Issuu

Feljegyzések a karanténból: Emlékeim a coronavírus-kutatás hőskorából Lomniczi Béla* A visszaemlékezés az 1970-es években végzett kutatómunkám azon epizódjával kapcsolatos, amikor jellemeztem a coronavírusok prototípusának, a csirke fertőző bronchitis vírusának genomját. Ennek eredményeképpen sikerült az akkor még csak elektronmikroszkópos megjelenése alapján összetartott coronavírus-csoportot elhelyezni a radikálisan új szemléletű, Baltimore-féle genetikai szempontú osztályozásban (1971). Annak fényében, hogy az elmúlt évtizedekben a coronavírusok evolúciós térhódításának – újabban emberben ̶ lehettünk tanúi, talán nem érdektelen visszatekinteni kutatásuk olyan periódusára, amikor a taxonómiai besoroláshoz szükséges, sőt „életstílusukat” leíró adatokat is megismertük. Megpróbáltam az ismertetést és terminológiát az akkori ismeretek keretében tartani s azt is érzékeltetni, hogy hol tartott a korabeli virológia. A narratívában a száraz tudományos tényeket társadalmi és személyes vonatkozásokra való utalással fűszereztem. (Egyet nem tettem: nem deklaráltam, hogy megnyílt az út a vakcinakészítés előtt...) Remélem, hogy kiderül, akkor is volt tudományos élet...

(A) Röviden a coronavírusokról (1) A természetellenes gazdasűrűség a coronavírus-fertőzések melegágya A II. világháború előtt lényegében csak egyetlen betegséget, a csirkék fertőző (infectious) bronchitisét (FB, olykor: IB) ismerték, amelynek kórokozóját később ide sorolták. A betegséget 1931-ben írták le az USÁ-ban, ahol az üzemiszintű csirketartás első számú „közellensége” volt. Ez legalább 3 tényezőnek volt tulajdonítható: (a) Kontagiozitása (terjedőképessége) minden más ismert fertőzését felülmúlta, beleértve a mostani emberi járványok kórokozóit is. (b) Az FB-vírus (FBV vagy IBV) egymagában olyan komplex pathogenitást mutatott, mintha egyszerre több kórokozó fertőzte volna meg a gazdát: a légzőszervi tünetek mellett egyes vírustörzsek a vesét károsították, de az igazi csapás a „termelésre”a petevezető megbetegedése volt, aminek következtében a tyúkok tojástermelése lezuhant, és amit deformált, törékeny (tehát felhasználásra alkalmatlan) tojások rakása kísért (1. kép). *Akkor: MTA Állategészségügyi Kutató Intézet, Budapest

(c) Mire a ’60-as évek közepére világszerte elterjedt, már tucatnyi antigéntípus létezésére is fény derült. (d) Meg kell viszont említeni, hogy már az ’50-es években sikerült gyengített vírustörzsből élő vakcinát készíteni, amivel a gazdasági veszteségeket kordában lehet tartani. A ’60-as évekre több emlős fajban is fedeztek fel morfológiailag hasonló („IBVszerű”) vírusokat. Ezek elnevezése az általuk okozott kórképek jelentős változatosságára utal. A teljesség igénye nélkül: sertésben Transmissible gastroenteritis (TGEV) és Haemagglutinating encephalitis virus (HEV); újszülött borjakban: Neonatal calf diarrhoe coronavirus (NCDCV); macskában: Feline infectious peritonits virus (FIPV); egérben: Mouse hepatitis virus (MHV). Emberben: Human coronavirus (HCV, légzőszervi tüneteket okoz) és Human enteric coronavirus (HECV). „...ami a növényben megnyilvánul, az a névben le van írva.” ̶ vallotta Linné (1778). (2) A coronavírus rendszertani csoport születése és elnevezése Eleinte ezek a vírusok többféle „leánykori néven” is futottak. Az „IBV-like (IBVszerű)” kézenfekvő lehetett mindaddig, amíg azt nem implikálta, hogy egy-egy állatjárvány azzal kezdődött, hogy maga az IBV „ugrott át” csirkéről az emlős fajokra, amiről persze szó sem volt. De illették őket a „myxo-like” névvel is, a vírus-részecskéknek (virionok) az influenza-vírushoz való hasonlósága miatt; utóbbiak akkor a „myxovírus” csoportba tartoztak. (A myxo kifejezés a nyálkahártyát bevonó nyákanyaghoz, mucinhoz való affinitásra utalt). Elektonmikroszkópban mindkét csoport tagjai 100-200 nm (nanométer, a mm milliomod része) átmérőjűek, lipidtartalmú burkuk van, amiből 10, ill. 20 nm hosszú nyúlványok állnak ki. Az IBV-szerű vírusoké azonban nemcsak hosszabbak, de végeiken bunkó-szerűen ki is szélesednek, miközben az ezekhez tartozó nyél a régi felvételeken gyakran nem is látszott. Ami igen, az a fénylő foltok koszorúja (corona, latin) egy-egy nagyobb, világos pacniként feltűnő virion körül (2. kép).

Volt olyan anekdota is, hogy a napfogyatkozáskor feltűnő fényes napkorona ihlette volna az elnevezést (3. kép). Végeredményben mindegy, bár a korona, mint fejdísz aligha, úgyhogy alighanem helytelen koronavírusnak magyarítani. A coronavirus nevet 1968-ban fogadta el a vírustaxonómiával foglalkozó bizottság, a csoport prototípusának pedig az IBV-t jelölték meg.

(B) A vírusok osztályozása „genetikai rendszerek” alapján A víruskutatás nem jelentéktelen hányada rendszerezéssel is foglalkozott: tulajdonképpen még a legegyszerűbbnek látszó, a gyakorlati diagnosztikai célokat szolgáló rutineljárások is ilyennek tekinthetők, amennyiben pl. egy-egy új vírus izolálását követően ennek azonosítása, rokonsági viszonyainak megállapítása vagy éppen csoportba sorolása volt a cél. Ehhez számos információt vettek figyelembe: a gazdához való viszonyt (melyik állatfajban milyen betegséget okozott), a virion tulajdonságait [morfológiáját (méret, szerkezet), genomjuk/nukleinsavuk kémiai (DNS vagy RNS) és fizikai (egyszálú vagy kétszálú molekula) tulajdonságait.] Ezek felhasználásával a ’80-as évek elejére az élővilág (baktériumok, növények és állatok) vírusait összesen 59 családba vagy ennek megfelelő kategóriába sikerült beosztani. Közülük 17-ben voltak DNS-, 42-ben pedig RNS-genommal rendelkező vírusok. A gerinces állatok és az ember vírusai 19 csoportban oszlottak meg, amelyek közül 13, RNS-vírusokat foglalt magában. (1) Baltimore osztályai (1971) Tehát amíg a csoportba sorolás a rutindiagnosztika körébe került, addig a kategóriákat fémjelző genomok kémiai és fizikai tulajdonságainak meglepő változatossága (lásd fent is) a vírus családnál magasabb rendszertani kategóriák létrehozása után kiáltott. Egy erre vonatkozó javaslattal állt elő David Baltimore, amerikai virológus (33 éves), 1971-ben; szerinte minden víruscsoport besorolható a természetben addigra megismert hatféle „genetikai rendszer” valamelyikébe (1. ábra). A genetikai rendszer, némi egyszerűsítéssel, arról tájékoztat, hogy egy adott vírusgenom (pl. egyszálú RNS) milyen lépések révén fejezi ki a saját szaporodására vonatkozó genetikai információt a fertőzött sejtben. Még szélesebb értelemben itt a vírus életstílusáról van szó, arról, hogy azzal a genetikai anyaggal, ami rendelkezésére áll, hogyan reprodukálja, pontosabban reprodukáltatja magát a gazdasejtben, hogyan találja fel magát a természetben, ami fennmaradásának biztosítéka.

