Spot On Sonderausgabe Mykotoxin Studie: Hinter dieser kleinen Probe steckt eine große Geschichte.

Sonderausgabe Mykotoxin-Studie

Eine Veröffentlichung von Romer Labs®

Hinter dieser kleinen Probe steckt eine große Geschichte

Die neuesten Ergebnisse der weltweiten Mykotoxin-Studie von BIOMIN Multi-Mykotoxin-Risikobewertung: Jenseits jeglicher Regulierung

Photo: dusanpetkovic

Inhalt

4-7

Die Ergebnisse der BIOMIN Mykotoxin-Studie 2018 Ergebnisse und Trends aus der derzeit umfassendsten Studie.

Von Alexandro Marchioro, Mykotoxin-Produktmanager, BIOMIN

Spot On ist eine Publikation der Romer Labs Division Holding GmbH, die kostenlos erhältlich ist.

ISSN: 2414-2042

Herausgeber: Joshua Davis, Cristian Ilea

Mit Beiträgen von: Martina Bellasio, Alexandro Marchioro, Yong Wee Liau Graphik: GraphX ERBER AG Recherche: Kurt Brunner

Verlag: Romer Labs Division Holding GmbH Erber Campus 1 3131 Getzersdorf, Austria Tel: +43 2782 803 0 www.romerlabs.com

©Copyright 2019, Romer Labs® Alle Rechte vorbehalten. Kein Teil dieser Publikation darf ohne schriftliche Genehmigung des Inhabers der Urheberrechte in jeglicher materieller Form für gewerbliche Zwecke vervielfältigt werden.

8-11 Mykotoxin-Risikobewertung: Die ganze Geschichte Nur 6 der etwa 400 bekannten Mykotoxine werden durch Verordnungen reguliert.

Wie können wir ein vollständiges Bild vom Vorkommen neuartiger und maskierter Mykotoxine sowie von den „üblichen Verdächtigen“ erhalten?

Von Yong Wee Liau, Geschäftsführerin, Romer Labs Asien

Alle Bilder sind das Eigentum von Romer Labs oder werden mit Lizenz verwendet.

Romer Labs is part of ERBER Group

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S p o t O n S o n d e r a u s g a b e M y ko t ox i n e

Editorial

Hinter dieser einen kleinen Probe steckt eine große Geschichte Die Experten unserer Schwesterfirma BIOMIN veröffentlichen jährlich die Ergebnisse ihrer weltweiten Mykotoxin-Studie. Diese Studie wird von den Futtermittel- und Tierproduzenten aus gutem Grund sehr geschätzt. Mit über 80.000 analysierten Proben aus fast 80 Ländern ist die Studie branchenführend, wenn es darum geht, bestimmte Mykotoxin-Kontaminationsmuster bei Rohmaterialien und Futtermitteln zu identifizieren. Die Studie trägt maßgeblich dazu bei, das Bewusstsein für die vielfältigen Auswirkungen von Mykotoxinen auf Schweine, Geflügel, Wiederkäuer und andere Tiere zu schärfen. In einem unsicheren Marktumfeld und angesichts der raschen Klimaveränderung liefert die Studie Klarheit über das Vorkommen von regulierten und noch nicht regulierten Mykotoxinen.

Auch innerhalb der Analytiker-Community hat sie sich als nützliches Tool erwiesen. In der Ausgabe von Spot On zur letztjährigen Studie habe ich darauf hingewiesen, wie wichtig es ist, vor der Implementierung eines Programms zur Mykotoxinkontrolle zuverlässige Methoden für den Mykotoxinnachweis an der Hand zu haben. Was nicht messbar ist, kann auch nicht kontrolliert werden. In diesem Jahr tragen die Studienergebnisse noch etwas zur Erhöhung der Komplexität bei. Laut der Aussage unserer Freunde bei BIOMIN sind wir Zeuge eines immer häufiger auftretenden multiplen Mykotoxinvorkommens. Mit anderen Worten, es wird immer wahrscheinlicher, dass eine durchschnittliche Getreide- oder Futtermittelprobe nachweisbare Spiegel von mehr als einem Mykotoxin enthält.

Die Probleme, die durch multiples Mykotoxinvorkommen verursacht werden können, sind kaum vorhersehbar. Zwischen bestimmten Mykotoxinen konnten wir sogar synergistische Effekte beobachten. „Synergistisch“ heißt, dass die kombinierte Wirkung zweier Mykotoxine größer ist als die bloße Summe ihrer Einzeleffekte.

Darüber hinaus trifft dies auf mehrere Mykotoxine zu, nicht nur auf die „üblichen Verdächtigen“, d. h. auf die regulierten Mykotoxine wie Deoxynivalenol und Aflatoxin. Je mehr wir über die Gefahren des multiplen Mykotoxinvorkommens lernen, desto wichtiger werden validierte Analysemethoden, mit denen mehrere Mykotoxine in ein und derselben Probe nachgewiesen werden können.

In dieser Ausgabe von Spot On bewertet Alexandro Marchioro, mein Kollege bei BIOMIN, einige der Ergebnisse der weltweiten Mykotoxin-Studie von BIOMIN und analysiert das multiple Mykotoxinvorkommen in unterschiedlichen Regionen auf der ganzen Welt. Yong Wee Liau, meine Kollegin von Romer Labs Asia, diskutiert neuartige und maskierte Mykotoxine sowie einige Beispiele für die Auswirkungen eines multiplen Mykotoxinvorkommens. Darüber hinaus stellt sie Methoden zur Analyse von Getreide- und Futtermittelproben für den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Mykotoxine vor. Wie wir zu sagen pflegen: Hinter dieser kleinen Probe steckt eine große Geschichte. Die Multi-Mykotoxinanalyse verspricht, "Licht ins Dunkel" zu bringen.

