Bioteca - Low glycaemic index bread

Sottoprodotti della macinazione fermentati Ingredienti funzionali per la produzione di pane a basso indice glicemico

ERICA PONTONIO1 - ANNA LORUSSO1 - ANDREA MINISCI2 MARCO GOBBETTI3 - CARLO GIUSEPPE RIZZELLO1* Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti - Università degli Studi di Bari Aldo Moro - Via G. Amendola 165/A - 70126 Bari - Italia 2 Valle Fiorita Catering S.r.l. - Via Delle Comunicazioni 24 - 72017 Ostuni (BR) - Zona Sisri - Italia 3 Facoltà di Scienze e Tecnologie - Libera Università di Bolzano - 39100 Bolzano - Italia *e-mail: carlogiuseppe.rizzello@uniba.it

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Parole chiave: basso indice glicemico, lievitazione naturale, sottoprodotti della macinazione, Lactobacillus

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SOMMARIO Lactobacillus plantarum DSM 32248 Lactobacillus rossiae DSM 32249, isolati da germe di grano, sono stati utilizzati per fermentare una miscela di sottoprodotti della macinazione. La fermentazione ha migliorato le proprietà funzionali di germe e crusca, che sono considerati importanti fonti di composti funzionali.

Un pane di frumento è stato prodotto usando il 15% (p/p) della miscela fermentata e paragonato ad un pane ottenuto con lievito di birra e senza l’impiego di germe e crusca. L’uso dell’ingrediente ha migliorato le caratteristiche biochimiche, funzionali, nutrizionali, di struttura e sensoriali del pane, che ha mostrato caratteristiche nutrizionali migliori rispetto all’uso esclusivo della farina di frumento. La digeribilità proteica, gli indici nutrizionali e l’indice di idrolisi dell’amido sono risultati nettamente migliorati.

Secondo la normativa vigente, il pane prodotto mediante il protocollo proposto in questo studio può essere definito come ad “alto contenuto di fibra” ed a “basso indice glicemico”.

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ingredienti funzionali

Fermented milling by-products: functional ingredients for the production of a low-glycaemic index bread Keywords: low-glycaemic index, sourdough fermentation, milling by-products, Lactobacillus ABSTRACT Lactobacillus plantarum DSM 32248 and Lactobacillus rossiae DSM 32249, previously isolated from wheat germ, were used to ferment a milling by-product mixture. Lactic acid fermentation improved the functional properties of wheat bran and germ already considered as important sources of functional compounds. A wheat bread was prepared using 15% (w/w) of fermented milling by-products, and compared to baker’s yeast wheat bread prepared without the addition of milling by-products. The biochemical, functional, nutritional, textural and sensory features of the wheat bread had improved compared to the use of only wheat flour. A marked improvement was found in protein digestibility, nutritional indexes, and the rate of starch hydrolysis when fermented milling by-products were used as ingredients. According to the current regulations, bread made under these study conditions can be defined as having “high fibre content” and “low glycaemic index”.

INTRODUZIONE Gli alimenti a basso indice glicemico (IG), come quelli naturalmente ricchi e/o arricchiti in fibra, sono raccomandati per prevenire l’insorgenza di diverse malattie (es. diabete) e i fattori di rischio delle malattie cardiache (De Angelis et al., 2009; Liljeberg et al., 1996). La fibra alimentare è largamente riconosciuta come una delle componenti della dieta in grado di contribuire al mantenimento di un ottimale stato di salute del consumatore. Le linee guida nutrizionali degli Stati Uniti (Dietary Guidelines for Americans) ed Europa (EFSA Scientific Opinion) raccomandano ai consumatori di raggiungere le soglie giornaliere di fibra consigliate consumando frutta, verdura e cereali integrali. I cereali integrali sono una fonte importante di fibre, poiché la più alta concentrazione di queste si riscontra negli strati tegumentali esterni della cariosside (es. frazioni di crusca e germe) (Katina et al., 2007; Messia et al., 2016).

Sebbene tali frazioni abbiano proprietà nutrizionali eccellenti e il loro uso nell’industria alimentare e dei mangimi sia aumentato nell’ultimo decennio, crusche e germe vengono scartate durante la procedura di macinazione del grano a causa dei problemi tecnologici e di stabilità che provocano negli sfarinati e nei prodotti da essi ottenuti (Coda et al., 2015). Oltre all’alto contenuto di fibra, crusca e germe sono caratterizzati dall’abbondanza di proteine ad alto valore biologico, aminoacidi essenziali, minerali, vitamine e composti funzionali.

Crusca e germe di grano, grazie anche all’attenzione riservatagli dalla recente letteratura scientifica, sono stati rivalutati come potenziale fonte di composti funzionali, diventando sempre più richiesti come ingredienti per la produzione di alimenti, poiché i consumatori preferiscono prodotti naturalmente fortificati piuttosto che complementare la loro dieta con integratori alimentari aggiuntivi e di sintesi (Messia et al., 2016). Tuttavia, il germe contiene una frazione lipidiaprile 2018 ˙ 335

LA COMBINAZIONE DELLA BIOTECNOLOGIA DELLA LIEVITAZIONE NATURALE E L’AGGIUNTA AL PANE DEI SOTTOPRODOTTI DELLA MACINAZIONE PRE-FERMENTATI PUÒ MIGLIORARE LE PROPRIETÀ FUNZIONALI E NUTRIZIONALI DEL PANE.

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ca ed enzimi idrolitici, come lipasi e lipossigenasi che, durante le fasi di stoccaggio, portano alla progressiva ossidazione della frazione grassa e all’irrancidimento, con conseguente rilascio di composti indesiderati in grado di alterare il profilo organolettico. Recentemente è stata dimostrata la possibilità di stabilizzare dal punto di vista ossidativo e, contemporaneamente, di aumentare il valore funzionale dei sottoprodotti della macinazione attraverso la fermentazione di tali frazioni con batteri lattici selezionati, in un processo affine alla tradizionale lievitazione naturale, come forma di pre-trattamento delle materie prime (Rizzello et al., 2010a; 2012).