A sejtes lények világban csak egyetlen genetikai rendszer létezik: a 2-DNS → mRNS formula (m: messenger; I. osztály). Ezt a vírusok is alkalmazzák, de ezen kívül még öt másikat is „feltaláltak” maguknak. Lenyűgöző, hogy ezek mindegyikével kiszolgálható az életben maradáshoz nélkülözhetetlen két alapvető genetikai folyamat: a genom megsokszorozódása (replikáció) és információjának tovább adása (transzkripció), amely vírusspecifikus mRNS-ek képződéséhez vezet. Az 1. ábrán is feltűnik, hogy valamennyi osztályban az „információs végtermék” mRNS s minden információs nyíl ebbe az irányba mutat. Innentől viszont az program fehérjébe „fordítása” (transzláció) és maga a fehérjeszintézis már egységes módon történik a sejt apparátusa révén. A vázolt megközelítés egyébként azért jelentett új szemléletet a vírustaxonómiában, mert különböző vírus-csoportokat volt képes összefogni, mondhatni, család feletti rendszertani kategóriákba, ami a rendszerezés legkevésbé triviális műveletének számít. (2) Az egyszálú RNS-genomok biológiailag nem egyenértékűek Az 1. ábra másik érdekes üzenete (és Baltimore felismerése) az, hogy az osztályok felében (IV., V. és VI.) 1-RNS (egyszálú) genomot találunk, de ezek genetikai értéke/minősége nem ekvivalens, mert információt kifejező stratégiájuk három „különböző világ” (de legalábbis osztály) létezését feltételezik. A továbbiakban csak az említettekkel foglalkozom, minthogy a coronavírus is ezek valamelyikébe kellett, hogy tartozzon. Az alábbiakban az osztályok genetikai stratégiája közti lényes eltéréseket érintem csak. (i) A IV. osztályban a mRNS nukleotid-szekvenciájával és információ-tartalmával megegyező RNS-genom található: megegyezés alapján ezt pozitív polaritásúnak nevezik (1-RNS+). Amint sejtbe kerül, rendhagyó módon, transzlációval kezd (mRNS→fehérje), az első fehérjetermékek pedig RNS-d-RNS-polimerázok (d: dependens, ezek RNS-minta alapján csinálnak új RNS-

fonalakat: transzkripció.) Az ütem lenyűgöző: egyetlen sejtben pár ezer új genom-RNS szintetizálódik percenként. Még le sem váltak a szülőmintáról, már csomagolódnak is az ugyancsak általuk programozott tokfehérjékbe. Így 3-4 órán belül már új virionok nemzedéke szabadul ki a sejtből vagy annak romjaiból. Sikeres sejtfertőzés hajtható végre vírusból kivont RNS-sel is: RNS-ük önmagában is fertőző. Hogy ennek milyen evolúciós jelentősége lehet, nem világos, hisz’ utóbbi természetes körülmények között nem fordul elő. Ismertebb tagok: poliovírus, és sok növényi vírus. (ii) Az V. osztály genomja ezzel szemben negatív polaritású (1-RNS--), mert szekvenciája komplementere saját mRNS-ének (ahogy egy forma is komplementere egy szobornak, de azért mindkettő használható egy másolat készítéséhez). A sejtbe jutva önmagában semmit sem ér, mert a sejtnek nincs RNS-másoló vagy átíró enzimje, hogy kisegítse. De láss csodát, kiderült, hogy maga a virion tartalmaz vírusspecifikus traszkriptázt (ez a mRNS-készítő enzim, ami mRNS-t ír át a genomról). Láttuk, hogy a IV. osztály vírusai ezt az enzimet hátrahagyják a haldokló sejtben, hisz’ nem szorulnak rá, mert genomjuk önmagában is mRNS-értékű. Az V. osztály vírusai azonban ”kénytelenek” a vírusrészecskébe csomagolva magukkal vinni, mert a fertőzőzés elején csak ez tud mRNS-t átírni a genom-RNS-ről (transzkripció). Utóbbiak itt is kódolnak RNS-d-RNS-polimerázt, ami a genom replikációját intézi. Már az a tény is tabudöntögető volt, hogy a virion egy anyagcsere-enzimet hurcol magával, mert addig a vírust „annyira élettelennek” tartották, hogy definíció szerint sem tartalmazhatott efféle enzimet, tehát senki nem is keresett ilyent egy vírusrészecskében. Baltimore megtette és nyert... Ismerős képviselői: rhabdovírusok (veszettség vírusa) és az influenzavírusok. Érdekesség: az előbbi genomja egyetlen folyamatos RNS-szál, utóbbié azonban 8 szegmentben (!) létezik, ergo mindegyik darabnak saját transzkriptáza és mRNS-e van, mégis elég jól elboldogul a fertőzött sejt citoplazmájában bekövetkező „molekula-tumultusban”! (iii) A VI. osztálybeli vírusok életstílusának megismerése, mondhatni, megrázkódtatást idézett elő a kor biológiai felfogásában. Arról van szó, hogy a megelőző években H. M. Temin (Wisconsin-i Egyetem) 1-RNS genommal rendelkező, daganatot okozó vírusokkal (oncovírusok) fertőzött sejtek anyagcseréjének vizsgálata során arra a következtetésre jutott, hogy a virionban 1-RNS formában létező vírusgenom a sejten belül úgy viselkedik, mintha 2DNS-vírus lenne. Mi több, ez a provírusnak nevezett képlet a sejt genetikai anyagába is beépül, és a sejtosztódás során vele együtt replikálódik. Az állítás elfogadhatatlannak tűnt, mert eszerint a genetikai információ RNS-ről DNS-nek adódna át, vagyis ellenkező irányban ahhoz képest, mint amit F. H. C. Crick un. centrális dogmájá „megenged”. Utóbbi szerint a természetben a genetikai információ átadás kötelező iránya: DNS→DNS és/vagy RNS→fehérje. Sokáig csak közvetett kísérleti bizonyítékai voltak, ezért szenzáció számba ment, amikor Temin és tőle függetlenül Baltimore (akkor még Salk Intézet, California), csirkeill. egér-sarcomavírusban RNS-d-DNS-polimeráz aktivitást mutatott ki. (Cikkeik egymás mellett jelentek meg, a Nature 1970 jún 27-i számában.) Ez már közvetlen bizonyíték volt arra, hogy a természetben az RNS nemcsak egy másik RNS-nek vagy fehérjének, de DNS-nek is adhat át genetikai információt. Az enzim neve: reverse transcriptase (fordított irányban átíró enzim). Az akkori idők legnagyobb biológiai felfedezéseiként értékelhetjük s már 1975-ben Nobel-díjat kaptak. A csoportot később a retrovírusnak nevezték el. A retrovírus-genom még

egy furcsasága: nem egy, hanem 2 db 1-RNS példány épül be a virionba. Ezek bal (5’) végük egy rövid szakaszán egymáshoz kapcsolódnak, mint az A-betű két szára. Rengeteg állati tumorvírus, de a HIV is ide tartozik.