Viel Freude beim Lesen dieser Ausgabe von Spot On.

E i n e Ve rö f f e n t l i c h u n g v o n Ro m e r L a b s ®

Martina Bellasio, PhD

Produktmanagerin Mykotoxine

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Photo: eclipse_images

Globale BIOMIN MykotoxinStudie 2018

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S p o t O n S o n d e r a u s g a b e M y ko t ox i n e

Die neueste Ausgabe der jährlichen Studie, bei der 18.424 Proben landwirtschaftlicher Rohstoffe aus 79 Ländern in mehr als 81.900 Analysen unterzogen wurden, hebt die Gefahren hervor, die von den wichtigsten Mykotoxinen in Primärfuttermitteln ausgehen und beleuchtet die potenziellen Risiken für die Tierproduktion.

Von Alexandro Marchioro Mykotoxin-Produktmanager, BIOMIN

D

ie Ergebnisse der BIOMIN MykotoxinStudie liefern Einblicke in das Vorkommen von Aflatoxinen (Afla), Zearalenon (ZEN), Deoxynivalenol (DON), T-2-Toxin (T-2), Fumonisinen (FUM) und Ochratoxin A (OTA) in den Hauptbestandteilen von Futtermitteln. Diese umfassen unter anderem Mais, Weizen, Gerste, Reis, Sojabohnenmehl, Maisglutenmehl, trockenes Destilliergetreide (dried distillers grains, DDGS) und Silage.

Risikoniveaus

Aufgrund der hohen Empfindlichkeit hochmoderner Nachweissysteme reicht es nicht mehr aus, nur über das Vorhandensein von Mykotoxinen zu sprechen — auch deren Konzentrationen sind zu berücksichtigen.

Folglich werden die jüngsten Ergebnisse anhand einer Mykotoxin-Risikokarte dargestellt, die sowohl auf dem Vorhandensein von Mykotoxinen als auch auf deren potenziellen Schäden für Tiere in Abhängigkeit von den Konzentrationen im Zusammenhang mit bekannten Gesundheitsrisiken basiert.

In Abbildung 1 sind die Daten zum Mykotoxinvorkommen pro Region als Prozentsatz aller getesteten Proben dargestellt. Das Gesamtrisiko einer bestimmten Region ergibt sich aus dem prozentualen Anteil der Mykotoxine, die die Schwellenwerte für Fortsetzung des Artikels auf S. 8 E i n e Ve rö f f e n t l i c h u n g v o n Ro m e r L a b s ®

5

Afla 15% ZEN 56% DON 64% T-2 44% FUM 47% OTA 16%

Nordeuropa Gesamtrisiko 56%

Mitteleuropa Gesamtrisiko 46%

Afla 1% ZEN 42% DON 66% T-2 49% FUM 44% OTA 10%

Afla 21% ZEN 67% DON 58% T-2 24% FUM 84% OTA 31%

Naher Osten Gesamtrisiko 60%

Afla 8% ZEN 34% DON 67% T-2 3% FUM 44% OTA 3%

Südeuropa Gesamtrisiko 61%

Nordamerika Gesamtrisiko 73%

Abbildung 1. Weltkarte des Mykotoxin-Vorkommens und Mykotoxin-Risikos in verschiedenen Regionen. Die Kästchen zeigen den prozentualen Anteil der analysierten unterschiedliche Risikoniveaus an.

Afla 15% ZEN 71% DON 65% T-2 15% FUM 87% OTA 15%

In Nordamerika stellten DON und

Afla 27% ZEN 48% DON 67% T-2 25% FUM 72% OTA 7%

Afla 26% ZEN 81% DON 77% T-2 10% FUM 71% OTA 6%

Südafrika Gesamtrisiko 67%

Südamerika Gesamtrisiko 72%

Nutztiere dar.

Afla 14% ZEN 10% DON 70% T-2 0% FUM 84% OTA 3%

Afrika Gesamtrisiko 65%

Bedrohungen für

Mittelamerika Total Risk 70%

FUM die größten

Afla 7% ZEN 72% DON 72% T-2 1% FUM 74% OTA 6%

Legende

Moderates Risiko

6

Extremes Risiko

n n n n

Moderates Risiko: 0 – 25 % der Proben über dem Risikoschwellenwert Hohes Risiko: 26 % – 50 % der Proben über dem Risikoschwellenwert Sehr hohes Risiko: 51 % – 75 % der Proben über dem Risikoschwellenwert Extremes Risiko: 76 % – 100 % der Proben über dem Risikoschwellenwert S p o t O n S o n d e r a u s g a b e M y ko t ox i n e

Afla 28% ZEN 77% DON 90% T-2 1% FUM 87% OTA 7%

Afla 10% ZEN 55% DON 82% T-2 2% FUM 72% OTA 14%

Afla 54% ZEN 51% DON 68% T-2 1% FUM 81% OTA 30%

Afla 87% ZEN 22% DON 33% T-2 0% FUM 86% OTA 73%

Ozeanien Gesamtrisiko 17%

18 424

81 936

79

Proben

Analysen

Länder

Co-Kontamination 70%

Südostasien Gesamtrisiko70%

China & Taiwan Gesamtrisiko 85%

Ostasien Gesamtrisiko 60%

Afla 3% ZEN 53% DON 66% T-2 54% FUM 37% OTA 35%

Südasien Gesamtrisiko 86%

Osteuropa Gesamtrisiko 36%

Proben mit Mykotoxin-Kontamination für die jeweilige Region. Gemäß der Legende zeigen die Farben

20%

10%

<Nachweisgrenze

1 Mykotoxin

mehr als 1 Mykotoxin

Anzahl der Mykotoxine je Probe, basierend auf Proben, die auf 3 oder mehr Mykotoxine getestet wurden.

