Tesi

Universit` a degli Studi di Roma ‘Sapienza’ ` DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI FACOLTA Corso di Laurea quadriennale in Fisica

Tesi di Laurea

Gli effetti del sale sull’aggregazione di complessi polielettroliti - liposomi cationici

Laureando:

Relatore:

David Sasso

Prof. Federico Bordi

Matricola 694034

Anno Accademico 2011-2012

Ai nonni.

`, Alla mia tribu per aver sognato, sofferto, e lottato insieme a me.

Al gruppo PhOBiA, ` amica una tribu `. che mi ha accolto con generosita

Indice Introduzione

vii

1 Sistemi colloidali ed aggregazione 1.1 Definizione di sistemi colloidali e principali tipi di colloidi . .

1.2 Interazioni tra particelle colloidali cariche - teoria DLVO . .

1.2.1 Forze di Van der Waals . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.3 Stabilit`a dei colloidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.4 I polielettroliti: adsorbimento correlato e particelle decorate 1.5 La formazione degli aggregati di liposomi cationici: il ruolo della patch-attraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1 1 4 10 12 15

. . . . .

. 20

2 Gli 2.1 2.2 2.3

effetti del sale sugli aggregati DOTAP/DOPC - NaPA Punto isoelettrico ed inversione di carica . . . . . . . . . . . .

La condensazione rientrante in presenza di sale monovalente .

Controllo delle dimensioni degli aggregati: bilanciamento fine tra forze a lungo e corto raggio . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.4 Alte concentrazioni di sale: il desorbimento del polielettrolita .

3 Materiali e Metodi 3.1 Liposomi cationici: self-assembling e stabilit`a .

3.1.1 Dinamica di formazione dei liposomi .

3.1.2 Stabilit`a dei liposomi . . . . . . . . . .

3.1.3 DOTAP e DOPC . . . . . . . . . . . .

3.2 NaPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.3 Preparazione dei campioni . . . . . . . . . . .

3.3.1 Sonicazione . . . . . . . . . . . . . . .

3.4 Particle Sizing: Light Scattering Dinamico . .

3.4.1 Teoria del Light Scattering . . . . . . .

3.4.2 Scattering da particelle discrete . . . .

3.4.3 Teoria del Light Scattering Dinamico .

3.4.4 Analisi dei dati . . . . . . . . . . . . . ii

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

23 23 28 31 33 35 35 36 41 43 44 45 46 48 50 52 53 59

iii

INDICE 3.5 3.6

Potenziale ζ: misure di mobilit`a elettroforetica . . . . . . . . . 62 Zetasizer Nano ZS (Malvern) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

4 Risultati 70 4.1 Misure preliminari . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 4.2 Misure di DLS e Potenziale ζ . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 5 Discussione dei risultati 82 5.1 La condensazione rientrante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 5.2 L’inversione di carica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 5.3 Stabilit`a del sistema: il diagramma di fase . . . . . . . . . . . 89 Conclusioni

94

Elenco delle figure 1.1 1.3 1.4 1.5 1.6 2.1 2.2 2.4 2.5 2.6 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17

Distinzione tra dispersioni molecolari, colloidi e bulk . .

Interazione di Van der Waals tra atomo e superficie (a) due superfici (b) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Struttura a blob di un polielettrolita . . . . . . . . . .

Adsorbimento correlato dei polielettroliti . . . . . . . .

Disomogeneit`a di carica e patch attraction . . . . . . .

.

2

. . . .

11 18 19 21

Correlazione degli Z-ion adsorbiti su una superficie carica. .

Cristallo di Wigner-Seitz costituito da Z-ion. . . . . . . . . .

Adsorbimento di Z-ion unidimensionali (rods). . . . . . . . .

Allargamento del picco con la concentrazione di NaCl . . . .

Effetti del sale (a) e del raggio idrodinamico (b) sul potenziale di interazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . .

24 24 27 30

Principali tipi di liposomi . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Entropia con lipidi isolati e aggregati . . . . . . . . . . . . .

Concentrazione degli aggregati lipidici . . . . . . . . . . . . .

Concentrazione micellare critica . . . . . . . . . . . . . . . .

Geometrie degli aggregati di lipidi . . . . . . . . . . . . . . .

Ripiegamento dei foglietti lipidici. . . . . . . . . . . . . . . .

Temperatura di transizione . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Formule di struttura di un fosfogliceride e di uno sfingolipide Formule di struttura dei lipidi DOTAP e DOPC. . . . . . .

Monomero del poliacrilato di sodio (NaPA) . . . . . . . . . .

Cavitazione inerziale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Schema di un esperimento di Light Scattering . . . . . . . .

Vettore di scattering. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Pattern di interferenza e fluttuazioni di intensit`a. . . . . . .

Funzione di autocorrelazione delle intensit`a. . . . . . . . . .

Layer di Stern e layer diffuso . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Approssimazioni di Smoluchowski e Huckel. . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . .

iv

. e . . . .

. . tra . . . . . . . .

. 32 36 37 38 39 40 41 42 43 43 45 48 49 50 54 55 63 65

v

ELENCO DELLE FIGURE 3.18 3.19 3.20 3.21

Principio di una misura di mobilit`a elettroforetica. . . .

Set-up sperimentale di una misura PALS/LVD. . . . .

Fotografia dello strumento Malvern Zetasizer Nano ZS Unit`a mobile dello Zetasizer Nano ZS (Malvern) . . . .

. . . .

. . . .

66 67 68 68

4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7

Misure preliminari per il polielettrolita . . . . . . . . . . . .

Misure preliminari per il sale . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Diagramma di fase preliminare . . . . . . . . . . . . . . . . .

Rh alle varie concentrazioni di NaCl. . . . . . . . . . . . . .

Potenziale Îś alle varie concentrazioni di NaCl. . . . . . . . .

Relazione tra inversione di carica e condensazione rientrante.

Diagramma di fase del sistema. . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . .

72 73 74 76 77 78 80

5.1

Immagini al TEM di piccoli aggregati di complessi polielettrolitiliposomi cationici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Raggi idrodinamici a basse (a) ed alte (b) concentrazioni di NaCl Potenziale Îś a basse (a) ed alte (b) concentrazioni di NaCl . .

Simulazione MC del potenziale di interazione tra particelle decorate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Confronto tra i diagrammi di fase con liposomi costituiti da una miscela DOTAP/DOPC (a) e da solo DOTAP (b) . . . .

5.2 5.3 5.4 5.5

. . . .

. . . .

84 86 88 91 92

Elenco delle tabelle 1.1 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5

Classificazione dei colloidi in base alle fasi disperse e ai mezzi disperedenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Stabilit`a dei liposomi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Caratteristiche chimiche dei lipidi DOTAP e DOPC . . . . . .

Raggio idrodinamico medio e polidispersione dopo la sonicazione e dopo il successivo filtraggio. . . . . . . . . . . . . . . .

Quantit`a impiegate nella preparazione dei liposomi . . . . . .

Concentrazioni di NaPA e NaCl utilizzate nelle preparazioni .

vi

2 42 44 46 47 47

Introduzione Lo studio dei complessi polielettoliti-liposomi, negli ultimi anni, si `e rivelato molto interessante sia da un punto di vista teorico [1] che per le potenziali applicazioni nella veicolazione di farmaci e nelle terapie geniche [2]. In particolare, un’applicazione promettente `e quella della veicolazione di pi` u farmaci in un aggregato multi-compartimento [3]. Tuttavia, l’impiego degli aggregati `e efficace solamente se le loro dimensioni e la loro stabilit`a possono essere controllate in modo preciso e non dannoso per l’organismo ospite.

Recenti studi [4] hanno descritto dettagliatamente il comportamento e la stabilit`a di una dispersione di complessi polielettroliti-liposomi costituiti da un polimero ionizzabile, il poliacrilato di sodio (NaPA), e un lipide cationico (DOTAP). Dai risultati `e emersa la possibilit`a di controllare le dimensioni degli aggregati, e la stabilit`a della dispersione, agendo su due parametri caratterizzanti il sistema: il rapporto di carica polielettrolita/lipide (ξ) e la forza ionica della soluzione, in gran parte determinata dalla concentrazione dell’elettrolita aggiunto (NaCl).

Lo scopo di questa tesi `e quello di valutare gli effetti di un semplice elettrolita (NaCl) sull’aggregazione dei complessi lipidi-polielettroliti, differenziandosi dal caso sopra citato per la composizione lipidica dei liposomi. In questo studio, infatti, si `e scelto di utilizzare una miscela di lipidi cationici (DOTAP) e zwitterionici (DOPC) nel rapporto DOTAP:DOPC = 1:4. I liposomi, di conseguenza, hanno una carica nuda circa cinque volte minore.

Questo dovrebbe rendere pi` u evidenti gli effetti indotti dal sale.

Un ulteriore obiettivo della tesi `e quello di verificare se il poliacrilato di sodio, per effetto del sale, va incontro al fenomeno del desorbimento, come trovato da Yaroslavov et al. [5] con un differente polielettrolita.

Gli effetti del sale sull’aggregazione dei complessi sono stati valutati studiando due fenomeni tipici del sistema: l’inversione di carica e la condensazione rientrante. In aggiunta, si `e analizzata la stabilit`a del sistema tracciandone un diagramma in funzione del rapporto di carica ξ e della concentrazione dell’elettrolita.

Le tecniche sperimentali utilizzate sono il Light Scattering Dinamico (DLS) vii

INTRODUZIONE

viii

e il Potenziale ζ, entrambe disponibili in un unico strumento, il Malvern Zetasizer NANO ZS. Il DLS `e stato impiegato principalmente per determinare le dimensioni (raggi idrodinamici) delle particelle disperse, mentre il Potenziale ζ `e una grandezza di estremo interesse sia per stimare la carica netta dei complessi, che, pi` u in generale, nello studio del potenziale di interazione tra le particelle colloidali.

Di seguito si d`a una breve panoramica del comportamento del sistema, corredata di un modello per il potenziale di interazione in grado di descrivere i fenomeni osservati.

Mettendo in una soluzione acquosa, contenente polielettroliti anionici, una preparazione di liposomi cationici, si osserva un rapido auto-assemblaggio delle particelle. Il processo `e guidato da interazioni di natura principalmente elettrostatica, sebbene siano importanti anche forze entropiche. Al contrario, le forze di natura osmotica, che si originano dagli effetti di svuotamento, non sembrano ricoprire un ruolo dominante. Ci`o `e dovuto al rapido adsorbimento dei polielettroliti sulla superficie carica dei liposomi.

Quando una catena si avvicina con i suoi gruppi ionizzati alla superficie del liposoma, essa interagisce sia con la carica superficiale, sia con le altre catene eventualmente gi`a adsorbite. Le due interazioni sono ovviamente di senso opposto: mentre la superficie, di carica opposta, attrae il polielettrolita, le catene tendono a respingersi l’una con l’altra, a causa della carica omologa.

Questa competizione fa s`ı che i polielettroliti vengano adsorbiti in modo correlato, ovvero depositandosi sulla superficie in domini ordinati costituiti da catene parallele tra loro. Di conseguenza, i complessi polielettroliti-liposomi appaiono dotati di una carica distribuita non uniformemente, con regioni cariche negativamente (dove `e presente il polielettrolita) alternate a regioni cariche positivamente (dove la carica del liposoma `e nuda). In quest’ottica si preferisce dare ai complessi il nome di particelle “decorate”, piuttosto che “rivestite”, proprio per enfatizzare la distribuzione di carica a patch (macchie).

Da tale distribuzione si origina una forza a corto raggio tra i complessi (patchattraction), di natura attrattiva e dipendente dal potenziale di superficie, dalla densit`a di carica e dalla sua disomogeneit`a. I complessi, quindi, possono andare incontro ad aggregazione, qualora la patch-attraction risulti dominante rispetto alla repulsione elettrostatica (peraltro schermata dai contro-ioni in soluzione). L’adsorbimento correlato dei polielettroliti `e causa anche dei due fenomeni discussi nella tesi: l’inversione di carica e la condensazione rientrante.

L’inversione di carica si ha quando sulla superficie viene adsorbita una quantit`a di polielettrolita in eccesso rispetto a quella necessaria alla neutralizzazione. Man mano che aumenta il rapporto di carica polielettrolita/lipide ξ, la carica del liposoma `e via via annullata dal polielettrolita, fino al raggiungi-

INTRODUZIONE

ix

mento del punto isoelettrico; aumentando ulteriormente ξ, si assiste ad una inversione di carica del complesso rispetto alla carica originaria del liposoma.

La carica netta del complesso pu`o raggiungere anche valori molto maggiori della carica superficiale nuda; in questo caso si parla di giant overcharging.

Il fenomeno contro-intuitivo dell’inversione di carica `e legato all’altro comportamento osservato, ovvero la condensazione rientrante. Al crescere di ξ, le dimensioni degli aggregati aumentano fino a raggiungere un picco in prossimit`a del punto isoelettrico; dopo il punto isoelettrico le dimensioni tornano a diminuire, fino a tornare, grossomodo, ai valori dei liposomi nudi.

Sia l’inversione di carica che la condensazione rientrante possono essere interpretati alla luce di un semplice modello, nel quale il potenziale di interazione `e costituito da due termini: il primo (potenziale di Velegol e Thwar [6]) tiene conto sia della repulsione coulombiana tra le particelle cariche, schermata dai contro-ioni presenti in soluzione, sia della patch-attraction; il secondo `e dovuto, invece, alle forze di Van der Waals. Questo secondo contributo `e generalmente trascurato, a causa della debolezza delle interazioni e alla loro breve portata; tuttavia, quando la forza ionica `e sufficientemente alta, il raggio d’azione delle interazioni elettrostatiche diventa confrontabile con quello delle forze di Van der Waals, e queste non possono pi` u essere trascurate.

La presenza del contributo delle forze di Van der Waals ha profonde implicazioni sulla stabilit`a del sistema. In presenza di questo termine, infatti, il potenziale di interazione presenta un minimo secondario, posto aldil`a della barriera repulsiva. Se il minimo secondario `e abbastanza profondo (10 kB T ), le particelle possono aggregarsi indipendentemente dalla reciproca repulsione, poich´e essa opera a distanze minori di quella del minimo. Il processo di aggregazione `e inarrestabile, poich´e l’aumento delle dimensioni degli aggregati ha l’effetto di aumentare la profondit`a del minimo e, quindi, favorire l’aggregazione di altre particelle. La formazione di aggregati macroscopici prende il nome di flocculazione.

A forze ioniche ancora maggiori, il sale pu`o inibire l’adsorbimento del polielettrolita sulla superficie del liposoma. Ci`o significa che dovrebbe esistere una soglia di concentrazione di sale, sopra la quale la patch-attraction risulta meno intensa e l’aggregazione pu`o tornare ad essere un fenomeno arrestato.

Se cos`ı fosse, si osserverebbero nuovamente preparazioni stabili.

INTRODUZIONE

x

Struttura della tesi La tesi `e organizzata in due parti: nella prima, costituita da due capitoli, vengono discussi i concetti necessari alla comprensione del sistema; la seconda parte, ovvero i capitoli 3, 4, 5, descrive le tecniche sperimentali utilizzate, i risultati ottenuti e la loro discussione alla luce di quanto esposto nella prima parte.

Nel dettaglio, il primo capitolo presenta: la definizione e le principali caratteristiche dei sistemi colloidali (par. 1.1); un’introduzione alla teoria delle interazioni tra particelle colloidali (par. 1.2), partendo dalla teoria DLVO e specificando le caratteristiche delle forze di Van der Waals (par.

1.2.1); una discussione sulla stabilit`a dei sistemi colloidali, in base a quanto esposto nel paragrafo precedente (par. 1.3); la descrizione dei polielettroliti, di come avviene l’adsorbimento sulla superficie dei liposomi, mettendo in risalto la correlazione delle catene adsorbite e l’immediata conseguenza di particelle decorate (par. 1.4); il ruolo della patch-attraction nell’aggregazione dei complessi (par. 1.5).

Il secondo capitolo, invece, espone gli effetti del sale sull’aggregazione, ponendo l’accento sui fenomeni dell’inversione di carica (par. 2.1) e della condensazione rientrante (par. 2.2). Nel paragrafo 2.3 si discute l’effetto del sale sul bilanciamento tra le forze repulsive e quelle attrattive, spiegando nel dettaglio il modello adottato per l’interpretazione delle evidenze sperimentali. Infine, il paragrafo 2.4 introduce il fenomeno del desorbimento del polielettrolita, previsto alle alte concentrazioni di sale.

La sezione sperimentale inizia con il capitolo 3, dove vengono descritti nell’ordine: i materiali e il protocollo di preparazione (par. 3.1, 3.2 e 3.3); la tecnica del DLS (par. 3.4); la tecnica del Potenziale ζ (par. 3.5); lo strumento (par. 3.6).

Nel capitolo 4 sono esposti i risultati ottenuti, con l’ausilio di grafici nei quali sono riportati gli andamenti del raggio idrodinamico e del Potenziale ζ in funzione del rapporto di carica ξ (par. 4.2). Prima dei risultati, sono presentate anche le misure preliminari (par. 4.1) che hanno permesso di definire gli intervalli di ξ e di concentrazione di sale pi` u significativi. Nei risultati `e presente anche un diagramma nel quale `e possibile visualizzare la stabilit`a del sistema in funzione di ξ e della concentrazione di sale.

La discussione dei risultati `e rimandata al capitolo 5 ed `e stata divisa in tre punti: la condensazione rientrante (par. 5.1); l’inversione di carica (par.

5.2); la stabilit`a del sistema (par. 5.3).

Infine, nelle conclusioni `e ripresa la discussione dei risultati ottenuti, mettendo in luce i limiti del lavoro e i possibili sviluppi.

Capitolo 1 Sistemi colloidali ed aggregazione 1.1

Definizione di sistemi colloidali e principali tipi di colloidi

I colloidi rappresentano una vasta classe di materiali che si differenziano dagli stati ordinari della materia (solidi, liquidi, gas). Un primo esempio di colloidi `e dato da tutte quelle sostanze intermedie tra i solidi ed i liquidi, comunemente dette soffici. Lo stesso termine “colloide” (dal greco κωλλα, colla) richiama questo aspetto. Tuttavia, con il tempo si `e esteso sempre pi` u il suo significato, fino ad includere molte sostanze che non rispondono al criterio intuitivo di materia soffice. Il carattere distintivo dei colloidi `e stato individuato nella loro struttura microscopica, piuttosto che nelle loro propriet`a macroscopiche.

I sistemi colloidali consistono di una fase dispersa distribuita uniformemente, in uno stato finemente suddiviso, all’interno di un mezzo disperdente (la fase continua). Con il termine “finemente suddiviso” si intende che almeno una delle dimensioni delle particelle sia compresa nel range 1 nm ÷ 1 µm [7].

Pertanto le dispersioni colloidali si differenziano sia dalle soluzioni, nelle quali le particelle del soluto sono sub-nanometriche (molecole), sia dalle sospensioni, dove le particelle sospese eccedono il micron (fig. 1.1).

Entrambe le fasi (disperdente e dispersa) possono essere gassose, liquide o solide. Si ha, di conseguenza, una grande variet`a di sistemi colloidali, elencati in tabella 1.1.

All’elenco proposto si aggiungono alcuni colloidi di interesse biologico: il sangue, che `e una dispersione di corpuscoli in siero; le ossa, una dispersione di fosfato di calcio racchiuso nel collagene; le membrane cellulari, costituite 1

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

Figura 1.1: Distinzione tra dispersioni molecolari, colloidi e bulk. I sistemi colloidali sono caratterizzati da particelle finemente disperse, le cui dimensioni rientrano nel range 1 nm ÷ 1 µm.

Fase dispersa Mezzo Solida Gas Solida

Liquido

Solida

Solido

Liquida Liquida Liquida Gas Gas Micellare

Gas Liquido Solido Liquido Solido Liquido

Polimeri

Liquido

Classe Aerosol solido

Esempi fumo, particolato, polvere Sol dentifricio, alogenuri d’argento Sospensione solida vetri colorati, perle Aerosol liquido nebbia, spray Emulsione latte, creme Emulsione solida gelati Schiuma (foam) schiume Schiuma solida polimeri espansi Colloidi associati sapone, detergenti Gel gel, colle

Tabella 1.1: Classificazione dei colloidi in base alle fasi disperse e ai mezzi disperedenti.

2

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

3

Figura 1.2

da macromolecole (proteine, glucidi, colesterolo) finemente distribuite nella fase continua dei lipidi.

A seconda della loro affinit`a con le molecole del solvente si distinguono colloidi liofilici e liofobici. I primi, in virt` u della loro affinit`a con il solvente, sono facilmente preparati per aggiunta del mezzo disperdente adatto e sono termodinamicamente stabili (∆G di formazione negativa). I colloidi liofobici, invece, a causa della loro repulsione verso il solvente, necessitano di un notevole apporto di energia esterna per essere formati e sono, in genere, termodinamicamente instabili. Particolare caso `e quello dei colloidi di associazione, in cui le particelle disperse sono micelle che si formano spontaneamente quando la concentrazione delle molecole supera un valore critico (vedi par.

3.1.1).

Il fatto che le particelle siano finemente disperse nel mezzo ha profonde implicazioni sul comportamento dei colloidi: l’alto rapporto superficie/volume che ne deriva comporta un aumento considerevole della percentuale di molecole di superficie; queste molecole hanno propriet`a differenti da quelle del bulk, in quanto interagiscono con un minor numero di molecole e in modo non isotropo.

Uno degli effetti pi` u evidenti `e la tensione superficiale, ovvero quella tensione meccanica che si sviluppa lungo la superficie di separazione (interfaccia) tra un fluido ed un materiale differente, sia esso solido, liquido o gassoso. Nel paragrafo 1.3 si vedr`a il ruolo della tensione superficiale nella stabilit`a dei colloidi.

Nel descrivere l’intero sistema, quindi, non `e possibile considerare solo il contributo delle molecole del bulk, ma occorrer`a tener conto in maniera

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

4

specifica delle molecole all’interfaccia. Com’`e stato appena detto, la dispersione fine della particelle implica un alto rapporto superficie/volume (fig. 1.2).

Infatti, se consideriamo per semplicit`a particelle cubiche di lato d composte da molecole identiche (anch’esse cubiche) di lato h, il numero di particelle di superficie `e 6d2 /h2 ; mentre il numero di molecole di bulk `e d3 /h3 . Il rapporto superficie/volume risulta quindi 6h/d ed `e inversamente proporzionale alle dimensioni delle particelle. Valori tipici sono, ad esempio, quelli del bromuro d’argento, dove il volume molare `e di 30 cm3 mol-1 e h = 0.37 nm. In 1 cm3 la frazione di molecole di superficie `e circa 2 su 10 milioni. Se, invece, si suddivide il volume in 1012 particelle di 1 µm, la frazione delle molecole di superficie sale a 1 su 450. Infine, per particelle di 10 nm, la percentuale di molecole di superficie `e del 22 %.

1.2

Interazioni tra particelle colloidali cariche - teoria DLVO

La teoria DLVO, sviluppata da Derjaguin, Landau, Verwey e Overbeek tra il 1941 e il 1948 [8, 9], descrive l’interazione tra particelle colloidali cariche. Il potenziale di interazione `e costituito da due termini: uno repulsivo, dovuto alle cariche superficiali delle particelle, ed uno generalmente attrattivo, dovuto alle forze di Van der Waals V = VR + VA

(1.1)

La repulsione elettrostatica non pu`o essere descritta come semplice repulsione coulombiana tra due particelle dotate di carica, ma deve necessariamente coinvolgere gli ioni presenti in soluzione. Infatti, una carica immersa in una soluzione elettrolitica induce una ridistribuzione degli ioni secondo uno schema ben definito: adiacente alla superficie carica c’`e un primo strato (strato di Stern) costituito quasi esclusivamente da ioni di segno opposto (contro-ioni); il secondo strato (strato diffuso) ha un’estensione maggiore e vede la presenza simultanea di contro-ioni e co-ioni (ioni dello stesso segno della carica superficiale). Questa atmosfera ionica scherma completamente la carica della particella. L’interazione avviene, in realt`a, tra le due nuvole ioniche: quando le particelle si trovano abbastanza vicine da far sovrapporre i rispettivi strati diffusi, si genera tra quest’ultimi una repulsione elettrostatica dovuta alla loro carica omologa (opposta alle cariche superficiali). Un’interpretazione alternativa `e che la carica superficiale sia schermata, a brevi distanze, solo parzialmente dall’atmosfera ionica, generando una repulsione coulombiana tra le particelle in virt` u della loro carica netta. In entrambi le descrizioni

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

5

l’interazione ha luogo solamente quando la distanza tra le particelle `e minore dello spessore dei due strati diffusi: nel primo caso affinch´e le due nuvole si sovrappongano, nel secondo per rendere parziale lo schermo dei contro-ioni.

Per una descrizione quantitativa del doppio strato elettrico si utilizza la teoria di Gouy-Chapman.

Sia Ďƒ la densit`a di carica superficiale, ÎŚ0 il potenziale elettrico di superficie.

La soluzione elettrolitica sia, invece, caratterizzata da una concentrazione ionica c0i (nel bulk) e una costante dielettrica r . Ammesso che gli ioni non attraversino la superficie, possiamo scrivere l’equazione di Poisson: ∇2 ÎŚ = −

Ď 0 r

dove la densit`a di carica degli ioni `e data da X Ď = zi eci (r)

(1.2)

(1.3)

i

e zi `e la valenza dello ione i-esimo.

Se imponiamo l’uguaglianza dei potenziali elettrochimici nel bulk e in un punto qualsiasi a distanza r dalla superficie carica, possiamo ricavare per ci (r) l’espressione ¾0 + zi eΌ(r) + kB T log ci (r) = ¾0 + kB T log c0i

(1.4)

avendo preso ÎŚ(∞) = 0 nel bulk, da cui ci (r) = c0i exp (−zi eÎŚ(r)/kB T )

(1.5)

L’esponenziale, coincidente con il fattore di Boltzmann, ci dice che la presenza della carica superficiale provoca un addensamento di ioni opposti e uno svuotamento di ioni dello stesso segno 1 .