(C) Zsengék az ’első hazai’ kategóriában (1963-68) (1) Miért éppen egy coronavírus? (i) 1962 őszén elnöki ösztöndíjasként kezdtem az MTA Állategészségügyi Kutató Intézetében. Amikor 1963-ban először kísértem akkori főnökömet, Derzsy Domokost, egyik kiszállására (akkoriban ez volt a kutatóintézet hasznosságának egyik értékmérője), a csirkeistállóban ott várt a nyugatról behurcolt, nálunk még egészen új betegség, a fertőző bronchitis. Ideális téma volt egy kezdőnek, mert egy csomó ’első hazai’ jelzővel ellátott teljesítést lehetett kipipálni: a betegség első hazai előfordulása (Derzsyvel), majd a hazai elterjedtség felmérése, a hazai kórokozó izolálása és azonosítása, ismeretterjesztő/továbbképző cikkek megjelentetése (lásd az Publikációkban: 1-6. közlemények). Minden későbbi alapkutatási témámat fiatalkori gyakorlati élmény ihlette, így ezt is. Voltaképpen, az ember úgy érezhette, hogy ezek teljesítésével válthatja meg a belépőjegyet ahhoz, hogy később majd alapkutatásnak tekinthető vizsgálódásokat is végezhessen. Tekintettel szakmánkra, ez eléggé ésszerű megközelítésnek tűnt, és csak sajnálhatja, ha valaki bármelyiket is kihagyta. Ekkora váltásnak azonban akkoriban nem nagy realitása volt. Egyrészt azért sem, mert a ’60-as években még virágkorát élte az a doktrína, miszerint intézetünk egy amolyan gyorsszerviz, amelynek fő feladata a magyar állategészségügy égető kérdéseinek megoldása a „nagyüzemesedő” mezőgazdaságban. Sőt ez volt a távlati tudományos tervek vezérmotívuma is; a kutatási témák inspirálója tehát az óriási veszteségeket okozó fertőző betegségek. (Mintha ezek örökké velünk maradnának...) Mindamellett hálásnak kell lennünk eltartónknak, az Akadémiának és államunknak, ha elnézi, hogy olykor kíváncsiságból vagy devianciából a felszín alá is próbálunk benézni, és ennek gyümölcseit alapkutatásként próbáljuk feltálalni. (Ami a szervezeti szabályzatban egyébként le volt fektetve.)

(ii) Másrészt, amikor 1968-69-es skóciai tanulmányutamon (Department of Biochemistry, Marischal College, University of Aberdeen) először találkoztam a molekuláris biológia gyakorlatával, hamar ráébredtem, hogy ennek módszertani, de a kutatási anyagok beszerzésének anyagi és logisztikai feltételei az én életemben idehaza aligha valósulnak meg. Ezért ha a jövőben ilyen módszereket akarok igénybe venni, célszerűbb lesz egy erre alkalmas laborba vinnem a témát. [A skóciai tanulmányút alatt ez meg is történt: nemcsak megengedték, hogy ottani főtémám (interferon) mellett a baromfipestis vírus (NDV) virulenciáján

dolgozzak, de az egyik PhD-hallgató, ebből is írt disszertációt.] A vázolt megközelítés azért sem volt irreális, mert pénzt (meghívást) szerezni ösztöndíjra nem volt lehetetlen (olykor könnyebbnek tűnt, mint hazai hozzájárulást kapni a kiutazáshoz).

(D) A coronavírus-genom jellemzése (1975-76) Ilyesmik járhattak a fejemben, amikor 1974-ben megpályáztam egy Wellcomealapítványi ösztöndíjat, amiből a kutatási költségek kivételével, saját magamat finanszírozhatom. Az előkészítő levelezés során jeleztem, hogy a coronavírus genom jellemzésével is szeretnék foglalkozni. Ez nem volt rendkívüli felvetés az ingyen munkaerőért cserébe. Az akkori tanulmányutakról, motivációkról és eredményességről, sok érdekes megtudható Braun Tibor: Vándorbottal a tudományos kutatásban c. könyvéből (Typotex Elektronikus Kiadó Kft., 2018). Korábbi tapasztalatom alapján nem volt kétséges, hogy Aberdeen-i főnököm, Derek Burke, tanszéke lenne a legalkalmasabb hely, aki időközben az óriási tempóban fejlesztett Warwick-i Egyetemen (Coventry mellett) a Biological Sciences vezetője lett. Többféle vírustéma futott a tanszéken, sokféle módszerrel és oktatási intézmény lévén, könnyen lehetett módszerekhez, információhoz jutni. Ráadásul kifejezetten bátorították nemcsak a kollaborációt, de meglepő módon, még új téma felvetését is. Pechemre, ő szabbatikál-útra készült az USÁ-ba, bár jelezte, hogy tanulmányutam második felében várnak Warwick-ban.

(1) A Központi Orvoskutató Intézetben, Londonban Kicsit fejest ugrottam az ismeretlenbe, amikor úgy határoztam, hogy az északlondoni (Mill Hill) National Institute for Medical Research-ben kezdek 1975 szept elején. A virológiai osztályon (a nálam 1 évvel fiatalabb) John Skehelnek, akit ekkor neveztek ki a WHO World Influenza Centre igazgatójának, volt egy influenza-kutató csoportja, amelyben bőven akadt tennivaló. Főemberével, Alan Hay-jel, a hallgatag skóttal, még Aberdeenben ismerkedtem meg. Még ha „tárt karokkal fogadtak” is ̶ ők is Burke „post-doc” beosztottjai voltak a ’60-as években ̶ nem feledkeztem meg a ”nincsen ingyen ebéd” elvről. Így beszálltam influenza-témájukba, és előkészületeket tettem az FBV-munkára. (1a) Amit tudtunk a coronavírus genomjáról... Vizsgálataim megkezdéséig 6 cikk jelent meg a témáról; ezekben az egyetlen biztosnak tűnő adat az volt, hogy a genom egyszálú RNS (1-RNS). Méretéről semmi biztos, feltehetően azért nem, mert gyakran darabokban találták, viszont az egyik dolgozatban arról írtak, hogy a genom negatív polaritású (lásd V. osztály). Miközben a laborban küszködtem, figyeltem a könyvtárban, hogy nem

jelenik-e meg valamelyik lapban egy közlemény, miszerint „mindent megcsináltak”. Aggodalmam nem volt alaptalan: a Nature október 9-i számában jött egy rövid cikk, amitől meghűlt bennem a vér. Egy angol kutatócsoport (Comptonból) a sertés coronavírus (TGEV) genomjáról megállapította, hogy ultracentifugáláskor (UC) azonos ülepedési és hődisszociációs tulajdonsággal rendelkezik az RNS-daganat-vírusokéval, azaz két példányban van benne az 1RNS (lásd a VI. osztályt fent). Skehel átfutotta a cikket és megnyugtatott, hogy ez „kuka” (igaz, ő egy másik 4-betűs szót használt)... Nekem még szokni kellett ezt a fajta „tekintélytiszteletet.” Ami azt illeti, volt mire szerénytelennek lennie: amit az influenzavírus sejtreceptorhoz kötődéséről tudunk, az jórészt az ő munkásságának köszönhető. Anglia talán legtermékenyebb virológusa lett. Később a >600 fős kutatóintézet igazgatója, majd a Royal Society tagja és titkára. A lovaggá ütés már csak hab volt a „brit tortán”.

(1b) ... és amit fel kellett deríteni A transzkriptáz-reakciót rendszeresen használtuk, ezért az influenzatéma „oldalvizén” különféle vírusokra optimális reakciókeverékeket állítottam össze annak vizsgálatára, hogy van-e az FB-virionban ilyen enzim. Meg is jegyezték, hogy a világon a „legjobb helyen” vagyok ezekhez a kísérletekhez (valóban, 1971-ben Skehel az elsők közt mutatta ki a transzkriptáz előfordulását az influenzavírus-részecskében). Szóval a feladat leegyszerűsödött: ha találok enzimet az FBV-ben, az negatív szálúnak (V. osztály) minősül, ha nem, a genomnak fertőzőképesnek kell lennie (IV. osztály). A harmadik lehetőség, az oncornavírusokkal való hasonlóság (VI. osztály) külön ellenőrzése fel sem merült, mert a fent említett Nature-cikk metodikai tévedésen alapult. [1c] A coronavírus virionjában nincs RNS-transzkriptáz (6) Ami azt illeti, a coronavírus őket nem igazán érdekelte („your stupid virus” ̶ hangzott el néha). Ehhez képest lovagiasan tűrték, hogy hetente több száz előkeltetett tojást használjak el az FBV szaporításra a WHO influenza-központ 4000-es keretéből, miközben nekem mindössze 300 fontom volt kutatásra. Vagy tíz, egymástól függetlenül készült FBV-preparátumot is teszteltem, de egyik esetben sem detektáltam enzim-aktivitást. Így amikor egy laborbeszámolón nem hangzott el kritika, ezt a vonalat le is zártam azzal a konklúzióval, hogy az FBV genomja negatív polaritású nem lehet, ergo az V. osztály kizárva. Ezzel leszűkült a választás a IV. osztályra. Kezdetnek nem rossz, gondoltam...

