Estudios investigación para detección y control de listeria monocytogenes en la IA Mª Carmen Rota

Estudios de investigación para la detección y control de Listeria monocytogenes en la Industria Alimentaria Mª Carmen Rota crota@unizar.es

#JornadaCITACleanity

Organiza:

Colabora:

Profesora Titular de Nutrición y Bromatología de la Facultad de Veterinaria de Zaragoza.

Miembro del Grupo en el Instituto Agroalimentario de Aragón; así como de la Red de Excelencia PROCARSE “Productos cárnicos seguros, nutritivos y saludables” Es licenciada y doctora en Veterinaria.

Es autora de diversas publicaciones científicas relacionadas con patógenos alimentarios, y en especial con Listeria monocytogenes.

En 2002 fue Cofirmante del Premio de Investigación concedido por la Asociación Nacional de Veterinarios Oficiales de Mataderos e Industrias Cárnicas.

Grupo de Investigación Consolidado

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“ Análisis y Evaluación de la Seguridad Alimentaria”

 Financiación: Gobierno de Aragón y Fondo Social Europeo  Coordinación 

Agustín Ariño Moneva



Antonio Herrera Marteache (desde 2002 hasta 2012)

Facultad de Veterinaria (Área Nutrición y Bromatología). UZA

Línea de investigación: Evaluación y control de riesgos biológicos vehiculados por los alimentos

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Listeria monocytogenes

 Listeriosis humana: enfermedad infecciosa grave • EFSA (2015): 2.161 casos confirmados en 2014 • Incremento desde 2008 • Muertes: 210 casos • España: 4º lugar

 Alimentos ”Listos para el Consumo” (LPC) • Ubicuio • Psicrótrofo • Biofilm

 Problema importante empresas alimentarias Alimentos

Superficies industria

3 3

Criterios microbiologicos en alimentos LPC: L. monocytogenes Unión Europea: Reglamento CE nº 2073/2005

Favorece el desarrollo de L. monocytogenes

No favorece el desarrollo de L. monocytogenes EEUU • • •

n=5 c=0

n=5 c=0

≤ 100 ufc/g

EN/ISO 11290-2

Productos comercializados durante su vida útil

Ausencia / 25 g

EN/ISO 11290-1

Antes de dejar el control de la empresa alimentaria

≤ 100 ufc/g

EN/ISO 11290-2

Productos comercializados durante su vida útil

pH ≤ 4,4 o aw ≤ 0,92 pH ≤ 5,0 y aw ≤ 0,94 Vida útil < 5 días

EEUU: ausencia/ 25g

Aceptabilidad de un lote

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Criterios microbiologicos en superficies: L. monocytogenes Unión Europea: Reglamento CE nº 2073/2005

Los explotadores de las empresas alimentarias que produzcan alimentos listos para el consumo susceptibles de plantear un riesgo de Listeria monocytogenes para la salud pública deberán: 

Tomar siempre muestras de las zonas y el equipo de producción, como parte de su plan de muestreo

 Detectar la posible presencia de dicha bacteria  Método de referencia: (norma ISO 18593:2013)

EEUU: ausencia/ superficies

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Comercializaciรณn Alimentos LPC EEUU

Uniรณn Europea:

Problema importante Industria alimentaria

Proyecto INNPACTO (IPT-2012-0189-060000). “ Evaluación y control del riesgo de Toxoplasma gondii en jamón y desarrollo de métodos rápidos para el análisis de Listeria monocytogenes”

Entidad financiadora: MINECO Duración: 1-1-2013 hasta 31-12-2015 I. P.: Susana Bayarri Fernández

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OBJETIVO Desarrollo de métodos de análisis rápidos para el control de Listeria monocytogenes en jamón curado loncheado listo para el consumo



Puesta a punto de un método rápido basado en la medida de la Impedancia para la detección de Listeria monocytogenes



Aplicación de la Impedancimetría al control del proceso de loncheado y envasado

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Puesta a punto de un mĂŠtodo rĂĄpido basado en la medida de la Impedancia para la detecciĂłn de Listeria monocytogenes

Ensayos con cultivo puro de 6 cepas de Listeria spp

Buenos resultados : R2 > 0,91 Elevada sensibilidad: 1 ufc

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Evaluación del método de la impedancia para la detección de L. monocytogenes en jamón curado

Impendaciometría

Muestras negativas: no curva típica.

Ausencia Listeria spp. /25 g Muestras positivas: curva típica.