Combinando la 1.2 con la 1.5, si ottiene l’equazione di Poisson-Boltmann (PB):

X zi eÎŚ 2 0 ∇ ÎŚ=− zi ci (r) exp − (1.6) k T B i che, risolta, fornisce il potenziale in funzione della separazione tra le particelle. ` interessante notare che la 1.5 `e rigorosamente valida solamente se il E potenziale elettrico ÎŚ `e dovuto in modo esclusivo a cariche esterne. Nell’equazione PB, invece, esso `e determinato anche dagli ioni in soluzione, che sono 1

occorre considerare che il segno dell’esponente `e dato dal prodotto dei segni dello ione e del potenziale elettrico dovuto alla carica superficiale

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

6

in costante agitazione termica. Ad ogni modo, nell’approssimazione di campo medio, i potenziali Ό nelle due equazioni coincidono.

Nella teoria di Gouy-Chapman si considera il caso di una superficie infinita.

In questo modo la dipendenza di ÎŚ si riduce ad una sola coordinata spaziale, diciamo x, e la PB diviene

d2 ÎŚ zi eÎŚ(x) e X 0 zi ci exp − (1.7) =− dx2 0 r i kB T Per risolvere completamente la 1.7 occorre utilizzare le due condizioni al contorno

dÎŚ =0 dx x→∞

dÎŚ Ďƒ (1.8) =− dx x=0 r 0 La prima impone che il potenziale sia nullo all’infinito, una richiesta ragionevole se si considera il sistema particella-atmosfera ionica complessivamente neutro. La seconda condizione, invece, si ottiene integrando la 1.2 dalla superficie all’infinito e ricordando, ancora una volta, che la carica dell’atmosfera ionica `e uguale, in modulo, alla carica della superficie.

Utilizzando l’identit`a 2 2 d dΌ dΌ dΌ =2 (1.9) 2 dx dx dx dx si ottiene d dx

dÎŚ dx

2

dÎŚ X 0 −zi eÎŚ zi ci exp = dx k T B i

2kB T X 0 d −zi eÎŚ = c exp r 0 i i dx kB T 2kB T = r 0

Integrando la 1.10 da x all’infinito

2 dÎŚ 2kB T X 0 zi eÎŚ = c exp − −1 dx r 0 i i kB T

(1.10)

(1.11)

Nell’estrazione della radice quadrata della 1.11, il segno va scelto coerentemente con il segno della carica superficiale.

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

7

A questo punto, per ricavare la relazione tra la densit`a di carica superficiale Ďƒ e il potenziale di superficie ÎŚ0 , ovvero tra Ďƒ e le concentrazioni ioniche sulla superficie e nel bulk, occorre combinare la seconda delle 1.8 e la 1.11:

2

Ďƒ 2kB T X 0 zi eÎŚ −1 = − = c exp − r 0 r 0 i i kB T 2kB T X sup = (ci − c0i ) (1.12) r 0 i Questa relazione, riarrangiata, porta all’equazione di Grahame (o teorema del valore di contatto) X i

csup = i

X

c0i +

i

Ďƒ2 2kB T r 0

(1.13)

In questa uguaglianza il termine dominante `e quello della densit`a di carica superficiale. Ad esempio, valori tipici 2 potrebbero essere: r = 78.5, kB T = 4.1 ¡ 10−21 J, Ďƒ = 0.2 C/m2 . Con questi numeri, il secondo termine della 1.13 vale circa 11.6 M, mentre le concentrazioni di bulk (il primo termine) sono grossomodo nell’ordine di 1 M. Nel caso di un semplice elettrolita simmetrico e monovalente come il cloruro di sodio (z+ : z− = 1 : 1), la soluzione dell’equazione PB si semplifica notevolmente. L’esponenziale che compare nel lato destro della 1.11 pu`o essere riscritto nel seguente modo:

eÎŚ eÎŚ eÎŚ eÎŚ exp − − 1 = exp − exp − − exp kB T 2kB T 2kB T 2kB T (1.14) e usando la definizione 2 sinh(x) = ex − e−x , si ottiene s

eÎŚ dÎŚ 8kB T c0 =− sinh (1.15) dx r 0 2kB T L’integrazione della 1.15, permette infine di ricavare l’espressione per il potenziale ÎŚ:

2kB T 1 + Γ0 exp (−kD x) ÎŚ(x) = log (1.16) e 1 − Γ0 exp (−kD x) dove sono state introdotte le grandezze Γ0 e kD , rispettivamente un parametro che tiene conto del potenziale di superficie e l’inverso della lunghezza di Debye lD .

2

considerando acqua a temperatura ambiente

8

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR. Le due grandezze sono definite dalle seguenti relazioni:

eÎŚ0 exp (eÎŚ0 /2kB T ) − 1 = tanh Γ= exp (eÎŚ0 /2kB T ) + 1 2kB T s r 0 kB T −1 lD = kD = P 2 0 i (zi e) ci

(1.17)

La lunghezza di Debye `e una grandezza molto significativa in quanto definisce la scala alla quale le interazioni elettrostatiche sono importanti.

Infatti essa `e definita coma la distanza alla quale le interazioni elettrostatiche ` interessante notare che hanno intensit`a uguale all’agitazione termica. E la lunghezza di Debye dipende soprattutto dalla valenza degli ioni, che di conseguenza influenza fortemente la scala alla quale il potenziale decade.

Se invece vogliamo mettere in relazione la densit`a di carica superficiale Ďƒ con il potenziale di superficie ÎŚ0 , basta combinare la 1.15 con la seconda delle 1.8

p eÎŚ 0 (1.18) Ď&#x192; = 8kB T c0 r 0 sinh 2kB T Lâ&#x20AC;&#x2122;equazione PB pu`o essere risolta completamente, e in modo abbastanza semplice, nel caso in cui il eÎŚ/kB T sia minore dellâ&#x20AC;&#x2122;unit`a 3 . A temperatura ambiente kB T vale circa 25 meV, pertanto la condizione `e verificata per ÎŚ < 25 mV. In questo caso `e possibile sviluppare in serie di Taylor lâ&#x20AC;&#x2122;esponenziale presente nella PB: X

X eÎŚ eÎŚ 0 0 eci exp â&#x2C6;&#x2019; â&#x2030;&#x2C6; eci 1 â&#x2C6;&#x2019; (1.19) kB T kB t i i dove sono stati omessi i termini di ordine superiore.

Il termine di ordine P zero si annulla per la neutralit`a del bulk, ovvero i ec0i = 0.

Il primo membro della PB diviene, a questo punto, !

X 2 â&#x2C6;&#x2019; e2 c0i /kB T ÎŚ = â&#x2C6;&#x2019; r 0 kD ÎŚ (1.20) i

avendo utilizzato la definizione di kD data dalla seconda delle 1.17.

Lâ&#x20AC;&#x2122;equazione PB viene finalmente semplificata nella forma â&#x2C6;&#x2021;2 ÎŚ = k 2 ÎŚ nota come approssimazione di Debye-Huckel.

3

si sta considerando sempre il caso di ioni monovalenti, per cui zi = 1

(1.21)

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

9

In questa approssimazione il caso di una superficie piana semi-infinita, considerato nella teoria di Gouy-Chapman, d`a come soluzione unâ&#x20AC;&#x2122;esponenziale decadente: ÎŚ(x) = ÎŚ0 exp (â&#x2C6;&#x2019;kx) (1.22) mentre la densit`a di carica si ottiene linearizzando la 1.18 Ď&#x192; = r 0 kÎŚ0

(1.23)

Finora abbiamo considerato solamente una superficie isolata in soluzione.

Nella teoria DLVO, al contrario, si vuole studiare lâ&#x20AC;&#x2122;interazione tra due superfici cariche.

Ricordiamo che entrambe le superfici sono circondate da un doppio strato diffuso e caratterizzate dallo stesso potenziale elettrochimico (costante allâ&#x20AC;&#x2122;equilibrio). Quando le atmosfere ioniche si intersecano, lâ&#x20AC;&#x2122;eccesso di ioni nella regione di sovrapposizione induce una differenza di pressione osmotica tra il bulk e la suddetta regione. Questa differenza di pressione compensa la variazione di potenziale elettrochimico prodotta dallâ&#x20AC;&#x2122;eccesso di ioni.

In formule,

â&#x2C6;&#x201A;p â&#x2C6;&#x201A;Âľ = ci (1.24) â&#x2C6;&#x201A;x T â&#x2C6;&#x201A;x T La forza che si genera tra le due superfici, di natura repulsiva, si pu`o calcolare integrando la 1.24 e moltiplicando per la superficie. In approssimazione di debole sovrapposizione, la forza repulsiva tra due particelle sferiche separate da una distanza D `e Frep = (64Ď&#x20AC;RkB T c0 Î&#x201C;20 lD )eâ&#x2C6;&#x2019;kD D

(1.25)

dove si pu`o notare, ancora, lâ&#x20AC;&#x2122;importanza della lunghezza di schermo di Debye (lD ). Questa relazione ci dice che aumentando la concentrazione di elettrolita, ovvero diminuendo lD , possiamo ridurre lâ&#x20AC;&#x2122;intensit`a della repulsione elettrostatica tra le particelle colloidali.

Per concludere occorre puntualizzare alcuni limiti di applicabilit`a dellâ&#x20AC;&#x2122;equazione di Poisson-Boltzmann [10]: 1. gli ioni sono considerati puntiformi e si trascurano le interazioni steriche tra di essi 2. essendo stata fatta lâ&#x20AC;&#x2122;approssimazione di campo medio, non si tiene conto delle fluttuazioni delle concentrazioni ioniche 3. non `e considerata la correlazione tra gli ioni, importante soprattutto ad alte concentrazioni o valenze ioniche

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

10

4. non si tiene conto delle forze elettrostatiche dovute a cariche immagine, nel caso in cui la costante dielettrica della superficie sia differente da quella del mezzo 5. la distribuzione superficiale della carica `e assunta continua, mentre in realt`a i gruppi ionici sono distribuiti discretamente

1.2.1

Forze di Van der Waals

La forza di Van der Waals `e la somma di tutte le interazioni tra molecole (o atomi) diverse dai legami chimici. Le forze che contribuiscono all’interazione, comunemente dette forze di Van der Waals, si originano dai dipoli permanenti o indotti delle molecole. Si distinguono: forza di Keesom → tra due dipoli permanenti forza di Debye → tra un dipolo permanente ed uno indotto forza di London → tra dipoli indotti istantanei

Queste forze sono generalmente anisotrope, ovvero dipendono dall’orientazione relativa delle molecole. Il contributo elettrostatico alla forza di Van der Waals (forza di Keesom) risente molto dell’agitazione molecolare e, a temperatura ambiente, `e spesso trascurabile.

Un’approssimazione del potenziale molto utilizzata `e il potenziale di Lennard-Jones

r 6 rm 12 m −2 VLJ = V0 (1.26) r r Vista la dipendenza da r−6 , le interazioni di Van der Waals decadono molto rapidamente con la distanza. Tuttavia, a causa del loro carattere ubiquitario, il contributo delle forze di dispersione nell’interazione tra oggetti macroscopici non `e necessariamente trascurabile.

La teoria che descrive l’interazione di Van der Waals totale tra oggetti o aggregati molto pi` u grandi di una molecola `e la teoria di Hamaker [11], dove si fa la drastica assunzione che l’energia totale di interazione `e data dalla somma delle energie di interazione di ogni coppia. Di seguito si d`a una breve descrizione della teoria; per ulteriori approfondimenti si rimanda il lettore a testi specialistici [12, 13].

Partiamo col considerare il caso di un singolo atomo vicino ad una superficie infinita (fig. 1.3, pannello a). L’atomo `e posto nel vuoto ad una distanza D dalla superficie. Dividendo la superficie in anelli infinitamente sottili di raggio interno x, raggio esterno x + dx e spessore dz si ha che il volume di

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

11

Figura 1.3: Schema per il calcolo dell’interazione di Van der Waals tra atomo e superficie (a) e tra due superfici (b).

ciascun anello `e dV = 2πxdxdz e il numero di atomi presenti sull’elemento di volume `e dN = ρdV , con ρ densit`a atomica della psuperficie. Il generico atomo della superficie dista dall’atomo esterno r = x2 + y 2 .

L’energia totale di interazione si ottiene integrando su tutti gli anelli Z ∞ Z ∞ x dx 2 dz U (D) = −2πCρ = (1.27) (x + z 2 )3 0 Z D∞ πCρ dz πCρ = − =− (1.28) 4 2 6D3 D z Come si pu`o vedere l’interazione totale decade molto pi` u lentamente (D−3 ) −6 rispetto alla singola interazione (D ). La forza di attrazione tra la superficie e l’atomo si ottiene derivando la 1.28.

L’equazione 1.28 pu`o essere utilizzata per calcolare l’energia di interazione per unit`a di superficie tra due superfici infinite, separate da una distanza D nel vuoto e caratterizzate da densit`a atomiche ρ1 e ρ2 (fig. 1.3, pannello b): Z πCρ1 ρ2 ∞ dz πCρ1 ρ2 U (D) ≡ Ua (D) = − =− (1.29) 3 a 6 12D2 D z o pi` u sinteticamente, AH (1.30) 12πD2 dove `e stata introdotta la costante di Hamaker AH = π 2 Cρ1 ρ2 , i cui valori tipici sono dell’ordine di 10−20 J. Il ragionamento pu`o essere esteso a oggetti di forma arbitraria, per i quali U (D) si ottiene integrando sui volumi dei due oggetti: Z Z AH UHamaker = − 2 dV2 dV1 r−6 (1.31) π Ua (D) = −

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

12

Per particelle sferiche si utilizza l’approssimazione di Derjaguin che lega la forza di Van der Waals tra di esse all’energia di interazione tra due superfici infinite:

R1 R2 Fsfer. (D) = 2π Ua (D) (1.32) R1 + R2 Questa espressione `e valida per separazioni molto piccole rispetto ai raggi delle particelle, ovvero D << R1,2 .

La costante di Hamaker non `e propriamente una costante, dipendendo da molti fattori, compresa la separazione tra le superfici. Un calcolo rigoroso di AH richiederebbe la teoria di Lifshitz che coinvolge la teoria quantistica dei campi. Inoltre, la presenza di un mezzo tra le due superfici riduce l’intensit`a dell’interazione 4 e pu`o addirittura rendere l’interazione repulsiva, anzich´e attrattiva [12].

Infine, va sottolineato che la teoria di Hamaker `e applicabile solamente quando la separazione tra le particelle `e piccola. A distanze maggiori occorre tener conto delle rapide fluttuazioni dei dipoli indotti. Infatti, a causa di effetti di ritardo, le interazioni di dispersione decadono con D−7 , invece che con D−6 . La distanza alla quale bisogna tener conto di ci`o pu`o essere stimata dalla frequenza f delle fluttuazioni del dipolo e risulta dell’ordine5 di c/f .

1.3

Stabilit` a dei colloidi

Un principio fondamentale della termodinamica afferma che, se un sistema `e mantenuto a temperatura costante, esso tender`a ad evolvere spontaneamente verso stati a minor energia libera. La stabilit`a `e quindi collegata al raggiungimento di un minimo dell’energia libera. Tuttavia esistono diversi tipi di stabilit`a, a seconda che il minimo sia locale o assoluto: nel primo caso avremo metastabilit`a, ovvero una situazione di equilibrio che pu`o essere cambiata con un sufficiente apporto di energia; nel secondo un equilibrio veramente stabile.

L’energia che separa l’equilibrio metastabile da quello stabile `e chiamata energia libera di attivazione e, nei sistemi termodinamici, `e spesso fornita dall’agitazione termica. In un processo di aggregazione, ad esempio, l’energia di attivazione `e fornita da meccanismi di collisione: se la particella collide con energia sufficiente a superare la barriera di potenziale repulsiva, essa entrer`a a far parte dell’aggregato, ammesso che questa transizione implichi una diminuzione di energia libera.

Nel precedente paragrafo abbiamo visto che le molecole di superficie giocano un ruolo chiave nella descrizione dei colloidi. In effetti una molecola 4 5

tipicamente di un ordine di grandezza gli effetti di ritardo dipendono dal tempo che la luce impiega a propagare le fluttuazioni

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

13

di superficie risente di interazioni differenti da una molecola del bulk: un processo in cui una molecola passa da uno stato all’altro (da superficie a bulk o viceversa) comporta necessariamente una variazione di energia libera.

Come esempio consideriamo la rottura di una colonna di materiale. Il lavoro ∆W necessario a separare i due pezzi `e proporzionale all’area (2A) creata; se il processo avviene in modo reversibile, questo lavoro si traduce in un aumento di energia libera ∆G ∆G = ∆W = 2σA

(1.33)

dove σ `e la tensione di superficie.

Da questo discorso semplicistico sembra che la frattura di un materiale sia sempre sfavorita dall’aumento della superficie di interfaccia e che il sistema debba tornare, prima o poi, alla condizione iniziale. In realt`a, se un liquido si inserisce tra le due porzioni di materiale separate, la situazione cambia: l’insorgere di forze repulsive tra le superfici pu`o rendere stabile la nuova condizione.

Venendo ai colloidi, una dispersione rappresenta uno stato di energia libera maggiore rispetto al materiale in fase continua. Il passaggio dalla fase finemente dispersa alla fase continua avviene in modo spontaneo, a meno che una barriera di potenziale sufficientemente grande non prevenga l’associazione delle particelle.

L’energia necessaria a superare la barriera proviene dal moto browniano delle particelle, risultante dal bombardamento della loro superficie da parte delle molecole del solvente. L’energia cinetica media di una particella in moto browniano `e (3/2)kB T. Se la barriera `e alta (10 kB T) le possibilit`a che una particella possieda l’energia sufficiente a superarla sono trascurabilmente piccole e il sistema, in verit`a metastabile, viene definito colloidalmente stabile.

Viceversa, una barriera di 1 ÷ 2 kB T corrisponde ad un sistema instabile.

L’altezza della barriera dipende da diversi fattori, tra cui: composizione del mezzo, temperatura e pressione.

Un aumento di temperatura, alzando l’energia media delle collisioni, dovrebbe aumentare la probabilit`a di superare la barriera di potenziale; tuttavia questo `e un effetto relativamente piccolo [7].

Infine, bisogna considerare un’ulteriore possibilit`a: a volte i sistemi colloidali presentano un minimo secondario dell’energia libera. Questo minimo secondario, tipicamente profondo pochi kB T, permette la formazione di piccoli aggregati di breve durata (flocculi). Il processo prende il nome di flocculazione debole o flocculazione nel minimo secondario ed `e caratterizzato dalla precariet`a dell’equilibrio: sebbene il moto browniano non sia sufficiente a dissociare gli aggregati, una vigorosa agitazione pu`o disintegrarli facilmente. Nella

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

14

preparazione di dispersioni colloidali stabili bisogna, pertanto, considerare i vari fattori che influenzano l’altezza della barriera energetica che previene l’aggregazione.

I metodi pi` u utilizzati per stabilizzare le dispersioni sono: stabilizzazione elettrostatica → la carica netta presente sulle su-

perfici delle particelle colloidali comporta una barriera elettrostatica repulsiva. stabilizzazione sterica → l’aggregazione ` e sfavorita dall’ingombro di

macromolecole adsorbite sulla superficie delle particelle colloidali Nella stabilizzazione elettrostatica la carica superficiale delle particelle colloidali ha diverse origini: ionizzazione di gruppi funzionali superficiali, differente solubilit`a degli ioni (per una particella formata da ioni), sostituzione ionica isomorfa, superfici cristalline cariche, adsorbimento selettivo di ioni.

La stabilizzazione sterica, invece, coinvolge l’adsorbimento di macromolecole (polimeri) sulla superficie delle particelle colloidali. Ci sono due effetti sul potenziale di interazione: primo, una riduzione delle forze attrattive di Van der Waals; secondo, l’insorgere di una repulsione tra le particelle.

Se consideriamo un rivestimento compatto e stabile 6 , lo spessore δ dello strato adsorbito fa in modo che le particelle non possano avvicinarsi ad una distanza minore di 2(a+δ), dove a `e il raggio delle particelle. In una collisione, quindi, il potenziale attrattivo dovuto alle forze di Van der Waals `e ridotto dalla presenza del rivestimento, che aumenta la distanza tra i centri delle particelle.

Se, invece, lo strato non `e abbastanza compatto da giustificare l’assunzione di urto tra sfere rigide, occorre considerare altri effetti dovuti proprio alla compenetrazione degli strati adsorbiti. In questo caso si assiste all’insorgere di una repulsione tra le superfici, causata da due fattori: primo, l’aumento di concentrazione delle macromolecole adsorbite induce l’ingresso, tra le due superfici, di molecole del solvente (osmosi); secondo, la coesistenza di un maggior numero di segmenti di polimero in una regione ristretta comporta una notevole riduzione di entropia e, quindi, la comparsa di un termine repulsivo nel potenziale (repulsione entropica).

La presenza del polielettrolita ha altri effetti, di cui bisogna tener conto, che contribuiscono all’instabilit`a del sistema. I maggiori sono: bridging flocculation → in una soluzione di polielettroliti sufficiente-

mente lunghi la stessa catena pu`o essere adsorbita, alle sue estremit`a, da particelle diverse, legandole.

6

ovvero che non si distacchi in conseguenza degli urti

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

15

depletion flocculation → quando due particelle vengono a stretto

contatto i polielettroliti non adsorbiti vengono allontanati dalla regione interstiziale; questo svuotamento induce uno svuotamento anche delle molecole di solvente (osmosi) e una conseguente attrazione tra le superfici

1.4

I polielettroliti: adsorbimento correlato e particelle decorate

I polielettroliti sono macromolecole formate da molte unit`a ripetute (monomeri) recanti gruppi ionizzabili, i quali, in un solvente polare, si dissociano liberando contro-ioni nella soluzione e, a causa di ci`o, lasciano carichi i monomeri lungo lo scheletro del polimero. Per la neutralit`a del sistema, la carica presente sulla catena di monomeri dev’essere uguale a quella dei contro-ioni rilasciati.

I polielettroliti manifestano un comportamento diverso dalle particelle colloidali: la differenza `e dovuta principalmente alla loro flessibilit`a e speciale conformazione. Le propriet`a dei polielettroliti, infatti, sono determinate dalla correlazione tra conformazione e interazioni elettrostatiche [14]: la forma del polielettrolita `e dettata dalle forze inter- ed intra-molecolari, ma a sua volta contribuisce a definirle. Tipicamente, la presenza di monomeri carichi lungo la catena instaura forze a lungo raggio che promuovono l’elongazione del polimero.

Il comportamento dei polielettroliti in soluzione `e fortemente influenzato dal tipo di solvente: in buoni solventi la dimensione della catena `e determinata dal bilanciamento tra elasticit`a del polimero e repulsione elettrostatica tra i monomeri [15, 16]; in solventi poveri, invece, i polielettroliti adottano una configurazione a “collana di perle” [17].

Oltre alle interazioni tra i monomeri carichi sulla catena, bisogna considerare gli effetti di schermo dei contro-ioni dispersi in soluzione. A differenza delle soluzioni elettrolitiche, qui c’`e un’intrinseca asimmetria tra le cariche di segno opposto: le cariche lungo la catena sono legate tra loro e si muovono insieme al polimero, mentre i contro-ioni diffondono liberamente. Inoltre, la condensazione dei contro-ioni intorno alle unit`a cariche del polielettrolita `e un fenomeno correlato. Per questo le soluzioni di polielettroliti esibiscono comportamenti interessanti [16], non riscontrabili nelle soluzioni elettrolitiche: 1. passaggio soluzione diluita → semi-diluita a concentrazioni basse (rispetto a catene neutre) 2. picco pronunciato nella funzione di scattering

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

16

3. elevata pressione osmotica legata al contributo dei contro-ioni â&#x2C6;&#x161; 4. viscosit`a proporzionale a c, con c concentrazione del polielettrolita 5. dinamica â&#x20AC;&#x153;non-entangledâ&#x20AC;? in un ampio range di concentrazioni I principali modelli che descrivono il comportamento dei polielettroliti in soluzione si basano sulla condensazione dei contro-ioni, inizialmente introdotta da Imai e Onishi [18], Oosawa [14] e ripresa da Manning [19, 20]. In questi studi il polielettrolita `e schematizzato come una catena infinitamente lunga e sottile e la dispersione di polimeri `e considerata infinitamente diluita. In tal modo lâ&#x20AC;&#x2122;interazione tra gli ioni liberi e la catena `e governata da un piccolo numero di gruppi carichi in una ristretta regione del polielettrolita, essendo i gruppi pi` u distanti schermati. La struttura locale di un breve segmento della catena, in maggior parte determinata dalla repulsione elettrostatica tra i gruppi carichi, pu`o essere supposta estremamente estesa. Inoltre, i gruppi sono schermati, a distanze maggiori, dai contro-ioni e si possono quindi trascurare le interazioni tra polielettroliti differenti (anche in considerazione del regime di forte diluizione). Infatti, per soluzioni molto diluite, la lunghezza di schermo di Debye `e maggiore della distanza tra due gruppi, che quindi possono interagire tramite un potenziale coulombiano non schermato. Le interazioni con gli ioni liberi, invece, sono supposte dipendere unicamente dalla densit`a lineare di carica 7 . In pratica il polielettrolita `e visto come un filo infinito con una carica distribuita linearmente. Infine, la costante dielettrica del solvente `e supposta costante e uguale a quella del solvente puro.

Lâ&#x20AC;&#x2122;idea base della condensazione dei contro-ioni `e che, quando la densit`a di carica della catena supera un valore critico, alcune cariche vengono schermate dagli ioni liberi in soluzione, in modo tale che lâ&#x20AC;&#x2122;energia di repulsione coulombiana tra unit`a cariche adiacenti sia uguale allâ&#x20AC;&#x2122;energia termica kB T .

Nel modello di Manning-Oosawa il parametro che caratterizza elettrostaticamente il comportamento dellâ&#x20AC;&#x2122;intero sistema `e definito dalla relazione Ξb =

lb e2 |zp | = b w kB T b

(1.34)

dove b `e la distanza tra le cariche del polielettrolita, w `e la costante dielettrica del solvente, zp `e la valenza dei gruppi carichi del polielettrolita e lb = e2 |zp |/ w kB T `e la lunghezza di Bjerrum (lb â&#x2C6;ź 7 a temperatura ambiente).

La lunghezza di Bjerrum corrisponde proprio alla distanza alla quale lâ&#x20AC;&#x2122;energia di interazione coulombiana `e uguale allâ&#x20AC;&#x2122;agitazione termica.

7

la carica si immagina uniformemente distribuita lungo la catena

17

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

Figura 1.4: Catena di polielettrolita in un buon solvente, in regime di forte diluizione e in assenza di sale. All’interno di ogni blob la catena ha una conformazione disordinata. Viceversa, su larga scala, i blob sono abbastanza allineati.