(1d) Nem tudok kivonni ép genom-RNS-t az FBV-ből De aztán beütött a krach...Közben persze a genom-RNS izolálásával és tisztításával is foglalkoztam, ezúttal inkább csak az irodalomra támaszkodva, mert lassan (alighanem túl későn) jöttem rá, hogy ebben a tekintetben tán mégsem a legjobb helyen vagyok. Az történt, hogy a hagyományos RNS-izolálási módszer (SDS-detergens, fenol, kloroform, meg ilyenek) ennél a vírusnál csődöt mondott, jóllehet a kontrollként beállított NDV és Sindbis-vírus RNS-preparátumai tökéletesek voltak. UC-analízissel ugyan látszott, hogy az FBV RNS-e ezeknél jóval nagyobb, de a legtöbb preparátumban sajnos a csúcs degradált (töredezett) RNS-darabokkal volt elcsúfítva, ahogy ezt mások cikkeiben is láttam. Ezt így nem sok értelme volt folytatni. Lassan kifogytam az ötletekből, meg a lelkesedésből is. (1e) Ekkor egy „mentőangyal” érkezett a kanadai Guelph-i Egyetem kutatója, Dobos Péter (a legendás Dobos Károly, a Yad Vashem kitüntetett Pesthidegkúti református lelkész fia) személyében, aki meghívottként birnavírus kutatásairól számolt be egy intézeti szemináriumon. Ezt a csoportot ő sorolta be a III. osztályba s rendezte taxonómiai státusát. Megnyugtatott, hogy a probléma, amibe belefutottam, nem ismeretlen jelenség, a megoldás pedig a proteinase K nevű „mindenevő” fehérjebontó enzim, ami szemben a kémiai eljárással, előbb emészti meg a víruspreparátumban esetleg visszamaradó RNS-bontó enzimet (az RNáz-t), mint utóbbi a vírus-RNS-t. Nem akarta elhinni, hogy az RNS-munkában nem használunk proteináz K-t, noha már 2 évvel korábban leírták. Hogy ne legyek igazságtalan: az RNS-kutatók körében volt egy mondás, miszerint „az univerzum fő közege az RNáz”. Mindenesetre olyankor ez el is hangzott, amikor meglátták legújabb RNS preparátumom UC-eredményét...

(2) A Warwick-i Egyetemen, ahol mellém szegődött a szerencse A (számomra legalábbis) új módszert már csak a Warwick-i Egyetemen próbálhattam ki, ahová a nyári szabadságok elején érkeztem. Itt szerencsére nem volt senki, aki lebeszélhetett volna róla s teljes időmet saját témámnak szentelhettem. (2a) Témám hamar feléledt tetszhalott állapotából, köszönhetően még olyan látszólag egyszerű személyi tényezőknek is, mint pl. régi skóciai asszisztens barátom (Fred Troup) segítőkészsége, aki itt már főtechnikussá lépett elő, és ebben a minőségben a rendelések és izotóp-felhasználás felelőse (és ura). Napokon belül minden rendelésem megérkezett, és szinte „dúskálhattam” az

izotópokban is. [Örök hitelem volt nála, amiért 1969- ben, a diplomások közül egyedüliként, elmentem a „stag party”-jára (legénybúcsú)]. De persze sorsdöntőnek az bizonyult, hogy Burke (még Amerikából!) kért 3 hónap ösztöndíjat a Wellcome Reserch Fundation-tól, ami nem terhelte a magyar keretet. Én meg e fedezet birtokában engedélyt a tartózkodás meghosszabbításra. Ekkor a háttérben egy bizonytalan kimenetelű levelezés vette kezdetét ̶ ui. ez egy új ösztöndíjnak számított! ̶ köztem és az intézet igazgatója között, aztán utóbbi és az Akadémia között, aztán az MTA és az OÖT (Országos Ösztöndíjtanács) között, majd mindez visszafelé. A nyári ügyintézés eredménye egy aug 25-i keltezésű levél, ami „zöld utat adott a maradáshoz”, jóllehet mire ez megérkezett, már útban kellett volna lennem hazafelé. Az egész alapja a sárga (szolgálati) útlevél, ami egy zseniális találmány volt annak biztosítására, hogy jogilag akkor sem vagy külföldön, ha fizikailag már kint vagy... Muszáj megemlítenem, hogy a hosszabbítás kérését gyakran a „22-es csapdája” elvén kezelték. Az illetékesek szemében ez a disszidálási szándék diagnosztikai jele volt, aminek közvetlen kiváltója viszont a hosszabbítás megtagadása; az intézetünkből kint maradtak esetében legalábbis. Remélem, hogy ma senki sem tudja követni ezt a logikát.

(2b) Warwick-i hétköznapok és egy sikeres kollaboráció Valamennyien egy nagyméretű közös laborban dolgoztunk, ami ‘azonnali kérdések’ lehetőségét biztosította, ha valakinek problémája akadt. A tanszék fő témája az interferon volt Burke vezetésével (pár évvel később az elsők között klónozták az interferont), emellett kisebb csoportok különböző vírusok szaporodásával foglalkoztak. Az egyik szintén egy pozitív-szálú víruscsoporton, a Togavírusokon dolgozott. (Rovarok közvetítette kórokozók között ide tartozott az általam markerként használt Sindbis-vírus és ennek egy közeli rokona, a Semliki forest virus, SFV, ami viszont az ő modelljük volt). A pozitívszálú vírusok eltérő al-stratégiákkal szaporodnak, és ennek egy hasznos kollaboráció lett a következménye. A „legtalálékonyabb” a kicsi, de nem primitív poliovírus (Picornavírusok, név: „apró RNAvírus”, de azért nem annyira: genomja 2.5 millió dalton), aminek genomjáról nemcsak RNS-replikáló enzimek, de szerkezeti fehérjék is közvetlenül fordíthatók át fehérjévé a sejtben. Azonban ugyanezt a logikát keresve a Togavírusok 4.5 millió daltonos 1-RNS+-genomjának működése még évekig homályban maradt, és csak a ’70-es évek közepén oldódott meg. Lényege: hiába van pozitív szál a genomban, és hiába vannak rajta a vírus szerkezeti fehérjéjének génjei, ezeket a sejt nem ismeri fel. Egy dolog valamit kódolni, és más dolog annak közvetlen hozzáférhetősége (transzláció) a sejt számára. További dilemma, hogy a genomon csak egyetlen gén van, ami közvetlenül innen fordítható le; szóval a vírusnak nagyon „észnél kell lennie”, hogy a sejttel melyik fehérjét szintetizáltatja elsőként. Kiderült, hogy ez egy RNS-transzkriptáz enzim, amivel már lehet mit kezdeni. Ez ui. csinál egy genomnál kisebb, un. szubgenomikus mRNS-t, amiről a vírus szerkezeti fehérjéi is

szintetizálhatók. Ha belegondolunk, a szubgenomikus nem más, mint a messenger messengere...).

