This thesis focusses on aspects of the heterogeneity of basement membranes (BM). Chapter 1 provides a brief introduction on the structure and complcrslrio~aof normal arzd parluological BM. The DM components whtch occur in alnnosr a11 BM are briefly described :is well as the components with a more limited tissue distributiorr. Furtlrernlore [he aim of the studies described in this thesis is outlined. In chapter 2 the development of BM rcacziwe monoclonal antibodies (MA), Isy imrnunrtation of rnicewith intact denuded BM is described. MA 1052 and 1053 reacted with the ISM ofthe epidermis anci epidermal adnexa and furtlrermore in the lung with the DM of the alveolar epithelium. In the gastrointestinal tract only the superfici:ll part of zhe eplrlielial Bhll rcacted. MA 1065 showed inmunoseactivity with the epiderm~ialand adnexal BM in the skin and the epithelial DM of trachea and oesopl~agus,and f~~ntl1ermor.eshowed periceiUu1;1r staining of the basal keratlnocytes and basal corneal elpithella1 cells. MA 1087, ruijcel against human glornenilar BM, showed inumunoreaerivity wzrh all RNE, except [lie C~IS~I.~I~ epi~fvellalBM ~nthe cornea. Furthermore Ihe suscep~ilail~~yofthe targel eprlopes ol' ohelre MA for various enzymes, and the localization OF the epitopes In the cliifesenr layers ol" tlic DM was tested, the Patter lsy chesnical splitting of human skin. The results indicate that the epltopes of MA 1052, 1053, 1065 and 1087 are susceptible lor prnteases, bu~nut degraded by bacterial collagenase. In chapter 3 the epitopes of MA 1052, 1053 and 1087 are cfiaracterized. Despite tllle tllTferences observed by im~nt~nohistoche~nicaleualualion of the tissue distribution patterns of these antibodies described in chapter 2, a11 three antibodies reacted with the same bands on western blots of isolated and collagenase digested glcamerulas and amilutic DM. Comparing the molecular weight of these bands with the stained bands on irnmunoblocs crf sent from patients with anti-glornerular BM autoantiboclies, directed against the NCI domarn of type IV collagen, identical parrehns of immunoseactivi~ywere Eo~lnd.From thcse findings we concPwde that all three rnonoclona! antibodies are reactive with epitopes localizecl In the non-collagenaus (NCI) domain or' type IV collirgen. An example oEBM hererogelrc~tyin cunnecjionwrth one type of epilliell~~nr 1.4 tfc$cr.~he~I i11 chapter 4. We Cr~undthat ctnrral human cphhelial corneal BM lacks ImImuntw-cac~lv~~y lor. type IV collagen, using various cuntr-~ypc1V collager~anti[rotlies. In sirn~l:~!expcr ililcr~l\ larnirzln was founcl unnformly drstribured rn the eratlre corneal ep~ihel~alE3M. By e8uc~1onlnrcroscopy the central corneal region did not show 21 cllaraelerisnie ejr~thelit~l13M. Scvi:r;~l explanat~onsare considered for the apparent lack of type 1Y collagen Irnln~tnoresc~iv~ly:I. Type IV collagen is totally absent and a dlffererzt structural component 1s depoc~lctlor Bowman's membrane takes over type 1V collagela h~nction;2. Type 1Y collagen de~ernlinants are masked by glycopmteins or protengllycans; 3. The arrangement of BM cornpnnenrs in a ~~~pramnlecularstructure is altered res~~llingin loss of type PV collagen deterrninmaas. If type IV collagen is indeed ;~bsent this could be due to the 11rgt.r level 01 d~fferennrakmnof cenzsal corneal epithelium, which 1s generalcd in the linlbal prolircratron