Il criterio che stabilisce il verificarsi della condensazione dei contro-ioni afferma che, quando la densit`a lineare di carica del polielettrolita (e|zp |/b) supera il massimo valore consentito (per il quale b < |zc |lB ), i contro-ioni condensano 8 . La condizione di Manning-Oosawa si esprime nella forma 1 lB > b |zp zC |

(1.35)

La frazione dei contro-ioni che restano liberi in soluzione `e f=

b lB |zp zc |

(1.36)

pertanto la frazione che condensa `e 1−f =1−

b lB |zp zc |

(1.37)

Di conseguenza il polielettrolita presenta una carica efficace Qp = zp eN f , con N numero delle unit`a cariche.

Quanto detto finora `e valido nel limite di diluizione infinita. Man mano che la concentrazione di polielettrolita aumenta, bisogna considerare gli effetti associati alla conformazione della catena e la loro influenza sulle propriet`a della soluzione.

I polielettroliti possiedono un’interessante propriet`a, non ancora completamente compresa [21]: la loro conformazione sembra essere fortemente correlata alla carica efficace o, equivalentemente, al loro stato di dissociazione.

Ovviamente la conformazione del polielettrolita dipende anche dalla qualit`a del solvente, in particolare dalla forza ionica.

Il modello che descrive la forma delle catene (scaling model ) si basa sul concetto di lunghezza di scala. In particolare Dobrynin, Colby e Rubinstein [16] hanno individuato due scale significative: la lunghezza di Debye lD e la 8

in modo da riportare la densit` a lineare di carica al valore massimo consentito

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

18

lunghezza di correlazione Ξc . Su scale molto piccole (qualche monomero) le catene formano piccoli â&#x20AC;&#x153;blobâ&#x20AC;? (fig. 1.4), allâ&#x20AC;&#x2122;interno dei quali le interazioni elettrostatiche non sono rilevanti. A causa della condensazione dei contro-ioni ogni blob possiede una carica efficace, ma al suo interno la conformazione `e dettata da interazioni termodinamiche tra i monomeri neutri e il solvente.

Su scale maggiori i blob costituiscono le unit`a per strutture estese, dette â&#x20AC;&#x153;blob di correlazioneâ&#x20AC;?, la cui lunghezza arriva fino a Ξc . La lunghezza di correlazione risulta indipendente dalla lunghezza della catena e inversamente ` importante sottolineare proporzionale alla concentrazione del polielettrolita. E che il modello descrive bene anche le catene adsorbite. Torneremo tra breve su questo aspetto.

Durante lâ&#x20AC;&#x2122;adsorbimento le catene dei polielettroliti rimpiazzano i controioni sulla superficie carica. Se il polielettrolita ha valenza f N , dove f `e la frazione dei monomeri carichi 9 , la lunghezza di Gouy-Chapman 10 `e ÎťGC =

2Ď&#x20AC;lB f N Ď&#x192;

(1.38)

Questa grandezza, inversamente proporzionale alla densit`a superficiale di carica Ď&#x192;, definisce la scala sopra la quale la densit`a dei polielettroliti decade come lâ&#x20AC;&#x2122;inverso della radice quadrata della distanza dalla superficie. â&#x2C6;&#x2019;2 Per Ď&#x192; > lB (f N )â&#x2C6;&#x2019;3 la distanza tra due catene adsorbite `e maggiore della loro distanza media dalla superficie (D); in questo regime, a causa delle forti repulsioni elettrostatiche, le catene tendono ad organizzarsi in un liquido di Wigner fortemente correlato [22], come mostrato in figura 1.5.

Confrontando lâ&#x20AC;&#x2122; energia elettrostatica coinvolta nellâ&#x20AC;&#x2122;adsorbimento di una catena con quella legata alle forze interne, Dobrynin et al. [23] hanno mostrato che, fintantoch´e i polielettroliti non si sovrappongono nello strato adsorbito, lâ&#x20AC;&#x2122;attrazione della superficie non perturba la loro conformazione interna, la quale resta determinata dalle repulsioni elettrostatiche tra i monomeri e dalle interazioni con il solvente; invece essa ha effetti sui gradi di libert`a di traslazione e di orientazione delle catene. Ci`o implica che la frazione f dei contro-ioni non condensati, essendo determinata dalla dimensione dei blob, non viene alterata significativamente dallâ&#x20AC;&#x2122;attrazione della superficie: i polielettroliti, nellâ&#x20AC;&#x2122;adsorbimento, mantengono i loro contro-ioni condensati. Di conseguenza nel calcolare la carica netta del complesso particella-polielettroliti si deve supporre che le catene adsorbite abbiano carica f N .

Diversi studi [24, 25, 26] mostrano che, a causa della competizione di forze attrattive con la superficie e repulsive con le altre catene, i polielettroliti 9

corrispondente alla frazione dei contro-ioni liberi in soluzione ÎťGC `e la distanza dal piano (con densit`a superficiale di carica Ď&#x192;) alla quale lâ&#x20AC;&#x2122;energia kB T potenziale dello ione `e uguale allâ&#x20AC;&#x2122;energia termica. In formule: ÎťGC = 2Ď&#x20AC;Ď&#x192;Ze 10

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

19

Figura 1.5: Schema di adsorbimento delle catene di polielettrolita su una superficie costituita da lipidi zwitterionici (cerchi grigi) e cationici (cerchi bianchi). I polielettroliti tendono a disporsi parallelamente per minimizzare l’interazione reciproca.

sono adsorbiti in modo correlato. Per enfatizzare questo aspetto ci si riferisce ai complessi particella-polielettrolita con il termine “particelle decorate”, anzich´e il pi` u comune “particelle rivestite”. Infatti l’adsorbimento correlato del polielettrolita implica una distribuzione non uniforme delle catene, con la presenza di domini o “patch” di segno alterno, a seconda che ci sia un eccesso o l’assenza di polielettrolita. La presenza di questi domini d`a origine ad una forza di tipo attrattivo tra le particelle, ma rimandiamo la discussione di questo aspetto al prossimo paragrafo.

1.5

La formazione degli aggregati di liposomi cationici: il ruolo della patch-attraction

Uno dei meccanismi che porta alla formazione di aggregati di complessi liposomi-polielettroliti `e la separazione di fase [27]: la separazione di un gas povero e di un liquido ricco di particelle comporta un abbassamento dell’energia libera del sistema ed `e quindi termodinamicamente favorita.

Alternativamente, gli aggregati possono formarsi per aggiunta di particelle “sticky” che aderiscono irreversibilmente in seguito agli urti che occorrono nei

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

20

processi diffusivi.

In entrambi i casi gli aggregati dovrebbero crescere indefinitamente, senza raggiungere una dimensione massima. In realt`a subentrano dei meccanismi di arresto che ne limitano la crescita. Ad esempio, nella diffusion-limited cluster aggregation (DLCA) [28] l’aumento di dimensioni degli aggregati `e limitato dal fatto che, sopra una certa soglia, la probabilit`a di un urto efficace `e trascurabile per via della ridotta mobilit`a.

Classicamente, la formazione di aggregati stabili nei colloidi `e stata giustificata in termini di una competizione tra le forze attrattive a corto raggio e quelle repulsive a lungo raggio. Raggiunta una determinata dimensione, l’aggregato accumula abbastanza carica di superficie da respingere le altre particelle. La scala alla quale le forze repulsive (coulombiane) agiscono `e data dalla lunghezza di Debye lD (vedi par. 1.2); se lD `e dell’ordine delle dimensioni delle particelle primarie, o maggiore, si possono formare aggregati. Questa condizione `e facilmente soddisfatta quando si lavora con particelle colloidali debolmente cariche in un mezzo con una bassa permeabilit`a. Viceversa, gi`a in presenza di ioni monovalenti alla concentrazione molare di 10−2 a T = 25 °C, lD `e dell’ordine dei 10 nm. In quest’ultimo caso la formazione degli aggregati necessita di una diversa spiegazione.

Il semplice meccanismo del “bridging”, nel quale una catena `e adsorbita su due particelle contemporaneamente, non sembra essere l’ipotesi migliore per diverse ragioni: non spiega perch´e la formazione di aggregati si osservi anche con catene relativamente corte [29]; la differente scala temporale dell’adsorbimento e della diffusione rende la probabilit`a del bridging molto bassa; non giustifica il fenomeno della condensazione rientrante (vedi par. 2.2).

Un’interpretazione pi` u convincente `e quella fornita da Velegol e Thwar [6], secondo i quali un ruolo fondamentale `e giocato dalla correlazione nell’adsorbimento del polielettrolita. Come gi`a detto, le forze di attrazione tra la superficie della particella e i polielettroliti insieme alle repulsioni tra le catene producono una distribuzione della carica superficiale non uniforme.

I domini di segno alterno che si formano (patch) sono responsabili di un ulteriore potenziale di interazione tra le particelle, di natura attrattiva, che si va ad aggiungere a quello previsto dalla teoria DLVO. Velegol e Thwar hanno dimostrato che questo potenziale dipende dal potenziale di superficie medio Φ e dalla sua deviazione standard σ. La forza attrattiva che si viene ad instaurare tra due particelle con carica distribuita in modo disomogeneo `e spesso chiamata “charge patch attraction”, per sottolinearne l’origine.

Uno sguardo pi` u approfondito alla natura di questa forza mostra che quando due particelle disomogeneamente cariche si avvicinano, l’energia di interazione `e minimizzata da un’opportuna orientazione dei rispettivi domini, in modo da avvicinare patch di segno opposto (fig. reffig:patch-attraction).

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

21

Figura 1.6: Le disomogeneit`a di carica presenti sulle due superfici si orientano in modo da produrre unâ&#x20AC;&#x2122;attrazione tra le particelle. Questa forza a corto raggio prende il nome di â&#x20AC;&#x153;patch-attractionâ&#x20AC;?.

Il modello proposto prevede la suddivisione della superficie di una particella Ë&#x2020; di forma arbitraria e distribuzione di carica in N regioni di ugual area A, gaussiana. La loro estensione (L) devâ&#x20AC;&#x2122;essere, inoltre, sufficiente a garantire la trascurabilit`a delle interazioni elettrostatiche tra regioni adiacenti (L >> H, lD ). Inotre, i potenziali di superficie delle varie regioni sono supposti indipendenti. Infine si trascurano completamente gli effetti dellâ&#x20AC;&#x2122;orientazione delle particelle causata dalla disomogeneit`a di carica.

Il potenziale di Velegol e Thwar per due particelle sferiche, separate da una distanza H, vale VV T =

kD H eĎ&#x20AC;Ra Rb (Ξa2 + Ξb2 + Ď&#x192;a2 + Ď&#x192;b2 ) log(1 â&#x2C6;&#x2019; eâ&#x2C6;&#x2019;2kD H ) + 2Îśa Îśb log coth Ra + RB 2

(1.39)

dove compare il Potenziale Îś che verr`a introdotto nel paragrafo 3.5.

Per alcune combinazioni di ÎŚ e Ď&#x192; il potenziale mostra un massimo, corrispondente alla barriera che le particelle devono superare per aderire allâ&#x20AC;&#x2122;aggregato ( " 2 # 2 )

2 2 2Îś + Ď&#x192; Îś max VVT = Ď&#x20AC; R (Îś 2 + Ď&#x192; 2 ) log 1 â&#x2C6;&#x2019; + Îś 2 log Îś 2 + Ď&#x192;2 Ď&#x192;2 (1.40) La posizione del massimo `e

1 Îś2 Hmax = log (1.41) kD Îś 2 + Ď&#x192;2 ` interessante notare che un aumento della disomogeneit`a, rappresentata E da Ď&#x192;, comporta, secondo la 1.40, una riduzione dellâ&#x20AC;&#x2122;altezza della barriera

CAPITOLO 1. SIST. COLLOIDALI ED AGGR.

22

ed un aumento della distanza media tra le particelle. Il Potenziale ζ, al contrario, ha un effetto positivo sull’altezza della barriera: valori maggiori di Potenziale ζ significano maggiore repulsione tra le particelle.

Poich´e l’altezza della barriera cresce con il raggio di curvatura, gli aggregati sono effettivamente limitati nelle dimensioni e di forma tendenzialmente sferica 11 . Nello schema appena descritto l’aggregazione delle particelle decorate `e un processo attivato termicamente e finemente regolato dai parametri ζ, σ e kD , oltrech´e dalla dimensione R delle particelle.

In definitiva, `e il bilanciamento tra la componente repulsiva (coulombiana) e i termini attrattivi (charge patch attraction e forze di Van der Waals) a regolare la formazione degli aggregati. Nel prossimo capitolo affronteremo le conseguenze di questo bilanciamento in presenza di un semplice elettrolita (NaCl), discutendo in particolare due dei fenomeni pi` u caratteristici: la condensazione rientrante e l’inversione di carica. Qui vale la pena accennare al fatto che anche questi fenomeni, al pari della disomogeneit`a della carica superficiale, sono una diretta conseguenza dell’adsorbimento correlato del polielettrolita.

11

le protrusioni, caratterizzate da un piccolo raggio di curvatura, sono prontamente eliminate dall’adesione di altre particelle

Capitolo 2 Gli effetti del sale sugli aggregati DOTAP/DOPC NaPA 2.1

Punto isoelettrico ed inversione di carica

L’adsorbimento di ioni polivalenti sulla superficie della particella causa la progressiva neutralizzazione della carica nuda. Ad una concentrazione di ioni opportuna avviene la schermatura completa e la particella colloidale `e vista come un oggetto complessivamente neutro. Questa condizione `e di estrema importanza nello studio dei colloidi perch´e `e intrinsecamente collegata alla stabilit`a delle dispersioni e alla dimensione degli aggregati di particelle. Nel capitolo precedente si `e gi`a discusso del ruolo della carica superficiale nell’interazione tra particelle colloidali. Ora si `e interessati, invece, a stabilire quali siano gli effetti dell’aggiunta di un sale monovalente sulla carica superficiale e quindi sul sistema. In particolare occorre analizzare il duplice ruolo dell’elettrolita: come schermo elettrostatico per la carica superficiale e come promotore dell’adsorbimento degli ioni polivalenti sulla superficie.

Sorprendentemente la neutralizzazione della carica non impedisce l’adsorbimento di ulteriori molecole cariche. Abbiamo gi`a accennato al fatto che i polielettroliti, a causa dell’attrazione con la superficie e la reciproca repulsione, non si dispongono in modo casuale, ma formano un liquido fortemente correlato sulla superficie carica (fig. 2.1). Nella teoria di Debye gli ioni, non correlati, hanno il solo effetto di schermare la carica della particella; al contrario, la correlazione rende possibile una over-compensazione della carica e la particella mostra, vista dall’esterno, una carica netta di segno opposto a 23

CAPITOLO 2. EFFETTI DEL SALE SUGLI AGGREGATI

24

Figura 2.1: Correlazione degli Z-ion adsorbiti su una superficie carica: gli ioni si dispongono secondo lo schema di un liquido di Wigner.

Figura 2.2: Un cristallo di Wigner costituito da Z-ion su una superficie uniformemente carica. La cella esagonale di Wigner-Seitz pu`o essere semplificata con un disco di raggio R.

quella originaria. Questo fenomeno controintuitivo `e chiamato overcharging (inversione di carica).

Lâ&#x20AC;&#x2122;inversione di carica `e un fenomeno generale che si manifesta ogni volta che ioni ad alta valenza (Z-ion) partecipano allo schermo elettrostatico.

Ad esempio in sistemi composti da particelle positivamente cariche in una soluzione contenente DNA. Le teorie di Gouy-Chapman, Debye-Huckel e Onsager-Manning, citate nel primo capitolo, si basano tutte sullâ&#x20AC;&#x2122;equazione di Poisson-Boltzmann che `e ottenuta nellâ&#x20AC;&#x2122;approssimazione di campo medio. Questo approccio `e soddisfacente quando si lavora con ioni monovalenti, per i quali la correlazione `e trascurabile, mentre presenta delle criticit`a in presenza di Z-ion.

Se consideriamo una disposizione degli Z-ion secondo lo schema mostrato in figura 2.2 `e possibile assegnare ad ogni ione unâ&#x20AC;&#x2122;area Ď&#x20AC;R2 = 1/n, con n = Ď&#x192;/Ze densit`a ionica superficiale. La dimensione di ogni cella `e r Ze R = (Ď&#x20AC;n)â&#x2C6;&#x2019;1/2 = Ď&#x20AC;Ď&#x192; 2 2 R Z e = 2Î&#x201C;, Î&#x201C;= (2.1) ÎťGC RkB T avendo utilizzato la definizione di ÎťGC (eq. 1.38) e introdotto il parametro Î&#x201C; noto come costante di accoppiamento di Coulomb.

Per Z = 1 (ioni monovalenti), il sistema `e debolmente accoppiato e Î&#x201C; â&#x2C6;ź 1: lâ&#x20AC;&#x2122;approssimazione di campo-medio `e valida. Gi`a per Z = 3 si

CAPITOLO 2. EFFETTI DEL SALE SUGLI AGGREGATI

25

Figura 2.3: Avvicinandosi alla superficie gi`a neutralizzata lo Z-ion respinge le cariche omologhe creando una lacuna di segno opposto. La lacuna `e la causa dellâ&#x20AC;&#x2122;attrazione dello ione in eccesso.

ottiene Î&#x201C; = 6.4, e R risulta molto pi` u grande di ÎťGC . In questa condizione gli ioni non interagiscono tra loro quando si trovano ad una distanza dalla superficie minore di R e la trattazione che ha portato allâ&#x20AC;&#x2122;equazione PB perde di consistenza. I sistemi caratterizzati da Î&#x201C; >> 1 necessitano, quindi, di una descrizione alternativa.

Nel 1999 Perel e Shklovskii [30] hanno proposto un modello nel quale lo schermo `e confinato in una regione estremamente vicina alla superficie e lâ&#x20AC;&#x2122;atmosfera ionica pu`o essere approssimata con un liquido bidimensionale fortemente correlato. Quando uno Z-ion si avvicina alla superficie gi`a neutralizzata, esso respinge gli ioni gi`a adsorbiti sulla superficie, creando una lacuna (lacuna di correlazione) come in figura 2.3. Lo Z-ion `e infine attratto dalla lacuna (di segno opposto). Chiamando x la distanza dalla superficie, per x << R lâ&#x20AC;&#x2122;effetto degli altri ioni `e trascurabile e la concentrazione degli ioni `e regolata da un campo elettrico uniforme pari a E = 2Ď&#x20AC;Ď&#x192;/ . Il numero di ioni alla distanza x `e N (x) = Ns exp (â&#x2C6;&#x2019;x/ÎťGC )

(2.2)

dove Ns ' n/ÎťGc `e la concentrazione degli Z-ion vicino alla superficie.

Per x >> R la lacuna di correlazione si comporta come una carica immagine puntiforme ed il suo effetto `e trascurabile a grandi distanze 1 . In questa regione si ha una concentrazione di ioni uniforme

1.65Z 2 e2 N0 = Ns exp â&#x2C6;&#x2019; (2.3) RkB T Nella teoria di Gouy-Chapman la concentrazione degli ioni ha un andamento ben diverso: NGC (x) = 1

kB T 2 2 2Ď&#x20AC;e Z (x +

ÎťGC )2

(2.4)

la scala alla quale lâ&#x20AC;&#x2122;energia di interazione ione-lacuna diventa paragonabile a kB T `e x = Î&#x201C;2 ÎťGC /2

CAPITOLO 2. EFFETTI DEL SALE SUGLI AGGREGATI

26

La differenza `e dovuta, appunto, allâ&#x20AC;&#x2122;effetto della correlazione degli ioni.

Il numero di Z-ion che aderiscono su una superficie neutralizzata, o di segno invertito, dipende dal bilanciamento tra le forze repulsive di tipo coulombiano e lâ&#x20AC;&#x2122;attrazione che deriva dalla correlazione degli ioni. La carica netta della particella dopo lâ&#x20AC;&#x2122;adsorbimento di un eccesso di Z-ion pu`o essere calcolata da considerazioni sul potenziale chimico [26]: Qâ&#x2C6;&#x2014; =

r kB T log(N/N0 ) Ze

(2.5)

dove N `e la reale concentrazione di Z-ion e N0 `e quella necessaria alla neutralizzazione della carica superficiale. Chiaramente, per N > N0 si ha unâ&#x20AC;&#x2122;inversione di carica dovuta allâ&#x20AC;&#x2122;eccesso degli Z-ion. I valori tipici di N0 sono molto bassi; ad esempio, per Z = 3 si ha N0 = 0.3 mM. Di conseguenza non `e difficile realizzare praticamente le condizioni per lâ&#x20AC;&#x2122;inversione di carica, come riscontrato empiricamente anche nel presente lavoro.

Naturalmente non `e sensato aspettarsi che lâ&#x20AC;&#x2122;inversione di carica possa crescere indefinitamente: lâ&#x20AC;&#x2122;entit`a massima dellâ&#x20AC;&#x2122;overcharging `e, nel caso di Z-ion sferici, p Qâ&#x2C6;&#x2014; = 0.83 QZe (2.6) ` possibile ottenere inversioni di carica superiori grazie allâ&#x20AC;&#x2122;aggiunta di un E sale monovalente, come il cloruro di sodio, o con lâ&#x20AC;&#x2122;utilizzo di Z-ion lineari. Gli ioni monovalenti dellâ&#x20AC;&#x2122;elettrolita hanno il solo effetto di schermare le interazioni elettrostatiche, non essendo soggetti alla correlazione tipica degli Z-ion. Ci`o comporta un sostanziale aumento dellâ&#x20AC;&#x2122;overcharging: lo schermo del sale riduce lâ&#x20AC;&#x2122;energia potenziale elettrostatica, mentre non ha conseguenze altrettanto immediate sulla correlazione degli Z-ion adsorbiti.

Nguyen et al. [24] hanno calcolato analiticamente la dipendenza del rapporto Ď&#x192; â&#x2C6;&#x2014; /Ď&#x192; dalla lunghezza di schermo di Debye lD nei due casi limite: lD >> R0 e lD << R0 , dove si ricorda che R0 = (Ď&#x20AC;Ď&#x192;/Ze) `e la dimensione della cella di Wigner-Seitz nel punto di neutralizzazione. Le relazioni ottenute sono:

Ď&#x192;â&#x2C6;&#x2014; R0 = 0.41 << 1 (lD >> R0 ) (2.7) Ď&#x192; lD

2 Ď&#x192;â&#x2C6;&#x2014; Ď&#x20AC; R0 = â&#x2C6;&#x161; (lD << R0 ) (2.8) Ď&#x192; 2 3 lD log(R0 /lD ) In entrambe le relazioni, lâ&#x20AC;&#x2122;overcharging (Ď&#x192; â&#x2C6;&#x2014; /Ď&#x192;) cresce al diminuire di lD ; ad alte concentrazioni di sale (eq. 2.8), pu`o superare il 100 %. Sopra una certa soglia il sale monovalente pu`o indebolire anche i legami tra gli

CAPITOLO 2. EFFETTI DEL SALE SUGLI AGGREGATI

27

Figura 2.4: Adsorbimento di Z-ion unidimensionali (rods). I polielettroliti si dispongono parallelamente formando un cristallo di Wigner unidimensionale di passo A.

Z-ion adsorbiti, provocando la dissoluzione del liquido fortemente correlato.

Conseguentemente sparisce anche il fenomeno dellâ&#x20AC;&#x2122;inversione di carica.

Tornando un momento sul ruolo della correlazione degli Z-ion, vale la pena considerare il caso molto interessante dei polielettroliti, nei quali i gruppi ionizzati sono disposti linearmente lungo una catena (in prima approssimazione) estesa. La geometria che meglio rappresenta un polielettrolita `e quella di rod (asta). Rod carichi adsorbiti sulla superficie della particella tendono a disporsi parallelamente a causa delle forti repulsioni laterali, formando un cristallo di Wigner unidimensionale di passo A in direzione perpendicolare ai polielettroliti (fig. 2.4). Se la catena `e caratterizzata da una densit`a lineare Ρ lâ&#x20AC;&#x2122;overcharging ad alte concentrazioni di sale, `e descritto dalla relazione [31] Ρ/Ď&#x192;lD Ď&#x192;â&#x2C6;&#x2014; = Ď&#x192; log(Ρ/Ď&#x192;lD )

(lD << A0 )

(2.9)

dove A0 = Ρ/Ď&#x192; `e la distanza laterale tra le catene quando si raggiunge la neutralizzazione della carica. Anche qui Ď&#x192; â&#x2C6;&#x2014; /Ď&#x192; cresce al diminuire di lD , raggiungendo, a differenza degli Z-ion sferici, il 200 % (giant overcharging).

Questa differenza `e dovuta alla maggiore correlazione delle catene rispetto agli Z-ion sferici, a sua volta derivante dallâ&#x20AC;&#x2122;estensione dei polielettroliti. In pratica lâ&#x20AC;&#x2122;ordine su piccola scala del cristallo di Wigner `e preservato anche a piccoli valori di Ď&#x192;lD .

Alcuni polielettroliti non sono propriamente delle catene rigide, manifestando invece una certa flessibilit`a. Nel paragrafo 1.4 si `e visto che un polielettrolita `e caratterizzato da varie scale, tra cui la lunghezza di persistenza, alla quale la catena composta da blob carichi appare estesa. Inoltre, `e stato anche accennato al fatto che, una volta adsorbito, esso resta appiattito sulla superficie. In questâ&#x20AC;&#x2122;ottica, anche se flessibile, il polielettrolita si comporta come schematizzato sopra. Lâ&#x20AC;&#x2122;unica accortezza `e quella di considerare la corretta densit`a lineare, che a causa della condensazione dei contro-ioni vale Ρ 0 = (f ekB T /l2 ), dove l `e la lunghezza di persistenza. Viceversa, si ha una sensibile differenza di comportamento tra catene rigide e flessibili quando la densit`a superficiale Ď&#x192; `e tale da rendere la distanza tra i polielettroliti (A)

CAPITOLO 2. EFFETTI DEL SALE SUGLI AGGREGATI

28

confrontabile con la loro estensione trasversale (a), ovvero quando le catene entrano in contatto tra loro.