Risikoniveau

Afla 4% ZEN 19% DON 47% T-2 0% FUM 27% OTA 5%

Das Risikoniveau stellt den prozentualen Anteil der Proben in „parts per billion“ (ppb, Teile pro Milliarde) dar, die auf mindestens ein Mykotoxin oberhalb des Risikoschwellenwerts positiv getestet wurden. Ein sehr hohes Risikoniveau weist darauf hin, das > 50 % der Proben möglicherweise ein Risiko für die Produktivität oder die Anfälligkeit für Krankheiten darstellen.

Empfohlene Risikoschwellenwerte für wichtige Mykotoxine in ppb Afla

ZEN

DON

T-2

FUM

OTA

2

50

150

50

500

10

©Copyright BIOMIN Holding GmbH, 2019. Nutzung erfolgte mit Genehmigung.

E i n e Ve rö f f e n t l i c h u n g v o n Ro m e r L a b s ®

7

In Südasien und der Region China/Taiwan ist das Risiko im Zusammenhang mit Mykotoxinen für Nutztiere am größten.

Fortsetzung von S. 5.

Regionale Einblicke

Nutztiere übersteigen. Die Risikoschwellenwerte basieren auf weltweiten praktischen Erfahrungen aus dem Feld sowie auf wissenschaftlichen Studien, die durchgeführt wurden, um die jeweiligen Feldsituationen möglichst genau widerzuspiegeln, wobei für jedes Mykotoxin die sensibelste Spezies zu Grunde gelegt wurde.

Dabei schließen die als Basis verwendeten durchschnittlichen Risikoniveaus weder spezifische, schwerwiegende und lokal auftretende Fälle von Mykotoxinkontamination in Betrieben oder auf Agrarflächen aus, noch erklären sie die negativen Auswirkungen eines multiplen Mykotoxin-Vorkommens.

Die Mykotoxin-Risikokarte beruht auf dem Mykotoxin-Einzelvorkommen. Angesichts der bekannten synergistischen Wirkungen (das Vorhandensein mehrerer Mykotoxine verstärkt die potenzielle Schädigung) werden die Bedrohung durch Mykotoxine für Tiere sowie die subklinischen Folgen (auch eine geringe Mykotoxinkontamination kann die Gesundheit und Leistung der Tiere beeinträchtigen) möglicherweise unterschätzt.

In Südasien und der Region China/Taiwan ist das Risiko im Zusammenhang mit Mykotoxinen für Nutztiere am größten. Beide Regionen sehen sich einem extremen Risiko gegenüber, denn mehr als 85 % der Proben wiesen ein über den Schwellenwerten liegendes Kontaminationsniveau auf. Tabelle 1 bietet einen Überblick über die Anzahl der getesteten Proben, das Vorkommen der einzelnen Mykotoxine, die durchschnittlichen Kontaminationsniveaus und die maximalen Kontaminationswerte. Generell stellen die Fumonisine und Deoxynivalenol weltweit die größte Bedrohung dar, wobei in einigen Proben beide Mykotoxine nachgewiesen wurden.

Europa

Innerhalb dieses Rankings präsentierte sich Europa als eine Region mit mäßigem bis hohem Risiko, wobei über die Hälfte der Proben oberhalb der Schwellenwerte getestet wurden. Mit einem Risikoschwellenwert von 45 % stellte Mitteleuropa eine bemerkenswerte Ausnahme dar. Mit 84 % und einer durchschnittlichen Konzentration von 1031 ppb zeigten

Tabelle 1. Detaillierte Ergebnisse des Mykotoxinvorkommens nach Region

Europa

Anzahl der Proben

Positive Proben (%)

Durchschnitt der positiven Proben (ppb)

Höchstwert (ppb) Asien

Nord Amerika

Naher Osten

T-2

FUM

OTA

4311

3208

2983

2878

176

248000

40700

6062

26204

5912

44

139

602

34

1833

7

12% 5

56% 154

601

4890

10256

53796

17

362

735

Durchschnitt der positiven Proben (ppb)

Anzahl der Proben

Positive Proben (%)

Durchschnitt der positiven Proben (ppb)

33%

1705 8%

130

1008

3

Durchschnitt der positiven Proben (ppb)

27%

161

15% 15

Number of samples

556

Maximum (ppb)

105

Positive (%)

Average of Positive (ppb)

67%

8

402

Positive Proben (%)

34%

1597

13641

Höchstwert (ppb)

Anzahl der Proben

1772

80%

10790

6023

Durchschnitt der positiven Proben (ppb)

65%

3371

280

Anzahl der Proben

Positive Proben (%)

3371

63%

Höchstwert (ppb)

Positive Proben (%)

Quelle: Mykotoxin-Studie von BIOMIN, 2018

8

DON

3360

Höchstwert (ppb)

Afrika

ZEN

4080

Anzahl der Proben

Höchstwert (ppb)