Tone, asseurning that highly drffcrentiated epithelium can not produce a BM.Aiternatively, the acell~~larrow man^ membrane rn~gk~tlack triggers to induce its production by the egirhe&lalceBi5. It is cancliladed that central human corneal epithelial BM is the only BM which lacks i~nraat~noreactiviiywith antibodle@to type IW collagen, and therefore the basic ~trklcturc ofthis BM might be different from that of other BM. In chapter 5 we describe tfne isolatnon and cultivation of umbflical cord stromal cells. The stromal cell by immunohistochem~~tsyappears ha combine characteristics of muscle cells, in containing desmin, smooth muscle actin and myosin and being enveloped by BM c~mpcrnclzts, and of Fibroblasds, nn being reactive with fibrnoectisr. Lslrrasrructurally, rhew c~Ii$ have the same characteristics as rnyofihrc>blastsIn granulation tissue or In healing \vo~r~~ds. 'I'laey canbalm EibrnbIasl-like erid~pla~sn~creticulum, peripheral parallel cytoplasrnaaic frldmerits with deme body condelisations and discontinuous extracellular BM-like material. Tllerefore, we conclude that the stromal cells of the umbilical cord strunla are rnyofibroblasts. Myc~fibroblastsappear lo be the only cell type which produce ample amounts of BM material which is not tiepasited into a continuoilrs BM. 117chapler 6 expesisnelats are described with human colonic tumor cell lirzes (5583-E, HT291, wl~ichdo not prcjduce imrnunoreacrivc BM type I"/ collagen m vim. These ceils were xenograftec! j~ztonude rats lo generate epithelial neoplasms. By irnmunnhistochemistry, no hulnarr but only rat type IV collagen containing BM were observed at the rransihon nf lilmor. cells and Pias1 strorna. TWOother tumor cell lines (WISH, KB), showed BM strilceaires in vivo which stained both wit11 h~rmarland host specific anti-type IV collagen ant[bodics. 'Tiiese findings were in, agreement witla results of in siru hybr~dizationexperiments using a type IY collagen c-DNA probe. 111the xenografts c>E 5583-E an3 H'T-29, hyhridization was observed exclusively wit11 tlae rat nncsencliyme between the tumor cells, wherea.. xenogsalts of WJS1-Iand KB showed a hybridiration reaction with the tumor ceils anti rat stronial ct~n~ponents.Furihcrmorc in sat cprderrnls hybr~d~~arionwas ol3seneci ~~ii1l11~14a1 kcralinacyies ant1 wEth Lhe strorna adjacent ro 'the epirhclial DM. Fros71 these result< wc cr)nclucie tllan in xenogri~ftsof ll~rnnancancer cells but also in normal epithelia, s~romalcell, conaril311leLa llnc deposition of a DM. In chapter 7 experiments are described whlch attempted to screen human normal ancl tiiim~irceils In their eupabili~yto produce BM cornpclnents in vitro. Cells were grown on geliltin ca>;~zcdgPi1ss slides or 011denuded amniotic BM or cytocentrifuged on glass slides ancl slruii~eilwith anrciboclies LO BM components. Culture supernatants were precipitated and .subseq~renzlyelectropluorescd and inmmunoblotted using antibodies to 13W eomponen[s. Cytopl;~\~n~cLype IQ cc~llngenml?NA was deterrli~nedby Northern blotling. Furtllermore, the tc~leof;~rtif"icialextracellular matrix was investigated In ~tsability to ialfluence the proclriclionr of 13M cornponcrlrs in vltro. Only a few cell lines (KB, WlSPI and rnyofibroblasts) tvere still capable to procluce Bh/n components In vntro. It1 chapter- 8, ~Eicresults or the studies are cllsc~nssedin s broncler context. I:inaily, rn cliill~tcr(3 some of the technic~uesused in the experitnents reported In rh~sthesls are exte~lslvelyclcscrihec4.
So far BM research has primarily foc~issedan the components irblch c;rn be ok~herved1t1 nearly all BM. Our experiments sbow the1 the n~.~crolnr>lecularstszlctL~reOF rhe Rkil ,\rrtl even the molecular structure of individual UM campoilent5 may vary deperrtltng on 11reccli or Wetiss~zetype.hlrtherrnore SI~OW thai, in contrast ro the grl~erally,~ccepaedconcept tiv~tt"e~~~tl~c~Ii;il' 13M are produced by epitheilal cells, mesenchymal cclls do CCPIILP~~~U~~ co pro~l~cr~tt~l and deposition of BM cornponelzts at the bound;[ry of epithelium sucl ~lnderlyirlg$ti om,a, uvhich lead to the formation of the epithelial/mesenchymI BM.