Muestra negativa : 2 días Muestra positiva: 3 días 25 g jamón 225 ml OB 30 ºC/24 h

Threshold

Tiempo de detección TD

OB 30 ºC/ 24 h Presencia Listeria spp. /25 g

Contaminación experimental

Referencia ISO 11290-1 Caldo Fraser 37 ºC/48 h

OCLA 37 ºC/24-48 h

Muestra positiva: 7 días

25 g jamón 225 ml Half Fraser 30 ºC/24 h

OCLA 37 ºC/24-48 h Contaminación experimental

Confirmación: L. monocytogenes Pruebas bioquímicas 48 h

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Evaluación del método de la impedancia para la detección de L. monocytogenes en jamón curado ISO 16140:2003 Protocolo para la validación de métodos alternativos

• Inclusividad-exclusividad

• Especificidad relativa 100%

Impedanciometría

• Sensibilidad relativa 100% • Eficacia relativa 100%

vs

Referencia ISO 11290-111

• Nivel de detección relativa ≤1 ufc/25 g jamón

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Evaluación del método de la impedancia para la detección de L. monocytogenes en jamón curado

Metodología PCR

Muestra positiva: 2 días 25 g jamón + Listeria Special Broth (LSB) 30 ºC/25 h

Extracción y amplificación DNA Kit Iq-Check L. monocytogenes II 3h

Contaminación experimental

Metodo de Referencia

Muestra positiva: 7 días

Metodo de Referencia

Confirmación: Sólo muestras positivas a L. monocytogenes

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Evaluación del método de la impedancia para la detección de L. monocytogenes en jamón curado ISO 16140:2003 Protocolo para la validación de métodos alternativos

• Inclusividad-exclusividad

• Especificidad relativa 100%

PCR real time

• Sensibilidad relativa 100% • Eficacia relativa 100%

vs

Referencia ISO 11290-111

• Nivel de detección relativa ≤1 ufc/25 g jamón

12 Propuesta de método alternativo para la detección de L. monocytogenes

Características

Nº análisis simultáneos Precio/Muestra positiva

Industria alimentaria Equipo Método de

Impedanciometria

Precio/Muestra negativa Tiempo máximo Muestra positiva

• Análisis simultáneo: 64 muestras

Tiempo Muestra negativa

• Presencia de L. monocytogenes en 3 días

Inversión inicial

• Reducción de tiempo hasta 4 días frente al método de referencia ISO 11290-1

Formación personal

• Resultados negativos en 2 días (screening)

13 Aplicación de la Impedanciometría para el control de L. monocytogenes en el proceso de loncheado y envasado

Muestras  Jamón curado N=190 Presencia de L.loncheado monocytogenes /25 g

Muestra 1: pH: 6,0 y aw: 0,92

Muestra 2: pH: 5,3 y aw: 0,90

1,0%

5 muestras/lote  Superficies de la industria cárnica N=284 - Zona de deshuesado (13 zonas): 150 - Zona de loncheado (9 zonas) : 134

antes / después L+D

Muestreo: Norma ISO 18593:2013

“ Red de Excelencia” Consolider “Productos cárnicos seguros, nutritivos y saludables"

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Detección de L. monocytogenes en superficies

Presencia Listeria spp.: 36% Presencia L. monocytogenes: 9,2% Zona Deshuesado

Zona Loncheado

22 (12%)*

4 (3,7%)

Limpias

Sucias

Presencia L. monocytogenes

Presencia L. monocytogenes

ª Deshuesado (>%) * 16 (10,7%)

* Diferencia significativas (p ≤ 0,05)

ª No diferencia significativas (p ≥ 0,05)

10 (7,5%)

Prevalencia ≤ otros estudios

¡Problemática!

Presencia L. monocytogenes en industrias elaboración alimentos LPC: • Nichos/ reservorios • Biofilm • Resistencia a desinfectantes

15 Problemática de L. monocytogenes por su persistencia en la industria alimentaria Persistencia L. monocytogenes Industria alimentaria

Formación de biofilm

Adaptación a desinfectantes

Cepas esporádicas: se han introducido en la planta pero son destruidas por los procesos habituales de limpieza y desinfección

Cepas persistentes: se identifican repetidamente en los análisis de superficies, durante meses e incluso durante años

Ubicuidad Contaminación alimentos (LPC)

16 Problemรกtica de L. monocytogenes por su persistencia en la industria alimentaria Identificar: - Patrones de persistencia de L. monocytogenes en la industria

- Rutas de transmisiรณn en plantas de procesado: trazabilidad

Aislados de L. monocytogenes de la industria

Subtipos moleculares

Estrategias de control eficaces: L+D y estructurales

ยก Eliminaciรณn de la contaminaciรณn !