La lievitazione naturale è una delle più antiche biotecnologie alimentari per la fermentazione dei cereali, che è stata riscoperta per il suo effetto positivo sulle proprietà sensoriali, nutrizionali, di conservazione e strutturali dei prodotti lievitati da forno (Gobbetti et al., 2014). L’acidificazione, la proteolisi, l’attivazione di un certo numero di enzimi e la sintesi di metaboliti microbici causano diversi cambiamenti durante la lievitazione naturale, che influiscono sull’impasto e sulla matrice influenzandone numerosi aspetti nutrizionali/funzionali (De Angelis et al., 2009). La lievitazione naturale può ridurre la risposta glicemica del pane, migliorare la biodisponibilità di fibre, sali minerali, vitamine e composti funzionali di vario tipo (De Angelis et al., 2009; Gobbetti et al., 2014).

Sulla base di tali considerazioni, è stato ipotizzato che la combinazione della biotecnologia della lievitazione naturale e l’aggiunta al pane dei sottoprodotti della macinazione pre-fermentati potessero essere efficaci per migliorare le proprietà funzionali e nutrizionali del pane. In questo studio, batteri lattici selezionati sono stati utilizzati per la pre-fermentazione di una miscela di crusca e germe di grano. Gli effetti funzionali, nutrizionali, tecnologici e sensoriali legati all’impiego di tali ingrediente pre-fermentati nella panificazione sono stati valutati analiticamente. In particolare, l’indice glicemico dei prodotti sperimentali Tecnica Molitoria - vol. LXIX

ingredienti funzionali è stato determinato mediante una sperimentazione in vivo. Sulla base dei risultati raccolti, il protocollo di trattamento dei sottoprodotti della macinazione e le modalità d’impiego nella produzione di pani a basso indice glicemico sono stati brevettati (brevetto n.

102016000015871, depositato il 16 febbraio 2016).

MATERIALI E METODI Microrganismi, condizioni di crescita e sottoprodotti della macinazione I batteri lattici impiegati come starter per la fermentazione dei sottoprodotti della macinazione sono stati precedentemente isolati da germe di grano (Rizzello et al., 2010a) e identificati mediante sequenziamento parziale dei geni 16S rRNA, recA, pheS e rpoA come Lactobacillus plantarum DSM 32248 e Lactobacillus rossiae DSM 32249b (Rizzello et al., 2010a; Pontonio et al., 2017). I ceppi sono stati coltivati su MRS modificato fino al raggiungimento della fase esponenziale tardiva (circa 8 ore), come precedentemente determinato dalla cinetica di crescita (Rizzello et al., 2010a). Il substrato mMRS è stato ottenuto aggiungendo il 5% v/v di estratto di lievito fresco e maltosio (28 mM) al terreno MRS fornito dalla Oxoid (Basingstoke, Hampshire, Regno Unito) (Coda et al., 2010b). Il pH finale è stato portato a 5,6 per simulare le condizioni di un impasto di farina di frumento (Pontonio et al., 2015). I ceppi sono stati selezionati per le loro spiccate capacità di crescita e acidificazione in germe di grano e sono caratterizzati dal mostrare attività metaboliche peculiari. Entrambi sono depositati presso la collezione di Colture DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germania). Per essere utilizzati per la fermentazione dei sottoprodotti della macinazione, le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione (10.000 x g, 10 minuti, 4 °C), lavate

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due volte in tampone fosfato 50 mM, pH 7,0 e risospese in acqua.

Sei campioni di germe di grano (Triticum aestivum Appulo cv.) e crusca sono stati forniti da Molini Tandoi (Corato, BA, Italia). I campioni di crusca e germe sono stati miscelati prima dell’uso.

La composizione chimica del germe di grano era la seguente: umidità 11,11±0,37%; proteine (N x 5,70) 28,56±0,88% di sostanza secca (s.s.); grasso 7,99±0,04% di s.s.; carboidrati totali 60,21±1,10% (fibra totale 5,28±0,25%); ceneri 3,77±0,07% di s.s.

La crusca utilizzata in questo studio aveva la seguente composizione chimica: umidità 15,5±0,4%; proteine (N x 5,70) 20,98±0,12% di s.s.; grasso 5,1±0,10% di s.s.; carboidrati totali 67,21±1,10% (fibra totale, 40,3±0,60%); ceneri 5,25±0,12% di s.s.

Analisi microbiologiche Dieci grammi di crusca o germe di grano sono stati sospesi in 90 mL di soluzione di cloruro di sodio sterile (0,9%, peso/volume) e omogeneizzati con un miscelatore da laboratorio (PBI International Milano, Italia) per 2 minuti a temperatura ambiente. I batteri lattici mesofili sono stati determinati su MRS modificato a 30 °C per 48-72 ore, in anaerobiosi. I lieviti sono stati enumerati su Yeast extract-Peptone-Dextrose agar (YPD, Oxoid), contenente 150 ppm di cloramfenicolo, a 30 °C per 72 ore. Gli enterobatteri totali sono stati determinati su Violet Red Bile Glucose Agar (VRBGA, Oxoid) a 37 °C per 24 ore.

Fermentazione dei sottoprodotti della macinazione Cento grammi di impasto sono stati preparati miscelando 62,5% di una miscela di crusca e germe in rapporto di 4:1 (p/p) e 37,5% (p/p di impasto) di acqua e inoculati con L. plantarum DSM 32248 e L. rossiae DSM 32249 alla densità cellulare finale di ca. 2 x 107 ufc/g di 338 ˙ aprile 2018

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ingredienti funzionali impasto. La resa dell’impasto (DY, peso dell’impasto x 100/peso della farina) era 160. Le fermentazioni sono state condotte in tre repliche indipendenti, a 30 °C per 24 ore. Al termine della fermentazione, i sottoprodotti della macinazione fermentati (SMf) sono stati raffreddati a 4 °C e analizzati entro 2 ore dalla fermentazione.

Al fine di evitare cambiamenti funzionali e nutrizionali del germe, i SMf sono stati liofilizzati prima della panificazione e non disidratati con l’impiego di alte temperature. Tutte le analisi sono state condotte in tre repliche indipendenti.

