Enfermedades virales en jitomate y chile ocasionadas por especies del género Tobamovirus

Enfermedades virales en jitomate (tomate) y chile ocasionadas por especies del género Tobmovirus, con énfasis en Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV) Cd. Obregón, Sonora. 8 marzo 2019

Dr. Ramiro González Garza Biociencia, S. A de C. V. Oficina: (81) 83726827; Celular: 8113246160

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¿Qué le pasa a mi planta?

¿Quién de los presentes no ha oído esa pregunta cuando los síntomas con claros de virosis?

Adolf Mayer trabajando en Holanda en la estación experimental de Wegeningen le pidieron unos agricultores que estudiara una enfermedad que les estaba afectando las plantas de tabaco, enfermedad que el llamó “Enfermedad del mosaico del tabaco” y describió sus síntomas en detalle. Demostró que la enfermedad se podía trasmitir usando sabia de la planta afectada como inóculo para infectar a planas sanas. El supuso que la enfermedad podía ser diseminada por una bacteria muy pequeña o por una toxina

En 1892 Dmitri Ivanovsky demostró que la enfermedad del mosaico del tabaco, era causada por un agente "invisible" altamente contagioso, capaz de pasar a través de un filtro de porcelana Chamberland que las bacterias no pueden atravesar.

En 1898 Martinus Beijerinck repitió el trabajo de Ivanovski. Adicionalmente, logró la transferencia de dicho "agente filtrable" de una planta a otra y por primera vez utilizó la palabra Virus.

Padres de la virología

Francis O. Holmes en 1929, científica del Boyce Thompson Institute for Plant Research (Yonkers, NY), produjo lesiones locales inoculando el TMV en Nicotiana gultinosa y que éstas lesiones eran proporcionales a la dilución del inóculo

En 1935 Wendell Stanley cristalizó la nucleoproteina del Virus del Mosaico del Tabaco (TMV), aunque el pensó que había cristalizado una proteína pura.

Por su descubrimiento fue galardonado con el premio novel de química en1946, fue el primer premio nobel concedido a un virólogo.

Stanley primero descubrió que el TMV era desactivado por la enzima Tripsina, lo cual le dio la pauta, de la naturaleza proteica del TMV. El pensamiento científico de mediados de 1930 se concentraba en que el material genético de los organismos, tendría que estar contenido en las proteínas, ya que el ácido nucleico era una estructura tan simple como un almidón.

Wendell Stanley

¿Qué es un virus? ❑ El virus es una nucleoproteina que se multiplica solamente en las células vivas y tiene la capacidad de causar enfermedad ❑ Es demasiado pequeño para ser visto en microscopios ópticos ❑ Los virus atacan a toda las formas de vida, desde los humanos, animales, plantas y todo tipo de microorganismos ❑ Existen descritos aproximadamente 4,000 virus diferentes, de los cuales 1000 de ellos, parasitan plantas y se describe un virus nuevo cada mes

Formas de virus

Tomado de: Agrios, G. N. 2005 Plant Pathology 5 th. Edition. Elseviere Academic press. 922 p

Cรณmo se clasifican los virus a diferencia de los demรกs patรณgenos y seres vivientes

En 1966 se crea el Comité Internacional de Taxonomía de virus (ICTV).

El primer reporte de Clasificación y Taxonomía de virus fue editado en 1971 y el último reporte editado fue en el 2011 ahora es en línea, no editado. https://talk.ictvonline.org/

https://viralzone.expasy.org/

CaracterĂ­sticas de la partĂ­cula viral y su genoma de un Tobamovirus (TMV, ToMV y del virus nuevo TOBRFV, entre otros)

Género Tobamovirus Número de especies del género

Especies que afectan a Jitomate y Chile

Especies del gĂŠnero Tobamovirus Tobacco mosaic virus Bell pepper mottle virus Brugmansia mild mottle virus Cactus mild mottle virus Clitoria yellow mottle virus Cucumber fruit mottle mosaic virus Cucumber green mottle mosaic virus Cucumber mottle virus Frangipani mosaic virus Hibiscus latent Fort Pierce virus Hibiscus latent Singapore virus Kyuri green mottle mosaic virus Maracuja mosaic virus Obuda pepper virus Odontoglossum ringspot virus Opuntia chlorotic ringspot virus Paprika mild mottle virus Passion fruit mosaic virus Pepper mild mottle virus

Plumeria mosaic virus Rattail cactus necrosis-associated virus Rehmannia mosaic virus Ribgrass mosaic virus Streptocarpus flower break virus Sunn-hemp mosaic virus Tobacco latent virus Tobacco mild green mosaic virus Tomato brown rugose fruit virus Tomato mosaic virus Tomato mottle mosaic virus Tropical soda apple mosaic virus Turnip vein-clearing virus Ullucus mild mottle virus Wasabi mottle virus Yellow tailflower mild mottle virus Youcai mosaic virus Zucchini green mottle mosaic virus

Diagrama del genoma del virus del mosaico del tabaco (Tobacco mosaic virus, TMV) El genoma del TMV es una molécula de ARN mensajero que produce 4 proteínas durante la infección viral

