Biocatalyst

Biocatalyst

December 2020

Discovering

SARS-CoV-2 Biocatalyst | December 2020

1

2

Biocatalyst | December 2020

Biocatalyst December 2020

Afandi Andre Hendrawan Anwar Fauzi Rakhmat Aulia Gusning Ati Dianti Nurwinda Destari Ira Rhabbiyatun Syani Lestari Wevriandini Nadira Rahmatunisa Nisrina Fitri Nurjannah Nisrina Pratsaniyati Sari Marina Wulandari Nasution Muhammad Azri Muhammad Fauzan Muhammad Fauzan Muttaqin Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati Institut Teknologi Bandung

Biocatalyst | December 2020

3

KATA PENGANTAR Puji syukur penulis ucapkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat-Nya, sehingga penulis bisa menyelesaikan Buku Protein SARS-CoV-2. Buku ini disusun oleh peserta kelas BT6112 Teknologi Biokatalis dan Enzim, Program Studi Magister Bioteknologi, Institut Teknologi Bandung. Adapun tujuan dari disusunnya buku ini adalah untuk memberikan informasi kepada masyarakat luas tentang berbagai macam protein penyusun SARS-CoV-2 secara sistematis dan mudah untuk dipahami. Dengan begitu, kami berharap buku ini memiliki daya tarik yang lebih luas di kalangan masyarakat untuk lebih memahami berbagai protein penyusun SARS-CoV-2 dan akhirnya meningkatkan kepedulian kita bersama-sama dalam memerangi pandemi SARS-CoV-2 yang dihadapi saat ini.

Pada buku ini akan dijelaskan baik protein struktural maupun non struktural yang berguna dalam proses infeksi SARS-CoV-2. Struktur, fungsi, dan mekanisme dari setiap protein penyusun SARS-CoV-2 akan dijelaskan secara lebih dalam sehingga informasi ini memberikan gambaran bagi pembaca untuk mengendalikan virus ini. Berbagai metode seperti pembuatan vaksin, antibodi, ataupun inhibitor yang potensial berdasarkan karakterisasi struktur dan fungsi pada tiap protein penyusun SARS-CoV-2 juga akan dijelaskan pada buku ini. Maka dari itu, kami juga berharap dengan adanya buku ini pembaca dapat menemukan berbagai macam ide pengobatan dan mengembangkan penelitian dalam mencegah infeksi dari SARS-CoV-2 serta penyebarannya.

Tersusunnya buku ini tentu bukan dari usaha penulis seorang. Dukungan moral dan material dari berbagai pihak sangatlah membantu tersusunnya buku ini. Kami sampaikan terimakasih kepada Prof. Dr. Zeily Nurachman dan Dr. Ernawati Arifin Giri-Rachman selaku dosen pengampu mata kuliah BT6112 Teknologi Biokatalis dan Enzim atas segala kontribusi di dalam penyempurnaan buku ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada keluarga, sahabat, rekan-rekan, dan pihak-pihak lainnya yang membantu secara moral dan material bagi tersusunnya buku ini.

Penulis menyadari bahwa penulisan buku ini masih jauh dari kata sempurna. Maka dari itu, penulis sangat mengharapkan partisipasi pembaca untuk memberikan masukan baik berupa kritikan maupun saran untuk membuat buku ini menjadi lebih baik dari segi isi maupun segi yang lainnya. Penulis mohon maaf bila ada hal yang kurang berkenan dalam penulisan buku ini. Akhir kata, penulis mengucapkan terima kasih dan selamat membaca.

Bandung, 22 Desember 2020

Tim Penyusun

4

Biocatalyst | December 2020

DAFTAR ISI Daftar Isi KATA PENGANTAR 4 DAFTAR ISI 5 BIODATA PENULIS 6 Bagaimana Sars-CoV-2 menginfeksi manusia? 9 PROTEIN E: Envelope, ‘Kemasan’ Sars-Cov-2 12 PROTEIN S: Spike, Tanda Pengenal SARS-COV-2 20 PROTEIN N: Nucleocapsid, ‘Kemasan’ RNA. 27 NSP12: Polimerisasi oleh RdRp 30 NSP13: Helicase, Unzipping RNA 32 NSP9: Tempat Pengikatan RNA Saat Replikasi 35 NSP10: Bersama dengan Nsp14 dan Nsp 16 dalam Metilasi RNA 37 NSP14: Proofreading 39 NSP16: Penyamaran RNA Sars-CoV-2 44 NSP1 49 NSP3 52 NSP5: MPro 56 NSP6: Induksi Autofagi pada Sel Inang 61 ORF3a: Inflamasi dan Apoptosis Sel hingga Pelepasan Virus 67 P E N U T U P 69

Biocatalyst | December 2020

5

BIODATA PENULIS Muhammad Fauzan Muttaqin Siregar 10416027 S1 Mikrobiologi Bioteknologi Mikroba

21119005 S2 Bioteknologi Bioteknologi Mikroba

Nisrina Pratsaniyati Sari

Muhammad Azri

11917027 S1 Teknologi Pascapanen Bioteknologi Mikroba

21119013 S2 Bioteknologi Bioteknologi Mikroba

Marina Wulandari Nasution

Lestari Wevriandini

20519034 S2 Kimia Biokimia

6

Ira Rhabbiyatun Syani

21119016 S2 Bioteknologi Bioteknologi Mikroba

Dianti Nurwinda Destari

Anwar Fauzi Rakhmat

20619302 S2 Biologi Genetika dan Bioteknologi Molekuler

21119018 S2 Bioteknologi Bioteknologi Mikroba

Andre Hendrawan

Muhammad Fauzan

21119003 S2 Bioteknologi Genetika dan Bioteknologi Molekuler

21119019 S2 Bioteknologi Bioteknologi Mikroba

Biocatalyst | December 2020

Nadira Rahmatunisa 21120001 S2 Bioteknologi Bioteknologi Mikroba

Nisrina Fitri Nurjannah 21120005 S2 Bioteknologi Bioteknologi Mikroba

Aulia Gusning Ati 21120021 S2 Bioteknologi Bioteknologi Mikroba

Afandi 30619006 S3 Biologi Genetika dan Bioteknologi Molekuler

Biocatalyst | December 2020

7

Profil Dosen Pengampu Mata Kuliah Prof. Dr. Zeily Nurachman Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Biokimia

Dr. Ernawati Arifin Giri-Rachman Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati Genetika dan Bioteknologi Molekuler

Profil Asisten Mata Kuliah

Sonia Yurista Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati S2 Bioteknologi Bioteknologi Mikroba

8

Biocatalyst | December 2020

INTRODUKSI

Bagaimana Sars-CoV-2 menginfeksi manusia?

Ira Rhabbiyatun Syani, Lestari Wevriandini

SARS-CoV-2 merupakan virus yang diselubungi oleh envelope yang memiliki RNA untai positif yang termasuk dalam subfamili sarbecovirus, ortho coronavirinae yang dapat menginfeksi manusia dan mamalia lainnya. Diameter virus ini sekitar 65–125 nm, single stranded RNA yang dilengkapi dengan spike menyerupai mahkota pada bagian permukaan luar. SARS-CoV-2 memiliki jumlah genom ~29.9-30 kb yang terdiri dari 11-14 open reading frames (ORFs). Masing-masing ORF akan mengkode berbagai jenis protein berupa protein struktural maupun non-struktural yang berperan untuk kelangsungan hidup dan kemampuan virulensi virus (Tabel 1).

Dua poliprotein besar pada SARS-CoV-2 yaitu ORF1a dan ORF1b akan pertama kali membelah secara proteolitik membentuk 16 non struktural protein (nsp) (nsp 1-16), sedangkan ORF lainnya berperan membentuk struktural dan aksesoris protein seperti ORF2 (protein spike), ORF3a, ORF4 (protein envelope), ORF5 (protein membrane), ORF6, ORF7a, ORF7b, ORF8, ORF9 (protein nucleocapsid), ORF10 (Gambar 1). Meskipun jumlah protein-protein tersebut masih belum bisa dipastikan, jika dijabarkan protein tersebut terdiri dari 4 jenis protein struktural, 16 jenis protein nonstruktural (nsp), dan sekitar 6-7 protein aksesoris.

Pada buku ini akan dibahas beberapa protein penting SARS-CoV-2 (yang telah disebutkan sebelumnya) yang berperan menginfeksi inangnya

(sel manusia). Protein-protein tersebut yaitu protein struktural, meliputi protein S (spike), protein M (membrane), protein E (envelope), protein N (nucleocapsid); protein non struktural (nsp) yaitu nsp1, nsp3, nsp6, nsp9, nsp10, nsp12, nsp13, nsp14, nsp16; dan satu protein aksesoris ORF3.

Adapun peran protein-protein virus tersebut dalam menginfeksi sel inang dijelaskan secara singkat pada Gambar 2, sedangkan struktur dan fungsi protein masing-masing secara mendetail akan dibahas pada masing-masing sub-bab pada buku.

Seperti jenis coronavirus lain, struktur SARS-CoV-2 sebagian besar dibentuk oleh protein M yang berfungsi untuk melindungi genom RNA virus. SARSCoV-2 masuk ke dalam sel inang melalui reseptor ACE2 yang ditemukan dalam berbagai jenis organ seperti hati, jantung, ginjal, dan saluran pencernaan dimana prosesnya dimulai dengan penempelan glikoprotein S pada reseptor ACE2 pada sel inang. Selain protein S, terdapat protein E yang juga berperan sebagai ion channel yang membantu virus menginfeksi sel inang.

Ketika virus telah berhasil menginfeksi sel inang, RNA untai positif virus akan dilepaskan ke dalam sel inang yang mana RNA tersebut dilindungi oleh protein N. Selanjutnya RNA yang telah dilepaskan akan ditranslasi menjadi berbagai jenis protein non struktural, dimana masing-masing memiliki peranan penting dalam proses perbanyakan partikel virus di dalam sel inang.

Tabel 1. Gen-gen yang diekspresikan oleh SARS-CoV-2 (Yoshimoto, 2020)

Biocatalyst | December 2020

9

Setelah proses translasi awal, protein akan dipotong oleh protease sel inang membentuk poliprotein, kemudian virus bereplikasi membentuk kopian untai RNA positif menjadi untaian RNA negatif pada komplek RdRp dengan bantuan nsp12 sebagai polimerase yang dibantu oleh nsp7, nsp8 dan juga nsp13 sebagai helikase. Selain itu, terdapat nsp9 yang berperan sebagai protein binding phosphate. Selanjutnya terjadi proses capping dan proofreading untai RNA negatif yang akan dimediasi oleh nsp 10,14, dan16 dibantu oleh nsp 11 dan 15.

Setelah proses replikasi selesai, RNA untai negatif akan di translasi oleh ribosom inang yang mana di sini terdapat nsp1 yang mempunyai peran untuk berikatan dengan ribosom untuk menghalangi

translasi RNA inang sehingga meperbesar peluang RNA virus untuk ditranslasi.

Setelah proses translasi berhasil, pemotongan protein akan dilakukan oleh nsp3 dan nsp5 sebagai protease kemudian diakhir proses, protein struktural (M, S, N, E) baru akan terbentuk, proses ini akan membuat sel inang memberikan respon pertahanan terhadap infeksi virus berupa pengaktifkan sel autofagi (autofagosom) melalui retikulum endoplasma, akan tetapi virus memiliki nsp 6 dibantu oleh nsp3 dan 4 yang dapat menghambat proses pertahanan sel inang tersebut. Pada akhirnya virus berhasil memperbanyak diri (release) ke dalam sel inang yang mana sebelumnya dapat terjadi apoptosis pada sel inang yang dimediasi oleh protein ORF3.

Gambar 0. Struktur dan genom SARS-CoV-2 (GeneTex., 2020)

Gambar 1. Mekanisme infeksi dan perkembangbiakan SARS-CoV-2 (Boopathy dkk., 2020).

Referensi : Yoshimoto, F.K. 2020. The Proteins of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2 (SARS CoV-2 or n-COV19), the Cause of

COVID-19. The Protein Journal 39:198â&#x20AC;&#x201C;216 .<https://doi.org/10.1007/s10930-020-09901-4>.

Astuti, I and Ysrafil. 2020. Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2): An overview of viral structure and

host response. Elsevier Public Health Emergency Collection 14(4): 407â&#x20AC;&#x201C;412. <doi: 10.1016/j.dsx.2020.04.020> GeneTex. 2020. A Review of the SARS-CoV-2 (COVID-19) Genome and Proteome. <https://www.genetex.com/MarketingMaterial/Index/

SARS-CoV2_Genome_and_Proteome>. Diakses tanggal 2 Desember 2020.

Boopathi, S., Poma, A.B., and Kolandaive, P. 2020. Novel 2019 Coronavirus Structure, Mechanism of Action, Antiviral drug promises and rule out against its treatment. Journal of biomolecular Structure & Dynamics. <doi: 10.1080/07391102.2020.1758788>.

10

Biocatalyst | December 2020

Sel terinfeksi coronavirus. Sumber gambar: UN News (news.un.org) Diakses pada 20 Desember 2020 Biocatalyst | December 2020

11

PROTEIN

PROTEIN E: Envelope, ‘Kemasan’ Sars-Cov-2 Dianti Nurwinda Destari

Protein E adalah protein struktural terkecil (~812 kDa) dari virus SARS-CoV-2 yang memainkan peran multifungsi dalam pembentukan virus baru atau virus-like particles/ VLP melalui serangkaian proses seperti perakitan (assembly), pembentukan selubung virus (envelope formation), pembentukan tunas (budding), pelepasan virus dan patogenesis terhadap sel inang yang dimediasi oleh pembentukan viroporin (Hassan et al., 2020; Liang et al., 2020; Sarkar & Saha, 2020). Protein E SARS-CoV-2 terinsersi sebagai protein membran integral pendek tersusun dari 75-76 asam amino (Bianchi et al., 2020; Hassan et al., 2020; Mohideen, 2021; Sarkar & Saha, 2020; Schoeman & Fielding, 2020). Urutan asam amino dari protein E SARSCoV-2 (75 asam amino) diekstraksi dari GenBank: QHD43418.1 dapat ditampilkan pada Gambar 1 (Mohideen, 2021).

Berdasarkan struktur sekunder, protein E SARSCoV-2 (75 asam amino) tersusun atas satu unit atau monomer yang terdiri dari empat α-helix tangan kanan (four righthanded α-helices) yaitu α1-helix, α2-helix, α3-helix, dan α4-helix yang terhubung dengan loop atau β-turn seperti pada Gambar 2 (Mohideen, 2021). Namun, literatur lain menurut Gupta et al. (2020) menyatakan bahwa monomer dari protein E SARS-Cov-2 (75 asam amino) terdiri dari tujuh α-helix dan 8 loop seperti pada Gambar 3. Bentuk α-helix merupakan bentuk struktur sekunder protein paling umum dan berperan dalam motif pengikatan DNA (DNA binding motif) termasuk helix-turn-helix motif dan zinc finger motif. Sedangkan bentuk loop adalah bentuk struktur sekunder protein berperan dalam stabilitas protein (Mohideen, 2021).

Selain itu, protein E SARS-CoV-2 (75 asam amino) memiliki 3 bagian domain: • Domain N-terminal hidrofilik pendek dikenal dengan NTD (N-terminal domain) terdiri dari 1-8

asam amino tepatnya pada posisi bentuk α1-helix dan terletak pada daerah ekstraseluler dikenal sebagai permukaan molekul yang dapat diakses (accessible molecular surface) atau area terpapar pelarut (solvent-exposed area), • Domain transmembran hidrofobik disebut TMD (Transmembrane domain) terdiri dari 2 subunit yaitu S1 dan S2. Subunit S1 meliputi α2-helix (residu 9-38) dan α3-helix (residu 42-57), yang dihubungkan dengan loop pendek (residu 39-41) • Domain C-terminal hidrofilik panjang dikenal dengan CTD (C-terminal domain) yang terletak pada daerah ekstraseluler terdiri dari asam amino 58-75 (α4-helix). Hal tersebut dibuktikan pada ilustrasi Gambar 4 (Mohideen, 2021) Pada bagian NTD dan TMD terdapat single amphipathic α-helix dengan motif struktural VSEETG tepatnya berada di urutan asam amino ke 5-10 protein E SARS-CoV-2. Daerah single amphipathic α-helix bersama dengan sekelompok asam amino bermuatan positif (seperti lisin atau arginin) yang terletak di ujung berperan dalam pembentukan viroporin. Daerah single amphipathic α-helix menginisiasi proses pembentukan viroporin.

Residu asam amino positif ujung ini mengikat viroporin ke membran ERGIC sel inang melalui interaksi elektrostatik dengan kelompok kepala (head group) bermuatan negatif dari phospholipid bilayer (Gambar 5). Kemudian pembentukan viroporin (~ 60–120 asam amino) dilanjutkan melalui oligomerisasi protein E bagian TMD membentuk struktur pentamerik pori hidrofilik dalam membran ERGIC sel inang terinfeksi yang memungkinkan pengangkutan ion melintasi membran ketika residu hidrofilik menghadap bagian dalam pori dan mengubah sifat permeabilitas membran. ganda fosfolipid (phospholipid bilayer) (Mohideen, 2021; Schoeman & Fielding, 2019).

Gambar 1. Urutan asam amino dari protein E SARS-CoV-2 (residu 1-75) yang diekstraksi dari GenBank (QHD43418.1) menunjukkan 3 domain yang berbeda (Mohideen, 2021).

12

Biocatalyst | December 2020

untuk stabilisasi protein E ketika proses translokasi ke membran ERGIC (ER-Golgi Intermediate Compartment) (Fung & Liu, 2018; Sicari et al., 2020).

Gambar 2. Struktur 3D monomer protein E SARS-Cov-2 (75 asam amino) terdiri dari empat α-helix dan loop atau β-turn. Terdapat situs aktif (active site) diantara α1-helix dan α2-helix. Domain N-terminal dan C-terminal yang ditunjukkan dengan warna biru dan merah menempati ruang ekstraseluler (Mohideen, 2021).

Gerbang viroporin pada NTD diatur oleh residu asam amino Phe4 (Gambar 6) untuk mekanisme opening dan closing penghantaran ion. Perubahan konformasi struktur gerbang viroporin dipengaruhi oleh pH lingkungan sel (apabila dalam lingkungan sel memiliki pH semakin asam atau rendah maka terjadi perubahan konformasi gerbang viroporin menjadi terbuka (open state)). Perubahan konformasi gerbang viroporin mengarah pada mekanisme penghantaran ion yang ditandai dengan perubahan volume pori viroporin 4 tahap meliputi (i) closed discontinuous state; (ii) continuous channel state 1; (iii) continuous channel state 2; dan (iv) closed discontinuous state (Gambar 7) (Mohideen, 2021; Sarkar & Saha, 2020; Schoeman & Fielding, 2019, 2020).

Fungsi Protein E SARS-CoV-2 dalam Pembentukan Virus Baru atau Virus-Like Particles/ VLP Protein E SARS-CoV-2 memiliki peran dalam pembentukan virus baru. Hal ini diawali dengan proses transkripsi genom sehingga menghasilkan subgenomic RNA (sgRNA) SARSBiocatalyst | December 2020

CoV-2 yang ditranslasi atau diterjemahkan menjadi protein struktural (nucleocapsid (N), spike (S), membrane (M), envelope (E)) dan aksesori. Protein struktural S, M, dan E dan beberapa protein aksesori ditranslokasi atau ditargetkan secara bersama ke dalam endoplasmic reticulum (ER) untuk mengalami pelipatan dan modifikasi pasca-translasi (post-translational modifications/PTM) yang beragam, termasuk pembentukan ikatan disulfida, glikosilasi terkait-N (N-linked glycosylation), dan palmitoylation (Gambar 9).

Untuk protein E SARS-CoV-2 sebagian besar memiliki topologi membrane hairpin (Gambar 4), walaupun dapat mengarah pada topologi membran bentuk lain. Dalam topologi membrane hairpin bagian NTD dan CTD protein E SARS-CoV-2 terpapar ke sisi sitoplasma atau ruang ekstraseluler tidak dimodifikasi melalui N-linked glycosylation. Dalam bentuk topologi lain, protein E SARS-CoV-2 terbukti terglikosilasi pada residu N (Asparagine) tepatnya di N66, dengan bagian CTD terpapar ke sisi luminal. Protein E SARS-CoV-2 juga mengalami modifikasi palmitoylation pada residu C (Cysteine) tepatnya di C40, C43, C44

Setelah mengalami pelipatan dan modifikasi pasca-translasi yang beragam, protein struktural S, M, dan E ditranslokasi atau ditargetkan ke membran ERGIC untuk melakukan pembentukan virus baru melalui serangkaian proses meliputi perakitan (assembly), pembentukan selubung virus (envelope formation), pembentukan tunas (budding), dan pelepasan virus dengan kompleks genom-nucleocapsid (N) yang terkonsentrasi di membran ERGIC (Gambar 10). Proses perakitan virus dimulai dengan pembentukan viroporin protein E. Tentunya protein E telah mengalami modifikasi palmitoylation sehingga stabilitas protein E. tetap berikatan atau menjangkar (anchor) terhadap membran ERGIC tepatnya pada bagian lipid rafts.

Setelah protein E terinsersi pada membran, proses perakitan virus dilakukan melalui pembentukan viroporin protein E. Viroporin SARS-CoV-2 terbentuk melalui oligomerisasi membentuk struktur pentamerik yang memiliki aktivitas saluran ion

Gambar 3. Menurut Gupta et al. (2020), struktur 3D monomer protein E SARSCov-2 (75 asam amino) hanya terdiri dari tujuh α-helix (α1, α2, α3, α4, α5, α6, α7) dan 8 loop.

13

Gambar 4. Protein E SARS-CoV-2 (75 asam amino) terdiri dari tiga domain: domain N-terminal atau NTD, domain transmembran atau TMD, dan domain C-terminal atau CTD. TMD terdiri dari dua subunit, yaitu S1 (residu 9-38) dan S2 (residu 42-57) yang dihubungkan dengan loop. Selain itu, topologi protein E SARS-CoV-2 (75 asam amino) adalah membrane hairpin (Mohideen, 2021).

memiliki aktivitas saluran ion (ion channel activity). Viroporin selektif terhadap kation (H+, K+, Na+, dan Ca2+) untuk inisiasi pembentukan virus baru pada tahap perakitan (assembly). Akibat aktivitas saluran ion pada viroporin, terjadi akumulasi konsentrasi ion Ca2+ dan H+ pada bagian intraseluler membran ERGIC yang menyebabkan ketidakseimbangan ion Ca2+ dan H+ dalam sel.

Oleh karena itu, hal tersebut memicu kebocoran ion Ca2+ dan H+ menuju sitoplasma sel inang. Konsentrasi ion Ca2+ dan H+ berlebih pada sitoplasma menyebabkan blokade DMV (Double membrane vesi-

cle) yang dibentuk oleh induksi beberapa protein non-structural nsp. Hal ini menghasilkan akumulasi struktur membran yang akan berfungsi sebagai tempat untuk replikasi genomic RNA (gRNA) virus. Kemudian hasil replikasi genomic RNA (gRNA) virus diselubungi oleh protein struktural (nucleocapsid (N) membentuk kompleks genom-nucleocapsid (N) untuk melindungi gRNA dari protease sel inang di sitoplasma ketika proses translokasi ke membran ERGIC. Kompleks genom-nucleocapsid (N) yang terkonsentrasi di membran ERGIC berikatan dengan protein struktural E, M, S (Gambar 10). Interaksi protein E dengan protein struk-

tural lainnya membantu dalam proses pembentukan virus baru seperti interaksi protein E dengan protein M, dan interaksi protein E dengan protein S. Interaksi protein E dengan protein M membentuk selubung virus dengan proporsi protein M yang melimpah daripada protein E. Interaksi ini terjadi pada bagian residu CTD untuk kedua protein tersebut. Selain itu, protein E juga memicu kelengkungan membran selubung virus (membrane curvature of the viral envelope), sehingga memungkinkan virus baru memiliki bentuk bola dan morfologi yang khas. Terdapat bagian NTD yang mengarahkan kelengkungan membran selubung virus. Interaksi protein E dan M juga menginduksi atau memicu proses pembengkokan (bending) membran yang menginisiasi untuk pembentukan tunas (budding). Ketika tunas terbentuk, maka interaksi protein E dan M juga memfasilitasi inisiasi proses pemotongan (scission) untuk pelepasan virus dan membentuk virus baru (Gambar 11). Virus baru diangkut ke dalam vesikula dinding halus (smooth-wall vesicles) dan dilepaskan ke lingkungan ekstraseluler secara eksositosis

Gambar 5. a. Ilustrasi tipe struktur viroporin dan motif amphipathic Îą-helix beserta residu lisin atau arginin yang terletak di ujung. Perubahan konformasi struktur viroporin diregulasi melalui aliran ion dengan mekanisme opening dan closing pori viroporin. b. Struktur 3D pentamerik viroporin dari protein E SARS-CoV-2 (75 asam amino) (Gupta et al., 2020; Schoeman & Fielding, 2019) 14

Biocatalyst | December 2020

pompa Na+/ K+ ATPase (persegi panjang ungu) telah dikaitkan dengan memburuknya penyakit pernapasan akibat virus seperti yang disebabkan oleh SARSCoV-2 (Gambar 12) (Nieto-Torres et al., 2015; Schoeman & Fielding, 2020).

Gambar 6. Ilustrasi residu asam amino Phe4 sebagai gerbang viroporin untuk penghantaran ion dalam kondisi gate (closed) (Mandala et al., 2020; Sarkar & Saha, 2020).

melalui jalur sekretori (Gambar 9), dengan demikian virus baru dapat memperluas infeksi (Fung & Liu, 2018; Mohideen, 2021; Nieto-Torres et al., 2015; Ruch & Machamer, 2012; Schoeman & Fielding, 2019, 2020; Sicari et al., 2020).