Süd Amerika

Afla

2831

8% 12

5276

41% 61

3212 1%

57% 664

3345 82%

181

123444

461

3001

1596

317

43

2184

10

583

72100

48

316

15

1074

173

65%

926

2021

67

736

552

72%

4336

25%

165

15%

5465 72%

174

87%

37

14427

15

422

552

552

12220

34

72%

126

130724

44%

24880

165

15%

1143

3%

5020 71%

3212

1773

2188

67%

15

1749

5107

48%

26%

2%

3% 13

835 7% 75

158

15% 2

5

552

552

9373

27

74%

6% 5

S p o t O n S o n d e r a u s g a b e M y ko t ox i n e

Photo: Dr. Microbe 69

Proben aus Südeuropa ein sehr hohes Vorkommen von FUM. In Mittel- und Nordeuropa zeigte sich 2018 eine Erhöhung der DON-Werte. Auch die Prävalenz war mit 64 % und einer durchschnittlichen Konzentration von 776 ppb recht hoch. Mit einer Prävalenz von 66 % und einer durchschnittlichen Konzentration von 724 ppb zeigte sich in Nordeuropa ein ähnliches Niveau der DON-Werte. In bestimmten Getreiden wie Weizen, Gerste usw. war das Vorkommen von DON besonders hoch. Hier betrug die durchschnittliche Konzentration 912 ppb.

Asien

In Asien ist das Risikoniveau in diesem Jahr am höchsten. In China treten FUM und DON häufig auf, besonders in Mais. 96 % aller Maisproben waren mit diesen beiden Mykotoxinen kontaminiert. Die durchschnittliche Kontamination mit FUM betrug 3438 ppb, während die DON-Werte durchschnittlich bei 540 ppb lagen. Südasien unterschied sich von den anderen Regionen, da abgesehen von FUM und DON noch andere Probleme auftraten. Aflatoxin war in 44 % aller in Südasien getesteten Proben nachweisbar. Außerdem enthielten 87 % der Proben Aflatoxine, die größtenteils in Fertigfutterproben gefunden wurden. Die höchste regionale Kontamination mit Afla betrug 697 ppb, im Gegensatz zur Kontamination mit FUM, die bei 47.285 ppb lag. Dieser letzte Wert ist zwar hoch, beträgt aber weniger als ein Drittel des letztjährigen FUM-Niveaus.

ZEN wurde in 65 % der getesteten Proben nachgewiesen und war somit das Mykotoxin mit dem dritthäufigsten Vorkommen in den aus Asien stammenden Proben.

Nordamerika

In Nordamerika stellten DON und FUM die größten Bedrohungen für Nutztiere dar. Die DONKontamination in Getreiden stieg von 65 % in 2017 auf 86 % in 2018. Die durchschnittliche Konzentration betrug 1853 ppb. Fumonisine waren in 70 % der analysierten Maisproben vorhanden und mit 3497 ppm war die durchschnittliche Konzentration relativ hoch.

DDGS, ein wichtiges Mais-Teilprodukt, war besonders stark mit DON kontaminiert: Die Prävalenz lag bei 98 % und die durchschnittliche Kontamination bei 1420 ppb.

Für die Fumonisine wurde mit einer durchschnittlichen Konzentration von 3001 ppb ebenfalls ein hoher Wert gefunden. ZEN, Afla und OTA wurden in 34 %, 8 % bzw. 3 % der Proben nachgewiesen, die jeweiligen Durchschnittswerte betrugen 362 ppb, 17 ppb bzw. 13 ppb. Die weltweit höchste Konzentration von FUM wurde in Nordamerika gefunden und betrug 130,724 ppb.

Süd- und Mittelamerika

Die Mykotoxinbelastung in diesen Regionen war ebenfalls hoch. Mittelamerika zeigte ein Risikoniveau von 70 %. Dieser Wert wurde von Südamerika mit 72 % noch übertroffen. In Südamerika war DON in 88 % aller Getreideproben vorhanden und die Tests ergaben hohe Durchschnittskonzentrationen (1949

E i n e Ve rö f f e n t l i c h u n g v o n Ro m e r L a b s ®

ppb). Eine maximale Konzentration von 24.880 ppb wurde nachgewiesen. FUM ist das in dieser Region am häufigsten vorkommende Mykotoxin. Es kontaminierte 86 % aller Maisproben, 100 % der DDGS-Proben und 89 % der Fertigfutterproben. Es konnte sogar eine FUM-Konzentration von 72.100 ppb nachgewiesen werden. Argentinien war ein besonderer Hotspot für das Vorkommen von FUM mit durchschnittlich 4.762 ppb.

In Brasilien zeigt FUM mit 73 % die höchste Prävalenz und eine durchschnittliche Konzentration von 2144 ppb und wurde in 86 % (2.605 pbb) vor allem in Maisproben gefunden. Das Mykotoxin mit der zweithöchsten Prävalenz ist DON (70%, 1073 ppb).

Naher Osten

Mit einem Schwellenwert von 60 % ist das Risikoniveau im Nahen Osten ebenfalls sehr hoch.

Insbesondere zeigt sich eine Zunahme der Prävalenz von FUM, DON und ZEN mit Kontaminationsniveaus von 87 %, 65 % bzw. 71 %. Mit einer Prävalenz von 100 % und einer durchschnittlichen Konzentration von 3.101 ppb ergab sich für Maisproben ein noch düstereres Bild.

Generell stellen die Fumonisine und Deoxynivalenol weltweit die größte Bedrohung dar, wobei in einigen Proben beide Mykotoxine nachgewiesen wurden.

Afrika

Wie schon 2017, war in Afrika DON das häufigste Mykotoxin, das in 77 % aller analysierten Proben nachgewiesen wurde. Die Durchschnittskonzentration betrug 736 ppb. FUM und ZEN traten in 77 % bzw. 72 % aller Proben auf. Das Gesamtrisikoniveau in Südafrika alleine (67 %) war höher als auf dem ganzen Kontinent (65 %).