La cinetica di acidificazione è stata determinata online mediante un pHmetro (modello 507, Crison, Milano, Italia) con una sonda per alimenti solidi. I dati sono stati modellati secondo l’equazione di Gompertz (Zwietering, Jongeberger, Roumbouts e van’t Riet, 1990):

LE FERMENTAZIONI SONO STATE CONDOTTE IN TRE REPLICHE INDIPENDENTI,

A 30 °C PER 24 ORE.

y = k + A exp {-exp [(Vmaxe/A) (λ - t) + 1]}; dove y è l’entità di acidificazione espressa come dpH/ dt (unità di pH/h) al tempo t; k è il livello iniziale della variabile dipendente da modellare; A (∆pH) è la differenza di pH (unità) tra il valore iniziale (pH0) e il valore raggiunto nella fase stazionaria (pHt) della fermentazione dell’impasto; Vmax è la velocità massima di acidificazione (dpH/h), λ è la durata della fase di latenza dell’acidificazione espressa in ore, e t è il tempo. I dati sperimentali sono stati modellati attraverso la procedura di regressione non lineare con il software Statistica 12.0 (StatSoft Inc., Tulsa, USA).

Preparazione del pane e proprietà tecnologiche Un pane contenente SMf (P-SMf) con DY di 160 è stato prodotto presso l’impianto pilota del Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti dell’Università di Bari. Il P-SMf è stato prodotto secondo il protocollo a due fasi di fermentazione vol. LXIX - Tecnica Molitoria

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GLI INGREDIENTI UTILIZZATI ERANO I SEGUENTI: 53,1% (P/P) DI FARINA DI FRUMENTO TENERO, 31,9% (P/P)

DI ACQUA, 15% (P/P) DI

SMF E 1% (P/P) DI SALE.

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comunemente utilizzato per la produzione di pane a lievitazione naturale. In particolare, è stata effettuata prima la produzione di SMf (fermentazione per 24 ore a 30 °C, fase I) e successivamente la miscelazione con farina, acqua e lievito di birra (2h a 30 °C, fase II). Gli ingredienti utilizzati erano i seguenti: 53,1% (p/p) di farina di frumento tenero, 31,9% (p/p) di acqua, 15% (p/p) di SMf e 1% (p/p) di sale. Un pane ottenuto con lievito di birra, contenente la stessa percentuale di sottoprodotti della macinazione (15%, p/p) non fermentati (P-SM), e un pane di frumento ottenuto con lievito di birra (CTR) prodotto senza l’aggiunta di sottoprodotti della macinazione, sono stati preparati (DY, 160) e usati come controlli. Il lievito di birra è stato aggiunto alla percentuale del 2% (p/p), corrispondente ad una densità cellulare finale di ca. 7 log cfu/g in tutti i tipi di pane. Gli impasti sono stati miscelati a 60 × g per 5 min con un miscelatore IM 5-8 ad alta velocità (Mecnosud, Flumeri, Italia) e la fermentazione a 30 °C per 2 ore. Tutti i pani sono stati cotti a 220 °C per 50 minuti (Combo 3, Zucchelli, Verona, Italia).

L’analisi strumentale o della struttura (Texture Profile Analysis, TPA) è stata effettuata con TVT300XP (TexVol Instruments, Viken, Svezia). Lo strumento è equipaggiato con sonda cilindrica PCy25S. Per l’analisi, i pani (300 g) sono stati confezionati in sacchetti microforati in polipropilene e conservati per 24 ore a temperatura ambiente. La crosta non è stata rimossa. Nel dettaglio, i parametri dell’analisi TPA sono stati: 1 ciclo di compressione, velocità della sonda 1 mm/s e 30% di deformazione del campione. Il sistema analitico BVM (TexVol Instruments) è stato utilizzato per determinare il volume specifico. L’analisi TPA ha previsto la determinazione, mediante software dedicato, dei seguenti parametri: durezza (forza massima del picco); fratturabilità (il primo picco significativo durante la compressione del pane da parte della sonda) e resilienza (rapporto tra la prima area di decompressione con la Tecnica Molitoria - vol. LXIX

ingredienti funzionali prima di compressione). Altezza, larghezza, profondità, area e volume specifico dei pani sono stati misurati dal sistema BVM (TexVol Instruments).

Un colorimetro Minolta CR-10 è stato utilizzato per l’analisi del colore della crosta. I risultati sono stati riportati come coordinate cromatiche (L, a, e b) e la differenza colorimetrica dE* calcolata nel seguente modo: dE*ab = √(dL)2 + (da)2 + (db)2 dove dL, da e db sono le differenze per i valori di L, a e b tra campione e riferimento (una lastra ceramica bianca avente L=93,4, a=-0,39 e b=3,99).

Caratterizzazione chimica, biochimica e funzionale Il pH è stato determinato come descritto precedentemente. La TTA è stata misurata su 10 g di SMf o campioni di pane, che sono stati omogeneizzati con 90 mL di acqua distillata per 3 minuti in Mixer 400P (Interscience, St Nom, Francia) ed espressi come quantità (in mL) di 0,1 M NaOH necessaria per raggiungere pH 8,3. Gli estratti acquosi (Water/salt-soluble extract, WSE) di crusca, germe e impasti, sono stati preparati secondo il metodo riportato da Weiss et al. (1993), e utilizzati per analizzare gli acidi organici, gli amminoacidi liberi totali (Total Free Amino Acids, TFAA) e l’attività fitasica.

Le concentrazioni di acido lattico e acetico sono state determinate mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) come riportato da Coda et al. (2011). Il Quoziente di Fermentazione (FQ) è stato determinato come il rapporto molare tra acido lattico e acetico. I TFAA sono stati analizzati mediante analizzatore di amminoacidi Biochrom serie 30 (Biochrom Ltd., Cambridge Science Park, Inghilterra) con una colonna a scambio catiovol. LXIX - Tecnica Molitoria

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nico (Na) (20 x 0,46 cm), come descritto da Rizzello et al. (2010a).

L’attività fitasica è stata determinata monitorando l’idrolisi del p-nitrofenilfosfato (p-NPP) (Sigma, 1040) come descritto da Rizzello et al. (2010a). Una unità (U) di attività è stata definita come la quantità di enzima richiesta per rilasciare 1 μmol/min di p-nitrofenolo nelle condizioni di test.

L’attività di detossificazione (scavenging) del radicale 2,2-difenil-1-picrylhydrazyl (DPPH) è stata determinata sull’estratto metanolico di SMf, P-SM e P-SMf (Rizzello et al., 2016a) come indice dell’attività antiossidante. I dati raccolti sono stati comparati con quelli ottenuti impiegando l’antiossidante sintetico idrossitoluene butilato (BHT), alla concentrazione di 75 ppm. La concentrazione dei polifenoli totali è stata determinata come descritto da Slinkard e Singleton (1997) ed espressa come equivalente di acido gallico.