Valamikor a nyár végén tartottam egy laborbeszámolót. A bemutatott eredmények némi felbolydulást okoztak. Nem csoda: azzal jöttem elő, hogy az ő modellvírusukénál közel kétszer hosszabb genomú pozitívszálú vírus is létezik. Az egyik hozzászóló, Ian Kennedy, mindjárt fel is ajánlotta, hogy ha tudnék neki készíteni nagy tisztaságú, P32-izotóppal erősen jelölt RNS-preparátumot, akkor alávetné egy olyan analízisnek, amellyel további adatokat lehet nyerni a molekulasúlyra vonatkozóan. (Ez volt az un. T1-RNáz rezisztens oligonukleotida analízis, a kor RNS-ujjlenyomatozása. Lásd a 3c-ben.) Bár az egyik laborasztalnál egymással szemben dolgoztunk, sosem beszéltünk, így aztán ekkor tudta meg, hogy mivel is foglalkozom. Mivel a személyes érintkezés általában a délelőtti (rettenetes) kávé- és délutáni teaszünetre korlátozódott csak, amikor általában „versenyt hallgattak” egymással, én sem tudtam, hogy ő a szubgenomikus mRNS-koncepció egyik kidolgozója, impresszív publikációs háttérrel (olyan lapokba közölt, mint a Journal of Molecular Biology). Aztán kitudódott, hogy otthon egy roncs Bentleyt restaurál, és meghívása van (az akkor már Nobel-díjas) Baltimore-hoz a Harvardra. Végül a Kaliforniai Egyetemre ment, és megfejtette a coronavírus szaporodási stratégiát, amelynek kiszolgálásához 6 (!) szubgenomikus mRNS-re van szükség. Ja és Kaliforniában jó pénzért eladta a Bentleyt...

[3] A coronavírus genomja a leghosszabb fertőző RNS a természetben (6, 7) Egy kutató számára alig van nagyobb élmény a laborban, mint amikor egy eldöntendő (igen/nem) típusú hipotézisre sikerül (na jó: neki is tetsző...) választ kapnia: ilyen volt számomra a genom fertőzőképességének kimutatása. Ez rögtön, a legelső kísérletben sikerült. 18-19 napos csirkeembrók veséjéből készült sejttenyészetet „transzfektáltam” FBV-RNS-sel (lásd lejjebb). Amikor pár nappal később észrevettem a mikroszkópban a coronavírus okozta citopatogén hatást, csak egy asszisztens fiú árválkodott rajtam kívül a laborban, így neki mutattam meg. Bevallása szerint még sosem látott vírusokozta elváltozást, sőt ilyen nevű vírusról sem hallott. Így, nyilván azt sem értette, hogy mire fel ez az érzelmi kitörés... A mikroszkópos vizsgálat során az ember alig hitt a szemének; az IBV-törzs (Beaudette, lásd az F/4-ben), amivel dolgoztam, 60 °C-on 3 percen belül elpusztul (ez azt jelenti, hogy 100 millió virionból egy sem marad életben), ugyanakkor a belőle kivont RNS a 80 °C-ot is vígan túléli. Vagy: amíg az FBV kizárólag csirkesejteket tud fertőzni, az RNS-sel egérsejtek is átprogramozhatók s egyetlen ciklus erejéig termelnek vírust.

Az címben foglalt állítást tucatnyi kísérlet eredményei és ismétlések alapján lehetett és kellett igazolni. De szerencsére, a proteináz K-val kombinált RNSextrakció jelentős javulást eredményezett az RNS-preparátumok minőségében.

Miért olyan „nagy ügy” az RNS-izolálás? Az RNS a természetben nem csupaszon fordul elő, mindig védi valamilyen fehérje a környezetben előforduló RNázoktól. Az FBV genomot az 50 ezer daltonos nukleoprotein (N) burkolja (lásd az E. fejezetben), nagyon-nagyon szorosan. Úgy tűnt, a kémiai (fenolos) deproteinizálás nemcsak tökéletlen volt, de ennek során sérült is az RNS-szál. A fehérjével szennyezett RNS analízise pedig fals eredményeket produkált, amint ezt a coronavírusról közölt cikkekben is látni. Tovább rontotta a helyzetet a denaturálás (lásd hátrább), mint a szál épségét ellenőrző kezelés. (Lásd hátrább.)

A kísérletek egyébként két irányban folytak. (3a) Mindenekelőtt minden kétséget kizáróan kellett bizonyítani, hogy az FBVRNS önmagában is fertőzőképes. Vagyis amikor a sejtbe ’kényszerítés’ után beindul a vírus szaporodása, ez csakis az RNS-nek tulajdonítható, nem pedig a preparálást (elvben) túlélő maradék virionoknak. Transzfekció és a mRNS anatómiája. Elmondható, hogy minden fertőző RNS egyúttal mRNS is (még ha némi megszorítással is; lásd a szubgenomikus változatot), de persze nem minden vírus mRNS fertőző (a szubgenomikusok sem). Természetes körülmények között a fertőző változat nem játszik szerepet a vírus terjedésében, így egészséges sejthez adva az nem is veszi fel. Csak úgy lehet bejuttatni, ha „lenyomjuk a sejt torkán”: hipertóniás sóoldattal előkezelt („szomjaztatott”) sejthez DEAE-dextrán (egy órásmolekula) jelenlétében hozzáadva, a sejt bekortyolja az RNS-t is, és beindul a fertőzés.

A mRNS mindkét végén sajátos vegyület-csoportok vannak [grafikus ábrázolásakor az 5’ (bal)végen metilezett (ez a cap, sapka), míg a 3’ (jobb)-végen akár 100-200 adenilsav is ismétlődhet egymás után: ez a poli-A „farok”]. Ennek jelenléte is igazolhatja egy genom fertőzőképességét. A két vég tehát nem felcserélhető, és a szekvencia mellett ezek is jelzik a genom polaritását.

Különböző eljárásokkal kimutatott poli-A végződés jelenléte az RNS 3’-végén szintén megerősítette, hogy valóban pozitív polaritású szállal van dolgunk (lásd a 4. képen is). (3b) Az idő jelentős részét azonban a molekulasúly és az RNS fizikai állapotának meghatározása kötötte le. Ennek két oka is volt. Egyrészt minél hosszabb egy RNS, annál hajlamosabb a degradálódásra. Másrészt a centrifugálás alatt az ülepedés nem arányos a molekulára ható centrifugális erővel, hanem attól is függ, hogy mennyire van kinyújtva, azaz megszabadítva a másodlagos szerkezettől (denaturálás).

Hidrodinamikai problémák. Egy szemléletes hasonlat valamennyire érzékelteti a problémát: ha mondjuk egy 10 kg-os kihúzott kötelet több méter magasból ledobunk, kisebb kárt okoz, mintha gubancba összefogva engedjük el, mert utóbbi gyorsabban zuhan. A vázolt aerodinamikai jelenséghez hasonló hidrodinamikai elv érvénysül vizes közegben való ülepedéskor is. Ennek alapján egy kritikus azt is mondhatja, hogy pl. a 2. ábrán az FBV-RNS nem azért jutott el a centrifugacső aljának közelébe, mert nagyobb a tömege, azaz a molekula hosszabb, mint a többié, hanem azért, mert eltérő másodlagos szerkezete révén tömörebb gubancot képez, ezért gyorsabban haladt lefelé a viszkózus cukoroldatban.

Úgyhogy számos denaturálási kísérletet kellett elvégezni (centrifugálások és agargélben futtatás durva denaturálószerek jelenlétében, RNS-ek olvadáspontjának összehasonlítása) annak bizonyítására, hogy az FBV-RNS hidrodinamikai sajátosságai nem térnek el a választott markerekétől, ezért utóbbiak alkalmasak molakulatömegének megbecsülésére, ráadásul extrapolálással (2. ábra). Az ezzel való bíbelődés nem volt felesleges: egybehangzó eredményeink szerint az FBV-genom molekulasúlya 8 millió dalton. A denaturálások eredményei egyúttal azt is bizonyították, hogy a genom egyetlen és folyamatos poliribonukleotida szál (a VI. osztálybeli onkornavírus genomhoz való hasonlóságot pedig „műtermék” lehetett az angol kísérletben). (3c) A molekulasúly meghatározása egyedi nukleotidszakaszok segítségével Létezik egy mondás, hogy rendkívüli állítás rendkívüli bizonyítást igényel. Ezért Kennedyvel kollaborációban még egy különleges módszert bevetettünk a molekulasúly meghatározására.