2.2

La condensazione rientrante in presenza di sale monovalente

L’overcharging, insieme al bilanciamento tra forze repulsive e forze attrattive, d`a luogo ad un fenomeno noto con il nome di condensazione rientrante delle particelle decorate. Man mano che il rapporto di carica polielettrolita/lipide aumenta, la riduzione della carica netta dei complessi favorisce la formazione di aggregati stabili sempre pi` u grandi. In prossimit`a del punto isoelettrico, essi raggiungono la dimensione massima. Superato questo punto, un ulteriore aumento del rapporto di carica polielettrolita/lipide comporta la formazione di aggregati pi` u piccoli. Aumentando il contenuto di polielettrolita, `e possibile che la repulsione tra le particelle sia cos`ı forte, e l’adsorbimento del polielettrolita cos`ı uniforme, da impedire completamente l’aggregazione. In questo caso si ritrovano particelle della stessa dimensione di quelle osservabili in assenza di polielettrolita 2 .

Bordi, Sennato e Truzzolillo [4] hanno recentemente mostrato che questa complessa fenomenologia `e ben spiegata da un semplice potenziale di interazione dato dalla somma di due termini: il primo, introdotto da Velegol e Thwar [6] sulla base del modello HHF (Hogg-Healy-Fuerstenau), descrive l’interazione elettrostatica dovuta alla carica superficiale e alla sua distribuzione non uniforme; il secondo, invece, tiene conto delle forze di Van der Waals. Entrambi i termini sono ricavati nell’approssimazione di Derjaguin, secondo la quale la forza tra le superfici delle due particelle interagenti `e proporzionale ad un raggio “efficace” (Reff ), il cui reciproco `e la somma dei reciproci dei raggi delle particelle (Ra,b ). L’approssimazione vale per distanze −1 d << Ra,b e kD << Ra,b , dove kD `e l’inverso della lunghezza di schermo di Debye. In queste condizioni, il potenziale dovuto alla patch-attraction mostra una barriera di altezza proporzionale a Reff . L’aggregazione delle particelle decorate pu`o essere pertanto descritta come un processo attivato termicamente dove, a causa della dipendenza della barriera da Reff , una dimensione finita `e stabilizzata. Una descrizione pi` u dettagliata di questo modello `e presentata nel paragrafo 2.3.

Il fenomeno della condensazione rientrante `e generale e non dipende dai dettagli della struttura chimica dei componenti. Infatti `e stato osservato con diversi polielettroliti e sistemi colloidali, quali micelle [32], particelle di 2

trascurando lo spessore dello strato di polielettrolita adsorbito

CAPITOLO 2. EFFETTI DEL SALE SUGLI AGGREGATI

29

latex [33], vescicole di fosfolipidi [34]. Al contrario, presenta una sensibile dipendenza da alcuni parametri fisici della soluzione che influenzano il raggio e l’intensit`a della forza tra le particelle: temperatura, forza ionica, lunghezza e flessibilit`a delle catene.

Gli effetti del sale sul fenomeno della condensazione rientrante sono legati, principalmente, al suo ruolo di schermo. Una maggiore forza ionica si traduce in un minore raggio d’azione delle forze elettrostatiche, mentre non ha effetti immediati sulla correlazione nell’adsorbimento dei polielettroliti, e quindi sull’intensit`a della patch-attraction. Inoltre, se la forza ionica `e sufficientemente alta, il contributo delle forze di Van der Waals non pu`o essere pi` u ignorato. Anzi, rappresenta la chiave di lettura per un fenomeno che si osserva proprio ad alta forza ionica: la flocculazione secondaria. In figura 2.6 `e mostrato il potenziale di interazione a diverse concentrazioni di sale (pannello a) e per diverse dimensioni degli aggregati (pannello b). Come si pu`o vedere nel pannello (a) il sale ha il duplice effetto di abbassare la barriera repulsiva (fino alla totale scomparsa) e di causare la comparsa di un minimo secondario (dovuto al contributo delle forze di Van der Waals). Entrambi questi effetti concorrono a facilitare l’aggregazione dei complessi. Tuttavia, la formazione di aggregati via via pi` u grandi porta ad un innalzamento della barriera repulsiva (pannello b). In definitiva si ha un meccanismo di arresto, regolato dalle dimensioni degli aggregati, che previene il raggiungimento del minimo primario. Ad ogni modo, la flocculazione `e comunque possibile nel minimo secondario, la cui profondit`a aumenta con le dimensioni degli aggregati (pannello b). Questo meccanismo prende il nome di flocculazione secondaria e si traduce, generalmente, nella formazione di piccoli aggregati, facilmente dissociabili con un apporto di energia esterna.

In presenza di sale, gli aggregati stabili si formano solamente lontano dal punto isoelettrico, ovvero dove la carica netta `e sufficiente ad evitare la flocculazione. Per questo si assiste ad un allargamento della regione di instabilit`a del sistema con l’aumento della forza ionica (fig. 2.5). Ai rapporti di carica per i quali si osservano aggregati finiti, l’innalzamento della barriera repulsiva occorre prima della comparsa del minimo secondario, vanificandone l’effetto. Vicino al punto isoelettrico, viceversa, `e il minimo secondario a raggiungere per primo un’altezza tale da rendere l’aggregazione termodinamicamente favorita.

Prendendo in esame un rapporto polielettrolita/lipide per il quale il sistema `e stabile indipendentemente dalla quantit`a di sale, si osserva (fig. 2.5) che una maggiore concentrazione di elettrolita implica un aumento delle dimensioni degli aggregati (si segua un’immaginaria linea verticale in corrispondenza di un fissato valore di ξ).

CAPITOLO 2. EFFETTI DEL SALE SUGLI AGGREGATI

30

Figura 2.5: Raggio idrodinamico medio hR/R0 i degli aggregati in funzione del rapporto molare polielettrolita/lipide, in assenza (•) e a diverse concentrazioni di NaCl. Le ombreggiature rappresentano le regioni di instabilit`a. All’aumentare della concentrazione di sale si assiste ad un allargamento delle regioni di instabilit`a.

2.3

Controllo delle dimensioni degli aggregati: bilanciamento fine tra forze a lungo e corto raggio

Nel paragrafo precedente si `e accennato al fatto che i fenomeni dell’overcharging e della condensazione rientrante possono essere interpretati sulla base di un semplice potenziale di interazione, costituito da due termini: il potenziale di Velegol e Thwar e un termine che tiene conto delle forze di Van der Waals.

Il potenziale di Velegol e Thwar, espresso analiticamente dalla 1.39, descrive l’interazione tra due particelle con distribuzione di carica superficiale disomogenea, e tiene conto sia della patch-attraction che della repulsione tra particelle dotate di carica omologa. ` facile mostrare che in assenza di sale, date le basse concentrazioni geneE ralmente utilizzate negli esperimenti, il raggio delle interazioni elettrostatiche, ovvero la lunghezza di schermo di Debye, `e cos`ı grande da rendere trascurabile il termine attrattivo delle forze a corto raggio di Van der Waals. Tuttavia, se si aumenta la forza ionica, dipendente in larga misura dalla quantit`a di sale aggiunto, la lunghezza di schermo lD diventa comparabile con il raggio d’azione delle forze di Van der Waals e quindi il loro contributo non pu`o essere pi` u trascurato.

Utilizzando l’approssimazione di Derjaguin, in accordo con le assunzioni fatte nella derivazione di Velegol e Thwar, le interazioni di Van der Waals possono

CAPITOLO 2. EFFETTI DEL SALE SUGLI AGGREGATI

(a)

31

(b)

Figura 2.6: PANNELLO (a): effetto del sale sul potenziale di interazione (eq. 2.11). al crescere della forza ionica la barriera di potenziale si abbassa.

Il sale provoca la comparsa di un minimo secondario. A forze ioniche maggiori la barriera `e completamente rimossa e il potenziale presenta un unico minimo profondo.

PANNELLO (b): effetto del raggio idrodinamico sul potenziale (eq. 2.11).

Lâ&#x20AC;&#x2122;aumento delle dimensioni delle particelle provoca un innalzamento della barriera e un aumento della profondit`a del minimo secondario.

essere descritte [35], nel caso dei liposomi (gusci sferici), dallâ&#x20AC;&#x2122;espressione:

1 1 1 1 AH RA RB â&#x2C6;&#x2019; â&#x2C6;&#x2019; + VV dW = â&#x2C6;&#x2019; 6(RA + RB ) H + hA + hB H + hA H + hB H

H(H + hA + hB ) AH â&#x2C6;&#x2019; log (2.10) 6 (H + hA )(H + hB ) dove RA e RB sono i raggi delle particelle, hA e hB gli spessori dei rispettivi gusci, H la separazione tra di esse; AH `e la costante di Hamaker, gi`a introdotta nel paragrafo 1.2.1.

Aggiungendo questo termine al potenziale di Velegol e Thwar (eq 1.39) si ottiene: V

= â&#x2C6;&#x2019; â&#x2C6;&#x2019;

Ď&#x20AC;RA RB kD H 2 2 2 2 (ÎśA + ÎśB + Ď&#x192;A + Ď&#x192;B ) log(1 â&#x2C6;&#x2019; eâ&#x2C6;&#x2019;2kD H ) + 2Îśa ÎśB log coth RA + RB 2

AH RA RB 1 1 1 1 â&#x2C6;&#x2019; â&#x2C6;&#x2019; + 6(RA + RB ) H + hA + hB H + hA H + hB H

AH H(H + hA + hB ) log 6 (H + hA )(H + hB )

(2.11)

La figura 2.6 mostra lâ&#x20AC;&#x2122;evoluzione del potenziale descritto dalla 2.11 allâ&#x20AC;&#x2122;aumentare della forza ionica. Le curve si riferiscono ad un caso realistico con A = B, RA = RB = 100 nm, ÎśA = ÎśB = 25 mV, Ď&#x192;A = Ď&#x192;B = 15 mV,

CAPITOLO 2. EFFETTI DEL SALE SUGLI AGGREGATI

32

AH = 10−20 J, T = 298 K. Mentre a bassa forza ionica le forze di Van der Waals possono essere trascurate ed il processo di aggregazione `e regolato solamente dalla barriera di potenziale, sopra una determinata soglia di concentrazione di elettrolita compare un minimo secondario che modifica la cinetica di aggregazione e la stabilit`a termodinamica della dispersione. A forze ioniche ancora maggiori la barriera repulsiva scompare definitivamente e la curva mostra solamente un minimo profondo. In questa condizione il colloide `e completamente destabilizzato.

Dall’equazione 2.11 emerge che le dimensioni degli aggregati risultano determinate da un fine bilanciamento tra la repulsione elettrostatica (governata dalla carica netta delle particelle), la patch-attraction (dovuta alla disomogeneit`a della carica superficiale) e le interazioni di Van der Waals (rilevanti solamente ad alta forza ionica). Per valutare quantitativamente il raggio stabilizzato e l’effetto del sale sull’ampiezza della regione di instabilit`a, si pu`o utilizzare la legge di Noro-Frenkel [36]. Truzzolillo [21] ha seguito questo approccio elaborando la seguente procedura per le simulazioni Monte Carlo: 1. si tronca il potenziale a H = Hmax imponendo Vmax = ∞ (di fatto Vmax > 10kB T ) 2. si calcola per ogni valore di R il secondo coefficiente del viriale, definito dalla relazione Z ∞ 1 B2ef f = − (e−U2 (r)/kB T −1) 4πr2 dr 2V 0 3. aumentando R il B2ef f diminuisce e il sistema si stabilizza se la barriera Vmax raggiunge il valore 10kB T prima che B2ef f raggiunga il valore critico -1.81 [37] Le simulazioni sono in buon accordo con i dati sperimentali per bassi rapporti polielettrolita/lipide [38], mentre si discostano dal comportamento empirico nella regione dell’overcharging. Ci`o `e dovuto, con ogni probabilit`a, al contributo del polielettrolita alla forza ionica, che nella teoria di Debye-Huckel non `e quantificabile in modo semplice.

Riassumendo, nel modello dell’interazione tra due particelle appena descritto, il sale riduce il raggio d’azione delle forze elettrostatiche, rendendolo paragonabile a quello delle forze di Van der Waals. Introducendo il loro contributo nel potenziale di interazione (eq. 2.11), si osserva la comparsa di un minimo secondario. Parallelamente, l’aggiunta di sale provoca un abbassamento della barriera repulsiva tra le particelle. Entrambi gli effetti

CAPITOLO 2. EFFETTI DEL SALE SUGLI AGGREGATI

33

contribuiscono allâ&#x20AC;&#x2122;instabilit`a del sistema. Tuttavia, considerando anche la dipendenza del potenziale di interazione dal raggio degli aggregati, risulta che lâ&#x20AC;&#x2122;altezza della barriera cresce con R, cos`Äą come la profondit`a del minimo. In definitiva lâ&#x20AC;&#x2122;aggregato sar`a stabilizzato ad una dimensione che dipende dalla velocit`a con cui barriera e minimo raggiungono un valore molto pi` u grande dellâ&#x20AC;&#x2122;energia termica.

Infine, se la forza ionica `e sufficientemente alta, si assiste alla scomparsa della barriera repulsiva e il potenziale di interazione `e caratterizzato da un unico minimo profondo. Lâ&#x20AC;&#x2122;aggregazione non `e pi` u arrestata e il colloide `e definitivamente destabilizzato.

2.4

Alte concentrazioni di sale: il desorbimento del polielettrolita

Lâ&#x20AC;&#x2122;ultimo fenomeno legato allâ&#x20AC;&#x2122;aggiunta di sale che verr`a considerato `e il desorbimento del polielettrolita.

A causa della presenza di diverse scale, una teoria completa del desorbimento dei polielettroliti non `e ancora stata formulata. Esistono, invece, diversi modelli che si applicano a regimi particolari. Tra gli approcci pi` u utilizzati troviamo: soluzioni delle equazioni di campo-medio linearizzate; teorie di scala; formulazione di un criterio empirico per la transizione adsorbimentodesorbimento; modelli a multistrati di Stern, dove si utilizza un lattice discreto costituito da siti che possono essere occupati da un monomero, una molecola di solvente o un piccolo ione. Per un elenco esaustivo si veda [39].

Winkler e Cherstvy [40] hanno proposto un modello per lâ&#x20AC;&#x2122;adsorbimento di un polielettrolita flessibile su una superficie carica, in presenza di sale, basato su un approccio di campo-medio generalizzato. In accordo con questo modello, il regime di desorbimento occorre quando lâ&#x20AC;&#x2122;inverso della lunghezza di schermo di Debye eccede il valore kc3 =

24|Ď&#x192;||Ď | j02 0 r kB T lK

(2.12)

dove j0 = 2.405 `e la prima radice positiva delle funzioni di Bessel di primo tipo, lK `e la lunghezza di Kuhn (pari al doppio della lunghezza di persistenza), e Ď `e la densit`a lineare di carica del polielettrolita. Lâ&#x20AC;&#x2122;equazione 2.12 tiene nel limite a/lD â&#x2020;&#x2019; â&#x2C6;&#x17E;, dove a `e il raggio della particella.

Da un punto di vista sperimentale, Yaroslavov et al. [5] hanno mostrato che, in un sistema costituito da un policatione (poly-N-ethyl-4-vinylpyridinium bromide) e liposomi anionici preparati con una mistura di lipidi carichi (phosphatidylserine) e zwitterionici (phosphatidylcholine), la concentrazione di

CAPITOLO 2. EFFETTI DEL SALE SUGLI AGGREGATI

34

sale alla quale avviene la rimozione completa del polielettrolita `e grossolanamente proporzionale alla densit`a superficiale di carica. Nel paragrafo 5.3 `e presentato il calcolo della concentrazione di cloruro di sodio necessaria al desorbimento del polielettrolita, sulla base della 2.12.

In realt`a, il fenomeno del desorbimento del polielettrolita non `e universale, dipendendo non solo dalla concentrazione di sale e dalla temperatura, ma anche dalla natura del polielettrolita, in particolare dalla sua estensione [41].

Capitolo 3 Materiali e Metodi 3.1

Liposomi cationici: self-assembling e stabilit` a

I liposomi sono delle vescicole sferiche costituite da uno o pi` u doppi strati lipidici. In soluzione acquosa si autoassemblano grazie al carattere anfifilico dei loro costituenti (fosfolipidi).

Le molecole anfifiliche, possedendo una parte idrofobica e una idrofila, danno luogo ad una moltitudine di strutture morfologicamente differenti; tra queste sono particolarmente interessanti le vescicole unilamellari e multilamellari. Infatti le loro caratteristiche le rendono un ottimo modello per la membrana cellulare, nonch´e un efficiente mezzo di incapsulamento e rilascio di farmaci e macromolecole biologiche (proteine, DNA).

Esistono diversi tipi di liposomi (fig. 3.1), classificabili secondo la loro dimensione e struttura: SUV (Small Unilamellar Vesicles) LUV (Large Unilamellar Vesicles) MLV (Multi-Lamellar Vesicles) MVV (Multi-Vesicle Vesicles)

A seconda della carica portata dai fosfolipidi si hanno liposomi cationici (carichi positivamente), anionici (carichi negativamente) o neutri (costituiti da fosfolipidi zwitterionici).

Le preparazioni di liposomi carichi sono generalmente pi` u stabili in quanto la carica superficiale previene l’aggregazione delle particelle disperse. Inoltre esse rivestono un particolare interesse nello studio dell’adsorbimento di polimeri carichi.

35

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

36

Figura 3.1: Principali tipi di liposomi.

Diverse propriet`a dei liposomi, come la stabilit`a, la densit`a di carica superficiale, il rapporto tra le superfici idrofobiche/idrofiliche, la dimensione, la mobilit`a elettroforetica, la rigidit`a del doppio strato, l’interazione con ioni o altre molecole cariche, dipendono dalla composizione dei fosfolipidi e dalle propriet`a del mezzo.

3.1.1

Dinamica di formazione dei liposomi

La dinamica di formazione dei liposomi `e governata principalmente dalle interazioni idrofobiche che tendono a massimizzare l’entropia del sistema.

Come si pu`o osservare nella figura 3.2, quando il lipide `e isolato le molecole d’acqua si trovano “imbrigliate” dalle interazioni idrofobiche producendo configurazioni ordinate a bassa entropia. Viceversa, l’aggregazione dei lipidi in strutture compatte comporta una liberazione di gran parte delle molecole d’acqua e quindi un considerevole aumento di entropia.

Da un punto di vista semi-quantitativo la formazione di strutture lipidiche pu`o essere predetta da considerazioni termodinamiche.

L’equilibrio che viene ad instaurarsi tra n lipidi isolati e un aggregato di ordine n `e descritto dall’uguaglianza del potenziale chimico nelle due condizioni. nL1 ←→ Ln RT log Xn (3.1) n dove X1 e Xn sono le frazioni molari del monomero isolato e di quello presente in un aggregato e, analogamente, µ01 e µ0n sono i potenziali chimici standard di un monomero nelle due configurazioni. µ01 + RT log X1

=

µ0n +

37

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

Figura 3.2: Disposizione delle molecole d’acqua intorno ad un lipide isolato e ad aggregati di lipidi. Nel primo caso le molecole d’acqua sono ”imbrigliate” dalle interazioni idrofobiche e questo corrisponde a bassi valori di entropia; viceversa gli aggregati di lipidi tendono a liberare le molecole d’acqua promuovendo alti valori di entropia.

Figura 3.3: Concentrazione degli aggregati lipidici vs numero di aggregazione. La curva rappresenta la 3.2. Si nota la presenza di un massimo, corrispondente al numero di aggregazione pi` u probabile.

Dall’equazione 3.1 si ricava la frazione molare di monomeri aggregati: Xn = n(X1 )n e−

0 n(µ0 n −µ1 ) KT

(3.2)

rappresentata graficamente in figura 3.3.

Ad ogni modo, misurando la tensione superficiale, si trova che esiste una concentrazione micellare critica (c.m.c.) al di sopra della quale il sistema manifesta un comportamento qualitativamente differente, come mostrato in figura 3.4. Sopra tale soglia si ha la formazione spontanea di strutture ordinate, la cui geometria dipende dalla natura del lipide.

Una trattazione rigorosa di questi argomenti si pu`o trovare nel testo di Israelachvili [12].

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

38

Figura 3.4: Andamento della tensione superficiale in funzione della concentrazione di monomeri. In prossimit`a della concentrazione micellare critica (c.m.c.) si assiste ad un brusco cambiamento dovuto all’aggregazione dei lipidi.

Come `e stato detto in precedenza, esistono diverse strutture possibili per gli aggregati lipidici. Ci`o che determina quale struttura si former`a `e il rapporto tra le dimensioni trasversali della testa polare e della coda idrofobica.

Il parametro che descrive questo aspetto `e il fattore di impacchettamento α=

V a0 lc

(3.3)

dove V `e il volume del lipide, a0 `e l’area della testa polare e lc `e la lunghezza delle code. Sostanzialmente α misura il grado di somiglianza del lipide ad un cilindro: valori minori dell’unit`a corrispondono a lipidi con testa pi` u grande della base di un cilindro di ugual volume; l’unit`a indica un lipide cilindrico; infine valori maggiori di 1 si riferiscono a lipidi con una testa piccola.

La forma del lipide si riflette sulla geometria della struttura dell’aggregato nel modo descritto in figura 3.5.

I fosfolipidi utilizzati in questo lavoro rientrano tra quelli di forma cilindrica e si auto-assemblano quindi per formare un doppio strato.

Sempre a causa delle interazioni idrofobiche i foglietti si ripiegano su se stessi in presenza di acqua, dando luogo ai tipi di liposomi che sono stati gi`a descritti (fig. 3.1).

Il meccanismo di ripiegamento, alla base del metodo di preparazione descritto nel paragrafo 3.3, `e rappresentato in figura 3.6.

Il doppio strato lipidico pu`o trovarsi in fase gel-solida o in fase liquidocristallina, a seconda della temperatura (fig. 3.7). Sopra la temperatura di

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

Figura 3.5: Geometrie degli aggregati di lipidi. A seconda della forma del lipide, descritta dal fattore di impacchettamento, possono formarsi differenti strutture: micelle, rods, bilayer, micelle inverse.

39

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

Figura 3.6: Meccanismo di ripiegamento dei foglietti lipidici. Le interazioni idrofobiche, che tendono a massimizzare lâ&#x20AC;&#x2122;entropia del sistema, promuovono la formazione di liposomi.

40

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

41

Figura 3.7: Fasi gel-solida e liquido-cristallina del doppio strato lipidico.

La temperatura alla quale le due fasi coesistono `e detta temperatura di transizione (Tm ).

transizione Tm 1 si hanno fosfolipidi abbastanza liberi di muoversi e diffondere nella superficie. La temperatura di transizione dipende dalla natura del fosfolipide ed aumenta all’aumentare del grado di saturazione del lipide, ovvero del numero di atomi di carbonio nelle catene idrofobiche.

3.1.2

Stabilit` a dei liposomi

I liposomi non sono termodinamicamente stabili, in quanto l’energia libera pu`o essere sempre diminuita da una riduzione della superficie di interfaccia.

La tendenza all’aggregazione `e dovuta alle forze di Van der Waals (attrattive).

La stabilit`a, quindi, deve essere prodotta da altre interazioni che si oppongono all’attrazione dei liposomi. Nella teoria DLVO (par. 1.2), si fa risalire la stabilit`a del colloide all’equilibrio tra le forze di Van der Waals e la repulsione elettrostatica tra le particelle colloidali.

In realt`a, si `e visto [42] che questa interpretazione non `e sufficiente a descrivere la stabilit`a dei liposomi, per i quali occorre considerare una nuova forza, che si origina dall’interazione dei lipidi con le molecole del solvente.

Questa forza, di carattere repulsivo, si chiama “forza di idratazione” e dipende da come le molecole d’acqua si orientano in risposta ai campi elettrici generati dalle cariche superficiali, o per meglio dire `e legata alla diminuzione dell’entropia del solvente.

Ruckenstein [43] ha mostrato che la repulsione tra particelle colloidali dipende sia dalla densit`a di carica che dalla densit`a di dipoli sulla superficie, quest’ultima dovuta alla presenza di “ion pairs”.

I liposomi impiegati in questo lavoro sono carichi e risultano quindi intrinsecamente pi` u stabili dei liposomi neutri.

Alla concentrazione lipidica (1.6 mg/ml) e alla frazione molare di DOTAP (21 %) utilizzate, si `e riscontrata una buona stabilit`a dei liposomi, come si pu`o vedere dalle misure di DLS e Potenziale-ζ riportate in tabella 3.1.

1

La Tm `e definita come la temperatura alla quale le due fasi coesistono

42

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI t 0 +1 g +2 g

Rh (nm) 56 ± 8 53 ± 7 46 ± 7

P.D.I. 0.277 0.280 0.286

ζ-Pot (mV) 58 ± 4 52 ± 4 49 ± 3

Tabella 3.1: Raggio idrodinamico medio, polidispersione e Potenziale ζ di un campione costituito da soli liposomi in acqua. Al passare dei giorni non si `e notata una significativa variazione dei valori.

(a)

(b)

Figura 3.8: Formule di struttura di un fosfogliceride (a) e di uno sfingolipide (b)

3.1.3

DOTAP e DOPC

I fosfolipidi o fosfatidi, sono sostanze organiche distribuite ubiquitariamente nel mondo animale e vegetale. Vengono classificati tra i lipidi complessi perch`e costituiti, oltre che da carbonio, idrogeno e ossigeno (come i lipidi semplici), anche da fosforo e da azoto.

Si dividono in fosfogliceridi (o glicerofosfolipidi) e in sfingolipidi (o sfingofosfolipidi). Nei primi un acido grasso di un trigliceride `e sostituito da un gruppo fosfato (a sua volta esterificato con un alcol). Negli sfingolipidi, invece, il glicerolo `e sostituito dalla sfingosina (o dai suoi derivati) ossia un amminoalcol insaturo. Ad esso si lega un acido grasso a formare il ceramide

(a)

(b)

Figura 3.9: Formule di struttura dei lipidi DOTAP (a) e DOPC (b).

43

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI Lipide

Formula chimica

Peso Molecolare

Tm

DOTAP

C42 H80 N O4 Cl

698.542

-22°C

DOPC

C44 H84 N O8 P

786.113

0 °C

Immagine

Tabella 3.2: Caratteristiche dei lipidi utilizzati. La tabella `e stata ricavata dalle informazioni rese disponibili dal produttore (Avanti Polar Lipids).

da cui derivano tutti gli sfingolipidi. In figura 3.8 sono mostrate le formule di struttura dei due tipi.

Le propriet`a fisico-chimiche dei fosfolipidi dipendono in gran parte dal loro carattere anfipatico, ovvero dalla presenza di una testa polare (idrofilica) e una coda apolare (idrofobica).