Le fibre totali (solubili e insolubili) di SMf, P-SM e PSMf sono state determinate secondo i metodi ufficiali AOAC 991.42 e 993.18 (Horwitz e Latimer, 2006).

Proprietà nutrizionali del pane Il metodo di Akeson e Stahman, modificato come riportato da Rizzello et al. (2016), è stato utilizzato per la valutazione della digeribilità delle proteine dei pani in vitro (In Vitro Protein Digestibility, IVPD), secondo un protocollo che prevede la simulazione della digestione nel tratto gastrointestinale mediante l’impiego di trattamenti enzimatici a più step. L’IVPD di P-SMf, P-SM e CTR è stata determinata ed espressa come percentuale di proteina solubilizzata dopo l’idrolisi enzimatica, sul totale. Il Chemical Score (CS) stima la quantità di proteine necessarie per fornire il quantitativo di amminoacidi essenziali (Essential Amino Acid, EAA) per gli adulti, rispetto ad una proteina di riferimento che è stata recentemente ridefinita dalla FAO (Food and Agriculture Organi342 ˙ aprile 2018

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ingredienti funzionali zation, 2007) (Millward, 2012). È stato calcolato utilizzando l’equazione di Block e Mitchel (1946), che confronta il contenuto di EAA dei campioni rispetto alla quantità dello stesso amminoacido nella proteina di riferimento. La sequenza di amminoacidi essenziali limitanti corrisponde all’elenco di EAA aventi CS più basso (Block e Mitchel, 1946). Il Protein Score indica il CS dell’amminoacido più limitante presente nella proteina del campione (Block e Mitchel, 1946).

L’indice degli amminoacidi essenziali (EAAI) stima la qualità della proteina di prova, utilizzando come criterio il suo contenuto di EAA. EAAI è stato calcolato secondo la procedura di Oser (1959) che considera il rapporto tra EAA del campione e EAA della proteina di riferimento, secondo la seguente equazione:

√

EAAI =

n

(EAA1 * 100) (EAA2 * 100)(…) (EAAn * 100) [campione] (EAA1 * 100) (EAA2 * 100)(…) (EAAn * 100) [riferimento]

Il Valore Biologico (BV) indica la frazione utilizzabile della proteina del campione. Il BV è stato calcolato utilizzando l’equazione di Oser (1959): BV = ([1,09*EAAI]-11,70) Il rapporto di efficienza proteica (PER) stima la qualità nutrizionale della proteina basata su uno specifico profilo amminoacidico. Esso è stato determinato utilizzando il modello sviluppato da Ihekoronye (1981): PER = -0,468 + (0,454 * [Leucina]) - (0,105 * [Tirosina]) L’Indice Nutrizionale (NI) normalizza le variazioni qualitative e quantitative della proteina del campione rispetto al riferimento. È l’unico, tra gli indici elencati, che contempla la concentrazione della proteina digeribile nella formula di calcolo, oltre che i rapporti tra gli vol. LXIX - Tecnica Molitoria

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amminoacidi essenziali. Di fatto, NI è stato calcolato utilizzando l’equazione di Crisan e Sands (1978), che considera i fattori quali/quantitativi con pari importanza: NI = (EAAI * Proteine (%)/100) Idrolisi in vitro dell’amido e indice glicemico in vivo L’analisi dell’idrolisi dell’amido in vitro simula la digestione in vivo dell’amido. L’analisi è stata eseguita come descritto da Liljeberg et al. (1996). Il kit K-FRUGL 09/13 (Megazyme Intl., Irlanda) è stato utilizzato per la determinazione della concentrazione di glucosio rilasciato da un campione di pane avente concentrazione definita di amido durante una digestione enzimatica a più step. Il grado di idrolisi dell’amido in momenti diversi (determinato da 0 a 180 minuti, a intervalli di 30 minuti) è stato espresso come la porzione di amido idrolizzato sul totale. La cinetica dell’idrolisi e l’Indice di Idrolisi dell’amido (HI) sono stati calcolati attraverso il modello non lineare proposto da De Angelis et al.

(2009). Le curve di idrolisi sono state ottenute usando la seguente equazione dal software Statistica 12.0: C = C (1 - e-kt), dove t è il tempo, C è la concentrazione al tempo t, C è la concentrazione di equilibrio, e k è il costante cinetica. Il BY è stato utilizzato come riferimento (HI = 100).

Sulla base dei risultati raccolti in laboratorio, si è deciso di effettuare la determinazione in vivo, mediante sperimentazione clinica.

L’Indice Glicemico in vivo (IG) è stato determinato da Farcoderm S.r.l. (Pavia, Italia), secondo il protocollo certificato ISO 26642:2010. Venti volontari sani non fumatori, donne e uomini, di età compresa tra 18 e 60 anni, con indici di massa corporea normali (21,5 344 ˙ aprile 2018

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ingredienti funzionali kg/m2) e non sottoposti ad alcuna terapia farmacologica hanno partecipato allo studio. Sciroppo di glucosio e P-SMf sono stati utilizzati per il test in vivo. Aliquote di pane contenenti 50 g di carboidrati potenzialmente disponibili e una soluzione di glucosio (50 g di glucosio; 0,140 mL di aroma di arancia; 0,535 g di estratto di arancia liquida; 0,250 g di acido citrico; 0,180 g di cloruro di sodio; 0,1 g di aroma di limone; 12,5 mg di sodio benzoato; 3 mg di metil paraidrossibenzoato; 3 mg di propil paraidrossibenzoato e acqua pura per raggiungere un volume di 100 mL) sono stati somministrati ai volontari. Dopo l’ingestione della soluzione di glucosio o del pane, campioni di sangue (Accu-Check SoftClick e Accu-Check Softclick Lancet, Roche Diagnostic, Monza, Italia) sono stati prelevati dai volontari mediante il metodo del “capillary finger-prick” ogni 30 minuti. Le aree sottese alle curve di risposta glicemica per ciascun campione sono state calcolate escludendo l’area di base corrispondente al livello di digiuno. Ogni serie di analisi è durata 2 ore. I valori individuali di GI risultanti sono stati mediati per ottenere il valore IG complessivo per P-SMf e P-SM.

L'ANALISI SENSORIALE HA VALUTATO: ELASTICITÀ, COLORE DELLA CROSTA E DELLA MOLLICA,

SAPORE ACIDO, ODORE ACIDO, DOLCEZZA,

SAPIDITÀ, FRIABILITÀ

E INTENSITÀ DI SAPORE.