Ortiz et al (2016)

Proyecto de investigación “Diseño de estrategias aplicadas a la industria cárnica para el control de Listeria monocytogenes” Tesis Doctoral Doctoranda: Mirian Labrador Bernad Beca Predoctoral DGA. Gobierno de Aragón. C091/2014 (BOA 28/08/2014) Director de la beca: Mª Carmen Rota García

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Diseño de estrategias aplicadas a la industria cárnica para el control de Listeria monocytogenes”

1. Recopilación de un banco de aislados de L. monocytogenes procedentes de la industria alimentaria

2. Caracterización genética de los aislados de L. monocytogenes 3. Estudio de tolerancia de las cepas de L. monocytogenes aisladas del procesado, a distintos desinfectantes de uso habitual en la industria alimentaria 4. Aportación de medidas para el control (L+D) de L. monocytogenes en la industria y en el producto final

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Recopilaciรณn de un banco de aislados de L. monocytogenes procedentes de la industria alimentaria

Productos cรกrnicos LPC

Muestras ambientales

n= > 200 aislados

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Caracterización de la contaminación por L. monocytogenes en el proceso de elaboración de productos cárnicos LPC. SUBTIPOS MOLECULARES

Serotipos Serotipos 1/2 a, 1/2 b, 1/2 c, 4b

Pulsotipos Diversidad genética

Multiples genes Linaje I, II, III y IV

20

Caracterización de la contaminación por L. monocytogenes en el proceso de elaboración de productos cárnicos LPC.

 Serotipado  Serotipos (13). Más frecuentes (95%): 1/2 a, 1/2 b, 1/2 c, 4b  PCR multiplex: multiples cebadores Grupo IIa: serotipos 1/2a y 3a Grupo IIb: serotipos 1/2b, 3b y 7 Grupo IIc: serotipos 1/2c y 3c Grupo IVb: serotipos 4b, 4d y 4e

• Aislados alimentos • Pacientes con listeriosis

Herramienta Identificar brotes epidémicos Prevención brotes: control contaminación durante la producción y distribución de alimentos

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Caracterización de la contaminación por L. monocytogenes en el proceso de elaboración de productos cárnicos LPC.

 Electroforesis en Gel de Campo Pulsado (PFGE)  Digestión del DNA de cada cepa con endonucleasas de restricción: AscI, ApaI  Fragmentos de gran tamaño que se separan mediante electroforesis  Alta capacidad de discriminación: alimentos, plantas procesado y pacientes.  Base de datos de subtipos  Método de referencia (Técnica estandarizada): - Centro de Control y Prevención de Enfermedades (CDC) en EEUU - PulseNet International (http://www.pulsenetinternational.org)

Base de datos europea (EURL Lm DB)

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Caracterización de la contaminación por L. monocytogenes en el proceso de elaboración de productos cárnicos LPC.

 Electroforesis en Gel de Campo Pulsado (PFGE)

21 aislados 7 pulsotipos

Pulsotipos: nº cepas diferentes y su trazabilidad Brotes de origen alimentario: detección y seguimiento

• Software BioNumerics • Dendrograma: coeficiente de similitud de patrones de bandas • Método de agrupación UPGMA

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Criterios de persistencia, supervivencia y diversidad genética de L. monocytogenes

Cepas persistentes: pulsotipos detectados en el ambiente o los equipos de forma repetida (tres o más veces) durante un periodo mínimo de tres meses. (Keto-Timonen et al.

2007).

Cepas supervivientes: pulsotipos detectados tras un largo período de tiempo (2 o 3 años) Diversidad genética de los pulsotipos se estimó mediante el índice de diversidad de Simpson (D), que representa la probabilidad de que dos aislados con distintos orígenes se identifiquen como pulsotipos diferentes (Hunter y Gaston 1988)

N= nº total de aislados, S= nº de pulsotipos, ni= nº de aislados pertenecientes al pulsotipo i.

Caracterización de la contaminación por L. monocytogenes en el proceso de elaboración de productos cárnicos LPC.

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Secuenciación de múltiples genes (MLST-Multilocus Sequence Typing)  Secuenciación y detección de los polimorfismos de un solo nucleótido: •

Fragmento pequeño (500 pb)

•

Varios genes constitutivos esenciales de L. monocytogenes

•

Genes muy conservados: secuenciación da información evolutiva entre los aislados abcZ: transportador ABC dat: aminotransferasa de d-aminoácidos cat: catalasa dapE: succinil diaminopimelatodessucinilasa

bglA: β-glucosidasa lhkA: histidinaquinasa Ldh: lactato deshidrogenasa (algunos casos)

 Poder de discriminación > Técnica de PFGE  Patrones

MLST:

base

de

datos

creada

por

el

Instituto

Pasteur

(http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Lmono.htm).

Perfiles alélicos se han identificado como subtipos persistentes en diferentes cadenas de procesado de alimentos de diversos países europeos

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Caracterización de la contaminación por L. monocytogenes en el proceso de elaboración de productos cárnicos LPC.