In questo studio sono stati utilizzati un fosfolipide cationico (DOTAP) ed uno neutro (DOPC).

L’1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-3-trimethylammonium-propane (chloride salt), in breve DOTAP, presenta una carica netta positiva dovuta al gruppo propilammonio unito alle catene aciliche da un legame estere. La sua formula chimica `e C42 H80 N O4 Cl (fig. 3.9(a)) ed ha massa molecolare 698.542 Dalton.

Passa dallo stato gel-solido a quello liquido-cristallino a -22°C. L’1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine, noto come DOPC, `e un lipide neutro in grado di formare liposomi in acqua, sia da solo che insieme ad altri lipidi. Al pari del DOTAP `e solubile in molti solventi organici, ma non in acqua. La sua formula chimica `e C44 H84 N O8 P (fig. 3.9(b)) ed ha massa molecolare 786.113 Dalton. La temperatura di transizione dallo stato gel-solido a quello liquido-cristallino `e prossima ai 0°C. In tabella 3.2 sono riportate le informazioni principali sui lipidi utilizzati.

3.2

NaPA

Il poliacrilato di sodio (NaPA) `e un polielettrolita anionico formato dalla ripetizione dell’unit`a [−CH2 − CH(COON a) − N a]n . ` utilizzato anche in ambito commerciale per la sua capacit`a di assorbire E una quantit`a d’acqua pari a centinaia di volte la propria massa.

In acqua, il NaPA libera ioni di sodio, rimanendo carico negativamente.

La distanza tra i gruppi ionizzabili lungo la catena `e di circa 2.5 ˚ A, la stessa

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

44

del DNA, ma i due polielettroliti differiscono per la lunghezza di persistenza 2 , che per il NaPA `e di 1 nm, mentre per il DNA `e di circa 50 nm. Ci`o `e dovuto al fatto che il poliacrilato di sodio `e molto pi` u flessibile del DNA. Da misure dielettriche si ottiene che la percentuale di ioni rilasciati si attesta intorno al 35% [44].

Il peso molecolare del polielettrolita utilizzato (PolyScience) `e 60 kDa.

Figura 3.10: Monomero del polielettrolita anionico poliacrilato di sodio (NaPA).

3.3

Preparazione dei campioni

I liposomi sono stati preparati sciogliendo appropriate quantit`a di DOTAP e DOPC in una soluzione metanolo-cloroformio (1:1 vol/vol). Le quantit`a di DOTAP e DOPC utilizzate (riportate in tabella 3.4) assicurano una frazione molare x = [DOTAP]/[DOTAP+DOPC] di 0.21. Per ogni lipide carico (DOTAP) ci sono circa quattro lipidi neutri (DOPC).

La soluzione `e stata fatta essiccare in un roto-evaporatore per tutta la notte e il film lipidico ottenuto `e stato idratato con acqua Milli-q, caratterizzata da una resistivit`a ρ = 18.2 MΩ· cm, alla temperatura di 25 °C, ben al di sopra delle temperature di transizione dei due lipidi (0 °C per il DOTAP e -20 °C per il DOPC).

La concentrazione lipidica 3 `e stata mantenuta fissa al valore 0.8 mg/ml, corrispondente 4 a circa 1.4 · 1013 liposomi/ml.

2

la lunghezza di persistenza lp `e definita come la lunghezza oltre la quale c’`e perdita di correlazione in direzione tangenziale. In altri termini, `e la lunghezza entro la quale i vari segmenti di cui `e composta la catena sono abbastanza allineati. La formula che esprime questo concetto `e −L < cos θ >= e lp (3.4) 3 4

intesa come concentrazione finale (dopo l’aggiunta del polielettrolita) considerando liposomi di raggio 50 nm

45

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI Rh (nm)

P.D.I

SONIC.

56 ± 8

0.368

FILTR.

55 ± 7

0.282

Tabella 3.3: Raggio idrodinamico medio e polidispersione dopo la sonicazione e dopo il successivo filtraggio. La sonicazione ha prodotto SUV di circa 56 nm di raggio. Il filtraggio (pori da 450 nm di diametro) non ha modificato la size dei liposomi, ma ha ridotto la polidispersione della preparazione.

La riduzione delle dimensioni dei liposomi `e avvenuta tramite sonicazione impulsata della soluzione per 1 h. La durata degli impulsi `e stata di 0.8 s, l’intervallo tra gli impulsi di 0.6 s.

Al termine della sonicazione la soluzione appariva trasparente e le misure di DLS hanno mostrato una distribuzione di raggi idrodinamici log-normale con valor medio (56 ± 8) nm e polidispersione P.D.I. = 0.368. Il raggio idrodinamico medio `e compatibile con le tipiche dimensioni delle SUV, come ci si aspetta per il metodo di preparazione adottato.

Infine `e stato utilizzato un filtro di policarbonato (pori da 450 nm di diametro) per rimuovere eventuali aggregati o MLV persistenti. Come si pu`o osservare in tabella 3.3 l’operazione ha ridotto la polidispersione del campione.

Una volta ottenuta la dispersione di SUV, i vari campioni sono stati preparati tramite aggiunta di NaPA e NaCl, in concentrazioni opportune.

La quantit`a di poliacrilato di sodio da utilizzare `e stata scelta in modo da mantenere costante il rapporto di volume polielettrolita:lipidi = 1:1.

Il sale `e stato prima mescolato con le preparazioni di polielettrolita e poi aggiunto, insieme a questo, ai liposomi. Per non alterare significativamente la concentrazione del polielettrolita si `e scelto di utilizzare piccoli volumi di NaCl (qualche µl) ad alta concentrazione (fino a 5 M).

3.3.1

Sonicazione

La sonicazione consiste nell’utilizzo di ultrasuoni come sorgente di energia per produrre effetti fisici, chimici e biologici sulla materia.

Il principio fisico su cui si basa tale tecnica `e la cavitazione, ovvero la formazione, lo sviluppo ed il collasso implosivo di bolle (o cavit`a) all’interno di un liquido sottoposto ad un intenso campo ultrasonoro [45].

Quando la sonda vibra molto rapidamente e con intensit`a sufficiente, nel mezzo si producono onde di pressione di elevata frequenza (> 20 kHz). Queste onde generano enormi compressioni nella fase positiva dell’onda pressoria e

46

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI DOTAP mg

DOPC mg

H2 O ml

x

cL mg/ml

I

7.0

27.5

21.6

22 %

0.8

II

9.3

39.3

30.4

21 %

0.8

III

10.1

42.7

33.0

21 %

0.8

Prep.

Tabella 3.4: Quantit`a impiegate nella preparazione dei liposomi. Dalle ultime due colonne si pu`o apprezzare come le frazioni molari e le concentrazioni di lipidi siano state mantenute costanti.

cp (µg/ml): 5 [NaCl] (mM):

10

15

17.5

5

10

20

20 50

30 80

50 100

100 200

150 400

Tabella 3.5: Concentrazioni di NaPA e NaCl utilizzate nelle preparazioni.

Considerando anche le concentrazioni nulle (assenza di NaPA o di NaCl) si hanno 10x9 possibili coppie di valori corrispondenti a sistemi distinti.

dilatazioni nella fase negativa. Se la pressione negativa supera la resistenza a trazione molecolare del liquido (soglia di cavitazione), si assiste ad uno svuotamento locale di molecole di solvente con conseguente formazione di microbolle la cui dimensione `e dell’ordine del µm (fig. 3.11). La successiva compressione fa implodere le bolle di gas e le molecole di solvente riempiono nuovamente lo spazio vuoto. Durante questo meccanismo c’`e un notevole rilascio di energia che comporta temperature e pressioni elevatissime (500K e 1000 atm) [46].

Gli ultrasuoni sono in grado di rompere le MLV; i frammenti risultanti danno luogo alla formazione di liposomi unilamellari, quali LUV e SUV. Le dimensioni finali e l’omogeneit`a della popolazione dipendono da diversi parametri, quali potenza e frequenza degli ultrasuoni, tempo di sonicazione, immersione della sonda.

3.4

Particle Sizing: Light Scattering Dinamico

Le spettroscopie costituiscono uno dei metodi pi` u potenti per indagare le propriet`a della materia. L’idea di base di tutte le tecniche spettroscopiche `e quella di ricavare informazioni sul sistema investendolo con una sonda adatta.

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

47

Figura 3.11: Meccanismo di funzionamento della cavitazione inerziale. Al passare dei cicli dell’onda acustica le dimensioni delle microbolle aumentano; raggiunte le dimensioni critiche le microbolle implodono con un notevole rilascio di energia (hot spots).

Nel caso in cui la sonda sia una radiazione elettromagnetica, l’interazione sonda-bersaglio `e dominata dall’accoppiamento del campo elettrico con le cariche presenti nella materia. Se l’energia posseduta dall’onda corrisponde al salto tra due livelli atomici (o molecolari) assistiamo ai fenomeni dell’emissione e dell’assorbimento. Un’altra possibile risposta della materia `e la diffusione dell’onda incidente: quando la radiazione investe la materia si produce un moto oscillatorio degli elettroni, dovuto all’interazione tra il campo elettrico dell’onda e le cariche. In questo modo gli elettroni diventano sorgenti secondarie di radiazione, riemettendo luce della stessa frequenza (diffusione Rayleigh) o spostata a causa dei moti roto-vibrazionali (diffusione Raman).

Il Light Scattering, oggetto di questo paragrafo, si basa sulla diffusione elastica della luce.

Lo schema tipico di un esperimento di Light Scattering `e mostrato in figura 3.12. Il fascio laser passa attraverso un polarizzatore, che definisce l’orientazione del campo elettrico, incide sul campione e la luce diffusa viene raccolta da un rivelatore posto ad un angolo noto.

Sia il fascio incidente che quello diffuso sono sagomati da slits e lenti.

L’angolo θ al quale viene raccolta la luce scatterata `e detto angolo di scattering ed `e definito dalle direzioni del fascio incidente e del rivelatore.

Il piano in cui giace l’angolo di scattering `e chiamato piano di scattering.

Il volume di scattering, invece, `e l’intersezione tra la regione investita dal fascio incidente e quella “vista” dal rivelatore (fig. 3.12).

Un ulteriore parametro che caratterizza la diffusione `e il vettore di scattering, dato dalla differenza tra il vettore d’onda del fascio incidente e quello

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

Figura 3.12: Schema di un esperimento di Light Scattering. Il fascio laser, passando attraverso un polarizzatore, incide sul campione; la luce diffusa viene raccolta all’angolo θ (angolo di scattering). Nella figura sono visibili anche il volume di scattering e l’angolo di accettanza del detector (ω).

Figura 3.13: Quantit`a di moto trasferita dall’onda. La differenza tra il vettore d’onda iniziale e quello finale prende il nome di vettore di scattering.

48

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

49

del fascio diffuso. Esso rappresenta l’impulso trasferito dall’onda incidente alla materia. Nell’ipotesi di scattering elastico, il vettore d’onda del raggio diffuso ~kf `e uguale, in modulo, a quello del raggio incidente ~ki , differendo invece per orientazione (fig. 3.13).

Il modulo del vettore di scattering pu`o essere quindi calcolato nel seguente modo: |~q|2 = |~ki − ~kf |2 = = |~ki |2 + |~kf |2 − 2 · |~ki | · |~kf | cos θ = = k 2 + k 2 − 2k 2 cos θ = 2k 2 (1 − cos θ) θ = 4k 2 sin2 2 4π θ |~q| = sin λ 2

3.4.1

(3.5)

Teoria del Light Scattering

La diffusione della luce pu`o essere descritta in termini della teoria classica dell’elettromagnetismo.

Un’onda monocromatica polarizzata linearmente che viaggia nel vuoto `e descritta dalla formula ~ i (~r, t) = E0 eˆ exp i(~ki · ~r − ωt) E

(3.6)

dove E0 `e l’intensit`a del campo elettrico, eˆ `e il versore del campo elettrico che definisce la polarizzazione dell’onda, ~ki `e il vettore d’onda di modulo 2π/λ e ω `e la pulsazione (frequenza angolare).

Nel descrivere il fenomeno della diffusione supporremo che lo scattering sia debole, ovvero: 1. la maggior parte dei fotoni passa indisturbata attraverso il campione in modo che la probabilit`a di scattering multiplo sia molto bassa 2. il fascio incidente non `e distorto significativamente dal mezzo (approssimazione di Rayleigh-Gans-Debye) 3. il processo di diffusione `e quasi-elastico, cosicch´e il vettore d’onda del fascio diffuso `e uguale, in modulo, al vettore d’onda del fascio incidente Un fattore importante per la realizzabilit`a di una misura di Light Scattering `e l’indice di rifrazione delle particelle rispetto al mezzo. Infatti, un indice di

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

50

rifrazione troppo diverso da quello del solvente, nel caso in cui le particelle non siano molto piccole, produce una notevole differenza di fase dellâ&#x20AC;&#x2122;onda incidente tra la regione del mezzo e quella allâ&#x20AC;&#x2122;interno di una particella.

Per evitare ci`o, devâ&#x20AC;&#x2122;essere a â&#x2C6;&#x2020;Ď&#x2020; = 2Ď&#x20AC;[np â&#x2C6;&#x2019; nm ] << 1 (3.7) Îť0 dove np `e lâ&#x20AC;&#x2122;indice di rifrazione della particella, nm quello del mezzo, a il raggio della particella e Îť0 la lunghezza dâ&#x20AC;&#x2122;onda nel vuoto.

La 3.7 assicura anche che la rifrazione allâ&#x20AC;&#x2122;interfaccia solvente-particella sia trascurabile; la direzione dellâ&#x20AC;&#x2122;onda incidente `e quindi invariata allâ&#x20AC;&#x2122;interno del volume di scattering e lâ&#x20AC;&#x2122;equazione 3.6 rappresenta una buona descrizione dellâ&#x20AC;&#x2122;onda incidente anche allâ&#x20AC;&#x2122;interno del campione.

Dâ&#x20AC;&#x2122;altra parte anche un indice di rifrazione troppo simile a quello del mezzo `e da evitarsi: molecole otticamente indistinguibili dal mezzo non diffondono la luce.

Lo scattering della luce `e intrinsecamente collegato alle propriet`a ottiche del campione, descritte dalla costante dielettrica (~r, t). ~ s (R, ~ t) dellâ&#x20AC;&#x2122;onda Si pu`o dimostrare [47] che lâ&#x20AC;&#x2122;ampiezza del campo elettrico E scatterata `e pari a

Z 2 k E exp [i(kR â&#x2C6;&#x2019; Ď&#x2030;t)] (~ r , t) â&#x2C6;&#x2019;

0 0 ~ t) = â&#x2C6;&#x2019; Es (R, exp (â&#x2C6;&#x2019;i~q ¡ ~r)d3 r (3.8) 4Ď&#x20AC; R

0 V con (~r, t) costante elettrica del mezzo alla posizione ~r, 0 costante dielettrica media del mezzo, ~q vettore di scattering, V volume di scattering. ~ in cui `e calcolato il campo elettrico, come la posizione ~r del La posizione R generico centro scatteratore, `e relativa ad unâ&#x20AC;&#x2122;origine arbitraria O. In sostanza questa equazione ci dice che il campo elettrico `e, fattori moltiplicativi a parte, la trasformata di Fourier spaziale delle variazioni istantanee di .

Dallâ&#x20AC;&#x2122;equazione 3.8 si pu`o vedere subito come un mezzo perfettamente omogeneo, nel quale (~r, t) = 0 , non produca scattering. Da un punto di vista qualitativo ci`o `e spiegabile con il seguente ragionamento: se (~r, t) non ha variazioni locali, la fase delle onde diffuse dipender`a solamente dalla posizione ~r dellâ&#x20AC;&#x2122;elemento scatteratore; suddividendo il volume di scattering in elementi infinitesimi, non `e difficile immaginare che, per ogni elemento dVi considerato, ce ne sia un altro (dVj ) che produce unâ&#x20AC;&#x2122;onda diffusa sfasata di mezzo periodo.

Lâ&#x20AC;&#x2122;intensit`a dellâ&#x20AC;&#x2122;onda diffusa pu`o essere calcolata dal campo elettrico ES ~ t) = |ES (R, ~ t)|2 : in base alla relazione I(R, ~ t) = I(R,

N N E02 X X ~ j (t) â&#x2C6;&#x2019; R ~ k (t)]} bj (~q, t)bâ&#x2C6;&#x2014;j (~q, t) exp {â&#x2C6;&#x2019;i~q ¡ [R 2 R j k

(3.9)

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

3.4.2

51

Scattering da particelle discrete

In una sospensione contenente centri di scattering discreti, chiamati per semplicit`a â&#x20AC;&#x153;particelleâ&#x20AC;?, possiamo scrivere il campo elettrico diffuso in termini delle: Â&#x2C6; coordinate Rj (t) dei centri di massa di tali particelle Â&#x2C6; posizioni rj (t) dei volumetti infinitesimi dV relativamente ai centri di

massa.

Considerando N particelle sospese in un volume di scattering V , la 3.8 diviene 2

~ t) = â&#x2C6;&#x2019; k E0 exp [i(kR â&#x2C6;&#x2019; Ď&#x2030;t)] ES (R, (3.10) 4Ď&#x20AC; R

N Z X P (~r, t) â&#x2C6;&#x2019; L 3 Ă&#x2014; exp (â&#x2C6;&#x2019;i~q ¡ ~rj )d rj exp [â&#x2C6;&#x2019;i~q ¡ Rj~(t)]

0 V j dove P (~rj , t) `e la costante dielettrica locale nella posizione r~j allâ&#x20AC;&#x2122;interno della particella, L `e la costante dielettrica media del liquido, 0 `e ancora la costante dielettrica media dellâ&#x20AC;&#x2122;intera sospensione.

La 3.11 pu`o essere riscritta introducendo

k 2 (~ rj , t) â&#x2C6;&#x2019; L â&#x2C6;&#x2020;Ď (~rj , t) = (3.11) 4Ď&#x20AC; 0 A questo punto si ottiene ~ t) = â&#x2C6;&#x2019;E0 exp [i(kR â&#x2C6;&#x2019; Ď&#x2030;t)] (3.12) ES (R, R

N Z X 3 â&#x2C6;&#x2020;Ď (~rj , t) exp (â&#x2C6;&#x2019;i~q ¡ ~rj )d rj exp [â&#x2C6;&#x2019;i~q ¡ Rj~(t)] Ă&#x2014; j

V

Trascurando lo scattering di fondo, dovuto alle fluttuazioni spontanee del liquido, lâ&#x20AC;&#x2122;intensit`a della diffusione dipende dalla differenza tra le propriet`a dielettriche delle particelle e quelle del solvente. La quantit`a â&#x2C6;&#x2020;Ď (~rj , t) pu`o essere interpretata come la â&#x20AC;&#x153;densit`a locale del materiale diffusoreâ&#x20AC;?.

Se invece definiamo la lunghezza di scattering nel seguente modo Z bj (~q, t) = â&#x2C6;&#x2020;Ď (~rj , t) exp (â&#x2C6;&#x2019;i~q ¡ ~rj )d3 rj (3.13) V

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

52

possiamo riscrivere la 3.13 come N

~ t) = −E0 ES (R,

exp [i(kR − ωt)] X ~ j] bj (~q, t) exp [−i~q · R R j

(3.14)

Scritto in questo modo, il campo elettrico diffuso risulta essere la somma dei campi elettrici diffusi dalle singole particelle. Ogni termine `e dato dal prodotto tra la lunghezza di scattering, determinata dalla distribuzione istantanea del materiale nella particella, e il fattore di fase, determinato invece dalla posizione istantanea della particella all’interno del campione.

In un esperimento di Light Scattering, in realt`a, viene misurata l’intensit`a dell’onda diffusa. A questo proposito occorre calcolare la grandezza IS (~q, t) = |ES (~q, t)|2 : IS =

3.4.3

N N n o E02 X X ∗ ~ ~ b (~ q , t)b (~ q , t) exp −i~ q · [ R (t) − R (t)] j j k j R2 j k

(3.15)

Teoria del Light Scattering Dinamico

I concetti esposti in questo paragrafo sono in larga parte ripresi dal testo fondamentale di Berne e Pecora [47], al quale si rimanda per eventuali approfondimenti.

Il DLS, noto anche come PCS (Photon Correlation Spectroscopy) o QELS (Quasi-Elastic Light Scattering), `e insieme alla spettroscopia Raman una delle principali tecniche di spettroscopia di diffusione. Permette di misurare raggi idrodinamici in un ampio range (da pochi nm a qualche µm) ed `e particolarmente indicato nello studio di emulsioni, colloidi, micelle, proteine, polimeri, macromolecole biologiche.

Il principio di base `e piuttosto semplice: il campione viene irradiato con un fascio laser e un rivelatore raccoglie le fluttuazioni dell’intensit`a diffusa ad un angolo di scattering (θ) noto. Da un punto di vista microscopico le fluttuazioni dell’intensit`a diffusa sono causate dal moto browniano dei centri scatteratori. Infatti le macromolecole in sospensione sono costantemente bombardate dalle molecole del mezzo che a causa dell’agitazione termica si muovono molto velocemente; questo moto casuale (random walk ) si riverbera nell’intensit`a diffusa.

La luce che arriva al rivelatore `e data dalla sovrapposizione delle onde diffuse dai vari centri scatteratori, pertanto l’intensit`a misurata presenta il tipico pattern dell’interferenza, ovvero una figura a macchie (speckles). A

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

53

Figura 3.14: Pattern di interferenza e fluttuazioni dell’intensit`a diffusa.

Lo schema a macchie, tipico dell’interferenza, non `e statico risentendo del moto browniano dei centri scatteratori.

Figura 3.15: Fluttuazioni dell’intensit`a diffusa (a) e funzione di autocorrelazione delle intensit`a (b). La costante di tempo della funzione di autocorrelazione delle intensit`a corrisponde al tempo medio delle fluttuazioni.

causa del moto browniano che produce fluttuazioni nell’intensit`a, il pattern di interferenza non `e statico. In un esperimento di DLS si focalizza l’attenzione su uno speckle (o su un piccolo gruppo) e si analizzano le fluttuazioni dell’intensit`a diffusa in quella regione della superficie del rivelatore (fig. 3.14).

Confrontando valori di intensit`a a tempi differenti si osserva che essi tendono ad essere correlati per intervalli di tempo brevi, mentre a intervalli lunghi si hanno valori indipendenti (fig. 3.15).

Questo comportamento, tipico delle variabili stocastiche, `e ben descritto dalla funzione di autocorrelazione definita nel seguente modo: Z 1 T G2 (τ ) = hI(~q, 0)I(~q, τ )i = lim dtI(~q, t)I(~q, t + τ ) (3.16) T →∞ T 0

54

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

Il ruolo di questa funzione `e di comparare il segnale I(~q, t) con un suo valore ritardato di τ . Per un moto browniano “puro” (distribuzione gaussiana degli spostamenti) la funzione di autocorrelazione decade esponenzialmente nel modo indicato in figura 3.15 5 .

In un esperimento di DLS l’output fornito dallo strumento `e proprio la G2 (τ ), calcolata dal correlatore digitale tramite la rappresentazione discreta della 3.16: N 1 X G2 (τ ) = lim I(ti ) · I(ti + τ ) (3.17) N →∞ N i=1 Sotto le ipotesi di particelle sferiche e sospensione diluita possiamo considerare la lunghezza di scattering b(~q, t) indipendente dal tempo e le posizioni delle particelle scorrelate tra loro. Cos`ı facendo l’intensit`a diffusa media pu`o essere facilmente calcolata: N

N

XX hI(~q, t)i ~ j (t) − R ~ k (t)]}i hexp {−i~q · [R = h|E(~q, t)|2 i = I0 j k =

N X j

1+

N X

~ j (t)]ihexp [−i~q · R ~ k (t)]i = N hexp [−i~q · R

j

(3.18) Nel ricavare la 3.18 `e stata utilizzata la 3.8 omettendo il fattore moltiplicativo in modo che E(~q, t) =

N X

~ j (t)] exp [−i~q · R

(3.19)

j

In realt`a le informazioni fisiche interessanti sono contenute nella funzione di autocorrelazione dei campi elettrici, definita in modo analogo alla 3.16: hE(~q, 0)E ∗ (~q, τ )i g1 (~q, τ ) ≡ I(~q)

(3.20)

dove, al denominatore, I(~q) `e il consueto fattore normalizzante hE(~q, 0)E ∗ (~q, 0)i.

Il campo elettrico diffuso, somma vettoriale di N campi elettrici determinati dallo scattering di particelle distribuite a caso, pu`o essere immaginato come un random-walk di N vettori. Essendo le posizioni delle particelle totalmente scorrelate, le fasi dei singoli campi elettrici saranno distribuite omogeneamente 5

la dimostrazione `e data pi` u avanti nel paragrafo

55

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

nell’intervallo [0:2π]. Inoltre, il moto browniano deio centri scatteratori fa n ~ j e, con esse, le fasi ~q · R ~ j (t) . In queste condizioni fluttuare le posizioni R il valor medio del campo diffuso risulta essere zero.

Sostituendo la 3.19 nella 3.20 otteniamo per la g1 (~q, τ ) l’espressione N 1 X ~ j (0) − R ~ j (τ )]}i g1 (~q, τ ) = hexp {−i~q · [R N j

~ j (0) − R ~ j (τ )]}i = hexp {−i~q · [R

(3.21)

avendo utilizzato l’ipotesi che particelle identiche hanno le stesse propriet`a cinetiche medie.

Per trovare la relazione che sussiste tra la g2 , determinata sperimentalmente, e la g1 , di maggior interesse fisico, occorre calcolare esplicitamente anche la funzione di autocorrelazione delle intensit`a. In questo caso abbiamo G2 (~q, τ ) = hI(~q, 0)I(~q, τ )i = X ~ j (0) − R ~ k (0) + R ~ l (τ ) − R ~ m (τ )]}i = = hexp {−i~q · [R j,k,l,m

~ ~ )]}i|2 = N 2 + N 2 |hexp {−i~q · [R(0) − R(τ Normalizzando la 3.22 nel consueto modo g2 (~q, τ ) =

6

(3.22)

abbiamo

hI(~q, 0)I(~q, τ )i ~ ~ )]}i|2 = 1 + |hexp {−i~q · [R(0) − R(τ N2

(3.23)

Confrontando la 3.23 con la 3.21 si ottiene la relazione di Siegert che `e proprio la relazione cercata tra le funzioni di autocorrelazione dei campi elettrici e delle intensit`a: g2 (~q, τ ) = 1 + |g1 (~q, τ )|2

(3.24)

Per tener conto delle condizioni sperimentali la 3.24 deve essere modificata con l’introduzione di un parametro β che tenga conto del grado di coerenza spaziale della luce diffusa sulla superficie del rivelatore. In pratica β dipende dal rapporto tra l’area di rivelazione e l’area di uno speckle: se questo rapporto `e molto minore di 1 (rivelatore puntiforme) abbiamo β → 1; se invece l’area del rivelatore `e grande rispetto a quella di uno speckle β → 0.