Proprietà sensoriali L’analisi sensoriale dei pani è stata effettuata da un panel composto da 10 assaggiatori addestrati (5 maschi e 5 femmine; età media: 35 anni; intervallo: 1854 anni). Elasticità, colore della crosta e della mollica, sapore acido, odore acido, dolcezza, sapidità, friabilità e intensità di sapore sono stati considerati come attributi sensoriali utilizzando una scala da 0 a 10, con 10 il punteggio più alto, secondo il metodo descritto da Rizzello et al. (2010b).

Analisi statistica Le analisi sono state condotte su tre repliche indipendenti di ciascun campione. Ogni replica è stata analizzata tre volte. I set di dati ottenuti sono stati vol. LXIX - Tecnica Molitoria

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sottoposti ad analisi ANOVA ad una via; il confronto a coppie è stato ottenuto con la procedura di Tukey a p<0,05, utilizzando il software statistico Statistica 12.0 (StatSoft Inc., Tulsa, USA).

RISULTATI Caratterizzazione dei sottoprodotti della macinazione fermentati La crusca di frumento era caratterizzata da una densità cellulare di Enterobacteriaceae di 4,0±0,1 log cfu/g e batteri lattici e lieviti rispettivamente inferiori a 3,0 e 2,0 log cfu/g. Il germe di grano ospitava una densità cellulare di presunti batteri lattici e lieviti compresa rispettivamente tra 2,8±0,2 e 4,5±0,3 105 ufc/g e da 1,2±0,4 a 3,4±0,3 103 ufc/g. Le Enterobacteriaceae non sono state trovate in 1 g di campione. Crusca e germe di grano avevano valori di pH e TTA rispettivamente di 6,7±0,1 e 16,3±0,1 mL di 0,1 M NaOH/10 g e 6,29±0,05 e 17,8±0,31 mL di 0,1 M NaOH/10 g. I TFAA erano rispettivamente 2,92 ± 0,31 g/kg e 15,69 ± 0,15 g/kg in crusca e germe di grano.

Dopo la fermentazione, il SMf era caratterizzato da valori di pH e TTA rispettivamente di 4,64±0,12 e 20±2 (mL NaOH 0,1 M). La cinetica di acidificazione durante le 24 ore di fermentazione ha generato valori rispettivamente di ∆pH, λ e Vmax di 0,88, 1,5 ore e 0,30 ∆pH/h. Le concentrazioni di acido lattico e acetico erano 87±8 mmol/kg e 12±2 mmol/kg. Di conseguenza, il pane FMP aveva FQ di 4,83. La concentrazione di TFAA rilasciata durante la fermentazione era di 5,27±0,20 g/kg. L’attività fitasica di WSE era di 2,34 U. La concentrazione di fenoli totali di SMf era di 98 mmol/kg. L’attività di scavenging dell’estratto metanolico ottenuto da SMf determinata sul radicale DPPH era 78±2% (75±2% è stato osservato per BHT). La fibra totale, espressa su sostanza secca, era del 36,2±0,3%, di cui 28,0±0,1% insolubile e 8,1±0,2% solubile.

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ingredienti funzionali Proprietà chimiche, biochimiche, funzionali e tecnologiche del pane pH, TTA, concentrazioni di acidi organici e TFAA, attività fitasica e antiossidante, polifenoli totali e fibra di P-SMf, P-SM e CTR (prima della cottura) sono riportati nella tab. 1. L’aggiunta di sottoprodotti della macinazione fermentati ha causato una diminuzione del pH e un aumento dei valori di TTA. Tuttavia, come previsto, rispetto agli altri impasti di pane, il P-SMf aveva il pH più basso. A causa della fermentazione preliminare cui i sottoprodotti della macinazione sono stati sottoposti, il P-SMf conteneva rispettivamente 28±2 e 5,4±0,3 mmol/kg di acido lattico e acetico.

Queste concentrazioni hanno generato un FQ di 5,18, che è in accordo con i valori solitamente presenti nei prodotti a lievitazione naturale (Rizzello et al., 2010b).

L’uso di SMf e SM non fermentati, come ingrediente, ha causato un aumento del 54% e del 70% della concentrazione di TFAA, rispettivamente rispetto al CTR (fig. 1). Allo stesso modo, la concentrazione di fenoli totali era rispettivamente del 70% e del 75% superiore a CTR in P-SM e P-SMf. Come previsto, è stata riscontrata una tendenza simile per l’attività antiossidante, che è aumentata del 31% e 38% rispettivamente in P-SM e P-SMf. L’attività fitasica di P-SMf è stata la più alta (circa 36% e 63% in più confronto a P-SM e CTR, rispettivamente).

Dopo la cottura non c’erano differenze significative nel volume specifico di P-SMf, P-SM e CTR. Tuttavia, il valore di durezza, corrispondente alla forza del primo picco di compressione del prodotto, era il più alto per MPB (circa 25% e 5% in più rispetto a P-SMf e CTR, rispettivamente). La resilienza, che indica quanto bene il pane recupera la sua forma originale, non era significativamente diversa tra i pani. Dopo la cottura, il valore della fratturabilità è stato maggiore per CTR rispetto a P-SMf e P-SM. L’analisi visiva della crosta di pane prodotto con SMf ha mostrato un colore più intenso rispetto a CTR. Invol. LXIX - Tecnica Molitoria

aprile 2018 ˙ 347

Tabella 1 - Principali caratteristiche biochimiche, funzionali, nutrizionali e tecnologiche dei pani (resa dell’impasto 160): P-SMf, contenente sottoprodotti della macinazione fermentati (15% p/p); P-SM, contenente sottoprodotti della macinazione non fermentati (15% p/p) e CTR, ottenuto con la sola farina di grano tenero. I dati sono la media di tre analisi indipendenti.

