Técnicas Especiales

La inmunofluorescencia es un conjunto de técnicas en las que se emplean anticuerpos para detectar y localizar, antígenos específicos en células y/o tejidos. Al igual de que se ha aplicado para identificar varias subpoblaciones de linfocitos, en especial las de células T CD4 y CD8. También es adecuada para identificar especies bacterianas, detectar complejos Ag-Ab en enfermedad autoinmunitaria, descubrir componentes del complemento en tejidos y localizar hormonas y otros productos celulares teñidos in situ. Desde un punto de vista biológico, la posibilidad de estudiar la presencia de un anticuerpo y de un antígeno en cualquier preparación biológica es siempre importante y muy útil en la inmunología, es por ello que en 1944 Albert Coons mostró que con facilidad se puede marcar los anticuerpos con moléculas que tienen la propiedad de la fluorescencia. Debido a que las moléculas fluorescentes absorben luz de una longitud de onda, siendo denominadas como “excitación” y emiten luz de otra longitud de onda denominada “emisión”. De esta forma la luz emitida puede verse con un microscopio de fluorescencia, que está equipado con una fuente de luz UV. Esta técnica se conoce como inmunofluorescencia, en la cual suelen emplearse compuestos fluorescentes, como fluoresceína y rodamina, pero también otras sustancias muy fluorescentes, por ejemplo: ficoeritrina que es un pigmento de color muy intenso y muy fluorescente color rojo obtenido de algas,el cual absorbe luz de manera eficiente (~30 veces más que la fluoresceína) y por su tono es un buen marcador de inmunofluorescencia. El hecho de que existan distintos fluorocromos capaces de emitir a diferentes longitudes de onda, permite que puedan detectarse Ag diferentes en un mismo corte de tejido o célula.

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Ejemplos:

Fluoresceína: es un colorante orgánico, el cual es el marcador más utilizado para procedimientos de inmunofluorescencia, debido a que absorbe luz azul de 490 nm y emite una fluorescencia verde-amarillo intensa de 517 nm.

Rodamina: es un colorante orgánico, que absorbe en el intervalo del verde y el amarillo de 515 nm y emite una fluorescencia roja intensa de 546 nm. Ya que emite fluorescencia en una longitud de onda más larga que la fluoresceína, puede usarse en pruebas de inmunofluorescencia de dos colores. Es así como la visualización de la fluorescencia puede realizarse utilizando un microscopio de fluorescencia (para cortes de tejido o células en portaobjetos) o por Citometría de flujo (para células en suspensión).

La tinción con anticuerpo fluorescente de moléculas de la membrana celular o de cortes de tejido puede ser directa o indirecta:

En la tinción directa el anticuerpo específico (el anticuerpo primario) se conjuga directamente con fluoresceína, esta tinción se utiliza para diagnosticar enfermedades de tipo autoinmunitario, es decir, aquéllas en las cuales las defensas pierden el control y atacan algún órgano de nuestro propio organismo.

En la tinción indirecta el anticuerpo primario no se marca y se detecta con un reactivo adicional marcado con fluorocromo. En la actualidad se han desarrollado varios reactivos para dicha tinción: el más usual es un anticuerpo secundario marcado con fluorocromo formado en una especie contra anticuerpos de otra especie, un ejemplo es la inmunoglobulina antirratón de cabra marcada con fluoresceína. Una de las ventajas de esta técnica es que no es necesario conjugar el anticuerpo primario con un fluorocromo, ya que los métodos indirectos evitan la pérdida de anticuerpo que suele ocurrir durante la reacción de conjugación. Además de que aumentan la sensibilidad de tinción porque múltiples moléculas del reactivo fluorocromo se unen a cada molécula de anticuerpo primario, lo que incrementa la cantidad de luz que se emite en la localización de cada molécula de anticuerpo primario.

PASOS CLAVES DE UNA INMUNOFLUORESCENCIA:

1. Fijación: se preserva la localización, composición y estructura del material biológico a analizar manteniendo lo más fielmente posible a la situación que existe in vivo. Lo cual dependerá del tipo de microscopia a utilizar, la estructura subcelular que se quiera detectar, entre otras.

2. Permeabilización: se producen poros en las membranas celulares, que permiten el ingreso de los anticuerpos a la célula si queremos detectar estructuras internas de la célula. Estos serán más “suaves” o más “fuertes” según de la naturaleza del compuesto permeabilizante a utilizar (por ejemplo: Tritón X‐ 100, NP40). 3. Bloqueo: su función es impedir interacciones inespecíficas de los anticuerpos con el material biológico a analizar y así reducir la marcación inespecífica, es así como el anticuerpo primario debe competir con la proteína bloqueante para unirse a su epitope y así detectar la estructura de interés. Generalmente se utilizan soluciones proteicas concentradas (por ejemplo: la Albúmina bovina sérica o gelatina de pescado). 4. Inmunodetección: en este último paso se diferencian dos tipos de inmunofluorescencia; directa o indirecta, debido a que la molécula que es reconocida por los anticuerpos se denomina antígeno. Cada antígeno tiene al menos un epítopo o región reconocida por un anticuerpo.