Generalmente si inserisce anche un altro parametro sperimentale (B), la baseline, che corrisponde al valore che la funzione di autocorrelazione delle intensit`a assume per tempi lunghi.

6

ovvero dividendo per hI(~q, 0)I(~q, 0)i = N 2 (eq. 3.18)

56

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI La 3.24 diventa quindi g2 (~q, τ ) = B(1 + β|g1 (~q, τ )|2 )

(3.25)

Negli esperimenti di DLS si cerca di configurare l’apparato in modo che il rivelatore accetti segnali provenienti da un solo speckle (β = 1). Ad ogni modo la determinazione di β pu`o essere eseguita durante il fit dei dati acquisiti.

Per particelle sferiche non interagenti tra loro, possiamo collegare direttamente il moto browniano dei centri scatteratori alla funzione di autocorrelazione dei campi elettrici.

In prima approssimazione consideriamo solamente sfere identiche. Ri~ ) = R(τ ~ ) − R(0) ~ scrivendo la 3.21 in termini dello spostamento ∆R(τ si ottiene ~ )]i = hexp [∆R(τ ~ )]i g1 (~q, τ ) = hexp [−i~q · ∆R(τ (3.26) ~ ) `e una variabile Lo spostamento di una particella in moto browniano ∆R(τ casuale avente distribuzione di probabilit`a gaussiana: ~ )] = P [∆R(τ

3 2πh∆R2 (τ )i

3/2

3∆R2 (τ ) exp − 2h∆R2 (τ )i

(3.27)

Lo spostamento quadratico medio della particella `e dato da h∆R2 (τ )i = 6D0 τ

(3.28)

dove D0 `e il coefficiente di diffusione di una particella libera, dato dalla relazione di Stokes-Einstein D0 =

kB T 6πηR

(3.29)

Nella 3.29 kB `e la costante di Boltzmann, T la temperatura in gradi Kelvin, η la viscosit`a del mezzo, Rh il raggio della particella.

Il valor medio della 3.26 calcolato sulla distribuzione di probabilit`a 3.27 d`a per la g1 (~q, τ ) la seguente espressione: 2

q 2 g1 (~q, τ ) = exp − h∆R (τ )i = exp (−q 2 D0 τ ) (3.30) 6 Questa relazione permette, finalmente, di collegare la funzione di correlazione dei campi elettrici al raggio delle particelle.

Concettualmente si procede nel seguente modo: acquisita la g2 (~ q , τ ) si calcola tramite la relazione di Siegert la g1 (~q, τ )

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

57

dal fit esponenziale (eq. 3.30), noto il modulo del vettore di scattering,

si determina il coefficiente di diffusione D0 grazie alla relazione di Stokes-Einstein si ottiene il raggio della particella

L’applicazione di questa procedura porta all’individuazione del raggio idrodinamico, ovvero del raggio di un’ipotetica particella sferica che diffonde con lo stesso coefficiente D0 determinato sperimentalmente.

Realisticamente parlando, le particelle non avranno tutte la stessa dimensione e poich´e il loro moto browniano, cardine del DLS, dipende da tali dimensioni, occorre considerare l’effetto della polidispersione sulle misure.

In presenza di particelle polidisperse la 3.30 assume la forma P 2 2 j bj (q) exp (−q Dj τ ) P 2 g1 (~q, τ ) = (3.31) j bj (q) dove Dj `e il coefficiente di diffusione della j-esima particella e i termini bj (q) rappresentano il contributo (peso) di ciascuna particelle allo scattering.

Passando al continuo, Z Z 2 g1 (~q, τ ) = P (D) exp (−q Dτ )dD con P (D)dD = 1 (3.32) .

La P (D) `e la distribuzione, pesata in intensit`a, dei coefficienti di diffusione, legata alla distribuzione dei raggi P (R) dalla relazione di Stokes-Einstein, il vero obiettivo del Particle Sizing.

L’equazione 3.32 ci dice che la funzione di autocorrelazione dei campi elettrici `e la Trasformata di Laplace della distribuzione P (D). In linea di principio si potrebbe estrarre la P (D) operando un’inversione diretta della 3.32, tuttavia, la presenza di errori sperimentali nella determinazione di g1 (~q, τ ) rende il problema “mal posto”. Nel prossimo paragrafo vedremo come superare questa difficolt`a.

3.4.4

Analisi dei dati

L’equazione 3.32 stabilisce la relazione tra la g1 e la distribuzione dei coefficienti di diffusione P (D), alla quale si `e interessati per determinare la distribuzione dei raggi idrodinamici.

Tuttavia ricavare la P (D) dalla 3.32 non `e affatto semplice: gli errori sperimentali e la deviazione dalle condizioni ideali, ipotizzate nella descrizione teorica, rendono l’inversione diretta tramite antitrasformata di Laplace (ILT)

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

58

un problema mal-posto con troppe soluzioni distinte compatibili con i dati [48, 49].

Alternativamente si pu`o tentare di descrivere la g1 (τ ) con un semplice sviluppo in serie e risalire direttamente agli indici pi` u interessanti della P (D): media, deviazione standard, skewness, kurtosis, ecc. Questa procedura `e alla base del metodo dei cumulanti, sviluppato da Koppel nel 1972 [50].

Un’analisi pi` u generale e robusta richiede l’utilizzo di tecniche meno legate a ipotesi dello sperimentatore sul sistema studiato. Il fine di tali tecniche `e quello di selezionare la distribuzione P (D) pi` u aderente al sistema in esame, basandosi sulla minimizzazione della funzione " #2 X 1 2 χ2 = (g1 (τ ) − wm (D)e−q Dm τ ) (3.33) 2 σ m attraverso i parametri di fit wm e Dm .

Nei metodi non-regolarizzati i pesi wm sono assunti positivi e il loro set di valori definisce l’istogramma dei coefficienti di diffusione, ovvero dei raggi idrodinamici.

Tra i metodi non-regolarizzati troviamo: fit a singolo esponenziale analisi con istogrammi fit a pi` u esponenziali con procedure NNLS (Non-Negative Least Square)

I metodi di regolarizzazione, invece, mirano ad invertire la 3.32 senza particolari ipotesi sulla distribuzione dei pesi wm . La funzione che viene minimizzata differisce dalla 3.33 per un termine aggiuntivo che esprime la regolarizzazione della soluzione. " #2 X 1 2 χ2R = (g1 (τ ) − wm (D)e−q Dm τ ) + α||℘w(D)||2 (3.34) 2 σ m Il parametro α misura la “forza” della regolarizzazione, mentre l’operatore ℘ sintetizza il criterio con il quale viene regolarizzata la soluzione. Tipicamente si identifica ℘ con la derivata seconda, in modo da scartare soluzioni troppo oscillanti.

I principali metodi di regolarizzazione sono: CONTIN metodi di massima entropia

Di seguito descriviamo brevemente le tecniche di analisi pi` u comuni, ovvero il metodo dei cumulanti e CONTIN.

59

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI Metodo dei cumulanti. L’analisi parte dallo sviluppo in serie ln |g1 (τ )| = ln[g1 (0)] +

g 00 (0)g1 (0) − g102 (0) τ 2 g10 (0) · ·τ + 1 + ··· g1 (0) g12 (0) 2

(3.35)

Imponendo la condizione di normalizzazione della g1 (τ ) Z g1 (0) = P (D)dD ≡ 1 la 3.35 diventa ln |g1 (τ )| = g10 (0)τ + [g100 (0) − g 02 (0)]τ 2 /2 + · · ·

(3.36)

Il significato del termine g10 (0) si ricava dalla sua espressione esplicita

Z d 0 −q 2 Dτ g1 (0) = P (D)e dτ τ =0 Z = −q 2 DP (D)dD ≡ −q 2 < D > Analogamente si pu`o concludere che il secondo termine dello sviluppo `e proporzionale a σ 2 (D).

In modo pi` u conciso si pu`o considerare che sussiste una relazione tra la funzione generatrice dei cumulanti K(x) e la funzione generatrice dei momenti M (x), esprimibile nella forma K(x) = ln[M (x)]

(3.37)

In quest’ottica risulta chiaro che i termini dello sviluppo 3.35 altro non sono che i momenti della distribuzione P (D).

Nel metodo dei cumulanti si estende il concetto di fit esponenziale, valutando anche gli effetti della polidispersione.

L’indice di polidispersione `e definito come la varianza della distribuzione normalizzata con il quadrato del valor medio.

P.D.I. =

σ 2 (D) K2 = 2 2 <D> K1

(3.38)

dove K1 e K2 sono, rispettivamente, il primo ed il secondo cumulante.

Ci si riferisce al valor medio del raggio idrodinamico come “z-Average”.

Questo dato, essendo affetto dalla polidispersione del sistema, viene considerato attendibile solo per campioni abbastanza monodispersi.

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

60

CONTIN. L’algoritmo CONTIN `e stato sviluppato da Provencher [51, 52] con l’intento di selezionare la soluzione migliore tra tutte quelle compatibili con i dati sperimentali. Si basa, essenzialmente, su due principi: principio di parsimonia conoscenza assoluta a priori

Il “principio di parsimonia” suggerisce di prendere, tra le soluzioni possibili, quella pi` u semplice 7 poich´e `e meno probabile che corrisponda ad artefatti [48].

Per “conoscenza assoluta a priori”, invece, si intende l’imposizione di alcune condizioni note alla soluzione cercata. Una limitazione immediata `e la positivit`a della distribuzione.

L’algoritmo lavora in modo iterativo: dopo aver minimizzato la funzione χR per α = 0 (eq. 3.34), da cui si ricava la soluzione di riferimento, ripete l’operazione per diversi valori di α e tramite un F-test calcola la probabilit`a di rigetto della soluzione trovata; alla fine della procedura viene fornita la soluzione con probabilit`a di rigetto pi` u bassa [53].

Il risultato principale nel Particle Sizing `e la distribuzione dei raggi idrodinamici. L’istogramma fornito da CONTIN `e pesato in intensit`a, intendendo con questo che i pesi wm sono assegnati secondo l’intensit`a diffusa dalla particella di raggio idrodinamico considerato. Si ricorda che particelle pi` u grandi diffondono maggiormente la luce, specialmente in avanti.

Esistono altri modi di assegnare i pesi che portano a distribuzioni pesate in volume (pV ) o in numero di particelle (pN ). Quest’ultima distribuzione sarebbe la pi` u interessante, fornendo il vero istogramma di frequenza dei raggi idrodinamici, ma si dimostra [54] che il calcolo delle pV e pN risente maggiormente degli errori sperimentali ed `e quindi generalmente meno significativo.

Pertanto `e preferibile ragionare in termini di intensit`a, in modo da lavorare con valori ben definiti e attendibili.

3.5

Potenziale ζ: misure di mobilit` a elettroforetica

Nella teoria DLVO il Potenziale Zeta `e una grandezza molto importante per la previsione della stabilit`a delle sospensioni. Nel paragrafo 1.2 si `e visto che l’interazione tra due particelle cariche `e descritta da un potenziale ottenuto 7

ad esempio, quella che presenta il minor numero di massimi e minimi

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

61

come somma di un contributo attrattivo (VA ), uno repulsivo (VR ) ed uno relativo al solvente (VS ).

V = VA + VR + VS

(3.39)

La stabilit`a della sospensione `e dovuta, in larga misura, al rapporto tra VA e VR , legati a loro volta al Potenziale ζ.

Secondo la teoria DLVO sono da considerarsi stabili sospensioni con Potenziale ζ di almeno 25 mV 8 . Questo valore rappresenta solamente un’indicazione: la stabilit`a, in effetti, `e un fenomeno piuttosto complesso che dipende fortemente dai costituenti utilizzati.

La presenza di una particella carica in soluzione d`a luogo alla ridistribuzione degli ioni del solvente secondo uno schema generale in cui si ha un primo strato formato da contro-ioni (strato di Stern) e un secondo strato, pi` u diffuso, in cui compaiono sia ioni dello stesso segno della carica particellare (co-ioni) che di segno opposto (contro-ioni). In figura 3.16 `e rappresentato il doppio strato elettrico intorno ad una particella carica.

Il layer di Stern `e fortemente legato alla superficie carica della particella, mentre la distribuzione di carica del layer diffuso `e data dall’equilibrio tra le forze elettrostatiche e l’agitazione termica.

Il potenziale elettrico diminuisce con la distanza dalla superficie fino a divenire zero fuori del doppio strato. Il valore zero, assegnato al potenziale di bulk, `e convenzionale. Il valore del potenziale sulla superficie che separa il layer di Stern da quello diffuso viene detto Potenziale di Stern.

Il Potenziale ζ, invece, `e definito come il potenziale alla superficie di separazione idrodinamica, ovvero la superficie che idealmente separa la particella, ed il solvente che si trascina dietro nel suo moto, dal resto della soluzione.

La determinazione del Potenziale ζ viene fatta tramite misure di mobilit` a elettroforetica.

Quando viene applicato un campo elettrico ad una sospensione di particelle cariche si osservano vari effetti elettrocinetici: elettroforesi - movimento di una particella carica relativamente al

solvente elettrosmosi - movimento del liquido relativamente a una superficie

carica stazionaria potenziale di streaming - presenza di un campo elettrico dovuto al

moto forzato (meccanicamente) del liquido lungo una superficie carica 8

`e il potenziale per il quale il lavoro necessario a spostare una carica elementare, a temperatura ambiente, `e ' kB T ,

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

Figura 3.16: Layer di Stern e Layer diffuso intorno ad una particella carica. Gli ioni del solvente si dispongono in modo da formare un primo strato molto legato alla superficie della particella e caratterizzato da controioni; nel secondo strato, pi` u diffuso, ci sono sia ioni di segno uguale alla carica particellare (co-ioni) che di segno opposto (contro-ioni), distribuiti in virt` u dellâ&#x20AC;&#x2122;equilibrio tra forze elettrostatiche e agitazione termica. Il potenziale elettrico diminuisce al variare della distanza dalla superficie, fino al potenziale di bulk preso convenzionalmente come zero.

62

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

63

Â&#x2C6; potenziale di sedimentazione - presenza di un campo elettrico do-

vuto al moto di particelle cariche relativamente al mezzo, indotto dalla gravit`a o da accelerazione centrifuga La relazione che lega il Potenziale Îś alla mobilit`a elettroforetica `e lâ&#x20AC;&#x2122;equazione di Henry: 2 Îśf (ka) UE = (3.40) 3Ρ con UE mobilit`a elettroforetica, costante dielettrica del mezzo, Ρ viscosit`a, k inverso della lunghezza di Debye, a raggio della particella e f (ka) funzione di Henry.

La funzione di Henry `e la generalizzazione delle due approssimazioni storicamente introdotte da Smoluchowski e Huckel.

La formula di Smoluchowski, valida nel limite ka >> 1, si ottiene ponendo f (ka) = 1.5: Μ UE = (3.41) Ρ Per ka << 1, invece, si ottiene la formula di Huckel: UE =

2 Μ 3Ρ

(3.42)

dove si `e posto f (ka) = 1.

Le due approssimazioni sono mostrate in figura 3.17 dove sono evidenziati il raggio della particella (a) e la lunghezza di Debye (k â&#x2C6;&#x2019;1 ), che, ricordiamo, `e una misura dello spessore del doppio strato elettrico. La lunghezza di Debye `e collegata alla forza ionica della soluzione, che generalmente `e piuttosto bassa (basse concentrazioni di elettroliti in acqua): in queste condizioni `e sicuramente pi` u adeguata la teoria di Smoluchowski.

Le principali tecniche utilizzate per la misura della mobilit`a elettroforetica sono: Â&#x2C6; LDV - Laser Doppler Velocimetry Â&#x2C6; PALS - Phase Analysis Light Scattering

Il principio di una misura di mobilit`a elettroforetica `e mostrato in figura 3.18. In un esperimento LDV si misura lo shift di frequenza dovuto allâ&#x20AC;&#x2122;effetto doppler causato dal moto dei centri scatteratori. Le particelle cariche vengono accelerate dal campo elettrico applicato e si muovono da un elettrodo allâ&#x20AC;&#x2122;altro con velocit`a di deriva v~D determinata dalla viscosit`a del mezzo, dalla carica superficiale e dalla costante dielettrica del mezzo. Lo spostamento delle

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

Figura 3.17: Approssimazioni di Smoluchowski e Huckel. Quando il raggio della particella (a) `e piccolo rispetto allo spessore del doppio strato elettrico (k −1 ) vale l’approssimazione di Huckel; viceversa, per a >> k −1 , si ha l’approssimazione di Huckel.

Figura 3.18: Principio di una misura di mobilit`a elettroforetica. Un fascio laser incide sulla celletta portacampione; la luce diffusa subisce l’effetto doppler a causa del moto delle particelle cariche sotto il campo elettrico applicato producendo un segnale oscillante. La frequenza del segnale `e legata alla velocit`a delle particelle.

64

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

65

Figura 3.19: Set-up sperimentale di una misura PALS/LVD. Il fascio laser (1) viene separato per utilizzarne una parte come fascio di riferimento; la luce incide sulla celletta porta-campione (2); il fascio diffuso viene ricombinato con quello di riferimento e raccolto dal rivelatore (3); il segnale acquisito viene processato (4) e inviato al software di analisi (5).

frequenze `e, in genere, molto minore della frequenza dell’onda incidente e quindi di difficile determinazione. Per superare questa difficolt`a si separa il fascio laser in due componenti: la maggior parte dell’energia viene fatta incidere sul campione, mentre una piccola aliquota viene utilizzata come fascio di riferimento.

Se si devono eseguire misure su campioni ad alta forza ionica o di bassa mobilit`a elettroforetica, `e preferibile utilizzare la tecnica PALS. Questa tecnica, infatti, permette di effettuare misure accurate anche con bassi voltaggi (in modo da prevenire il surriscaldamento per effetto Joule).

Il set-up sperimentale di una misura PALS `e lo stesso di quello utilizzato nella tecnica LDV (fig. 3.19).

La differenza tra le due tecniche risiede nel metodo di analisi del segnale.

Invece dello shift di frequenza viene misurato lo spostamento di fase, legato allo spostamento delle particelle.

Nel Nano Zetasizer della Malvern, le misure PALS sono ulteriormente migliorate dall’utilizzo della tecnica Mixed Mode Measurement (M3), che consiste nella ripetuta inversione del campo elettrico applicato sia in modalit`a lenta (Slow Field Reversal - SFR) che veloce (Fast Field Reversal - FFR).

L’impiego di sequenze FFR e SFR serve a valutare gli effetti dell’elettrosmosi

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

66

Figura 3.20: Fotografia dello strumento Malvern Zetasizer Nano ZS

che potrebbero alterare la determinazione della mobilit`a elettroforetica. Infatti, durante la sequenza FFR il moto del liquido `e insignificante, mentre le particelle sospese raggiungono comunque la loro velocit`a di regime (a causa della loro scarsa inerzia). Gli effetti dell’elettrosmosi vengono valutati con la sequenza SFR, che fornisce valori pi` u precisi ma affetti dal movimento del fluido. Infine, vengono considerati anche gli effetti del moto browniano grazie ad una misura senza campo elettrico, effettuata tra le due sequenze.

3.6

Zetasizer Nano ZS (Malvern)

Le misure di DLS e Potenziale ζ sono state eseguite con un unico strumento, lo Zetasizer Nano ZS della Malvern (fig. 3.20).

Il principio di funzionamento `e il Light Scattering Dinamico, discusso nel paragrafo 3.4.

Lo strumento `e equipaggiato con un laser He-Ne (λ = 632.8 nm) da 4 mW e un autocorrelatore digitale con 4000 canali che lavora in un range di ritardi temporali 25 ns ÷ 8000 s.

L’angolo di scattering `e fisso al valore 173°, si lavora, pertanto, in backscattering. I vantaggi della tecnologia NIBS (Non Invasive BackScattering) sono: minore probabilit` a di scattering multiplo possibilit` a di lavorare con campioni concentrati minore sensibilit` a alle impurit`a (che essendo di grandi dimensioni

tendono a diffondere in avanti) L’intensit`a del fascio laser `e regolata da un attenuatore, in modo da evitare i problemi connessi a luce troppo intensa (o troppo debole).

67

CAPITOLO 3. MATERIALI E METODI

(a)

(b)

Figura 3.21: Unit`a mobile dello Zetasizer Nano ZS (Malvern). A seconda delle condizioni sperimentali viene determinato il fuoco della lente mobile: (a) per particelle piccole, o soluzioni diluite, `e preferibile focalizzare il fascio al centro del campione; (b) per particele grandi, o soluzioni concentrate, `e meglio mantenersi vicino alla parete della cuvetta.

Una lente mobile permette di determinare la posizione del volume di scattering (fig. 3.21): per particelle piccole, o soluzioni diluite, `e preferibile posizionare il fuoco al centro del campione, dove risente meno dei “flares” causati dalle pareti; per particelle grandi, o soluzioni concentrate, conviene effettuare le misure in prossimit`a della parete, dove la probabilit`a di scattering multiplo `e minima. In quest’ultimo caso i flares hanno un piccolo effetto sull’intensit`a diffusa, che `e decisamente maggiore rispetto a quella osservata con particelle piccole e soluzioni diluite.

Nelle misure DLS, il segnale raccolto dal detector `e processato da un correlatore digitale da 4000 canali e tempi di ritardo compresi nell’intervallo 25 ns ÷ 8000 s.

La funzione di autocorrelazione delle intensit`a, calcolata dal correlatore digitale, `e inviata al software “DTS” (Malvern) che la analizza con diversi algoritmi, tra i quali: metodo dei cumulanti, CONTIN, NNLS. Per quanto riguarda le misure di Potenziale ζ, lo strumento si avvale delle tecniche PALS (Phase Analysis Light Scattering) e M3 (Mixed Mode Measurement) descritte nel paragrafo 3.5.

Sia per le misure di DLS che di Potenziale ζ, `e stata utilizzata la celletta “Dip Cell” (750 mul) con elettrodi in palladio.

Capitolo 4 Risultati Gli effetti del sale sull’aggregazione dei complessi polielettroliti-liposomi cationici sono stati valutati in relazione ai fenomeni della condensazione rientrante e dell’overcharging.

Le grandezze pi` u efficaci per questo tipo di analisi sono il raggio idrodinamico medio (Rh ) e il Potenziale ζ.

Dalle dimensioni `e infatti possibile capire se si sono formati degli aggregati, ed eventualmente seguirne la crescita; oppure se i liposomi, in virt` u della loro reciproca repulsione elettrostatica, restano isolati.

La tecnica impiegata per il particle-sizing `e il Dynamic Light Scattering.

Tale tecnica `e particolarmente indicata nello studio dei colloidi per via delle sue caratteristiche: misure non invasive, rapidit`a d’esecuzione, possibilit`a di lavorare con soluzioni molto diluite e con quantit`a minime di campione, range ampio rispetto alle dimensioni delle particelle colloidali.

Le misure di Potenziale ζ, invece, sono essenziali per interpretare la formazione e la stabilit`a degli aggregati alla luce della teoria DLVO, descritta nel paragrafo 1.2, o di modelli pi` u recenti che tengono conto della distribuzione disomogenea della carica superficiale e delle forze di Van der Waals.

Le misure sono state eseguite variando sia la concentrazione di NaPA che di NaCl. Viceversa la concentrazione dei liposomi `e stata mantenuta fissa.

Nei grafici si `e spesso riportato, sulle ascisse, il valore del rapporto di carica ξ definito dalla relazione ξ=

Np NL

(4.1)

dove Np e NL sono le cariche totali del polielettrolita e dei lipidi.

Questa grandezza, tenendo conto della carica relativa del polielettrolita rispetto ai liposomi, `e molto significativa nella descrizione delle interazioni

68

CAPITOLO 4. RISULTATI

69

elettrostatiche tra i costituenti del sistema; inoltre permette di individuare il punto isoelettrico (ξ = 1) e la regione dell’overcharging (ξ > 1).

I valori di cp (tab. 3.5) sono stati scelti in modo da avere un intervallo di ξ piuttosto ampio 1 e tenendo conto della scala logaritmica tipica dei fenomeni esaminati.

Prima di intraprendere misure sistematiche sulle preparazioni, `e stata eseguita una serie di misure preliminari, il cui scopo era quello di individuare il punto isoelettrico e la regione dell’overcharging. Sebbene la relazione 4.1 fornisca un via diretta per la determinazione della concentrazione di polielettrolita necessaria alla neutralizzazione della carica, la complessit`a del sistema ne rende indispensabile una determinazione empirica.

Le misure preliminari sono servite anche per definire le concentrazioni di sale pi` u interessanti nello studio dell’aggregazione dei complessi. In questo senso si `e guardato principalmente alla stabilit`a dei campioni, distinguendo tre regioni di [NaCl] fenomenologicamente distinte (par. 4.1).

Nel paragrafo 4.2, invece, sono mostrati gli andamenti di Rh e Potenziale ζ ricavati dalle misure alle concentrazioni indicate in tabella 3.5.

4.1

Misure preliminari

In questo paragrafo sono riportati i risultati delle misure preliminari di DLS e Potenziale ζ che hanno permesso di determinare gli intervalli di cp e [NaCl] utili allo studio dell’aggregazione dei complessi DOTAP/DOPC - NaPA. Dalla relazione 4.1 ci si aspetta che la concentrazione di polielettrolita alla quale c’`e neutralizzazione della carica liposomiale sia di circa 20 µg/ml. In prossimit`a di questo valore ci si aspetta, dunque, una divergenza dei raggi idrodinamici.

Con questo riferimento `e stata studiata la regione compresa tra 0 e 50 µg/ml ottenendo i risultati in figura 4.1. Le misure sono state eseguite in assenza di NaCl per valutare il solo effetto del polielettrolita.