Schlussfolgerung

Die Analyse der 18.424 Proben im Rahmen dieser Studie unterstreicht zum wiederholten Male die Bedeutung einer kontinuierlichen Überwachung und Messung von Mykotoxinen in Getreiden und Futtermitteln. Nur wenn verlässliche Daten über die Mykotoxinkontamination verfügbar sind, können die Experten der Futtermittelbranche eine Verteidigungsstrategie in Form eines wirkungsvollen Programms zum Mykotoxinmanagement entwickeln und dabei die Tiere vor negativen Auswirkungen von Mykotoxinen auf ihre Gesundheit und Leistung schützen.

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S p o t O n S o n d e r a u s g a b e M y ko t ox i n e

Mykotoxin-Risikobewertung:

Die ganze Geschichte Die Forschungsergebnisse sind eindeutig: Lebens- und Futtermittelhersteller müssen die synergistischen Effekte eines multiplen Mykotoxin-Vorkommens berücksichtigen. Doch wie können wir erreichen, dass eine Probe all ihre Geheimnisse preisgibt? Das LC/MS-MS-Verfahren zur Bestimmung mehrerer Mykotoxine hat sich bereits als vielversprechend erwiesen.

Von Yong Wee Liau, Geschäftsführerin, Romer Labs Asien

E i n e Ve rö f f e n t l i c h u n g v o n Ro m e r L a b s ®

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Häufig werden die aus dem Pilz stammenden Verbindungen dann von der Wirtspflanze weiter modifiziert.

Diese chemische Modifikation stellt eine „Maske“ dar, durch die die wahre Identität des Mykotoxins verdeckt wird.

E

s existieren etwa 400 Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, die als Mykotoxine eingestuft werden und jeweils eigene spezifische, toxische Wirkungen auf Mensch und Tier haben. Nationale und internationale Vorschriften und Empfehlungen decken jedoch in der Regel nur einen kleinen Teil der Mykotoxine ab: Aflatoxine B1, B2, G1, G2 und M1; Fumonisine B1, B2 und B3; Ochratoxin A, Deoxynivalenol, Zearalenon, HT-2-Toxin und T-2-Toxin.

Diese Mykotoxine sind gut erforscht und werden in der verfügbaren Forschungsliteratur häufig behandelt.

Was ist jedoch über die anderen, nicht regulierten Mykotoxine in einer konkreten Probe bekannt? Welche verborgenen Risiken sind mit dem gemeinsamen Vorkommen dieser Mykotoxine verbunden? Wie finden wir heraus, was in einer Probe wirklich steckt? In diesem Artikel wird näher auf die nicht regulierten Mykotoxine eingegangen. Außerdem werden die Auswirkungen des multiplen Mykotoxin-Vorkommens diskutiert und ein Verfahren zur Analyse von Getreide- und Futterproben auf das gleichzeitige Vorhandensein mehrerer Mykotoxine vorgestellt.

Neuartige und maskierte Mykotoxine

Neuartige Mykotoxine sind jene, die aufgrund ihrer zunehmenden Häufigkeit und ihrer toxikologischen Eigenschaften (d. h. ihres Risikopotenzials für Tiere oder Menschen, die mit diesen Mykotoxinen verunreinigte Futter- bzw. Lebensmittel konsumieren könnten) potenzielle Kandidaten für eine Reglementierung sind. Strategien zur Messung und Kontrolle dieser Mykotoxine sind im Entstehen und unterliegen derzeit einer rasanten Entwicklung.

Eine besondere Unterklasse der nicht regulierten Mykotoxine sind die sogenannten „maskierten Mykotoxine“. Während der Infektion geben Pilze eine Vielzahl von Stoffwechselprodukten in die Pflanze ab, darunter die gut bekannten Mykotoxine Deoxynivalenol (DON) und Zearalenon (ZON). Häufig werden die

aus dem Pilz stammenden Verbindungen dann von der Wirtspflanze weiter modifiziert. Diese chemische Modifikation stellt die „Maske“ dar, durch die die wahre Identität des Mykotoxins verdeckt wird.

Für die Wirtspflanze erfüllt die Maskierung jedoch einen wichtigen Zweck, da sie eine ihrer wirkungsvollsten Entgiftungsstrategien darstellt. In der Regel ist ein Glukosemolekül oder ein Sulfat an der Konjugation und Entgiftung beteiligt. Obwohl die maskierten Mykotoxine die Pflanze nicht weiter schädigen, kann ihre Toxizität für Mensch und Tier erneut zum Problem werden, wenn das maskierte Molekül während der Verdauung im Gastrointestinaltrakt von Säugetieren abgespalten wird (Abbildung 1). Das immer häufigere Auftreten und die zunehmende Produktion bestimmter maskierter Mykotoxine, die in der Pflanzenzüchtung beobachtet werden, könnten mit der Entstehung neuartiger, resistenter Arten in Zusammenhang stehen.

Deoxynivalenol(DON)-3-Glucosid zum Beispiel wurde Berichten zufolge mit einer Resistenz gegenüber durch Fusarien verursachten Kopfbrand in Verbindung gebracht. Obwohl Fusarium-resistente Pf lanzen niedrigere DON-Gesamtkonzentrationen aufweisen, wurde in diesen Pflanzen ein höheres DON-3-Glu/DONVerhältnis gemessen, was auf eine erhöhte Produktion des maskierten Mykotoxins hinweist.