Protein E SARS-CoV-2 berfungsi dalam patogenesis terhadap sel inang dimediasi oleh pembentukan viroporin yang memiliki aktivitas saluran ion. Pembentukan viroporin terkait dengan infeksi virus dikenali oleh sensor seluler (sinyal molekul 1). Hal ini memicu aktivasi transkripsi dan translasi dari komponen inflamasi NLRP3 (NLRP3, ASC dan procaspase-1) dan pro-IL-1β yang tidak aktif. Akibat aktivitas saluran ion pada viroporin, terjadi akumulasi konsentrasi ion Ca2+ dan H+ pada bagian intraseluler membran ERGIC yang menyebabkan ketidakseimbangan ion Ca2+ dan H+ dalam sel. Oleh karena itu, hal tersebut memicu kebocoran ion Ca2+ dan H+ mengikuti gradien elektrokimia menuju ke sitoplas-

ma sel. Konsentrasi ion Ca2+ dan H+ berlebih pada sitoplasma atau ketidakseimbangan ionik ini sebagai sinyal molekul 2 yang dapat menginduksi perakitan kompleks inflamasi (NLRP3 inflammasome). Hal tersebut memicu pematangan (maturation) pro-IL-1β menjadi IL-1β melalui aksi caspase-1.

IL-1β yang disekresikan memediasi respon pro-inflamasi yang kuat yang dapat merusak sel dan organisme ketika distimulasi berlebihan. Selain itu, perubahan ketidakseimbangan ionik di kompartemen intraseluler disertai dengan penundaan atau penghambatan transport protein. Hal ini mengakibatkan penurunan kadar molekul MHC-I (persegi panjang biru) pada membran plasma, sehingga sel yang terinfeksi tidak dapat dikenali oleh sistem imun.

Penghambatan transport protein juga mengurangi tingkat dan aktivitas di permukaan sel saluran ion dan transporter yang penting untuk akumulasi edema.

Kerusakan pompa natrium epitel (persegi panjang hijau) dan

Selain itu, protein E SARS-CoV-2 berfungsi dalam patogenesis terhadap sel inang dapat dimediasi oleh proses PDZ-binding motif. Pada bagian CTD protein E terdapat motif PBM (DLLV) untuk proses PDZ-binding motif. Motif PBM memungkinkan pengikatan ke domain PDZ sel inang. Untuk PBM dalam protein E SARS-CoV-2 diklasifikasikan sebagai tipe II dengan urutan asam amino DLLV, yang dicirikan oleh urutan konsensus X-ΦX-ΦCOOH, X mewakili asam amino apapun dan Φ adalah residu hidrofobik, biasanya diwakili oleh residu asam amino V, I, atau L. Sedangkan PDZ merupakan domain protein sel inang. Motif PBM dapat berinteraksi dengan domain PDZ dari lima protein sel inang yang mengarah ke patogenesis (Gambar 13). Salah satu protein sel inang tersebut antara lain syntenin.

Interaksi PBM protein E SARSCoV-2 dengan domain PDZ protein syntenin memicu ekspresi berlebih dari sitokin pro-inflamasi yang dimediasi oleh jalur atau pathway p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK).

Dengan kata lain, interaksi protein tersebut menginduksi jalur

Gambar 7. Ilustrasi mekanisme penghantaran ion yang ditandai dengan perubahan volume pori viroporin 4 tahap meliputi (i) closed discontinuous state; (ii) continuous channel state 1; (iii) continuous channel state 2; dan (iv) closed discontinuous state (Sarkar & Saha, 2020) Biocatalyst | December 2020

15

Gambar 8. Perubahan konformasi pori viroporin pada residu asam amino Phe26 membentuk bottleneck ketika aliran ion tinggi. Selain itu, residu asam amino Phe20, Phe23, dan Phe26 mengalami perubahan konformasi ketika terjadi mekanisme penghantaran ion untuk stabilisasi segmen transmembran protein E dalam struktur viroporin (Sarkar & Saha, 2020).

duksi jalur p38 MAPK sehingga memicu ekspresi berlebih dari sitokin pro-inflamasi. Oleh karena itu, ekspresi sitokin pro-inflamasi IL-1β dan IL-6 serta serum protein amiloid A fase akut (the acute phase protein serum amyloid A) meningkat secara sig nifikan. Hal ini mengakibatkan inflamasi inang mewakili respon imun yang memburuk terhadap infeksi, kerusakan jaringan yang khas, dan edema. Selain itu, terjadi infeksi memuncak pada ARDS (Acute respiratory distress syndrome) yang konsisten dengan kasus infeksi SARSCoV-2 yang parah (Schoeman & Fielding, 2020).

Pengaruh Hexamethylene Amiloride (HMA) dan Amantadine (AMT) sebagai Inhibitor bagian TMD Protein E SARSCoV-2 Hexamethylene amiloride (HMA) dan amantadine (AMT) sebagai inhibitor protein E SARS-CoV-2 mengikat residu polar di lumen NTD, sedangkan pH asam mempengaruhi konformasi CTD. Untuk menyelidiki bagaimana TMD protein E SARS-CoV-2 berinteraksi dengan obat-obatan inhibitor, dapat dilakukan pergeseran kimiawi (chemical shifts) protein E akibat interaksi dengan HMA dan AMT. Pada rasio molar obat : protein (4: 1), HMA menyebabkan gangguan pergeseran kimia 16

yang signifikan (CSPs/ chemical shift perturbations) pada residu NTD, termasuk Thr9, Gly10, Thr11, Ile13 dan Ser16, diikuti oleh CSPs yang lebih sederhana untuk CTD Ala36 dan Leu37 (Gambar 14) (Mandala et al., 2020).

Berdasarkan hasil, menunjukkan bahwa obat-obatan inhibitor harus memiliki ikatan afinitas yang tinggi terhadap residu asam amino Glu8 dan Asn15 untuk menutup pintu masuk NTD dari protein E SARS-CoV-2 sehingga menghambat konduksi kation. Residu asam amino Glu8 dan Asn15 merupakan residu pertama yang dapat berinteraksi dengan molekul ion pada central core di NTD. Ketika

terjadi interaksi tersebut, maka akan mempengaruhi konformasi Phe4 yang berperan sebagai gerbang pintu masuk untuk mekanisme buka-tutup viroporin.

Dengan demikian, obat-obatan inhibitor seperti HMA dan AMT idealnya harus ditargetkan dan dikirim ke membran ERGIC sel inang untuk secara maksimal menghambat aktivitas saluran ion viroporin dari protein E SARS-CoV-2.

Terhambatnya aktivitas saluran ion viroporin mampu menekan aktivasi inflamasi yang mengarah pada pathogenesis sel inang (Mandala et al., 2020; Sarkar & Saha, 2020).

Gambar 9. Siklus replikasi SARS-CoV-2 yang memiliki tahapan proses dan modifikasi pasca-translasi (post-translational modifications/PTM) yang beragam, termasuk pembentukan ikatan disulfida, glikosilasi terkait-N (N-linked glycosylation), dan palmitoylation untuk protein E (Sicari et al., 2020).

Biocatalyst | December 2020

Gambar 10. Jalur yang dirangsang oleh aktivitas saluran ion viroporin mengarah ke pembentukan virus baru atau virus-like particles/ VLP (Nieto-Torres et al., 2015).

Gambar 11. A. Pembentukan budding. B. Proses bending untuk budding dan proses scission untuk pelepasan virus. Warna oranye menunjukkan protein E, dan warna hijau menunjukkan protein M (Ruch & Machamer, 2012).

Biocatalyst | December 2020

17

Gambar 12. Jalur yang dirangsang oleh aktivitas saluran ion viroporin berfungsi dalam patogenesis sel inang (Nieto-Torres et al., 2015).

Gambar 14. Pengaruh HMA dan AMT mengikat TMD protein E SARS-CoV-2. a, Spektrum korelasi 2D 15N-13Cα bebas-HMA (apo, hitam) antara TMD protein E yang tidak berikatan dengan HMA berwarna hitam dan TMD protein E terikat dengan HMA berwarna oranye. Hal ini menunjukkan gangguan pergeseran kimia (CSPs) yang disebabkan oleh HMA. b, CSPs spesifik residu yang diinduksi oleh HMA dan AMT. Warna oranye menunjukkan CSPs residu spesifik yang diinduksi oleh HMA dan warna merah muda menunjukkan CSPs residu spesifik yang diinduksi oleh AMT. Residu asam amino pada bagian NTD merupakan residu paling terganggu oleh obatobatan inhibitor, dan HMA menyebabkan gangguan yang lebih besar daripada AMT. Garis putus-putus menunjukkan CSPs rata-rata. c, Sebuah pose docking representatif dari HMA. Obat atau inhibitor tersebut terdapat pada bagian NTD protein E dengan gugus guanidinium yang berinteraksi dengan residu asam amino seperti Thr11 (Mandala et al., 2020).

Gambar 13. Peran protein E SARS-CoV-2 dalam patogenesis terbagi menjadi dua yaitu disebabkan oleh pembentukan viroporin dan PDZ-binding motif (Schoeman & Fielding, 2020).

Daftar Pustaka Bianchi, M., Benvenuto, D., Giovanetti, M., Angeletti, S., Ciccozzi, M., & Pascarella, S. (2020). Sars-CoV-2 Envelope and Membrane Proteins: Structural Differences Linked to Virus Characteristics? BioMed Research International, 2020. https://doi.org/10.1155/2020/4389089 Fung, T. S., & Liu, D. X. (2018). Post-translational modifications of coronavirus proteins: Roles and function. In Future Virology (Vol. 13, Issue 6, pp. 405–430). Future Medicine Ltd. https://doi.org/10.2217/fvl-2018-0008 Gupta, M. K., Vemula, S., Donde, R., Gouda, G., Behera, L., & Vadde, R. (2020). In-silico approaches to detect inhibitors of the human severe acute respiratory syndrome coronavirus envelope protein ion channel. Journal of Biomolecular Structure and Dynamics. https://doi.org/10.1 080/07391102.2020.1751300 Hassan, S. S., Choudhury, P. P., & Roy, B. (2020). SARS-CoV2 envelope protein: non-synonymous mutations and its consequences. Genomics, 112(6), 3890–3892. https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2020.07.001 Liang, Y., Wang, M. L., Chien, C. S., Yarmishyn, A. A., Yang, Y. P., Lai, W. Y., Luo, Y. H., Lin, Y. T., Chen, Y. J., Chang, P. C., & Chiou, S. H. (2020).

Highlight of Immune Pathogenic Response and Hematopathologic Effect in SARS-CoV, MERS-CoV, and SARS-Cov-2 Infection. In Frontiers in Immunology (Vol. 11). Frontiers Media S.A. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.01022 Mandala, V. S., McKay, M. J., Shcherbakov, A. A., Dregni, A. J., Kolocouris, A., & Hong, M. (2020). Structure and drug binding of the SARS-CoV-2 envelope protein transmembrane domain in lipid bilayers. Nature Structural and Molecular Biology. https://doi.org/10.1038/s41594-02000536-8 Mohideen, A. K. S. (2021). Molecular docking analysis of phytochemical thymoquinone as a therapeutic agent on sars-cov-2 envelope protein. Biointerface Research in Applied Chemistry, 11(1), 8389–8401. https://doi.org/10.33263/BRIAC111.83898401 Nieto-Torres, J. L., Verdiá-Báguena, C., Castaño-Rodriguez, C., Aguilella, V. M., & Enjuanes, L. (2015). Relevance of viroporin ion channel activity on viral replication and pathogenesis. In Viruses (Vol. 7, Issue 7, pp. 3552–3573). MDPI AG. https://doi.org/10.3390/v7072786 Ruch, T. R., & Machamer, C. E. (2012). The coronavirus E protein: Assembly and beyond. In Viruses (Vol. 4, Issue 3, pp. 363–382). https://doi. org/10.3390/v4030363

18

Biocatalyst | December 2020

Sarkar, M., & Saha, S. (2020). Structural insight into the role of novel SARSCoV-2 E protein: A potential target for vaccine development and other therapeutic strategies. PLoS ONE, 15(8 August). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237300 Schoeman, D., & Fielding, B. C. (2019). Coronavirus envelope protein: Current knowledge. In Virology Journal (Vol. 16, Issue 1). BioMed Central Ltd. https://doi.org/10.1186/s12985-019-1182-0 Schoeman, D., & Fielding, B. C. (2020). Is There a Link Between the Pathogenic Human Coronavirus Envelope Protein and Immunopathology?

A Review of the Literature. In Frontiers in Microbiology (Vol. 11). Frontiers Media S.A. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.02086 Sicari, D., Chatziioannou, A., Koutsandreas, T., Sitia, R., & Chevet, E. (2020). Role of the early secretory pathway in SARS-CoV-2 Infection. In Journal of Cell Biology (Vol. 219, Issue 9). Rockefeller University Press. https://doi.org/10.1083/JCB.202006005

Biocatalyst | December 2020

19

PROTEIN

PROTEIN S: Spike, Tanda Pengenal SARS-COV-2

Aulia Gusning Ati

Untuk dapat menginfeksi sebuah sel, SARS CoV 2 dibantu oleh sebuah struktur protein pada bagian terluarnya yaitu protein spike. Protein spike merupakan struktur yang sangat penting karena memiliki fungsi untuk mengenali dan berikatan pada reseptor sel inang yaitu reseptor ACE2 (Angiotensin-Converting Enzyme 2). Tidak hanya itu, protein spike juga mampu membantu fusi dari virus untuk masuk ke dalam sel akibat perubahan konformasi yang terjadi dari struktur spikenya setelah terjadi penempelan pada reseptor. Protein spike merupakan protein struktural yang krusial dalam tahap awal infeksi karena tanpa adanya proses pengenalan antara protein spike dan reseptor sel inang maka virus tidak dapat masuk ke dalam sel inang. Hal ini menyebabkan banyak penelitian dilakukan untuk mempelajari mengenai struktur maupun fungsi dari protein spike dengan harapan informasi tersebut dapat digunakan untuk menentukan target yang tepat dalam proses mencegah masuknya SARS-CoV-2 ke dalam tubuh (Huang, et.al., 2020).

Struktur Protein Spike (S) Protein spike memiliki ukuran 180-200 kDa dengan total panjang 1273 aa. Protein spike terdiri dari N-terminus ekstraselular, domain transmembran (TM) pada membran virus, dan segmen C-terminal intraselular pendek. Protein spike diselubungi oleh polisakarida yang membuat virus ini dapat mengelak dari pertahanan sistem imun inang saat proses masuknya 20

virus ke dalam sel. Protein spike merupakan protein homotrimerik, yaitu protein yang terdiri dari 3 untai sekuens asam amino identik dan saling berkaitan (Watanabe, et.al, 2020). Setiap protomer dari spike protein terdiri dari dua subunit, yaitu subunit S1 yang berperan dalam proses pengenalan dan penempelan pada sel inang dan subunit S2 yang berperan dalam proses fusi virus ke dalam sel seperti yang diilustrasikan pada gambar 1.

bentuk struktur seperti mahkota (crown) sehingga virus ini disebut dengan virus corona. Pada saat sebelum infeksi, protein spike ini berada dalam keadaan native atau belum aktif. Namun ketika proses infeksi, maka protease dari sel target akan mengaktifkan spike protein dengan cara memotong antara subunit S1 dan S2 sehingga merubah konformasi subunit S2 dan akhirnya proses fusi virus ke dalam sel inang terjadi (Tang, et.al., 2020).

Bagian yang pertama dari protein spike ialah sinyal peptide (residu ke- 1-13) berlokasi pada N-terminus, subunit S1 (residu ke- 14-685), dan subunit S2 (residu ke- 686-1273). Subunit S1 terdiri dari beberapa domain yaitu N-Terminal Domain (residu ke- 14-305), Receptor Binding Domain (residu ke 319-514).

Subunit S2 terdiri dari beberapa domain antara lain fusion peptide (FP) (residu ke- 788-806), Heptad Repeat 1 (HR1) (residu ke- 912-984), Heptad Repeat 2 (HR2) (residu ke- 1163-1213), Transmembrane Domain (TM) (residu ke- 1213-1237) dan Connector Domain (residu ke 1237-1273) (Xia, et.al., 2020).

Bagian dari subunit S1 ini mem-

a. Struktur Subunit S1 Penempelan partikel virus pada permukaan sel reseptor inang merupakan tahap awal dari proses infeksi. Tahap ini menjadi kunci infeksi SARS-CoV 2 terhadap sel inang karena merupakan proses penentu masuknya virus ke dalam sel. Subunit S1 adalah bagian dari protein spike yang bertugas dalam proses pengenalan dan penempelan terhadap reseptor ACE2. Bagian dari subunit S1 yang berikatan langsung dengan ACE2 ialah Receptor Binding Domain (RBD). RBD telah banyak dikarakterisasi karena merupakan domain kunci yang berinteraksi langsung dengan reseptor ACE2

Gambar 1. (a) Skema struktur protein S (b) Protein S menempel pada reseptor ACE2 (Huang et.al., 2020) Biocatalyst | December 2020

informasi terkait strukturnya dapat digunakan untuk mendesain target agen teurapetik atau vaksin. Selain Receptor Binding Domain, juga terdapat N-Terminal Domain yang juga merupakan bagian dari subunit S1. Tidak seperti RBD, N-Terminal Domain memiliki fungsi yang belum diketahui secara jelas namun ada beberapa penelitian yang menghipotesiskan bahwa NTD berperan dalam mengenali beberapa gugus gula spesifik dalam membantu saat proses penempelan (Huang, et.al., 2020).

Pada penelitian yang dilakukan oleh Lan, et.al., (2020) diketahui bahwa RBD memiliki struktur yang terdiri dari daerah core dan Receptor Binding Motif (RBM) seperti yang ditunjukkan pada gambar 3. Bagian core terdiri dari 5 untai beta sheet antiparallel yang berputar yaitu β1, β2, β3, β4 and β7 serta heliks pendek dan loops. Bagian RBM (Receptor Binding Motif) terdiri dari untai β5 dan β1 serta heliks α4 dan a α5 dan loops.

Bagian RBM ini adalah daerah yang paling banyak mengandung asam amino yang berikatan dengan ACE2. Pada RBD terdapat 9 residu sistein, 8 residu sistein diantaranya membentuk 4 pasang ikatan disulfida (3 pasang di bagian inti untuk membantu stabilisasi struktur lembaran dan 1 pasang mengkoneksikan loops di ujung distal dari RBM).

Bila dibandingkan dengan SARS CoV, RBD dari SARS CoV 2 memiliki struktur yang serupa dan memiliki mode Biocatalyst | December 2020

Gambar 2. Struktur Protein Spike SARS CoV 2 (a) Skema struktur primer protein spike yang terdiri dari berbagai domain. SS (Signal Sequence), NTD (N-Terminal Domain), RBD (Receptor Binding Domain), SD1 (Sub Domain 1), SD2 (Sub Domain 2), S1/S2 (S1/S2 situs pemotongan S1/S2), S2’ (Situs Pemotongan S2’), HR1 (Heptad Repeat 1), HR2 (Heptad Repeat 2), FP (Fusion Peptide), CH (Central Helix), CD(Connector Domain), TM (Transmembrane Domain), CT (Cytoplasmic Tail); (b) Struktur prefusi protein spike dari sisi atas dan bawah (Wrapp et.al., 2020); (c) struktur homotrimerik dan monomer dari protein spike (Tang, et.al., 2020)

pengikatan yang hampir identik. Meskipun demikian, tetap ditemukan perbedaan beberapa asam amino antara RBD SARS CoV 2 dan SARS CoV. Perbedaan asam amino ini ditemukan pada asam amino kunci yang berperan langsung dalam pengikatan antara SARS CoV2 dan ACE2. Asam amino F486 yang ditemukan pada RBD SARS CoV 2 membentuk interaksi aromatik yang lebih

kuat terhadap asam amino Y83, yang sebelumnya interaksi ini dilakukan oleh asam amino I472 pada RBD SARS CoV. Terdapat pula asam amino E484 yang berinteraksi membentuk ikatan ionik yang dengan K31 ACE2, dimana sebelumnya pada SARS RBD asam amino yang berperan adalah P470. Perubahan-perubahan asam amino ini membuat afinitas pengikatan dari RBD SARS CoV 2 21

reseptor sel inang dan yang kedua adalah membantu fusi virus ke dalam sel inang. Fungsi ini sangat berkaitan dengan struktur yang dimiliki oleh protein spike yaitu bagian subunit S1 yang berperan dalam pengenalan dan penempelan pada reseptor ACE2 dan subunit S2 yang berperan dalam melakukan fusi. Struktur dan fungsi yang dimiliki oleh protein spike dari SARS-CoV 2 ini berkaitan erat dengan masuknya SARS CoV 2 ke dalam sel inang. Untuk menyempurnakan fungsinya, protein spike dari SARS CoV 2 ini akan diaktivasi secara proteolisis oleh protease sel inang setelah menempel pada reseptor (Shang, et.al., 2020).

Gambar 3. Struktur Receptor Binding Domain (RBD) yang berikatan pada reseptor ACE2 (Lan, et.al., 2020)

lebih besar dibanding SARS CoV. Afinitas pengikatan ini diperkuat dengan percobaan menggunakan Surface Plasmon Resonance Assay, dimana didapatkan konstanta disosiasi antara ACE2 dan SARS CoV 2 ialah 4,7 nM sedangkan ACE 2 dan SARS CoV ialah 31 nM. Semakin kecil konstanta disosiasi maka menunjukkan semakin besar afinitas pengikatan antara keduanya (Lan, et.al., 2020). b. Struktur Subunit S2 Subunit S2 terdiri dari FP, HR1, HR2, domain TM, dan domain sitoplasmik yang berperan dalam proses fusi dan masuknya virus. Fusion peptide (FP) merupakan asam amino pendek (15-20 aa) yang utamanya terdiri dari residu hidrofobik. Fusion peptide berfungsi untuk mengaitkan spike protein dan memicu terjadinya fusi dengan 22

cara mendisrupsi dan mengikat lipid bilayer membran sel. HR1 dan HR2 terdiri dari heptapeptide yang berulang yaitu HPPHCPC dimana H adalah residu hidrofobik, P adalah residu hidrofilik, dan C adalah residu lainnya yang memiliki muatan. HR1 dan HR2 membentuk 6 heliks yang akan membantu fusi antara virus ke dalam sel inang ketika konformasinya berubah. Pada bagian C terminus terdapat TM domain sebagai tempat protein spike terkait pada virus dan sitoplasmik domain yang berada pada bagian intraselular virus (Xia, et.al., 2020).

Fungsi Protein Spike Pada SARS-CoV 2, protein spike berfungsi untuk membantu proses infeksi atau masuknya virus ke dalam sel inang dengan melakukan dua hal yaitu pengenalan dan penempelan pada

Untuk masuk ke dalam sel inang, bagian protein spike SARSCoV 2 pertama-tama akan mengenali reseptor dan melakukan pengikatan pada reseptor ACE2.

Domain yang terlibat dalam pengikatan ini ialah Receptor Binding Domain (RBD) yang merupakan bagian dari subunit S1 protein spike. Ketika keduanya telah berikatan maka selanjutnya terjadi proses fusi. Ada 2 mekanisme jalur yang dapat terjadi terkait masuknya virus.

Jalur masuk yang pertama ialah melalui fusi langsung pada permukaan sel membran inang atau melalui proses endositosis.

Pada jalur masuk yang pertama yaitu melalui fusi langsung pada inang, virus dapat berfusi apabila terdapat protease inang di bagian membran yang akan memotong antara subunit S1 dan subunit S2. Contoh dari protease yang paling sering ditemukan ialah Transmembrane Protease/Serine Subfamily Member 2 (TMPRSS2) atau furin. Ketika terjadi pemotongan maka akan terjadi perubahan konformasi yang membuat protein S terpotong menjadi dua bagian yaitu subunit S1 dan subunit S2. Hal ini memBiocatalyst | December 2020

Gambar 4. Mekanisme masuknya SARS CoV 2 ke dalam sel yang diinisiasi oleh protein spike, (a) Proses pengenalan terhadap sel inang dan fusi virus (Horani, et.al.,2020) (b) Perubahan konformasi spike protein akibat aktivasi protease (Fan, et.al, 2020)

buat fusion peptide pada subunit S2 terekspos dan memicu fusi virus. Fusion peptide akan berubah konformasi sehingga protein ini menginsersikan dirinya ke dalam membrane sel inang. Perubahan konformasi juga terjadi pada HR1 dan HR2 yang menyebabkan jarak antara membran virus dan sel inang semakin dekat dan akhirnya keduanya melakukan fusi (Tang, et.al, 2020).

Apabila pada permukaan membrane sel inang tidak didapatkan banyak protease, maka virus juga dapat masuk ke dalam sel melalui proses endositosis. Virus akan terendositosis dan berada pada endosome. pH pada endosome ini lama kelamaan akan semakin menurun dan memicu antara fusi virus dan endosome sehingga genom virus dapat keluar ke sitoplasma sel (Wang, et.al., 2018). Rendahnya pH endosome ini akan mengaktivasi protease endosomal seperti cathepsin L ataupun furin yang akan mengaktivasi protein spike dengan cara yang sama yaitu memotong subunit S1 dan subunit S2 (Tang, et.al., 2020). Hal Biocatalyst | December 2020

tersebut kemudian menyebabkan adanya fusi antara membran virus dan endosome. Proses masuknya virus baik melalui proses endositosis ataupun fusi langsung pada membran sel diilustrasikan pada gambar 4. a. Penempelan Protein Spike pada Reseptor ACE2

Reseptor Binding Domain merupakan bagian dari spike protein yang melakukan penempelan pada ACE2 reseptor. Saat melakukan penempelan, maka protein spike akan berada pada konformasi “standing up state” yang mana salah satu RBD dari protein spike terekspos ke luar

Gambar 5. Struktur protein spike saat “lying down state” (kiri) dan “standing up state” (kanan) (Wrapp, et.al., 2020) 23

Gambar 6. (a) Proses preaktivasi furin saat proses pengemasan (b) tanda panah menunjukkan situs pemotongan furin (c) skema situs pemotongan furin pada SARS CoV 2 dibandingkan virus lainnya (Shang, et.al., 2020)

dan berikatan dengan reseptor ACE2 (Wrapp, et.al., 2020).