Il valore atteso di cp , corrispondente alla neutralizzazione della carica superficiale, `e stato sostanzialmente confermato dalle misure che hanno mostrato una divergenza di Rh intorno a cp = 17.5 µg/ml (a), accompagnata da valori di Potenziale ζ molto piccoli (b). Il rapporto di carica corrispondente vale ξ0 = 0.82.

Successivamente si `e variata la concentrazione di sale tenendo fissa cp . I risultati mostrati in figura 4.2 si riferiscono a due concentrazioni di polielettrolita diverse, scelte con il criterio di rappresentare le zone prima e dopo il 1

circa due ordini di grandezza (ξ = 0.1 ÷ 10).

70

CAPITOLO 4. RISULTATI

140

0

10

20

30

40

120

140

120

<R> (nm)

flocculazione 100

100

80

80

60

60

40

0

10

20

30

40

30

40

40

c(NaPA) (µg/ml)

(a)

ζ-Pot (mV)

0

10

20

60

60

40

40

20

20

0

0

-20

-40

-20

0

10

20

30

40

-40

c(NaPA) (µg/ml)

(b)

Figura 4.1: Raggio idrodinamico medio (a) e Potenziale ζ (b) in assenza di NaCl. Il grafico mostra una divergenza delle dimensioni nella regione centrata in cp = 17.5 µg/ml. Le linee tratteggiate sono solamente una guida per gli occhi. La freccia nel pannello (a) indica la presenza di aggregati mesoscopici (Rh ∼ µm).

71

CAPITOLO 4. RISULTATI

100

200

300

400

50

<R> (nm)

50

40

30

70

60

40

0

100

0

100

200

300

400

40

40

30

30

20

20

400

0

100

90

90

40

80

70

60

ζ-Pot (mV)

flocculazione

<R> (nm)

30

200

100

200

300

400

300

400

40

30

20

20

10

10

0

50 0

100

0

100

200

300

400

0

0

100

200

[NaCl] (mM)

[NaCl] (mM)

(c)

(d)

200

300

400

0

110

100

200

300

400

300

400

10

90

0

80

-10

-10

-20

-20

-30

-30

70

70

60

60

50

50

40

40 0

100

200

300

400

flocculazione

80

ζ-Pot (mV)

90

10

100

flocculazione

100

<R> (nm)

10

60

50

110

100

0

100

70

50

(b) 300

400

50

(a) 200

300

60

[NaCl] (mM)

110

70

200

[NaCl] (mM)

110

80

100

60

10

30

0

flocculazione

0

ζ-Pot (mV)

60

0

-40

-40 0

100

200

[NaCl] (mM)

[NaCl] (mM)

(e)

(f)

300

400

Figura 4.2: Raggio idrodinamico medio e Potenziale ζ in assenza di NaPA (a-b), a cp = 10 µg/ml (c-d) e a cp = 40 µg/ml (e-f). Le linee tratteggiate sono solamente una guida per l’occhio. Le regioni grigie corrispondono ad una rapida flocculazione.

CAPITOLO 4. RISULTATI

72

Figura 4.3: Diagramma di fase ottenuto dai campioni preparati nella fase preliminare dello studio. Il simbolo indica soluzioni stabili; viceversa, rappresenta i campioni instabili.

punto isoelettrico. Nello specifico i valori utilizzati sono: cp = 10 µg/ml (c,d) e cp = 40 µg/ml (e,f). Nei pannelli (a,b), invece, si hanno liposomi e NaCl, senza aggiunta di NaPA. Gli andamenti in funzione del sale evidenziano una generale riduzione di Rh all’aumentare di [NaCl] (a,c,e): le linee tratteggiate, tracciate con il solo intento di aiutare la visualizzazione dei dati, testimoniano tale diminuzione.

In presenza di polielettrolita (c,e) queste misure preliminari hanno evidenziato regioni di instabilit`a in cui il campione andava incontro a rapida flocculazione, rappresentate graficamente con un’ombreggiatura.

Anche il Potenziale ζ `e risultato diminuire all’aumentare di [NaCl] (b,d,f); alla concentrazione pi` u alta di polielettrolita (cp = 40 µg/ml), appartenente alla regione dell’overcharging, tale diminuzione deve intendersi in modulo.

Per concludere la presentazione dei risultati preliminari si riporta il diagramma di fase prodotto da queste misure iniziali (fig. 4.3).

Nel diagramma sono riportate sia le combinazioni di cp e [NaCl] che hanno prodotto campioni stabili ( ) sia quelle che hanno dato flocculazione ( ). Nella figura i valori non sono in scala e le zone ombreggiate evidenziano la regione di instabilit`a. Come si pu`o osservare in corrispondenza di cp = 17.5 µg/ml, le preparazioni risultano sempre instabili, indipendentemente dalla quantit`a di NaCl aggiunta. Allo stesso modo, il diagramma mostra che per [NaCl] = 50 mM qualsiasi apporto di NaPA provoca la flocculazione del campione.

Infine `e utile notare che in assenza di polielettrolita le concentrazioni di sale impiegate non sono sufficienti a promuovere la formazione di aggregati macroscopici.

CAPITOLO 4. RISULTATI

4.2

73

Misure di DLS e Potenziale ζ

Come gi`a detto, sono stati preparati 90 campioni, corrispondenti alle combinazioni di cp e [NaCl] scelte. Alcuni di questi campioni sono risultati troppo instabili per eseguire misure significative, flocculando nel giro di pochi secondi. Nei grafici questa informazione `e stata resa con l’introduzione di zone ombreggiate.

Ogni punto sperimentale `e stato ricavato da un set di circa 20 sotto-misure, dal quale sono stati calcolati i valori medi e gli errori sperimentali.

Nelle misure di DLS l’analisi dei dati, costituiti dalla funzione di autocorrelazione delle intensit`a, `e stata fatta con l’algoritmo CONTIN e confrontata con i valori z-Average (metodo dei cumulanti).

In figura 4.4 sono mostrate le misure di size alle diverse concentrazioni di NaCl: (a) 0 M; (b) 5 mM; (c) 100 mM; (d) 200 mM; (e) 400 mM. Osservando i pannelli (a,c,e) si assiste ad un aumento delle dimensioni per ξ < 1 e riduzione per ξ > 1. Negli intorni di ξ = 1 sono stati omessi i valori di Rh , ritenuti poco affidabili per via della evidente torbidit`a dei campioni.

Ad ogni modo le misure eseguite hanno fornito dimensioni nell’ordine dei µm, in accordo con l’aspettativa di una possibile instabilit`a del campione nei dintorni del punto isoelettrico.

Il pannello (b), relativo a [NaCl] = 5 mM, mostra una sostanziale costanza della size prima del punto isoelettrico e una riduzione appena accennata nella regione dell’overcharging. Infine nel pannello (d), ovvero a [NaCl] = 0.1 M, il raggio idrodinamico `e, entro gli errori sperimentali, praticamente invariato.

Dai grafici di size presentati, risulta che i raggi idrodinamici delle particelle sono compresi tra i 40 e i 120 nm. Se si aggiungono i valori osservati in corrispondenza del punto isoelettrico (Rh ∼ 4 ÷ 6 µm), si delinea un picco molto pronunciato che manca di definizione. Ci`o `e dovuto al fatto che, nelle condizioni sperimentali in cui si operava, le variazioni di ξ necessarie a definire con pi` u dettaglio il picco avrebbero comportato preparazioni di campioni quasi identici 2 . Tuttavia, come verr`a spiegato nel paragrafo 5.1, le variazioni di Rh sono sufficienti a distinguere la crescita del raggio dei liposomi decorati dalla formazione di piccoli aggregati.

Le dimensioni dei semplici liposomi (fig. 4.2 (a)), quindi senza aggiunta di NaPA, sono compatibili con le SUV aspettate dal processo di sonicazione (par. 3.3.1).

In figura 4.5 sono riportate le misure di Potenziale ζ alle varie concentrazioni di NaCl. 2

variazioni di volume nell’ordine dei µl, difficilmente realizzabili

74

CAPITOLO 4. RISULTATI 1

120

80

60

60

80

ξ=0

0.25

0.5

0.75

0.75

0.75

1

2.5

5

7.5

flocculazione

120

80

0.5

0.5

140

120

120

100

0.25

0.25

140

100

40

140

1

2.5

5

7.5

<R> (nm)

140

<R> (nm)

160

flocculazione

160

100

100

80

80

60

60

ξ=0 40

40

40

0.25

0.5

0.75

1

ξ

ξ

(a)

(b)

1

2.5

5

7.5

80

120

0.25

0.5

0.75

1

2.5

5

7.5

2.5

5

7.5

flocculazione

100

120

100

60

<R> (nm)

<R> (nm)

60

40

40

80

80

60

60

ξ=0 40 20

0.25

0.5

0.75

1

2.5

5

7.5

20

40

ξ=0 0.25

0.5

Rapp. carica (ξ)

0.75

(c)

2.5

5

7.5

(d) 0.25

0.5

0.75

1

2.5

5

7.5

100

flocculazione

100

80

<R> (nm)

1

Rapp. carica (ξ)

80

60

60

40

40

ξ=0 0.25

0.5

0.75

1

2.5

5

7.5

ξ

(e)

Figura 4.4: Raggi idrodinamici alle varie concentrazioni di NaCl: (a) 0 M; (b) 5 mM; (c) 100 mM; (d) 200 mM; (e) 400 mM. Le figure nei pannelli (a,c,e) mostrano il fenomeno della condensazione rientrante. Le zone ombreggiate indicano la flocculazione del campione, mentre le linee tratteggiate sono solamente una guida per l’occhio.

75

CAPITOLO 4. RISULTATI 0.25

0.5

0.75

1

2.5

5

7.5

40

40

20

20

0

0

-20

-20

-40

-40

-60

0.25

0.5

0.75

1

2.5

5

7.5

0.25

60

ZP (mV)

ZP (mV)

60

0.5

0.75

2.5

5

7.5

40

40

20

20

0

0

-20

-20

-40

-40

-60

-60

-60 0.25

0.5

0.75

Rapp. carica (ξ)

1

2.5

5

7.5

Rapp. carica (ξ)

(a)

(b) 0.25

ZP (mV)

1

0.5

0.75

1

2.5

5

7.5

30

30

20

20

10

10

0

0

-10

-10

-20

-20

-30

-30

-40

-40 0.25

0.5

0.75

1

2.5

5

7.5

Rapp. carica (ξ)

(c) 1

2

3

4

5

6

7

20 30

20

20

10

10

0

ZP (mV)

ZP (mV)

0 30

0

1

2

3

4

5

6

7

20

15

15

10

10

5

5

0 0

1

2

3

4

Rapp. carica (ξ)

(d)

5

6

7

0

0

1

2

3

4

5

6

7

Rapp. carica (ξ)

(e)

Figura 4.5: Potenziale ζ alle varie concentrazioni di NaCl: (a) 0 M; (b) 5 mM; (c) 10 mM; (d) 100 mM; (e) 200 mM. Le linee tratteggiate sono solamente una guida per l’occhio. A basse concentrazioni di NaCl (a,b,c) c’`e inversione di carica, mentre ad alte concentrazioni (d,e) il Potenziale ζ si mantiene positivo.

0

76

CAPITOLO 4. RISULTATI

ZP (mV)

<R> (nm)

140

0.25

0.5

0.75 1

2.5

5

7.5

140

120

120

100

100

80

80

60

60

40

40

40

40

20

20

0

0

-20

-20

-40

-40 -60

-60 0.25

0.5

0.75 1

2.5

5

7.5

Rapp. carica (ξ)

Figura 4.6: Raggio idrodinamico medio e Potenziale ζ a [NaCl] = 5 mM. Si pu`o notare la corrispondenza tra il punto isoelettrico definito dall’annullamento del Potenziale ζ e il picco della size.

CAPITOLO 4. RISULTATI

77

Nei pannelli (a,b,c) possiamo osservare il tipico andamento del Potenziale ζ collegato all’inversione di carica: a bassi rapporti di carica il Potenziale ζ non varia significativamente con ξ; in prossimit`a del punto isoelettrico, definito dall’annullamento del Potenziale ζ, si assiste ad una brusca riduzione che determina il cambio di segno; per ξ > 1 il Potenziale ζ torna ad essere costante, ma di segno opposto a quello iniziale.

Viceversa, alle concentrazioni di NaCl pi` u alte, il Potenziale ζ si `e mantenuto sempre positivo, escludendo l’individuazione del punto isoelettrico (pannelli d,e). Qui le curve presentano un minimo in corrispondenza di ξ ∼ 1: l’aggiunta di polielettrolita oltre la quantit`a necessaria a compensare il numero di cationi di DOTAP produce un effetto contrario a quello atteso, rialzando i valori di Potenziale ζ.

La correlazione che sussiste tra le misure di DLS e Potenziale ζ pu`o essere apprezzata dal confronto degli andamenti di Rh e del Potenziale ζ. In figura 4.6 sono stati accostati i due andamenti ottenuti a [NaCl] = 5 mM: il picco della size `e allineato con il punto isoelettrico (individuato dall’annullamento del Potenziale ζ).

Dall’insieme delle misure eseguite e da osservazioni qualitative sulla torbidit`a dei campioni si `e, infine, tracciato uno diagramma della stabilit`a del sistema 3 , riportato in figura 4.7. Sulle ascisse `e riportato il rapporto di carica ξ, mentre in ordinata la concentrazione di sale [NaCl]. Entrambe gli assi sono in scala logaritmica per agevolare la rappresentazione dei dati.

Le preparazioni stabili sono contraddistinte dal simbolo ( ), mentre quelle instabili da ( ).

3

sono stati considerati stabili quei campioni abbastanza limpidi da permettere misure di DLS e che non hanno mostrato una chiara evoluzione temporale della size

78

CAPITOLO 4. RISULTATI

[NaCl] (mM) - Logscale

0.25

0.5

0.75

1

2.5

5

7.5

100

100

10

10

0.25

0.5

0.75

1

2.5

5

7.5

Rapp. carica (ξ) - Logscale

Figura 4.7: Diagramma di fase del sistema. Le preparazioni stabili sono contraddistinte dal simbolo ( ), mentre quelle instabili da ( ). Per una migliore visualizzazione dei dati sono state utilizzate scale logaritmiche su entrambi gli assi. La descrizione del diagramma si trova nel testo.

Il diagramma `e piuttosto semplice ed evidenzia chiaramente tre regioni distinte di [NaCl]: 1. [N aCl] < 10 mM → il sistema `e stabile per tutti i rapporti di carica, eccetto per valori molto vicini alla neutralizzazione (ξ = 0.82) 2. 10 mM < [N aCl] < 100 mM → il sistema `e sempre instabile, se si eccettua il punto individuato da ξ = 0.23 e [NaCl] = 5 mM 3. [N aCl] > 100 mM → c’`e un ritorno alla stabilit`a, con la solita eccezione di ξ = 0.82

Capitolo 5 Discussione dei risultati Nel modello accettato in questa tesi, l’aggregazione dei complessi polielettrolitiliposomi cationici `e determinata dall’equilibrio tra tre forze di natura elettrostatica: 1. repulsione coulombiana → interazione dovuta alle cariche efficaci dei complessi e descritta dalla semplice legge di Coulomb. La carica efficace delle particelle `e determinata dai lipidi carichi del liposoma (cationi), dagli anioni presenti sulle catene di polielettrolita adsorbite e dall’effetto di schermo degli ioni presenti in soluzione (prevalentemente dovuti al sale).

2. patch-attraction → attrazione dovuta alla disomogeneit`a della carica superficiale. Tale disomogeneit`a `e causata dall’adsorbimento correlato del polielettrolita.

3. forze di Van der Waals → interazioni a corto raggio tra le particelle, importanti solamente quando la lunghezza di Debye `e confrontabile con il loro raggio d’azione.

Il potenziale che descrive l’interazione tra i complessi `e dato, quindi, dal contributo di queste forze. Partendo dal potenziale di Velegol e Thwar, che considera solamente la repulsione coulombiana e la patch-attraction, `e possibile esprimere il potenziale di interazione tra due complessi nel seguente modo: ΦAB (H) = hΦVABT (H)i + ΦV dW (H) (5.1) Il potenziale di Velegol e Thwar presenta una barriera, la cui altezza dipende dalla carica superficiale e dalla sua deviazione standard, nonch´e dalle dimensioni delle particelle.

79

CAPITOLO 5. DISCUSSIONE

80

L’aggiunta del termine ΦV dW si rende necessaria quando la concentrazione di NaCl `e tale da rendere il raggio delle interazioni elettrostatiche confrontabile con quello delle forze attrattive di Van der Waals.

Analiticamente questo comporta la comparsa di un minimo secondario nel potenziale. Se questo minimo secondario `e abbastanza profondo (diversi kB T ), l’aggregazione pu`o avvenire anche se le particelle non hanno energia sufficiente a superare la barriera del potenziale di Velegol e Thwar, la quale impedisce l’accesso al minimo primario. Ci`o si verifica, ad esempio, quando l’aggregato `e abbastanza grande e l’energia necessaria per superare la barriera `e molto maggiore di kB T .

I risultati esposti nel capitolo precedente verranno discussi in termini del modello appena riassunto, prestando particolare attenzione ai fenomeni della condensazione rientrante e dell’overcharging, oltre che alla stabilit`a del sistema.

5.1

La condensazione rientrante

Diversi studi (si veda ad esempio [55, 56, 57, 58, 59, 60]) hanno evidenziato che il fenomeno della condensazione rientrante `e piuttosto generale per sistemi costituiti da liposomi carichi e polielettroliti. Il fenomeno, infatti, si presenta indipendentemente dalla densit`a di carica superficiale [58], dal segno delle cariche del polielettrolita e dei liposomi [57], dalla natura specifica del polielettrolita [59, 60] o dei liposomi [55, 56, 57].

All’aumentare del rapporto di carica ξ (polielettroliti/liposomi) si assiste ad una riduzione della carica netta del complesso; ci`o favorisce la formazione di cluster via via pi` u grandi. Quando il polielettrolita compensa esattamente la carica liposomiale, gli aggregati raggiungono la loro dimensione massima; un eccesso di polielettrolita produce un ridimensionamento della size. Superata una certa soglia, l’adsorbimento del polielettrolita non `e pi` u possibile e le nuove molecole diffondono liberamente nella soluzione.

Come vedremo nel paragrafo 5.3, il sale influisce notevolmente sulla stabilit`a del sistema. Per ora basta accennare al fatto che occorre distinguere tre regioni: [NaCl] < 10 mM; 10 mM < [NaCl] < 100 mM; [NaCl] > 100 mM. In figura 4.4 si `e visto che, in assenza di sale, la dipendenza del raggio idrodinamico Rh dal rapporto di carica ξ riproduce esattamente la dinamica della condensazione rientrante. Le dimensioni iniziali, di circa 50 nm, sono compatibili con quelle di liposomi preparati per sonicazione (SUV). L’aggiunta di polielettrolita produce un sensibile aumento delle dimensioni delle particelle in sospensione, fino a valori non pi` u coerenti con la presenza di sole SUV. Questo aumento pu`o essere spiegato sia dall’adsorbimento del polielettrolita

CAPITOLO 5. DISCUSSIONE

Figura 5.1: Immagini al TEM (Transmission Electron Microscopy) di tipici aggregati di complessi polielettroliti-liposomi. I liposomi decorati isolati hanno un aspetto sferico, mentre quelli presenti nei cluster, a causa delle forze di adesione tra le membrane adiacenti, hanno i contorni piatti.

Lâ&#x20AC;&#x2122;intero aggregato, tuttavia, mantiene una forma compatta. La barra rappresenta 100 nm.

81

CAPITOLO 5. DISCUSSIONE

82

sulla superficie dei liposomi, sia dalla formazione di piccoli aggregati. Nel primo caso le catene di polielettrolita, disponendosi sulla superficie dei liposomi, contribuiscono alla crescita del raggio idrodinamico sia con la loro estensione che con alterazioni del coefficiente di diffusione della particella, dal quale si ricava Rh . Sebbene questa spiegazione concordi con le lievi variazioni di Rh riscontrate, sembra smentita dal fatto che in questi sistemi le catene di polielettrolita tendono a rimanere aderenti alla superficie [61, 62], avendo, quindi, un effetto minimo sul raggio della particella e sulla sua forma che ne determina le modalit`a diffusive. Inoltre, questa interpretazione si scontra con la diminuzione di size riscontrata per ξ > 1, dove la maggior quantit`a di polielettrolita avrebbe dovuto causare l’effetto contrario. L’altra possibilit`a, ovvero la formazione di piccoli aggregati, `e sostenuta da immagini al TEM (Transmission Electron Microscopy) nelle quali si nota che, nel processo di aggregazione, le membrane dei liposomi non vengono ristrutturate (fig. 5.1).

In questo modo, infatti, si esclude il passaggio da SUV a LUV, che sarebbe stato compatibile con la crescita di size. Inoltre, bisogna considerare che il numero di aggregazione `e dato dal volume relativo dell’aggregato, ovvero dal rapporto tra il volume dell’aggregato (V ) e il volume del singolo liposoma (V0 ) n = V /V0 = (R/R0 )3 Vista la dipendenza cubica dal rapporto R/R0 , anche piccoli scostamenti di Rh possono comportare variazioni sensibili del numero di aggregazione.

Nella regione vicina alla neutralizzazione di carica il sistema ha mostrato una evidente instabilit`a, testimoniata da rapida flocculazione. Pur non avendo riportato le relative misure di size 1 , si pu`o intendere la flocculazione come una prova della formazione di aggregati enormi 2 , in accordo con la fenomenologia della condensazione rientrante.

L’aggiunta di una piccola aliquota di NaCl (5 mM), non ha impedito il verificarsi della condensazione rientrante, ma ne ha alterato le caratteristiche.

Dal pannello (a) della figura 5.2, dove si confrontano gli andamenti di Rh in assenza di sale e a [NaCl] = 5 mM, salta subito all’occhio che, a basse concentrazioni di polielettrolita, il sale produce un aumento della size, ma ne limita la crescita con ξ. Questo fatto pu`o essere giustificato nel seguente modo: il sale, aumentando la forza ionica della soluzione, scherma parzialmente la carica superficiale e, conseguentemente, riduce la barriera repulsiva tra i complessi. L’effetto di schermo del sale `e, fino al punto isoelettrico, dominante rispetto a quello del polielettrolita; per questo Rh risulta, entro gli errori sperimentali, costante.

1 2

non riproducibili e quindi considerate inattendibili dalle misure eseguite risultano valori di Rh dell’ordine dei µm.

83

CAPITOLO 5. DISCUSSIONE 0.25

0.5

0.75

1

2.5

5

7.5

120

120

100

100

80

80

60

60

40

40 0.25

0.5

0.75

1

Rapp. carica (ξ)

(a)

2.5

5

7.5

0.25

140

<R> (nm)

<R> (nm)

140

0.5

0.75

1

2.5

5

7.5

100

100

80

80

60

60

40

40

0.25

0.5

0.75

1

2.5

5

7.5

Rapp. carica (ξ)

(b)

Figura 5.2: Raggi idrodinamici a basse (a) ed alte (b) concentrazioni di NaCl. Nel pannello (a) sono riportati i valori di Rh a [NaCl] = 0 mM (•) e 5 mM ( ); nel pannello (b) ci sono gli andamenti di size relativi a [NaCl] = 200 mM ( ) e 400 mM (•). Le zone grige servono a visualizzare la larghezza dei picchi.

Ad alti rapporti di carica, invece, il sale non `e pi` u in grado di mascherare l’effetto del polielettrolita e il tipico comportamento della condensazione rientrante `e ripristinato, compreso il riavvicinamento alle dimensioni originarie in regime di alto rapporto di carica. Sempre dal confronto delle due curve si osserva che, in presenza di sale, il ritorno alle dimensioni originarie `e pi` u lento. Ci`o `e imputabile, probabilmente, all’effetto depressivo del sale sull’adsorbimento del polielettrolita.

Concentrazioni di NaCl comprese nella fascia 10 mM ÷ 80 mM hanno destabilizzato il sistema, rendendo poco significativa l’analisi delle misure di DLS. La discussione sulla stabilit`a `e rimandata al paragrafo 5.3 Venendo alle alte concentrazioni di sale (100, 200 e 400 mM), l’alta forza ionica ha permesso, nuovamente, di ottenere preparazioni stabili su cui effettuare l’analisi della size.

Mentre per [NaCl] = 100 mM non si `e trovato un andamento chiaro di Rh 3 , alle concentrazioni di sale pi` u alte (200 e 400 mM) ritroviamo il fenomeno della condensazione rientrante (fig. 5.2, pannello (b)). Ci`o `e dovuto, con ogni probabilit`a, al desorbimento del polielettrolita indotto dagli ioni di sale. Infatti, a concentrazioni cos`ı alte di NaCl, gli ioni dell’elettrolita saturano quasi completamente la superficie carica dei liposomi, ostacolando fortemente l’adesione delle catene di polielettrolita. In questo modo il sistema si trova in una situazione in cui il grande apporto di sale scherma le cariche superficiali e al tempo stesso previene l’adsorbimento di NaPA. Nello schema delineato finora, questa condizione deprime il ruolo della patch-attraction: 3

il raggio idrodinamico medio `e, entro gli errori sperimentali, costante con ξ

CAPITOLO 5. DISCUSSIONE

84

l’aggregazione `e quindi regolata dal bilanciamento tra le forze di Van der Waals e la repulsione elettrostatica tra le superfici cariche, peraltro fortemente indebolita dallo schermo del sale. Infine, `e interessante notare che l’aumento di [NaCl] da 200 a 400 mM ha prodotto un allargamento del picco (fig. 5.2 (b)), prevedibile in base ai risultati ottenuti in altri lavori [63]. Le ombreggiature grige servono a visualizzare la larghezza dei picchi.

Riassumendo, gli effetti del sale sulla dimensione degli aggregati dipendono dalla sua concentrazione: a [NaCl] = 5 mM c’` e un duplice effetto: a basse concentrazioni di

polielettrolita il sale promuove l’aggregazione schermando le cariche superficiali e mascherando, al contempo, l’effetto del polielettrolita; dopo il punto isoelettrico il ruolo del polielettrolita ritorna ad essere dominante, sebbene il sale, deprimendone l’adsorbimento, rallenta il ritorno della size ai valori iniziali nella fascia 10 mM < [NaCl] < 80 mM si assiste ad una diffusa instabilit` a

del sistema con formazione di aggregati enormi, indipendentemente dalla quantit`a di polielettrolita per [NaCl] = 200 e 400 mM si ripresenta il fenomeno della condensa-

zione rientrante, che mostra anche un allargamento del picco con la concentrazione di elettrolita.