Tomado de: Gergerich, R. C. et al. 2006 DOI: 10.1094/PHI-I-2008-0122-01

http://www.dpvweb.net/dpv/showdpv.php?dpvno=370

Tobacco mosaic virus Introduction Main Diseases Geographical Distribution Host Range and Symptomatology Strains Transmission by Vectors Transmission through Seed Transmission by Grafting Transmission by Dodder Serology Nucleic Acid Hybridization Relationships Stability in Sap

Purification Properties of Particles Particle Structure Particle Composition Properties of Infective Nucleic Acid Molecular Structure Genome Properties Satellites Relations with Cells and Tissues Ecology and Control Notes References Acknowledgements Figures

Tobacco mosaic virus

Transmission by Vectors Virus transmitted principally by mechanical inoculation. Virus has no true vectors, although there have been reports of incidental transmission by chewing insects, most probably by mechanical means (Lojek & Orlob, 1969; Harris & Bradley, 1973). Soil-borne virus particles or fragments of infected tissue can serve as sources of infection via roots. Virus is very persistent on clothing and on glasshouse structures (Broadbent & Fletcher, 1963).

Transmission through Seed Not transmissible via seed or pollen. However, virus is often present in the seed coat, and there are occasional reports, principally with tomato, of plants consequently becoming infected by wounding of the embryo during germination (Broadbent, 1965).

Nuevas especies de Tobamovirus Los genes de resistencia TM-1, TM-2 y TM-22 y el gen “L” en chiles, han sido recientemente rotos por mutación de los Tobamovirus recién descubiertos: virus de mosaico de tomate moteado (ToMMV), reportado en Brasil, México, y los EE.UU., y el gen de resistencia TM-22 y el L, ha sido roto por el virus rugosos del tomate (ToBRFV) reportado en Israel (2014), Jordania (2015), EEUU (2019), Alemania y México (2019) (https://www.eppo.int/ACTIVITIES/plant_quarantine/alert_list_viruses/tomato_brown_ru gose_fruit_virus)

http://www.dpvweb.net/dpv/showdpv.php?dpvno=330

Pepper mild mottle virus Introduction Main Diseases Geographical Distribution Host Range and Symptomatology Strains Transmission by Vectors Transmission through Seed Transmission by Grafting Transmission by Dodder Serology Nucleic Acid Hybridization Relationships Stability in Sap

Purification Properties of Particles Particle Structure Particle Composition Properties of Infective Nucleic Acid Molecular Structure Genome Properties Satellites Relations with Cells and Tissues Ecology and Control Notes References Acknowledgements

ÂżCĂłmo se trasmite un virus en Vegetales?

Los virus no pueden penetrar la cutícula de las plantas, ni la pared celular de celulosa, la forma como pueden hacerlo, es a través del óvulo por la fecundación de un polen infectado, semilla, o por un vector o una herida, que rompa éstas barreras defensivas de la planta

Formas de trasmisiรณn de los virus Mecรกnica (contacto) Insectos Arรกcnidos Nematodos Hongos Cuscuta Semilla Polen vegetativa

Prueba de trasmisiรณn virus por injerto, cortes en tejido

Prueba de trasmisiรณn virus por injerto, cubriendo el tejido

Transmisiรณn de virus por contacto, semilla y polen

Transmisiรณn de virus por insectos

Transmisiรณn de virus por nematodos, รกcaros y hongos

Transmisión de virus por insectos: Definiciones

Período de adquisición.- Tiempo que el insecto necesita para adquirir el virus.

Período de incubación.- tiempo requerido por el insecto entre el período de adquisición y el período en que puede trasmitir el virus Período de inoculación.- el tiempo que el insecto necesita para trasmitir el virus a una planta sana Período de retención o infectividad.- período que el insecto permanece infectivo.

Diagrama de un รกfido vector alimentรกndose en una planta hospedante, y mostrando el camino interno de un virus circulativo

Tomado de: Gergerich, R. C. et al. 2006 DOI: 10.1094/PHI-I-2008-0122-01

Virus de importancia en hortalizas trasmitidos por mosquitas blancas em México Begomovirus (SSDNA + )

– Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV) – Pepper huasteco Virus (PHV) – Chino del Tomato Virus (CdTV)

Crinivirus (SSRNA + ) – Tomato Infectious Chlorosis Virus (TICV) – Tomato Chlorosis Virus (ToCV)

Torradovirus (SSRNA +) – Tomato Torrado Virus (ToTV) – Tomato Apex Necrosis Virus (ToANV)

Virus de importancia en cultivos hortícolas trasmitidos mecánicamente Tobamovirus – – – –

Tobacco mosaic virus (TMV) Tomato mosaic virus (ToMV) Tomato Brown rugose fruit virus ToBRFV) Pepper mild mottle virus (PMMoV)

– Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV)

Potexvirus – Potato virus X (PVX) – Pepino mosaic virus (PepMV)

¿Como infecta un Tobamovirus si no tienen insectos ni otro tipo de vectores?