Ketika tidak berikatan dengan reseptor ACE2, maka protein spike biasanya berada pada konformasi “lying down state” dimana RBD tidak terekspos ke luar seperti yang diilustrasikan pada gambar 5.

Pada penelitian yang pernah dilakukan oleh Shang, et.al. (2020), diketahui bahwa SARS CoV 2 memiliki afinitas pengikatan RBD yang lebih tinggi dibanding SARS CoV. Hasil ini juga didukung oleh penelitian yang dilakukan Lan et.al (2020). Namun apabila dibandingkan protein spike secara keseluruhan antara SARS CoV 2 dan SARS CoV, ternyata afinitas pengikatan antara spike SARS CoV 2 dengan ACE2 lebih rendah dibanding SARS CoV. Hal ini menjadi sebuah hasil yang paradoks karena meskipun bagian RBD SARS CoV 2 memiliki afinitas pengikatan yang lebih kuat dibandingkan dengan SARS CoV, namun af24

initas pengikatan protein spike secara keseluruhan lebih rendah dibanding SARS CoV. Hal ini dapat terjadi kemungkinan disebabkan oleh adanya perubahan yang dinamis pada RBD. Pada beberapa penelitian didapatkan bahwa protein spike dari SARS CoV berada pada kondisi “standing up state” lebih sering dibandingkan protein SARS CoV 2 yang lebih sering ditemukan pada kondisi “lying down state”.

Hal ini menyebabkan SARS CoV memiliki kesempatan yang lebih tinggi untuk mengenali reseptor sel inang dibandingkan dengan SARS CoV 2 dan menyebabkan pengukuran afinitas pengikatan SARS CoV menjadi lebih tinggi. Meskipun konformasi “lying down state” ini menyebabkan SARS CoV 2 lebih sulit untuk mengakses dan berikatan pada reseptor ACE2, namun kondisi ini membantu SARS CoV 2 untuk mengelak penyerangan imun lebih baik. Konformasi “lying down state” membuat bagian RBD tidak terekspos keluar dan sulit dikenali oleh antibodi

(Shang, et.al., 2020).

Aktivasi Protease Sel Inang dan Fusi Virus Untuk menjaga tingginya infektivitas dari sars cov 2, virus ini bergantung pada strategi yg kedua yaitu aktivasi protease dari inang. Aktivasi oleh protease ini memicu virus untuk melakukan fusi ke dalam sel.

Pada SARS CoV 2, ditemukan situs pemotongan protease yang tidak dimiliki oleh SARS CoV dan virus corona lainnya. Terdapat motif RxxR yang merupakan situs pemotongan furin pada SARS CoV 2 (Gambar 6). Furin merupakan salah satu enzim pro-protein convertase, sehingga adanya situs pemotongan ini membuat protein spike dari SARS CoV 2 mengalami pre-aktivasi ketika proses pengemasan virus.

Setelah dilakukan pre-aktivasi furin, kemudian virus mengenali reseptor ACE2 sel inang target dan terjadi aktivasi oleh protease seperti TMPRRS2 bahkan Biocatalyst | December 2020

furin pada bagian permukaan sel inang atau oleh cathepsin L yang merupakan protease pada endosom (Gambar 6a). Dengan adanya pre-aktivasi furin menyebabkan SARS CoV 2 lebih mandiri terhadap sel target dan meningkatkan proses masuknya virus ke dalam sel target terutama pada sel dengan ekspresi TMPRSS2 dan cathepsin L yang rendah (Shang, et.al, 2020).

dan human lung fibroblast cell.

Kedua, ketika diberikan inhibitor proprotein convertase, maka efisiensi masuknya SARS CoV 2 dibandingkan SARS CoV menjadi menurun. Yang ketiga, bila dilakukan treatment menggunakan siRNA yang menarget furin, maka protein spike tidak teraktivasi dan tidak dapat masuk ke dalam sel target (Shang, et.al., 2020).

Pada penelitian yang dilakukan Shang et.al (2020), proses pre-aktivasi furin ini diketahui meningkatkan proses masuknya virus ke dalam sel. Apabila furin ini dimutasi maka ditemukan bahwa SARS CoV 2 mengalami penurunan kemampuan untuk masuk ke dalam sel. Hal ini dibuktikan dengan beberapa percobaan yaitu yang pertama ketika dilakukan mutasi pada daerah situs pemotongan furin, SARS CoV 2 mengalami penurunan kemampuan untuk dapat masuk ke dalam 3 jenis sel yaitu human cervical cell, human lung epithelial cell,

Bila disimpulkan maka dari proses penempelan hingga fusi maka SARS CoV 2 memiliki konformasi yang berubah-ubah untuk mendukung fungsinya dalam proses infeksi virus ini.

SARS CoV 2 akan mengalami tahapan mulai dari prefusion state yaitu ketika protein spike belum menempel pada ACE2 dan RBD masih dalam keadaan â&#x20AC;&#x153;lying down stateâ&#x20AC;?, penempelan virus (viral attachment) yaitu ketika protein spike berikatan pada ACE2 dan RBD pada konformasi â&#x20AC;&#x153;standing up stateâ&#x20AC;?, fusion intermediate yaitu ketika terjadi proses aktivasi oleh protease

yang membuat subunit S1 terdisosiasi dan S2 berubah konformasinya untuk mendekatkan membran virus dan sel, dan yang terakhir adalah post fusion state dan viral entry yaitu ketika virus mengalami fusi dan akhirnya genom virus masuk ke dalam sel. Tahapan-tahapan tersebut terangkum pada gambar 7.

Gambar 7. Perubahan konformasi protein spike pada proses masuknya virus ke dalam sel inang (Cai, et.al., 2020).

Biocatalyst | December 2020

25

Gambar 8. Rangkuman potensial obat-obatan yang menarget protein spike

Referensi Al-Horani, R. A., Kar, S., & Aliter, K. F. (2020). Potential Anti-COVID-19 Therapeutics that Block the Early Stage of the Viral Life Cycle: Structures, Mechanisms, and Clinical Trials. International Journal of Molecular Sciences, 21(15), 5224.

Cai, Y., Zhang, J., Xiao, T., Peng, H., Sterling, S. M., Walsh, R. M., ... & Chen, B. (2020). Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. bioRxiv.

Du, L., Tai, W., Yang, Y., Zhao, G., Zhu, Q., Sun, S., ... & Jiang, S. (2016). Introduction of neutralizing immunogenicity index to the rational design of MERS coronavirus subunit vaccines. Nature communications, 7(1), 1-9.

Fan, X., Cao, D., Kong, L., & Zhang, X. (2020). Cryo-EM analysis of the post-fusion structure of the SARS-CoV spike glycoprotein. Nature communications, 11(1), 1-10.

Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., & Liu, S. W. (2020). Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacologica Sinica, 41(9), 1141-1149.

Lan, J., Ge, J., Yu, J., Shan, S., Zhou, H., Fan, S., ... & Wang, X. (2020). Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature, 581(7807), 215-220.

Monteil, V., Kwon, H., Prado, P., HagelkrĂźys, A., Wimmer, R. A., Stahl, M., ... & Romero, J. P. (2020). Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2. Cell.

Shang, J., Wan, Y., Luo, C., Ye, G., Geng, Q., Auerbach, A., & Li, F. (2020). Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences, 117(21), 11727-11734.

26

Biocatalyst | December 2020

PROTEIN N: Nucleocapsid, ‘Kemasan’ RNA.

PROTEIN

Afandi

Protein nukleokapsid (N) respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) adalah protein yang sangat imunogenik dan paling melimpah di dalam sel yang terinfeksi virus (Chang dkk. 2014).

Fungsi utama protein N adalah untuk mengemas molekul genom virus yang berupa untai tunggal RNA positif berukuran ~30 kb menjadi kompleks ribonukleoprotein (RNP). Protein N terdiri atas dua unit globular yaitu N-terminal domain (NTD) dan C-terminal domain (CTD). Masing-masing unit dihubungkan oleh suatu linker (Gambar 1). Baik NTD dan CTD berperan dalam pengemasan genom virus RNA, sedangkan IDR terlibat dalam memodulasi aktivitas pengikatan RNA. Analisis sekuens menunjukkan bahwa ia memiliki persentase identitas 90,52% dengan protein N SARS-CoV, dengan wilayah yang paling terlestarikan di dua domain inti dan penghubung.

Analisis evolusi molekuler dari protein N menunjukkan bahwa SARS-CoV-2 termasuk dalam garis keturunan B betacoronavirus yang terletak di cabang yang sama dengan SARS-CoV dan dua kelelawar coronavirus (Gambar 1B). Mereka terpisah dengan baik dengan virus korona lain, yang umumnya sesuai dengan pohon evolusi virus korona ini.

Dimerisasi terjadi melalui pertukaran domain dari dua hairpin β1-β2β2-β2, yang menghasilkan

Biocatalyst | December 2020

Gambar 1. Struktur organisasi protein N. B. Analisis filogenetik gen protein N SARS COV 2.

empat titik pusat ββ-sheet dari monomer yang berlawanan, dan di tengah oleh interaksi antara CTD α4 satu dan α4 yang berlawanan (gambar 2). Protein N aktif dalam pembentukan nukleokapsid CoV dan dalam memberikan lapisan pelindung untuk genom virus ssRNA. Ini berarti protein N mampu mengikat asam nukleat di satu sisi, dan mengasosiasikan diri menjadi homooligomer di sisi lain. Menurut model CoV N yang diterima saat ini, NTD mengikat basa gugus ribonukleotida dan CTD meng oligomerisasi dan melapisi ikatan punggung asam nukleat (Gambar 2B).

Protein N mengikat gRNA pada RTC dan penting untuk penggabungan materi genetik virus ke dalam partikel CoV (Cong dkk.

2017). Telah dihipotesiskan bahwa dimerisasi dan kemungkinan oligomerisasi protein CoV N memainkan peran penting dalam perakitan partikel virus. Perekru-

tan oligomer protein N ke kompleks replikase-transkriptase (RTC) di DMV dan terbelit dengan membran melalui interaksi dengan nsp, sehingga memungkinkan pemuatan erat gRNA yang sangat besar dan efisien melalui banyak situs pengikatan ke dalam kompleks ribonukleoprotein (Gambar 3). Pembentukan ribonukleokapsid adalah bagian penting dalam perakitan virus dan kompleks RNP merupakan template untuk replikasi karena kompleks RNA polimerase tergantung dari kompleks RNA-dependent.

Penelitian mengenai NTD dilakukan oleh (Zeng et al. 2020) sedangkan CTD dilakukan oleh (Zinzula et al. 2020), keduanya melakukan hal yang sama yaitu mengekspresikan bagian CTD/ NTD di dalam sel E. coli BL21.

Protein rekombinan kemudian dilakukan karakterisasi dari mas

27

ing-masing domain. Hasil kedua penelitian tersebut menyimpulkan bahwa hal yang sama yaitu protein N SARS COV 2 membentuk dimer, baik NTD dan CTD dapat berinteraksi dengan probe asam nukleat RNA maupun RNA. Zeng dkk 2020 juga melaporkan bahwa serum darah pasien COVID-19 yang sudah sembuh, ditemukan adanya antibodi IgG, IgA, dan IgM terhadap antigen N.

Sebagian besar RNP virus terletak dalam ~25 nm dari permukaan bagian dalam membran. RNP dikemas dalam bentuk "spherically" di permukaan dalam membran tanpa indikasi simetri ikosahedral.

Ujung karboksil dari protein M telah terbukti berinteraksi secara khusus dengan protein N, hasil ini menunjukkan bahwa interaksi M-N membatasi beberapa molekul N dalam posisi dengan amplop. Fungsi utama

protein N coronavirus adalah untuk melindungi genom RNA menjadi ribonukleoprotein untuk dimasukkan ke dalam virion secara lengkap. Jadi protein N harus terikat dengan RNA. Selama infeksi virus, protein N juga harus segera dipisahkan untuk mengekspos genom RNA untuk ekspresi, transkripsi dan replikasi yang efisien. Fungsi ini menuntut penghalang energi rendah untuk memisahkan protein N dari RNA.

Gambar 2. Diagram pita dan susunan topologi dimer SARS-CoV-2 N CTD, ditunjukkan dalam empat orientasi; dua monomer CTD masing-masing digambarkan dalam warna hijau tua dan hijau muda. B. Model terkini untuk organisasi struktural SARSCoV N yang dikomplekskan dengan 7 bp ssRNA, ditampilkan dalam empat orientasi; dua monomer N dan kepadatan ssRNA yang diduga masing-masing digambarkan dalam warna hijau tua, hijau muda dan oranye.

Gambar 3. Model peran protein CoV N selama infeksi. Setelah sintesis, protein CoV N secara konstitutif berkumpul menjadi oligomer dengan bentuk filamen terjalin longgar atau lebih kompak, yang direkrut ke RTC yang dilokalisasi pada vesikel membran ganda (DMV) dan membran berbelit melalui interaksinya dengan nsp3. Pada platform replikasi ini, gRNA yang baru disintesis dilibatkan oleh oligomer protein N, yang bekerja sama dengan protein struktural lainnya untuk membentuk partikel virus di kompartemen Golgi.

28

Biocatalyst | December 2020

Referensi Chang, Chung Ke, Ming Hon Hou, Chi Fon Chang, Chwan Deng Hsiao, and Tai Huang Huang. 2014 . “The SARS Coronavirus Nucleo capsid Protein - Forms and Functions.” Antiviral Research 103 (1): 39–50. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2013.12.009.

Zeng, Weihong, Guangfeng Liu, Huan Ma, Dan Zhao, Yunru Yang, Muziying Liu, Ahmed Mohammed, et al. 2020. “Biochemical Characterization of SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein.” Biochemical and Biophysical Research Communications 527 (3): 618–23. https://doi.org/10.1016/j. bbrc.2020.04.136.

Cong, Yingying, Franziska Kriegenburg, Cornelis A.M. De Haan, and Fulvio Reggiori. 2017. “Coronavirus Nucleocapsid Proteins Assemble Constitutively in High Molecular Oligomers.” Scientific Reports 7 (1): 1–10. https://doi.org/10.1038/s41598-017-06062-w.

Zinzula, Luca, Jerome Basquin, Stefan Bohn, Florian Beck, Sven Klumpe, Günter Pfeifer, István Nagy, Andreas Bracher, F. Ulrich Hartl, and Wolfgang Baumeister. 2020. “High-Resolution Structure and Biophysical Characterization of the Nucleocapsid Phosphoprotein Dimerization Domain from the Covid-19 Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2.” Biochemical and Biophysical Research Communications. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2020.09.131.

Biocatalyst | December 2020

29

PROTEIN

NSP12: Polimerisasi oleh RdRp

Andre Hendrawan

SARS-CoV-2 memanfaatkan protein kompleks RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) untuk replikasi RNA (Snijder dkk. 2016, Posthuma dkk.

2017). Kompleks tersebut terdiri atas subunit katalitik yaitu nsp12 dan subunit aksesoris yaitu satu subunit nsp7 dan dua subunit nsp8 (Subissi dkk. 2014, Posthuma dkk. 2017). Subunit nsp12 terdiri atas domain nidovirus RdRp-associated nucleotidyltransferase (NiRAN), domain antarmuka (interface), dan domain RdRp (Gambar 1).

Domain RdRp (Gambar 2) berbentuk menyerupai tangan kanan sehingga dapat dibagi menjadi subdomain jari, subdomain telapak, dan subdomain jempol (thumb). Subunit nsp7 dan nsp8 berikatan pada subdomain jempol. Subunit nsp8 lain berikatan pada subdomain jari (Kirchdoerfer & Ward 2019).

Subunit nsp12 berikatan dengan RNA di antara subdomain jari dan jempol (Hillen dkk. 2020). Sisi aktif terletak pada motif A, B, C, D, dan E pada subdomain telapak. Motif F dan G pada subdomain jari berperan dalam memosisikan RNA template.

Motif C berikatan pada bagian ujung 3â&#x20AC;&#x2122; RNA. Asam amino serin pada posisi residu ke-759 serta aspartat pada posisi residu ke-760 dan ke-761 pada motif C (Peng dkk. 2020) berperan dalam sintesis RNA (Gambar 3).

Dupleks RNA yang memanjang diapit struktur heliks Îą yang merupakan perpanjangan subunit nsp8 (Zhai dkk. 2005). Ukuran perpanjangan ini setara dengan 28 pasangan basa RNA yang dihitung dari sisi aktif. Residu-residu bermuatan positif pada perpanjangan tersebut berinteraksi dengan RNA untuk menjaga kestabilan RNA ketika replikasi berlangsung.

Kompleks RdRp ini dikenal sebagai molekul target bagi remdesivir (Subissi dkk. 2014, Jordan dkk.

2018). Remdesivir merupakan obat yang berperan sebagai analog ribonukleotida yang dapat dilibatkan dalam reaksi polimerisasi RNA. Dalam replikasi RNA, pengikatan remdesivir pada untai RNA baru dapat menghambat replikasi karena remdesivir tidak dapat diikatkan dengan ribonukleotida sehingga untai RNA baru tidak dapat dibentuk secara lebih lanjut.

30

Gambar 1. Struktur kompleks RdRp pada sudut pandang yang berbeda.

Gambar 2. Sisi aktif pada domain RdRp. Biocatalyst | December 2020

Gambar 3. Perpanjangan nsp8 berinteraksi dengan dupleks RNA.

Gambar 4. Posisi pengikatan remdesivir dalam inhibisi replikasi RNA.

Referensi Hillen HS, Kokic G, Farnung L, Dienemann C, Tegunov D, Cramer P (2020) Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature 584: 154156.

Jordan PC, Stevens SK, Deval J (2014) Nucleosides for the treatment of respiratory RNA virus infections. Antivir Chem Chemother 26: 1-19.

Kirchdoerfer RN, Ward AB (2019) Structure of the SARS-CoV nsp12 polymerase bound to nsp7 and nsp8 co-factors. Nat Commun 10 (2342). doi: 10.1038/s41467-019-10280-3.

Peng Q, Peng R, Yuan B, Zhao J, Wang M, Wang X, Wang Q, Sun Y, Fan Z, Qi J, Gao GF, Shi Y (2020) Structural and biochemical characterization of the nsp12-nsp7-nsp8 core polymerase complex from SARS-CoV-2. Cell Rep 31. doi: 10.1016/j.celrep.2020.107774.

Posthuma CC, te Velthuis AJW, Snijder EJ (2017) Nidovirus RNA polymerases: complex enzymes handling exceptional RNA genomes. Virus Res 234: 58-73.

Snijder EJ, Decroly E, Ziebuhr J (2016) The nonstructural proteins directing coronavirus RNA synthesis and processing. Adv Virus Res 96: 59-126.

Subissi L, Imbert I, Ferron F, Collet A, Coutard B, Decroly E, Canard B (2014) SARS-CoV ORF1b-encoded nonstructural proteins 12-16: replicative enzymes as antiviral targets. Antiviral Res 101: 122-130.

Zhai Y, Sun F, Li X, Pang H, Xu X, Bartlam M, Rao Z (2005) Insights into SARS-CoV transcription and replication from the structure of the nsp7-nsp8 hexadecamer. Nat Struct Mol Biol 12: 980-986.

Biocatalyst | December 2020

31

PROTEIN

NSP13: Helicase, Unzipping RNA Muhammad Fauzan

Analogi Apabila kita pernah melihat proses fotokopi dokumen, tentunya kita pernah melihat bagaimana suatu dokumen berlembar-lembar, yang disatukan oleh paper clip atau staples, dipisahkan satu sama lain, kemudian diperbanyak sehingga menjadi copy dokumen baru. Pada Sars-Cov-2, dokumen tersebut adalah materi genetic RNA, sementara mesin fotokopinya dimiliki oleh sel manusia. Sebelum proses perbanyakan copy RNA melalui mesin fotokopi sel inang, proses pemisahan â&#x20AC;&#x2DC;dokumenâ&#x20AC;&#x2122; sehingga menjadi lembar terpisah dilakukan oleh helicase. Pada artikel ini, kita akan sama-sama melihat bagaimana Sars-CoV-2 membuka lembaran dokumen, dalam hal ini untai ganda RNA, menjadi untai tunggal RNA yang siap untuk diperbanyak. Proses ini selanjutnya kita sebut unzipping (hint: unzipping plastik ziplock).

Struktur Untuk memahami secara utuh bagaimana proses unzipping terjadi, ada baiknya kita memperhatikan bagaimana penampalkan fisik dari helicase. Helicase, atau pada Sars-CoV-2 sering disebut dengan Nsp13, merupakan enzim (protein) berbentuk segitiga yang memiliki lima bagian atau domain.

Kelima bagian tersebut diberi nama RecA1,

Gambar 1 Pencitraan fisik dari enzim helicase (protein Nsp13). Pencitraan ini diperoleh dengan metode Cryo-EM (Chen et al., 2020)

RecA2, Stalk, Zinc-Binding Domain (ZBD), dan 1B. Ilustrasi bentuk dan bagian enzim terdapat pada Gambar 1. Masing-masing bagian tersebut merupakan protein yang terdiri dari banyak sekali â&#x20AC;&#x2DC;batu bataâ&#x20AC;&#x2122; penyusun, atau yang kita sering sebut dengan asam amino. Ada 20 asam amino yang tergolong menjadi lima golongan asam amino.

Masing-masing golongan tersebut memiliki sifat yang berbeda. Apabila suatu asam amino digabungkan dengan asam amino yang lain, maka

Gambar 2 Proses discontinuous transcription pada Sars-Cov-2 (V'kovski et al., 2020) 32

Biocatalyst | December 2020

akan terbentuk suatu protein yang memiliki sifat yang unik, termasuk lima bagian pada helicase.

Salah satu bagian pada helicase yaitu Zinc-Binding Domain, atau sering disebut dengan Zinc-finger, merupakan bagian yang memiliki asam amino lestari Cysteine dan Histidine. Keberadaan dua asam amino tersebut memungkinkan helicase untuk memiliki kemampuan dalam melakukan interaksi protein dengan protein, kemampuan untuk berikatan dengan RNA rantai tunggal atau ganda, serta pemotongan ikatan antar basa nukleotida atau unzipping. Dengan kata lain, dengan keberadaan dua asam amino tadi memungkinkan helicase untuk menjalankan proses unzipping.

merase pada daerah gen, sedangkan TRS-L merupakan tempat pemberhentian RNA polymerase pada daerah leader sequence (leader sequence ditandai dengan huruf L pada kotak berwarna L).

TRS tersebut adalah tempat RNA polymerase berhenti. RNA polymerase tersebut kemudian akan melanjutkan transkripsi dimulai dari daerah TRS-L. Arah transkripsi (arah copy) berlangsung dari ujung 3’ menuju ujung 5’ pada untai RNA positif (yang merupakan untai template).

Sebagai ilustrasi, gen A pada Sars-Cov-2 akan ditranskripsi. Pertama-tama, RNA polymerase akan menempel pada ujung 3’ dari untai RNA posi-

Selain memiliki bagian untuk melakukan proses unzipping, helicase memiliki bagian yang berperan sebagai tempat pengikatan Adenosine Triphosphate (ATP). ATP diibaratkan sebagai ‘baterai’ yang ketika dipasang akan menyalakan fungsi protein tersebut. Bagian tempat pengikatan ATP, atau bisa kita sebut sebagai slot baterai ATP, terletak antara bagian RecA1 dan RecA2. Ketika ATP tersebut berikatan pada slot tersebut, helicase dapat melakukan fungsi untuk unzipping rantai RNA Sars-Cov-2 untuk selanjutnya dilakukan proses perbanyakan copy.

Discontinuous transcription vs normal transcription Dalam proses perbanyakan copy RNA, terdapat tahap-tahap yang dilakukan oleh mesin polymerase untuk memperbanyak untai RNA dari satu untai menjadi banyak untai. Pada umumnya, polimerisasi berlangsung beriringan dengan perbanyakan copy RNA. Namun pada Sars-Cov-2, terdapat perbedaan pada proses perbanyakan copy RNA, dimana polymerase berhenti pada daerah khusus RNA. Akibatnya, hasil transkrip (copy) sgRNA yang dihasilkan berupa beberapa lembar transkrip RNA. Mari kita perhatikan kotak berwarna biru yang merupakan untai positif RNA (dengan kata lain merupakan untai yang terkandung dalam virus).

Ketika untai RNA positif masuk ke dalam sel inang, untai tersebut akan ditranskripsi menjadi copy RNA negatif. Copy RNA tersebut kemudian akan ditranskripsi kembali menjadi untai sgRNA positif.