A mai RNS-szekvenálás „ősi’ változata az un. T1-RNáz rezisztens oligonukleotid analízis volt, amellyel részleges szekvencia-adatokhoz lehetett jutni. Egy érdekes „mellék-terméke” az eljárásnak, hogy meg lehet vele becsülni egy RNS nukleotidjeinek számát . [Részletesebb kifejtését lásd az F-fejezet (iii)-ban. Enélkül ez is nehezen érthető.} A képen a futtatás iránya lentről felfelé mutat, ennek megfelelően az 1. számú folt tartalmazza a T1-gyel felszecskázott” RNS leghosszabb szakaszát: ez halad a leglassabban. Szívószállal kicsíphető a folt és meghatározható a benne levő nukleotidok száma, ami az 1. sz.-ban: 41. (A 2.-ben: 39, a 7.-ben: 19, a 6.-ban: 13). Ugyancsak megmérhető a bennük levő, és a futtatás előtti összRNS radioaktív beütéseinek száma.

Ezekből egyszerű hármas szabállyal kiszámítható, hogy az FBV genom legalább 23 200 nukleotidot tartalmaz (a 7 számozott folt adatainak átlaga), ami példátlanul hosszú RNS általában, de 1-RNS+-nek különösen. Ez 7.9 millió dalton molekulasúlynak felel meg. A 4. kép bal alsó sarkában vizuálisan is feltűnik a csóvaszerű poli-A szakasz. Az oligonukleotida ujjlenyomatozás „új magasságokba emelte” az RNS-tisztítás nimbuszát: amikor Kennedynek átadtam az első mintát, benyúlt a szekrényébe és kivett egy üveget azzal a megjegyzéssel, hogy a neki készülő anyagot még azzal is kezeljem! Nem tett jót annak a meggyőződésemnek, hogy már mindent tudok a tökéletes RNS preparálásáról...

A genom-szekvenálási korszak beköszönte természetesen korrigálta az általunk közölt értéket: kb. 20%-kal ’növelte’ a genom hosszát, 30 000 nukleotidre, amely kb. 10 millió daltonra számítható át. Így még érthetetlenebb, hogy a ’80-as évek közepéig megjelent cikkek miért ragadtak le a kb. 6 milliós értéknél. Szóval a hidrodinamikai módszerek inherens torzításait ismerve, kár, hogy akkor nem fogalmaztunk bátrabban: legalább 8 millió...

(E) Az FBV szerkezeti fehérjéi (1979) Február végétől ismét a Warwick-i Egyetemen voltam, ezúttal egy 3-hónapos EMBO (European Molecular Biology Organization) ösztöndíjjal. Az FBV fehérjéinek vizsgálatában szerettem volna kissé elmélyedni, mert idehaza Nagy Évával (akkor gyakornok volt nálam) azt találtuk, hogy az FBV szerotípusok az envelop (E) fehérje mobilitása alapján két csoportba oszthatók. Molekulasúlya a Massachusetts törzsekben 30 000, míg az összes többi szerotípusban 28 000 dalton. (A szerotípusokról bővebben az F-fejezetben.) Ez tipikusan olyan észlelet volt, ami megérdemelte, hogy alaposabban is utánanézzünk, ne csak a jelenséget írjuk le egy rövid cikkben (9). Abban az időben a vírusfehérjék analízise két fő technikán nyugodott: vírustisztítás ultracentrifugálással (UC), majd szeparálás poliakrilamid-gél-elektroforézissel (PAGE).

Ezeket már itthon is tudtuk csinálni, de izotóp-jelölések nélkül. Hogy mekkora a különbség köztük, azt demonstrálja a 3. ábra két baloldali futtatási sávja (a vándorlás iránya fentről lefelé): a kénizotóppal (S35) jelölt fehérjék autoradiográfiás képe (negatív filmen) és ugyanezen gél (Coomassie kékkel való) festés után.

A másik két sáv a Mass és a Connecticut szerotípus fehérjeképének különbségeit mutatja: mivel ezek J131-gyel jelölt preparátumok, amely eljárás csak a felszíni fehérjéket jelöli, semmi kétség, hogy a burok (envelop, E) kis glükoproteidjének (gp30/gp28) szintjén van a diagnosztikai értékű eltérés. Ezen a gélen az is látszik, hogy a nyúlványfehérje (régen: peplomer, P, ma: spike, S) egy része a 94 000 daltonos pozíció rovására inkább a gél tetejének közelében marad (a p170-nél tűnik fel), ui. hajlamos molekulapárokká aggregálódni. Végül a vírus legtömegesebb fehérjéje az RNS-t védő nukleoprotein (N), ami összeépülése után foszforilálódik (Pp50). A téma a tervezettnél kissé jobban „beszippantott”. Annyi egymásnak ellentmondó adat volt az irodalomban az emlős coronavírusok strukturális fehérjéiről is, hogy érdemes volt egyszer s mindenkorra tisztázni a különböző vírustisztítási módszerek hatását az FBV fehérjeképére. Emellett az is kiderült, hogy még az sem mindegy, hogy tojáson vagy embrióvese sejttenyészeten szaporítottam-e a vírust. Módom volt vizsgálni a fehérjék poszttranszlációs modifikációit (szénhidrátgyökökkel való kapcsolódást, foszforilációt stb). Ebbe a témába John Morser szállt be, aki többéves fehérjemunkájának tapasztalatait osztotta meg. A cikk (10) a tudományt nem rengette meg, viszont a következő évek vírus-munkáihoz felbecsülhetetlen segítséget jelentettek az ezzel a munkával szerzett tapasztalatok.

(F) Az FBV-törzsek változatossága és járványok követése (1980) Április végétől ismét 2 hónapot töltöttem a Warwick-i Egyetemen, ezúttal a Royal Society ösztöndíjával. A látogatás során különböző járványokból izolált FBV törzseket vetettünk alá genetikai analízisnek annak megállapítására, hogy az RNS-ujjlenyomati technika segítségével folytatható-e járvány(ügyi) nyomozás.

Az akkori módszer a bonyolult hangzású és a rendkívül munkaigényes „T1-RNáz rezisztens oligonukleotida analízis” volt. (1) Előbb a módszerről. A mai szekvenálás elődjeként létezett egy szellemes eljárás, amellyel részleges szekvencia-adatokhoz, ez által pedig vírustörzs azonosítási lehetőséghez lehetett jutni. A T1-RNázt egy penészgombában fedezték fel s jelentőségét az adja, hogy az RNS-t egy guanozin (G) gyöknél vágja el. Mivel a 4 nukleotid (ntd) egyike sem szabályosan oszlik el egy molekulán, hanem véletlenszerűen, a T1-enzimmel felaprított darabok különböző hosszúságúak, de általában nagyon rövidek (pár ntd) lesznek. Működési eleve: minél hosszabb egy oligonukleotid (oligo: kevés), annál valószínűbb, hogy két különböző RNS-molekulán csak akkor fordul elő azonos méretben, ha azok közeli rokonok. A fragmentumok méret szerinti megoszlása révén tehát törzseket lehet megkülönböztetni és egy adott törzset azonosítani. Az izotóppal jelölt fragmentumokat egymásra derékszögben (2 dimenzióban) futtatják gélelektroforézissel, majd negatív filmre fektetve exponálják. Így kapják a 4. és 5. képen látható fragmentum-eloszlásokat. A képek alsó részén a különálló foltok (bennük ~5-50 ntd-t tartalmazó RNS-szakaszokkal) térbeli eloszlása annyira egyedi, hogy ujjlenyomat-szerűen jellemez egy-egy törzset. A zöld vonal feletti régióban (5. kép) látható összefolyó foltok viszont nem alkalmasak azonosításra, mert csak pár ntd-nyi rövid szakaszokat képviselnek. (További információk a D, 3c-ben is.) Elmondható, hogy a technikai kivitelezés a rengeteg buktató miatt legalább annyira művészet, mint tudomány... A Warwick-ban megszokott hozzáállásnak megfelelően szerencsére Jon P. Clewley, a tanszék egyik post-doc-ja is beszállt a vizsgálatokba, ami alapvető volt. (Enyhe túlzással ő a 2-dimenziós „ gélfuttatások Paganini”-je volt. Most visszanézve a Google Scholarban, világviszonylatban is a legszebb RNS-ujjlenyomatokat produkálta.)