In dit proef~chiiftworden enkele aspecten vilia basale mernliraan Izeteroge~~tteir[Bkll) Inbelicht.hoofdstuk
1 wordt de structuur en saniensrelling wail de normale en yaclrolnpisch af~,vijkendeBM beschreven. De BM cornponenken worden ingedeeld in bestiaiilddelen clie in alle BM worden waargenomen en conzpoiieiiteii die een gelimiteerde BM distributie hebbeili. In het laatste gedeelte van dit hoofdstuk wordt de vraagstelling van clit proefsclnrift geschetst.Tnhoofdstuk
2 wordt de ontwikkeling van monoclonale antilichameii (MA) beschreven, door muizen te irimuniseren met intacte BM. MA 1052 en 1853 reageren met de BM van huid, talg- en zweetklieren en haarschachtenvan de huid ei1 verder in de loc- met de BM van het alveolaire epitheel. In de maag-darm tractus reageren deze rnui~oclontllenalleen met de BM aan de top van de villi of crypten. MA 1065, dciareiitegeil, reageer1 alleen naet cle BM van cle Eiuid, klieren en I~aarsehachtenvan de huid ei1 rnet de epitl-seliale BM virti slokdarmi en luchrpijp. Verder reageert MA 1065 ook pericelltiiliiir met basale Eii~idcellen en basale cornea epi~lneelcellenz.MA 1087, opgewekt door iinisu~ii~isxrieinei glornerulrrire BNP, reageert rnet allc DM, met uitzoriderinrg van de centrale epitlzeliiale BM in clz coi iic:r. Vervolgeris ~ifordtde gevoeligheid var1 dc epiropen van deze MA voor vcrschillciidc enzymen beschrevei~.De epitopen van MA 1052, IQ53 en 1065 zijn gevoelig vocii. proteases, maar blijven intsict na collagenace-digestie. De lacalisatie van de cpltopeii in dc verschillende lagen van de BM, gebeurde na chemische splitsing in de BM. Stukjes humane huid worden gaïrncubeerd met een zoutoplossing, waarna de opperhuid van de lederlluid kan worden gescheiden, waarbij de splitsing plaats vindt binnen de BM. De verscliilllende lagen worden afzonderlijk aangekleurd met de MA. De epitopen van MA l052 en 1053 komen voor in het gedeelte van de BM dat na splitsing vastzit aan het stromalle deel van de huid. Het epitoop wan MA 1065 wordt geiocaiiseerd in biet BM-gedeelte, dat na splitsi~igdirect .tegeil de epitheel cellen aanzit. Boveneljen wordt dit epiroop waargenomen roaidom de basale epitheel cellen. In hourds~uk3 worden de epitopenvan MA 1052, 1053 en 108hnader gekaraktcrisaerrf. In legei~stellarugtot de verscllillen die qua aarikleurii~gspatroon kUSSe11 deze MA wordt waargenomen (hoofdstuk 21, icagerena deze drie antllicharneir iner dezelfde eiwitbrinden op western blotc, van coillagenase gedigesteertje glurnerullnire en arnnn0i.i BM. Identieke aankleuriiigspa'dronen worde1.i waargenomen, warilieer de rnolecuul gewichien vtiti de7.c banden op western bJot worden vergelekeil mek de aankleuringspéutroiiei~van ser:i vali patienten me?anti-glomeruilaire BM autoianailichanien, gericht tegen het NCI cloon~' VC~II lype IQ collageen. Liin deze bevindingen kunnen we concluderen dat de MA 1052, IC153 cri 108'7 gericht zijn regen epiitopen die zich binnen het NC'J-domein van xype 1V ccillageeii~ bevinden. De moleculaire slructumr vali d~tNC1-domein verschilt afliankelijk vaml wecfsel of cel type.
Samenvatting
Concluderend kunnen we stellen dat de centrale cornea epitheliale BM de enige BM is die type IV collageen mist. De basale structuur van deze BM is waarschijnlijk verscl~illendvan andere BM. In hoofdstuk 5 wordt de isalatie en het kweken van navelstreng stroma cellen beschreven. Deze stroma cel bevat. iinmunohistocheri~ischekarakteristieken zowel van gladde spiercellen (desmine, glad spierweefsel actine, myosine), als van fibroblasten (fibronuectine). rlJltrastructuree1 bevatten deze cellen dezelfde karakteristieken als myofibroblasten, die o.a. voorkomen bij de wondgenezing. Deze cellen bevatten eeii fibroblast-achtig gedilateerd elzcloplasrnatisch retnculuni, periiere parallelle cytnplasmntische filamenten met focale condensaties, en discontii~uëcxtracellulsiire BM deposities. Deze bevindingen suggereren dat de stramale cellen van de navelstreng myofiliroblasten zijn. De myafibroblast is het enige cel type dat behoorlijke hoeveelheden BM cnnnponenren maakt, maar deze niet in een contiilue BM structuur * fzetten. Iri hoordstilik6 worden experiinenten bescl~revenmet huinane colon t~iinicarcellijnaen (5583-12, NT-29), die geen type IV collageen maken in vitro. Deze cellen werden ingespoteil in naakte ratteil om epitheliale inainoren te genereren. Met beliulp van iminuiicihistoct~emie wordt geen l~~irriune-,maer alleen een ratte-type IV collageen bevs~rten~ieBM wa:nrgen/mcn hij tie overgang van humane tunnor cellen en het omliggende gzislheci. (ratte) strama. Twee andere tumor cellijnen (WISH, KB), gaven i11 liaakte rnlzen BM structuren te zien die 7oweP met huinaan als met gastheer specifieke anti-type IV collageen :~ntilich~imenreageren. Dezc bevindingen zijn in overeenstemming inet C~Cresultaten van U? sital l-iybridisntieexperinicnten waarbij gebruik werd gemaaki van een LypdV collageen CDNA probe. In de xenografts van 5583 en MT-29 werd alleen Irybridlsatie waargenomen niet cellen in hei rattestroma, terwijl xcnografts van WIS13 en
2. 'Ope lV collageen epitopen worden gemaskeerd doos andere BM componenten zoals glycoproteïnec; of proteoglycanen.