Pada untai RNA positif terdapat daerah dengan nama TRS (Transcription Regulatory Site). Terdapat dua TRS, yaitu TRS-B dan TRS-L. TRS-B merupakan tempat pemberhentian RNA PolyBiocatalyst | December 2020

Gambar 3 Proses dicontinuous transcription, template switching, dan backtracking pada Sars-Cov-2 (hipotesis) (Chen et al., 2020)

tif. RNA polymerase kemudian akan bergeser ke arah ujung 5’ (pada gambar ini ke arah kiri). Seiring dengan bergesernya RNA polymerase, untai RNA negative (copy RNA) juga terbentuk. Proses ini berlangsung hingga RNA polymerase sampai di daerah TRS-B. Pada daerah TRS-B, proses polimersisasi RNA negative akan berhenti, dan RNA polymerase akan melewati (skip) sehingga transkripsi akan dimulai kembali pada daerah TRS-L menuju leader sequence, dan berhenti pada ujung 5’ leader sequence. Hasil dari transkripsi tersebut adalah satu untai RNA negative dari gen A yang tersambung dengan leader sequence. Ilustrasi tersebut hanya menggambarkan proses discontinuous transcription untuk satu gen. Pada kenyataannya, banyak gen yang ditranskripsi dengan proses tersebut sehingga dihasilkan banyak untai RNA negatif masing-masing gen.

33

Mekanisme backtracking Salah satu hal yang menjadi ciri khas helicase pada Sars-Cov-2 adalah mekanisme backtracking. Backtracking adalah proses unzipping yang dilakukan untuk membebaskan copy RNA dari template RNA. Ilustrasi backtracking akan lebih mudah dibayangkan dengan gambar 3.

Referensi Chen, J., Malone, B., Llewellyn, E., Grasso, M., Shelton, P. M. M., Olinares, P. D. B., Maruthi, K., Eng, E. T., Vatandaslar, H., Chait, B. T., Kapoor, T. M., Darst, S. A., & Campbell, E. A. (2020). Structural Basis for Helicase-Polymerase Coupling in the SARS-CoV-2 Replication-Transcription Complex. Cell, 182(6), 1560-1573.e13. https://doi. org/10.1016/j.cell.2020.07.033 V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., & Thiel, V. (2020). Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. https://doi.org/10.1038/s41579-020-004686

Proses backtracking memerlukan ‘baterai’ NTP (ATP atau GTP). Setelah copy untai RNA yang baru terbentuk, helicase akan mulai bekerja membuka ikatan antara copy untai RNA (pada gambar di atas pRNA atau product RNA), dengan RNA template. Proses ini mirip dengan membuka resleting jaket. Akibatnya copy RNA (pRNA) yang tadinya berikatan dengan RNA template, kini menjadi terbebas. Proses backtracking ini berperan dalam discontinuous transcription pada saat membentuk untai RNA negative dari suatu gen.

34

Biocatalyst | December 2020

PROTEIN

NSP9: Tempat Pengikatan RNA Saat Replikasi Marina Wulandari Nasution

Nsp9 adalah salah satu protein non struktural dari virus SARSCoV-2 yang akan membentuk protein homodimer agar mencapai keadaan stabil. Protein Nsp9 memiliki 1 rantai heliks pada ujung C-terminal dan 7 lembar beta antiparalel yang akan membentuk β barrel. Rantai heliks akan membentuk dimer dengan Nsp9 lainnya dan menjadi permukaan interaksi (Gambar 1). Terdiri dari 113 asam amino, protein ini memiliki kesamaan dengan Nsp9 dari SARS-CoV sebesar 97%, hanya sekitar 3 basa yang berbeda (Littler et. al., 2020).

Fungsi Nsp9 adalah sebagai tempat pengikatan RNA untuk proses replikasi, maka dari itu diperlukan protein yang stabil.

Nsp 9 akan membentuk homodimer yang stabil dan akan menjadi tempat berikatannya materi genetik dari virus SARSCoV-2.

Gambar 1 Struktur dimer Nsp9

Nsp9 mempunyai motif yang lestari pada setiap protein Nsp9 dari corona virus. Motif GxxxG pada Îą-heliks dan motif N-finger atau NNExxxx pada C-terminal adalah daerah lestari dan mempunyai fungsi pada Nsp9.

Motif GxxxG yang terdapat pada Îą-heliks menyebabkan adanya

interaksi van der Waals antara protomer Nsp9. Residu Gly100 dan Gly104 akan membentuk rantai heliks dengan interaksi van der Waals yang kemudian akan menjadi permukaan interaksi dimer Nsp 9. Adanya interaksi van der Waals pada motif GxxxG akan menyebabkan residu heliks berbentuk menyilang

Gambar 2 Perbandingan sekuens dari protein Nsp9 virus corona.

Biocatalyst | December 2020

35

Hasil mutasi kemudian diamati dengan menggunakan electrophoretic mobility shift assay (EMSA) untuk melihat afinitas pengikatan asam nukleat pada setiap mutan. Hasil EMSA menyatakan bahwa residu Leu4 dan Leu6 tidak mempunyai pengaruh pada afinitas pengikatan asam nukleat, kemudian residu Arg7 menunjukkan afinitas pengikatan asam nukleat lebih lemah 2,5 kali dibandingkan wild type, dan ketika mutasi pada beberapa residu langsung yaitu L4A/L6A/R7A/N8A hampir tidak menunjukkan afinitas pengikatan asam nukleat (Zeng et. al., 2018). Data ini menunjukkan bahwa residu R7 pada N-finger punya peran yang penting dalam kestabilan pengikatan asam nukleat.

Untuk memastikan fungsi dari Nsp 9 adalah untuk mengikat materi genetik dari virus baik berupa DNA maupun RNA, dilakukan pengujian dengan menggunakan EMSA dengan materi genetik berupa ssRNA dan ssDNA yang ditambahkan Nsp 9 dengan berbagai konsentrasi.

Hasil menunjukkan sedikit pengurangan materi genetik dengan bertambahnya konsentrasi Nsp 9 yang ditambahkan, hal ini dapat menjelaskan bahwa Nsp 9 akan lebih memilih berinteraksi dengan materi genetik dengan rantai tunggal (Gambar 5).

Gambar 3 Perbandingan sekuens dari protein Nsp9 virus corona.

36

Gambar 4 Hasil EMSA pada mutan Nsp 9.

Keseluruhan mekanisme pengikatan asam nukleat dan bagaimana Nsp 9 bekerja sebagai transport ke dalam sel host masih belum diketahui secara pasti. Tetapi Nsp 9 mempunyai peran penting dalam mesin RNA-dependent RNA replicase.

Materi genetik berupa asam nukleat rantai tunggal akan berikatan pada dimer Nsp 9, yang kemudian akan masuk kedalam sel inang dan menginfeksi sel.

Kemudian virus akan bereplikasi dengan mesin replikasi yang telah dibawa dan akan menginfeksi lebih banyak sel inang.

Jin Z, Du X, Xu Y, Deng Y, Liu M, Zhao Y, et al. Structure of M (pro) from COVID-19 virus and discovery of its inhibitors. Nature.

2020. https://doi.org/10.1038/s41586-0202223-y.

Littler, Dene R, and Gully, Benjamin S, et al. â&#x20AC;&#x153;Crystal Structure of the SARS-CoV-2 Non-structural Protein 9, Nsp9â&#x20AC;?. iScience, vol.23,no.7, 2020, pp. 15-. doi:10.1016/j. isci.2020.101258.

Zeng Z, Deng F, Shi K, et al. Dimerization of Coronavirus nsp9 with Diverse Modes Enhances Its Nucleic Acid Binding Affinity.

J Virol. 2018;92(17):e00692-18. Published 2018 Aug 16. doi:10.1128/JVI.00692-18 Zhang, C., Chen, Y., Li, L. et al. Structural basis for the multimerization of nonstructural protein nsp9 from SARS-CoV-2. Mol

Referensi

Biomed 1, 5 (2020). https://doi.org/10.1186/ s43556-020-00005-0

Gambar 5 Kemampuan pengikatan Nsp 9 dengan asam nukleat (A) pada DNA rantai tunggal dan (B) pada RNA rantai tunggal (Zhang et. al., 2020)

Biocatalyst | December 2020

PROTEIN

NSP10: Bersama dengan Nsp14 dan Nsp16 dalam Metilasi RNA Nadira Rahmatunisa

SARS-CoV-2 memiliki gen yang mengkode 4 jenis protein struktural dan 16 jenis protein non struktural (Nsp) yang berperan penting dalam siklus kehidupan virus, untuk dapat mengeksploitasi lingkungan seluler sel inang yang akan diinfeksi. Untuk dapat bereplikasi dengan baik, virus ini memerlukan mekanisme untuk bersembunyi dari imunitas sel inang. Harus ada mekanisme perlindungan RNA virus agar tidak didegradasi oleh inang sebagai materi asing yang dikenali oleh sistem imun sel. Pada mRNA sel inang, mRNA tersebut dilindungi dengan capping pada ujung 5’ dengan 7-metilguanisil. SARS-CoV-2 memimik hal serupa dengan melakukan capping pada ujung 5’ RNA yang mengandung N7’methylated guanosine triphosphate dan C2’O-Methylribosiladenine (Krafcikova et al., 2020).

Proses capping ini dilakukan oleh beberapa Nsp, diantaranya adalah Nsp10, Nsp14, dan Nsp16.

Nsp14 berperan dalam proses proofreading dan capping. Ujung C dari Nsp ini memiliki aktivitas N7 guanidin-metil transferase sedangkan ujung N dari Nsp14 memiliki aktivitas eksoribonuklease (ExoN). Nsp10 berperan sebagai kofaktor dari Nsp14. Nsp10 menempel pada ujung C . Interaksi ini dapat menstabilisasi dan menstimulasi aktivitas transferase yang dilakukan oleh Nsp14 untuk dapat memetilasi ujung C dan ujung N dari RNA SARS-CoV-2 membentuk cap-0(M2GppNRNA). Proses capping selanjutnya dilakukan oleh

Nsp16. Nsp16 melakukan aktivitas metil transferase dengan donor metil berupa S-adenosil L-metionin-dependent metiltransferase (SAM). Aktivitas yang dilakukan oleh Nsp16 ini membutuhkan Nsp10 karena tanpa Nsp10, Nsp16 memiliki afinitas yang rendah dalam melakukan pengikatan RNA yang akan mempengaruhi aktivitas capping.

Nsp10 juga diketahui dapat menjadi penghubung antara sisi katalitik pada Nsp14 dan Nsp16 (Krafcikova et al., 2020; Romano et al., 2020).

Dalam analisis struktur dari Nsp10. Hampir tidak ditemukan penelitian yang menganalisis struktur mandiri Nsp10. Kebanyakan jurnal yang ditemukan, Nsp10 dianalisis strukturnya bersama dengan Nsp14 dan Nsp16. Nsp10 terdiri dari 2 domain, yaitu helikal α-subdomain dan β-subdomain.

Bagian helikal α-subdomain diantaranya adalah α1, α2, α3, α4, dan α6 sedangkan bagian β-subdomain terdiri dari 2 antiparalel β-sheet, yaitu β1 dan β2, heliks pendek α5, dan region coil-coiled.

Region coil-coiled ini berperan sebagai molecular spacer sehingga dapat memposisikan aktivitas katalitik terjadi pada jarak yang tepat. Nsp10 juga memiliki fitur kunci, yaitu adanya 2 situs pengikatan seng (Zn). Zn ini berperan sebagai kofaktor katalitik bagi Nsp10. Ikatan ini dapat mempengaruhi konformasi dari Nsp10. Lokasi pengikatan Zn ini diantaranya ada pada residu Cis (74, 77, dan 90) dan His (38), antara heliks α2 dan α3, kemudian pada residu Cis (117,120, 128, dan 130) yang

Gambar 1. Proses sintesis capping pada mRNA SARS-CoV-2 (Romano et al., 2020) Biocatalyst | December 2020

37

membantu stabilisasi ujung C Nsp10. Dimer Nsp10 dan Nsp16 dibentuk oleh region coil-coiled dan α2, α3, dan α4 yang berhubungan dengan bagian heliks α1 dan β1 dari Nsp16. Interaksi anatara Nsp10 dan Nsp16 terjadi melalui ikatan hidrogen dan dapat dimediasi oleh molekul air (Krafcikova et al., 2020).

Gambar 2. Kompleks Nsp dengan Nsp10 sebagai penghubung molekuler antara aktivitas proofreading dan capping (Romano et al., 2020)

Referensi: Romano, M., Ruggiero, A., Squeglia, F., Maga, G., & Berisio, R. (2020).

A Structural View of SARS-CoV-2 RNA Replication Machinery: RNA Synthesis, Proofreading and Final Capping. Cells, 9(5), 1267. https:// doi.org/10.3390/cells9051267 Krafcikova, P., Silhan, J., Nencka, R. (2020) Structural analysis of the SARS-CoV-2 methyltransferase complex involved in RNA cap creation bound to sinefungin. Nat Commun 11, 3717. https://doi. org/10.1038/s41467-020-17495-9

Gambar 3. Kompleks struktur Nsp10 dan Nsp 16. Nsp 10 ditunjukan oleh warna jingga dan Nsp16 ditunjukan oleh warna cyan (Krafcikova et al., 2020) 38

Biocatalyst | December 2020

NSP14: Proofreading

PROTEIN

Muhammad Fauzan Muttaqin Siregar Nsp 14 merupakan protein non struktural dari virus SARSCoV-2 yang memiliki dua domain dengan fungsi yang berbeda (protein bifungsional). Protein ini memiliki panjang 527 asam amino, dimana pada domain N terminal dari Nsp 14 memiliki aktivitas exoribonuklease (ExoN) dan memiliki tiga motif yang lestari: motif I (DE), II (E), dan III (D).

Akibat keberadaan motif ini, Nsp 14 dimasukkan ke dalam “DEED outlier” dari protein superfamily DEDD exonuklease (Ma et al 2015, Ogando et al 2019), yang merupakan kelompok enzim dengan aktivitas proofreading (Becares et al 2016, Ogando et al 2019). Pada bagian C-terminal dari Nsp 14, memiliki aktivitas (N7 guanine)-methyl transferase, yang berperan pada sintesis cap pada RNA virus (Chen et al 2009b). secara struktur Nsp 14 pada SARS-CoV-2 memiliki kekerabatan yang tinggi dengan SARS-CoV, dengan menunjukkan 95,06% identity dan 98% similarity saat dilakukan BLAST (Gambar 3). Hal ini menunjukkan kekerabatan baik secara phylogeny maupun perilaku fungsional (Selvaraj et al 2020).

Pemodelan dari Nsp 14 menunjukan susunan topologi berupa 6 betasheets, 8 beta-hairpins, 2 beta-bulges, 24 beta-strands, 14 helices, 6 helix-helix interacs, 63 beta-turns, 2 gamma-turns (Gambar 1A). Topologi ini mirip dengan SARS-CoV yaitu 6 betasheets, 8 beta-hairpins, 3 beta-bulges, 23 beta-strands, 13 helices, 10 helix-helix interacs, 60 beta-turns (Gambar 1A) (Selvaraj et al 2020). Dalam menjalankan fungsinya, Nsp 14 membutuhkan kofaktor Nsp 10, Biocatalyst | December 2020

dimana kofaktor ini berperan penting dalam menjaga struktur domain ExoN dari Nsp 14 dengan cara berikatan pada sisi N terminal dari protein (Gambar 2B). Hasil eksperimen SAXS terhadap Nsp 14 tanpa kehadiran Nsp 10 menunjukkan perubahan konformasi yang besar pada ujung N dari Nsp 14, yang berimbas pada keseluruhan bentuk dari lipatan asam amino pada domain ExoN. Selain itu, interaksi dengan Nsp 10 terbukti meningkatkan aktivitas nucleolytic dari NSP 14 SARS-CoV, yang naik 35 kali lipat (Bouvet et al 2012).

Struktur dan Fungsi NSP 14 SARS-CoV-2 Struktur eksperimental dari Nsp 14 SARS-CoV-2 masih belum tersedia pada Protein Data Bank (PDB), namun urutan asam amino dari Nsp 14 telah tersedia di NCBI: YP_009725309.1 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), sehingga dapat dilakukan mod-

eling (Gambar 2) dengan template berupa sekuens asam amino dari virus SARS-CoV yang memiliki kekerabatan sangat tinggi dengan SARS-CoV-2 (Gambar 3) (Ferron et al 2017, Ma et al 2015).

Struktur dan Fungsi Domain Exoribonuklease (ExoN) NSP 14 SARS-CoV-2 Domain ExoN dari Nsp 14 pada SARS-CoV-2 memiliki kekerabatan yang sangat tinggi dengan SARS-CoV dengan hanya didapati 13 urutan asam amino yang tidak lestari dari total 287 asam amino. Domain ini mengandung konformasi asam amino berupa lipatan α/β, sama seperti enzim anggota DEDD superfamili eksonuklease lainnya (Derbyshire et al 1991). Secara spesifik, domain ini membentuk struktur lembaran β pusat yang terbentuk dari lima untai β. Struktur ini diapit oleh α-heliks, kecuali pada lembar β3, yang serupa dengan domain

Gambar 1. Struktur keseluruhan dari Nsp 14: (a) struktur template, Nsp 14 dari SARS-CoV (PDB ID:5c8s). (b) pemodelan Nsp 14 SARS-CoV-2 berdasarkan template. (c) Superimposisi struktural dari kedua Nsp 14 39

atom Mg2+ akan mengaktivasi satu molekul air dengan cara mendeprotonasi H2O menjadi OH-. Molekul air yang teraktivasi tersebut kemudian secara nukleofilik dapat menyerang fosforus pada ikatan fosfodiester dari ujung 3â&#x20AC;&#x2122; dari molekul RNA virus, dan menyebabkan terlepasnya ikatan pada ribonukleotida yang salah, dan dapat digantikan dengan urutan yang benar (Gambar 5) (Yang 2011).

Struktur dan Fungsi Domain (N7 guanine)-methyl transferase NSP 14 SARS-CoV-2

Gambar 2. Pemodelan homolog dari kompleks Nsp 14 dan Nsp 10 SARS-CoV-2.

(A) Organisasi domain dari Nsp 14 dan Nsp 10. (B) Representasi struktur kedua domain Nsp 14, dan interaksinya dengan Nsp 19

ExoN virus SARS-CoV (Gambar 4) (Ferron et al 2017, Ma et al 2015). Berdasarkan pensejajaran secara struktural dengan SARS-CoV, Residu katalitik dari domain ExoN dari SARS-CoV-2 meliputi residu DEED yaitu Asp90, Glu92, Glu191, Asp272 (Gambar 2A) (Ferron et al 2017, Ma et al 2015). Struktur ini juga Mirip dengan RNase T dari E. coli dan RNase AS dari M. tuber-

culosis, yang merupakan dua jenis eksonuklease yang berperan dalam pematangan RNA melalui pemrosesan pada ujung 5â&#x20AC;&#x2122; (Romano et al 2015, Romano et al 2014). Mekanisme kerja domain ExoN Nsp 14 SARS-Cov-2 sama dengan enzim eksonuklease kelompok DEED superfamili lainnya, yaitu memanfaatkan dua buah atom Mg2+ dalam pelepasan ribonukleotida. Satu

Pada domain Guanine-N7 methyltransferase dari Nsp 14 SARS-CoV-2, secara keseluruhan terdapat 4 daerah yang teramati memiliki perubahan bentuk dibandingkan dengan SARS-CoV (Gambar 1B), dimana pada template (SARS-CoV), menunjukkan struktur alpha helix, sedangkan pada daerah yang sama pada SARS-CoV-2 menunjukkan konformasi loop, begitu pula dengan tiga daerah lainnya. Perubahan ini cenderung mengarah dari bentuk teratur, menuju bentuk yang lebih tidak teratur (Selvaraj et al 2020). Domain ini menunjukkan fitur struktural yang unik dengan

Gambar 3. Hasil pensejajaran sekuens asam amino SARS-CoV-2 dan SARS-CoV 40

Biocatalyst | December 2020

SAM (S-Adenosyl methionine) merupakan senyawa donor gugus metil pada reaksi Guanine-N7 methyltransferase yang dikatalisis oleh Nsp14. Klaster kedua berbentuk kantong yang menahan GTP (Cap core) yang merupakan substrat dari Nsp 14 (Gambar 2B) (Ma et al. 2015).

Gambar 4. Struktur domain ExoN Nsp 14 SARS-CoV

menampilkan lipatan atipikal, berbeda dengan canonical Rossmann fold yang dimiliki oleh sebagian besar RNA MTase virus. Hal ini menyebabkan domain Guanine-N7 methyltransferase Nsp 14 tidak masuk dalam kelas SAM-dependent MTase manapun (Byszewska et al 2014, Chouhan et al 2019, Schubert et al 2003). Struktur lembar β dari N7-MTase Nsp 14 terbentuk dari lima untai β (Romano et al 2020), dan dikarenakan urutan asam aminonya yang memiliki kemiripan yang tinggi dengan Nsp 14 SARSCoV, keduanya juga memiliki bentuk konformasi yang sama, dengan adanya dua klaster residu asam amino yang menjadi kunci dari aktivitas N7-MTase dari kedua protein (Chen et al 2009a, Chen et al 2013, Jin et al 2013). Klaster pertama adalah SAM-binding motif I (DxGxPxG/A), meliputi Asp331, Gly333, Pro335, dan Ala337, dimana

Fungsi utama dari domain ini pada Nsp 14 SARS-CoV-2, sama dengan Nsp 14 SARSCoV, dimana struktur kantong yang dimiliki dapat mengatur jarak dan orientasi dari substrat (Cap core) dan ligan (SAM) (Gambar 6), sehingga dapat terfasilitasi aktivitas donor gugus metil dari SAM pada posisi N7 dari guanin (Fabrega et al 2004).

A.2 Pencarian Senyawa Inhibitor bagi Nsp 14 Nsp 14 memegang peran penting dalam infeksi sel inang oleh virus SARS-CoV-2, salah satunya dalam proses capping gRNA yang merupakan tahapan penting untuk menjaga kestabilan gRNA, mencegah degradasi oleh RNAse inang, dan membantu pengenalan gRNA oleh ribosom inang melalui eukaryotic translation initiation factor 4E (elF4E) (Ma et al 2015).

Fungsi penting ini menjadikan domain N7-Mtase dari Nsp 14

dapat menjadi target penerapa senyawa antiviral untuk dapat mengganggu aktivitas tersebut, sehingga dapat mencegah terjadinya translasi, maupun replikasi dari genom virus (Elmezayen et al 2020, Ferron et al 2012, Ma et al 2015). Salah satu penelitian mengenai pencarian senyawa kandidat obat yang mengganggu aktivitas N7-Mtase Nsp 14 SARS-CoV-2 dilakukan oleh Selvaraj et al pada tahun 2020. Penelitian tersebut mencoba menemukan beberapa senyawa kandidat obat yang berasal dari TCM (Traditional Chinese Medicine) Database@ Taiwan (Ma et al 2016, Wang et al 2018). Seleksi senyawa kandidat antiviral dilakukan dengan melakukan High Throughput Virtual Screening (HTVS) (Lobo-Galo et al 2020, Patidar et al 2016), dan hasilnya didapatkan 5 senyawa terbaik yang dapat berikatan pada sisi aktif domain N7-Mtase Nsp14 SARS-CoV-2 (Gambar 7), dan kelima senyawa memiliki interaksi dengan salah satu residu asam amino yang sama dengan substrat N7Mtase, yaitu Guanosine-P3-Adenosine-5’,5’-Triphosphate (G3A), sehingga senyawa TCM dapat menjadi inhibitor kompetitif dari G3A.

Gambar 5. Mekanisme Exonuklease domain ExoN Nsp 14 SARS-Cov-2 Biocatalyst | December 2020

41

Gambar 6. Mekanisme katalisis transfer metil oleh domain N7-MTase Nsp 14 SARS-CoV

Selain memiliki kemampuan untuk dapat berikatan pada sisi aktif N7-MTase, kelima molekul juga terbukti dapat membentuk kompleks yang cukup stabil dengan N7-Mtase, yang ditandai dengan konstannya nilai RMSD (Root Mean Square Deviation) yang menyatakan jarak yang terbentuk antara substrat/ senyawa TCM dengan Nsp 14 ketika saling berikatan (Gambar 8). Senyawa kandidat antiviral juga memiliki ikatan yang cukup kuat dengan sisi pengikatan substrat dari N7-Mtase, yang ditunjukkan dengan jumlah ikatan hidrogen yang terbentuk seiiring dengan waktu (Gambar 9). Tidak hanya menunjukkan jumlah ikatan hidrogen yang lebih banyak dibandingkan substrat G3A, kelima senyawa TMC juga teramati membutuhkan waktu yang lebih cepat dalam membentuk ikatan hidrogen dengan sisi aktif , yang mengindikasikan kecenderungan pembentukan kompleks yang lebih cepat antara senyawa kandidat antiviral dengan N7-Mtase dibandingkan 42

dengan substrat G3A. Hasil ini menunjukkan kelima senyawa tersebut memiliki potensi yang besar sebagai inhibitor kompetitif yang dapat menghambat proses capping gRNA oleh(N7 guanine)-methyl transferase NSP 14 SARS-CoV-2.

Referensi

Becares M, Pascual-Iglesias A, Nogales A, Sola I, Enjuanes L, Zuñiga S. 2016. Mutagenesis of Coronavirus nsp14 Reveals Its Potential Role in Modulation of the Innate Immune Response. Journal of virology 90: 5399-414 Bouvet M, Imbert I, Subissi L, Gluais L, Canard B, Decroly E. 2012. RNA 3 ‘-end mismatch excision by the severe acute respiratory syndrome coronavirus nonstructural protein nsp10/nsp14 exoribonuclease complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109: 9372-7 Byszewska M, Śmietański M, Purta E, Bujnicki JM. 2014. RNA methyltransferases involved in 5’ cap biosynthesis. RNA Biol 11: 1597-607 Chen Y, Cai H, Pan J, Xiang N, Tien P, et al. 2009a.