(2) Szerotípusok felhasználása járványok követésére Egy vírustörzs szero- vagy antigén-típusának meghatározása rutineljárás a legegyszerűbb diagnosztikai laborban is, csak specifikus ellenanyag-tartalmú vérsavó (szérum) kell hozzá, és ezek reakcióját kimutató valamilyen teszt. Adott típuson belül azonban egyes törzsek megkülönböztetése már nehezebb, míg egyedi felismerésük szinte lehetetlen immunológiai megközelítéssel. Pedig járvány-nyomozáshoz, azaz egy bizonyos vírustörzs követéséhez, gazdaállományok vagy területek között, pont erre lenne szükség. Mégis nézzük meg, mit lehetett kezdeni az akkori módszerekkel. Abban az időben az FBV-nek már legalább 8 szerotípusa volt ismert világszerte. Tulajdonképpen még a szerotípus meghatározásával is tudtak valamennyire következtetni a fertőzés eredetére és/vagy területi terjedésére. Pl. az 5 amerikai antigéntípusból az ’50-es évektől a Massachusetts lett a leggyakoribb Európában is, nyílván a tenyészanyag európai importja miatt. De azért volt kivétel: pl. az általam ’67-ben izolált első hazai törzs, meglepő módon, a sokkal ritkább Connecticut csoportba tartozott (5), a Mass csak később került elő. Vagy: a ’70-es évek közepére Új-

Zélandon (NZ) és Ausztráliában egymástól megkülönböz-tethető területspecifikus antigéntípusokat találtak, noha a megelőző évtizedben utóbbiból is exportáltak tenyész-csirkét/tojást Új Zélandba. A szerotípusok genetikai hátteréről azonban semmi sem volt ismert, ezért előbb ezt vizsgáltuk meg: összesen 7 szerotípus 1-1 reprezentáns törzsét. Ezek RNSujjlenyomati képe között olyan nagy volt a különbség, hogy a zöld vonal alatti „specifikus régióban” (az 5. képen) átfedő foltokat nem is lehetett azonosítani (a képeket nem mutatom). Ez nem volt nagyon meglepő, hisz’ egy nukleisavat analizáló módszertől el is várható, hogy az túlszárnyalja a fehérjék antigéntulajdonságain alapuló eljárások érzékenységét. Az azonban világossá vált, hogy a genetikai módszer még ilyen korlátozott formában is „túl sokat tud”: differenciálóképessége egyedi törzsekig terjedhet, ezért szerotípusspecifikus RNSujjlenyomat bizonyára nem is létezik. Már csak azért sem, mert egy-egy szerotípus is genetikailag diverzifikálódott törzsek gyűjteménye lehet. Ennek néztünk utána a következőkben.

(3) Genotípusok a járvány-nyomozásban Jól ismert, hogy az RNS-vírusok genomja a másolás során egyes helyeken ntd-szubsztitúciót ’szenved el’ (az RNS- replikáznak ui. nincs javító- mechanizmusa), vagy evolúciós szempontból nézve ’ebben az áldásban részesül’, ezért tudnunk kellett, hogy ezek egyáltalán manifesztálódnak-e az ujjlenyomati képeken.

Ennek felderítésére a világon leginkább elterjedt Mass-szerotípusból több törzset hasonlítottunk össze, hogy legalább vizuális benyomást szerezzünk a genom divergenciájának előfordulásáról és mértékéről. Kiderült, hogy a 6 vizsgált törzsnek 4-féle, egymástól jelentősen különböző ujjlenyomati képe van (5. kép). Ez evolúciót jelent akcióban: a törzsek genomjai ugyan jelentős ntd-diverzifikálódást („szétfejlődést”) mutatnak: már legalább 4 genetikai változat született, de antigén-szerkezetüket tekintve (még) egyben (azonos csoportban) vannak. Ugyanakkor három törzs (baloldali sor) ujjlenyomata annyira hasonló, hogy csak egy-két folt erejéig találunk köztük különbséget; ezek egyazon genetikai változat különböző variánsainak tekinthetők. (4) Epidemiológiai következtetések az egyes FBV-törzsek történetével való összevetés alapján Most, hogy nevük is van és definiáltuk a szerotípuson belüli genetikai variabilitáson alapuló egységeket (evolúciós fokozatokat és leszármazást is tükröző törzs-csoportok), az ezeket alkotó törzsek egyedi története segítségével legalább kommentálhatjuk az epidemiológiai vonatkozásokat. Ne felejtsük el, hogy az evolúció megközelítés egyik fontos szempontja a „honnan származik?” kérdésre felel, vagyis az ős, az ősi állapot megismerésére. (4a) A Beaudette-variánsok azonossága Az US-Bea/37-et F. R. Beaudette, a legnevesebb amerikai (baromfi) mikrobiológus izolálta 1937-ben s e törzsben „tisztelhetjük” minden idők legelső coronavírus izolátumát. Persze ez nem jelenti azt, hogy evolúciós értelemben ez lenne az „ős-coronavírus” vagy akár csak az FB-ősvírus. Már az ’50-es évekre több 100-szor passzálták át előkeltetett tyúktojáson, melynek következtében az eredetileg az embriót csak megbetegítő törzs annyira virulens lett, hogy a 910-napos embriót 30 órán belül megölte. Ezzel szinte „kiadaptálódott a természetből”: ui. még fiatal csirkét sem lehet vele megfertőzni, sőt ellenanyag termelődésre késztetni sem, így csak laboratóriumban tartható fenn. Embrióból készült epithel-típusú sejttenyészetben (vese- és tüdőhámban) óriássejt indukálása közben kitűnően szaporodik, fibroblaszt sejteket viszont már nem támadja meg. Nyilván eredetileg gyengíteni akarták a törzset vakcina készítése céljából, de jelentősen „túlpasszálták”. Az embrióölő változat viszont az FB szerodiagnosztika, a 3 nap alatt eredményt adó neutralizációs próba alapja lett.