3. De supramoleculaire stmct~iurvan BM componenten is veranderd waardoor de type IW collageen cpinopen verloren gaan. De afwezigheid van type TV collageen kan worderi werkilaard door de hogere differenaiatie graad van het centrale cornea epitheel t.o.v. het eplthee1 in het perifere gedeelte. Hoger gedifferentieerde cellen zijn mogelijk niet meer in staiit type /V collageen te produceren. Een andere mogelijkheid is, dat dc acellulaire en avasculaire membraan van Bowman bepaalde prikkels mist, die nodig rijn voor het epitheel om type TV collageen te produceren.
Een votsai~eeldvan E3.M he~erogeniteitbinnen een type epiheel wordt beschreven in hoofclcteik 4. De epitheliale 13,M van het centrale deel van de cornea bevat geen ypc collrugeen, terwijl andere BM componenten, zoais laminine en heparan sulfaai proteoglycaan, over de totale lengte van de cornea wordt waargenomen. U%trasrnlctureel wordt in ]-iet centrale gedeelre van de cornea geen norinale continue epitheliale BM waargenomen. Mogelijke verklaringen voor de afwezigheid van type IY collageen imnauruorealctfviteit kztni~enzijn:
1. Type IV collageen is totaal afwezig terwijl een andere structurele componerir of de membraan van Bowman cleze ~dructu~elefunctie van type IV collageen overneemt.
Tot dusverre is veel onderzoek verricht aan conipaneiilen die in alle BM vooi-knrneii. 11-1 dil proefschrift wordt echter beschreven, dat de niacratnoleculaire samel~siellingen zelfs clc moleculaire structuur van afzonderlijke componenten kunnen verschilleri, afhallkeiijk van het weefsel of de cel waarin deze bestanddelen voorkomen.
In dit onderzoek wordt tevens beschreven, dat in tegeilstellirzg tot cle algemccrn geaccepteerde opvatting, namelijk, dat de epitheliale DM enkel wordcn geproduceerd door de aangrenzende epihheelcellen, 6ók de stromale~nesei~cI~y~nalecellen een bijdrage leverei1 bij de tot stand koming van de "epitheliale-mesenchy~nale"BM.
In hoofdstuk 7 worden experimenten beschreven waarin wordt getracht de productie van BM componenten in vitro te screenen. Cellen werden gekweekt op gelatine gecotite object-glaasjes, op gedenudeerde amnion Bh4 of gecelïrrifiigeerd op glaasjes en vervolgeias aangekleurd met de anti-BM antilichamen. Supernatant van deze celkweken werd geprecipiteerd en vervolgens geEleccrofoseerd en geblot iaa ar niuacellulose papier en aangekleurd met de antilichamen gericht tegen BM componenten. Qroplusrnatlsch type IV collageen mRNX werd bepaald d.m.v. nortbes11 blotting. Verder werd de ral van een artificiele extracellulaire inatrk getest op de beinvloeding van cle productie van BM componenten En vitro. Slechts een aantal van de geteste tumor ceLlijnen (WlSH, KB, myofibroblasten) waren in vifro nog in staat om BM companenitcn te proclucereil.
KB, zowel met de tuniorcellen als met de cellen in het rattestroma hybridi~iitittte zien gaven. Verder werd in ratle-epidermis hybridisatie \~~aargenornenzowel In de !>;.isale keratinoqten als in stroma ce31ei1 aamgreriaend aan de epitheliale BM. Uit deze resultlaien kan worden geconcludeerd dat in xenografts van humane tumorcellen, maar c>& in normale epithelîa, stromale cellen een sol spelen bij de depositie van de BM.
In hoofdstuk 8 worden de resultaten van deze stiidies belicht regen een bretleie achtergrond. Tevenworden enkele suggesries voos verder onderzoek in de niibi,je toekomst besproken. Ten slotle worden in hoofdstuk 9 enkele technieken tiltgebreider beschreven.