Functional screen reveals SARS coronavirus nonstructural protein nsp14 as a novel cap N7 methyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106: 3484-9 Chen Y, Cai H, Pan Ja, Xiang N, Tien P, et al. 2009b.

Functional screen reveals SARS coronavirus nonstructural protein nsp14 as a novel cap N7 methyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106: 3484-9 Chen Y, Tao J, Sun Y, Wu A, Su C, et al. 2013.

Structure-function analysis of severe acute respiratory syndrome coronavirus RNA cap guanine-N7-methyltransferase. Journal of virology 87: 6296-305 Chouhan BPS, Maimaiti S, Gade M, Laurino P. 2019. Rossmann-Fold Methyltransferases: Taking a “β-Turn” around Their Cofactor, S-Adenosylme-

thionine. Biochemistry 58: 166-70 Derbyshire V, Grindley ND, Joyce CM. 1991. The 3’5’ exonuclease of DNA polymerase I of Escherichia coli: contribution of each amino acid at the active site to the reaction. EMBO J 10: 17-24 Elmezayen AD, Al-Obaidi A, Şahin AT, Yelekçi K. 2020. Drug repurposing for coronavirus (COVID-19): in silico screening of known drugs against coronavirus 3CL hydrolase and protease enzymes. Journal of biomolecular structure & dynamics: 1-13 Fabrega C, Hausmann S, Shen V, Shuman S, Lima CD. 2004. Structure and mechanism of mRNA cap (guanine-N7) methyltransferase. Molecular cell 13: 77-89 Ferron F, Decroly E, Selisko B, Canard B. 2012. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral research 96: 21-31 Ferron F, Subissi L, Morais A, Le N, Sevajol M, et al.

2017. Structural and molecular basis of mismatch correction and ribavirin excision from coronavirus RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences 115: 201718806 Jin X, Chen Y, Sun Y, Zeng C, Wang Y, et al. 2013.

Characterization of the guanine-N7 methyltransferase activity of coronavirus nsp14 on nucleotide GTP. Virus research 176: 45-52 Lobo-Galo N, Terrazas-López M, Martinez-Martinez A, Díaz-Sánchez Á. 2020. FDA-approved thiol-reacting drugs that potentially bind into the SARS-CoV-2 main protease, essential for viral replication. Journal of Biomolecular Structure and Dynamics: 1-12 Ma Y, Wu L, Shaw N, Gao Y, Wang J, et al. 2015.

Structural basis and functional analysis of the SARS coronavirus nsp14-nsp10 complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 112: 9436-41 Ma Y, Zhou K, Fan J, Sun S. 2016. Traditional Chinese medicine: potential approaches from modern dynamical complexity theories. Frontiers of Medicine 10: 28-32 Ogando NS, Ferron F, Decroly E, Canard B, Posthuma CC, Snijder EJ. 2019. The Curious Case of the Nidovirus Exoribonuclease: Its Role in RNA Synthesis and Replication Fidelity. Front Microbiol 10: 1813 Patidar K, Deshmukh A, Bandaru S, Lakkaraju C, Girdhar A, et al. 2016. Virtual Screening Approaches in Identification of Bioactive Compounds Akin to Delphinidin as Potential HER2 Inhibitors for the Treatment of Breast Cancer. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP 17: 2291-5 Romano M, Ruggiero A, Squeglia F, Maga G, Berisio R. 2020. A Structural View of SARS-CoV-2 RNA Replication Machinery: RNA Synthesis, Proofreading and Final Capping. Cells 9: 1267 Romano M, Squeglia F, Berisio R. 2015. Structure and Function of RNase AS: A Novel Virulence Factor From Mycobacterium tuberculosis. Current medicinal chemistry 22 Romano M, van de Weerd R, Brouwer Femke CC, Roviello Giovanni N, Lacroix R, et al. 2014.

Structure and Function of RNase AS, a Polyadenylate-Specific Exoribonuclease Affecting Mycobacterial Virulence In Vivo. Structure 22: 719-30 Schubert HL, Blumenthal RM, Cheng X. 2003.

Many paths to methyltransfer: a chronicle of convergence. Trends Biochem Sci 28: 329-35 Selvaraj C, Dinesh DC, Panwar U, Abhirami R, Boura E, Singh SK. 2020. Structure-based virtual screening and molecular dynamics simulation of SARSCoV-2 Guanine-N7 methyltransferase (nsp14) for identifying antiviral inhibitors against COVID-19.

Wang J, Wong YK, Liao F. 2018. What has traditional Chinese medicine delivered for modern medicine? Expert reviews in molecular medicine 20: e4 Yang W. 2011. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Q Rev Biophys 44: 1-93

Biocatalyst | December 2020

Gambar 7. (I) Interaksi molekuler senyawa TCM terbaik hasil virtual screening: ligan TCM berinteraksi dengan sisi pengikatan substrat (a) TCM57025, (b) TCM 3495, (c) TCM 20111, (d) TCM 31007, and (e) TCM 5376, informasi residu yang berinteraksi didapatkan melalui XP docking. (II) Interaksi molekuler substrat Guanosine-P3-Adenosine-5â&#x20AC;&#x2122;,5â&#x20AC;&#x2122;-Triphosphate (G3A) (II) dengan sisi aktif N7-MTase.

Gambar 8. Grafik RMSD pada rentang waktu 50 ns dari simulasi Molecular Dynamics (MD) untuk substrat (G3A), dan senyawa TCM terbaik dalam membentuk kompleks dengan Nsp 14 dari SARS-CoV-2. Panel bawah menunjukkan tampilan yang diperbesar dari daerah yang ditandai.

Biocatalyst | December 2020

Gambar 9. Grafik jumlah ikatan hidrogen pada rentang waktu 50 ns dari substrat G3A, dan senyawa TCM

43

PROTEIN

NSP16: Penyamaran RNA Sars-CoV-2

Muhammad Azri

Sars-CoV-2 yang menyebabkan sindrom pernafasan akut berat (SARS-CoV-2) merupakan patogen penting yang dapat mengancam kesehatan manusia dan dinamika perekonomian serta penyebab dari pandemi COVID-19. SARS-CoV 2 berasal dari subfamili dari Coronavirinae kemudian diklasifikasikan menjadi empat genera besar yakni Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus, dan Deltacoronavirus. Klasifikasi awalnya didasarkan pada hubungan antigen dan kemudian dikonfirmasi dengan perbandingan sekuens dari seluruh genom virus (Wang et al, 2015).

SARS-CoV 2 adalah virus RNA untai tunggal yang memiliki arah strand positif. Dua pertiga dari genom coronavirus berisi kerangka pembacaan terbuka yang besar (ORF), ORF1ab, yang mengkode poliprotein 1a (pp1a) dan poliprotein 1ab (pp1ab), yang terakhir dihasilkan melalui pergeseran bingkai 1 ribosom.

Poliprotein pp1a / 1ab dipotong menjadi 16 protein nonstruktural (nsp1 hingga nsp16) dan mencakup banyak enzim pemrosesan RNA, seperti RNA polimerase yang bergantung pada RNA (nsp12), RNA helikase dan trifosfatase (nsp13), eksoribonuklease dan N7-MTase (nsp14 ), endonuklease (nsp15), dan 2’O-MTase (nsp16) (Wang et al, 2015).

Selain itu, SARS-CoV 2 memiliki genom terbesar dari semua virus tipe RNA. Secara khusus, genom SARS-CoV-2 memiliki ~ 29.800 basa, yang mengkode 4 protein struktural dan 16 protein nonstruktural (nsp1 – nsp16) 44

yang penting untuk siklus hidup virus ini. SARS-CoV-2 memanfaatkan lingkungan sel secara maksimal untuk digunakan dan direplikasi. Yang penting, RNA virus harus dilindungi dari imunitas bawaan seluler. Salah satu elemen terpenting yang memastikan integritas RNA virus adalah cap, pengaturan khusus di ujung 5 ‘molekul RNA yang terdiri dari N-7 methylated guanosine triphosphate dan C2-O-methyl-ribosyladenine (cap 1) (Wang et al, 2015).

2’-O-RNA methyltransferase (MTase) adalah salah satu enzim dari virus ini yang merupakan target potensial untuk terapi antiviral karena sangat penting untuk pembentukan cap pada RNA yang baru terbentuk dan merupakan proses yang penting untuk stabilitas RNA virus. Fungsi MTase ini dikaitkan dengan protein nsp16, yang membutuhkan kofaktor, nsp10, untuk menjalankan aktivitasnya dengan baik (Decroly et al, 2008).

Susunan capping tersebut ini menyerupai mRNA asli sel inang, menstabilkan RNA, dan memastikan proses penerjemahan yang efektif. Namun, pada sel manusia, cap yang dipasang pada mRNA yang baru ditranskripsi yang sudah ada di dalam nukleus, yang tidak dapat diakses oleh virus corona. Sebaliknya, mereka memiliki enzim penyintesis cap sendiri (Chen & Guo, 2016).

Baik nsp14 dan nsp16 merupakan methyltransferases (MTases) yang bergantung pada donor S-adenosylmethionine (SAM) yang penting un-

tuk siklus hidup virus. Secara khusus, nsp16 menjadi target molekuler yang sangat menjanjikan dari desain obat inhibitor.

Telah ditunjukkan bahwa 2’-O methyltransferase (MTase) ini vital diperlukan untuk replikasi virus corona dalam kultur sel.

Aktivitas enzimatik dari kedua kompleks MTase ini (nsp14 dan nsp16) secara signifikan ditingkatkan oleh adanya nsp10, yang merupakan aktivator yang diperlukan untuk menjalankan fungsi dengan efektif (Decroly et al, 2008; Chen & Guo, 2016).

Menariknya, MTase nps16 menjadi tidak aktif tanpa aksesori protein nsp10 sebagai aktivator. Analisis struktural dari protein SARS-CoV nsp10 dalam bentuk tanpa berikatan dengan dengan nsp16 menunjukkan tidak ada perubahan konformasi yang signifikan dari nsp16. Oleh karena itu, fungsi nsp10 dalam menginduksi perubahan konformasi pada nsp16 MTase yang fungsional menjadi enzim yang produktif. Pada prinsipnya, pengetahuan tentang hubungan antar nsp10-nsp16 adalah target obat. Namun, mengingat luasnya area interface ini dan jaringan kompleks ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik, kecil kemungkinannya hal itu dapat ditargetkan oleh molekul berukuran sangat kecil sebagai kandidat obat inhibitor (Wang et al, 2015; Chen & Guo, 2016).

Struktur kompleks nsp10-nsp16 mengungkapkan beberapa faktor penting yang dapat dieksploitasi untuk menargetkan pemasangan cap pada molekul RNA virus yang baru terbentuk dalam Biocatalyst | December 2020

dalam desain terapeutik. Kompleks nsp10-nsp16 harus dapat saling mengikat dan membentuk dimer untuk dapat berfungsi introduksi GTP termetilasi, dan mengenali setidaknya nukleotida pertama untai RNA, serta substrat untuk reaksi metilasi yakni SAM sebagai donor metil (Wang et al, 2015; Chen & Guo, 2016).

2.

Proses Capping RNA Struktur cap-0 mRNA terbentuk secara bersamaan melalui reaksi enzimatik sekuensial, termasuk RNA triphosphate (TPase), RNA guanylyltransferase (GTase), dan RNA (guanineN7) -methyltransferase (N7-MTase). Pada eukariota yang lebih tinggi dan beberapa virus, struktur cap-0 m7GpppN-RNA selanjutnya dimetilasi pada posisi ribosa 2’-O dari mRNA yang baru terbentuk oleh ribosa 2’-O-methyltransferase (2’-O-MTase) untuk membentuk cap -1 (m7GpppNm) dan struktur cap-2 (m7GpppNmNm)

(Wang et al, 2015).

3. Eksplorasi Kandidat inhibitor untuk menghambat aktivitas MTase (NSP 16) SARS-CoV 2 Pada penelitian Krafcikova et al.

(2020) yang terbit dalam jurnal Nature menunjukkan struktur kristal kompleks nsp10-nsp16 yang dapat terikat pada sinefungin inhibitor pan-MTase di situs aktif. Perbandingan struktural tersebut mengungkapkan daerah konservasi yang tinggi antara situs pengikatan aktif MTase dengan RNA virus SARS-CoV-2 yang dibandingkan dengan SARS-CoV. Data tersebut menunjukan bahwa persiapan penghambat MTase yang menargetkan beberapa virus corona - tetapi tidak untuk flavivirus yang seharusnya memungkinkan. Bersama-sama, data kami menambah informasi penting untuk penemuan obat berbasis struktur yakni salah satu kandidatnya yakni Sinefugin.

Struktur kristal SARS-CoV-2

nsp10-nsp16 dalam kompleks dengan sinefungin, penghambat pan-MTase yang awalnya diisolasi dari Streptomyces griseoleus. Struktur tersebut mengungkapkan lipatan keseluruhan yang mirip dengan SARS-CoV nsp10nsp16, dan, yang terpenting, mengungkapkan detail atom tentang bagaimana sinefungin menghambat nsp16 MTase.

Ini memberikan titik awal untuk desain inhibitor tertentu. Untuk mendapatkan kompleks protein nsp10-nsp16, para peneliti mengcoekspresikan gen yang megkode nsp10 dan nsp16 secara bersama-sama ke dalam E. coli BL21. Kompleks MTase ini

stabil selama pemurnian protein menunjukkan kesesuaian untuk dilakukan lanjutan analisis struktural. Kompleks nsp10-nsp16 ditambah dengan pan-MTase inhibitor yakni Sinefungin yang kemudian diuji kristalisasi.

Gambar 1. Proses pembentukan struktur cap-1 pada ujung 5’ mRNA SARS-CoV-2 (Wang et al, 2015) Biocatalyst | December 2020

45

Gambar 2. Struktur keseluruhan kompleks protein nsp10-nsp16 (Krafcikova et al, 2020

Akhirnya diperoleh kristal yang terdifraksi hingga resolusi 2,4 Å.

Struktur dilihat dengan molekuler replacement dan menunjukkan lipatan alphabeta campuran dengan ikatan sinusfungin pada bagian tengah. Fitur utama nps16 MTase adalah strip paralel dan anti-paralel β-sheets (seperti yang muncul dalam struktur dari interface nsp10: β4, β3, β2, β6, β7, β9, β8, β1) dalam bentuk dari huruf J yang distabilkan dari dalam oleh heliks α3 dan α4 di sekitarnya dan dari luar oleh heliks α5-α9. Berdasarkan posisi sinefungin dalam struktur tersebut terlihat jelas bahwa reaksi ini berikatan dengan nsp16. Kedua situs pengikatan ini membentuk ngarai yang terdefinisi dengan baik dalam struktur nsp16 seperti yang terlihat pada gambar 3. Situs pengikatan untuk sinefungin harus bersentuhan langsung den-

gan gugus 2-hidroksil pada nukleotida pertama setelah gugus GTP termetilasi. Secara khusus, fungsionalitas amino kiral di C6 ‘dari sinefungin harus diarahkan ke tempat pengikatan cap RNA. Oleh karena itu, modifikasi pada bagian molekul ini, berdasarkan desain struktur, telah mengarah pada desain inhibitor yang sangat aktif dari berbagai MTase seperti yang ditunjukkan sebelumnya pada berbagai turunan terkait sinefungin.

Berdasarkan posisi sinefungin dalam struktur tersebut terlihat jelas bahwa reaksi ini berikatan dengan nsp16. Kedua situs pengikatan ini membentuk ngarai yang terdefinisi dengan baik dalam struktur nsp16 seperti yang terlihat pada gambar 3. Situs pengikatan untuk sinefungin harus bersentuhan langsung dengan gugus 2-hidroksil pada

nukleotida pertama setelah gugus GTP termetilasi. Secara khusus, fungsionalitas amino kiral di C6 ‘dari sinefungin harus diarahkan ke tempat pengikatan cap RNA. Oleh karena itu, modifikasi pada bagian molekul ini, berdasarkan desain struktur, telah mengarah pada desain inhibitor yang sangat aktif dari berbagai MTase seperti yang ditunjukkan sebelumnya pada berbagai turunan terkait sinefungin.

Penyelarasan struktur 3D dari SARS CoV dengan SARS CoV 2 secara insilico dilakukan dengan mengurutan sususnan asam amino primer NSP16 dari SARS CoV NP_828873.2) dan SARS CoV2 (YP_009725311.1) dengan identitas urutannya sebesar 93,3% dan kesamaan urutan sebesar 99,0% (Yoshimoto, 2020).

Gambar 3. Model situs pengenalan RNA oleh kompleks nsp10-nsp16 (kiri); Penyelarasan struktur situs aktif MTase dari SARS-CoV-2 dengan SARS-CoV (kanan) 46

Biocatalyst | December 2020

Gambar 4. Pensejajaran urutan asam amino primer NSP16 SARS CoV dan SARS-CoV-2

Selanjutnya, para peneliti mencoba untuk menentukan apakah penghambat SARS-CoV-2 MTase berpotensi aktif melawan virus lain. Mereka melakukan penyelarasan struktural dari SARS-CoV-2 MTase dengan SARS-CoV MTase Perbandingan struktural yang mengungkapkan daerah konservasi yang tinggi dari situs aktif MTase antara SARS-CoV dan SARSCoV-2. Penemuan ini dapat memberi gambaran bahwa pengembangan MTase inhibitor yang aktif terhadap MTase seharusnya dapat dilakukan, namun, pengembangan MTase inhibitor terhadap coronaviridae sedikit tidak mungkin kecuali, jika menjadi inhibitor menjanjikan yang mana memiliki kemiripan dengan substratnya seperti

Sinefungin . Namun, dua pasangan residu tersebut dipertahankan baik itu pada SARS CoV dan SARS CoV 2 yakni Asp114, Asn 101, Asp 99, Asn 43 dan Asp 130 yang membuat ikatan hidrogen dengan basa adenin pada sisi 2’-O RNA yang penting dalam pengenalannya dan menjadi pusat (situs) reaksi metilasi serta penting untuk katalisis. Hal tersebut menunjukkan bahwa ada rongga lipofilik yang signifikan di dekat nukleobase adenin dari sinefungin di SARSCoV dan SARS CoV 2 MTase.

Dalam pada studi lain, Mtase flavivirus telah dibuktikan bahwa bagian dari enzim tersebut dapat ditargetkan secara efektif oleh penghambat MTase tanpa mempengaruhi protein sel host.

Oleh karena itu, para peneliti yakin bahwa bagian dari protein nsp16 ini dapat memainkan peran yang sangat penting dalam desain terapi obat inhibitor COVID-19 pada masa mendatang. Meskipun jalan yang harus ditempuh masih panjang, melalui pengujian praklinis dan klinis terhadap inhibitor sebelum dapat diperkenalkan ke dalam praktik klinis, para peneliti yakin penelitian ini memberikan landasan yang kokoh dalam usaha pencarian molekul obat.

Dalam penelitian lainnya yakni Benoni et al. (2020) yang menguji seberapa efektif Sinefugin dalam menghambat pembentukan cap m7Gp3A pada mRNA secara in vitro.

Gambar 5. IC50 Sinefungin terhadap penghambatan 2’O – Methytransferase (NSP 16) Benoni et al.

(2020)

Biocatalyst | December 2020

47

Metode yang digunakan untuk skrining inhibitor RNA MTase didasarkan pada label radioaktif.

Di sini, para peneliti mengambil pendekatan alternatif dan mengembangkan metode berbasis LC-MS untuk menilai nilai IC50 dari penghambatan MTase nsp10-nsp16.

Metode tersebut bersifat umum dan dapat diterapkan pada RNA MTase dan RNA apa pun dengan urutan apa pun. Para peneliti menyiapkan cap m7Gp3A-RNA sebagai substrat dan dengan nsp10-nsp16 MTase serta adanya SAM dan berbagai konsentrasi inhibitor yang seluruhnya dilakukan secara in vitro. Sebagai model inhibitor, mereka memilih pan-MTase inhibitor yakni Sinefungin. Mereka mengoptimalkan kondisi reaksi MTase untuk mencapai setengah konversi dari RNA awal yang dibatasi. LC-MS dilakukan dalam mode positif untuk memastikan sensitivitas pengukuran yang lebih tinggi. Dengan menggunakan metode ini, dapat menentukan nilai IC50 dari Sinefungin sebagai 286 ± 66 nM yang terli-

hat pada gambar 5.

Nilai ini sesuai dengan nilai yang dipublikasikan sebelumnya (736 ± 71 nM) untuk SARSCoV nsp10-nsp16 MTase yang diperoleh dengan uji pengikatan filter. Kurva penghambatan Sinefungin. M7Gp3A-RNA yang ditutup diberi perlakuan dengan nsp10-nsp16 dan SAM pada berbagai konsentrasi Sinefungin. Setelah reaksi, RNA dipotong oleh nuklease P1, dianalisis dan cap dimetilasi (m7Gp3Am) diukur dengan LC-MS. Pengukuran dilakukan dengan rangkap tiga. Pendekatan berbasis LC-MS dan analisis mendalam menunjukkan bahwa SARS-CoV-2 nsp16 memiliki kekhususan substrat yang lebih luas daripada yang diyakini sebelumnya. Terutama kemampuan nsp16 untuk menggunakan Gp3A yang tidak termetilasi yang menunjukan memiliki implikasi penting bagi siklus hidup virus, dikarenakan ini mengungkapkan bahwa nsp16 pada prinsipnya dapat bertindak sebelum nsp14 N7 MTase dalam mementuk cap

0 pada sisi N7 ujung 5’ mRNA yang baru terbentuk.

Stimulasi aktivitas nsp16 2’-O-MTase oleh nsp10 adalah mekanisme umum untuk virus korona, dan nsp10 secara fungsional sangat penting dalam aktivasi dan stimulasi nsp16 Selain itu, senyawa spesifik dapat dikembangkan dengan menargetkan pada sisi aktif pengikatan RNA pada nsp16 (2’-O-Mtase), seperti yang ditunjukkan oleh hasil simulasi bahwa Sinefugin berpotensi menekan aktivitas 2’O-Mtase dalam membentuk cap 1 pada RNA yang baru terbentuk.

Oleh karena itu, berbagai pendekatan tersebut memberikan potensi dan bukti prinsip bahwa senyawa seperti Sinefugin yang menargetkan 2’-O-MTase secara spesifik dapat menekan replikasi virus corona, menunjukkan bahwa 2’-O-MTase dari virus corona adalah target obat antivirus yang potensial.

Referensi : Banerjee, A. K., Blanco, M. R., Bruce, E. A., Honson, D. D., Chen, L. M., Chow, A., ... & Thai, J. (2020). SARS-CoV-2 disrupts splicing, translation, and protein trafficking to suppress host defenses. Cell.

Min, Y. Q., Mo, Q., Wang, J., Deng, F., Wang, H., & Ning, Y. J. (2020). SARS-CoV-2 nsp1: bioinformatics, potential structural and functional features, and implications for drug/vaccine designs. Frontiers in Microbiology, 11, 2393.

Schubert, K., Karousis, E. D., Jomaa, A., Scaiola, A., Echeverria, B., Gurzeler, L. A., ... & Ban, N. 2020. SARS-CoV-2 Nsp1 binds the ribosomal mRNA channel to inhibit translation. Nature structural & molecular biology, 27(10), 959-966.

Semper, C., Watanabe, N., & Savchenko, A. (2020). Structural characterization of Nonstructural protein 1 from SARS-CoV-2. bioRxiv.

Thoms, M., Buschauer, R., Ameismeier, M., Koepke, L., Denk, T., Hirschenberger, M., ... & Stuerzel, C. M. (2020). Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science, 369, 1249-1255.

48

Biocatalyst | December 2020

PROTEIN

NSP1

Ira Rhabbiyatun Syani

Struktur Nsp1

Gambar 1. Struktur dasar nsp1 (Semper et.al, 2020)

Nsp1 memiliki struktur yang terdiri dari 180 aÂŹsam amino dengan rumus molekul C872H1383N247O270S4 Memiliki berat molekul ~19.8 kDA. Nsp1 memiliki kesaman 84% dengan nsp1 SARS-COV dari sifat dan fungsi biologis yang serupa namun jika dibandingkan dengan protein nsp lain kesamaan ini masih tergolong rendah (Min et.al., 2020). Protein nsp1 memiliki struktur yang terdiri dari alfa helix, beta sheet yang dapat membentuk loop dan juga beta barel (Gambar 1).

Gambar 11.1. Struktur dasar nsp1 (Semper et.al, 2020).

Wilayah terminal-N memiliki struktur yang lebih kaku yang terdiri dari ι-heliks dan dua domain antiparalel β-sheet dan dianggap memiliki aktivitas pengikatan terhadap mRNA karena muatan positif pada permukaan yang teramati. Sedangkan, Terminal-C terdiri dari dua heliks-pendek yang terhubung dengan loop inter domain yang terdiri dari 28 asam amino, membuat wilayah ini sangat dinamis, dan berperan untuk berikatan dengan ribosom. Keseluruhan domain Nsp1 tersusun dalam membentuk alur kecil atau struktur mirip kantong yang meliputi dua β-sheet antiparalel yang dapat menampung molekul besar (Vankandari et.al., 2010).

NSP1 merupakan non struktural protein sering Biocatalyst | December 2020

disebut leader protein karena merupakan protein yang pertama produksi oleh bagian N-Terminal genom virus pada ORF1ab. Nsp1diketahui memiliki residu Lys 164 dan His 165 pada bagian termial C dimana keduanya berperan penting dalam melakukan interaksi iaktan dengan 40s Ribosom, hal ini terbukti dari berbagai penelitian yang telah dilakukan, jika kedua residu asam amio tersebut dimutasi maka akan kehilangan afinitasnya untuk berikatan dengan ribosom (Thoms et.al., 2020 ; Schubert et.al., 2020 ).