Toxizität modifizierter Mykotoxine

„Modifiziertes Mykotoxin“ ist ein weiterer Begriff, der die Veränderungen beschreibt, denen Mykotoxine ausgesetzt sein können. Der Begriff „modifizierte Mykotoxine“ bezieht sich sowohl auf die Modifikation eines Ausgangstoxins durch den Pilz selbst als auch auf die Maskierung des Toxins im Pflanzengewebe. Eine weitere Art der Modifikation findet bei Säugetieren statt, wenn Aflatoxin B1 über verunreinigtes Futter verzehrt und in Aflatoxin M1 umgewandelt wird.

Dieses Aflatoxin M1 gelangt in die Milch laktierender Tiere, über die es anschließend ausgeschieden wird.

Abbildung 1. Spaltung von Deoxynivalenol-3-Glucosid zu nativem Deoxynivalenol während der Verdauung.

H

H3C

H

H

H3C

O

H

O

OH

Verdauung O

O

O HO

OH

CH3

O

HO

O HO

OH

CH3

O OH HO OH Quelle: Romer Labs

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Darüber hinaus können Toxine auch während der Lebensmittelverarbeitung, insbesondere beim Erhitzen und Fermentieren, modifiziert werden, wodurch ihre Prävalenz steigt. Die so modifizierten Mykotoxine können in gesundheitsrelevanten Mengen in Lebensund Futtermitteln enthalten sein.

Von allen Mykotoxinen ist Deoxynivalenol im Hinblick auf häufig beobachtete Modifikationen am besten erforscht. Die modifizierten Formen von Deoxynivalenol lassen sich in zwei Hauptgruppen einteilen: chemisch veränderte und maskierte Formen.

Es gibt zwei Hauptformen von chemisch verändertem Deoxynivalenol, die der Pilz selbst ausscheidet: 3-Acetyl-Deoxynivalenol und 15-Acetyl-Deoxynivalenol, wie sie in Fusarium-kontaminierten Getreidearten vorkommen. Pflanzen sind in der Lage, Deoxynivalenol zu Deoxynivalenol-3-Glucosid umzuwandeln und so zu maskieren. Wie aktuelle Studien zeigen, kann DON-3-Glucosid zwei sulfonierte Formen annehmen: Deoxynivalenol-3-Sulfat und Deoxynivalenol-15-Sulfat.

Welche spezifischen Schäden können modifizierte, maskierte und andere neuartige Mykotoxine verursachen? Modifizierte Mykotoxine können entweder toxischer oder weniger toxisch sein als ihre Ausgangsverbindungen. So können sie beispielsweise aufgrund von Modifikationen eine höhere Bioverfügbarkeit aufweisen. Die toxikologischen Daten zu modifizierten Mykotoxinen sind begrenzt und die aktuellen Forschungsergebnisse und Erkenntnisse über die tatsächlichen Risiken und Auswirkungen dieser Verbindungen sind unzureichend. Dieses Wissensdefizit erschwert die Durchführung einer fundierten Risikobewertung. Gleichwohl liegen Studien vor, in denen das potenzielle Risiko, das modifizierte Mykotoxine für die Lebensmittelsicherheit darstellen, beschrieben wird. Maskierte Mykotoxine können im Verdauungstrakt von Mensch und Tier „demaskiert“ werden. Dabei wird die Ausgangsverbindung freigesetzt und kann ihre toxikologische Wirkung erneut entfalten. Ähnlich verhält es sich mit anderen neuartigen Mykotoxinen: Es liegen nur begrenzte toxikologische Daten vor, was die Festlegung von Vorschriften und Grenzwerten für maximal tolerierte Dosen (MTD) zum Schutz von Mensch und Tier vor möglichen Gesundheitsrisiken erschwert.

Da sich modifizierte Mykotoxine hinsichtlich ihrer chemischen Reaktionen anders verhalten als die jeweiligen Ausgangsmykotoxine, können sie im Rahmen der Routineanalyse leicht übersehen werden. Die derzeitigen Nachweismethoden für regulierte Mykotoxine in Lebens- und Futtermitteln beinhalten kein routinemäßiges Screening auf diese modifizierten Mykotoxine, da diese nicht unter die gesetzlichen Vorschriften fallen. Eine Untersuchung mithilfe der Standardmethoden ergibt möglicherweise Kontaminationswerte unterhalb der gesetzlichen Grenzwerte, während Kontaminationen durch modifizierte Mykotoxine unentdeckt bleiben. Dieses Ergebnis ist zwar korrekt, aus toxikologischer Sicht würde die Integration von modifizierten Toxinen (z. B.

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als Summenparameter) jedoch zuverlässigere Daten für die Risikobewertung liefern. Zusammengenommen weisen alle diese Fakten auf die potenziellen Gefahren für die menschliche Gesundheit hin, die von modifizierten Mykotoxinen ausgehen. Verordnungen über Höchstgehalte für modifizierte Mykotoxine sowie für andere neuartige Mykotoxine sind derzeit Gegenstand von Diskussionen in der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit.

Multiples Mykotoxinvorkommen

Da wir nun wissen, dass mehrere Mykotoxine von ein und demselben Pilz produziert werden, ist es nicht verwunderlich, dass die synergistische Wirkung eines multiplen Mykotoxinvorkommens zunehmend Gegenstand der Forschung geworden ist. Die in den letzten Jahren im Rahmen mehrerer unabhängiger Studien gesammelten Daten zeigen, dass landwirtschaftliche Rohstoffe oft mit mehr als einem Mykotoxin kontaminiert sind. Die toxikologischen Wechselwirkungen von Mykotoxinen sind in der Regel synergistisch. Das bedeutet, dass die toxikologische Wirkung von zwei oder mehr in derselben Probe vorhandenen Mykotoxinen höher ist, als die Summe der toxikologischen Wirkung der einzelnen Mykotoxine.