Los Tobamovirus infectan todas las células de las plantas huéspedes y se trasmiten mecánicamente

Punto de dilución Máxima de la sabia: 1:100;000,000

Tomado de: https://slideplayer.es/slide/5454337/

Diferentes acercamientos de la epidermis de una planta de jitomate

Los tricomas son cĂŠlulas vivas de la planta de tomate

Ciclo de replicaciรณn del virus del mosaico del tabaco (TMV)

Tomado de: Gergerich, R. C. et al. 2006 DOI: 10.1094/PHI-I-2008-0122-01

El proceso de movimiento de célula a célula es relativamente lento: el tiempo de multiplicación viral en una célula y su posterior movimiento a otra varía entre una y varias horas

Tomado de: Gergerich, R. C. et al. 2006 DOI: 10.1094/PHI-I-2008-0122-01

Translocaciรณn de un virus en una planta

Tomado de: Agrios, G. N. 2005 Plant Pathology 5 th. Edition. Elseviere Academic press. 922 p

ÂżComo se detecta un virus?

SĂ­ntomas en tomate y chile causados por el Tobacco mosaic virus (TMV)

SĂ­ntomas causados por el Tomato mosac virus (ToMV)

SĂ­ntomas causados por el Tomato brown rugose fruit virus (TOBRFV)

Tobamovirus en tomate y pimiento

Potexvirus en tomate

SĂ­ntomas causados por Pepper mild mottle virus

Los síntomas de una planta infectada con virus pueden variar de acuerdo a: La temperatura La luminosidad La variedad o cultivar La fase fenológica del cultivo en la cual sucedió la infección • La nutrición del cultivo • La cepa o aislamiento del virus • Infecciones mixtas con otros virus Etc. • • • •

Técnicas utilizadas para la diagnosis de un virus en plantas Sintomatología (absolutamente no recomendada Plantas diferenciales (indexación) Microscopía Electrónica (de apoyo, no diagnóstico) ELISA (Serología) en placa, membrana, tira reactiva (inmunocromatografía) PCR y RT-PCR Amplificación de polimerasa recombinante RPA Segunda generación de secuenciadores

¿Como se detectan los virus y otros patógenos con las nuevas tecnologías?

Agdia ImmunoStrips

30 minutos o menos

Tiras reactivas (ImmunoStripsTM) Colchón de la muestra

Esqueleto plástico

Colchón del conjugado

Líneas de reacción

Colchón absorbente

Membrana

Anticuerpos específicos de la proteina X buscada (móvil)

Muestra

Oro coloidal

Anticuerpos específicos de la proteina X buscada (inmóvil )

Anticuerpos específicos al oro coloidal (immobile)

Protéine X

1 Depósito de la muestra

1 2

3

3

2 Membrana con conjugados

Membrana

La muestra penetra a la membrana por capilaridad

Los anticuerpos específicos unidos al oro coloidal reconocen el epítope requerido de la proteína X

Acarreado por el buffer el complejo migra por la tira. El epítope del patógeno es reconocido por el anticuerpo pulverizado en la membrana

Línea de prueba

4

5

Línea de control

Membrana absorbente

4

El exceso de oro coloidal es reconocido por los anticuerpos específicos y revelan la línea de control

5

La membrana absorbente va a absorber el exceso de buffer

Los diferentes pasos de una prueba de ELISA para la detecciรณn de virus

Adiciรณn de Anticuerpo

Lavado

Adiciรณn de La muestra

Lavado

Adiciรณn del Conjugado

Lavado

Adiciรณn del sustrato

Resultado de ELISA

Reacciรณn en cadena de la polimerasa (PCR)

Termociclador de punto final

Ciclos de la PCR

Amplificaciรณn del fragmento de ADN en una prueba de PCR dentro del termociclador

Visualizaciรณn del fragmento amplificado de la PCR en el gel

ÂżQue hace el Laboratorio Biociencia cuando recibe una planta de Jitomate (tomate) o chile para detecciĂłn de virosis?

Barrido (Screening) de virus en jitomate recomendado por el laboratorio de la empresa Agdia. Inc. Los 14 virus mĂĄs comunes encontrados en los EUA y en las muestras que la empresa trabaja a nivel internacional, con la tĂŠcnica usada para su diagnĂłstico

Virus menos comunes (23) pero tambiĂŠn encontrados por la empresa Agdia, Inc. afectando al cultivo del jitomate en sus muestras trabajadas nacionales e internacionales, con la tĂŠcnica usada para su diagnĂłstico

Protocolo de diagnรณstico para el ToBRFV del CNRF

Flujo del trabajo de la detecciรณn del ToBRFV del CNRF

Se solicitan para el diagnĂłstico 1000 semilla, se procesa la mitad de ellas se remojan durante la noche y se siembran en charolas estĂŠriles

Una vez germinada se toman las hojas cotiledonares y se maceran, en cada muestra los guantes se desechan para evitar contaminaciรณn

La muestra se macera y se pasa a tubos Eppendorf estĂŠriles, el resto del macerado es guardado al 70 grados bajo cero

Nueva TecnologĂ­a. AmplificaciĂłn de la Polimerasa Recombinante

Muchas gracias