5.2

L’inversione di carica

La condensazione rientrante `e molto spesso collegata ad un altro fenomeno piuttosto generale: l’inversione di carica. A causa dell’adsorbimento correlato del polielettrolita sulla superficie del liposoma, `e possibile che ci sia una over-compensazione della carica superficiale e quindi un inversione di segno della carica totale.

Il legame che c’`e tra l’overcharging e la condensazione rientrante `e evidente: la diminuzione della carica netta delle particelle deprime il termine repulsivo del potenziale di interazione, rendendo pi` u agevole l’aggregazione (aggregati pi` u grandi); superata la neutralizzazione della carica, l’aumento di carica invertita rialza la barriera energetica che si oppone all’aggregazione (aggregati pi` u piccoli).

Come per la discussione delle misure di DLS, anche qui `e utile suddividere l’analisi in due regimi: basse concentrazioni di sale ([NaCl] < 10 mM) e alte concentrazioni ([NaCl] > 100 mM). La fascia intermedia, caratterizzata da diffusa instabilit`a, non ha permesso misure di Potenziale ζ.

85

CAPITOLO 5. DISCUSSIONE 0.5

0.75

1

2.5

5

7.5

0 60

40

40

20

20

0

0

-20

-20

-40

-40

-60

-60 0.25

0.5

0.75

1

2.5

5

7.5

ζ-Pot (mV)

ζ-Pot (mV)

0.25 60

1

2

3

4

5

6

7

16

16

14

14

12

12

10

10

8

8

6

6

4

4

2

2 0

0 0

1

2

3

4

ξ

ξ

(a)

(b)

5

6

7

Figura 5.3: Potenziale ζ a basse (a) ed alte (b) concentrazioni di NaCl. Nel pannello (a) i valori di [NaCl] sono: (•) 0 mM; ( ) 5 mM; ( ) 10 mM. Nel pannello (b): (•) 100 mM; ( ) 200 mM; ( ) 400 mM. A basse concentrazioni (a) il sale riduce i valori di Potenziale ζ, mentre ad alte concentrazioni (b) rende il minimo pi` u profondo e pi` u stretto.

In figura 5.3 sono riportati gli andamenti di Potenziale ζ, raggruppati nelle due regioni di interesse.

Nel pannello (a) si pu`o apprezzare come l’aggiunta di modeste quantit`a di sale produce una riduzione del Potenziale ζ: l’aumento della forza ionica non fa altro che aumentare la schermatura della carica superficiale e questo si riflette direttamente sulla determinazione del Potenziale ζ.

Notevolmente, la posizione del punto isoelettrico non dipende dalla concentrazione di NaCl. In effetti, l’aggiunta di piccole quantit`a di sale non influenza significativamente le modalit`a di adsorbimento del polielettrolita ed il rapporto di carica ξ tiene conto solamente delle cariche dei polielettroliti e dei lipidi.

Altro aspetto interessante delle curve a basso sale `e la simmetria dei valori di Potenziale ζ, a bassi ed alti rapporti di carica. Qualitativamente possiamo affermare che questo corrisponde ad un’inversione perfetta della carica. Evidentemente, sopra una determinata concentrazione ogni ulteriore aggiunta di polielettrolita non si riflette in un suo adsorbimento, piuttosto esso diffonder`a libero in soluzione.

Per concentrazioni di NaCl maggiori (pannello (b)) l’inversione di carica scompare, lasciando il posto a profili di Potenziale ζ caratterizzati da un ` interessante notare che la mancata presenza dell’overcharging non minimo. E pregiudica il verificarsi della condensazione rientrante, alla quale `e in genere strettamente correlato (vedi fig. 4.6). Infatti, nel paragrafo precedente si `e visto come la condensazione rientrante sia presente anche ad alte concentrazioni di sale (fig 5.2). Invece del punto isoelettrico, in corrispondenza del picco di

CAPITOLO 5. DISCUSSIONE

86

size abbiamo un minimo di Potenziale ζ. Questo fatto non deve stupire: la barriera di potenziale che si oppone all’aggregazione di una particella dipende dal valore assoluto del Potenziale ζ e non dal suo segno. Alla concentrazione pi` u alta (400 mM) il minimo diventa pi` u profondo e pi` u stretto, mentre il plateau `e pi` u alto. Inoltre la posizione del minimo `e leggermente spostata verso rapporti di carica minori.

5.3

Stabilit` a del sistema: il diagramma di fase

Nella discussione delle misure di DLS e Potenziale ζ, centrata soprattutto sui fenomeni della condensazione rientrante e dell’overcharging, si `e spesso accennato che il sistema mostrava dei punti di instabilit`a tali da rendere impossibili le misure. In questo paragrafo si analizzeranno in modo sistematico gli effetti del sale sulla stabilit`a del sistema.

Nella presentazione dei risultati `e stato proposto un grafico (diagramma di fase) in cui sono riportati i punti di stabilit`a e instabilit`a del sistema (fig.

4.7).

Salta subito all’occhio la disposizione estremamente regolare delle due fasi. Procedendo dal basso verso l’alto, ovvero aumentando [NaCl], abbiamo: una serie di punti stabili (eccetto il punto isoelettrico); poi una fascia che va dai 10 mM agli 80 mM in cui il sistema `e sempre instabile; infine una fascia di punti stabili, con l’eccezione del punto isoelettrico. Se, invece, si scorre orizzontalmente il diagramma, si pu`o osservare che la stabilit`a del sistema `e sostanzialmente indipendente dal rapporto di carica ξ, ovvero dalla quantit`a di polielettrolita. Per completare la panoramica sul diagramma di fase, bisogna aggiungere che in assenza di polielettrolita non si assiste mai alla precipitazione del sistema in una fase instabile.

Questo comportamento del sistema pu`o essere descritto in termini del modello accettato in questa tesi, ovvero del bilanciamento tra repulsione coulombiana, patch-attraction e forze di Van der Waals. In realt`a, vedremo tra breve, occorre integrare questo quadro con l’aggiunta di un ulteriore effetto del sale: il desorbimento del polielettrolita.

In assenza di sale il sistema mostra instabilit`a solamente in prossimit`a del punto isoelettrico. Questo comportamento `e determinato solamente dalla complessazione del poliacrilato di sodio con i liposomi cationici e serve come base di partenza per discutere gli effetti del sale.

L’aggiunta di piccole quantit`a di NaCl (5 mM) induce un allargamento della regione di instabilit`a molto pronunciato (in pratica si passa da un solo

87

CAPITOLO 5. DISCUSSIONE

(a)

(b)

Figura 5.4: Simulazione MC del potenziale di interazione tra particelle decorate. Pannello a: all’aumentare della forza ionica la barriera repulsiva si abbassa fino a scomparire completamente, favorendo di fatto l’aggregazione; il sale promuove anche la formazione di un minimo secondario oltre la barriera. Pannello b: man mano che le dimensioni dell’aggregato aumentano la barriera repulsiva cresce, ma cresce anche la profondit`a del minimo secondario. L’aggregazione `e comunque favorita.

punto instabile alla quasi totalit`a di punti instabili). Negli studi fatti con solo DOTAP come costituente dei liposomi, Sennato et al. [63] avevano mostrato un effetto simile del sale ma molto pi` u graduale. La spiegazione del differente comportamento `e da trovarsi, con tutta probabilit`a, nella differente costituzione dei liposomi: la presenza di DOPC (neutro) nel rapporto 4:1 con il DOTAP rende il sistema molto meno carico e quindi pi` u sensibile a piccole variazioni di [N aCl].

In regime di basso sale l’aggregazione `e descritta efficacemente dal potenziale di Velegol e Thwar, senza necessit`a di aggiungere il contributo delle forze di Van der Waals. L’effetto del sale `e quindi sui contributi repulsivo e della patch-attraction.

Per [NaCl] = 10 mM, notiamo gi`a una destabilizzazione completa del sistema: indipendentemente dal rapporto di carica ξ si hanno punti di instabilit`a. Questo regime perdura fino a [NaCl] = 80 mM. La spiegazione risiede nella presenza di un minimo secondario nel potenziale di interazione, il quale permette l’aggregazione nonostante la barriera energetica cresca con le dimensioni dell’aggregato. Infatti quando una particella si avvicina all’aggregato incontra prima il minimo secondario e poi la barriera. L’insorgere del minimo secondario nel potenziale `e dovuto al contributo della forza attrattiva di Van der Waals, che diventa importante quando la forza ionica `e abbastanza grande da confinare le interazioni elettrostatiche in un raggio confrontabile al raggio d’azione delle forze di Van der Waals.

CAPITOLO 5. DISCUSSIONE

88

Truzzolillo et al. [4] hanno studiato lâ&#x20AC;&#x2122;andamento del potenziale di interazione al variare del sale (fig. 5.4 (a)) e delle dimensioni dellâ&#x20AC;&#x2122;aggregato (fig. 5.4 (b)). Lâ&#x20AC;&#x2122;elettrolita favorisce lâ&#x20AC;&#x2122;abbassamento della barriera repulsiva, come `e lecito aspettarsi, e sopra una determinata concentrazione la abbatte completamente, lasciando solamente un minimo profondo (pannello a). Tuttavia, man mano che le particelle decorate si legano, la carica superficiale dellâ&#x20AC;&#x2122;aggregato aumenta e questo produce un innalzamento della barriera repulsiva (pannello b). Contemporaneamente il minimo secondario diventa pi` u profondo.

Se la profondit`a raggiunge diversi kB T lâ&#x20AC;&#x2122;adesione delle particelle diventa irreversibile, in quanto la rottura del legame `e statisticamente improbabile.

A dispetto di quanto appena detto, aumentando ulteriormente la concentrazione di NaCl câ&#x20AC;&#x2122;`e un ritorno alla stabilit`a. Infatti nel diagramma di fase in corrispondenza delle concentrazioni maggiori (100, 200 e 400 mM) si ripresenta la situazione iniziale, nella quale il sistema era instabile solamente in prossimit`a del punto isoelettrico.

Il modello fin qui utilizzato per descrivere lâ&#x20AC;&#x2122;aggregazione dei complessi non spiega come ci`o possa accadere. Ad ogni modo, Yaroslavov et al. [5] hanno dimostrato che sopra una concentrazione critica, proporzionale alla densit`a di carica superficiale, il sale pu`o causare il desorbimento del polielettrolita.

Nel nostro sistema la densit`a di carica superficiale `e data dalla relazione e = 4.6 ¡ 10â&#x2C6;&#x2019;2 C/m2 (5.2) Ď&#x192;C = 1 ADOT AP + ADOP C x â&#x2C6;&#x2019; 1 Ë&#x161;2 , ADOP C = 72.5 A Ë&#x161;2 e dove abbiamo utilizzato i valori ADOT AP = 73.4 A x = 0.21 (frazione molare del DOTAP).

In accordo con il modello di Winkler e Cherstvy [40], valido per polielettroliti flessibili su una superficie sferica, il regime di desorbimento si raggiunge quando lâ&#x20AC;&#x2122;inverso della lunghezza di Debye eccede il valore critico s 24|Ď&#x192;C ||Ď | Ë&#x161;â&#x2C6;&#x2019;1 = 0.67 A (5.3) kC = 3 2 f0 0 r kB T lK dove j0 = 2.405 `e la prima radice positiva della funzione di Bessel di primo tipo J0 , lK = 24 nm `e la lunghezza di Kuhn e Ď = 2.24 ¡ 10â&#x2C6;&#x2019;10 C/m `e la densit`a di carica lineare del polielettrolita. La lunghezza di Kuhn `e il doppio della lunghezza di persistenza, che nel caso del NaPA vale â&#x2C6;ź 12 Ë&#x161; A. La densit`a di carica lineare, invece, `e stata stimata considerando che la distanza tra due gruppi ionizzabili (monovalenti) del NaPA `e b = 2.5 Ë&#x161; Ae tenendo conto del fatto che la condensazione dei contro-ioni riduce la densit`a di carica lineare di un fattore f , valutabile con la regola di Manning [64] f=

b 4Ď&#x20AC; 0 r kB T =b¡ = 0.35 lB e2

(5.4)

89

CAPITOLO 5. DISCUSSIONE

(a)

(b)

Figura 5.5: Confronto tra i diagrammi di fase con liposomi costituiti da una miscela DOTAP/DOPC (a) e da solo DOTAP (b). Il diagramma nel pannello (a) `e stato ristretto alla regione di ξ sovrapponibile con quella dell’altro diagramma (pannello (b)). Nel diagramma di sinistra la separazione tra punti stabili e instabili `e legata essenzialmente alla concentrazione di sale; viceversa nell’altro diagramma la separazione coinvolge sia i valori di ξ che di [N aCl]. Inoltre il ritorno alla stabilit`a ad alte concentrazioni `e riscontrabile solamente nel pannello (a).

dove lB `e la lunghezza di Bjerrum.

L’inverso della lunghezza di Debye `e legato alla concentrazione di NaCl dalla relazione p (5.5) k = 4πlB CN aCl da cui si ottiene CN aCl ' 1.0 · 1023 ioni/m3 , corrispondente a [NaCl] = 170 mM. Questo valore, puramente indicativo, non `e troppo lontano da quello riscontrato sperimentalmente e collocabile intorno ai 100 mM. In figura 5.5 viene confrontato il diagramma di fase con quello ottenuto da Sennato et al. [63] con lo stesso polielettrolita e liposomi composti da solo DOTAP. I range dei due diagrammi di fase non sono sovrapponibili, in quanto il primo (quello del sistema in esame) ha un’estensione maggiore in ξ e minore in [NaCl]; inoltre il secondo (Sennato et al.) `e pi` u dettagliato (pi` u punti). Tuttavia, limitandosi alla regione comune, si pu`o apprezzare l’enorme differenza tra i due diagrammi: i liposomi di puro DOTAP (pi` u carichi) conferiscono al sistema una sensibilit`a maggiore alle variazioni del rapporto di carica, testimoniata da una separazione tra i punti stabili e quelli instabili pi` u complessa; viceversa i liposomi costituiti da una miscela DOTAP/DOPC nel rapporto 1:4 danno al sistema una maggiore sensibilit`a nei confronti delle variazioni di [N aCl]. Questa differenza non stupisce affatto se si considera

CAPITOLO 5. DISCUSSIONE

90

che la minor carica nuda dei liposomi DOTAP/DOPC `e schermata dal sale in modo molto pi` u evidente.

Unâ&#x20AC;&#x2122;altra differenza evidente tra i due diagrammi `e il comportamento del sistema ad alte concentrazioni di sale: nel caso della miscela DOTAP/DOPC si assiste, dai 100 mM in poi, ad un ritorno alla stabilit`a, interpretato come effetto del desorbimento del polielettrolita; nellâ&#x20AC;&#x2122;altro caso (DOTAP) il sistema rimane destabilizzato fino a 0.8 M.

Conclusioni Lo scopo della tesi `e quello di studiare gli effetti di un sale monovalente (NaCl) sull’aggregazione dei complessi NaPA-DOTAP/DOPC. Si `e scelto di caratterizzare il sistema attraverso lo studio di due fenomeni: l’inversione di carica (overcharging) la condensazione rientrante

Inoltre, `e stato prodotto un diagramma di fase (fig. 4.7) nel quale `e possibile leggere la stabilit`a del sistema in funzione del rapporto di carica polielettrolita-lipide (ξ) e dell’ammontare di NaCl. Le tecniche sperimentali impiegate sono il Light Scattering Dinamico (DLS) e il Potenziale ζ.

Il DLS ha permesso di determinare il raggio idrodinamico delle particelle disperse e, quindi, di stimarne le dimensioni. In questo modo si `e potuto distinguere tra complessi isolati, dal raggio idrodinamico dell’ordine di quello delle SUV (< 100 nm), piccoli aggregati (qualche centinaio di nm) e grandi aggregati (∼ µm), seguendo l’evoluzione delle dimensioni con il rapporto di carica polielettrolita-lipide.

Invece le misure di Potenziale ζ hanno fornito una stima indiretta della carica superficiale netta delle particelle colloidali, nonch´e un’importante grandezza fisica per l’interpretazione dei fenomeni esaminati.

I risultati ottenuti sono stati interpretati sulla base del modello per le interazioni tra particelle decorate descritto nel capitolo 2. Il potenziale di interazione `e dato dalla somma di due contributi: il potenziale di Velegol e Thwar, che tiene conto della repulsione coulombiana e della patch-attraction, e il potenziale di Van der Waals, calcolato considerando i liposomi gusci sferici.

Il secondo termine, generalmente trascurabile, diventa rilevante con l’aggiunta di sufficienti quantit`a di sale, ovvero quando le interazioni elettrostatiche sono abbastanza schermate da avere raggio d’azione confrontabile con quello delle forze di Van der Waals.

91

CONCLUSIONI

92

Il quadro generale che emerge dalle misure presentate nel capitolo 4 `e piuttosto semplice: esistono tre regimi di concentrazione di sale, nei quali gli effetti del sale sono qualitativamente differenti.

Basse concentrazioni di NaCl. A concentrazioni minori di 10 mM, il cloruro di sodio non ha grandi effetti sul sistema, come `e lecito aspettarsi.

La condensazione rientrante si manifesta in modo analogo al caso senza sale (fig. 4.4), cos`ı come per l’inversione di carica, dove si nota solamente una lieve riduzione dei valori di Potenziale ζ (fig. 4.5). In definitiva, il sale ha un piccolo effetto di schermo, ma non sembra alterare significativamente l’adsorbimento del polielettrolita, n´e la fenomenologia che ne deriva (appunto la condensazione rientrante e l’inversione di carica). Nel diagramma di fase (fig. 4.7), la regione a basso sale mostra un sistema stabile per ogni rapporto di carica ξ, eccetto che nei dintorni del punto isoelettrico. Anche qui, l’analogia con il caso senza sale `e perfetta, a testimonianza del fatto che piccole quantit`a di NaCl non alterano la stabilit`a del sistema.

Concentrazioni intermedie di NaCl. Nel regime compreso tra i 10 mM e gli 80 mM, il sale ha destabilizzato completamente il sistema, impedendo, di conseguenza, lo studio della condensazione rientrante e dell’inversione di carica.

La destabilizzazione delle preparazioni `e giustificata dal modello accettato per l’interpretazione dei risultati: il sale ha il duplice effetto di schermare la repulsione tra particelle, dovuta alla loro carica netta omologa, e, al tempo stesso, di produrre la presenza di un minimo secondario nel potenziale di interazione. Se abbastanza profondo da rendere termodinamicamente improbabile la fuga delle particelle, questo minimo secondario, essendo aldil`a della barriera repulsiva, provoca la flocculazione del campione (flocculazione secondaria). L’aumento delle dimensioni degli aggregati, associato ad un aumento del contributo repulsivo, provoca altres`ı un aumento della profondit`a del minimo secondario: l’aggregazione procede senza possibilit`a di arresto fino alla flocculazione completa del colloide. Inoltre, se la concentrazione di sale `e abbastanza alta, la barriera pu`o sparire del tutto ed il potenziale `e caratterizzato da un solo minimo molto profondo. Anche in questo caso la flocculazione `e inarrestabile.

Alte concentrazioni di NaCl Contrariamente a quanto ci si potrebbe aspettare, aumentare ulteriormente la concentrazione di sale porta ad un nuovo effetto, il desorbimento del polielettrolita, che va a rimescolare l’importanza dei contributi attrattivi e repulsivi del potenziale di interazione.

Infatti, fino a [N aCl] = 80 mM il potenziale di interazione descritto dalla

CONCLUSIONI

93

2.11 permette di interpretare correttamente il comportamento del sistema, come discusso nel capitolo 5; sopra questa soglia, invece, `e stato osservato un ritorno alla stabilit`a, in contrasto con la previsione di flocculazione completa derivante dalla presenza di un un unico minimo molto profondo. A tutte le concentrazioni di NaCl sopra gli 80 mM (ovvero 100, 200 e 400 mM), le preparazioni sono risultate stabili indipendentemente dal rapporto di carica polielettrolita/lipide. Questo suggerisce che l’elettrolita, sopra una determinata soglia, agisce non solo da schermo, ma entra direttamente nella dinamica di adsorbimento del polielettrolita.

Yaroslavov et al. [5] hanno mostrato che la concentrazione di NaCl richiesta per la rimozione completa del polielettrolita `e grossomodo proporzionale alla densit`a superficiale di carica dei complessi. Dai calcoli esposti nel paragrafo 5.3, si ottiene una concentrazione critica per il desorbimento del polielettrolita di circa 170 mM. Il valore teorico risulta sensibilmente differente dall’intervallo determinato sperimentalmente (80 ÷ 100 mM). Tuttavia, data la complessit`a del sistema, l’accordo almeno sull’ordine di grandezza `e un risultato stimolante.

Infine, `e interessante notare che in regime di alto sale l’inversione di carica non si verifica ed il Potenziale ζ varia molto poco con il rapporto di carica ξ (fig. 4.5). Anche questo fatto pu`o essere interpretato come un effetto del desorbimento del polielettrolita (indotto dal sale), piuttosto che un effetto diretto dell’elettrolita.

Limiti e sviluppi della tesi Lo studio condotto presenta sicuramente dei limiti.

Ad esempio, occorre definire maggiormente gli andamenti, specialmente quelli relativi alle dimensioni degli aggregati. L’ostacolo principale che `e stato riscontrato a tal proposito `e la necessit`a di lavorare con basse concentrazioni di polielettrolita e lipide. In queste condizioni, le variazioni necessarie a infittire la regione del punto isoelettrico sono risultate talmente piccole da rendere, per via degli errori di preparazione, i campioni praticamente indistinguibili tra loro.

Se si vuole procedere in questa direzione, quindi, occorre risolvere il problema ridefinendo l’ordine di grandezza delle concentrazioni di polielettrolita e lipide, oppure migliorando il protocollo di preparazione dei campioni.

Un maggior dettaglio `e auspicabile anche nelle variazioni di [N aCl], in modo da poter individuare con pi` u precisione le soglie di passaggio tra i tre regimi di sale descritti. In particolare, `e interessante capire se la transizione tra i regimi comporta un cambiamento cos`ı netto nella stabilit`a del sistema, oppure se il passaggio `e graduale ed esiste una regione in cui il diagramma di fase `e pi` u complesso. Anche qui, l’ostacolo principale `e stato quello di

CONCLUSIONI

94

lavorare con quantit`a minime di cloruro di sodio; si `e preferito procedere in modo sicuro, distanziando tra loro le misure.

Un altro ovvio sviluppo `e quello di indagare sistemi costituiti dallo stesso polielettrolita, ma con miscele di DOTAP/DOPC dalla diversa frazione molare. Nellâ&#x20AC;&#x2122;immediato, si potrebbe studiare il caso intermedio tra quello qui analizzato, con un lipide carico ogni quattro neutri, e quello con soli lipidi carichi (DOTAP).

Infine, sarebbe interessante coinvolgere altre tecniche sperimentali, quali TEM (Trasmission Electron Spectroscopy) e SANS (Small Angle Neutron Scattering), che permetterebbero una maggiore sensibilit`a nella determinazione delle dimensioni delle particelle, ed una migliore valutazione dellâ&#x20AC;&#x2122;adsorbimento del polielettrolita.

Ringraziamenti Desidero ringraziare tutte le persone che hanno partecipato a questa avventura finale.

Ringrazio il mio Relatore, per la sua preziosa guida nella comprensione del lavoro e nella stesura della tesi. Lo ringrazio particolarmente per la sua capacit`a di adattarsi al mio carattere, e per la pazienza mostrata durante le mie “pause di riflessione”. I suoi consigli si sono sempre rivelati puntuali e chiari.

I miei ringraziamenti vanno anche alla Dottoressa Sennato, che mi ha accompagnato fin dal primo giorno, spiegandomi con dovizia tutti gli aspetti del lavoro sperimentale che andavamo ad eseguire. Grazie alla sua disponibilit`a sono riuscito a orientarmi in un campo complesso, a me precedentemente ignoto.

Del gruppo PhOBiA desidero ringraziare anche il Dottor Fabio Domenici e la dottoressa Bomboi, che mi hanno pi` u volte soccorso e spronato nei momenti difficili. In loro ho trovato sincera amicizia, prima ancora che collaborazione.

Di questo li ringrazio in modo speciale.

Infine, un saluto va alla neo-dottoressa Eleonora Stefanutti, con la quale ho condiviso per qualche tempo scrivania (sua), caramelle (sue) e pensieri (in gran parte suoi); al nuovo arrivato Fabio, gi`a membro importante del gruppo, auguro di vivere un’esperienza positiva come la mia.

Venendo alla mia trib` u, non posso che ringraziare tutti per l’infinito e incondizionato sostegno.

Grazie pap`a, per la fiducia che mi hai sempre concesso nonostante le mie molte cadute. A te e mamma devo moltissimo e spero che la coronazione di questo sogno sia un anticipo sufficiente.

Grazie mamma, per avermi dato amore e protezione, soprattutto quando non pensavo di averne bisogno.

Un abbraccio ai miei fratelli Gabriele, Laura, Sara e Silvia, perfetti amici d’infanzia ed un solido riferimento in tutti questi anni, e ai nuovi arrivati nella famiglia (Alessandro I., Mariano, Alessandro G., Silvia e i nipotini Federica, Chiara, Francesco, Giorgia).

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RINGRAZIAMENTI

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Un caro saluto a tutto il resto della famiglia (finalmente ce l’ho fatta!).

Infine, non possono mancare gli amici!

Ringrazio: Marco e Gianni, per avermi accompagnato e talvolta trascinato in tutti questi anni; Claudio, Roberto, Stefano, Maria Luisa (l’ho scritto bene?), Elisa, Gaia, Alessandra, Alessandro, Gaetano, Francesco, Luca, per la loro inestimabile amicizia.

Per concludere, non potevo dimenticare la mia seconda famiglia: il Comitato Locale Sabatino di Croce Rossa. Una menzione speciale va ad Alessandro I. (sei il pi` u citato nei ringraziamenti, come minimo mi aspetto una promozione!) ed Emanuela, senza i quali niente sarebbe accaduto, Daniela, Pasquale, Pino, Sara (anche lei pluricitata), Laura.

E i Pionieri? Non vi ho tralasciati! Al contrario, vi ho riservato l’onore di concludere le mie fatiche: un bacio a Chicca, Alessio, Stefano, Claudia, Valentina, Roberta E., Matteo, Sara (un’altra), Luca, Roberta A. ed i nuovi arrivati!

THE END

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