Kompleks interaksi ikatan Nsp1 dan ribosom 40s Mekanisme kerja nsp1 dalam menekan proses translasi mRNA inang yaitu dengan cara menyabotase ribosom sel inang yang dilakukan oleh bagian C-terminal nsp1. Hasil penelitian menunjukan bahwa ketika dilakukan percobaan ekspresi tanpa adanya bagian N terminal tidak terlalu berdampak besar terhadap pembajakan ribosom. Namun, jika yang dihilangkan bagian C terminal maka pembajakan terhadap ribosom tidak berjalan. Selain itu, diketahui nsp1 hanya berinteraksi membentuk ikatan dengan subunit 40s dan 80s ribosom sedangkan pada 60s itu terjadi interaksi ikatan yang menyebabkan sebagian besar pembajakan oleh nsp1 terjadi saat pra inisiasi translasi mRNA (Schubert et.al., 2020 ).

49

Gambar 2. Struktur Cryo-EM interaksi ikatan antara nsp1 dengan ribosom 40s ribosom (Thoms et.al., 2020).

Kompleks interaksi ikatan Nsp1 dan ribosom 40s Mekanisme kerja nsp1 dalam menekan proses translasi mRNA inang yaitu dengan cara menyabotase ribosom sel inang yang dilakukan oleh bagian C-terminal nsp1. Hasil penelitian menunjukan bahwa ketika dilakukan percobaan ekspresi tanpa adanya bagian N terminal tidak terlalu berdampak besar terhadap pembajakan ribosom. Namun, jika yang dihilangkan bagian C terminal maka pembajakan terhadap ribosom tidak berjalan. Selain itu, diketahui nsp1 hanya berinteraksi membentuk ikatan dengan subunit 40s dan 80s ribosom sedangkan pada 60s itu terjadi interaksi ikatan yang menyebabkan sebagian besar pembajakan oleh nsp1 terjadi saat pra inisiasi translasi mRNA (Schubert et.al., 2020 ).

Semua kompleks ribosom yang diamati menampilkan mode pengikatan yang sama dari nsp1 ke subunit 40S, di mana domain C-terminal dari nsp1 (nsp1-C) yang terikat secara kaku di dalam saluran masuk mRNA. Nsp1 berinteraksi dengan rRNA helix h18, dengan protein uS5 dari bagian ribosom 40S serta protein uS3 dari bagian kepala ribosom 40S (Gambar 2) yang mana semua ikatan tersebut dilakukan oleh alfa helix.

Kedua heliks menstabilkan satu sama lain melalui interaksi hidrofobik. Potensial elektrostatis pada permukaan nsp1-C menampilkan tiga patch utama yaitu, patch bermuatan negatif pada α1 yang menghadap residu bermuatan positif pada uS3; patch bermuatan positif pada α2 menghadap ke bagian tulang punggung fosfat dari h18; dan tambalan hidrofobik pada antarmuka α1- α2 yang terkena residu hidrofobik pada uS5 (Thoms et.al., 2020).

50

Mekanisme kerja Nsp1 mRNA memiliki struktur cap berupa 5’7-methylguanosine (m7G) yang penting untuk proses penetrasi mRNA pada 43S preinitiation complex (PIC) yang berinteraksi melalui faktor inisiasi translasi eIF4F. Dimana 43S PIC terbentuk dari 40S subunit ribosom, ternary complex IF2-GTP-Met-tRNAiMet, dan multi-subunit faktor inisiasi IF3.

Kompleks tersebut yang akan melakukan pra inisiasi mRNA sebelum masuk kepada proses translasi (Yuan et.al., 2020). Ini merupakan dasar dimana nsp1 dapat menghambat proses translasi pada mRNA inang (Gambar 11.3).

Ada dua mekanisme Nsp1 dalam membajak proses translasi sel inang, pertama berikatan langsung dengan kompleks ribosom 40s. Kedua, melakukan pemotongan endonukleolitik pada bagian 5′UTR pada mRNA inang, akan tetapi tidak terjadi pemotongan pada bagian 5′UTR mRNA virus karena nsp1 memiliki interaksi struktural yang unik dengan viral mRNA yaitu dengan cara mengikat bagian stem loop (SL) pada bagian UTR (Untranslated region) genom mRNA virus membentuk membentuk komplek SL1/nsp1.

Gambar 3. Mekanisme pembajakan ribosom oleh nsp1 (Banerjee et,al., 2020) Biocatalyst | December 2020

Hal tersebut yang membuat mRNA inang tidak kompeten untuk ditranslasikan, akan tetapi mRNA inang masih dapat ditranslasikan oleh bagian ribosom yang masih kosong tanpa nsp1 namun peluangnya menjadi rendah (Vankandari et.al., 2010).

Bisa dikatakan nsp1 merupakan protein yang memiliki patogenitas tinggi terhadap sel di paru-paru, dilihat dari hasil transkriptom mRNA inang setelah dilakukan percobaan dengan nsp1 hasilnya menunjukan banyak mRNA yang berubah (Yuan et.al., 2020).

Di sisi lain, Nsp1 juga diketahui memainkan peran kunci dalam menghambat produksi komponen pertahanan tubuh seperti interferon tipe-I, interferon-gamma, dan interleukin, yang merupakan molekul pensinyalan utama yang disekresikan oleh sel yang terinfeksi yang mengingatkan sel lain ketika adanya virus masuk. Oleh karena itu, nsp1 memainkan peran penting dalam fungsi mekanisme pertahanan antivirus seluler inang (mengatur respons interferon) dan mengubah sistem imun bawaan yang menguntungkan replikasi virus dan immune evasion, dimana hal ini berpotensi dapat dijadikan sebagai target pengobatan.

Seperti penjelasan sebelumnya, nsp1 dapat berikatan dengan SLI RNA pada daerah UTR genom virus membentuk kompleks yang stabil yang disebut komplek SL1/nsp1 sehingga meningkatkan proses translasi genom virus. Hal tersebut dapat dijadikan sebagai target pengobatan dengan menggantikan Sl1 mRNA dengan senyawa analog tertentu. Beberapa obat yang diketahui dapat berikatan dengan Nsp1 dan menghambat interaksi fisik antara Nsp1 dan mRNA virus diantaranya glycyrrhizic acid, lobaric acid, garcinolic acid, dan tirilazad (Vankandari et.al., 2010).

Gambar 4. Dampak dari pembajakan ribosom oleh nsp1 (Yuan et.al., 2020) Min, Y. Q., Mo, Q., Wang, J., Deng, F., Wang, H., & Ning, Y. J. (2020).

SARS-CoV-2 nsp1: bioinformatics, potential structural and functional features, and implications for drug/vaccine designs. Frontiers in Microbiology, 11, 2393.

Schubert, K., Karousis, E. D., Jomaa, A., Scaiola, A., Echeverria, B., Gurzeler, L. A., ... & Ban, N. 2020. SARS-CoV-2 Nsp1 binds the ribosomal mRNA channel to inhibit translation. Nature structural & molecular biology, 27(10), 959-966.

Semper, C., Watanabe, N., & Savchenko, A. (2020). Structural characterization of Nonstructural protein 1 from SARS-CoV-2. bioRxiv.

Thoms, M., Buschauer, R., Ameismeier, M., Koepke, L., Denk, T., Hirschenberger, M., ... & Stuerzel, C. M. (2020). Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science, 369, 1249-1255.

Vankadari, N., Jeyasankar, N. N., & Lopes, W. J. (2020). Structure of the SARS-CoV-2 Nsp1/5â&#x20AC;˛-Untranslated Region Complex and Implications for Potential Therapeutic Targets, a Vaccine, and Virulence.

The journal of physical chemistry letters, 11, 9659-9668 Yuan, S., Peng, L., Park, J. J., Hu, Y., Devarkar, S. C., Dong, M. B., ... & Xiong, Y. (2020). Nonstructural protein 1 of SARS-CoV-2 is a potent pathogenicity factor redirecting host protein synthesis machinery toward viral RNA. Molecular cell.

Referensi : Banerjee, A. K., Blanco, M. R., Bruce, E. A., Honson, D. D., Chen, L. M., Chow, A., ... & Thai, J. (2020). SARS-CoV-2 disrupts splicing, translation, and protein trafficking to suppress host defenses. Cell.

Gambar 5. Komplek SL1/nsp1 yang berpotesi sebagai target inhibisi obat (Vankandari et.al., 2010).

Biocatalyst | December 2020

51

PROTEIN

NSP3

Nisrina Pratsaniyati Sari

Gambar 1. Struktur 3D Protein PLpro

Nsp3 merupakan salah satu protein non struktural terbesar pada keluarga betacoronavirus dengan ukuran hampir mencapai 200 kD serta terdiri atas 1945 asam amino. Protein yang merupakan komponen kunci dari replikasi SARS-CoV-2 ini terdiri atas 16 domain, yaitu Ubiquitin-like domain 1 (Ubl1), Hypervariable Region (HVR), Macrodomain (Mac) I, II, dan III, Domain Preceding Ubl2 dan PL2pro (DPUP), Ubiquitin-like domain 2 (Ubl2), Papain-like protease two domain (PL2pro), Nucleic-acid Binding domain (NAB), betacoronavirus Specific Marker domain (betaSM), Transmembrane domain 1 (TM1), nsp3 ectodomain (3ecto), Transmembrane domain 2 (TM2), Amphipathic Helix region (AH1), serta domain spesifik Nidovirales dan Coronaviridae (Y1 & CoV-Y). Domain-domain yang menyusun nsp3 SARS-CoV-2 juga dapat ditemui pada nsp3 SARS-CoV, namun terdapat beberapa perbedaan residu asam amino penyusun yang kemudian menyebabkan perbedaan karakteristik struktur diantara keduanya. Menurut Angeletti et al. (2020), perbedaan ini salah satunya terletak pada posisi residu nsp3 192 yaitu ditemukannya residu prolin pada SARS-CoV-2 dan isoleusin pada SARS-CoV. Karena adanya efek sterik serta kekakuan dari prolin, struktur SARS-CoV-2 mengalami perubahan konformasi dibandingkan struktur SARS-CoV. Selengkapnya, perbandingan residu asam amino penyusun multidomain nsp3 SARS-CoV-2 dengan nsp3 SARS-CoV ditunjukkan pada Gambar 12.1.

Pada Gambar 12.1., terlihat bahwa urutan domain-domain nsp3 sejajar mulai dari Ubl1 pada N-terminusnya hingga Y1 & CoV-Y pada C-terminusnya. Domain Ubiquitin-like 1 atau Ubl1 yang terletak pada N terminal dari nsp3 ini memiliki 52

struktur yang sangat serupa dengan Ubiquitin manusia atau ISG15, namun memiliki inti yang berbentuk lebih oval akibat dari keberadaan dua heliks tambahan, yaitu 310 heliks dan alfa heliks. Pada Gambar 12.2a. terlihat bahwa elemen domain Ubl1 secara berturut-turut terdiri atas β1-α1-β2-α2η1-α3-β3-β4. Menurut Qui dan Xu (2020), Macrodomain I (MacI) dari SARS-CoV-2 memiliki struktur lipatan sandwich 3 lapis α-β-α yang serupa dengan struktur macrodomain SARS-CoV, MERSCoV, dan coronavirus lain. Domain ini disebut dengan macrodomain karena kesamaannya dengan domain MacroH2A dari histon 2A manusia. MacI terdiri atas β sheet inti dengan urutan strand β1β2-β7-β6-β5-β4. Terdapat 6 heliks yang berlokasi di dua sisi β sheet ini yaitu α1, α2, α3 pada satu sisi dan α4, α5, α6 pada sisi lainnya. Untuk memenuhi salah satu fungsinya yaitu berikatan dengan ADP-ribosa, terdapat daerah aktif pengikatan dengan residu Asp21 dan Asn39 yang ditunjukkan dengan warna merah pada Gambar 12.2b. Macrodomain II (MacII) terletak pada c terminal dari Mac I, yang kemudian diikuti dengan Macrodomain III (MacIII). Baik MacII maupun MacIII juga menunjukkan struktur khas macrodomain yaitu lipatan α-β-α. Beta sheet sentral dari MacII dan Mac III memiliki urutan β1-β6-β5-β2-β4-β3 serta terdapat 2 atau 3 heliks pada setiap sisinya. Hanya β3 yang bersifat antiparalel terhadap strand lainnya. Pada MacIII, terdapat sisi bermuatan positif yang terdiri atas residu lsy563, lys565, lys568, dan Glu571 untuk berikatan dengan oligoG pada RNA. Daerah pengikatan ini berkaitan dengan fungsi MacIII yang erat dengan aktivitas replikasi virus.

Biocatalyst | December 2020

Gambar 2. Perbandingan sekuens nsp3 SARS-CoV-2 dengan nsp3 SARS-CoV (Qiu dan Xu, 2020)

Pada Gambar 12.1., terlihat bahwa urutan domain-domain nsp3 sejajar mulai dari Ubl1 pada N-terminusnya hingga Y1 & CoV-Y pada C-terminusnya. Domain Ubiquitin-like 1 atau Ubl1 yang terletak pada N terminal dari nsp3 ini memiliki struktur yang sangat serupa dengan Ubiquitin manusia atau ISG15, namun memiliki inti yang berbentuk lebih oval akibat dari keberadaan dua heliks tambahan, yaitu 310 heliks dan alfa heliks. Pada Gambar 12.2a. terlihat bahwa elemen domain Ubl1 secara berturut-turut terdiri atas β1-α1-β2-α2η1-α3-β3-β4. Menurut Qui dan Xu (2020), Macrodomain I (MacI) dari SARS-CoV-2 memiliki struktur lipatan sandwich 3 lapis α-β-α yang serupa dengan struktur macrodomain SARS-CoV, MERSCoV, dan coronavirus lain. Domain ini disebut dengan macrodomain karena kesamaannya dengan domain MacroH2A dari histon 2A manusia. MacI terdiri atas β sheet inti dengan urutan strand β1β2-β7-β6-β5-β4. Terdapat 6 heliks yang berlokasi Biocatalyst | December 2020

di dua sisi β sheet ini yaitu α1, α2, α3 pada satu sisi dan α4, α5, α6 pada sisi lainnya. Untuk memenuhi salah satu fungsinya yaitu berikatan dengan ADP-ribosa, terdapat daerah aktif pengikatan dengan residu Asp21 dan Asn39 yang ditunjukkan dengan warna merah pada Gambar 12.2b.

Macrodomain II (MacII) terletak pada c terminal dari Mac I, yang kemudian diikuti dengan Macrodomain III (MacIII). Baik MacII maupun MacIII juga menunjukkan struktur khas macrodomain yaitu lipatan α-β-α. Beta sheet sentral dari MacII dan Mac III memiliki urutan β1-β6-β5-β2-β4-β3 serta terdapat 2 atau 3 heliks pada setiap sisinya. Hanya β3 yang bersifat antiparalel terhadap strand lainnya. Pada MacIII, terdapat sisi bermuatan positif yang terdiri atas residu lsy563, lys565, lys568, dan Glu571 untuk berikatan dengan oligoG pada RNA. Daerah pengikatan ini berkaitan dengan fungsi MacIII yang erat dengan aktivitas replikasi virus.

53

Bersamaan dengan domain MacII dan MacIII, Domain Preceding Ubl2 and PL2pro (DPUP) akan membentuk kompleks SARS-unique domain (SUD). Struktur DPUP terdiri atas 2 α heliks yang masing-masing terletak pada ujung N dan C terminal sebuah β sheet antiparalel. Domain Papain-like protease 2 (PL2pro) sendiri terdiri atas subdomain thumb, palm, dan fingers. PLpro merupakan enzim yang sangat penting bagi kelompok coronavirus. Enzim ini dibutuhkan untuk memproses poliprotein virus sehingga menjadi enzim kompleks replikase yang fungsional sehingga virus mampu melakukan penyebaran.

Menurut Shin et al. (2020), PLpro SARS-CoV-2 memiliki preferensi substrat yang berbeda dengan PLpro SARS-CoV. PLpro SARS-CoV-2 secara khusus mereduksi keberadaan substrat protein terkonjugasi ISG15 (Interferon Stimulated Gene 15).

Hal ini dibuktikan oleh adanya reduksi terhadap protein ISGylated pada lisat sel HeLa yang diinkubasi dengan PLpro SARS-CoV-2, sementara pada sel yang diinkubasi dengan PLpro SARS-CoV terjadi reduksi pada protein ubiquinated. Selain itu, PLpro SARS-CoV-2 lebih efisien dalam memisahkan AMC dari ISG-15-AMC dibandingkan dari K48-Ub2-AMC. Hal ini dikarenakan PLpro SARSCoV-2 mengikat ISG15 dengan 20-fold afinitas yang lebih tinggi dibandingkan terhadap K48-Ub2.

Sehingga, PLpro SARS-CoV-2 secara khusus berperan dalam memotong ISG15 dari substrat. Dalam peran patofisiologinya, PLpro SARS-CoV-2 berasosiasi dengan PRKDC (Protein kinase, DNA-activated, catalytic polypeptide) dan HNRNPK (Heterogenous nuclear ribonucleo-protein K) yang berperan dalam RNA splicing inang, serta galektin1 yang dapat menginduksi fusi virus den-

Gambar 3 Struktur kompleks PLpro SARS-CoV-2 dan ISG15 (Shin et al., 2020) 54

gan sel target. Berdasarkan penelitian oleh

Gambar 4. Peran PLpro nsp3 dalam siklus hidup SARSCoV-2 (Shin et al., 2020)

Shin et al. (2020), ekspresi PLpro SARS-CoV-2 di sel mamalia mampu menurunkan ISGylation dari protein sel setelah stimulasi IFNα (protein interferon yang meregulasi aktivitas sistem imun bawaan melawan infeksi virus), termasuk ISGylation dari IRF3 (Interferon Regulatory Factor 3) yang merupakan komponen kritis dari jalur interferon tipe 1.

Selain itu, terjadi pula penurunan fosforilasi dari TBK1 (TANK-binding kinase 1, protein kinase serin/treonin) dan IRF3 serta translokasi nuklear dari IRF3. Karena peran fosforilasi TBK1 dalam mengaktivasi jalur NF-κB (Nuclear factor kappa light chain enhancer of activated B cells: kelompok faktor transkripsi yang berperan dalam meregulasi berbagai aktivitas sel penting seperti respon inflamasi, pertumbuhan sel, dan apoptosis), ekspresi PLpro SARS-CoV-2 dapat menyebabkan gangguan dalam pensinyalan inflamasi inang. Selain itu, ekspresi PLpro SARS-CoV-2 juga secara efektif dapat menurunkan aktivasi promoter IFNB1 (berperan dalam pengkodean sitokin sebagai bagian dari respon imun bawaan terhadap patogen).

NAB atau Nucleic-acid Binding Domain memiliki struktur yang terdiri atas dua β sheet antiparalel yaitu β1 dengan β6 dan β2 dengan β8, serta satu β sheet paralel yang terdiri atas β3, β4, β5, dan β7.

Selain itu NAB juga memiliki dua α heliks (α1 & α2) dan dua 310 heliks (η1 & η2). Keseluruhan elemen ini memiliki urutan β1-β2-β3-α1-β4-β5-η1-η2β6-β7-α2-β8. Empat strand β yaitu β3- β4- β5β7 serta dua heliks yaitu α1 dan α2 membentuk struktur setengah barrel. Seperti namanya, domain Nucleic-acid Binding ini dapat berikatan dengan RNA melalui daerah bermuatan positif yang terdiri atas residu asam amino lys75, lys76, lys99, dan Arg106 (Qiu dan Xu, 2020). Karena perannya yang sangat penting dalam siklus hidup SARSCoV-2, keberadaan inhibitor terhadap nsp3 dapat membuka peluang akan pengembangan Biocatalyst | December 2020

opsi pengobatan baru. Pengobatan dengan memanfaatkan inhibitor terhadap domain PLpro dari nsp3 SARS-CoV-2. NAB atau Nucleic-acid Binding Domain memiliki struktur yang terdiri atas dua β sheet antiparalel yaitu β1 dengan β6 dan β2 dengan β8, serta satu β sheet paralel yang terdiri atas β3, β4, β5, dan β7. Selain itu NAB juga memiliki dua α heliks (α1 & α2) dan dua 310 heliks (η1 & η2). Keseluruhan elemen ini memiliki urutan β1-β2-β3-α1-β4-β5-η1-η2-β6-β7-α2-β8. Empat strand β yaitu β3- β4- β5- β7 serta dua heliks yaitu α1 dan α2 membentuk struktur setengah barrel.

Seperti namanya, domain Nucleic-acid Binding ini dapat berikatan dengan RNA melalui daerah bermuatan positif yang terdiri atas residu asam amino lys75, lys76, lys99, dan Arg106 (Qiu dan Xu, 2020). Karena perannya yang sangat penting dalam siklus hidup SARS-CoV-2, keberadaan inhibitor terhadap nsp3 dapat membuka peluang akan pengembangan opsi pengobatan baru. Pengobatan dengan memanfaatkan inhibitor terhadap domain PLpro dari nsp3 SARS-CoV-2 dapat menjadi solusi karena selain dapat menghambat penyebaran virus, aplikasinya juga dapat meningkatkan imunitas inang terhadap virus. Salah satu inhibitor nsp3 SARS-CoV-2 yang berpotensi dikembangkan adalah GRL-0617. GRL-0617 merupakan inhibitor non-kovalen terhadap SARS-CoV. Berdasarkan penelitian Shin et al. (2020), GRL0617 dapat berikatan dengan tirosin268 dari PLpro SARS-CoV-2 sehingga menghambat masuknya C terminus ISG15 ke daerah katalitik protease. Keberhasilan inhibisi ini sangat dipengaruhi oleh keberadaan residu tirosin268. Hal ini dibuktikan oleh adanya penurunan efek inihibisi GRL-0617 terhadap PLpro virus MERS yang mengalami mutasi tirosin268 menjadi treonin. Mode aksi dari inhibisi GRL-0617 terhadap aktivitas katalitik PLpro nsp3 SARS-CoV-2 ditunjukkan pada Gambar 5.

Pada kondisi normal, sisi c terminus dari ISG15 akan berikatan dengan sisi katalitik dari PLpro. Namun, dengan berikatannya GRL-0617 pada tirosin atau Y268 maka jalur masuknya menjadi tertutup. Berdasarkan pengujian potensi terapeutik dari GRL-0617 terhadap SARS-CoV-2 yang dilakukan oleh Shin et al. (2020), GRL-0617 secara efektif mampu menghambat aktivitas PLpro SARSCoV-2 sehingga menyebabkan peningkatan jumlah protein ISGylated dari lisat yang telah diberi perlakuan dengan IFNα. Inhibisi PLpro SARSCoV-2 oleh GRL-0617 menunjukkan terjadinya reduksi replikasi virus aktif yang diindikasikan dengan terhambatnya produksi RNA virus intraseluler, sehingga terjadi pula penurunan jumlah partikel virus yang dikeluarkan dari sel terinfeksi. Selain itu, inhibisi dengan GRL-0617 menyebabkan adanya peningkatan ISGylation IRF3 yang meregulasi respon imun antiviral inang. Terjadi pula peningkatan fosforilasi IRF3 dan TBK1 yang merupakan marka dari aktivasi jalur IFN serta fosforilasi p65 yang mengindikasikan aktivasi jalur NF-κB. Keberadaan inhibitor ini juga menginduksi kembali ekspresi gen-gen yang responsif terhadap IFN pada inang seperti ISG15, OAS1, PKR, dan MX1.

Sehingga, selain menghambat sintesis RNA virus, inhibisi PLpro SARS-CoV-2 juga meningkatkan pensinyalan antiviral via TBK1 dan IRF3.

Referensi Angeletti, S., Benvenuto, D., Blanchi, M., Giovanetti, M., Pascarella, S., & Ciccozzi, M. (2020). COVID-2019: The role of the nsp2 and nsp3 in its pathogenesis. Journal of Medical Virology, 1-5.

Frick, D. N., Virdi, R. S., Vuksanovic, N., Dahal, N., & Silvaggi, N. R. (2020). Molecular basis for ADP-Ribose binding to the Mac1 domain of SARS-CoV-2 nsp3. Biochemistry, 59, 2608-2615.

Lei, J., Kusov, Y., & Higenfeld, R. (2018). Nsp3 of coronaviruses: Structures and functions of a large multi-domain protein. Antiviral Research, 149(2018), 58-74.

Qiu, Y., & Xu, K. (2020). Functional studies of the coronavirus nonstructural proteins. STEMedicine, 1(2), 1-17.

Shin, D., Mukherjee, R, Grewe, D., Bojkova, D., Baek, K., Bhattacharya, A., Schulz, L., Widera, M., Mehdipour, A. R., Tascher, G., Geurink, P. P., Wilhelm, A., Noort, G. J. V. D. H. V., Ovaa, H., Muller, S., Knobeloch, K. P., Rajalingam, K., Schulman, B. A., Cinatl, J., Hummer, G., Ciesek, S., & Dikic, I. (2020). Papain-like protease regulates SARS-CoV-2 viral spread and innate immunity. Nature: 1-6.

Stogios, P. J., Skarina, T., Chang, C., Kim, Y., Di Leo, R., Savchenko, A., Joachimiak, A., Satchell, K. J. F., Center for Structural Genomics of Infectious Diseases (CSGID) (2020) Crystal structure of the ubiquitin-like domain 1 (Ubl1) of Nsp3 from SARS-CoV-2 doi: http://doi.

Gambar 5. Struktur daerah katalitik PLpro nsp3 SARS-CoV-2 tanpa (kiri) dan dengan (kanan) inhibisi GRL-0617 Biocatalyst | December 2020

org/10.2210/pdb7KAG/pdb.