P-SMf

P-SM

CTR

5,2±0,2b 9,2±0,6a 28±2a 5,4±0,3a 1640±30a

5,0±0,1b 6,3±0,4b 2,1±0,9b 1,5±0,7b 1116±21b

5,6±0,2a 4,6±0,1c nr nr 510±10c

29,0±0,2a 65±2a 1,1±0,2a 1,63±0,2a 4,9±0,2a

24±0,4b 58±3b 0,7±0,1b 1,21±0,3a 5,3±0,2a

7,2±0,2c 40±5c 0,4±0,1c 0,82±0,1b 1,0±0,1b

83±1a 59,5±0,6a 71,99±0,8a 44,8±0,7a 25,2±0,6a 3,4±0,1a

79±2b 37,2±0,7b 60,5±0,4b 42,0±0,4b 24,1±0,5a 3,0±0,1b

77±1b 24,5±0,2c 56,2±0,4c 39,9±0,4c 23,5 ±0,5b 2,8±0,2b

2,24±0,34a 2947±81c 0,72±0,02a 2421±8b

1,91±0,17a 3700±41a 0,72±0,04a 2310±11c

2,04±0,21a 3500±75b 0,75±0,03a 3078±4a

46,1±0,3c 14,7±0,2a 28,7±0,3c 55,5±0,9b

52,3±0,3b 12,5±0,1b 30,1±0.4b 50,4±0,8a

65,1±0,2a 7,1±0,1c 31,9±0,2a 40,45±0,7c

Caratteristiche biochimiche pH TTA (mL of 0.1 N NaOH/10g) Acido lattico (mmol/kg) Acido acetico (mmol/kg) TFAA (mg/kg) Caratteristiche funzionali Fenoli totali (mmol/kg) Attività antiossidante1 Attività fitasica (U)2 Fibre solubili (%) Fibre isnolubili (%) Indici nutrizionali Digeribilità in vitro delle proteine (%) Protein Score Indice degli amminoacidi essenziali (EAAI) Valore biologico (BV) Rapporto di efficienza proteica (PER) Indice nutrizionale (NI) Proprietà tecnologiche Volume specifico (cm3/g) Durezza (g) Resilienza Fratturabilità (J) Analisi del colore (crosta) L a b dE

L’attività antiossidante è stata determinata sulla base dell’attività di scavenging contro il radicale DPPH dopo 10 min di reazione.

Una unità (U) di attività fitasica era definita come la quantità di enzima necessario a liberare 1 µmol di fosfato per min nelle condizioni del saggio.

I dati sono la media di tre rilevazioni indipendenti ± deviazione standard (n=3); a-c Valori nella stessa riga con lettere di apice diverse differiscono in modo significativo (p<0,05); nr: non rilevato 1

2

348 ˙ aprile 2018

Tecnica Molitoria - vol. LXIX

ingredienti funzionali

fatti, la determinazione strumentale del colore ha mostrato che la luminosità della crosta (L) di P-SMf era la più bassa, mentre la differenza colorimetrica dE era la più alta (tab. 1).

Proprietà nutrizionali del pane Un approccio multi-step, che simula la digestione gastrointestinale in vivo, è stato utilizzato per stimare l’IVPD del pane. La digeribilità di P-SMf era significativamente superiore rispetto a P-SM e CTR. La frazione proteica digeribile è stata ulteriormente caratterizzata. In particolare, la composizione di amminoacidi e il CS correlato sono stati calcolati utilizzando il profilo di EAA riportato per gli adulti, come ridefinito dalla FAO nel 2007 (Millward, 2012). Sulla base dei CS, sono state determinate le sequenze di amminoacidi limitanti e il Protein Score. Tutti i pani vol. LXIX - Tecnica Molitoria

Fig. 1 - Concentrazione di amminoacidi liberi e loro derivati (mg/kg) dei pani (resa dell’impasto 160): P-SMf contenente sottoprodotti della macinazione fermentati (15% p/p); P-SM, contenente sottoprodotti della macinazione non fermentati (15% p/p) e CTR, ottenuto con la sola farina di grano tenero. I dati sono la media di tre analisi indipendenti. Barre d’errore e deviazioni standard sono riportate.

aprile 2018 ˙ 349

Fig. 2 - Tasso di idrolisi dell’amido dei pani (resa dell’impasto 160): P-SMf (triangolo) contenente sottoprodotti della macinazione fermentati (15% p/p); P-SM (cerchio), contenente sottoprodotti della macinazione non fermentati (15% p/p) e CTR (quadrato), ottenuto con la sola farina di grano tenero. a-c I valori ottenuti allo stesso tempo con lettere di apice differiscono in modo significativo (p <0,05).

mostravano Lisina e Metionina come gli amminoacidi più limitanti. Il terzo amminoacido essenziale limitante era Triptofano per P-SMf e MPB, mentre Treonina era limitante per CTR. Il più alto Protein Score è stato osservato per P-SMf (tab. 1). EAAI e BV, che sono comunemente usati per stimare la qualità delle proteine alimentari, erano significativamente superiori per P-SMf rispetto a P-SM e CTR (tab. 1). Anche NI e PER del P-SMf erano i più alti (tab. 1).

L’Indice di Idrolisi in vitro dell’amido (HI) è considerato una misura presuntiva dell’IG in soggetti sani (Åkerberg et al., 1998). L’idrolisi dell’amido a 30-180 min e i valori di HI sono mostrati in fig. 2. Dopo 180 minuti, la percentuale di amido idrolizzato era rispettivamente di 33,7, 55,0 e 65,1 per P-SMf, P-SM e BY (fig. 2). Il valore dell’indice di idrolisi (HI) di P-SMf era del 55%, rispetto all’84% e al 100% di P-SM e CTR. L’uso di SMf come ingrediente ha ridotto marcatamente l’HI, come conseguenza della biosintesi degli acidi organici operati dai batteri lattici (De Angelis et al., 2009). Il P-SMf è stato impiegato per la determinazione in vivo del livello di glucosio nel sangue e IG, poiché era caratterizzato da valori molto bassi di HI. Tutti i volontari hanno consumato sciroppo di glucosio 350 ˙ aprile 2018

Tecnica Molitoria - vol. LXIX

ingredienti funzionali (come riferimento) e pane secondo il protocollo sperimentale (ISO 26640:2010). L’IG di P-SMf è risultato pari a 36,9% (sciroppo di glucosio, IG=100).

Caratterizzazione sensoriale I risultati dell’analisi sensoriale del pane sono mostrati in fig. 3. Differenze significative tra i pani sono state trovate dai membri del panel, in particolare sul colore, il gusto acido, la dolcezza e la sapidità. Complessivamente, rispetto a CTR, l’aggiunta di sottoprodotti della macinazione ha causato un aumento dei punteggi per colore, gusto acido e sapore, tuttavia gli aumenti più elevati sono stati trovati quando SMf è stato aggiunto come ingrediente alla formulazione del pane.