Allerdings kann das gemeinsame Auftreten mehrerer Mykotoxine auch additive oder, seltener, antagonistische Effekte haben, durch die sich die Mykotoxinwirkungen gegenseitig aufheben.

Diese synergistischen Effekte sind von Tier zu Tier unterschiedlich und können sehr komplex sein. In Abbildung 2 sind sowohl die synergistischen, als auch die additiven Effekte bestimmter Mykotoxine bei Geflügel dargestellt. So ist zum Beispiel Aflatoxin B1 (AFB1) ein reguliertes Mykotoxin, das synergistische Effekte mit Diacetoxyscirpenol (DAS) und Cyclopiazonsäure (CPA), beides nicht regulierte Mykotoxine, und eine additive Wirkung mit DON, einem weiteren regulierten

Modifizierte Mykotoxine können entweder toxischer oder weniger toxisch sein als ihre Ausgangsverbindungen.

So können sie beispielsweise aufgrund von Modifikationen eine höhere Bioverfügbarkeit aufweisen.

Abbildung 2. Synergistische (rot ) und additive (gestrichelt) Wirkungen von Mykotoxinen bei Geflügel.

AFB1

AFB1

FB1

MON MON

D

CPA

FA OTA

DON

DAS T-2 Toxin

FA Citrinin

OTA ZEN

FB1

Quelle: BIOMIN

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Die toxikologischen Wechselwirkungen AFB1

Toxin

1 vonFB Mykotoxinen

Abbildung 3. Synergistische (rot) und additive (gestrichelt) Wirkungen von Mykotoxinen bei Schweinen.

AFB1

MON

sind in der Regel

Abbildung 4. Zusammenfassung der Schritte zur Etablierung einer Multi-Mykotoxin-Analyse auf der Basis von LC-MS/MS.

AFB1

Methodenentwicklung

DON

CPA

synergistisch. Das bedeutet, dass

FA

DAS

DON

die toxikologische

Wirkung von zwei oder mehr in FA derselben Probe Citrinin

vorhandenen Mykotoxinen höher ist als die Summe der toxikologischen Einzelwirkung der Mykotoxine.

OTA

T-2 Toxin ZEN

FB1

Quelle: BIOMIN

Mykotoxin, zeigt. Beim Schwein hat das gemeinsame Vorkommen von AFB1 und DON oder DAS dagegen keine bekannten Auswirkungen, wie in Abbildung 3 dargestellt. Stattdessen zeigt AFB1 bei dieser Tierart synergistische Effekte mit T-2-Toxin und Ochratoxin.

Im Folgenden wird auf die Vorteile, Grenzen und die Entwicklung der Methode unter Berücksichtigung der chemischen Vielfalt der Analyten und der Bandbreite der zu testenden landwirtschaftlichen Rohstoffe eingegangen.

Multi-Mykotoxin-Analyse

Analytiker setzen zunehmend auf LC-MS/ MS (Flüssigkeitschromatographie/TandemMassenspektrometrie) als wichtigste Methode zum Nachweis mehrerer Mykotoxine. Analysemethoden auf Basis der LC-MS/MS haben sich in den letzten zehn Jahren zu einer leistungsstarken und hochmodernen Messtechnik für die qualitative und quantitative Analyse von Mykotoxinen entwickelt. Dieses Verfahren ermöglicht die gleichzeitige Bestimmung eines breiten Spektrums von Mykotoxinen verschiedener chemischer Familien mit einer einzigen Messung: Saure (Fumonisine), basische (Mutterkornalkaloide), polare (Moniliformin, Nivalenol) und apolare Verbindungen (Zearalenon, Beauvericin) können alle gleichzeitig mit LC-MS/MS quantifiziert werden.

Weitere Vorteile dieser Methode sind ihre hohe Empfindlichkeit und Selektivität sowie die Möglichkeit, zusätzliche Informationen über das Masse/Ladungs-Verhältnis (m/z) und die FragmentIonen der untersuchten Analyten zu erhalten. Die Etablierung einer Multi-Mykotoxin-Methode auf Basis der LC-MS/MS erfolgt in der Regel in drei Phasen: Methodenentwicklung, Methodenoptimierung und Methodenvalidierung. Diese Schritte und Parameter sind in Abbildung 4 zusammengefasst. Während der Methodenentwicklung und -optimierung sollten die Qualität und Zuverlässigkeit der Ergebnisse

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DON

Methodenoptimierung

• LC- und MS-Parameter • Verfahren zur Probenvorbereitung • Stabilitätsprüfungen • Selektivität FB1 • Arbeitsbereich

• Nachweisgrenze (LOD = Limit of Detection), Quantifizierungsgrenze Methoden-T-2 Toxin (LOQ = Limit of Quantitation) validierung • Linearität, Genauigkeit • Präzision, Robustheit • Matrixeffekte, Wiederfindung

sorgfältig geprüft werden. Zu diesem Zweck müssen Analysestandards von höchster Qualität mit zertifizierter Konzentration und ausgewiesener Reinheit verwendet werden. Für bestimmte Analyten sind analytische Standards jedoch nicht kommerziell erhältlich. In diesen Fällen kann unter Umständen auf Standards, die sich noch in der Entwicklungsphase befinden, zurückgegriffen werden. Alternativ kann mit verfügbarem, aber weniger gut charakterisiertem Material gearbeitet werden.

Methodenentwicklung

Bei der Entwicklung einer Methode auf Basis der LC-MS/MS müssen die MS- und LC-Parameter sowie die Probenvorbereitung optimiert werden.