Secuenciación de múltiples genes (MLST) Cuatro grupos genéticos: Linajes  Linaje I: serotipos 1/2b, 3b, 4b, 4d y 4e  Linaje II: serotipos 1/2a, 3a, 1/2c y 3c

Brotes y casos listeriosis Alimentos/ambiente plantas de procesado

 Linaje III: serotipos 4a, 4c y algunas cepas atípicas de serotipo 4b  Linaje IV: poco frecuentes, aisladas de animales con síntomas

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Resistencia de L. monocytogenes a desinfectantes BIOFILMS

   

Limpieza insuficiente previa a la desinfección Humedad excesiva de las superficies Aclarado insuficiente tras la desinfección Dosis inadecuada desinfectantes

Exposición a concentraciones subletales de desinfectantes

Adaptación fenotípica a desinfectantes Adquisición genética de mecanismos de resistencia

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Resistencia de L. monocytogenes a desinfectantes Estudios de resistencia de L. monocytogenes a amonios cuaternarios Reference

Origen

Pais

Aislamientos resistentes (%)

Lemaitre et al (1998)

Pollo

Francia

9%

Aase et al (2000)

Pescado

Noruega

10%

Romanova et al (2002)

Pollo

USA

26%

Ortiz et al (2014)

Cerdo

EspaĂąa

10%

Jiang et al (2015):

Alimentos

China

22%

Ortiz et al (2016)

Cerdo

EspaĂąa

79%

Cepas persistentes

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Resistencia de L. monocytogenes a desinfectantes Estudios de resistencia de L. monocytogenes a desinfectantes

 Estudios en forma planctónica: incremento del CMI en amonios cuaternarios  Eficacia a las concentraciones utilizadas en la Industria alimentaria

 Cualquier cepas puede persistir en un “nicho”  Las cepas resistentes pueden contribuir a la persistencia  La persistencia puede favorecer la adquisición de resistencia

Necesidad de identificar y controlar la persistencia: implicación de la persistencia en brotes

Conclusión

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Necesario identificar las cepas de L. monocytogenes persistentes en el ambiente de industrias alimentarias: S U B T I P O S

 Nichos  Biofilms

• Localizar • Corregir • Eliminar

 Resistencia a desinfectantes Fenotípica

Genotípica

• Seguimiento • Rotación ???

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Bibliografía Artículos científicos •

Aase B, Sundheim G, Langsrud S, Rørvik LM. (2000) Occurrence of and a possible mechanism for resistance to a quaternary ammonium compound in Listeria monocytogenes. Int J Food Microbiol; 62:57-63.

•

EFSA. (2015). The Europe Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2014. EFSA Journal 2015; 13(12):4329

•

Jiang X., Yu T., Liang Y., Ji S., Guo X., Ma J., et al. (2015). Efflux pump-mediated benzalkonium chloride resistance in Listeria monocytogenes isolated from retail food. Int. J. Food Microbiol. 217 141–145.

•

Lemaitre, J.P., Echchannaoui, H. Michaut, G., Divies, C. Rousset, A. (1998). Plasmid-mediated resistance to antimicrobial agents among listeriae. J. Food Protect. 61: 1459-1462.

•

Martínez-Suárez, J. V., Ortiz, S., López-Alonso, V. Potential impact of the resistance to quaternary ammonium disinfectants on the persistance of Listeria monocytogenes in food processing. 2016. Frontiers in Microbiology; 7:638.

•

Ortiz S., López V., Martínez-Suárez J. V. (2014). Control of Listeria monocytogenes contamination in an Iberian pork processing plant and selection of benzalkonium chloride-resistant strains. Food Microbiol. 39 81–88.

•

Ortiz, S., López-Alonso, V., Rodríguez, P., Martínez-Suárez, J. V. 2016. The connection between persistent, disinfectant-resistant Listeria monocytogenes strains from two geographically separate Iberian pork processing plants.

• Romanova N,. Favrin S, Griffiths MW. (2002). Sensitivity of Listeria monocytogenes to sanitizers used in the meat processing industry. Appl Environ Microbiol. 68(12): 6405-9

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Bibliografía Legislación y Normas ISO • Reglamento (CE) nº 2073/2005 de la Comisión de 15 de noviembre de 2005 relativo a los criterios microbiológicos aplicables a los productos alimenticios. DOUE-L-2005-82539.

• ISO 16140. 2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs. Protocol for the validation of alternative methods.

• ISO 18593:2013. Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal methods for sampling techniques from surfaces using contact plates and swabs • ISO 11290-1. 1996. Microbiology of food and animal feeding stuffs — horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes. Part 1: Detection Method.International Organization for Standardization (ISO).

Direcciones web http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Lmono.htm : Base de datos creada por el Instituto Pasteur. http://www.pulsenetinternational.org : PulseNet International.

Gracias por vuestra atenciรณn