Rispetto al CTR, i punteggi degli attributi colore, gusto acido e sapore in P-SMf erano: 7,2±0,3 vs 5,1±0,1; 8,8±0,2 vs 5,3±0,4; 7,2±0,4 vs 5,9±0,2, rispettivamente. Anche la sapidità era la più alta per P-SMf. Nel complesso, l’aggiunta di SMf ha portato a un pane con caratteristiche sensoriali tipicamente presenti nel pane a lievitazione naturale (Rizzello et al., 2010b).

Fig 3 - Grafico a ragnatela dei dati di analisi sensoriale dei pani (resa in pasta 160): P-SMf contenente sottoprodotti della macinazione fermentati (15% p/p); P-SM, contenente sottoprodotti della macinazione non fermentati (15% p/p) e CTR, ottenuto con la sola farina di grano tenero. I dati sono la media di tre analisi indipendenti.

vol. LXIX - Tecnica Molitoria

aprile 2018 ˙ 351

DISCUSSIONI La ricerca scientifica ha largamente dimostrato come la fibra alimentare sia in grado di ridurre l’Indice Glicemico (IG) degli alimenti che la contengono in quantità apprezzabili, diminuendo il rischio di sviluppare il diabete di tipo 2 e migliorando il metabolismo insulinico/glucidico nei pazienti con diabete di tipo 2 (Prückler et al., 2015).

Globalmente, è stata riscontrata un’assunzione di fibra alimentare molto al di sotto delle raccomandazioni delle principali organizzazioni sulla salute pubblica (Jones, 2014). Crusca e germe di grano (sottoprodotti della macinazione) sono caratterizzati da un elevato contenuto di preziosi metaboliti secondari vegetali e sono eccellenti fonti di fibra. Tuttavia, essi sono considerati un sottoprodotto inevitabile dell’industria molitoria, con un basso valore commerciale, tanto da essere principalmente utilizzati come supplementi per l’alimentazione animale.

Il reinserimento di tali prodotti nella catena alimentare, come strategia per aumentare l’assunzione regolare di fibre alimentari, è attualmente oggetto di una forte discussione (Prückler et al., 2015). La fermentazione di tali ingredienti con i batteri lattici è stata individuata come una strategia promettente per incorporare efficacemente i sottoprodotti della macinazione nel pane attraverso una procedura di pre-trattamento tecnologicamente semplice, in grado di risolvere le principali problematiche tecnologiche e organolettiche generalmente correlate al loro impiego come ingredienti. Il miglioramento generale delle proprietà funzionali, nutrizionali, tecnologiche e sensoriali è stato recentemente dimostrato da numerosi autori (Coda et al., 2015; Manini et al., 2014; Rizzello et al., 2010a,b, 2012).

In questo studio, la crusca e il germe di grano sono stati miscelati, fermentati da batteri lattici selezionati e utilizzati come ingrediente per fortificare e migliorare le caratteristiche funzionali, nutrizionali e tecnologiche di pane di frumento (Rizzello et al., 2016b). Il rapporto 4:1 (crusca:germe) è stato impiegato per ripristinare il rapporto tra le due componenti nella cariosside. Lactoba352 ˙ aprile 2018

Tecnica Molitoria - vol. LXIX

ingredienti funzionali cillus plantarum e Lactobacillus rossiae, sono considerate specie di batteri lattici comuni del lievito naturale (Gobbetti et al., 2016). I ceppi utilizzati in questa ricerca però sono stati precedentemente isolati dal germe di grano e sono stati selezionati in base alle capacità di crescita e acidificazione in questa matrice. L’utilizzo di ceppi isolati dalla medesima matrice da fermentare consente di individuare biotipi particolarmente adattati al substrato, dotati spesso di caratteristiche competitive rispetto a ceppi isolati da matrici differenti. Come atteso, i batteri lattici sono cresciuti, durante l’incubazione dell’impasto di germe, crusca ed acqua, di ca. 2 cicli log; tale sviluppo ha provocato un’acidificazione intensa. Le lipasi endogene del germe di grano, la cui attività causa l’irrancidimento dei prodotti derivati da forno, sono parzialmente inibite in condizioni acide. L’acidificazione dovuta alla fermentazione dei batteri lattici, garantisce una maggiore stabilità del prodotto (Rizzello et al., 2010b).

Crusca e germe di grano sono considerati importanti fonti di FAA e fenoli e, come precedentemente riportato (Arte et al., 2015; Rizzello et al., 2010a, 2010b), il metabolismo dei batteri lattici provoca un ulteriore rilascio di tali composti come conseguenza diretta delle attività degli enzimi microbici o indiretta da parte degli enzimi endogeni della matrice, questi ultimi attivati dall’ambiente acido (Arte et al., 2015; Rizzello et al., 2016a; Coda et al., 2015). L’alta concentrazione di polifenoli ha causato un incremento dell’attività antiossidante del fermentato. I polifenoli sono i principali composti responsabili dell’attività antiossidante di una matrice alimentare. L’aumento dell’attività antiossidante deriva da una maggiore solubilità dei polifenoli a pH acido (garantito dalla fermentazione lattica) e dalla liberazione di fenoli semplici a partire da composti complessi (condensati o glicosilati) operata dagli enzimi dei batteri lattici. È stato anche osservato che l’attività fitasica nel fermentato ha raggiunto valori paragonabili ad un comune lievito naturale, come probabile risultato dell’attivazione delle fitasi endogene da parte del pH (Rizzello et al., vol. LXIX - Tecnica Molitoria

aprile 2018 ˙ 353

2010a, 2010b). La fitasi catalizza l’idrolisi dell’acido fitico, liberando fosfato disponibile. L’acido fitico è considerato un fattore antinutrizionale per gli esseri umani e gli animali in quanto agisce da chelante di minerali diminuendone la biodisponibilità (De Angelis et al., 2003).

In questo studio, il SMf è stato utilizzato come ingrediente per la produzione di pane di frumento e le sue caratteristiche sono state comparate a quelle di un pane contenente la stessa percentuale di sottoprodotti della macinazione non fermentati e ad uno prodotto con sola farina di frumento.

