sanjay Gupta (2011). Chamomile: A herbal medicine of the past with bright future. Mol Med Report, Author manuscript; available in PMC 2011 Feb 1. [9]. Janmejai K Srivastava, Sanjay Gupta (2009). Extraction, Characterization, Stability and Biological Activity of Flavonoids Isolated from Chamomile Flowers Mol Cell Pharmacol. Author manuscript, 2009 Jan 1; 1(3): 138. [10]. Journal of Applied Pharmaceutical Science (2011). German an Roman Chamolie.J. ISSN: 2231-3354, Received on: 12-12-2011, Revised on: 15:12:2011, Accepted on: 18 12 2011. [11]. Marilena marini, Carla bersani, giuseppe comi (2011). Impedance measurements to study the antimicrobial activity of essential oils from Lamiaceae and Compositae. Science Direct, Volume 67, Issue 3,5 August 2011, Pages 187 195. [12] Marziyeh Tolouee, Soheil Alinezhad, Reza Saberi, Ali Eslamifar, Seyed Javad Zad, Kamkar Jaimand,Jaleh Taeb, Mohammad-Bagher Rezaee, Masanobu Kawachi, Masoomeh Shams Ghahfarokhi, Mehdi Razzaghi Abyaneh (2010) Efect of Matricaria chamomilla L. flower esential oil on the growth and ultrastructure of Aspergillus niger van Tieghem. Int J Food Microbiol ;139(3):127 33. https://skkn.net/

32 [13]. Massimiliano Bonifacio, Antonella Rigo, Emanuele Guardalben, Christian Bergamini, Elisabetta Cavalieri, Romana Fato, Giovanni Pizzolo, Hisanori Suzuki, Fabrizio Vinante (2012). α bisabolol is an effective proapoptotic agent against BCR ABL(+) cells in synergism with Imatinib and Nilotinib. PLoS ONE 2012 01 01. [14] Nawal Hasan Al Bahtiti (2012). Chemical analysis and biological activity of Jordanian chamomile extracts. Journal of Food Science and Technology 4(1): 2225. [15]. Ompal Singh, Zakia Khanam, Neelam Misra, Manoj Kumar Srivastava (2011). Chamomile (Matricaria chamomilla L.): An overview, Pharmacogn Rev, 5(9): 82-95).[16] Orav A , Raal A, E Arak (2010). Content and composition of the essential oil of Chamomilla recutita (L.) Rauschert from some European countries. Nat Prod Res.2010;24(1):48 55. [17] Petrulova Poracka V, Repcak M, Vilkova M, Imrich J (2013). Coumarin of matricaria chamomilla L. aglycones and glycosides. Food Chem nov 1; 141(1): 54 59. Tài liệu tiếng Nga [18].

Предисловие // Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность / Отв. ред. А. Л. Буданцев. СПб. М. : Товарищество научных изданий КМК, 2013. Т. 5. Семейство Asteraceae (Compositae), кн. 2. Роды Echinops Youngia. С. 3 5. 312 с. https://skkn.net/

PHỤ LỤC https://skkn.net/

https://skkn.net/

https://skkn.net/

https://skkn.net/

https://skkn.net/

https://skkn.net/

https://skkn.net/

https://skkn.net/

https://skkn.net/

https://skkn.net/