Técnicas de ELISA

“inmunoensayo enzimático heterogéneo” debido a que dicha técnica utiliza Anticuerpos marcados con una enzima (por lo general la peroxidasa) con la cual pueden visualizar la reacción Ag-Ac. Un ejemplo sería: el cambio de color, que haría posible la medición del antígeno en la muestra utilizando la espectrofotometría. Es por ello que la técnica es de gran ayuda para la determinación de Antígenos y de Anticuerpos, así mismo, está siempre dependerá de una enzima. Para la técnica siempre se realiza una separación entre el inmunocomplejo formado sobre la fase sólida y las biomoléculas no fijadas. La técnica ELISA se fundamenta en la premisa de que después de acoplar antígenos solubles o anticuerpos a una matriz sólida insoluble, éstos retienen la actividad inmunológica y las biomoléculas pueden unirse a una enzima, reteniendo el conjugado resultante de la actividad enzimática o inmunológica. En la técnica es posible determinar la presencia de Haptenos al igual de moléculas de alto peso molecular. Algo muy importante de resaltar como ventaja de dicha técnica, es que presenta un alto grado de sensibilidad, detectabilidad, precisión y exactitud, lo que hace que los inmunoensayos enzimáticos según el principio ELISA, puedan equipararse a los radioinmunoensayos (RIA, basado en la formación específica de los complejos antígeno-anticuerpo).

CLASIFICACIÓN:

Se clasifica en competitivos debido a que en estos ensayos los anticuerpos o los antígenos son inmovilizados sobre la fase sólida y su unión con el conjugado antígeno-enzima o anticuerpoenzima, es inhibida por la presencia de analito no marcado en la muestra y también son clasificados en no competitivos, ya que en estos ensayos pueden subdividirse de acuerdo al inmuno reactante inmovilizado, siendo así, ensayos de captura de anticuerpos o de antígenos. Un ejemplo: serían los ensayos de ELISA indirecto.

DETERMINACIÓN DE ANTÍGENOS

Para la determinación de Antígenos se utiliza el modelo ELISA "Sandwich" directo. En el cual, el Anticuerpo específico para el Antígeno de interés, se encuentra adsorbido en un soporte sólido (por ejemplo: una placa de petri), sobre el que se añadirá la muestra biológica que contiene al antígeno, dejándolo reaccionar con el anticuerpo inmovilizado. Luego de lavar la placa de Petri y en dado caso de que en dicha muestra se encuentre el Ag, quedará capturado en la placa y será puesto en evidencia tras la adición de otro Ac específico conjugado con la enzima. Ya que, posteriormente del lavado se agrega un segundo anticuerpo ligado al enzima específico para un epítopo distinto del antígeno y se permite que reaccione con el antígeno unido después de eliminar el segundo anticuerpo mediante el lavado. Por último, se añade el sustrato incoloro que, por acción de la enzima, dará un producto coloreado que producirá un color observable a simple vista y cuantificable mediante un espectrofotómetro.

DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS

Para la determinación de Acs específicos para un determinado Ag se utiliza la modalidad de ELISA indirecto, sobre alguna muestra que contenga el anticuerpo primario (Ab1), como por ejemplo: el suero, se le añade a una placa de Petri recubierta con un antígeno y se permite que reaccione con el antígeno unido a dicha placa. Después de eliminar por lavado cualquier Ab1 libre, la presencia de anticuerpo unido a antígeno se detecta mediante la adición de un anticuerpo secundario (Ab2) conjugado con la enzima, que se une al anticuerpo primario. Posteriormente se elimina por lavado cualquier Ab2 libre y se añade un sustrato para la enzima. Con ello, la cantidad de producto de la reacción de color que se forma se mide con lectores espectrofotométricos de placa especializados, que pueden medir la absorbancia de la totalidad de los fosos de una placa de 96 fosos en segundos. Este modelo se pueden utilizar para antígenos, proteínas virales o bacterianas e incluso virus completos, pero cada día es más frecuente adsorber exclusivamente las proteínas de interés inmunológico. Esta es una de las técnicas de elección para buscar Acs contra proteínas del

virus HIV en sueros de pacientes.

ELISA COMPETITIVO

El método de ELISA competitivo es otra variante para medir cantidades de antígenos. En esta técnica primero se incuba el anticuerpo en solución con una muestra que contiene antígeno. Después la mezcla de antígeno y anticuerpo se añade a un foso de macrotítulo recubierto con antígeno. Es importante recordar: que cuanto más antígeno se encuentra en la muestra, menos anticuerpo libre está disponible para unirse al foso recubierto con antígeno. La adición de un anticuerpo secundario (Ab2) conjugado con la enzima específica para el isotipo (inmunoglobulina) de un anticuerpo primario puede utilizarse para determinar la cantidad de anticuerpo primario unido al foso como en un ELISA indirecto. Sin embargo, en la prueba competitiva cuanto más alta es la concentración de antígeno en la muestra original, más baja será la absorción.