55

PROTEIN

NSP5: MPro

Nisrina Fitri Nurjannah Dalam proses sintesis protein nonstrukturalnya, SARS-CoV-2 sendiri diketahui mentranskripsi dan mentranslasikan daerah orf1a dan orf1ab menjadi poliprotein panjang terlebih dahulu sebelum menjadi nsp- nsp yang fungsional. Untuk mendapatkan nsp yang fungsional, harus dilakukan terlebih dahulu pemotongan terhadap poliprotein tersebut. Nsp5, atau sering juga disebut main protease (Mpro) atau chymotrypsin-like protease (3CL-like) adalah salah satu protein nonstruktural dari SARS-COV-2 yang memiliki peranan penting dalam pemroresan poliprotein tersebut. Nsp5 adalah protease utama dari SARS-Cov-2 yang memiliki fungsi untuk melakukan pemotongan poliprotein tersebut dimulai dari pemotongan autolisis terhadap dirinya sendiri. Selanjutnya, nsp5 akan melakukan pemotongan pada 11 situs yang berbeda untuk menghasilkan 12 nonstruktural protein, yaitu dari nsp4 hingga nsp16. (Jeong et al, 2020).

Nsp5 terdiri atas 306 residu asam amino. Secara struktural, Nsp5 terdiri dari tiga domain. Domain I terdiri dari residu 8-101, domain II terdiri dari residu 102-184, dan domain III terdiri dari residu 201303. (Mirza, 2020) Domain I dan domain II tersusun atas struktur beta barrel antiparallel. Pada celah antara domain I dan domain II ini terdapat substrate-binding pocket dan catalytic domain dari nsp5. Catalytic domain pada nsp5 sendiri merupakan sebuah catalytic dyad. Domain I dan domain II masing- masing menyumbang satu residu terhadap dyad katalitik ini, Domain I menyumbang residu His41 dan domain II menyumbang residu Cys145. Katalitik dyad ini akan dijelaskan lebih lanjut kemudian. Selanjutnya, domain III terdiri atas lima buah alfa heliks yang tersusun membentuk klaster globular. Domain ini tidak berperan dalam aktivitas katalitik namun berperan dalam dimerisasi nsp5 dengan subunit nsp5 lainnya agar nsp5 menjadi aktif. Domain I dan domain II dari nsp 5 memiliki jarak yang lebih dekat sementara domain II terhubung dengan domain III melalui sebuah loop panjang (residu 185-200). (Jin et al, 2020).

Seperti yang telah disinggung di atas, nsp5 akan membentuk dimer dengan protomer nsp5 lainnya.

Dimer ini terbentuk dari interaksi antara domain III pada kedua protomer. Dimer yang tebentuk akan 56

memiliki simetri crystallographic two-fold axis yang berarti dimer yang terbentuk akan memiliki struktur yang sama saat diputar 180o. Setelah menjadi dimer, barulah nsp5 dapat menjadi protein fungsional. Meskipun begitu, masing- masing protomer tetap bekerja secara individual dan tidak terpengaruh oleh protomer lainnya. Proses dimerasi ini terjadi hanya untuk menstabilkan struktur nsp5. (Jin et al, 2020).

Selanjutnya, salah satu bagian paling penting dari struktur nsp5 adalah substrate-binding pocket.

Substrate-binding pocket nsp5 ini membentuk suatu relung yang diapit oleh residu dari domain I dan domain II. Substrate-binding pocket ini memiliki tujuh subsitus pengikatan yang terdiri dari P1P5, P1â&#x20AC;&#x2122;, dan P2â&#x20AC;&#x2122;. Selanjutnya, dyad katalitik akan berada di antara P1 dan P1â&#x20AC;&#x2122; untuk memutus substrat pada posisi S1 dan S1â&#x20AC;&#x2122;. Dyad katalitik pada nsp5 ini tergolong cukup unik. Hal ini dikarenakan, nsp5 digolongkan sebagai protein dari keluarga chymotrypsin-like protease. Ciri khas dari tripsin protease adalah adanya triad katalitik yang tersusun atas histidin, aspartat, dan serin. Namun, nsp5 memiliki dyad katalitik yang terdiri atas histidin dan sistein. Terdapat hipotesis bahwa pada dyad katalitik nsp5, terdapat molekul air yang berperan dalam pemotongan enzim sehingga membentuk pseudo-triad. Dyad katalitik nsp5 sendiri strukturnya distabilkan oleh residu- residu lainnya pada substrate-binding pocket. His41 akan membentuk ikatan C-H dengan His164. Selanjtunya, His164 akan distabilkan melalui ikatan hidrogen dengan molekul air yang terhubung dengan residu lainnya untuk semakin memperkuat struktur dyad

Gambar 1. Struktur nsp5 SARS-CoV-2 Biocatalyst | December 2020

Gambar 2. Struktur 3D dimer nsp5

Dalam melakukan pemotongan pada poliprotein, nsp5 akan mengenali sekuens asam amino spesifik pada polipeptida. Sekuens tersebut adalah leusin, glutamin, serin, alanin, glisin, dengan asam amino glutamin pada subsitusi P1 merupakan asam amino yang wajib ada pada polipeptida yang akan dipotong. Sekuens lainnya umumnya lebih fleksibel dan dapat digantikan dengan residu lain. (Jin et al, 2020) Nsp5 sendiri akan memotong polipeptida pada ikatan peptida antara glutamin dan serin. Kemudian, seperti yang telah disebutkan sebelumnya, nsp5 memiliki tujuh subsitus pengikatan substat yang akan diisi oleh residu dari polipeptida target sesuai dengan sekuens pengenalan yang telah disebutkan sebelumnya. Masing- maasing residu tersebut akan berinteraksi dengan beberapa residu pada nsp5 membentuk enzyme-substrate complex sebelum dapat terjadi pemotongan. (Ramos-Guzman et al, 2020).

Seperti yang dapat dilihat di bawah (gambar 5), residu substrat pada P1 membentuk banyak ikatan hidrogen yang cukup kuat dengan residu di sekitarnya seperti Glu166, Phe140, Asn142, ter-

masuk Cys145 yang merupakan bagian dari dyad katalitik. Banyaknya ikatan hidrogen yang terjadi disebabkan residu glutamin merupakan residu pengenalan utama dari polipeptida. Kemudian, residu substrat pada P1â&#x20AC;&#x2122; dan P2 teramati memiliki ikatan hidrogen dengan His41 yang merupakan dyad katalitik dari nsp5. Pada P2â&#x20AC;&#x2122; dan P3 juga teramati adanya ikatan hidrogen yang paling kuat yang terjadi diantara enzim dan protein. Ikatanikatan ini akan menstabilkan interaksi antara enzim dan substrat. Pose pengikatan substrat dengan enzim sendiri dapat dilihat di bawah (gambar 6). (Ramos-Guzman et al, 2020).

Dalam melakukan pemotongan pada polipeptida, nsp5 memiliki sebuah mekanisme. Mekanisme ini terdiri dari dua tahapan mendasar, yaitu asilasi dan deasilasi. Pada tahap asilasi, terjadi pemotongan ikatan peptida, sementara pada tahap deasilasi, terjadinya pemulihan sisi aktif dari nsp5 agar siap mengikat substrat polipeptida berikutnya. Proses asilasi sendiri dimulai dengan pembentukan Michaelis complex, atau substrate-enzyme complex, dengan bentuk seperti yang telah dijelaskan sebelumnya. Kemudian, terjadi pemutusan ikatan peptide melalui serangan nukleofilik oleh dyad katalitik dari nsp5. Seperti yang telah disebutkan sebelumnya, pemutusan terjadi pada ikatan peptide antara P1 dan P1â&#x20AC;&#x2122;. Setelah terjadi pemotongan, fragmen P1â&#x20AC;&#x2122; akan dikeluarkan dari kompleks enzim-substrat. Namun, karbon pada residu dari fragmen P1 justru akan membentuk ikatan kovalen dengan residu Cys145 dari enzim.

Kompleks antara fragmen substrat dengan enzim ini disebut dengan kompleks acyl-enzyme.

Gambar 3. Substrate-binding pocket nsp5 Biocatalyst | December 2020

57

Gambar 4. Dyad katalitik nsp5

Setelah terjadi pembentukan acyl-enzyme, maka, tahapan asilasi selesai dan pemotongan akan memasuki tahap berikutnya yaitu tahap deasilasi. Pada tahap deasilasi, terjadi hidrolisis acyl-enzyme. Akibatnya, fragmen P akan terlepas dan kedua residu katalitik menjadi bebas kembali.

Nsp5 akan menjadi apoenzim yang siap menerima substrat untuk siklus katalitik berikutnya. (Ramos-Guzman et al, 2020).

Nsp5 pada SARS-CoV-2 memiliki kemiripan dengan nsp5 pada SARS-CoV. Hasil alignment dari sekuens asam amino kedua nsp5 ini menunjukkan adanya sequence identity sebesat 96%. Mutasi asam amino yang ada sendiri bukan merupakan asam amino yang memegang peranan penting pada aktivitas katalitik nsp5. (Yoshino, 2020) Selanjutnya, superposisi struktur kristal nsp5 SARSCoV-2 dengan nsp5 SARS-CoV dan 11 main protease pada coronavirus lain menunjukkan bahwa domain I, domain II, dan terutama substrate binding pocket sangat terkonservasi. Variasi pada struktur main protease berbagai coronavirus ini umumnya terjadi pada domain III. Tingkat konservasi yang tinggi ini menimbulkan hipotesis bahwa pengembangan satu antivirus dengan target nsp5 atau main protease dapat menjadi pertahanan garis pertama yang efektif terhadap berbagai penyakit yang disebabkan oleh coronavirus. (Yang et al, 2005; Jin et al,2020).

Salah satu bagian paling penting dari struktur nsp5 adalah substrate-binding pocket. Bagian ini membentuk suatu relung yang diapit oleh residu dari domain I dan domain II. Substrate-binding pocket ini memiliki tujuh sub situs pengikatan yang terdiri dari P1-P5, P1â&#x20AC;&#x2122;, dan P2â&#x20AC;&#x2122;. Selanjutnya, dyad katalitik akan berada di antara P1 dan P1â&#x20AC;&#x2122; untuk memutus substrat pada posisi S1 dan S1â&#x20AC;&#x2122;.

Dyad katalitik pada nsp5 tergolong cukup unik karena nsp5 digolongkan sebagai protein dari keluarga chymotrypsin-like protease. Ciri khas dari tripsin protease adalah adanya triad katalitik yang tersusun atas histidin, aspartat, dan serin. Namun, 58

nsp5 memiliki dyad katalitik yang terdiri atas histidin dan sistein. Terdapat hipotesis bahwa pada dyad katalitik nsp5, terdapat molekul air yang berperan dalam pemotongan enzim sehingga membentuk pseudo-triad. Dyad katalitik nsp5 sendiri strukturnya distabilkan oleh residu- residu lainnya pada substrate-binding pocket. His41 akan membentuk ikatan C-H dengan His164. Selanjtunya, His164 akan distabilkan melalui ikatan hidrogen dengan molekul air yang terhubung dengan residu lainnya untuk semakin memperkuat struktur dyad katalitik ini. (Kneller et al, 2020).

Dalam melakukan pemotongan pada poliprotein, nsp5 akan mengenali sekuens asam amino spesifik pada polipeptida. Sekuens tersebut adalah leusin, glutamin, serin, alanin, glisin, dengan asam amino glutamin pada subsitus P1 merupakan asam amino yang wajib ada pada polipeptida yang akan dipotong. Sekuens lainnya umumnya lebih fleksibel dan dapat digantikan dengan residu lain. (Jin et al, 2020) Nsp5 akan memotong polipeptida pada ikatan peptida antara glutamin dan

Gambar 5. Interaksi antar residu asam amino pada substrat dan nsp5 Biocatalyst | December 2020

Gambar 6. Konformasi pengikatan substrat dengan nsp5

serin. Seperti yang telah disebutkan sebelumnya, nsp5 memiliki tujuh subsitus pengikatan substrat yang akan diisi oleh residu dari polipeptida target sesuai dengan sekuens pengenalan yang telah disebutkan sebelumnya. Masing- maasing residu tersebut akan berinteraksi dengan beberapa residu pada nsp5 membentuk enzyme-substrate complex sebelum terjadi pemotongan. (Ramos-Guzman et al, 2020) Seperti yang dapat dilihat pada gambar 5, residu substrat pada P1 membentuk ikatan hidrogen yang cukup kuat dengan residu di sekitarnya seperti Glu166, Phe140, Asn142, termasuk Cys145 yang merupakan bagian dari dyad katalitik. Banyaknya ikatan hidrogen yang terjadi disebabkan residu glutamin merupakan residu pengenalan utama dari polipeptida. Residu substrat pada P1’ dan P2 teramati memiliki ikatan hidrogen dengan His41 yang merupakan dyad katalitik dari nsp5.

Pada P2’ dan P3 juga teramati adanya ikatan hidrogen yang paling kuat yang terjadi diantara enzim dan protein. Ikatan- ikatan ini akan menstabilkan interaksi antara enzim dan substrat.

Konformasi pengikatan substrat dengan enzim dapat dilihat pada gambar 6. (Ramos-Guzman et al, 2020).

Pada pemotongan polipeptida, nsp5 memiliki sebuah mekanisme yang terdiri dari dua tahapan utama yaitu asilasi dan deasilasi. Pada tahap asilasi terjadi pemotongan ikatan peptida, sementara pada tahap deasilasi terjadi pemulihan sisi aktif nsp5 agar siap mengikat substrat polipeptida berikutnya. Proses asilasi dimulai dengan pembentukan Michaelis complex, atau substrate-enzyme complex, dengan bentuk seperti yang telah dijelaskan sebelumnya. Kemudian terjadi pemutusan ikatan peptida melalui serangan nukleofilik oleh dyad katalitik dari nsp5. Seperti yang telah dibahas, pemutusan terjadi pada ikatan peptide antara P1 dan P1’. Setelah terjadi pemotongan, fragmen P1’ akan dikeluarkan dari kompleks enzim-substrat. Namun, karbon pada residu dari fragmen P1 justru akan membentuk ikatan kovalen dengan residu Cys145 dari enzim. Kompleks antara fragmen substrat dengan enzim ini disebut Biocatalyst | December 2020

dengan kompleks acyl-enzyme. Setelah terjadi pembentukan acyl-enzyme, tahapan asilasi selesai dan pemotongan akan memasuki tahap berikutnya yaitu tahap deasilasi. Pada tahap deasilasi akan terjadi hidrolisis acyl-enzyme yang mengakibatkan fragmen P akan terlepas dan kedua residu katalitik menjadi bebas kembali. Nsp5 akan menjadi apoenzim yang siap menerima substrat untuk siklus katalitik berikutnya. (Ramos-Guzman et al, 2020).

Nsp5 pada SARS-CoV-2 memiliki kemiripan dengan nsp5 pada SARS-CoV. Hasil alignment dari sekuens asam amino kedua nsp5 ini menunjukkan adanya sequence identity sebesar 96%. Mutasi asam amino yang ada bukan merupakan asam amino yang memegang peranan penting pada aktivitas katalitik nsp5 (Yoshino, 2020). Selanjutnya, superposisi struktur kristal nsp5 SARS-CoV-2 dengan nsp5 SARS-CoV dan 11 main protease pada coronavirus lain menunjukkan bahwa domain I, domain II, dan terutama substrate binding pocket sangat lestari. Variasi pada struktur main protease berbagai coronavirus ini umumnya terjadi pada domain III. Tingkat kelestarian yang tinggi ini menimbulkan hipotesis bahwa pengembangan suatu antivirus dengan target nsp5 atau main protease dapat menjadi pertahanan garis pertama yang efektif terhadap berbagai penyakit yang disebabkan oleh coronavirus. (Yang et al, 2005; Jin et al,2020).

Referensi Jeong Gu, Song H, Yoon GY, Kim D and Kwon Y-C (2020) Therapeutic Strategies Against COVID-19 and Structural Characterization of SARS-CoV-2: A Review. Front. Microbiol. 11:1723. doi: 10.3389/ fmicb.2020.01723 Jin, Z., Du, X., Xu, Y. et al. Structure of Mpro from SARS-CoV-2 and discovery of its inhibitors. Nature 582, 289–293 (2020). https://doi. org/10.1038/s41586-020-2223-y Kneller, D.W., Phillips, G., O’Neill, H.M. et al. Structural plasticity of SARS-CoV-2 3CL Mproactive site cavity revealed by room temperature X-ray crystallography. Nat Commun 11, 3202 (2020). https://doi. org/10.1038/s41467-020-16954-7 Mirza, M. U., & Froeyen, M. (2020). Structural elucidation of SARSCov-2 vital proteins: Computational methods reveal potential drug candidates against main protease, Nsp12 RNA-dependent RNA polymerase and Nsp13 Helicase. Journal of Pharmaceutical Analysis, 10(4), 320-328. https://doi.org/10.20944/preprints202003.0085. v1 Ramos-Guzmán, C. A., Ruiz-Pernía, J. J., & Tuñón, I. (2020). Unraveling the SARS-Cov-2 main protease mechanism using Multiscale DFT/MM methods. https://doi.org/10.26434/chemrxiv.12501734.v2 Yang, H. et al. Design of wide-spectrum inhibitors targeting coronavirus main proteases. PLoS Biol. 3, e324 (2005).

Yoshino, R., Yasuo, N., & Sekijima, M. (2020). Identification of key interactions between SARS-Cov-2 main protease and inhibitor drug candidates. https://doi.org/10.26434/chemrxiv.12009636

59

Gambar 7. Mekanisme pemotongan polipeptida oleh nsp5 Gambar 9. Superposisi nsp5 SARS-Cov-2 dengan main protease 12 coronavirus lainnya.

Gambar 8. Sequence alignment dari nsp5 SARS-CoV (atas) dengan nsp5 SARS-CoV-2 (bawah).

60

Biocatalyst | December 2020

NSP6: Induksi Autofagi pada Sel Inang

PROTEIN

Lestari Wevriandini

Nsp 6 merupakan salah satu non struktural protein yang dimiliki oleh α dan β-coronaviruses, termasuk SARS-CoV-2 yang termasuk kedalam genus betacoronavirus (βCoV). Menurut Cottam et al. (2014), nsp 6 pertama kali diteliti pada virus IBV (infectious bronchitis virus) yang menginfeksi unggas (avian) di banyak industri peternakan ayam di dunia. Pada SARS-CoV-2, nsp 6 diduga memiliki peran yang hampir sama dengan jenis β-coronavirus lain yaitu dapat menginduksi mekanisme autofagi pada sel inang.

Untuk memahami lebih lanjut mengenai salah satu protein pada SARS-CoV-2 ini, maka pada tulisan ini akan dibahas 2 hal, yaitu bagaimana struktur dari nsp 6 (a) dan apa sebenarnya fungsi nsp 6 pada SARS-CoV-2 sehingga dapat membantu menginfeksi sel inang (b)?

STRUKTUR NSP 6 SARS-COV-2 Nsp 6 pada SARS-CoV-2 diperkirakan memiliki 290 residu asam amino sama dengan SARS-CoV dengan sequence identity 88,2% dan sequence

similarity 98,3% (Yoshimoto, 2020). Urutan residu asam amino untuk nsp 6 dapat dilihat pada Gambar 1. Dalam hal struktur, nsp 6 masih belum banyak diteliti, namun pada penelitian Heo dan Feig (2020) dilakukan pemodelan untuk nsp 6 pada SARS-CoV-2 (Gambar 1) dimana pemodelan ini diharapkan dapat membantu untuk lebih memahami mekanisme biologis pada SARS-CoV-2, menambah pengetahuan pada level molekular yang pada akhirnya dapat dieksplorasi untuk penentuan kandidat-kandidat atau target terapi dan target pengobatan pada pasien-pasien yang terinfeksi SARS-CoV-2.

Pada gambar 1 terdapat 3 jenis model yaitu FeigLab, Zhang group dan AlphaFold (refinement).

Model AlphaFold (refinement) merupakan model terbaru yang diteliti, sedangkan model FeigLab, Zhang group dan AlphaFold (tidak ditunjukkan dalam gambar) merupakan model perbandingan dari penelitian-penelitian yang dilakukan sebelumnya.

Gambar 1. Pemodelan struktur nsp 6 SARS-CoV-2, FeigLab (A), Zhang lab (B), AlphaFold (refinened model)

Gambar 2. Model nsp 6 SARS-CoV-2 dengan I-TASSER. (Panah menunjukkan prakiraan mutasi pada residu asam amino) (kiri); Analisis struktural nsp 6 pada SARS-CoV-2 dengan TMHMM dan Potter server (kanan).

Biocatalyst | December 2020

61

Model AlphaFold (refinement) merupakan model terbaru yang diteliti, sedangkan model FeigLab, Zhang group dan AlphaFold (tidak ditunjukkan dalam gambar) merupakan model perbandingan dari penelitian-penelitian yang dilakukan sebelumnya.

Model AlphaFold (refinement) memiliki jumlah 290 residu asam amino sama dengan model FeigLab dan Zhang group, namun model ini mempunyai nilai MolProbity sebesar 0,6 (kurang dari 1,5) yang menunjukkan ukuran nilai standar untuk pemodelan apakah suatu pemodelan protein memenuhi standar stereokemistri atau tidak. Adapun bagian N-terminal pada gambar 1 ditunjukkan oleh warna biru, dan bagian C-terminal ditunjukkan oleh warna merah, serta bagian refinement (perbaikan) dari pemodelan sebelumnya ditunjukkan oleh warna abu (ditunjukkan oleh panah merah).

Selain itu, model ini menunjukkan bahwa struktur nsp 6 mempunyai sekitar 14 ι-helix, 2 antiparalel β-strands dan 16 turns.

Pada penelitian Benvenuto et al. (2020) juga melakukan pemodelan terhadap struktur nsp 6 pada SARS-CoV-2 (Gambar 2). Pemodelan melibatkan 351 data sekuens COVID-19 pada manusia yang diperoleh dari databank GISAID. Selanjutnya data diurutkan dan diolah dengan berbagai jenis program/software terkait signal filogenetik, pemetaan, pemodelan homolog hingga pembentukan model struktur protein. Pada pemodelan ini juga dilakukan analisis mutasi dengan Mutant2.0 online server dengan melihat efek mutasi terhadap stabilitas protein yang terbentuk. Selain itu juga dianalisis prediksi struktur sekunder dan trans-membrane dengan program Jpred, TMHMM dan Protter services.

Berdasarkan hasil pemodelan, struktur dari nsp 6 hampir sama dengan pemodelan yang dilakukan oleh Heo dan Feig (2020), namun detail struktur nsp 6 seperti bagian-bagian protein, domain, dan lainnya masih belum diteliti lebih lanjut. Dari 351 data sekuens pasien COVID-19, didapatkan bahwa terdapat urutan asam amino yang berbeda pada beberapa negara Asia, Amerika, Ocenia dan Eropa. Jika pada posisi 3691 (Phe37 atau posisi 37 pada nsp 6) Sebagian besar sekuens SARSCoV-2 mempunyai residu asam amino leusin, namun sekuens pada negara tersebut menunjukkan perubahan residu asam amino berupa phenylala62

nine.

Analisis dari hasil tersebut menunjukkan bahwa, meskipun asam amino leusin maupun fenilalanin merupakan asam amino non polar, namun fenilalanin mempunyai cincin benzene pada rantai samping yang dapat memperkuat struktur sekunder protein melalui interaksi aromatik-aromatik dan hidrofobik. Analisis menunjukkan mutasI ini dapat menyebabkan stabilitas struktur protein yang lebih rendah. Posisi mutan diduga dekat dengan sisi C-terminal pada rantai helix transmembran pertama yang sesuai dengan sisi membran luar pertama, sehingga dekat dengan daerah sekuens yang kaya akan residu fenilalanin (pada posisi 32 hingga posisi 40).

Adapun analisis struktural yang dilakukan menggunakan TMHMM dan Potter server menunjukkan bahwa nsp 6 memiliki 7 heliks transmembran putative seperti pada virus corona lainnya (Gambar 2). Jika dikaitkan dengan analisis sebelumnya, konformasi helix ke bagian sitosol dari segmen yang menghubungkan transmembrane 1 dan 2 dapat memfasilitasi interaksi hidrofobik antara residu-residu aromatik. Adanya residu ganda dari fenilalanin pada daerah luar membran nsp 6 dapat mendukung afinitas diantara daerah ER (endoplasmic reticulum) yang dapat menginduksi pengikatan protein yang lebih stabil ke ER. Pengikatan ini akan terkait dengan fungsi dari nsp 6 dalam hal menginduksi mekanisme autofagi (dibahas pada bagian lanjutan) yang mana akan mendukung infeksi virus dengan memanfaatkan kemampuan autofagosom untuk mengirim komponen virus ke lisosom untuk degradasi. Hal tersebut akan membatasi ekspansi autofagosom secara langsung maupun tidak langsung saat terjadi starvation atau penghambatan kimia dari mTOR signalling saat terjadi infeksi virus.

Berdasarkan pembahasan terkait struktur nsp 6, maka dapat disimpulkan bahwa meskipun penelitian terkait struktur nsp 6 masih sangat sedikit dan masih dalam tahap pemodelan, namun penelitian lanjutan atau perubahan daerah yang terindikasi mengalami mutasi hingga penelitian eksperimental harus terus dipantau/dilakukan untuk melihat perkembangan virus. Perubahan atau mutasi se Biocatalyst | December 2020

dikitpun pada struktur protein virus dapat memberikan adaptasi yang berguna bagi virus untuk bertahan dan berkembang biak pada tubuh manusia dan dapat mengubah patogenisitas SARSCoV-2 secara signifikan. Selain itu perkembangan terkait struktur protein juga dapat menjadi target pertahanan host-antiviral terutama untuk mesing-mesin lisosom autafagik sel jika dikaitkan dengan fungsi dari nsp 6.