Nel complesso, l’uso di sottoprodotti della macinazione ha avuto un effetto positivo sulle proprietà funzionali e nutrizionali del pane. Tuttavia, i miglioramenti più marcati sono stati osservati quando nella formulazione del pane è stato incluso SMf. In base alle caratteristiche del SMf, i polifenoli totali e l’attività antiossidante del pane fortificato erano significativamente più alti rispetto al controllo e al P-SM. L’attività fitasica ha seguito la stessa tendenza. Quando il SMf e la fermentazione lattica sono state combinate, la concentrazione di TFAA è marcatamente aumentata. La lisina, che è considerato il principale amminoacido limitante della farina di frumento (Rizzello et al., 2012), è stata trovata a ca.

0,82 g/kg in P-SMf. La concentrazione di glutammina è risultata inferiore in P-SMf rispetto a P-SM, come risultato della conversione nell’amminoacido funzionale acido γ-aminobutirrico (GABA) durante il processo di fermentazione. Il GABA è un amminoacido non proteico, che agisce come il principale neurotrasmettitore inibitorio del sistema nervoso centrale, è un anti-ipertensivo, è coinvolto nella prevenzione del diabete ed ha effetti diuretici e tranquillanti.

Come precedentemente riportato, la conversione di glutammina è correlata all’attività del glutammato decarbossilasi (GAD) comunemente osservata nei ceppi di batteri lattici isolati da frumento e germe di grano (Rizzello et al., 2010a, 2012). Infatti, la concentrazione di GABA in P-SMf era la più alta.

Sebbene frequentemente utilizzata come indice qua354 ˙ aprile 2018

Tecnica Molitoria - vol. LXIX

ingredienti funzionali litativo della frazione proteica di un alimento, la composizione amminoacidica non è l’unico fattore predittivo del valore nutrizionale delle proteine. Questo dato deve essere combinato al valore di digeribilità delle proteine (Rizzello et al., 2016a), che permette di intuire qual è la percentuale effettivamente assimilabile sul totale.

Quest’ultima dipende dalla resistenza ai processi digestivi della specifica frazione. Il pane fortificato con sottoprodotti fermentati ha mostrato EAAI e BV più alti rispetto ai pani controllo. EAAI indica il rapporto degli amminoacidi essenziali del campione rispetto al riferimento, mentre BV stima l’azoto potenzialmente trattenuto dal corpo umano dopo il consumo. L’indice PER, che riflette la capacità di una proteina di sostenere l’aumento di peso corporeo, ha seguito la stessa tendenza. L’NI è considerato un fattore predittivo globale della qualità delle proteine. A causa dell’aumento della biodisponibilità delle proteine, il valore di NI del P-SMf è risultato significativamente superiore a quello di P-SM e CTR. Riguardo l’aspetto dei carboidrati, è stato osservato che P-SMf aveva un valore nettamente inferiore di HI rispetto a quello del controllo. Questo effetto potrebbe essere attribuito all’elevata concentrazione di fibre (circa 36,2% in SMf) e all’acidificazione biologica, che è uno dei principali fattori che riducono l’Indice di Idrolisi dell’amido (Rizzello et al., 2016a), principalmente in relazione all’aumento della percentuale di amido resistente. Il P-SMf è stato caratterizzato per un alto contenuto in fibra (6,53%) rispetto al pane di controllo (1,82%).

Inoltre, l’IG in vivo di P-SMf era di ca. 36,9%. Complessivamente, l’abbassamento della glicemia e dell’insulinemia da parte dell’acido lattico non è attribuito alla diminuzione della velocità di svuotamento gastrico, ma all’interazione tra amido e glutine che limita la biodisponibilità dell’amido (Östman et al., 2002). L’uso di sottoprodotti della macinazione ha influenzato la struttura e le proprietà sensoriali del pane. Nelle condizioni sperimentali di questo studio, i valori di durezza del pane contenente sottoprodotti non fermentati erano i più alti, probabilmente a causa dell’alta concentrazione di fibra nella vol. LXIX - Tecnica Molitoria

aprile 2018 ˙ 355

crusca. Come precedentemente riportato in letteratura (Rizzello et al., 2012), la fermentazione con batteri lattici ha migliorato tale aspetto strutturale, abbassandone il valore. Nel complesso, la fortificazione con sottoprodotti della macinazione ha causato una diminuzione della fratturabilità, probabilmente come conseguenza dell’indebolimento della rete di glutine causata dalle fibre.

Tuttavia, il valore più basso è stato trovato per P-SM. L’accettabilità sensoriale del P-SMf è stata valutata mediante un panel test, che ha mostrato un profilo organolettico apprezzato dagli assaggiatori, con un punteggio elevato per l’intensità complessiva del gusto. In particolare, il P-SMf è stato caratterizzato da un gusto e un sapore acidi, dovuti alla fermentazione lattica e risultava anche più sapido rispetto al controllo, probabilmente a causa dell’effetto della proteolisi da parte dei batteri lattici selezionati, che portano ad un marcato aumento degli amminoacidi liberi (alcuni dei quali caratterizzati da intensa sapidità) nel prodotto finito.

CONCLUSIONI Secondo il regolamento CE (n. 1924/2006) sulle indicazioni nutrizionali e salutistiche dei prodotti alimentari, il pane prodotto nel seguente lavoro può essere definito “ad alto contenuto in fibra” perché contiene almeno il 6% di fibre.

Sulla base dei valori soglia per la classificazione degli alimenti in base al loro IG, vengono comunemente considerate tre classi: (i) alimenti con IG basso (valori <55%); (ii) alimenti con IG intermedio (valori 55-70%); (iii) alimenti con IG alto (valori >70%).

Pertanto, il pane ottimizzato può essere definito a “basso indice glicemico” in quanto caratterizzato da un valore di IG di 37%.

Il protocollo biotecnologico proposto nel seguente lavoro è stato ottimizzato e validato a livello industriale presso Vallefiorita S.r.l. e insieme alle modalità 356 ˙ aprile 2018

Tecnica Molitoria - vol. LXIX

ingredienti funzionali d’impiego nella produzione di pani a basso indice glicemico, è stato recentemente brevettato (brevetto n.

102016000015871, depositato il 16 febbraio 2016).

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vol. LXIX - Tecnica Molitoria

Continua la Bibliografia a pag. 375

aprile 2018 ˙ 357

Continua la Bibliografia da pag. 357

Sottoprodotti della macinazione fermentati E. Pontonio - A. Lorusso - A. Minisci - M.Gobbetti - C.G. Rizzello

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