Detección de Inmunoglobulinas por Inmunodifusión

INMUNODIFUSIÓN Es una técnica utilizada para la detección y cuantificación de cualquiera de las inmunoglobulinas. Se basa en la presencia de un precipitado visible resultado de la combinación antígeno-anticuerpo. FUNDAMENTO TEÓRICO La inmunodifusión radial es una técnica de análisis inmunológico de tipo cuantitativo. Se utiliza para detectar la cantidad de anticuerpos que hay en el suero de un individuo. Esta técnica permite cuantificar de manera sencilla y económica inmunoglobulinas de isotipo G, M y A o antígenos solubles (C3, C4, transferrina, etc) presentes en muestras biológicas. La técnica se basa en la difusión de la muestra conteniendo el antígeno a medir (inmunoglobulinas o antígenos solubles) en una matriz semisólida de agar en la que se encuentra disuelto el Ac específico.

PRINCIPIO DEL MÉTODO

El procedimiento consiste en una inmunoprecipitación en agarosa entre un antígeno a cuantificar y su anticuerpo homólogo. Se realiza incorporando uno de los dos reactivos inmunes (generalmente el anticuerpo) uniformemente en una capa de agarosa y luego introduciendo el otro reactivo en pocillos cavados en el gel. El antígeno difunde radialmente en la mezcla gel-anticuerpo y se forma un disco o anillo visible en un punto que depende de la relación estequiometria antígeno-anticuerpo. A medida que más antígeno difunde, el anillo se re disuelve y reaparece a una distancia mayor del pocillo. Este aumento en el diámetro de precipitación continúa hasta que antígeno y anticuerpo reaccionan completamente.

Mientras que el precipitado se está expandiendo (16 a 20 horas) la relación entre el diámetro del anillo y el logaritmo de la concentración de antígeno es aproximadamente lineal. Al completarse la reacción, la relación entre el diámetro al cuadrado y la concentración es lineal.

Para evidenciar la reacción antígeno-anticuerpo se han usado diferentes métodos; de los basados en la inmunoprecipitación y la aglutinación, que adolecen de insuficiente sensibilidad y detectabilidad, se pasó a los que emplean marcadores para detectar dicha reacción. Se han usado isótopos radioactivos, compuestos fluorescentes y quimioluminiscentes, marcadores electroactivos, lantánidos, radicales libres estables, partículas de látex, liposomas, colorantes, coloides, bacteriófagos y enzimas, entre otros.

Las técnicas inmunoenzimáticas constituyen el desarrollo ulterior del radioinmunoanálisis; en lugar de los peligrosos radioisótopos de corta vida media, se emplean enzimas como sustancias marcadoras. Surgieron a mediados de la década de los 60 para la identificación y localización intracelular de antígenos y han tenido un auge vertiginoso, su uso se ha ampliado para la detección de un diverso número de antígenos y anticuerpos.

La técnica ELISA se fundamenta en la premisa de que luego de acoplar antígenos solubles o anticuerpos a una matriz sólida insoluble, éstos retienen la actividad inmunológica y en que estas biomoléculas también pueden unirse a una enzima, reteniendo el conjugado resultante, tanto la actividad enzimática como inmunológica. Estos ensayos se apoyan en tres características biológicas fundamentales: la extraordinaria especificidad de los anticuerpos, el elevado poder catalítico y la alta especificidad de las enzimas. Mediante la combinación de la reacción inmunológica con un indicador altamente sensible, el débil efecto inmunológico se ve reforzado por la amplificación enzimática, de forma que se consigue una elevada sensibilidad y detectabilidad; si a esto le añadimos la especificidad de la reacción inmunológica, se podrá comprender su aplicabilidad en el diagnóstico clínico.