Um die MS-Parameter zu optimieren, sollte jede Zielverbindung als reiner Analysestandard direkt in das Massenspektrometer injiziert werden. Dies ermöglicht die Auswahl des besten Ionisationsmodus (positiv oder negativ) und der am häufigsten vorkommenden Vorläufer- und Produkt-Ionen.

Außerdem können in dieser Phase die chromatographischen Bedingungen angepasst werden: Die geeigneten mobilen Phasen und Gradienten sowie die optimale chromatographische Säule müssen ausgewählt werden.

Viele Multi-Mykotoxin-Methoden verwenden einen „Verdünnen-und-Injizieren-Ansatz“: Dies bezieht sich auf die gängige Praxis, den Probenextrakt zu verdünnen, bevor er in das LC-MS/MS injiziert wird. Im Rahmen der Probenvorbereitung kann auch ein Reinigungsschritt durchgeführt werden. Das Mykotoxinmuster darf jedoch während der Probenreinigung nicht verändert werden, d. h. es muss sichergestellt sein, dass keins der gesuchten Mykotoxine von der für die Aufreinigung verwendeten Methode beeinflusst wird.

S p o t O n S o n d e r a u s g a b e M y ko t ox i n e

LC/MS-MS ermöglicht die gleichzeitige Bestimmung eines breiten Spektrums von Mykotoxinen verschiedener chemischer Familien mit einer einzigen Messung.

Analytiker setzen zunehmend

Methodenoptimierung

Zur Optimierung der Analysemethode gehören die Stabilitätsprüfung der Analyten in Standardlösungen und Proben sowie der Nachweis der Selektivität und die Bestimmung des Arbeitsbereichs.

Methodenvalidierung

Die Methodenvalidierung ist Voraussetzung für verlässliche Ergebnisse in Bezug auf Vergleichbarkeit und Rückverfolgbarkeit. Die Methodenvalidierung muss für jeden Zielanalyten in allen erforderlichen Matrizen separat durchgeführt werden. Typische Leistungsmerkmale, die bei der Validierung einer quantitativen Methode bewertet werden sollten, sind Nachweisgrenzen (limit of detection — LOD), Quantifizierungsgrenzen (limit of quantitation — LOQ), Linearität, Präzision, Selektivität, Robustheit, Genauigkeit, Matrixeffekte und Wiederfindungen. Die validierten Matrizen für von Romer Labs eingesetzte Multi-Mycotoxin Analysis 50+ sind Weizen, Mais, Schweinefutter und Silage.

Matrix-Effekte treten auf, wenn der Ionisationsprozess der Zielanalyten durch Matrixkomponenten beeinträchtigt wird. Matrixeffekte können einen erheblichen Einfluss auf die Quantifizierung von Mykotoxinen haben. Daher ist es unbedingt erforderlich, die Matrixeffekte zu bestimmen und auszugleichen.

Erreicht werden kann dies durch die Bestimmung der Wiederfindungsraten, gefolgt von einer mathematischen Korrektur der Ergebnisse um diesem Wert. Auch durch eine matrixangepasste Kalibrierung oder durch die Verwendung von isotopenmarkierter interner Standards können Matrixeffekte ausgeglichen werden. Letzteres E i n e Ve rö f f e n t l i c h u n g v o n Ro m e r L a b s ®

führt zu äußerst präzisen und zuverlässigen Ergebnissen bei gleichzeitig minimalem Zeitund Kostenaufwand pro Probe.

Das Verfahren kann durch dotierte Konzentrationsreihen des Analyten in Mehrfachmessung validiert werden.

Wenn verfügbar, sollten die Ergebnisse mit zertifizierten Referenzmaterialien bestätigt werden. Darüber hinaus ermöglichen matrixangepasste Referenzmaterialien und die Teilnahme an Laborvergleichsuntersuchungen eine zusätzliche Qualitätssicherung.

auf LC-MS/MS als wichtigste Methode zum Nachweis mehrerer Mykotoxine.

Fazit

Die Entwicklung von Multi-Mykotoxin-Methode auf Basis der LC-MS/MS zeigen großes Potenzial, das Risiko von multiplen Mykotoxin-Vorkommen frühzeitig zu erkennen. Je mehr wissenschaftliche Erkenntnisse zu den synergistischen Effekten verschiedener Mykotoxine, einschließlich neuartiger und maskierter Mykotoxine, zur Verfügung stehen, desto wichtiger werden validierte Analysemethoden, die diese Mykotoxine innerhalb einer einzigen Probe nachweisen können.

Eine Vielzahl verschiedener Parameter, die die Qualität und Zuverlässigkeit der Ergebnisse der LC-MS/ MS-Methode maßgeblich beeinflussen, muss für die jeweiligen Analyten in einer gegeben Matrix jeweils separat berücksichtigt werden. Darüber hinaus sind angesichts der chemischen Vielfalt der Mykotoxine Kompromisse bei der Methodenentwicklung erforderlich. Außerdem stellt die große Bandbreite der landwirtschaftlichen Rohstoffe sowie die unterschiedlichen Konzentrationsbereiche und Häufigkeitsverteilungen weitere Herausforderungen bei der Methodenentwicklung und -optimierung dar.

Nichtsdestotrotz werden neue Multi-MykotoxinMethoden dringend benötigt und es ist davon auszugehen, dass die technologischen Fortschritte in diesem Bereich die Anwendung dieser Verfahren weiter forcieren werden.

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Ihr Exemplar von Spot On

Multi-Mykotoxin-Analyse 50+

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