Az US-Mass C/55: az egyik első FB-vakcina volt; a kanadai Connaught Laboratórium terméke. Mint azóta is minden élő vakcinát, ezt is sorozatos tojásoltással gyengítették (attenuálták). Azonban erről is kimutatták később, hogy csirkében néhány passzázs után fokozódik pathogenitása (revertál). A GB-927/71-jelű törzset Angliai FB-járvány során izolálták a ’60-as évek végén. Következtetések: A járványtörténet ismeretében még az ilyen korlátozott „feloldóképességű” módszerrel kapott genetikai adatok is „szárnyakat kaphatnak.” (i) A specifikus (az 5. képen a zöld vonal alatti nagy és különálló) foltok eloszlása annyira hasonló, hogy semmi kétség afelől, hogy mindhárom törzs azonos leszármazási vonalhoz tartozik, és egy bizonyos mezei izolátum, a (legkorábban izolált vírus) Bea valamelyik felmenőjének leszármazottai. (ii) A hipergyors evolúció hírében álló RNS-vírus genetikai stabilitása elég nagy ahhoz, hogy egyedi vírus leszármazási vonalakat lehessen azonosítani. Ilyenek az ezek által fenntartott járványvonalak is. E variánsok izolálási történetéből az állapítható meg, hogy van olyan pathogén törzs, ami utódai révén, érdemleges genetikai változás nélkül, több mint 30 éven át volt jelen különböző kontinenseken fellépő csirke járványokban. (iii) A Bea-törzs identitása több száz tojáspasszázs alatt sem változott meg. Feltehetően a magzatburkok hámsejtjei nem igazán hatékony szelekciós környezet/háttér. (iv) A 927-jelű angliai törzs eredetét tekintve vagy a Bea egyik felmenőjének (még mezei változatának) járványról-járványra egzisztáló leszármazottja, vagy a Mass-C-vakcina alkalmazása is besegített terjesztésébe: nem volt eléggé attenuált, ezért itt-ott revertálódott virulenssé. (4b) A Massachusetts-szerotípusba tartozó változatok különbözősége Az aligha meglepő, hogy a különböző szerotípusok reprezentáns törzseinek RNSujjlenyomatai nem hasonlítanak egymásra, de hogy még egyazon szerotípusba tartozó törzseké (genetikai variánsoké) is eltérhetnek, az figyelemre méltó. A virulens US-Mass41/50-jelű törzset (1950-ben izolálták) mindig is a Massszerotípus prototípusának (reprezentánsának) tekintették, mind antigéntípusát, mind pathogenitását tekintve. Ebben a minőségben un. ráfertőző (challenge) törzsként használták vakcinakipróbálási kísérletekben. Hogy virulenciáját magasan tartsák, időnként csirkéből-csirkébe oltották. A gyengített NL-H120/56 a leginkább elterjedt és legsikeresebb FB-vakcina.

Hollandiában fejlesztették ki elég korán, de még ma is használják. Tulajdonképpen egy páros oltóanyag egyik komponense: a másik a H52. (A H nem Hollandiát jelenti, hanem a csirkefarm tulajdonosának kezdőbetűje, ahonnan a törzset izolálták.) A számok a tojás-passzázsokat jelzik, és két virulencia- fokozatot jelentenek. A H120-szal (a gyengébbel) vakcináznak először, a H52-vel (az erősebbel) pár héttel később.

A GB-140/74 egy angliai mezei izolátum. Következtetések. Valójában a szerotípuson belüli genetikai heterogenitás felismerése még egy különleges járványtani helyzet tisztázását teszi lehetővé: ha Mass-típusú törzset izolálnak FB-esetből, genetikai vizsgálattal tisztázható, hogy mezei járvány-törzsről, vagy az állományokban perzisztáló (akár mert visszavadult) vakcinatörzs reizolálásáról van-e szó. (5) Evolúciós fejlemények Mindamellett a vírus-RNS primer szerkezetében (ntd-eloszlás), majd az antigéntulajdonságokban bekövetkező változások jelentős evolúciós fejleménynek számítanak egy vírus történetében, mert ezek a sikeres fennmaradási stratégia elemei. Nézzük meg, hogy ’ megy ez a gyakorlatban. Mass-törzsek uralta területen és korszakban a gazdában felbukkanhat Mass-specifikus ellenanyagokkal gyengébben reagáló mutáns, mely utódai révén elterjed a gazdapopulációban (immunszelekció), miközben antigén-sajátosságait tekintve egyre messzebb „sodródik” a típustól, amelyből kivált. (Az influenza-variánsok „sokat tudnának mesélni” arról, hogy ezt miként csinálják...) Egy új szerotípusig történő fejlődés azonban több évszázados folyamat eredménye lehet. A már említett ntd-szubsztitúciók szelekció-semleges környezetben (pl. sejttenyészetben) is folyamatosan keletkeznek. A szerkezeti mutánsok felbukkanása fokozódhat, ha nő a vírusciklusok száma, sorsukat pedig befolyásolja a gazdasejt heterogenitása, mert ezekkel a szelekció lehetősége jelenik meg. Ideális feltételeket teremt erre a nagy és állandóan cserélődő állatpopuláció, amely eltérő fogékonyságú (immunitással rendelkező) egyedekből áll. És ekkor fenotípusos változás talán még a kimutathatóság szintje alatt sem jelent meg.

Új antigénvariánsok megjelenésének lesz egy fontos negatív következménye: adott típusból készített vakcina általában nem vagy viszonylag gyengébben véd egy másik típus fertőzése ellen. Mégis, praktikus okok miatt évtizedekig csak Mass-típusú vakcinákkal védekeztek Európában is (lásd H120 és H52), mert a megfigyelések szerint bizonyos fokú védelem heterológ típusokra is kiterjed. Az idegen típus elleni védettség még erősebb lehet, ha a csirkék nem vakcinától, hanem átvészeléssel jutottak immunitáshoz. Az USÁ-ban előforduló 5 szerotípust reprezentáló törzsek különbségei arra utalnak, hogy az egyedi ujjlenyomati képek által jellemzett genotípusok a

csirketartás körülményei között (talán évtizedek vagy évszázadnyi idő alatt) divergáltak az észlelt genetikai távolságba. Mindezek ellenére a fentiek fő üzenete, hogy a térben vagy időben jól elkülönült járvány-eseteknek általában egyedi törzse lehet, és ezek mozgása nyomon követhető. ***** Az ábrákat és képeket a nagydoktori disszertációmból (13) vettem. Senkit sem ismerek, akinek volna ilyen érzékletesen sikerült volna megragadni a leszármazás lényegét, mint a Veress Miklós (1942-2019) költőnek a Történelem c. versében:

Publikációk (1) Derzsy D., Lomniczi B.: A tyúkok fertőző bronchitisének előfordulása Magyarországon Magyar Állatorvosok Lapja 1966, 21, 194-196 (2) Lomniczi B.: A tyúkok fertőző bronchitise (szemlecikk) Magyar Állatorvosok Lapja 1966, 21, 221-227 (3) Lomniczi B.: A tyúkok fertőző bronchitise (ismeretterjesztő) Magyar Mezőgazdaság 1966, 21 (38. sz.), 18-19 (4) Lomniczi B., Stipkovits L.: Szerológiai vizsgálatok a fertőző bronchitis hazai elterjedtségének megállapítására Magyar Állatorvosok Lapja 1967, 22, 539-541 (5) Lomniczi B., Stipkovits L.: A fertőző bronchitis vírusának izolálása Magyar Állatorvosok Lapja 1968, 23, 600-603 (6) Lomniczi, B.: Biological poperties of avian coronavirus RNA Journal of general Virology 1970, 36, 531-533 (7) Lomniczi, B., Kennedy I.: Genome of infectious bronchitis virus Journal of Virology 1977, 24, 99-107 (8) Lomniczi B.: A coronavírusok fiziko-kémiai és biológiai tulajdonságai (szemle) Magyar Állatorvosok Lapja 1978, 33, 767-771

(9) Nagy, Éva, Lomniczi, B.: Polypeptide patterns of infectious bronchitis strains virus fall into two categories Archives of Virology 1979, 61, 341-345 (10) Lomniczi, B., Morser, J.: Polypeptides infectious bronchitis virus. I. Polypeptides of the virion Journal of general Virology 1981, 55, 155-164 (11) Clewley, J. P., Morser, J., Lomniczi, B.: Oligonucleotide fingerprinting of the RNA of different strains of Infectious Bronchitis Virus Proc. Internatl. Symp., Oct 1980, Würzburg. In: Adv. Exper. Med. Biol. (Ed.: V.ter Meulen et al), 1980, 142, 143-153 (12) Clewley, J. P., Morser, J., Avery, R. J., Lomniczi, B.: Oligonucleotide fingerprinting of ribonucleic acids of infectious bronchitis virus strains Infection and Immunity 1981, 32, 1227-1233 (13) Lomniczi Béla: A fertőző bronchitis vírus, a coronavírusok modelljének jellemzése Doktori Értekezés, 1983 Budapest

Warwick-i Egyetem, Interferon workshop, 1971 mรกrcius

Warwick-i Egyetem, Biological Sciences, 1976 ล sze

Stonehenge, Dobos PĂŠterrel, 1976 tavasz