FUNGSI NSP 6 SARS-COV-2 Seperti yang telah disebutkan sebelumnya bahwa nsp 6 pada SARS-CoV-2 mempunyai peran dalam hal menginduksi mekanisme autofagi pada sel inang. Autofagi merupakan salah satu respon seluler terhadap kelaparan yang akan mendegradasi organel-organel pada sitoplasma dan protein-protein yang sudah tua untuk dikirim ke lisosom (Choi et al., 2018). Menurut Wang dan Klionsky (2003), autofagi akan menyediakan pasokan asam amino jangka pendek saat respon terhadap kelaparan dengan mengirimkan organel-organel yang rusak dan protein-protein yang sudah tua ke lisosom untuk didegradasi.

Autofagi dimulai saat nukleasi fagofor yang akan meluas atau berkembang membentuk double membrane autofagosom yang dapat menyita bagian sitosol. Autofagi dimulai oleh interaksi sekuensial antara mTOR kinase (nutrient sensing) dan kompleks protein ULK1 (UKC). UKC merupakan kompleks ULK1, ATG13, RB1CC1/FIP200 dan ATG101. Pada keadaan kaya/cukup nutrisi, mTOR aktif dan memfosforilasi ATG13 di dalam UKC. Namun, pada kondisi kelaparan (starvation), mTOR dinonaktifkan dan ULK1 meningkatkan fosforilasi RB1CC1. Perubahan ini memungkinkan UKC mengikat kompleks protein kedua yang mengandung BECN1/Vps30/ATG6. ATG14 dan fosfodylinositol 3 kinase kelas 3 yang subunit katalitiknya disebut PIK3C3. Pengaktifan kompleks PIK3C3-BECN1 akan menginduksi ubiquitin reaction yang menghasilkan ATG5-ATG16 konjugat dan menambah PE ke MAPIL C3B/ATG8.

Perekrutan MAPILC3B-PE konjugat (LC3-II) akan membuat ekspansi fagofor dan melepaskan autofagosom ke sitosol.

memberi respon terhadap infeksi virus yang mana mekanismenya hampir sama saat sel mengalami kelaparan, namun mekanisme ini sendiri mempunyai dampak positif atau negatif pada infeksi tergantung sifat/karakteristik dari virus (Cottam et al., 2014), seperti kepekaan terhadap autofagi dan penghambatan autofagi dapat menyebabkan peningkatan replikasi dan virulensi virus (e.g. herpes simplex 1 (HSV1), vesicular stomatitis (VSV) dan virus sindbis); penghambatan pembentukan autofagosom atau pembatasan ekspansi lisosom yang menyebabkan autofagosom gagal mengirim komponen-komponen virus untuk didegradasi di lisosom (e.g. Neurovirulence pada HSV1); autofagi dapat mendorong terjadinya infeksi oleh picornavirus karena autofagosom menyediakan situs untuk replikasi (e.g. poliovirus dan coxsackievirus).

Adapun pengaktifan mekanisme autofagi yang telah dijelaskan sebelumnya oleh virus tentunya melibatkan kompleks protein virus itu sendiri.

Seperti yang kita ketahui SARS-CoV-2 merupakan salah satu virus RNA untai positif yang mana dua-pertiga genom nya mengkode protein non struktural (nsp) yang dibutuhkan untuk bereplikasi.

Nsp akan dirakit menjadi kompleks replikasi pada permukaan sitoplasma ER, selanjutnya perakitan replikase dan replikasi genom bertepatan dengan pembentukan membrane vesikula ganda (DMV) pada situs replikasi, dan proses inilah yang akan mengaktifkan autofagi. Pada IBV, MHV dan SARS induksi autofagi ini dilakukan oleh nsp 6 (Tabel 1) dan dimungkinkan juga dibantu beberapa nsp lain seperti nsp 2, 3, 4. Protein-protein ini memiliki domain multiple membrane-spanning yang berlokasi pada ER yang merupakan lokasi pengaktifan autofagi melalui jalur yang bergantung pada ATG5 dan PIK3C3 (Miller et al., 2020).

Tabel 1 Jalur autofagi protein non struktural dari Coronavirus

Pengaktifan autofagi juga dapat terjadi saat sel Biocatalyst | December 2020

63

Pada SARS-CoV-2 yang memiliki kesamaan struktur dengan SARS-CoV dimungkinkan induksi autofagi juga dilakukan oleh nsp 6 dibantu oleh nsp 3 dan nsp 4. Ketiga protein ini harus bekerja Bersama, jika nsp 3 bekerja sendiri, bagian C-terminal akan terisolasi dan menghasilkan struktur yang tidak teratur, serta proliferasi dari struktur membrane, sedangkan jika nsp 4 bekerja sendiri, maka tidak akan menghasilkan apapun (tidak berfungsi maksimal). Oleh karena itu, nsp 3 dan 4 harus co-ekspresi untuk membentuk multilamellar bodies. Adapun jika nsp 6 bekerja sendiri, maka akan diproduksi single membrane vesicle yang terlokalisasi pada pusat organisasi mikrotubul.

Banyak ciri autofagi yang diinduksi oleh nsp 6 menunjukkan bahwa protein tidak hanya akan membentuk DMV namun jg dapat mengaktifkan jalur omegasom yang biasanya digunakan oleh sel untuk menghasilkan autofagosom dari ER sebagai respons terhadap kelaparan. Ekspresi protein nsp 6 akan menghasilkan peningkatan kadar Ptdlns3P pada membran ER, perekrutan protein efektor Ptdlns3P WIPI2 dan pembentukan autofagosom langsung dari ER. Hal ini pada akhirnya akan membatasi ekspansi autofagosom untuk menghancurkan komponen virus di lisosom.

Gambar 3 menunjukkan bagaimana coronavirus dapat menginterferen/mengganggu mekanisme autofagi.

Dalam hal pembuktian terhadap fungsi nsp 6 terhadap mekanisme autofagi, Cottam et al. (2014) melakukan percobaan (Gambar 4 dan 5). Namun percobaan dilakukan pada jenis coronavirus lain seperti IBV. Meskipun demikian ini dapat menunjukkan peran/fungsi nsp 6 pada coronavirus yang juga dimungkinkan sama dengan fungsi nsp 6 pada SARS-CoV-2 sebelum adanya mutasi.

Gambar (4 dan 8) menunjukkan perbandingan pembentukan autofagosom saat respon terhadap kelaparan dan saat diinfeksi oleh nsp 6 IBV dan MHV. HBSS merupakan perlakuan kontrol kelaparan tanpa infeksi virus, LC3B merupakan sel puncta (untuk autofagosom) dan mCherry merupakan immunolabel yang digunakan pada pengamatan yang dirender dalam bentuk spherical spot dengan software Imaris. Adapun diameter puncta diwarnai dengan kode warna (menggunakan heatmap).

Hasil percobaan menunjukkan bahwa diameter puncta yang berwarna biru adalah kurang dari 0,3 64

Gambar 3. Skema Coronavirus dalam mengganggui jalur autofagi pada sel inang.

Îźm, puncta hijau berukuran 0,5 Îźm dan puncta merah berukuran 1 Îźm. Hal ini menunjukkan bahwa perlakuan dengan induksi nsp 6 IBV dan MHV memperlambat ekspansi atau pembentukan dari autofagosom dikarenakan ukuran standar untuk autofagosom (MAPILC3B) yang seharusnya terbentuk sebagai respon dari kelaparan adalah >=1 Îźm. Pada Gambar 4 (D), percobaan diulang untuk sel yang terinfeksi IBV pada keadaan absen/tidak adanya antibody melawan nsp 6 yang dideteksi dengan immunostaining untuk double stranded RNA (pseudocolor black). Hasil percobaan sama yang menunjukkan induksi nsp 6 IBV dan MHV memperlambat ekspansi atau pembentukan dari autofagosom. Pada Gambar 4 (E) menunjukkan perhitungan jumlah dan diameter puncta per sel Hasil yang didapat yaitu jumlah puncta pada sel yang diinfeksi virus lebih banyak dibandingkan dengan sel yang tidak terinfeksi, namun diameter puncta pada sel yang terinfeksi lebih kecil.Selanjutnya adalah percobaan terkait pengaruh infeksi nsp 6 IBV terhadap maturasi omegasom. Seperti yang telah dibahas sebelumnya bahwa omegasom merupakan sisi pada ER yang terlokalisasi untuk memproduksi Ptdlns3P yang dapat membantu .rekruitmen protein-protein yang dibutuhkan untuk membentuk autofagosom. WIPI2 yang diamati pada Gambar 4 merupakan marker untuk omegasom. WIPI2 ini akan berikatan dengan Ptdlns3P dengan kolokalisasi dengan ZFYVE1-GFP selama pembentukan autofagosom.

Biocatalyst | December 2020

Hasil percobaan menunjukkan bahwa nsp 6 dapat membatasi ekspansi dari omegasom dan memodulasi ukuran autofagosom sebelum autofagosom dirilis ke sitosol.

POSSIBLE SMART TARGETING (DRUG) OF THE AUTOPHAGY PATHWAY? Pada penelitian Shojaei et al.

(2020) menyebutkan bahwa belum ada obat yang disetujui untuk pengobatan SARS-CoV-2, namun investigasi praklinis menyarankan pengubahan tujuan dari beberapa obat yang disetujui FDA untuk uji klinis.

Separuh dari obat-obat tersebut merupakan modulator dari jalur autofagi.

Tabel 2 menunjukkan beberapa

obat untuk SARS-CoV-2 yang sedang dilakukan uji klinis berdasarkan data dari WHO, hubungannya terhadap mekanisme autofagi dan beberapa efek samping yang dapat muncul.

Semua obat yang diindikasikan memiliki efek samping yang cukup parah dan pasien yang dapat mentoleransi obat-obat ini sangat terbatas. Hal ini terkait dengan efek luaran obat terhadap sistemik tubuh, sebagai contoh chloroquine/CQ memiliki beberapa potensi sebagai terapi yang efektif untuk COVID-19 berdasarkan uji klinis awal, namun dapat menyebabkan retinopati, neuromiopati, nefropati, dan kardiomiopati. Meskipun fokus utama terkait dengan infeksi SARSCoV-2 dengan autofagi. dan fakta bahwa 58% obat-obatan yang sedang diuji klinis merupa-

kan modulator autofagi, namun juga harus dipertimbangkan modulasi mekanisme lain selain autofagi yang dapat menurunkan infeksi. Oleh karena itu, pada penelitian ini juga direkomendasikan dua target penelitian utama untuk para peneliti yang sedang menyelidiki interkoneksi infeksi virus dan autophagy: 1.

Pemahaman mekanistik tentang intracellular trafficking dan replikasi SARS-CoV-2.

2.

Mengembangkan terapi efektif yang dikhususkan untuk SARS-CoV-2 dan jalur autophagi.

Penelitian ini juga memodulasi pendekatan nanoteknologi untuk memproduksi nanoparticles/ nanomedicine yang memodulasi jalur autofagi untuk melawan COVID-19 (Gambar 5).

Gambar 4. Analisis autofagosom yang diidnduksi oleh protein nsp 6 coronavirus.

Biocatalyst | December 2020

65

Tabel 2. Target obat yang terkait dengan mekanisme autofagi berdasarkan data dari WHO

Gambar 5. Modulasi jalur autofagi dengan nanoparticle/nanomedicine.

Referensi Benvenuto, Domenico., Silvia Angeletti, Marta Giovanetti, Martina Bianchi, Stefano Pascarella, Roberto Cauda, Massimo Ciccozzi, Antonio Cassone. 2020.

Evolutionary analysis of SARS-CoV-2: how mutation of Non-Structural Protein 6 (NSP6) could affect viral autophagy.

Journal of Infection 81, e24–e27.

Choi Y, Bowman JW, Jung JU. 2018.

Autophagy during viral infection - a double-edged sword. Nat Rev Microbiol. 16(6):341–354.

Cottam, Eleanor M., Matthew C Whelband, and Thomas Wileman. 2014.

Coronavirus NSP6 restricts autophagosome expansion. Autophagy 10:8, 1426–1441.

Heo Lim and Michael Feig. 2020. Modeling of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Proteins by Machine Learning and Physics-Based Refinement. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, East Lansing, MI, USA. 66

Miller Katelyn, Marisa E. McGrath , Zhiqiang Hu , Sohha Ariannejad , Stuart Weston , Matthew Frieman & William T Jackson. 2020. Coronavirus interactions with the cellular autophagy machinery. AUTOPHAGY. <https://doi.org/ 10.1080/15548627.2020.1817280>.

Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat Cell Biol 2009; 11:46876; PMID:19270693; http://dx.doi. org/10.1038/ncb1854

Shojaei Shahla, Madhumita Suresh, Daniel J. Klionsky, Hagar Ibrahim Labouta, and Saeid Ghavami. 2020.

Autophagy and SARS-CoV-2 infection: A possible smart targeting of the autophagy pathway. VIRULENCE 2020, VOL. 11, NO. 1, 805–810. <https://doi.org/10.

1080/21505594.2020.1780088>.

Wang CW, Klionsky DJ. The molecular mechanism of autophagy. Mol Med 2003; 9:65-76; PMID:12865942 2.

Yoshimoto, Francis K. 2020. The Proteins of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS CoV 2 or n COV19), the Cause of COVID 19. The Protein Journal (2020) 39:198–216 Zhong Y, Wang QJ, Li X, Yan Y, Backer JM, Chait BT, Heintz N, Yue Z. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Biocatalyst | December 2020

PROTEIN

ORF3a: Inflamasi dan Apoptosis Sel hingga Pelepasan Virus Anwar Fauzi Rakhmat Protein ORF3a merupakan protein aksesori dari virus SARSCoV-2 yang memiliki ukuran paling besar diantara protein aksesori lainnya. Protein ini memiliki panjang 275 asam amino yang dikode oleh urutan genom yang dapat mengekspresikan lebih dari satu protein. (Hassan, et al. 2020) Protein ORF3a memiliki peranan penting pada patogenisitas virus, diantaranya menjadi pemicu inflamasi hingga pelepasan virus dari sel yang telah terinfeksi. Fungsi ini didukung oleh 6 domain y ang ada pada protein tersebut, dimana masing masing domain memiliki peranan kunci dalam aktivitas patogenesis dari virus ini. (Issa, et al. 2020).

Inflamasi yang terjadi pada pasien Covid-19 terjadi akibat adanya kelebihan produksi molekul sitokin yang mampu memicu inflamasi.(Issa, et al.

2020) Kondisi ini dapat dikenali dengan munculnya gejala seperti demam, pusing, hingga delirium dan halusinasi.(Lee, et al.

2014) Inflamasi yang disebabkan oleh protein ORF3a berkaitan dengan aktivitas dari domain yang terletak pada urutan asam amino 36-40 (PIQAS). Domain ini memiliki aktivitas TRAF3-binding motif yang mampu berasosiasi dengan TRAF3 untuk kemudian menjalankan rangkaian aktivasi

inflamasi hingga menginduksi produksi sitokin secara berlebih.

(Siu, et al. 2019) Kondisi inflamasi ini menjadi salah satu sorotan dalam pengembangan obat yang mampu mengurangi efek inflamasi, sehingga gejala yang timbul pada pasien tidak terlalu parah.(Shah, 2020).

Pada sel yang telah terinfeksi berat, akan terjadi apoptosis atau kematian sel yang disebabkan oleh molekul protein ORF3a.(Ren, et al. 2020). Aktivitas apoptosis ini berkaitan dengan struktur yang dimiliki oleh protein tersebut. Protein ORF3a dikenal memiliki struktur homotetramer, atau kumpulan dari empat molekul yang sama, dimana setiap tetramer terdiri dari dua dimer yang dibentuk oleh monomer dari protein ORF3a.

Struktur tetramer dari ORF3a hanya dapat dibentuk jika terdapat asam amino sistein pada urutan ke 133. Asam amino pada urutan ini menjadi penting bagi patogenesis SARS-CoV-2, karena tanpa asam amino ini struktur tetramer dari ORF3a tidak akan terbentuk. (Issa, et al.

2020)(Kern, et al. 2020).

Struktur ini membentuk kanal ion yang sensitif terhadap ion K+ pada bagian transmembrane dari sel yang terinfeksi. Kanal ion yang dibentuk oleh ORF3a

memiliki bagian pori yang memiliki dua bukaan pada bagian atas dan bagian terowongan pada bagian bawah yang memiliki enam bukaan (Kern, et al. 2020).

Kanal ion ini akan memompa ion K+ keluar membrane sitosol sehingga sel akan mengalami kekurangan ion Kalium (Chan, et al.

2009). Kondisi yang terjadi pada sel tersebut akan mengaktivasi jalur apoptosis ekstrinsik yang prosesnya didukung oleh protein caspase 8, caspase 9, Bid, sitokrom c dan pembentukan apoptosome yang akan mengaktivasi caspase 3 yang kemudian menghancurkan struktur sel sehingga terjadi apoptosis. (Ren, et al. 2020)(Chan, et al. 2009).

Untuk mendukung terjadinya apoptosis, protein ORF3a dari SARS-CoV-2 perlu berintegrasi dengan membrane sel yang terinfeksi agar dapat menjalankan aktivitas kanal ion.(Ren, et al. 2020). Untuk dapat mengarah ke membrane sel, protein ini didukung oleh tiga motif yaitu Caveolin-binding motif, YxxĎ&#x2020;, dan motif di-acidic. Ketiga motif ini berada pada urutan 141-149, 160-163, dan 171-173 secara berturut turut.(Issa, et al. 2020) Jika dibandingkan dengan protein ORF3a dari SARS-CoV yang pernah menjadi pandemi pada tahun 2002-2003, tingkat apoptosis yang dihasilkan oleh ORF3a dari SARS-CoV-2 cenderung lebih rendah. Hal ini terjadi karena ORF3a pada SARS-CoV-2 tidak mampu menginduksi apoptosis jika protein tersebut tidak terintegrasi pada membrane sel.

(Ren, et al. 2020)

Gambar 1. Urutan asam amino protein ORF3a dari SARS-CoV dan SARS-CoV-2 (Hassan, et al. 2020) Biocatalyst | December 2020

67

Pelepasan virus secara non-litik juga terjadi melalui protein ini, dimana protein ORF3a akan bergabung bersama protein S dalam penyusunan partikel virus. Selain itu, protein ini juga memiliki kemampuan co-lokalisasi dengan protein M dan E yang sangat penting dalam penyusunan molekul virus. Hal ini menjadikan ORF3a memiliki peranan penting dalam proses penyusunan virus dan pelepasan virus secara budding. (McBride & Fielding, 2012) Mengacu pada fungsi protein ORF3a yang cukup luas dan berpengaruh penting pada patogenisitas virus, banyak penelitian yang telah mengembangkan obat untuk menekan efek yang dihasilkan oleh ORF3a. Diantara penelitian tersebut, sebagian besar mengarah pada senyawa yang menghambat inflamasi untuk menekan efek yang dihasilkan dan meringankan gejala dari pasien Covid-19. (Shah, 2020).

blood-2014-05-552729 Siu, K., Yuen, K., Castano‐Rodriguez, C., Ye, Z., Yeung, M., & Fung, S. et al. 2019. Severe acute respiratory syndrome Coronavirus ORF3a protein activates the NLRP3 inflammasome by promoting TRAF3‐dependent ubiquitination of ASC. The FASEB Journal, 33(8), 8865-8877. doi: 10.1096/fj.201802418r Shah A. 2020. Novel Coronavirus-Induced NLRP3 Inflammasome Activation: A Potential Drug Target in the Treatment of COVID-19.

Front. Immunol. 11:1021. doi: 10.3389/fimmu.2020.01021 Ren, Y., Shu, T., Wu, D. et al. 2020. The ORF3a protein of SARS-CoV-2 induces apoptosis in cells. Cell Mol Immunol 17, 881–883 Kern, D. M., Sorum, B., Hoel, C. M., Sridharan, S., Remis, J. P., Toso, D. B., Brohawn, S. G. 2020. Cryo-EM structure of the SARS-CoV-2 3a ion channel in lipid nanodiscs. bioRxiv preprint doi: https://doi. org/10.1101/2020.06.17.156554 Chan, C., Tsoi, H., Chan, W., Zhai, S., Wong, C., & Yao, X. et al. 2009. The ion channel activity of the SARS-coronavirus 3a protein is linked to its pro-apoptotic function. The International Journal Of Biochemistry & Cell Biology, 41(11), 2232-2239. doi: 10.1016/j.biocel.2009.04.019 McBride, R., & Fielding, B. C. (2012). The role of severe acute respiratory syndrome (SARS)-coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses, 4(11), 2902–2923. https://doi.org/10.3390/ v4112902

Referensi.

Hassan, S. S., Choudhury, P. P., Basu, P., & Jana, S. S. 2020. Molecular conservation and differential mutation on ORF3a gene in Indian SARS-CoV2 genomes. Genomics, 112(5), 3226–3237.

Issa E, Merhi G, Panossian B, Salloum T, Tokajian S. 2020. SARSCoV-2 and ORF3a: nonsynonymous mutations, functional domains, and viral pathogenesis. mSystems 5:e00266-20 Lee DW, Gardner R, Porter DL, Louis CU, Ahmed N, Jensen M, et al.

(July 2014). Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome. Blood. 124 (2): 188–95. doi:10.1182/

Gambar 2. Struktur (a) monomer, (b) dimer, dan (c) tetramer dari protein ORF3a. (Kern, et al. 2020)

Gambar 3. (a) Struktur kanal ion pada ORF3a dengan dua pori pada bagian atas yang mengarah ke luar membrane dan (b, c, d) terowongan yang mengarah ke membran dan bagian dalam sitosol (kiri) (Kern, et al. 2020); Proses apoptosis pada sel melalui jalur intrinsic oleh protein ORF3a pada SARS-CoV-2 dan SARS-CoV (kanan) (Ren, et al. 2020).

68

Biocatalyst | December 2020

PENUTUP

Setelah membaca seluruh artikel buku ini, kita dapat mengetahui betapa cerdasnya SARS-COV-2 dalam menginfeksi manusia. Mulai dari memasuki sel manusia melalui reseptor ACE2, perbanyakan materi genetik, menghindari sistem pertahanan tubuh manusia, hingga dapat memperbanyak diri menjadi virus-virus yang baru. Ditambah lagi, SARS-COV-2 yang berukuran sangat kecil, tak kasat mata, sehingga kita tidak mengetahui apakah mereka berada di sekeliling kita atau tidak.

Pandemi coronavirus belum berakhir hingga buku ini diterbitkan. Walaupun vaksin coronavirus sudah tiba per Desember 2020, namun misteri apakah pandemi ini akan berakhir dan kondisi dunia akan kembali seperti semula hingaa saat ini belum terjawab.

Hingga pertengahan Desember dimana halaman penutup ini dibuat, efektivitas vaksin yang sudah tiba di Indonesia masih harus diuji efikasi dan keamanannya. Sebagai masyarakat, kita tidak bisa mengambil kebijakan publik terkait pandemi ini, namun setidaknya kita bisa mencerdaskan diri kita dan orang sekitar kita dengan pengetahuan mengenai SARS-COV-2 itu sendiri, sehingga kita bisa lebih mengenal SARS-COV-2 dan lebih waspada terhadap penularan COVID 19. Mari tetap jaga kesehatan diri kita dan tetap selalu terapkan protokol Kesehatan seperti memakai masker dan sering mencuci tangan.

Biocatalyst | December 2020

69

Pencitraan coronavirus yang keluar dari sel yang terinfeksi. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop elektron.

Sumber gambar: University of California San Fransisco (https://www.ucsf.edu/news/2020/02/416671/how-new-coronavirus-spreads-and-progresses-and-why-one-test-may-not-be-enough).

Diakses pada 20 Desember 2020 Biocatalyst | December 2020 70

Pencitraan coronavirus (gambar diberi pewarnaan).

Sumber gambar: scripps.edu (https://www.ucsf.edu/news/2020/02/416671/how-new-coronavirus-spreads-and-progresses-and-why-one-test-may-not-be-enough) Diakses pada 20 Desember 2020 Biocatalyst | December 2020 71

Setelah membaca seluruh artikel buku ini, kita dapat mengetahui betapa cerdasnya SARS-COV-2 dalam menginfeksi manusia. Mulai dari memasuki sel manusia melalui reseptor ACE2, perbanyakan materi genetik, menghindari sistem pertahanan tubuh manusia, hingga dapat memperbanyak diri menjadi virus-virus yang baru.

Ditambah lagi, SARS-COV-2 yang berukuran sangat kecil, tak kasat mata, sehingga kita tidak mengetahui apakah mereka berada di sekeliling kita atau tidak.

Pandemi coronavirus belum berakhir hingga buku ini diterbitkan. Walaupun vaksin coronavirus sudah tiba per Desember 2020, namun misteri apakah pandemi ini akan berakhir dan kondisi dunia akan kembali seperti semula hingaa saat ini belum terjawab. Hingga pertengahan Desember dimana halaman penutup ini dibuat, efektivitas vaksin yang sudah tiba di Indonesia masih harus diuji efikasi dan keamanannya. Sebagai masyarakat, kita tidak bisa mengambil kebijakan publik terkait pandemi ini, namun setidaknya kita bisa mencerdaskan diri kita dan orang sekitar kita dengan pengetahuan mengenai SARS-COV-2 itu sendiri, sehingga kita bisa lebih mengenal SARS-COV-2 dan lebih waspada terhadap penularan COVID 19. Mari tetap jaga kesehatan diri kita dan tetap selalu terapkan protokol Kesehatan seperti memakai masker dan sering mencuci tangan.

72

Biocatalyst | December 2020